JPH05310784A - ヒト乳頭腫ウイルスタンパク質と網膜芽細胞腫遺伝子タンパク質との結合のペプチド阻害剤 - Google Patents
ヒト乳頭腫ウイルスタンパク質と網膜芽細胞腫遺伝子タンパク質との結合のペプチド阻害剤Info
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- JPH05310784A JPH05310784A JP4233591A JP23359192A JPH05310784A JP H05310784 A JPH05310784 A JP H05310784A JP 4233591 A JP4233591 A JP 4233591A JP 23359192 A JP23359192 A JP 23359192A JP H05310784 A JPH05310784 A JP H05310784A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７タンパク質
から同定され、ＨＰＶ Ｅ７タンパクと網膜芽細胞腫遺
伝子（ＲＢＧ）によりコードされるタンパク質との結合
を有効に阻止する生化学的に純粋なポリペプチドに係
る。ポリペプチドはＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタ
ンパク質との生化学的相互作用のアンタゴニスト。 【効果】生殖器いぼ及び頚部癌の治療に有用である。
から同定され、ＨＰＶ Ｅ７タンパクと網膜芽細胞腫遺
伝子（ＲＢＧ）によりコードされるタンパク質との結合
を有効に阻止する生化学的に純粋なポリペプチドに係
る。ポリペプチドはＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタ
ンパク質との生化学的相互作用のアンタゴニスト。 【効果】生殖器いぼ及び頚部癌の治療に有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト乳頭腫ウイルスタ
ンパク質と網膜芽細胞腫遺伝子タンパク質との結合のペ
プチド阻害剤に係る。
ンパク質と網膜芽細胞腫遺伝子タンパク質との結合のペ
プチド阻害剤に係る。
【０００２】
【従来の技術】ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）は低分子
ＤＮＡを含むウイルスである。ＨＰＶは、シミアンウイ
ルス（ＳＶ４０）及びポリオーマウイルスのような類似
の低分子ＤＮＡを含むウイルスと共にパポーバウイルス
科に属するものとして分類される。２４種以上の遺伝的
に異なるＨＰＶ株が単離され、ハイブリダイゼーション
技術を使用するＤＮＡ配列相同により分類されている。
これらの株はＨＰＶ−１，ＨＰＶ−２等と呼称される。
種々の株は異なる疾患状態に関与すると思われる。ＨＰ
Ｖは人体で種々の上皮細胞増殖疾患の発生に関与又は寄
与するので医学的に重要である。例えば、ＨＰＶ株１６
及び１８の感染は頚部癌の発生に関連付けられる。ＨＰ
Ｖは頚部発癌のイニシエーターとして作用し、悪性変換
は他の因子との相互作用に依存すると予想されている。
ＨＰＶ株６及び１１の感染は生殖器いぼの発生に関連付
けられる。最近、男女両方で生殖器ＨＰＶ感染に関係す
る外来患者が著しく増加しており、３０歳以下の女性の
パパニコロー塗沫標本からＨＰＶの存在が検出されてい
ることから明らかなように、ＨＰＶ感染の発生率は増加
傾向にあると思われる。
ＤＮＡを含むウイルスである。ＨＰＶは、シミアンウイ
ルス（ＳＶ４０）及びポリオーマウイルスのような類似
の低分子ＤＮＡを含むウイルスと共にパポーバウイルス
科に属するものとして分類される。２４種以上の遺伝的
に異なるＨＰＶ株が単離され、ハイブリダイゼーション
技術を使用するＤＮＡ配列相同により分類されている。
これらの株はＨＰＶ−１，ＨＰＶ−２等と呼称される。
種々の株は異なる疾患状態に関与すると思われる。ＨＰ
Ｖは人体で種々の上皮細胞増殖疾患の発生に関与又は寄
与するので医学的に重要である。例えば、ＨＰＶ株１６
及び１８の感染は頚部癌の発生に関連付けられる。ＨＰ
Ｖは頚部発癌のイニシエーターとして作用し、悪性変換
は他の因子との相互作用に依存すると予想されている。
ＨＰＶ株６及び１１の感染は生殖器いぼの発生に関連付
けられる。最近、男女両方で生殖器ＨＰＶ感染に関係す
る外来患者が著しく増加しており、３０歳以下の女性の
パパニコロー塗沫標本からＨＰＶの存在が検出されてい
ることから明らかなように、ＨＰＶ感染の発生率は増加
傾向にあると思われる。
【０００３】特にＨＰＶ−１６、一般に乳頭腫ウイルス
の特徴は最近詳細に研究されている。ＨＰＶ−１６は７
９０４塩基対二重鎖ＤＮＡゲノムを含む（Ｓｉｅｄｏｒ
ｆ，Ｋ．，他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （１９８５） １４
５： １８１−１８５）。キャプシドは５０ｎｍであ
り、７２個のキャプソメアを含む（Ｋｌｕｇ，Ａ．，Ｊ
Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ （１９６５） １１： ４０３−
４２３）。更に、米国特許第４７７７２３９号は１７種
の合成ペプチドを開示しており、これらのペプチドがＨ
ＰＶ−１６に対する抗体を産生することが可能であり、
従って診断目的に有用であり得ると記載している。
の特徴は最近詳細に研究されている。ＨＰＶ−１６は７
９０４塩基対二重鎖ＤＮＡゲノムを含む（Ｓｉｅｄｏｒ
ｆ，Ｋ．，他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （１９８５） １４
５： １８１−１８５）。キャプシドは５０ｎｍであ
り、７２個のキャプソメアを含む（Ｋｌｕｇ，Ａ．，Ｊ
Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ （１９６５） １１： ４０３−
４２３）。更に、米国特許第４７７７２３９号は１７種
の合成ペプチドを開示しており、これらのペプチドがＨ
ＰＶ−１６に対する抗体を産生することが可能であり、
従って診断目的に有用であり得ると記載している。
【０００４】数種のＨＰＶタイプ、ウシ乳頭腫ウイルス
（ＢＰＶ）及びワタオウサギ乳頭腫ウイルス（ＣＲＰ
Ｖ）を含む数種の乳頭腫ウイルスのＤＮＡが配列決定さ
れている。これらのＤＮＡのすべてがオープンリーディ
ングフレームに関して類似のヌクレオチド配列パターン
を示す。オープンリーディングフレームは機能的に初期
領域（Ｅ）と後期領域（Ｌ）とに分割することができ、
Ｅ領域は複製及び形質転換に必要なタンパク質をコード
すると仮定され、Ｌ領域はウイルスキャプシドタンパク
質をコードすると仮定される（Ｄａｎｏｓ，Ｏ．，他、
Ｊ．ＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍ （１９８４）８３： ７ｓ
−１１ｓ）。
（ＢＰＶ）及びワタオウサギ乳頭腫ウイルス（ＣＲＰ
Ｖ）を含む数種の乳頭腫ウイルスのＤＮＡが配列決定さ
れている。これらのＤＮＡのすべてがオープンリーディ
ングフレームに関して類似のヌクレオチド配列パターン
を示す。オープンリーディングフレームは機能的に初期
領域（Ｅ）と後期領域（Ｌ）とに分割することができ、
Ｅ領域は複製及び形質転換に必要なタンパク質をコード
すると仮定され、Ｌ領域はウイルスキャプシドタンパク
質をコードすると仮定される（Ｄａｎｏｓ，Ｏ．，他、
Ｊ．ＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍ （１９８４）８３： ７ｓ
−１１ｓ）。
【０００５】ＨＰＶによりコードされる２種のタンパク
質Ｅ６及びＥ７は、ＨＰＶ誘発異常細胞増殖の病因に関
与すると考えられている。核酸配列から予想されるＨＰ
Ｖ−１６ Ｅ７タンパク質のアミノ酸配列は、Ｎ．Ｓａ
ｌｚｍａｎ及びＰ．Ｈａｗｌｅｙ， ”Ｔｈｅ Ｐａｐ
ｏｖａｖｉｒｉｄａｅ”， Ｖｏｌ．２， ｐ．３７
９， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． （１９
８７）に示されている。
質Ｅ６及びＥ７は、ＨＰＶ誘発異常細胞増殖の病因に関
与すると考えられている。核酸配列から予想されるＨＰ
Ｖ−１６ Ｅ７タンパク質のアミノ酸配列は、Ｎ．Ｓａ
ｌｚｍａｎ及びＰ．Ｈａｗｌｅｙ， ”Ｔｈｅ Ｐａｐ
ｏｖａｖｉｒｉｄａｅ”， Ｖｏｌ．２， ｐ．３７
９， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． （１９
８７）に示されている。
【０００６】Ｅ６及びＥ７タンパク質をコードするＨＰ
Ｖ遺伝子は、ＨＰＶ感染に関連付けられる頚部癌から抽
出した組織又は腫瘍細胞中で常に発現される。更に、Ｈ
ＰＶ−１６株に由来するＨＰＶ Ｅ６及びＥ７遺伝子
は、他のＨＰＶ遺伝子の不在下に細胞培養物中で上皮細
胞形質転換を誘導することが可能である。これらの所見
に基づき、ＨＰＶ感染により生じる細胞増殖の刺激の少
なくとも一部はＥ６及びＥ７ウイルスタンパク質に起因
すると考えられる。
Ｖ遺伝子は、ＨＰＶ感染に関連付けられる頚部癌から抽
出した組織又は腫瘍細胞中で常に発現される。更に、Ｈ
ＰＶ−１６株に由来するＨＰＶ Ｅ６及びＥ７遺伝子
は、他のＨＰＶ遺伝子の不在下に細胞培養物中で上皮細
胞形質転換を誘導することが可能である。これらの所見
に基づき、ＨＰＶ感染により生じる細胞増殖の刺激の少
なくとも一部はＥ６及びＥ７ウイルスタンパク質に起因
すると考えられる。
【０００７】ＨＰＶ Ｅ７タンパク質は、網膜芽細胞腫
遺伝子（ＲＢＧ）によりコードされるタンパク質と結合
することが示されている。ＲＢＧは、数種のヒト癌の増
殖調節に関与することが示されている。特に、ＲＢＧを
失活させる突然変異は異常又は増加細胞増殖に関連付け
られる。更に、全長ＲＢＧを欠失する腫瘍細胞に正常Ｒ
ＢＧを導入すると、細胞増殖が減少し、動物で腫瘍を形
成する能力も低下する。従って、ＨＰＶ Ｅ７タンパク
質と、それ自体細胞増殖及び分化の公知調節剤であるＲ
ＢＧタンパク質との結合は、Ｅ７タンパク質が細胞増殖
に影響する機序を提供する。Ｎ．Ｄｙｓｏｎ他、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４３： ９３４−９３６（１９８９）。
遺伝子（ＲＢＧ）によりコードされるタンパク質と結合
することが示されている。ＲＢＧは、数種のヒト癌の増
殖調節に関与することが示されている。特に、ＲＢＧを
失活させる突然変異は異常又は増加細胞増殖に関連付け
られる。更に、全長ＲＢＧを欠失する腫瘍細胞に正常Ｒ
ＢＧを導入すると、細胞増殖が減少し、動物で腫瘍を形
成する能力も低下する。従って、ＨＰＶ Ｅ７タンパク
質と、それ自体細胞増殖及び分化の公知調節剤であるＲ
ＢＧタンパク質との結合は、Ｅ７タンパク質が細胞増殖
に影響する機序を提供する。Ｎ．Ｄｙｓｏｎ他、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４３： ９３４−９３６（１９８９）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質との結
合を阻害する合成ペプチドを提供することである。本発
明の別の目的は、これらの合成ペプチド及び他の分子の
結合阻害活性をＨＰＶ Ｅ７−ＲＢＧタンパク質結合ア
ッセイで分析するための方法を提供することである。別
の目的は、これらの合成ペプチドを使用する生殖器いぼ
及び頚部癌の治療方法並びに合成ペプチドを含有する医
薬組成物を提供することである。
は、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質との結
合を阻害する合成ペプチドを提供することである。本発
明の別の目的は、これらの合成ペプチド及び他の分子の
結合阻害活性をＨＰＶ Ｅ７−ＲＢＧタンパク質結合ア
ッセイで分析するための方法を提供することである。別
の目的は、これらの合成ペプチドを使用する生殖器いぼ
及び頚部癌の治療方法並びに合成ペプチドを含有する医
薬組成物を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＨＰＶ Ｅ７
タンパク質とＲＢＧタンパク質との結合を阻害する新規
に合成された生化学的に純粋なポリペプチド（又はポリ
ペプチド類）を提供する。このポリペプチドはＨＰＶ
Ｅ７−ＲＢＧタンパク質相互作用のアッセイから同定さ
れた。本発明は更に、このポリペプチドを使用して生殖
器いぼ及び頚部癌を治療する方法も提供する。本発明の
新規ポリペプチドは、医薬組成物の成分として、スクリ
ーニングツールとして、更にはＨＰＶ誘発疾患又はＨＰ
Ｖ感染の阻害が有益な他の症状の予防及び治療において
有用である。
タンパク質とＲＢＧタンパク質との結合を阻害する新規
に合成された生化学的に純粋なポリペプチド（又はポリ
ペプチド類）を提供する。このポリペプチドはＨＰＶ
Ｅ７−ＲＢＧタンパク質相互作用のアッセイから同定さ
れた。本発明は更に、このポリペプチドを使用して生殖
器いぼ及び頚部癌を治療する方法も提供する。本発明の
新規ポリペプチドは、医薬組成物の成分として、スクリ
ーニングツールとして、更にはＨＰＶ誘発疾患又はＨＰ
Ｖ感染の阻害が有益な他の症状の予防及び治療において
有用である。
【００１０】１態様によると、本発明はＨＰＶ−１６の
注目領域から同定された次の配列：表Ａ ペプチドＡ：Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ
−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ （ＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質の残基２６〜３８を表
す、配列番号１）のペプチドに係る。
注目領域から同定された次の配列：表Ａ ペプチドＡ：Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ
−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ （ＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質の残基２６〜３８を表
す、配列番号１）のペプチドに係る。
【００１１】データによると、ペプチドＡは同定された
配列の単一ポリペプチドであるが、細胞環境内又は外に
ペプチドＡの相同体、イソ形又は遺伝的変異体が存在す
る可能性がある。本発明は、各々ＨＰＶ Ｅ７タンパク
質とＲＢＧタンパク質との結合を阻害するという条件下
でペプチドＡのこのような全相同体、イソ形又は遺伝的
変異体を包含する。ペプチドＡの相同体であるポリペプ
チドは特に、上記表Ａに示したアミノ酸配列を少なくと
も約４０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ま
しくは少なくとも約７５％維持するようなアミノ酸配列
を有する相同体を含む。
配列の単一ポリペプチドであるが、細胞環境内又は外に
ペプチドＡの相同体、イソ形又は遺伝的変異体が存在す
る可能性がある。本発明は、各々ＨＰＶ Ｅ７タンパク
質とＲＢＧタンパク質との結合を阻害するという条件下
でペプチドＡのこのような全相同体、イソ形又は遺伝的
変異体を包含する。ペプチドＡの相同体であるポリペプ
チドは特に、上記表Ａに示したアミノ酸配列を少なくと
も約４０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ま
しくは少なくとも約７５％維持するようなアミノ酸配列
を有する相同体を含む。
【００１２】ペプチドＡの他の変異体も本発明の範囲に
含まれることは当業者により理解されよう。このような
変異体は特に、保存性アミノ酸置換のみが合成ペプチド
Ａと異なる全変異体を含む。多くのこのような保存性ア
ミノ酸置換はＴａｙｌｏｒ，Ｗ．Ｒ．， Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ． １８８， ２３３ （１９８６）に記載さ
れている。
含まれることは当業者により理解されよう。このような
変異体は特に、保存性アミノ酸置換のみが合成ペプチド
Ａと異なる全変異体を含む。多くのこのような保存性ア
ミノ酸置換はＴａｙｌｏｒ，Ｗ．Ｒ．， Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ． １８８， ２３３ （１９８６）に記載さ
れている。
【００１３】本明細書において、ペプチドＡ又はそのフ
ラグメントは、精製後のポリペプチドがＨＰＶ Ｅ７タ
ンパク質とＲＢＧタンパク質との結合を阻害するという
条件下で、保存性アミノ酸置換、欠失又は他の処理によ
りアミノ酸配列中に得られるこのような任意の変異を含
む。例えば、実施例３に記載するペプチドＣは、２個の
アミノ酸を欠失するペプチドＡの誘導体である。ペプチ
ドＣは、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質と
の結合を阻害するというペプチドＡの活性を維持してい
る。該ポリペプチドがＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧ
タンパク質との結合を阻害し、該配列が表Ａに示した配
列に基づくものである限り、ペプチドＡのフラグメント
はアミノ酸数４個以上の配列を有する低分子ペプチドで
あり得る。
ラグメントは、精製後のポリペプチドがＨＰＶ Ｅ７タ
ンパク質とＲＢＧタンパク質との結合を阻害するという
条件下で、保存性アミノ酸置換、欠失又は他の処理によ
りアミノ酸配列中に得られるこのような任意の変異を含
む。例えば、実施例３に記載するペプチドＣは、２個の
アミノ酸を欠失するペプチドＡの誘導体である。ペプチ
ドＣは、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質と
の結合を阻害するというペプチドＡの活性を維持してい
る。該ポリペプチドがＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧ
タンパク質との結合を阻害し、該配列が表Ａに示した配
列に基づくものである限り、ペプチドＡのフラグメント
はアミノ酸数４個以上の配列を有する低分子ペプチドで
あり得る。
【００１４】ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク
質との結合を阻害し且つ表Ａに示したような部分的アミ
ノ酸配列又はその保存性置換を含むものであれば、ペプ
チドＡよりも高分子のポリペプチドも本発明の範囲に含
まれる。
質との結合を阻害し且つ表Ａに示したような部分的アミ
ノ酸配列又はその保存性置換を含むものであれば、ペプ
チドＡよりも高分子のポリペプチドも本発明の範囲に含
まれる。
【００１５】ペプチドＡのアミノ酸配列の利用価値が高
いことは当業者に容易に理解されよう。例えば、アミノ
酸配列からオリゴヌクレオチドプローブを構築し、ペプ
チドＡをコードするｃＤＮＡクローンをスクリーニング
するために使用することができる。ペプチドＡを含むこ
れらのクローンｃＤＮＡを使用してｍＲＮＡを転写さ
せ、翻訳及び発現させることができる。ペプチドＡによ
るこの操作は、遺伝子工学により大量のペプチドＡを製
造するため、又はペプチドＡの遺伝学を研究してその細
胞での役割を解明するために使用することができる。
いことは当業者に容易に理解されよう。例えば、アミノ
酸配列からオリゴヌクレオチドプローブを構築し、ペプ
チドＡをコードするｃＤＮＡクローンをスクリーニング
するために使用することができる。ペプチドＡを含むこ
れらのクローンｃＤＮＡを使用してｍＲＮＡを転写さ
せ、翻訳及び発現させることができる。ペプチドＡによ
るこの操作は、遺伝子工学により大量のペプチドＡを製
造するため、又はペプチドＡの遺伝学を研究してその細
胞での役割を解明するために使用することができる。
【００１６】更に、ペプチドＡの薬理特性を改善するた
めに合成ポリペプチドを製造することもできる。これら
の合成ペプチドは下記固相ペプチド合成技術により製造
することができる。
めに合成ポリペプチドを製造することもできる。これら
の合成ペプチドは下記固相ペプチド合成技術により製造
することができる。
【００１７】更に、このアミノ酸配列を使用してポリペ
プチドを製造し、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタン
パク質との結合に対して阻害効果を示す非ペプチド分子
の同定用スクリーン又はツールとして使用することもで
きる。
プチドを製造し、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタン
パク質との結合に対して阻害効果を示す非ペプチド分子
の同定用スクリーン又はツールとして使用することもで
きる。
【００１８】上記ペプチドは末端に種々の化学的修飾を
有していてもよく、このようなペプチドも本発明の範囲
に含まれる。特に、Ｃ末端にアミド基を有するペプチド
も有さないペプチドも製造することができる。Ｃ末端に
アミド基を有するペプチドを製造する場合、ペプチドは
先行するアミノ酸残基のカルボニル部分に共有結合した
カルボキシ末端アミド基を有する。ペプチドは更に、Ｎ
末端でアミノ酸に共有結合したアセチル基を有していて
もよい。特に環状及び二量体構造をもたらすような他の
化学的修飾も可能である。
有していてもよく、このようなペプチドも本発明の範囲
に含まれる。特に、Ｃ末端にアミド基を有するペプチド
も有さないペプチドも製造することができる。Ｃ末端に
アミド基を有するペプチドを製造する場合、ペプチドは
先行するアミノ酸残基のカルボニル部分に共有結合した
カルボキシ末端アミド基を有する。ペプチドは更に、Ｎ
末端でアミノ酸に共有結合したアセチル基を有していて
もよい。特に環状及び二量体構造をもたらすような他の
化学的修飾も可能である。
【００１９】本発明のポリペプチドは、ＨＰＶにより人
体に誘発される生殖器いぼ、頚部癌又は他の症状の治療
に有用である。本発明のポリペプチドは、ＨＰＶ又はＲ
ＢＧタンパク質に関連する疾患及び他の上記症状の治療
又は予防用医薬組成物に配合され得る。
体に誘発される生殖器いぼ、頚部癌又は他の症状の治療
に有用である。本発明のポリペプチドは、ＨＰＶ又はＲ
ＢＧタンパク質に関連する疾患及び他の上記症状の治療
又は予防用医薬組成物に配合され得る。
【００２０】別の態様によると本発明は、上記ペプチド
に免疫原性を与えることが可能なキャリヤーに結合した
上記ペプチド、これらのペプチドに対する抗血清及び該
抗血清に含まれる抗体に係る。
に免疫原性を与えることが可能なキャリヤーに結合した
上記ペプチド、これらのペプチドに対する抗血清及び該
抗血清に含まれる抗体に係る。
【００２１】本発明のペプチドは、ＨＰＶによる感染に
対する保護が所望される被検者の体内で抗体を産生させ
るため、即ちワクチンとして使用してもよいし、又は既
存のＨＰＶ感染に対する免疫応答を高めるために使用し
てもよい。抗血清を得るために本発明のペプチドを産生
種に注入してもよい。産生被検者で得られるポリクロー
ナル抗血清の代わりに、標準方法又はより新式の変形方
法を用いて抗体産生クローンを得るために動物に注入す
るための脾細胞もしくは他の抗体産生細胞を不滅化する
ことにより、モノクローナル抗体を製造することができ
る。種間の差異を補正するならば、得られたポリクロー
ナル又はモノクローナル抗体を治療薬として使用するこ
ともできる。
対する保護が所望される被検者の体内で抗体を産生させ
るため、即ちワクチンとして使用してもよいし、又は既
存のＨＰＶ感染に対する免疫応答を高めるために使用し
てもよい。抗血清を得るために本発明のペプチドを産生
種に注入してもよい。産生被検者で得られるポリクロー
ナル抗血清の代わりに、標準方法又はより新式の変形方
法を用いて抗体産生クローンを得るために動物に注入す
るための脾細胞もしくは他の抗体産生細胞を不滅化する
ことにより、モノクローナル抗体を製造することができ
る。種間の差異を補正するならば、得られたポリクロー
ナル又はモノクローナル抗体を治療薬として使用するこ
ともできる。
【００２２】タンパク質を宿主に直接投与すると、ＨＰ
Ｖに対する保護免疫を与えることができ、又は被検者が
既に感染している場合には、疾患の進行をより有効に抑
制するために被検者自身の免疫応答を助長することがで
きる。あらゆる用途でペプチドは免疫原形態で投与され
る。ペプチドは比較的短いので、免疫原性を与えるキャ
リヤー材料と結合することが必要であり得る。このキャ
リヤー材料は理想的には抗原的に中性であるべきであ
り、即ちそれ自体に対する抗体を産生できないものであ
るべきである。現状で満足できる多くのキャリヤーは宿
主中で抗体を産生させることが可能な抗原領域を含むの
で、抗原的中性は当然理想状態である。しかしながら、
抗原領域が非常に得易い該当ペプチドの抗原領域と実際
に異なる場合、又はキャリヤー部分に対する抗体が被検
者に無害である場合は、とりあえず許容可能である。
Ｖに対する保護免疫を与えることができ、又は被検者が
既に感染している場合には、疾患の進行をより有効に抑
制するために被検者自身の免疫応答を助長することがで
きる。あらゆる用途でペプチドは免疫原形態で投与され
る。ペプチドは比較的短いので、免疫原性を与えるキャ
リヤー材料と結合することが必要であり得る。このキャ
リヤー材料は理想的には抗原的に中性であるべきであ
り、即ちそれ自体に対する抗体を産生できないものであ
るべきである。現状で満足できる多くのキャリヤーは宿
主中で抗体を産生させることが可能な抗原領域を含むの
で、抗原的中性は当然理想状態である。しかしながら、
抗原領域が非常に得易い該当ペプチドの抗原領域と実際
に異なる場合、又はキャリヤー部分に対する抗体が被検
者に無害である場合は、とりあえず許容可能である。
【００２３】本発明のポリペプチドの予防薬又は治療薬
としての投与量は当然のことながら、患者群（年齢、性
別等）、処置すべき症状の重度、本発明のポリペプチド
の種類及びその投与経路により異なる。一般に、１日の
使用量は哺乳動物１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２
０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約
５ｍｇ／ｋｇ体重である。
としての投与量は当然のことながら、患者群（年齢、性
別等）、処置すべき症状の重度、本発明のポリペプチド
の種類及びその投与経路により異なる。一般に、１日の
使用量は哺乳動物１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２
０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約
５ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００２４】哺乳動物、特に人体に有効量の本発明のポ
リペプチドを与えるために、任意の適切な投与経路を使
用することができる。例えば、経口、直腸、膣、局所、
腸管外、眼、鼻、舌下、頬、静脈内等の経路を使用する
ことができる。製剤形態はタブレット、トローチ、分散
液、懸濁液、溶液、カプセル、クリーム、軟膏、座薬、
エアゾール等を含む。製剤形態は更に、この目的にあわ
せて特別に設計された埋没徐放装置又はこの方法で補助
的に機能するように修正された他のインプラント形態も
含む。
リペプチドを与えるために、任意の適切な投与経路を使
用することができる。例えば、経口、直腸、膣、局所、
腸管外、眼、鼻、舌下、頬、静脈内等の経路を使用する
ことができる。製剤形態はタブレット、トローチ、分散
液、懸濁液、溶液、カプセル、クリーム、軟膏、座薬、
エアゾール等を含む。製剤形態は更に、この目的にあわ
せて特別に設計された埋没徐放装置又はこの方法で補助
的に機能するように修正された他のインプラント形態も
含む。
【００２５】本発明の医薬組成物は、有効成分として本
発明のポリペプチド又はその薬学的に許容可能な塩を含
有し、更に薬学的に許容可能なキャリヤー及び場合によ
り他の治療成分を含有し得る。「薬学的に許容可能な
塩」なる用語は、無機塩基及び有機塩基を含む薬学的に
許容可能な非毒性塩基から調製される塩を意味する。組
成物は、経口、直腸、眼、肺、鼻、膣、舌下、皮膚、局
所又は腸管外（皮下、粘膜下、筋肉内、静脈内及び動脈
内を含む）投与に適切な組成物を含むが、任意の所与の
場合に最適な経路は、処置される症状の種類及び重度並
びに有効成分の種類に依存する。組成物は単位投与形態
で適宜調製され、製薬業界で公知の任意方法により製造
され得る。
発明のポリペプチド又はその薬学的に許容可能な塩を含
有し、更に薬学的に許容可能なキャリヤー及び場合によ
り他の治療成分を含有し得る。「薬学的に許容可能な
塩」なる用語は、無機塩基及び有機塩基を含む薬学的に
許容可能な非毒性塩基から調製される塩を意味する。組
成物は、経口、直腸、眼、肺、鼻、膣、舌下、皮膚、局
所又は腸管外（皮下、粘膜下、筋肉内、静脈内及び動脈
内を含む）投与に適切な組成物を含むが、任意の所与の
場合に最適な経路は、処置される症状の種類及び重度並
びに有効成分の種類に依存する。組成物は単位投与形態
で適宜調製され、製薬業界で公知の任意方法により製造
され得る。
【００２６】吸入により投与する場合、本発明のポリペ
プチドは加圧パックもしくはネブライザからのエアゾー
ルスプレー、又は適切な装置により粉末組成物を吸入さ
せることが可能なカートリッジとして調製され得る粉末
の形態で適宜放出される。吸入用好適放出システムは、
フルオロカーボン噴射剤中懸濁液又は溶液として調合さ
れ得る所定量吸入（ＭＤＩ）エアゾールである。
プチドは加圧パックもしくはネブライザからのエアゾー
ルスプレー、又は適切な装置により粉末組成物を吸入さ
せることが可能なカートリッジとして調製され得る粉末
の形態で適宜放出される。吸入用好適放出システムは、
フルオロカーボン噴射剤中懸濁液又は溶液として調合さ
れ得る所定量吸入（ＭＤＩ）エアゾールである。
【００２７】適切な局所製剤は、経皮装置、エアゾー
ル、クリーム、軟膏、ローション、散剤等を含む。
ル、クリーム、軟膏、ローション、散剤等を含む。
【００２８】実際の使用では、本発明のポリペプチドは
有効成分として慣用製薬配合技術に従って医薬キャリヤ
ーと緊密に混合され得る。キャリヤーは、例えば経口又
は非経口（静脈内及び動脈内を含む）投与に所望される
製剤形態に依存して種々の形態をとり得る。経口投与用
組成物を製造する際には通常の医薬キャリヤーを使用す
ることができ、例えば懸濁液、エリキシル剤及び溶液の
ような経口液体製剤の場合には、水、グリコール、油、
アルコール、矯味矯臭剤、保存剤、着色剤等を使用する
ことができ、例えば粉末、カプセル及びタブレットのよ
うな固体製剤の場合には、澱粉、糖類、微結晶セルロー
ス、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等のよう
なキャリヤーを使用することができる。投与し易いとい
う理由からタブレット及びカプセルが最も有利な経口投
与単位製剤であり、この場合、当然固体医薬キャリヤー
が使用される。必要に応じて、慣用技術によりタブレッ
トを糖衣又は腸溶コーティングしてもよい。
有効成分として慣用製薬配合技術に従って医薬キャリヤ
ーと緊密に混合され得る。キャリヤーは、例えば経口又
は非経口（静脈内及び動脈内を含む）投与に所望される
製剤形態に依存して種々の形態をとり得る。経口投与用
組成物を製造する際には通常の医薬キャリヤーを使用す
ることができ、例えば懸濁液、エリキシル剤及び溶液の
ような経口液体製剤の場合には、水、グリコール、油、
アルコール、矯味矯臭剤、保存剤、着色剤等を使用する
ことができ、例えば粉末、カプセル及びタブレットのよ
うな固体製剤の場合には、澱粉、糖類、微結晶セルロー
ス、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等のよう
なキャリヤーを使用することができる。投与し易いとい
う理由からタブレット及びカプセルが最も有利な経口投
与単位製剤であり、この場合、当然固体医薬キャリヤー
が使用される。必要に応じて、慣用技術によりタブレッ
トを糖衣又は腸溶コーティングしてもよい。
【００２９】上記一般投与形態以外に、本発明のポリペ
プチドは制御放出手段及び／又はデリバリ装置により投
与することもできる。
プチドは制御放出手段及び／又はデリバリ装置により投
与することもできる。
【００３０】経口投与に適切な本発明の医薬組成物は、
粉末、顆粒、又は水性液体、非水性液体、Ｏ／Ｗエマル
ジョンもしくはＷ／Ｏ液体エマルジョン中の溶液もしく
は懸濁液として所定量の有効成分を各々含むカプセル、
カシェ剤又はタブレットのような不連続単位として製造
され得る。このような組成物は任意の製薬方法により製
造され得るが、いずれの場合も、１種以上の必要成分を
構成するキャリヤーに有効成分を配合する段階を含む。
一般に、組成物は有効成分を液体キャリヤー又は微粉固
体キャリヤー又はその両方と均質且つ緊密に混合し、そ
の後、必要に応じて生成物を所望の形態に成形すること
により調製される。例えばタブレットは、場合により１
種以上の補助成分と共に圧縮又は成形することにより調
製され得る。圧縮錠剤は、粉末又は顆粒のような自由流
動形態の有効成分を場合により結合剤、潤滑剤、不活性
希釈剤、界面活性剤又は分散剤と混合して適切な機械で
圧縮することにより調製され得る。すりこみ錠剤は、不
活性液体希釈剤で湿潤させた粉末化合物の混合物を適切
な機械で成形することにより調製され得る。
粉末、顆粒、又は水性液体、非水性液体、Ｏ／Ｗエマル
ジョンもしくはＷ／Ｏ液体エマルジョン中の溶液もしく
は懸濁液として所定量の有効成分を各々含むカプセル、
カシェ剤又はタブレットのような不連続単位として製造
され得る。このような組成物は任意の製薬方法により製
造され得るが、いずれの場合も、１種以上の必要成分を
構成するキャリヤーに有効成分を配合する段階を含む。
一般に、組成物は有効成分を液体キャリヤー又は微粉固
体キャリヤー又はその両方と均質且つ緊密に混合し、そ
の後、必要に応じて生成物を所望の形態に成形すること
により調製される。例えばタブレットは、場合により１
種以上の補助成分と共に圧縮又は成形することにより調
製され得る。圧縮錠剤は、粉末又は顆粒のような自由流
動形態の有効成分を場合により結合剤、潤滑剤、不活性
希釈剤、界面活性剤又は分散剤と混合して適切な機械で
圧縮することにより調製され得る。すりこみ錠剤は、不
活性液体希釈剤で湿潤させた粉末化合物の混合物を適切
な機械で成形することにより調製され得る。
【００３１】ペプチドをワクチンとして投与しようとす
る場合、ペプチドは保護すべき被検者にこのような投与
を行うための慣用方法に従って調合される。抗体を治療
目的に使用する場合には、処置すべき被検者に適合可能
な種特性を与えることが一般に望ましい。従って、適切
なパートナーとの融合体は分泌されるモノクローナル抗
体に所望の特性を与えることができるので、多くの場合
はこれらの抗体をモノクローナル形態で製造することが
望ましい。
る場合、ペプチドは保護すべき被検者にこのような投与
を行うための慣用方法に従って調合される。抗体を治療
目的に使用する場合には、処置すべき被検者に適合可能
な種特性を与えることが一般に望ましい。従って、適切
なパートナーとの融合体は分泌されるモノクローナル抗
体に所望の特性を与えることができるので、多くの場合
はこれらの抗体をモノクローナル形態で製造することが
望ましい。
【００３２】設計後、本発明のペプチドは適切な手段に
より、一般には固相技術を使用する化学的ペプチド合成
により製造される。キャリヤータンパク質に結合させる
ためには、付加的な官能性（例えば適切な結合を提供す
るためにＣ末端のシステイン残基）を有するこれらのペ
プチドを合成すると適切である。しかしながら、使用さ
れるリンカーの種類に依存して複合体を形成するために
他のアプローチも可能である。その後、複合ペプチドを
被検動物に投与する。
より、一般には固相技術を使用する化学的ペプチド合成
により製造される。キャリヤータンパク質に結合させる
ためには、付加的な官能性（例えば適切な結合を提供す
るためにＣ末端のシステイン残基）を有するこれらのペ
プチドを合成すると適切である。しかしながら、使用さ
れるリンカーの種類に依存して複合体を形成するために
他のアプローチも可能である。その後、複合ペプチドを
被検動物に投与する。
【００３３】ペプチド合成 本明細書において「ペプチド」、「ポリペプチド」及び
「タンパク質」なる用語は交換可能に使用され、中性
（非荷電）形態又は塩形態であり、グリコシル化、側鎖
酸化もしくはリン酸化のような修飾を含まないか又はこ
れらの修飾を含む種々の長さのアミノ酸配列を意味す
る。当業者には周知のように、アミノ酸配列は酸性又は
塩基性基を含み、ペプチドにより示される特定のイオン
化状態は、タンパク質が溶液状態の場合には周囲媒体の
ｐＨに依存し、タンパク質が固体形態の場合にはタンパ
ク質を取り出した媒体のｐＨに依存する。アミノ酸側鎖
に結合した付加的置換基（例えばグリコシル単位、脂
質）又は無機イオン（リン酸イオン）により修飾された
タンパク質や、鎖の化学的変換に関する修飾（例えばス
ルフヒドリル基の酸化）も定義に含まれる。従って、
「ペプチド」又はその相当用語は、生物学的特性を損な
わないような上記修飾を施された適切なアミノ酸配列を
包含する。
「タンパク質」なる用語は交換可能に使用され、中性
（非荷電）形態又は塩形態であり、グリコシル化、側鎖
酸化もしくはリン酸化のような修飾を含まないか又はこ
れらの修飾を含む種々の長さのアミノ酸配列を意味す
る。当業者には周知のように、アミノ酸配列は酸性又は
塩基性基を含み、ペプチドにより示される特定のイオン
化状態は、タンパク質が溶液状態の場合には周囲媒体の
ｐＨに依存し、タンパク質が固体形態の場合にはタンパ
ク質を取り出した媒体のｐＨに依存する。アミノ酸側鎖
に結合した付加的置換基（例えばグリコシル単位、脂
質）又は無機イオン（リン酸イオン）により修飾された
タンパク質や、鎖の化学的変換に関する修飾（例えばス
ルフヒドリル基の酸化）も定義に含まれる。従って、
「ペプチド」又はその相当用語は、生物学的特性を損な
わないような上記修飾を施された適切なアミノ酸配列を
包含する。
【００３４】本発明の全ペプチドは十分に短いので、当
業界で慣用の方法を使用して化学的に合成することがで
きる。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（“Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓ
ｅＰｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， Ａｄｖａ
ｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ３２：２２
１−２９６， １９６９）； Ｇ．Ｂａｒｎａｙ及び
Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ “Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａ
ｓｅ ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ”， Ｔｈｅ
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ｖｏｌ．２， Ｅ．Ｇｒｏｓｓ
及びＪ．Ｍｅｒｅｎｈｏｌｅ編（１９８０）を参照され
たい。この方法は固体支持体にペプチドのカルボキシル
末端を共有結合させる原理に基づく。所望のペプチド配
列は、単一アミノ酸がカルボキシル末端からアミノ末端
に向かって成長するペプチド鎖に段階的にカップリング
することにより製造される。カップリングは典型的に
は、ブロックされた他の潜在的に反応性の基を有し得る
樹脂に結合されたアミノ酸のカルボキシル基の活性化に
より達せられる。成長中のポリペプチド鎖にアミノ酸を
加えた後、更に鎖が伸長する前に、典型的には保護基を
除去する。各アミノ酸はほぼ同一系列の反応によりカッ
プリングされるので、合成における綿密な条件探索はさ
して必要でない。ペプチドは固体支持体に結合している
ので、溶解度は合成中に大きな問題とならない。この方
法は迅速であり、簡単に使用することができる。この方
法は、１回の合成をアミノ末端の近傍で複数の方向に分
岐することができるので、アミノ末端置換を有する複数
の類似体の合成に非常に適しており、アミノ末端領域の
みが異なる多数の類似体を作成することができる。
業界で慣用の方法を使用して化学的に合成することがで
きる。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（“Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓ
ｅＰｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， Ａｄｖａ
ｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ３２：２２
１−２９６， １９６９）； Ｇ．Ｂａｒｎａｙ及び
Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ “Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａ
ｓｅ ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ”， Ｔｈｅ
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ｖｏｌ．２， Ｅ．Ｇｒｏｓｓ
及びＪ．Ｍｅｒｅｎｈｏｌｅ編（１９８０）を参照され
たい。この方法は固体支持体にペプチドのカルボキシル
末端を共有結合させる原理に基づく。所望のペプチド配
列は、単一アミノ酸がカルボキシル末端からアミノ末端
に向かって成長するペプチド鎖に段階的にカップリング
することにより製造される。カップリングは典型的に
は、ブロックされた他の潜在的に反応性の基を有し得る
樹脂に結合されたアミノ酸のカルボキシル基の活性化に
より達せられる。成長中のポリペプチド鎖にアミノ酸を
加えた後、更に鎖が伸長する前に、典型的には保護基を
除去する。各アミノ酸はほぼ同一系列の反応によりカッ
プリングされるので、合成における綿密な条件探索はさ
して必要でない。ペプチドは固体支持体に結合している
ので、溶解度は合成中に大きな問題とならない。この方
法は迅速であり、簡単に使用することができる。この方
法は、１回の合成をアミノ末端の近傍で複数の方向に分
岐することができるので、アミノ末端置換を有する複数
の類似体の合成に非常に適しており、アミノ末端領域の
みが異なる多数の類似体を作成することができる。
【００３５】組換ＤＮＡ技術は、所望のペプチドを合成
する代替方法を提供する。所望のペプチド又はタンパク
質のＤＮＡコーディング配列を、受容体細胞を形質転換
させるのに適切な発現ベクターに連結し、こうして受容
体細胞に遺伝子を発現させ、タンパク質を産生させる。
ＤＮＡコーディング配列は十分短いので、当業者に公知
の手段を使用して合成することができる。
する代替方法を提供する。所望のペプチド又はタンパク
質のＤＮＡコーディング配列を、受容体細胞を形質転換
させるのに適切な発現ベクターに連結し、こうして受容
体細胞に遺伝子を発現させ、タンパク質を産生させる。
ＤＮＡコーディング配列は十分短いので、当業者に公知
の手段を使用して合成することができる。
【００３６】コーディング配列を、所望のコーディング
配列の挿入に適切な制限部位を含むプラスミド中で組換
宿主に適合可能な調節配列の制御下におく。あるいは、
適切な調節配列、ベクター及び形質転換技術を使用して
細菌性又は非細菌性（即ち酵母）の組換宿主中でこれら
のペプチドを産生させることもできる。
配列の挿入に適切な制限部位を含むプラスミド中で組換
宿主に適合可能な調節配列の制御下におく。あるいは、
適切な調節配列、ベクター及び形質転換技術を使用して
細菌性又は非細菌性（即ち酵母）の組換宿主中でこれら
のペプチドを産生させることもできる。
【００３７】ＨＰＶ Ｅ７タンパク質−ＲＢＧタンパク
質相互作用のアンタゴニストを同定するために、ＨＰＶ
−１６ Ｅ７タンパク質のアミノ酸配列を試験した。Ｈ
ＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質のアミノ酸配列（配列番号
２）を下記表Ｂに示す。
質相互作用のアンタゴニストを同定するために、ＨＰＶ
−１６ Ｅ７タンパク質のアミノ酸配列を試験した。Ｈ
ＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質のアミノ酸配列（配列番号
２）を下記表Ｂに示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】Ｅ７タンパク質がＲＢＧタンパク質に結合
するのを妨害し得るペプチド配列を提供するように、こ
のタンパク質の数個の別々の領域を選択した。合成及び
試験したペプチドのうちの２種の配列を表Ｂでは下線で
示した。これらの下線で示した配列に対応するペプチド
を実施例１に記載するように合成及び単離した。その
後、実施例２に記載するように、精製ペプチドがＨＰＶ
Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質との結合を阻害す
る能力をアッセイした。
するのを妨害し得るペプチド配列を提供するように、こ
のタンパク質の数個の別々の領域を選択した。合成及び
試験したペプチドのうちの２種の配列を表Ｂでは下線で
示した。これらの下線で示した配列に対応するペプチド
を実施例１に記載するように合成及び単離した。その
後、実施例２に記載するように、精製ペプチドがＨＰＶ
Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質との結合を阻害す
る能力をアッセイした。
【００４０】ＨＰＶ Ｅ７タンパク質に無関係の別のペ
プチドも同様にＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパ
ク質との結合を阻害する能力について試験した。この別
のペプチドはヒトガストリン放出ペプチドの最後の８個
のアミノ酸残基（アセチル−ＧＲＰ ２０−２７）から
構成される。このＧＲＰペプチドはＨｅｉｍｂｒｏｏｋ
他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３： ７０１６−
７０１９，１９８８に記載されている。
プチドも同様にＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパ
ク質との結合を阻害する能力について試験した。この別
のペプチドはヒトガストリン放出ペプチドの最後の８個
のアミノ酸残基（アセチル−ＧＲＰ ２０−２７）から
構成される。このＧＲＰペプチドはＨｅｉｍｂｒｏｏｋ
他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３： ７０１６−
７０１９，１９８８に記載されている。
【００４１】ペプチドＡのみがＨＰＶ Ｅ７タンパク質
とＲＢＧタンパク質との結合を阻害した。配列Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐ
ｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ａｓ
ｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ（配列番号３）を有するペプチドＢ
も、アセチル−ＧＲＰ ２０−２７ペプチドも、ＨＰＶ
Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質との結合を阻害し
なかった。これらの実験の結果、配列Ｔｈｒ−Ａｓｐ−
Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌ
ｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ＮＨ2（配列
番号１）のペプチドは、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢ
Ｇ産物との結合を阻止する能力を有することが判明し
た。これらの実験から更に、Ｅ７タンパク質の種々の領
域又は他のタンパク質から同定された他のペプチドがＨ
ＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質との結合を阻
害できないことも判明した。
とＲＢＧタンパク質との結合を阻害した。配列Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐ
ｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ａｓ
ｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ（配列番号３）を有するペプチドＢ
も、アセチル−ＧＲＰ ２０−２７ペプチドも、ＨＰＶ
Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質との結合を阻害し
なかった。これらの実験の結果、配列Ｔｈｒ−Ａｓｐ−
Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌ
ｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ＮＨ2（配列
番号１）のペプチドは、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢ
Ｇ産物との結合を阻止する能力を有することが判明し
た。これらの実験から更に、Ｅ７タンパク質の種々の領
域又は他のタンパク質から同定された他のペプチドがＨ
ＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質との結合を阻
害できないことも判明した。
【００４２】
【実施例】以下、実施例により本発明を非限定的に説明
する。
する。
【００４３】実施例１ ＨＰＶ Ｅ７ペプチドの合成 ＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質の種々の領域を表すペプ
チドを合成した。これらのペプチドの配列は、表Ｂに示
すようなＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質の別個のセグメ
ントのアミノ酸配列からとり出した。ペプチドをペプチ
ドＡ及びペプチドＢと命名した。ペプチドＡは配列：Ｔ
ｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ
−ＮＨ2（式中、１３位のセリン残基に結合したアミド
基はセリン残基のカルボニル部分に共有結合したカルボ
キシ末端アミド基を表す）（配列番号１）を有する。
チドを合成した。これらのペプチドの配列は、表Ｂに示
すようなＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質の別個のセグメ
ントのアミノ酸配列からとり出した。ペプチドをペプチ
ドＡ及びペプチドＢと命名した。ペプチドＡは配列：Ｔ
ｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ
−ＮＨ2（式中、１３位のセリン残基に結合したアミド
基はセリン残基のカルボニル部分に共有結合したカルボ
キシ末端アミド基を表す）（配列番号１）を有する。
【００４４】ペプチドＢは配列：Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ
−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−
Ｖａｌ（式中、１６位のバリン残基はカルボン酸塩とし
て組み込んだ）（配列番号３）を有する。
ａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ
−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−
Ｖａｌ（式中、１６位のバリン残基はカルボン酸塩とし
て組み込んだ）（配列番号３）を有する。
【００４５】ペプチドＡはＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク
質（配列番号２）の残基２６〜３８に対応する。ペプチ
ドＢはＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質の残基４６〜６１
に対応する。これらのペプチドは、Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉ
ｆｉｅｌｄ， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：
２１４９−２１５４ １９６３及びＪ．Ｍ．Ｓｔｅｗａ
ｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ
Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，
Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ． Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｅｆ
ｏｒｄ， Ｉ１１．，２ｎｄ ｅｄ．，１９８４に記載
されているように固相ペプチド化学技術を使用して合成
した。実際の合成は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａペプチド合成器で行った。
ペプチドＡはｐ−メチル−ベンズヒドリルアミン樹脂上
で合成した。この樹脂を使用すると、フッ化水素で開裂
することによりカルボキシ末端アミド化ペプチドを単離
することができる。ペプチドＢはアミノアシル−フェニ
ルアセトアミドメチル樹脂上で合成した。この樹脂を使
用すると、カルボキシ末端アミノ酸残基に遊離カルボン
酸基を有するペプチドを単離することができる。どちら
のペプチドも保護側鎖基を有する市販のＢＯＣアミノ酸
を使用して合成した。樹脂結合ペプチドの開裂及び脱保
護は、液体フッ化水素を含有するスカベンジャーで処理
することにより行った。開裂させたペプチドの精製は、
Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８カラムを使用して逆相高性能液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行った。ＨＰＬ
Ｃを使用する精製方法は、Ｊ．Ｒｉｖｉｅｒ他、Ｊ．Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２８８： ３０３−３２８ １９
８４に記載されている。単離後、Ｂｅｃｋｍａｎ ６３
００アミノ酸アナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉａ）を使用するアミノ酸分析により各ペプチド
の組成を実証した。
質（配列番号２）の残基２６〜３８に対応する。ペプチ
ドＢはＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質の残基４６〜６１
に対応する。これらのペプチドは、Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉ
ｆｉｅｌｄ， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：
２１４９−２１５４ １９６３及びＪ．Ｍ．Ｓｔｅｗａ
ｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ
Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，
Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ． Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｅｆ
ｏｒｄ， Ｉ１１．，２ｎｄ ｅｄ．，１９８４に記載
されているように固相ペプチド化学技術を使用して合成
した。実際の合成は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａペプチド合成器で行った。
ペプチドＡはｐ−メチル−ベンズヒドリルアミン樹脂上
で合成した。この樹脂を使用すると、フッ化水素で開裂
することによりカルボキシ末端アミド化ペプチドを単離
することができる。ペプチドＢはアミノアシル−フェニ
ルアセトアミドメチル樹脂上で合成した。この樹脂を使
用すると、カルボキシ末端アミノ酸残基に遊離カルボン
酸基を有するペプチドを単離することができる。どちら
のペプチドも保護側鎖基を有する市販のＢＯＣアミノ酸
を使用して合成した。樹脂結合ペプチドの開裂及び脱保
護は、液体フッ化水素を含有するスカベンジャーで処理
することにより行った。開裂させたペプチドの精製は、
Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８カラムを使用して逆相高性能液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行った。ＨＰＬ
Ｃを使用する精製方法は、Ｊ．Ｒｉｖｉｅｒ他、Ｊ．Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２８８： ３０３−３２８ １９
８４に記載されている。単離後、Ｂｅｃｋｍａｎ ６３
００アミノ酸アナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉａ）を使用するアミノ酸分析により各ペプチド
の組成を実証した。
【００４６】実施例２ 合成ペプチドの結合阻害活性 ＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質との
結合を阻害する能力についてペプチドＡ、ペプチドＢ及
びアセチル−ＧＲＰ ２０〜２７をアッセイした。結合
阻害アッセイは、Ｎ．Ｄｙｓｏｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４３： ９３４−９３６ １９８９に記載の手順の変
形を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで実施した。Ｈｅｌａ細
胞の全細胞溶解物をヒトＲＢＧタンパク質のソースとし
て使用した。外部から加えられたＤＮＡの転写及び翻訳
を可能にするウサギ網状赤血球細胞遊離溶解物をＨＰＶ
−１６ Ｅ７タンパク質のソースとして使用した。ＨＰ
Ｖ−１６ Ｅ７遺伝子をＴ７プロモーターの制御下に組
換ＤＮＡクローンとしてウサギ網状赤血球溶解物に加
え、放射性標識メチオニンの存在下に６０分間３０℃で
インキュベートし、ＨＰＶ−１６ Ｅ７遺伝子を転写さ
せ、放射性標識メチオニンを含むＥ７タンパク質に翻訳
させた。次にＨｅｌａ細胞及びウサギ網状赤血球溶解物
を混合し、４℃で９０分間インキュベートした。更に処
理後、抗ＲＢＧタンパク質ネズミ抗体を加え、４℃で６
０分間インキュベートした。次に、ウサギ抗マウスＩｇ
Ｇ抗体及びタンパク質Ａセファロースを反応混合物に加
え、ＲＢＧタンパク質を免疫沈降させた。同時に、ＲＢ
Ｇタンパク質に結合したＥ７タンパク質も沈降させた。
更に６０分間４℃でインキュベーション後、沈降したタ
ンパク質を遠心分離により単離し、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により試験した。電気泳動後、ポリアクリ
ルアミドゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムに暴露させた。
これらの反応で使用したＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質
はその合成中に放射性標識したので、Ｘ線フィルムは、
ＲＢＧタンパク質に結合し、従って抗ＲＢＧタンパク質
抗体を使用してＲＢＧタンパク質と共に免疫沈降したＥ
７タンパク質の存在を示した。この生化学プロトコルに
より、ＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク
質とのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合の定量的概算値を得た。
結合を阻害する能力についてペプチドＡ、ペプチドＢ及
びアセチル−ＧＲＰ ２０〜２７をアッセイした。結合
阻害アッセイは、Ｎ．Ｄｙｓｏｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４３： ９３４−９３６ １９８９に記載の手順の変
形を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで実施した。Ｈｅｌａ細
胞の全細胞溶解物をヒトＲＢＧタンパク質のソースとし
て使用した。外部から加えられたＤＮＡの転写及び翻訳
を可能にするウサギ網状赤血球細胞遊離溶解物をＨＰＶ
−１６ Ｅ７タンパク質のソースとして使用した。ＨＰ
Ｖ−１６ Ｅ７遺伝子をＴ７プロモーターの制御下に組
換ＤＮＡクローンとしてウサギ網状赤血球溶解物に加
え、放射性標識メチオニンの存在下に６０分間３０℃で
インキュベートし、ＨＰＶ−１６ Ｅ７遺伝子を転写さ
せ、放射性標識メチオニンを含むＥ７タンパク質に翻訳
させた。次にＨｅｌａ細胞及びウサギ網状赤血球溶解物
を混合し、４℃で９０分間インキュベートした。更に処
理後、抗ＲＢＧタンパク質ネズミ抗体を加え、４℃で６
０分間インキュベートした。次に、ウサギ抗マウスＩｇ
Ｇ抗体及びタンパク質Ａセファロースを反応混合物に加
え、ＲＢＧタンパク質を免疫沈降させた。同時に、ＲＢ
Ｇタンパク質に結合したＥ７タンパク質も沈降させた。
更に６０分間４℃でインキュベーション後、沈降したタ
ンパク質を遠心分離により単離し、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により試験した。電気泳動後、ポリアクリ
ルアミドゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムに暴露させた。
これらの反応で使用したＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質
はその合成中に放射性標識したので、Ｘ線フィルムは、
ＲＢＧタンパク質に結合し、従って抗ＲＢＧタンパク質
抗体を使用してＲＢＧタンパク質と共に免疫沈降したＥ
７タンパク質の存在を示した。この生化学プロトコルに
より、ＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク
質とのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合の定量的概算値を得た。
【００４７】これらの生化学反応は、ペプチド濃度を変
えたときＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質と
の結合に及ぼす影響を評価するために、合成ペプチドを
加えて実施してもよいし、加えずに実施してもよい。本
発明者らの研究によると、これらの反応混合物にペプチ
ドＡを４０μＭ、２０μＭ又は２μＭの濃度で加えた
処、ＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質
との結合低下率は夫々９０％、９０％及び６０％であっ
た。ペプチドＢ又はアセチル−ＧＲＰ２０〜２７を反応
混合物に６０μＭまでの濃度で加えても、ＨＰＶ−１６
Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質との結合には何ら
影響しなかった。
えたときＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質と
の結合に及ぼす影響を評価するために、合成ペプチドを
加えて実施してもよいし、加えずに実施してもよい。本
発明者らの研究によると、これらの反応混合物にペプチ
ドＡを４０μＭ、２０μＭ又は２μＭの濃度で加えた
処、ＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質
との結合低下率は夫々９０％、９０％及び６０％であっ
た。ペプチドＢ又はアセチル−ＧＲＰ２０〜２７を反応
混合物に６０μＭまでの濃度で加えても、ＨＰＶ−１６
Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質との結合には何ら
影響しなかった。
【００４８】実施例３ ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質との結合を
阻止するペプチドＡの誘導体 実施例１に記載した方法を使用してペプチドＣと呼称さ
れる合成ペプチドを合成した。ペプチドＣの配列は、Ａ
ｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ
−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ＮＨ
2（式中、Ａｃはロイシン残基のαアミノ部分に共有結
合したアセチル基を表し、ＮＨ2はセリン残基のカルボ
ニル部分に共有結合したアミド基を表す）（配列番号
４）である。
阻止するペプチドＡの誘導体 実施例１に記載した方法を使用してペプチドＣと呼称さ
れる合成ペプチドを合成した。ペプチドＣの配列は、Ａ
ｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ
−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ＮＨ
2（式中、Ａｃはロイシン残基のαアミノ部分に共有結
合したアセチル基を表し、ＮＨ2はセリン残基のカルボ
ニル部分に共有結合したアミド基を表す）（配列番号
４）である。
【００４９】ペプチドＣは実施例１に記載したペプチド
Ａの誘導体である。従って、ペプチドＣの配列はペプチ
ドＡの配列に類似し、ＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質番
号２８〜３８のアミノ酸残基を含む。ペプチドＣは、ア
ミノ酸残基２６及び２７を欠失し且つ２８位のロイシン
残基に共有結合したアセチル基を有する点がペプチドＡ
と異なる。
Ａの誘導体である。従って、ペプチドＣの配列はペプチ
ドＡの配列に類似し、ＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質番
号２８〜３８のアミノ酸残基を含む。ペプチドＣは、ア
ミノ酸残基２６及び２７を欠失し且つ２８位のロイシン
残基に共有結合したアセチル基を有する点がペプチドＡ
と異なる。
【００５０】ペプチドＣを実施例２に記載したアッセイ
で試験した。ペプチドＣは１μＭ程度の低いペプチドＣ
濃度でＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク
質との結合を阻害した。この実験は、ペプチドＡの完全
な１３個のアミノ酸残基よりも小さいペプチドＡのセグ
メントを含むペプチドＡの誘導体が、ＨＰＶ Ｅ７タン
パク質とＲＢＧタンパク質との結合の阻害剤であること
を示す。更に、ペプチドＣはそれ自体、ＨＰＶ Ｅ７と
ＲＢＧタンパク質との結合のアンタゴニストである。
で試験した。ペプチドＣは１μＭ程度の低いペプチドＣ
濃度でＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク
質との結合を阻害した。この実験は、ペプチドＡの完全
な１３個のアミノ酸残基よりも小さいペプチドＡのセグ
メントを含むペプチドＡの誘導体が、ＨＰＶ Ｅ７タン
パク質とＲＢＧタンパク質との結合の阻害剤であること
を示す。更に、ペプチドＣはそれ自体、ＨＰＶ Ｅ７と
ＲＢＧタンパク質との結合のアンタゴニストである。
【００５１】実施例４ ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質との結合を
阻止するペプチドＡのメチル化誘 導体 ペプチドＤ ：実施例１に記載の方法を使用してペプチド
Ｄと呼称される合成ペプチドを合成した。ペプチドＤの
配列は、Ａｃ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙ
ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＮＨ2（式中、
Ａｃはアスパラギン酸残基のαアミノ部分に共有結合し
たアセチル基を表し、ＮＨ2はアスパラギン残基のカル
ボニル部分に共有結合したアミド基を表す）（配列番号
５）である。
阻止するペプチドＡのメチル化誘 導体 ペプチドＤ ：実施例１に記載の方法を使用してペプチド
Ｄと呼称される合成ペプチドを合成した。ペプチドＤの
配列は、Ａｃ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙ
ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＮＨ2（式中、
Ａｃはアスパラギン酸残基のαアミノ部分に共有結合し
たアセチル基を表し、ＮＨ2はアスパラギン残基のカル
ボニル部分に共有結合したアミド基を表す）（配列番号
５）である。
【００５２】ペプチドＤは、実施例１に記載したペプチ
ドＡの誘導体である。従って、ペプチドＤの配列はペプ
チドＡの配列に類似し、ＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質
番号２７〜３５のアミノ酸残基を含む。ペプチドＤは、
アミノ酸残基番号２６、３６、３７及び３８を欠失して
おり且つ２７位のアスパラギン酸残基に共有結合したア
セチル基を有する点においてペプチドＡと異なる。
ドＡの誘導体である。従って、ペプチドＤの配列はペプ
チドＡの配列に類似し、ＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質
番号２７〜３５のアミノ酸残基を含む。ペプチドＤは、
アミノ酸残基番号２６、３６、３７及び３８を欠失して
おり且つ２７位のアスパラギン酸残基に共有結合したア
セチル基を有する点においてペプチドＡと異なる。
【００５３】ペプチドＥ：実施例１に記載の方法を使用
してペプチドＥと呼称される合成ペプチドを合成した。
ペプチドＥの配列は、Ａｃ−Ａｓｐ−Ｎ−メチル−Ｌｅ
ｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｎ−Ｎ−メチル−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＮＨ2（式中、Ａ
ｃはアスパラギン酸残基のαアミノ部分に共有結合した
アセチル基を表し、ＮＨ2はアスパラギン残基のカルボ
ニル部分に共有結合したアミド基を表し、Ｎ−メチルは
２８及び３４位のロイシン残基のαアミノ部分に共有結
合し且つ３１位のチロシン残基のαアミノ部分に共有結
合したメチル基を表す）である。
してペプチドＥと呼称される合成ペプチドを合成した。
ペプチドＥの配列は、Ａｃ−Ａｓｐ−Ｎ−メチル−Ｌｅ
ｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｎ−Ｎ−メチル−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＮＨ2（式中、Ａ
ｃはアスパラギン酸残基のαアミノ部分に共有結合した
アセチル基を表し、ＮＨ2はアスパラギン残基のカルボ
ニル部分に共有結合したアミド基を表し、Ｎ−メチルは
２８及び３４位のロイシン残基のαアミノ部分に共有結
合し且つ３１位のチロシン残基のαアミノ部分に共有結
合したメチル基を表す）である。
【００５４】ペプチドＤ及びＥを、Ｒ．Ｅ．Ｊｏｎｅｓ
他、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ ２６５：１２７８
２−１２７８５， １９９０に記載のＨＰＶ−１６ Ｅ
７タンパク質結合アッセイで試験した。このアッセイ
は、Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質との結合を測定
する。ペプチドＤは２０ｎＭ、ペプチドＥは２ｎＭ程度
の低濃度でＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタン
パク質との結合を阻害した。これらの実験から明らかな
ように、ペプチドＡよりも小さいペプチドＡの誘導体及
びＮ−メチル化アミノ酸残基を含むペプチドＡの誘導体
は、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質との結
合の阻害剤である。更に、ペプチドＤ及びペプチドＥは
それ自体ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質と
の結合のアンタゴニストである。
他、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ ２６５：１２７８
２−１２７８５， １９９０に記載のＨＰＶ−１６ Ｅ
７タンパク質結合アッセイで試験した。このアッセイ
は、Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質との結合を測定
する。ペプチドＤは２０ｎＭ、ペプチドＥは２ｎＭ程度
の低濃度でＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタン
パク質との結合を阻害した。これらの実験から明らかな
ように、ペプチドＡよりも小さいペプチドＡの誘導体及
びＮ−メチル化アミノ酸残基を含むペプチドＡの誘導体
は、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質との結
合の阻害剤である。更に、ペプチドＤ及びペプチドＥは
それ自体ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパク質と
の結合のアンタゴニストである。
【００５５】実施例５ Ｅ７／ＲＢ結合アッセイ ： Ｅ７タンパク質とｐ１０５
−ＲＢとの間の複合体形成の検出に使用されるｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ溶液アッセイは、Ｄｙｓｏｎ他（３０）により
記載されている。ＲＢＧタンパク質のソースとして使用
される細胞溶解物は、（３０）に記載されているように
ヒトＴ２４膀胱癌細胞から調製した。Ｃ３６及び調節抗
体Ｐｂ４１６は、夫々ＲＢＧタンパク質及びＳＶ４０の
大きいＴタンパク質に対するモノクローナル抗体であ
る。これらの抗体は、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ
Ｙ）から寄贈された。段階的に希釈したペプチドアンタ
ゴニストを含有するＥ７／ＲＧＢタンパク質結合反応の
免疫沈降物を３５μｌのゲル充填用緩衝液に溶解させた
（３０）。Ｒｉｇｈｔ Ｓａｆｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ，
Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．）シンチレーションカクテ
ル中で５μｌを直接計数し、２５μｌをドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲ
ルを乾燥させ、−７０℃で一晩Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＡＲフ
ィルムに暴露させた。多数のサンプルをより迅速にアッ
セイし且つ結合結果をより容易に定量するために、Ｅ７
／ＲＧＢタンパク質会合の検出用プレート結合アッセイ
を実施した。精製組換Ｅ７を０．１Ｍ炭酸ナトリウム、
ｐＨ９．５に１ｎｇ／μｌで再懸濁させた。この溶液５
０μｌをポリ塩化ビニル微量滴定プレート（ＣＯＳＴＡ
Ｒ ２５９６， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ．）の各
ウェルに入れた。プレートを１８時間４℃で静かに撹拌
した。Ｅ７溶液を吸引し、プレートブロッキング用緩衝
液（ＰＢＢ）［５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ７．０、２５０
ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ ＮＰ４０、０．５％
（ｗ／ｖ）豚皮ゼラチン及び０．０２％アジ化ナトリウ
ム］１００μｌを各ウェルに加えた。緩衝液を除去し、
プレートをゼラチンを含まない上記緩衝液（ＰＢ）で３
回洗浄した。ウサギ網状赤血球溶解物中で調製した35Ｓ
−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ １００Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ．）
標識ＲＢＧタンパク質５ｆＭを、種々のペプチドアンタ
ゴニストを含有するＰＢ緩衝液で終容量５０μｌまで希
釈し、Ｅ７で処理したプレートに加えた。プレートを４
℃で１時間撹拌しながら再びインキュベートした後、溶
液を吸引し、各ウェルをＰＢで５回洗浄した。熱線切断
装置（Ｄ．Ｌｅｅ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を
使用してプレート上清を除去した。各ウェルをＲｅａｄ
ｙ Ｓａｆｅシンチレーションカクテル（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ．）３ｍｌに導入し、
１分間計数した。
−ＲＢとの間の複合体形成の検出に使用されるｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ溶液アッセイは、Ｄｙｓｏｎ他（３０）により
記載されている。ＲＢＧタンパク質のソースとして使用
される細胞溶解物は、（３０）に記載されているように
ヒトＴ２４膀胱癌細胞から調製した。Ｃ３６及び調節抗
体Ｐｂ４１６は、夫々ＲＢＧタンパク質及びＳＶ４０の
大きいＴタンパク質に対するモノクローナル抗体であ
る。これらの抗体は、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ
Ｙ）から寄贈された。段階的に希釈したペプチドアンタ
ゴニストを含有するＥ７／ＲＧＢタンパク質結合反応の
免疫沈降物を３５μｌのゲル充填用緩衝液に溶解させた
（３０）。Ｒｉｇｈｔ Ｓａｆｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ，
Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．）シンチレーションカクテ
ル中で５μｌを直接計数し、２５μｌをドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲ
ルを乾燥させ、−７０℃で一晩Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＡＲフ
ィルムに暴露させた。多数のサンプルをより迅速にアッ
セイし且つ結合結果をより容易に定量するために、Ｅ７
／ＲＧＢタンパク質会合の検出用プレート結合アッセイ
を実施した。精製組換Ｅ７を０．１Ｍ炭酸ナトリウム、
ｐＨ９．５に１ｎｇ／μｌで再懸濁させた。この溶液５
０μｌをポリ塩化ビニル微量滴定プレート（ＣＯＳＴＡ
Ｒ ２５９６， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ．）の各
ウェルに入れた。プレートを１８時間４℃で静かに撹拌
した。Ｅ７溶液を吸引し、プレートブロッキング用緩衝
液（ＰＢＢ）［５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ７．０、２５０
ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ ＮＰ４０、０．５％
（ｗ／ｖ）豚皮ゼラチン及び０．０２％アジ化ナトリウ
ム］１００μｌを各ウェルに加えた。緩衝液を除去し、
プレートをゼラチンを含まない上記緩衝液（ＰＢ）で３
回洗浄した。ウサギ網状赤血球溶解物中で調製した35Ｓ
−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ １００Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ．）
標識ＲＢＧタンパク質５ｆＭを、種々のペプチドアンタ
ゴニストを含有するＰＢ緩衝液で終容量５０μｌまで希
釈し、Ｅ７で処理したプレートに加えた。プレートを４
℃で１時間撹拌しながら再びインキュベートした後、溶
液を吸引し、各ウェルをＰＢで５回洗浄した。熱線切断
装置（Ｄ．Ｌｅｅ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を
使用してプレート上清を除去した。各ウェルをＲｅａｄ
ｙ Ｓａｆｅシンチレーションカクテル（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ．）３ｍｌに導入し、
１分間計数した。
【００５６】３０． Ｄｙｓｏｎ，Ｎ．，Ｄｕｆｆｙ，
Ｌ．Ａ．， ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ． （１９８
９） Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ７， ２３５−２４
０．実施例６ ペプチド合成 ： モデル４３０Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動ペプチド合成器で全アミノ酸の
導入のための二重カップリングプロトコルを使用して、
固相合成（３１）によりペプチド（表Ｃ）を調製した。
脱保護及び樹脂支持体からのペプチドの除去は、液体フ
ッ化水素酸で処理することにより行った（３２）。トリ
フルオロ酢酸−アセトニトリル勾配０．１％水溶液を使
用して逆相Ｃ１８シリカカラムで分取高圧液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）によりペプチドを精製した（３
３）。ペプチドの均質性を分析用ＨＰＬＣにより立証
し、同一性をアミノ酸組成分析により確認した。
Ｌ．Ａ．， ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ． （１９８
９） Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ７， ２３５−２４
０．実施例６ ペプチド合成 ： モデル４３０Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動ペプチド合成器で全アミノ酸の
導入のための二重カップリングプロトコルを使用して、
固相合成（３１）によりペプチド（表Ｃ）を調製した。
脱保護及び樹脂支持体からのペプチドの除去は、液体フ
ッ化水素酸で処理することにより行った（３２）。トリ
フルオロ酢酸−アセトニトリル勾配０．１％水溶液を使
用して逆相Ｃ１８シリカカラムで分取高圧液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）によりペプチドを精製した（３
３）。ペプチドの均質性を分析用ＨＰＬＣにより立証
し、同一性をアミノ酸組成分析により確認した。
【００５７】表Ｃは、これらの技術を使用して調製した
２３種のペプチドを列挙する。これらのペプチドは、Ｅ
７とＲＢＧタンパク質との結合を阻害するペプチドＡの
相同体を含む。
２３種のペプチドを列挙する。これらのペプチドは、Ｅ
７とＲＢＧタンパク質との結合を阻害するペプチドＡの
相同体を含む。
【００５８】３１． Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．
（１９６３） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，
２１４９−２１５４． ３２． Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，Ｓ．， Ｓｈｉｍｏｎ
ｉｓｈｉ，Ｙ．， Ｋｉｓｈｉｄａ，Ｙ．， Ｏｋａｄ
ａ，Ｍ．， ａｎｄ Ｓｕｇｉｈａｒａ，Ｈ． （１９６７） Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａ
ｎ ４０， ２１６４−２１６７． ３３． Ｒｉｖｉｅｒ， Ｊ．， ＭｃＣｌｅｎｔｏｃ
ｋ，Ｒ．， ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｈ． （１９
８４） Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ２８８， ３０３−３２８．
（１９６３） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，
２１４９−２１５４． ３２． Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，Ｓ．， Ｓｈｉｍｏｎ
ｉｓｈｉ，Ｙ．， Ｋｉｓｈｉｄａ，Ｙ．， Ｏｋａｄ
ａ，Ｍ．， ａｎｄ Ｓｕｇｉｈａｒａ，Ｈ． （１９６７） Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａ
ｎ ４０， ２１６４−２１６７． ３３． Ｒｉｖｉｅｒ， Ｊ．， ＭｃＣｌｅｎｔｏｃ
ｋ，Ｒ．， ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｈ． （１９
８４） Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ２８８， ３０３−３２８．
【００５９】
【表２】
【００６０】ＩＣ50値は、少なくとも２回の実験の平均
を表し、阻害剤の各濃度は３回ずつ試験した。実験間の
変動は１０％未満であった。５０％阻害濃度はマイクロ
モル単位である。ＮＤ＝定量せず。
を表し、阻害剤の各濃度は３回ずつ試験した。実験間の
変動は１０％未満であった。５０％阻害濃度はマイクロ
モル単位である。ＮＤ＝定量せず。
【００６１】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：13 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 1 5 10 配列番号：２ 配列の長さ：104 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Arg Asn Pro Ala Val Ile Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu 1 5 10 15 Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu 20 25 30 Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala 35 40 45 Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys 50 55 60 Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val 65 70 75 80 Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val 85 90 95 Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro 100 配列番号:３： 配列の長さ：16 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val 1 5 10 15 配列番号:４ 配列の長さ：11 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号:５ 配列の長さ：9 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/00 ＡＤＵ Ｇ 9284−4Ｃ 39/12 9284−4Ｃ 39/395 Ｅ 9284−4Ｃ Ｔ 9284−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 7/08 8318−4Ｈ // Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 マーク・ダブリユ・リーメン アメリカ合衆国、インデイアナ・46032、 カーメル、ブリアー・ストーン・トレイ ス・5122
Claims (10)
- 【請求項１】 ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパ
ク質との結合を阻害するアミノ酸配列：Ｌｅｕ−Ｔｙｒ
−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（配列番号４）を有するポリペ
プチド。 - 【請求項２】 式Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃ
ｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓ
ｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（配列番号１）又はＬｅｕ−Ｔｙｒ
−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（配列番号４）を有するポリペ
プチド。 - 【請求項３】 Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙ
ｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ
−Ｓｅｒ−ＳｅｒＮＨ2又はＡｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃ
ｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓ
ｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ＮＨ2である請求項２に記載のポ
リペプチド。 - 【請求項４】 各々ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタ
ンパク質との結合阻害剤であり且つＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃ
ｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓ
ｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒの部分的アミノ酸配列（配列番号
４）を有する１種以上のポリペプチドを含むポリペプチ
ド又はその保存性置換体。 - 【請求項５】 式：Ａｃ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃ
ｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＮＨ
2を有するポリペプチド。 - 【請求項６】 式：Ａｃ−Ａｓｐ−Ｎ−メチル−Ｌｅｕ
−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｎ−Ｎ−メチル−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＮＨ2を有するポリ
ペプチド。 - 【請求項７】 アミノ酸配列：Ｅ７−（２０−３２）−
アミド、Ｅ７−（２０−３０）−アミド、Ｅ７−（２０
−２９）−アミド、Ｅ７−（２０−２８）−アミド、
［Ｇｌｎ27］−Ｅ７−（２０−２７）−アミド、Ｅ７−
（２０−２６）−アミド、Ｅ７−（１４−２９）−アミ
ド、Ｅ７−（１８−２９）−アミド、Ｅ７−（２０−２
９）−アミド、Ｅ７−（２１−３２）−アミド、Ｅ７−
（２０−２９）−酸、Ｎ−Ａｃ−Ｅ７−（２０−２９）
−酸、Ｎ−Ａｃ−Ｅ７−（２０−２９）−アミド、Ｎ−
Ａｃ−Ｅ７−（２１−２９）−アミド、Ｎ−Ａｃ−Ｅ７
−（２２−３２）−アミド、［Ｓｅｒ24］−Ｅ７−（２
０−３２）−アミド、［ＡＢＵ24］−Ｅ７−（２０−３
２）−アミド、［ＡＣＭ24］−Ｅ７−（２０−３２）−
アミド、［Ｐｈｅ23］−Ｅ７−（２０−２９）−アミ
ド、［Ｐｈｅ25］−Ｅ７−（２０−２９）−アミド、
［Ｇｌｎ26］−Ｅ７−（２０−２８）−アミド、［Ａｓ
ｎ21］−Ｅ７−（２０−２８）−アミド、又は［Ａｓｎ
27］−Ｅ７−（２０−３０）−アミドを有するポリペプ
チド。 - 【請求項８】 治療薬として有効な量の請求項１から７
のいずれか一項に記載のポリペプチドを哺乳動物に投与
することからなる、非ヒト哺乳動物の生殖器いぼ又は頚
部癌の治療方法。 - 【請求項９】 ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＲＢＧタンパ
ク質との結合阻害剤である分子の同定方法であって、
（ａ）前記分子を請求項１から７のいずれか一項に記載
のポリペプチドと接触させる段階と、（ｂ）ＨＰＶ Ｅ
７タンパク質とＲＢＧタンパク質との結合の効果を前記
分子の不在下の効果に対して測定する段階とを含む方
法。 - 【請求項１０】 治療薬として有効な量の請求項１から
７のいずれか一項に記載のポリペプチドと薬学的に許容
可能なキャリヤーとを含有する、哺乳動物の生殖器いぼ
又は頚部癌の治療用医薬組成物。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US75482991A | 1991-09-04 | 1991-09-04 | |
| US754829 | 1991-09-04 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05310784A true JPH05310784A (ja) | 1993-11-22 |
Family
ID=25036533
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4233591A Pending JPH05310784A (ja) | 1991-09-04 | 1992-09-01 | ヒト乳頭腫ウイルスタンパク質と網膜芽細胞腫遺伝子タンパク質との結合のペプチド阻害剤 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0531080A3 (ja) |
| JP (1) | JPH05310784A (ja) |
| CA (1) | CA2077322A1 (ja) |
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| US5736318A (en) * | 1995-03-17 | 1998-04-07 | President And Fellows Of Harvard College | Method and kit for evaluating human papillomavirus transformed cells |
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| DE19649606C1 (de) * | 1996-11-29 | 1997-10-02 | Deutsches Krebsforsch | Systeme zur Bestimmung von Wirksubstanzen gegen HPV-assoziierte Karzinome |
| CA2321160A1 (en) * | 1998-02-13 | 1999-08-19 | Oxford Glycosciences (Uk) Ltd. | Methods and compositions for diagnosis of hepatoma |
| ATE235509T1 (de) * | 1998-06-30 | 2003-04-15 | Deutsches Krebsforsch | Peptide zur inhibition von hpv e7 proteinen |
| DE19901008A1 (de) * | 1999-01-13 | 2000-07-20 | Deutsches Krebsforsch | Peptide zur Inhibierung von HPV E6-Proteinen |
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| EP1862471A3 (en) * | 2000-02-07 | 2008-05-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Pharmacologically active antiviral peptides and methods of their use |
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-
1992
- 1992-09-01 CA CA002077322A patent/CA2077322A1/en not_active Abandoned
- 1992-09-01 EP EP19920307905 patent/EP0531080A3/en not_active Withdrawn
- 1992-09-01 JP JP4233591A patent/JPH05310784A/ja active Pending
Also Published As
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|---|---|
| EP0531080A2 (en) | 1993-03-10 |
| EP0531080A3 (en) | 1993-12-29 |
| CA2077322A1 (en) | 1993-03-05 |
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