JPH0532697A - Synthetic human osteocalcin and production thereof - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain in an industrially advantageous way the title compound for the therapeutic agents for bone dysbolism, standard substances for human osteocalcin assay, etc., by introduction of -carboxyglutamic acid using specific protecting L-gamma--carboxyglutamic ac ids. CONSTITUTION:With peptide's solid phase synthesis, using an insoluble resin as carrier, protecting amino acids are sequentially bonded, from the C-terminal of the aimed peptide, to the carrier using a peptide synthesizer, and as the amino acids at 21th and 24th from the N-terminal of the peptide, gamma- carboxyglutamic acids are introduced, using a derivative with the amino groups protected with 9-fluorenyloxycarbonyl(Fmoc) groups and gamma-carboxyl groups with t-butoxy groups, to effect synthesis of a protecting peptide chain on M insoluble resin followed by treatment with trifluoroacetic acid etc., to carry out elimination of the peptide from the resin and deprotection, thus giving the objective synthetic <21>, <24>Gla human osteocalcin having an amino acid sequence of the formula (Gla is gamma-carboxyglutamic acid residue).

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、合成ヒトオステオカル
シン、その製造方法およびヒトオステオカルシン測定用
標準物質としてのその用途に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a synthetic human osteocalcin, a method for producing the same and its use as a standard substance for measuring human osteocalcin.

【０００２】[0002]

【従来の技術】オステオカルシン〔別名、ｂｏｎｅ ｇ
ｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＧＰ）〕は、骨のビタミンＫ
依存性のカルシウム結合性タンパクである。そん分子量
は、５，８００であり、４９のアミノ酸残基により構成
されている。このタンパクは、オステオブラスト（骨芽
球）から産生され、骨の非コラーゲンタンパクの構成成
分の約２０％を占めている。このタンパクにはγ−ｃａ
ｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕ
ｅｓがあり、ハイドロキシアパタイトと強いアフィニテ
イがあり、それゆえに骨マトリックス形成に重要な役割
を有しているものと推定される。2. Description of the Related Art Osteocalcin [also known as bone g
la protein (BGP)] is vitamin K in bone.
It is a dependent calcium-binding protein. Its molecular weight is 5,800 and is composed of 49 amino acid residues. This protein is produced by osteoblasts (osteoblasts) and accounts for about 20% of bone non-collagen protein components. This protein contains γ-ca
rboxyglutamic acid resinu
es, hydroxyapatite and strong affinity, and therefore presumed to have an important role in bone matrix formation.

【０００３】このオステオカルシンは、ニワトリと牛の
骨から見出されたのが最初であるが〔Ｐｒｏ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７２，３９２５
（１９７５）、同７３，１４４７（１９７６）〕、その
他、人を含めて〔Ｊ．Ｂ．Ｃ．２５５，８６８５（１９
８０）〕種々の動物の骨から見出されており、その構造
の類似性がいわれている。This osteocalcin was first found in chicken and cow bones [Pro. Nat
l. Acad. Sci. USA, 72 , 3925
(1975), ibid. 73 , 1447 (1976)], including others [J. B. C. 255 , 8685 (19
80)] It has been found from the bones of various animals, and it is said that the structures are similar.

【０００４】このような観点からヒトオステオカルシン
は、骨代謝異常の治療薬としての可能性が考えられ、ま
た、ヒトオステオカルシンの測定系のための標準物質と
しても期待されている。From these viewpoints, human osteocalcin is considered to be a potential therapeutic drug for abnormal bone metabolism, and also expected as a standard substance for a human osteocalcin assay system.

【０００５】さらに、オステオカルシンは、白血球エス
テラーゼのインヒビター（Ｅｂｓｃｏ Ｍｅｄｉａ，１
９８５，ｐｐ．１４９〜１５８）、破骨細胞へのｃｈｅ
ｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ
ｇ，１１８、ｐｐ．１６３６〜１６４２，１９８６）、
Ｃａ⁺⁺、Ｍｇ⁺⁺の誘導タンパク（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ，
２，ｐｐ．８３〜９２，１９８３）などの生物活性を有
する。かかる観点からもオステオカルシンの合成が待た
れていた。Further, osteocalcin is an inhibitor of leukocyte esterase (Ebsco Media, 1
985, pp. 149-158), che to osteoclasts
moattractant (Endocrinolo
g, 118, pp. 1636-1642, 1986),
Ca ⁺⁺ , Mg ⁺⁺ derivative protein (Magnesium,
2, pp. 83-92, 1983) and the like. From this viewpoint, the synthesis of osteocalcin has been awaited.

【０００６】ヒトオステオカルシンの合成法としては、
特開平３−９０１００号公報にアミノ基がｔ−ブチルオ
キシカルボニル基（Ｂｏｃ）で、γ−カルボキシル基が
シクロヘキシルエステル基（ＯｃＨｅｘ）で保護された
保護Ｌ−γ−カルボキシグルタミン酸またはその塩を用
いてγ−カルボキシグルタミン酸を導入する^21,24Glaヒ
トオステオカルシンまたは^17,21,24Gla ヒトオステオカ
ルシンの製造方法が開示されている。As a method for synthesizing human osteocalcin,
JP-A-3-90100 discloses a protected L-γ-carboxyglutamic acid or a salt thereof in which an amino group is protected by a t-butyloxycarbonyl group (Boc) and a γ-carboxyl group is protected by a cyclohexyl ester group (OcHex). ^{21, 24} Gla method for producing human osteocalcin or ^17,21,24 Gla human osteocalcin introducing γ- carboxyglutamic acid is disclosed.

【０００７】しかし、この方法を用いると、保護アミノ
酸の結合により得られるペプチド樹脂から合成ヒトオス
テオカルシンを得るには、保護基のついたペプチドをぺ
プチド樹脂から脱離させる工程と保護基を脱離させる工
程を経ることが必要であり、一工程で脱離できる方法に
比し必然的にその反応収率が低い。However, when this method is used, in order to obtain synthetic human osteocalcin from a peptide resin obtained by conjugating a protected amino acid, the step of removing a peptide having a protecting group from the peptide resin and the removal of the protecting group are carried out. It is necessary to go through the step of allowing the reaction to take place, and the reaction yield is inevitably low as compared with the method in which desorption is possible in one step.

【０００８】[0008]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、合成の
^21,24Glaヒトオステオカルシンまたは^17,21,24Gla ヒト
オステオカルシン、それらを高い反応収率で製造するこ
とのできる製造方法およびヒトオステオカルシン測定用
標準物質を提供することを目的とする。The present invention is a synthetic method.
^{21, 24} Gla human osteocalcin or ^17,21,24 Gla human osteocalcin, and an object thereof is to provide a manufacturing method and a human osteocalcin measuring standard capable of producing them in a high reaction yield.

【０００９】本発明は、下記配列番号１のアミノ酸配列
を有する合成^21,24Glaヒトオステオカルシンおよびその
製造方法を提供するものである。 （アミノ酸配列中、Gla はγ−カルボキシグルタミン酸
残基を示す。）The present invention provides a synthetic ^21,24 Gla human osteocalcin having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 below and a method for producing the same. (In the amino acid sequence, Gla represents a γ-carboxyglutamic acid residue.)

【００１０】本発明はまた、下記配列番号２のアミノ酸
配列を有する合成^17,21,24Gla ヒトオステオカルシンお
よびその製造方法を提供するものである。 （アミノ酸配列中、Gla はγ−カルボキシグルタミン酸
残基を示す。）The present invention also provides a synthetic ^17,21,24 Gla human osteocalcin having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 below and a method for producing the same. (In the amino acid sequence, Gla represents a γ-carboxyglutamic acid residue.)

【００１１】前記配列番号１のアミノ配列を有する
^21,24Glaヒトオステオカルシンおよび配列番号２のアミ
ノ酸配列を有する^17,21,24Gla ヒトオステオカルシン
は、Ｐｏｓｅｒらによれば、ヒトオステオカルシン中
に、９１：９の割合で存在するとされている〔Ｐｏｓｅ
ｒ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，２５５，８６８５〜
８６９１（１９８０）〕、ヒトオステオカルシンを構成
するタンパクである。Having the amino sequence of SEQ ID NO: 1
^{21, 24} Gla human osteocalcin and ^17,21,24 Gla human osteocalcin having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, according to the Poser et al., In human osteocalcin, 91: there is a present at 9 ratio of [Pose
r, J. W. , Et al. , Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 255, 8685
8691 (1980)], a protein that constitutes human osteocalcin.

【００１２】本発明の合成の^21,24Glaヒトオステオカル
シンおよび^17,21,24Gla ヒトオステオカルシン（以下、
本発明のヒトオステオカルシンということがある）は、
ヒトオステオカルシンのペプチド合成法において、下記
式（１）[0012] ^{21, 24} Gla human osteocalcin and ^17,21,24 Gla human osteocalcin synthesis of the present invention (hereinafter,
The human osteocalcin of the present invention may be referred to as)
In the peptide synthesis method of human osteocalcin, the following formula (1)

【化４】 （式中、ｔＢｕはｔｅｒｔ−ブチル基を示す）で示され
る保護Ｌ−γ−カルボキシグルタミン酸またはその塩を
用いてγ−カルボキシグルタミン酸を導入することによ
って製造される。[Chemical 4] It is produced by introducing γ-carboxyglutamic acid using a protected L-γ-carboxyglutamic acid represented by (wherein tBu represents a tert-butyl group) or a salt thereof.

【００１３】ペプチド合成は、公知の方法、例えば、矢
島治明、榊原俊平著、日本生化学会編、生化学実験講座
（Ｉ）：“蛋白質の化学”４巻、東京化学同人発行（１
９７７）；および、泉谷信夫ほか著、“ペプチド合成の
基礎と実験”、丸善発行（１９８５）に記載されている
方法に準じて、液相法または固相法で行うことができ
る。本発明のオステオカルシンの合成法としては固相法
が好ましい。Peptide synthesis can be carried out by a known method, for example, by Haruaki Yajima, Shunpei Sakakibara, edited by The Biochemical Society of Japan, Biochemistry Experimental Course (I): "Chemistry of Protein", Volume 4, published by Tokyo Kagaku Dojin (1).
977); and Nobuo Izumiya et al., "Basics and Experiments of Peptide Synthesis", published by Maruzen (1985), and can be carried out by a liquid phase method or a solid phase method. The solid phase method is preferred as the method for synthesizing osteocalcin of the present invention.

【００１４】以下、固相法により本発明のヒトオステオ
カルシンまたはそれらの塩を合成する場合について説明
する。まず、目的とするヒトオステオカルシンのＣ末端
アミノ酸、すなわちＶａｌを保護アミノ酸として不溶性
樹脂に結合させる。このようなＣ末端アミノ酸を不溶性
樹脂に結合させた保護アミノ酸樹脂は市販品を用いるこ
ともできる。次いで、ヒトオステオカルシンのアミノ酸
配列に従ってＣ末端側から保護アミノ酸を順次結合さ
せ、保護ペプチド樹脂を得る。The case where the human osteocalcin of the present invention or a salt thereof is synthesized by the solid phase method will be described below. First, the target C-terminal amino acid of human osteocalcin, that is, Val, is bound to an insoluble resin as a protected amino acid. As the protected amino acid resin in which such a C-terminal amino acid is bound to an insoluble resin, a commercially available product can be used. Next, according to the amino acid sequence of human osteocalcin, protected amino acids are sequentially bound from the C-terminal side to obtain a protected peptide resin.

【００１５】不溶性樹脂としては、当該技術分野で知ら
れたいずれでもよく、例えばクロロメチル樹脂、オキシ
メチル樹脂、４−（オキシメチル）フェニルアセタミド
メチル樹脂などを挙げることができる。The insoluble resin may be any known in the art, and examples thereof include chloromethyl resin, oxymethyl resin, 4- (oxymethyl) phenylacetamide methyl resin and the like.

【００１６】保護アミノ酸とは、官能基が公知の方法に
より保護されたアミノ酸であり、各種の保護アミノ酸が
市販されている。本発明のヒトオステオカルシンを合成
する場合には、以下に示す保護アミノ酸のいずれかを選
択するのが好ましい。まず、アミノ酸のα−アミノ基の
保護基は９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基
（Ｆｍｏｃ）またはＢｏｃである。The protected amino acid is an amino acid whose functional group is protected by a known method, and various protected amino acids are commercially available. When synthesizing the human osteocalcin of the present invention, it is preferable to select any of the following protected amino acids. First, the protecting group for the α-amino group of amino acids is 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc) or Boc.

【００１７】Ａｒｇのグアニジン基の保護基はｐ−トル
エンスルホニル基（Ｔｏｓ）、ＮＯ₂ または４−メトキ
シ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル基（Ｍ
ｔｒ）である。Ａｓｐ、Ｇｌｕのカルボキシル基の保護
基は、ベンジルオキシ基（ＯＢｚｌ）、ｔ−ブトキシ基
（ＯｔＢｕ）またはＯｃＨｅｘである。Ｃｙｓのメルカ
プト基の保護基はｔＢｕ、４−メチルベンジル基（４Ｃ
Ｈ₃ ・Ｂｚｌ）、メトキシベンジル基（ＭＢｚｌ）また
はアセトアミドメチル（Ａｃｍ）である。Ｈｉｓのイミ
ダゾリル基の保護基はトリフェニルメチル（Ｔｒｔ）、
Ｔｏｓ、Ｆｍｏｃまたはジニトロフェニル基（Ｄｎｐ）
である。Ｔｒｐのインドリル保護基はＨＣＯか、あるい
は保護しなくてもよい。Ｔｙｒの水酸基の保護基は２−
ブロモベンジルオキシカルボニル基（ＢｒＺ）、２，６
−ジクロロベンジル基（Ｃｌ₂ Ｂｚｌ）、Ｂｚｌ、ｔＢ
ｕであるかあるいは保護しなくてもよい。各保護基は、
ペプチドの合成条件に応じ適切なものを選択する必要が
ある。The protecting group for the guanidine group of Arg is p-toluenesulfonyl group (Tos), NO ₂ or 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl group (M
tr). The protective group for the carboxyl group of Asp and Glu is a benzyloxy group (OBzl), a t-butoxy group (OtBu) or OcHex. The protecting group for the mercapto group of Cys is tBu, 4-methylbenzyl group (4C
H ₃ · Bzl), a methoxybenzyl group (MBzl) or acetamidomethyl (Acm). The protecting group for the imidazolyl group of His is triphenylmethyl (Trt),
Tos, Fmoc or dinitrophenyl group (Dnp)
Is. The indolyl protecting group of Trp may be HCO or unprotected. The protective group for the hydroxyl group of Tyr is 2-
Bromobenzyloxycarbonyl group (BrZ), 2,6
-Dichlorobenzyl group (Cl ₂ Bzl), Bzl, tB
u or may be unprotected. Each protecting group is
It is necessary to select an appropriate one according to the peptide synthesis conditions.

【００１８】本発明の^21,24Glaヒトオステオカルシンに
おける２１位および２４位のＧｌａならびに^17,21,24Gl
a ヒトオステオカルシンにおける１７位、２１および２
４位のＧｌａは、前記式（１）で表される保護Ｌ−Ｇｌ
ａとして導入することができる。[0018] 21-position and 24-position in ^{21, 24} Gla human osteocalcin of the present invention Gla and ^17,21,24 Gl
a positions 17, 21 and 2 in human osteocalcin
Gla at the 4th position is a protected L-Gl represented by the above formula (1).
can be introduced as a.

【００１９】この保護Ｌ−Ｇｌａの合成は次の方法によ
り行うことができる。The protected L-Gla can be synthesized by the following method.

【化５】 （工程ａ〜ｈ中、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメチルオ
キシカルボニル基を、ｔＢｕはｔ−ブチル基を、Ｂｚｌ
はベンジル基を示す。）[Chemical 5] (In steps a to h, Fmoc represents a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, tBu represents a t-butyl group, Bzl
Represents a benzyl group. )

【００２０】すなわち、まずＬ−プロリン（Ｉ）からＬ
−１−Ｆｍｏｃ−プロリネート（II) を合成し（工程
ａ）、次にこれを（２Ｓ）−１−Ｆｍｏｃ−２−（ｔ−
ブチルジメチルシリル）−オキシメチルピロリジン（II
I)となし（工程ｂ）、さらにこれを（２Ｓ）−１−Ｆｍ
ｏｃ−４−ｔ−ブトキシカルボニル−２−（ｔ−ブチル
ジメチルシリル）オキシメチル−５−ピロリジン（IV)
とする（工程ｃ）。That is, first, from L-proline (I) to L
-1-Fmoc-prolinate (II) was synthesized (step a), which was then (2S) -1-Fmoc-2- (t-
Butyldimethylsilyl) -oxymethylpyrrolidine (II
I) and none (step b), and further (2S) -1-Fm
oc-4-t-butoxycarbonyl-2- (t-butyldimethylsilyl) oxymethyl-5-pyrrolidine (IV)
(Step c).

【００２１】次に工程ｃで得られた化合物（IV) を脱シ
リル化して（２Ｓ）−１−Ｆｍｏｃ−４−ｔ−ブトキシ
カルボニル−２−ヒドロキシメチル−５−ピロリジン
（Ｖ）となし（工程ｄ）、これを（２Ｓ）−１−Ｆｍｏ
ｃ−４−ｔ−ブトキシカルボニル−５−オキソプロリン
ベンジルエステル（VI) となし（工程ｅ）、これにトリ
エチルアミンとｔ−ブチルアルコールを作用させてα−
ベンジル−γ，γ−ジ−ｔ−ブチル−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｌ
−γ−カルボキシグルタメート（VII)を合成（工程ｆ）
する。さらにこれを還元して、目的とする保護Ｌ−Ｇｌ
ａ（１）を得る（工程ｇ）。Next, the compound (IV) obtained in step c is desilylated to form (2S) -1-Fmoc-4-t-butoxycarbonyl-2-hydroxymethyl-5-pyrrolidine (V) (step d), this is (2S) -1-Fmo
c-4-t-Butoxycarbonyl-5-oxoproline benzyl ester (VI) was obtained (step e), and triethylamine and t-butyl alcohol were allowed to act on it to obtain α-
Benzyl-γ, γ-di-t-butyl-N-Fmoc-L
Synthesis of -γ-carboxyglutamate (VII) (step f)
To do. This is further reduced to give the desired protection L-Gl.
Obtain a (1) (step g).

【００２２】前記工程ａは、化合物Ｉと９−フルオレニ
ルメチルクロロフォルメートをＮａＨＣＯ₃ の存在下反
応させ、次にメタノール、ＤＣＣ（１，３−ジシクロヘ
キシルカルボジイミド）および４−ＤＭＡＰ（４−ジメ
チルアミノピリジン）を反応させることにより行うこと
ができる。In the step a, the compound I is reacted with 9-fluorenylmethyl chloroformate in the presence of NaHCO ₃ , followed by methanol, DCC (1,3-dicyclohexylcarbodiimide) and 4-DMAP (4-dimethyl). Aminopyridine) can be reacted.

【００２３】工程ｂは、化合物IIにＬｉＢＨ₄ を反応さ
せ、処理後、ｔ−ブチルジメチルシリルクロライドをＴ
ＥＡ、４−ＤＭＡＰの存在下反応させシリル化したの
ち、これに、ＲｕＯ₂ ハイドレートおよびＮａＩＯ₄ を
加え反応させ、化合物III を得ることができる。In step b, the compound II is reacted with LiBH ₄ and, after treatment, t-butyldimethylsilyl chloride is added to T.
After reacting in the presence of EA and 4-DMAP for silylation, RuO ₂ hydrate and NaIO ₄ are added and reacted to obtain compound III.

【００２４】工程ｃはＬＤＡ存在下、化合物III とｔ−
ブチルクロロフォルメートを反応させて実施することが
できる。In step c, compound III and t- are added in the presence of LDA.
It can be carried out by reacting butyl chloroformate.

【００２５】工程ｄは化合物IVとｐ−トルエンスルホン
酸を反応させ、ＮａＨＣＯ₃ を加えて行うことができ
る。Step d can be carried out by reacting compound IV with p-toluenesulfonic acid and adding NaHCO ₃ .

【００２６】工程ｅは、化合物Ｖとピリジニウムジクロ
メートを反応させ、次にベンジルアルコール、ＤＣＣお
よび４−ＤＭＡＰを反応生成物と反応させ、化合物VIを
得ることができる。In step e, compound V can be reacted with pyridinium dichromate, followed by reaction of benzyl alcohol, DCC and 4-DMAP with the reaction product to give compound VI.

【００２７】工程ｆは、化合物VIにｔ−ブチルアルコー
ルとＴＥＡを加えて反応させることにより行うことがで
きる。Step f can be carried out by adding t-butyl alcohol and TEA to compound VI and reacting them.

【００２８】工程ｇは、化合物VII のエタノール溶液に
Ｐｄ−Ｃを加え、水素を加えながら中圧の還元装置を用
いて実施することができる。Step g can be carried out by adding Pd-C to an ethanol solution of compound VII and using a medium pressure reducing apparatus while adding hydrogen.

【００２９】前記工程ａ〜ｇの組合せによる保護Ｌ−Ｇ
ｌａの合成は、Ｌ−プロリン（Ｉ）の光学活性が生成物
である保護Ｌ−Ｇｌａ（１）まで保持されるため、光学
分割の工程を要せず、高い反応収率を保つことができ
る。Protected LG by the combination of steps a to g
In the synthesis of la, the optical activity of L-proline (I) is retained up to the product, protected L-Gla (1), and therefore a step of optical resolution is not required and a high reaction yield can be maintained. .

【００３０】保護アミノ酸の結合は、例えば、Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ペプチドシンセサイ
ザー４３１Ａ型のようなペプチド合成機により行うこと
ができる。この結果、保護基のついたペプチド樹脂が得
られ、目的とする合成ヒトオステオカルシンを得るに
は、該ペプチド樹脂からペプチドを脱離し、さらに保護
基を脱離させる必要があるが、本発明の保護Ｌ−ＧＬａ
を用いるとこの２つの脱離工程を同時に行うことがで
き、反応収率の向上に寄与することができる利点があ
る。The binding of protected amino acids can be carried out, for example, by Appl
It can be performed by a peptide synthesizer such as a peptide synthesizer type 431A manufactured by ied Biosystems. As a result, a peptide resin with a protecting group is obtained, and in order to obtain the desired synthetic human osteocalcin, it is necessary to remove the peptide from the peptide resin and further remove the protecting group. L-GLa
The use of is advantageous in that these two desorption steps can be carried out at the same time and can contribute to the improvement of the reaction yield.

【００３１】得られた粗製ペプチドは、ペプチド製造の
公知の手段、例えば抽出：再結晶：ゲル濾過、イオン交
換、逆相などの各種クロマトグラフィー：電気泳動：向
流分配などにより単離精製することができるが、逆相高
速クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）による方法が最
適である。The obtained crude peptide is isolated and purified by a known means for peptide production, for example, extraction: recrystallization: gel filtration, ion exchange, various chromatographies such as reverse phase: electrophoresis: countercurrent distribution, etc. However, the method by reverse phase high performance chromatography (reverse phase HPLC) is most suitable.

【００３２】得られたペプチドである合成^21,24Glaヒト
オステオカルシンは、天然のヒトオステオカルシンと同
一の免疫学的挙動を示し、ヒトオステオカルシン測定用
標準物質として有効に使用できる。The obtained peptide, synthetic ^21,24 Gla human osteocalcin, exhibits the same immunological behavior as natural human osteocalcin, and can be effectively used as a standard substance for human osteocalcin assay.

【００３３】また、合成^21,24Glaヒトオステオカルシン
および合成^17,21,24Gla ヒトオステオカルシンは、骨代
謝疾患治療薬として有効であると考えられる。かかる治
療薬として使用する場合、合成品である本発明のヒトオ
ステオカルシンは、その分子量が６，０００前後であ
り、天然のヒトオステオカルシンの分子量が１７，００
０前後であるのと比較して低分子量であるため、経鼻投
与などの投与経路によっても吸収効率がよく好適であ
る。Further, synthetic ^{21, 24} Gla human osteocalcin and synthetic ^17,21,24 Gla human osteocalcin is believed to be effective as a bone metabolism disorder therapeutics. When used as such a therapeutic agent, the synthetic human osteocalcin of the present invention has a molecular weight of about 6,000, and a natural human osteocalcin has a molecular weight of 17,000.
Since it has a low molecular weight as compared with around 0, it is preferable because the absorption efficiency is good depending on the administration route such as nasal administration.

【００３４】[0034]

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。なお、実施例中、「％」は「重量％」を示す。 実施例１（保護Ｌ−Ｇｌａの合成） Ｌ−プロリン（Ｉ）１１．５ｇ（１００ｍｍｏｌ）を１
２５ｍｌのジオキサンに溶解し、２５６ｍｌの１０％Ｎ
ａＨＣＯ₃ を加え混合する。これに、９−フルオレニル
メチルクロロフォルメート２５．９ｇ（１００ｍｍｏ
ｌ）のジオキサン（２５０ｍｌ）溶液を滴下し、氷冷下
４時間、室温８時間攪拌した。その後、１，０００ｍｌ
の水を加えエーテルで洗浄し、氷冷下ｃｏｎｃ．ＨＣｌ
を用いて酸性とした後、４℃で一晩冷却した。そして濾
過を行い得られた残渣３１．４ｇ（９３ｍｍｏｌ）と４
−ジメチルアミノピリジン１１．４ｇ（９３ｍｍｏｌ）
およびメタノール３．８ｍｌ（９３ｍｍｏｌ）をジクロ
ロメタン１５０ｍｌに溶解し、これにＤＣＣ２１．１ｇ
（１０２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２０ｍｌ）
を加え２５℃で８時間攪拌した。その後、ＤＣＵ（Ｎ，
Ｎ−ジシクロヘキシルウレア）を濾過により除き、濾液
を１ＭＫＨＳＯ₄ 、水、５％ＮａＨＣＯ₃ の順で洗浄
し、ＭｇＳＯ₄ で乾燥後、溶媒を減圧下留去し、メチル
−Ｌ−１−Ｆｍｏｃ−プロリネート（II）３２．３ｇ
（収率９２％）を得た。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples. In addition, "%" shows "weight%" in an Example. Example 1 (Synthesis of Protected L-Gla) 11.5 g (100 mmol) of L-proline (I) was added to 1
Dissolve in 25 ml dioxane and dissolve 256 ml 10% N
Add aHCO ₃ and mix. To this, 25.9 g of 9-fluorenylmethyl chloroformate (100 mmo
A solution of l) in dioxane (250 ml) was added dropwise, and the mixture was stirred under ice cooling for 4 hours and at room temperature for 8 hours. After that, 1,000 ml
Water was added and the mixture was washed with ether, and then conc. HCl
It was acidified with and cooled at 4 ° C. overnight. Then, filtration was performed to obtain 31.4 g (93 mmol) of the residue and 4
-Dimethylaminopyridine 11.4 g (93 mmol)
And methanol 3.8 ml (93 mmol) are dissolved in dichloromethane 150 ml, to which DCC 21.1 g is dissolved.
A solution of (102 mmol) in dichloromethane (20 ml)
Was added and the mixture was stirred at 25 ° C. for 8 hours. After that, DCU (N,
N-dicyclohexylurea) was removed by filtration, the filtrate was washed with 1M KHSO ₄ , water and 5% NaHCO ₃ in that order, dried over MgSO ₄ , and the solvent was evaporated under reduced pressure to give methyl-L-1-Fmoc-prolinate. (II) 32.3g
(Yield 92%) was obtained.

【００３５】次に、得られた化合物II３０ｇ（８５ｍｍ
ｏｌ）のＴＨＦ溶液（２００ｍｌ）に、氷冷下、攪拌し
ながら、ＬｉＢＨ₄ ２．８ｇ（１２８ｍｍｏｌ）を滴下
し、室温で１６時間攪拌した後、再度氷冷しながら、水
と２ＮＨＣｌをゆっくりと加えた。次に反応液を酢酸エ
チルで抽出し、抽出液を飽和食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ
₄ で乾燥後、溶媒を減圧下留去し残渣を得た。この残渣
２４．７ｇ（収率９０％）と、ＴＡＥ１２．３ｍｌ（８
８ｍｍｏｌ）および４−ＤＭＡＰ０．４７ｇ（３．８ｍ
ｍｏｌ）をＤＭＦ１００ｍｌに溶解し、攪拌しながらｔ
−ブチルジメチルシリルクロライド１３．３ｇ（８８ｍ
ｍｏｌ）を加え、３時間室温で攪拌した。その後、氷水
と酢酸エチルを加え抽出し、抽出液を５％ＨＣｌ、食塩
水で洗浄し、乾燥後、溶媒を減圧下留去し、シリカゲル
クロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１）
で精製し、続いて、精製物３２．６ｇ（収率９８％）の
酢酸エチル溶液１５０ｍｌにＲｕＯ₂ハイドレート３２
０ｍｇと１０％ＮａＩＯ₄ ４００ｍｌを加え室温で１時
間反応させた。水層を酢酸エチルで洗浄後、有機層を合
わせシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキ
サン＝１：３）を用いて精製し、（２Ｓ）−１−Ｆｍｏ
ｃ−２−ｔ−ブチルジメチルシリル）オキシメチルピロ
リジン（III)３０．９ｇ（収率９２％）を得た。Next, 30 g (85 mm) of the obtained compound II was obtained.
ol) in a THF solution (200 ml) under ice cooling while stirring, 2.8 g (128 mmol) of LiBH _{4 was} added dropwise, and after stirring at room temperature for 16 hours, water and 2N HCl were slowly added while cooling with ice again. added. Then, the reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the extract solution was washed with saturated saline solution and washed with MgSO 4.
After drying at ₄ , the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a residue. This residue 24.7 g (yield 90%) and TAE 12.3 ml (8
8 mmol) and 0.47 g of 4-DMAP (3.8 m
mol) in 100 ml of DMF and t
-Butyldimethylsilyl chloride 13.3 g (88 m
mol) was added and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. Then, ice water and ethyl acetate were added for extraction, the extract was washed with 5% HCl and brine, dried, and then the solvent was distilled off under reduced pressure and silica gel chromatography (ethyl acetate: hexane = 1: 1).
The resulting product was purified with 32.6 g (yield 98%) of ethyl acetate in 150 ml of RuO ₂ hydrate.
0 mg and 400 ml of 10% NaIO ₄ were added and reacted at room temperature for 1 hour. After washing the aqueous layer with ethyl acetate, the organic layers were combined and purified using silica gel chromatography (ethyl acetate: hexane = 1: 3) to obtain (2S) -1-Fmo.
30.9 g (yield 92%) of c-2-t-butyldimethylsilyl) oxymethylpyrrolidine (III) was obtained.

【００３６】チッソ置換下、ジイソプロピルアミン１
１．１ｇ（１１１ｍｍｏｌ）とｎ−ブチルリチウム７
３．９ｇ（１１１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ４５ｍｌ中、７８
℃で攪拌し、そこに化合物III ２５ｇ（５５．４ｍｍｏ
ｌ）のＴＨＦ溶液４５ｍｌを温度に注意しながら滴下
し、３０分間攪拌した。次にｔ−ブチルクロロフォルメ
ート１３．８ｇ（１１１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液３０ｍ
ｌを７８℃に冷却下、滴下し、１時間、７８℃で反応さ
せ、さらに１時間室温で反応させた。反応終了後、ＮＨ
₄ Ｃｌ水溶液を加え、反応を停止させ、反応液を酢酸エ
チルで抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄後乾燥さ
せ、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をシリカゲルク
ロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：４）で
精製し、（２Ｓ）−１−Ｆｍｏｃ−４−ｔ−ブトキシカ
ルボニル−２−（ｔ−ブチルジメチルシリル）オキシメ
チル−５−ピロリドン（IV) １２．５ｇ（収率４２％）
を得た。Diisopropylamine 1 under nitrogen substitution
1.1 g (111 mmol) and n-butyl lithium 7
78 g of 3.9 g (111 mmol) in 45 ml of THF
Stir at ℃, 25g of compound III (55.4mmo
45 ml of the THF solution of 1) was added dropwise while paying attention to the temperature, and the mixture was stirred for 30 minutes. Then, 13.8 g (111 mmol) of t-butyl chloroformate in a THF solution of 30 m
1 was added dropwise under cooling to 78 ° C., and the mixture was reacted at 78 ° C. for 1 hour and further at room temperature for 1 hour. After the reaction, NH
₄ Cl aqueous solution was added to stop the reaction, and the reaction solution was extracted with ethyl acetate. The extract was washed with saturated brine and dried, the solvent was evaporated under reduced pressure, the obtained residue was purified by silica gel chromatography (ethyl acetate: hexane = 1: 4), and (2S) -1-Fmoc- 4-t-butoxycarbonyl-2- (t-butyldimethylsilyl) oxymethyl-5-pyrrolidone (IV) 12.5 g (yield 42%)
Got

【００３７】得られた化合物IV２０．０ｇ（３７．１ｍ
ｍｏｌ）のメタノール溶液７０ｍｌにｐ−トルエンスル
ホン酸７．８ｇ（３７．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２
時間攪拌した。反応液に飽和ＮａＨＣＯ₃ 溶液を加え、
反応液をアルカリ性とし、クロロホルムで抽出した。抽
出液を飽和食塩水で洗浄し乾燥後、溶媒を減圧下留去
し、シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキ
サン＝１：１）で精製し、（２Ｓ）−１−Ｆｍｏｃ−４
−ｔ−ブトキシカルボニル−２−ヒドロキシメチル−５
−ピロリジン（Ｖ) １２．５ｇ（収率７９％）を得た。20.0 g (37.1 m) of the obtained compound IV
7.8 g (37.1 mmol) of p-toluenesulfonic acid was added to 70 ml of a methanol solution of (mol.
Stir for hours. Saturated NaHCO ₃ solution was added to the reaction solution,
The reaction solution was made alkaline and extracted with chloroform. The extract was washed with saturated brine and dried, the solvent was evaporated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel chromatography (ethyl acetate: hexane = 1: 1), (2S) -1-Fmoc-4.
-T-butoxycarbonyl-2-hydroxymethyl-5
-Pyrrolidine (V) 12.5 g (yield 79%) was obtained.

【００３８】ピリジニウムジクロメート３０．３ｇ（８
０．５ｍｍｏｌ）を化合物Ｖ２０ｇ（２３．３ｍｍｏ
ｌ）のＤＭＦ溶液４５ｍｌに加え、４０℃、１６時間攪
拌した。その後、水を加え、クロロホルムで抽出し、抽
出液を５％酢酸、飽和食塩水で洗浄し乾燥後、溶媒を減
圧下留去し、褐色の油状物を得た。このものに、ベンジ
ルアルコール２．５ｇ（２３．５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ
５．０ｇ（２４．１ｍｍｏｌ）および４−ＤＭＡＰ０．
３ｇ（２．４ｍｍｏｌ）を加え、ジクロロメタン６０ｍ
ｌを溶媒として室温で３時間反応させた。その後化合物
IIを得たときと同様の処理（ＤＣＵの濾過以降）を行
い、（２Ｓ）−１−Ｆｍｏｃ−４−ｔ−ブトキシカルボ
ニル−５−オキソプロリンベンジルエステル（VI) ８．
３ｇ（収率６８％）を得た。Pyridinium dichromate 30.3 g (8
0.5 mmol of Compound V (20 g, 23.3 mmo)
It was added to DMF solution (45 ml) and stirred at 40 ° C. for 16 hours. Then, water was added and the mixture was extracted with chloroform. The extract was washed with 5% acetic acid and saturated saline and dried, and then the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a brown oily substance. To this, 2.5 g (23.5 mmol) of benzyl alcohol, DCC
5.0 g (24.1 mmol) and 4-DMAP0.
3 g (2.4 mmol) was added, and dichloromethane 60 m
1 was used as a solvent and reacted at room temperature for 3 hours. Then compound
The same treatment as that for obtaining II (after filtration of DCU) was carried out to give (2S) -1-Fmoc-4-t-butoxycarbonyl-5-oxoproline benzyl ester (VI) 8.
3 g (yield 68%) was obtained.

【００３９】化合物VI１０ｇ（１９．３ｍｍｏｌ）にｔ
−ブチルアルコールとＴＥＡを過剰に加えて２４時間還
流した。その後、溶媒を減圧下留去することによりα−
ベンジル−γ，γ−ジ−ｔ−ブチル−Ｎ−Ｆｍｏｃ−γ
−カルボキシグルタメート（VII)１０．３ｇ（収率９０
％）を得た。Compound VI (10 g, 19.3 mmol) was added to t
-Butyl alcohol and TEA were added in excess and refluxed for 24 hours. Then, the solvent is distilled off under reduced pressure to obtain α-
Benzyl-γ, γ-di-t-butyl-N-Fmoc-γ
-Carboxyglutamate (VII) 10.3 g (yield 90
%) Was obtained.

【００４０】さらに、化合物VII １０ｇ（１７ｍｍｏ
ｌ）をエタノール２０ｍｌに溶解し、１０％Ｐｄ−Ｃ１
ｇを加えて、水素を加えながら、中圧の還元装置を用い
て化合物（１）７．８ｇ（収率９０％）を得た。Further, 10 g of compound VII (17 mmo
l) is dissolved in 20 ml of ethanol and 10% Pd-C1 is added.
7.8 g of Compound (1) (yield 90%) was obtained by using a medium pressure reducing apparatus while adding g and hydrogen.

【００４１】実施例２（^21,24Glaヒトオステオカルシン
の合成） 配列番号１に示すアミノ酸配列を有する^21,24Glaヒトオ
ステオカルシンを合成した。 Ｆｍｏｃ−Ｖａｌの活性化 Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ０．３４ｇ（１．０ｍｍｏｌ）をＮ−
メチルピロリドン（ＮＭＰ）に溶解し、そこに０．４５
Ｍ〔２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−
１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオ
ロフォスフェート〕（ＨＢＴＵ）／ＨＯＢｔ／ＤＭＦ溶
液を０．５ｍｌ加え、攪拌することにより、カルボン酸
の水酸基がＨＢＴＵ基に置き換えられた活性化Ｆｍｏｃ
−Ｖａｌが生成した。Example 2 (Synthesis of ^21,24 Gla Human Osteocalcin) ^21,24 Gla human osteocalcin having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was synthesized. Activation of Fmoc-Val 0.34 g (1.0 mmol) of Fmoc-Val was added to N-
Dissolve in methylpyrrolidone (NMP), 0.45
M [2- (1H-benzotriazol-1-yl)-
1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate] (HBTU) / HOBt / DMF solution (0.5 ml) was added and stirred to activate Fmoc in which the hydroxyl groups of the carboxylic acid were replaced with HBTU groups.
-Val generated.

【００４２】保護Ｖａｌと不溶性樹脂との結合 不溶性樹脂を担体として、ペプチドシンセサイザー４３
１Ａ型（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
を使用して^21,24Glaヒトオステオカルシンの合成を行っ
た。不溶性樹脂０．２５ｇ（０．２５ｍｍｏｌ）にＮ−
メチルピロリドンに溶解した活性化Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ
１．０ｍｍｏｌを加え攪拌してＲｅｓｉｎ−Ｖａｌ（Ｆ
ｍｏｃ）を合成した。Binding of protective Val and insoluble resin Peptide synthesizer 43 using the insoluble resin as a carrier
Type 1A (manufactured by Applied Biosystems)
Was used to synthesize ^21,24 Gla human osteocalcin. N- to 0.25 g (0.25 mmol) of insoluble resin
Activated Fmoc-Val dissolved in methylpyrrolidone
Add 1.0 mmol and stir to mix Resin-Val (F
moc) was synthesized.

【００４３】Ｒｅｓｉｎ−Ｖａｌ（Ｆｍｏｃ）（樹
脂）への４８位Ｐｒｏの導入 イ）脱保護および洗浄 Ｒｅｓｉｎ−Ｖａｌ（Ｆｍｏｃ）のＮＭＰ溶液にピペリ
ジン０．５ｍｌを加え攪拌することによりアミノ基の保
護基であるＦｍｏｃ基を脱保護した。次にこの脱保護し
た反応生成物をＣＨ₂ Ｃｌ₂ で析出させ同時に不要なも
の（未反応のＮＭＰなど）を洗い流した。Introduction of 48-position Pro into Resin-Val (Fmoc) (resin) a) Deprotection and washing 0.5 ml of piperidine was added to NMP solution of Resin-Val (Fmoc) and the mixture was stirred to protect the amino group. Was deprotected. Next, the deprotected reaction product was precipitated with CH ₂ Cl ₂ and at the same time, unnecessary substances (unreacted NMP etc.) were washed away.

【００４４】ロ）活性化Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏの調製 Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ０．３４ｇ（０．１ｍｌ）と０．４５
Ｍ ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＭＦ溶液を反応させること
により同様に活性化Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏを得た。B) Preparation of activated Fmoc-Pro Fmoc-Pro 0.34 g (0.1 ml) and 0.45
Similarly, activated Fmoc-Pro was obtained by reacting a MHBTU / HOBt / DMF solution.

【００４５】ハ）縮合反応 Ｒｅｓｉｎ−Ｖａｌと活性化Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏのそれぞ
れのＮＭＰ溶液を徐々に混合し攪拌して、Ｒｅｓｉｎ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ（Ｆｍｏｃ）を得た。C) Condensation reaction Resin-Val and activated Fmoc-Pro NMP solutions are gradually mixed and stirred to obtain Resin-Val.
Val-Pro (Fmoc) was obtained.

【００４６】４７〜１位の各アミノ酸の導入 と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｒｅｓｉ
ｎ（樹脂）に、^21,24Glaヒトオステオカルシンの４７位
から１位までの各構成アミノ酸に対応する保護アミノ酸
を順次カップリングさせた。各アミノ酸のα−アミノ基
の保護基としてはＦｍｏｃ基を、Ｔｙｒの水酸基の保護
基としてはｔＢｕ基を、Ａｒｇのグアニジノ基の保護基
としてはＭｔｒ基を、ＧｌｕおよびＡｓｐのカルボキシ
ル基の保護基としてはＯｔＢｕ基を、Ｈｉｓのイミダゾ
リル基の保護基としてはＴｒｔ基を、Ｃｙｓのメルカプ
ト基の保護基としてはｔＢｕ基を用いた。Fmoc-Pro-Val-Resi was prepared in the same manner as the introduction of each amino acid at positions 47 to 1.
The protected amino acids corresponding to the respective constituent amino acids from position 47 to position 1 of ^21,24 Gla human osteocalcin were sequentially coupled to n (resin). Fmoc group as a protecting group of α-amino group of each amino acid, tBu group as a protecting group of hydroxyl group of Tyr, Mtr group as a protecting group of guanidino group of Arg, and protecting group of carboxyl group of Glu and Asp Was used as the protecting group for the imidazolyl group of His, and the tBu group was used as the protecting group for the mercapto group of Cys.

【００４７】合成方法についてはに従ったが、縮合反
応は３０〜４０分とした。また、各アミノ酸の導入反応
毎に微量のサンプリングを行い、ニンヒドリン反応を行
い、反応の進行を確認した。さらにペプチドシーケンサ
ーによりＮ末端５残基の確認を行った。The synthetic method was followed, but the condensation reaction was carried out for 30 to 40 minutes. In addition, a small amount of sampling was performed for each introduction reaction of each amino acid, and a ninhydrin reaction was performed to confirm the progress of the reaction. Furthermore, the N-terminal 5 residues were confirmed by a peptide sequencer.

【００４８】脱保護（ＴＭＳＢｒクリーベッジ法） 保護ペプチド樹脂のＮ末端のＦｍｏｃ基の脱保護をペプ
チドシンセサイザーで行って得たペプチド樹脂４００ｍ
ｇを秤量し、氷冷下、攪拌しながらチオアニソール１．
２ｍｌ、エタンジオール０．６ｍｌ、ｍ−クレゾール
０．２ｍｌ、ＴＦＡ７．５ｍｌ、ＴＭＳＢｒ１．３５ｍ
ｌを温度の上昇に注意しながらゆっくりと加えた。加え
終わった後も氷冷したまま２時間攪拌した。次に、前も
って冷やしておいたジエチルエーテル約５０ｍｌをペプ
チドの沈澱が出なくなるまでフラスコに加え、１時間攪
拌した。析出した沈澱を濾過しエーテルで洗浄した。次
に、残渣に２Ｎ酢酸を加えてペプチドを抽出し、ｐＨを
調整後、ゲル濾過を行い、得られた画分を凍結乾燥する
ことにより粗^21,24Glaヒトオステオカルシン２０３ｍｇ
を得た。Deprotection (TMSBr Cleavage Method) Peptide resin 400 m obtained by deprotecting the N-terminal Fmoc group of the protected peptide resin with a peptide synthesizer
1 g of thioanisole 1.
2 ml, ethanediol 0.6 ml, m-cresol 0.2 ml, TFA 7.5 ml, TMSBr 1.35 m
1 was added slowly, paying attention to the increase in temperature. After the addition was completed, the mixture was stirred for 2 hours while cooling with ice. Next, about 50 ml of chilled diethyl ether was added to the flask until precipitation of the peptide was stopped, and the mixture was stirred for 1 hour. The deposited precipitate was filtered and washed with ether. Next, 2N acetic acid was added to the residue to extract the peptide, the pH was adjusted, gel filtration was performed, and the obtained fraction was freeze-dried to give crude ^21,24 Gla human osteocalcin 203 mg.
Got

【００４９】逆相ＨＰＬＣによる^21,24Glaヒトオステ
オカルシンの精製 得られた粗^21,24Glaヒトオステオカルシン１０ｍｇを
０．１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．０、０．５ｍｌ）に
溶解し、逆相ＨＰＬＣにより精製した。カラムは資生堂
（株）製、Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｃｋを用い、溶離液
は、Ａ液として０．１％ＴＦＡ／ＤＷ、Ｂ液として８０
％ＣＨ₃ ＣＮ／（０．１％ＴＦＡ／ＤＷ）を用いて、
Ａ：Ｂ＝２：３（体積比）の条件下で溶出させた。
^21,24Glaヒトオステオカルシンに相当する画分を分取
し、凍結乾燥して精製^21,24Glaヒトオステオカルシンの
白色粉末５ｍｇ（収率５０％）を得た。[0049] The ^21,24 purified resulting crude Gla human osteocalcin ^21,24 Gla human osteocalcin 10mg by reverse phase HPLC was dissolved in 0.1M carbonate buffer (pH9.0,0.5ml), purified by reverse phase HPLC did. The column was Capcell Pack manufactured by Shiseido Co., Ltd., and the eluent was 0.1% TFA / DW as the solution A and 80 as the solution B.
% CH ₃ CN / (0.1% TFA / DW)
Elution was performed under the condition of A: B = 2: 3 (volume ratio).
A fraction corresponding to ^21,24 Gla human osteocalcin was collected and freeze-dried to obtain 5 mg (yield 50%) of white powder of purified ^21,24 Gla human osteocalcin.

【００５０】精製^21,24Glaヒトオステオカルシンの確
認 イ）分子量の測定 前記精製^21,24Glaヒトオステオカルシン０．３ｍｇを炭
酸バッファー０．５ｍｌに溶解し、上記と同様のＨＰＬ
Ｃ条件で溶出し、同時に分子量マーカーとの比較を行
い、４５０ｎｍにおける赤外吸収（ＯＤ）を測定した。
合成^21,24Glaヒトオステオカルシンは、分子量約６，０
００のところにピークが得られた。Confirmation of purified ^21,24 Gla human osteocalcin a) Measurement of molecular weight 0.3 mg of the purified ^21,24 Gla human osteocalcin was dissolved in 0.5 ml of carbonic acid buffer and the same HPL as above was used.
Elution was carried out under the condition C, and at the same time, comparison with a molecular weight marker was carried out to measure infrared absorption (OD) at 450 nm.
Synthetic ^21,24 Gla human osteocalcin has a molecular weight of about 6,0.
A peak was obtained at 00.

【００５１】ロ）硫酸バリウム吸着実験 前記精製^21,24Glaヒトオステオカルシンを炭酸バッファ
ーに溶かし、この溶液０．５ｍｌに対しＢａＳＯ₄ １ｍ
ｇを加え、４℃で１．５時間反応させた後、ＥＩＡ法に
より^21,24Glaヒトオステオカルシンの残存率（ペプチド
残存率）を測定した。比較のため^21,24Gluヒトオステオ
カルシンについても同様にしてＢａＳＯ₄ の吸着を調べ
た。結果を図１に示す。B) Barium Sulfate Adsorption Experiment The purified ^21,24 Gla human osteocalcin was dissolved in a carbonate buffer, and 0.5 ml of this solution was added to 1 m of BaSO ₄
After adding g, the mixture was reacted at 4 ° C. for 1.5 hours, and the residual ratio of ^21,24 Gla human osteocalcin (residual peptide ratio) was measured by the EIA method. For comparison, the adsorption of BaSO ₄ was also examined for ^21,24 Glu human osteocalcin. The results are shown in Fig. 1.

【００５２】実施例３（^17,21,24Gla ヒトオステオカル
シンの合成) １７位のアミノ酸の導入において、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ
（ＯｔＢｕ）に変えてＬ−Ｆｍｏｃ−Ｇｌａ（ＯｔＢ
ｕ）₂ を用いるほかは実施例２と同様にして保護ペプチ
ド樹脂９００ｍｇを得、このうち４００ｍｇを用いて、
実施例２と同様にして脱保護し、逆相ＨＰＬＣにて精製
し、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する^17,21,24Gl
a ヒトオステオカルシン１９７ｍｇを得た。Example 3 ( ^{Synthesis of 17,21,24} Gla Human Osteocalcin) In introducing the amino acid at position 17, Fmoc-Glu was used.
Instead of (OtBu), L-Fmoc-Gla (OtB
900 mg of protected peptide resin was obtained in the same manner as in Example 2 except that u) ₂ was used.
Deprotected in the same manner as in Example 2, purified by reverse phase HPLC, and had ^17,21,24 Gl having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
a Human osteocalcin 197 mg was obtained.

【００５３】実施例４（ヒトオステオカルシン測定系の
標準物質としての性能評価） 抗体固定化ビーズの調製 ポリスチレン製ビーズ（直径６ｍｍ）をよく洗浄してか
ら、特願平１−３０００３号明細書記載の抗Ｎ20抗体２
０μｇ／ｍｌの濃度を有するＰＢＳ溶液中に４℃の温度
で１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄し、１％牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液中に、４℃の温度で１昼
夜放置してポストコーテイング処理をして、抗Ｎ20抗体
固定化ビーズを得た。Example 4 (Performance evaluation as a standard substance for human osteocalcin assay system) Preparation of antibody-immobilized beads After polystyrene beads (diameter 6 mm) were thoroughly washed, they were described in Japanese Patent Application No. 1-30003. Anti-N20 antibody 2
After standing in a PBS solution having a concentration of 0 μg / ml at a temperature of 4 ° C. for 1 day and night, it was washed with PBS and left in a PBS solution of 1% bovine serum albumin (BSA) at a temperature of 4 ° C. for 1 day and night. After post-coating treatment, anti-N20 antibody-immobilized beads were obtained.

【００５４】ＨＲＰ標識抗体の調製 先に出願した特願平１−３０００３号明細書の中で作成
したヒトオステオカルシンのＣ末端ペプチド（⁴³Ａｒｇ
−⁴⁹Ｖａｌ）に対するポリクローナル抗体〔抗Ｏｓｔ−
Ｃ（７）〕の２．０ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液１ｍｌに、
１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）１００μｌと、４０μ
ｇのペプシンを２０μｌの同緩衝液に溶解して加え、３
７℃、４時間反応させた。Preparation of HRP-labeled antibody C-terminal peptide of human osteocalcin ( ⁴³ Arg prepared in Japanese Patent Application No. 1-30003 filed previously)
- ⁴⁹ Val) for the polyclonal antibody [anti-Ost-
C (7)] in 1 ml of 2.0 mg / ml PBS solution,
100 μl of 1M acetate buffer (pH 4.2) and 40 μl
g pepsin dissolved in 20 μl of the same buffer and added 3
The reaction was carried out at 7 ° C for 4 hours.

【００５５】反応終了後、ＰＢＳにて平衡化したセファ
デックスＧ２５カラム（φ２ｃｍ×４５ｃｍ）を用いて
分離しＦ（ａｂ′）₂ を採取した。Ｆ（ａｂ′）₂ の１
ｍｇ／ｍｌ０．０１Ｍリン酸０．１５ＭＮａＣｌ（ｐＨ
７．４）溶液２ｍｌに、ＭＢＳ１０ｍｇ／ｍｌの濃度の
ジメチルホルムアミド溶液５０μｌを添加し、２５℃の
温度で３０分間反応させた。次いでセファデックスＧ２
５を充填したカラムを用い、０．１Ｍリン酸緩衝液
（０．１ＭＰＢ）（ｐＨ６．０）でゲル濾過を行い、マ
レイミド化抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。After completion of the reaction, separation was carried out using a Sephadex G25 column (φ2 cm × 45 cm) equilibrated with PBS to collect F (ab ′) ₂ . F (ab ') ₂ of 1
mg / ml 0.01M phosphoric acid 0.15M NaCl (pH
7.4) 50 μl of a dimethylformamide solution having a concentration of 10 mg / ml MBS was added to 2 ml of the solution, and the mixture was reacted at a temperature of 25 ° C. for 30 minutes. Then Sephadex G2
Using a column packed with 5, gel filtration was performed with 0.1 M phosphate buffer (0.1 MPB) (pH 6.0) to separate the maleimidated antibody and unreacted MBS.

【００５６】一方、ＨＲＰの１０ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍ
ＰＢ（ｐＨ６．５）溶液２ｍｌにＳ−アセチルメルカプ
ト無水コハク酸の６０ｍｇ／ｍｌジメチルホルムアミド
溶液１２０μｌを加え、２５℃で２時間反応させた。次
に、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を８０
０μｌ、０．１ＭＥＤＴＡ１６０μｌ、１Ｍヒドロキシ
ルアミン１．６ｍｌを加え、０℃で４分間反応させた。
その後、反応液をコロジオンバッグに入れ、０．１ＭＰ
Ｂ（ｐＨ６．０）、５ｍＭＥＤＴＡ含有溶液を用いて、
４℃で３日間透析し、チオール化ＨＲＰを得た。On the other hand, HRP 10 mg / ml 0.1M
To 2 ml of the PB (pH 6.5) solution, 120 μl of a 60 mg / ml dimethylformamide solution of S-acetylmercaptosuccinic anhydride was added, and the mixture was reacted at 25 ° C. for 2 hours. Then, add 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.0) to 80
0 μl, 160 μl of 0.1 MEDTA, 1.6 ml of 1M hydroxylamine were added, and the mixture was reacted at 0 ° C. for 4 minutes.
Then, put the reaction mixture in a collodion bag and
B (pH 6.0), using a solution containing 5 mM EDTA,
It dialyzed at 4 degreeC for 3 days, and thiolated HRP was obtained.

【００５７】次に、マレイミド化抗体２ｍｇとチオール
化ＨＲＰ４ｍｇとを混合し、コロジオンバッグを用いて
氷冷下に４〜１０ｍｇ／ｍｌの蛋白濃度になるまで濃縮
し、１５〜２０℃で一夜放置した。その液を、ウルトロ
ゲルＡＣＡ ４４（ＬＫＢ社）を充填したカラムでゲル
濾過し、ＨＲＰ標識抗Ｏｓｔ−Ｃ（７）抗体を得た。Next, 2 mg of the maleimidated antibody and 4 mg of thiolated HRP were mixed, concentrated using a collodion bag under ice cooling to a protein concentration of 4 to 10 mg / ml, and allowed to stand at 15 to 20 ° C. overnight. . The solution was subjected to gel filtration with a column packed with Ultrogel ACA 44 (LKB) to obtain an HRP-labeled anti-Ost-C (7) antibody.

【００５８】サンドイッチ法ＥＩＡ測定系 で調製した抗Ｎ20抗体固定化ビーズ１個と、実施例２
で得た精製^21,24Glaヒトオステオカルシンを０〜２０ｎ
ｇ／ｍｌの範囲で含有する１％ＢＳＡ含有０．０５ＭＴ
ＢＳ（ｐＨ８．０）２００μｌとで作成したＨＲＰ標
識抗体の１％ＢＳＡ含有０．０５ＭＴＢＳ（ｐＨ８．
０）溶液２００μｌとを、各試験管に添加して、２５℃
の温度で２時間インキュベートした。次に試験管内の溶
液を吸引除去した後、０．０５ＭＴＢＳ（ｐＨ８．０）
で洗浄してから、３，３′，５，５′−テトラメチルベ
ンジジン塩酸塩０．０２％およびＨ₂ Ｏ₂ ２．５ｍＭを
含有する０．１Ｍリン酸／クエン酸緩衝液（ｐＨ４．
３）を０．４ｍｌずつ各試験管に加え、２５℃の温度で
３０分間反応させた後、反応停止剤として１Ｎ硫酸水溶
液を１ｍｌずつ加えて酸素反応を停止させた。次いで、
この溶液を分光光度計を用いて４５０ｎｍの波長におけ
る吸収強度を測定した。One anti-N20 antibody-immobilized bead prepared by the sandwich method EIA measurement system and Example 2
0~20n The in resulting purified ^{21, 24} Gla human osteocalcin
0.05 MT containing 1% BSA in the range of g / ml
HRP-labeled antibody prepared with 200 μl of BS (pH 8.0) 0.05 MTBS containing 1% BSA (pH 8.
0) Add 200 μl of the solution to each test tube and
Was incubated for 2 hours. Next, the solution in the test tube was removed by suction, and then 0.05 MTBS (pH 8.0)
In the washed and 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine 0.02% hydrochloride and H ₂ O ₂ 0.1 M phosphate / citrate buffer containing 2.5 mM (pH 4.
0.4 ml of 3) was added to each test tube and reacted at a temperature of 25 ° C. for 30 minutes, and 1 ml of 1N sulfuric acid aqueous solution was added as a reaction terminator to stop the oxygen reaction. Then
The absorption intensity of this solution at a wavelength of 450 nm was measured using a spectrophotometer.

【００５９】天然ヒトオステオカルシンおよび^21,24Glu
ヒトオステオカルシンについても同様にして吸収強度を
測定した。その結果を図２に示す。図２から本発明の合
成^21,24Glaヒトオステオカルシンが、天然ヒトオステオ
カルシンと免疫学的に同一の反応性を示すことがわか
る。Natural human osteocalcin and ^21,24 Glu
The absorption intensity of human osteocalcin was measured in the same manner. The result is shown in FIG. From FIG. 2, it can be seen that the synthetic ^21,24 Gla human osteocalcin of the present invention exhibits immunologically the same reactivity as natural human osteocalcin.

【００６０】[0060]

【発明の効果】本発明は、反応収率の高い^21,24Glaヒト
オステオカルシンおよび^17,21,24Glaヒトオステオカル
シンの合成法ならびにヒトオステオカルシンの測定用標
準物質を提供することができる。According to the present invention can provide a reference material for measuring synthetic methods as well as human osteocalcin having a high reaction yields ^{21, 24} Gla human osteocalcin and ^17,21,24 Gla human osteocalcin.

【００６１】[0061]

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：４９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro 1 5 10 15 Arg Arg Gla Val Cys Gla Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile 20 25 30 35 Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val 40 45 49 [Sequence listing] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 49 Sequence type: Amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Array Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro   1 5 10 15 Arg Arg Gla Val Cys Gla Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile      20 25 30 35 Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val              40 45 49

【００６２】配列番号：２ 配列の長さ：４９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Gla Pro 1 5 10 15 Arg Arg Gla Val Cys Gla Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile 20 25 30 35 Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val 40 45 49SEQ ID NO: 2 Sequence length: 49 Sequence type: Amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Array Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Gla Pro   1 5 10 15 Arg Arg Gla Val Cys Gla Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile      20 25 30 35 Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val              40 45 49

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明の合成^21,24Glaヒトオステオカルシンの
硫酸バリウム吸着を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing barium sulfate adsorption on synthetic ^21,24 Gla human osteocalcin of the present invention.

【図２】本発明の合成^21,24Glaヒトオステオカルシンの
免疫学的反応性を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the immunological reactivity of synthetic ^21,24 Gla human osteocalcin of the present invention.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 窪田 貴明 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社東京研究センター内 (72)発明者 岡田 昌宏 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社東京研究センター内 (72)発明者 細田 健治 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社東京研究センター内 (72)発明者 今泉 厚 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社東京研究センター内   ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page    (72) Inventor Takaaki Kubota             4-3, Asahigaoka, Hino-shi, Tokyo Teijin             Tokyo Research Center Co., Ltd. (72) Inventor Masahiro Okada             4-3, Asahigaoka, Hino-shi, Tokyo Teijin             Tokyo Research Center Co., Ltd. (72) Inventor Kenji Hosoda             4-3, Asahigaoka, Hino-shi, Tokyo Teijin             Tokyo Research Center Co., Ltd. (72) Inventor Atsushi Imaizumi             4-3, Asahigaoka, Hino-shi, Tokyo Teijin             Tokyo Research Center Co., Ltd.

Claims (6)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 下記配列番号１のアミノ酸配列を有する
合成^21,24Glaヒトオステオカルシン。 （アミノ酸配列中、Gla はγ−カルボキシグルタミン酸
残基を示す。）1. Synthetic ^21,24 Gla human osteocalcin having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 below. (In the amino acid sequence, Gla represents a γ-carboxyglutamic acid residue.) 【請求項２】 下記配列番号２のアミノ酸配列を有する
合成^17,21,24Gla ヒトオステオカルシン。 （アミノ酸配列中、Gla はγ−カルボキシグルタミン酸
残基を示す。）2. A synthetic ^17,21,24 Gla human osteocalcin having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 below. (In the amino acid sequence, Gla represents a γ-carboxyglutamic acid residue.) 【請求項３】 ヒトオステオカルシンのペプチド合成法
において、下記式（１） 【化１】 （式中、ｔＢｕはｔｅｒｔ−ブチル基を示す）で示され
る保護Ｌ−γ−カルボキシグルタミン酸またはその塩を
用いてγ−カルボキシグルタミン酸を導入する請求項１
記載の^21,24Glaヒトオステオカルシンまたはその塩の製
造方法。3. A method for synthesizing a peptide of human osteocalcin, wherein the following formula (1): A γ-carboxyglutamic acid is introduced using a protected L-γ-carboxyglutamic acid represented by the formula (wherein tBu represents a tert-butyl group) or a salt thereof.
21. A method for producing ^21,24 Gla human osteocalcin or a salt thereof. 【請求項４】 ヒトオステオカルシンのペプチド合成法
において、下記式（１） 【化２】 （式中、ｔＢｕはｔｅｒｔ−ブチル基を示す）で示され
る保護Ｌ−γ−カルボキシグルタミン酸またはその塩を
用いてγ−カルボキシグルタミン酸を導入する請求項２
記載の^17,21,24Gla ヒトオステオカルシンまたはその塩
の製造方法。4. A method of synthesizing a peptide of human osteocalcin, which comprises the following formula (1): The γ-carboxyglutamic acid is introduced using a protected L-γ-carboxyglutamic acid represented by the formula (wherein tBu represents a tert-butyl group) or a salt thereof.
The method for producing ^17,21,24 Gla human osteocalcin or a salt thereof according to the description. 【請求項５】 ヒトオステオカルシンの免疫学的測定法
における標準物質用の請求項１記載の合成^21,24Glaヒト
オステオカルシン。5. The synthetic ^21,24 Gla human osteocalcin according to claim 1, which is used as a standard substance in an immunoassay for human osteocalcin. 【請求項６】 下記工程ａ〜ｈの組合せ 【化３】 （工程ａ〜ｈ中、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメチルオ
キシカルボニル基を、ｔＢｕはｔ−ブチル基を、Ｂｚｌ
はベンジル基を示す）による請求項３記載の式（１）で
示される保護Ｌ−γ−カルボキシグルタミン酸の製造方
法。6. A combination of the following steps a to h: (In steps a to h, Fmoc represents a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, tBu represents a t-butyl group, Bzl
Represents a benzyl group). The method for producing a protected L-γ-carboxyglutamic acid represented by the formula (1) according to claim 3.