JPH05308997A - Method for rapidly measuring of bacterial number and gram-positive bacterial number and measurement kit - Google Patents
Method for rapidly measuring of bacterial number and gram-positive bacterial number and measurement kitInfo
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- JPH05308997A JPH05308997A JP13965592A JP13965592A JPH05308997A JP H05308997 A JPH05308997 A JP H05308997A JP 13965592 A JP13965592 A JP 13965592A JP 13965592 A JP13965592 A JP 13965592A JP H05308997 A JPH05308997 A JP H05308997A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、試料中の全細菌数とグ
ラム陽性細菌数を迅速、かつ、簡便に測定する方法、並
びにその際に用いる測定キットに関し、詳しくは尿検査
などの診断分野をはじめ、広汎な分野において適用が可
能な、全細菌数とグラム陽性細菌数の迅速、かつ、簡便
な測定方法、並びにその際に用いる測定キットに関す
る。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for rapidly and simply measuring the total number of bacteria and the number of Gram-positive bacteria in a sample, and a measuring kit used therefor, more specifically in the field of diagnostics such as urinalysis. The present invention also relates to a rapid and simple method for measuring the total number of bacteria and the number of Gram-positive bacteria, which can be applied in a wide range of fields, and a measurement kit used therefor.
【０００２】[0002]
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】従来よ
り、尿検査分野などでは、炎症の発見や病状を推定する
ために、尿等の試料中の細菌数等の測定が行なわれてい
る。例えば、尿中の細菌が増殖した場合、細菌尿症と診
断され、***症が暗示される。したがって、早期治
療や薬投与のため、細菌数の測定や、その細菌がグラム
陽性菌か陰性菌かどうかの識別判定を行なっている。こ
のような場合の細菌数の測定は、大部分の試料について
は平板培養法により行なわれ、多くは市販キットを用い
て実施されている。より具体的には、例えば所定量の試
料を寒天平板培地などの上で３７℃程度で２４時間程度
培養して、生成するコロニー数を求め、該コロニー数か
ら細菌数を測定することにより行なわれている。また、
グラム陽性細菌とグラム陰性細菌の識別判定は、前記細
菌増殖が確認された試料を、グラム染色法等により染色
することにより行なっている。さらに、特に重要と思わ
れる尿細菌については、種々の市販のキットを用いて病
原菌の同定が行なわれているのが現状である。しかしな
がら、これらの方法では、医者が患者の尿を採取して
も、検査結果が判るのは翌日である。したがって、検査
結果を待つことにより処置が遅れ、病状が悪化したりす
るなど、病状に合わせた迅速、かつ、適切な緊急処置が
できないという問題がある。さらに、患者は即日に治療
が受けられず、時間的或いは経済的負担も大きい。2. Description of the Related Art Conventionally, in the field of urinalysis and the like, the number of bacteria in a sample such as urine has been measured in order to detect inflammation and estimate the condition. For example, if bacteria in the urine multiply, bacteriuria is diagnosed, suggesting a urinary tract infection. Therefore, for early treatment and drug administration, the number of bacteria is measured, and whether the bacteria are gram-positive or negative is determined. In many cases, the number of bacteria is measured by the plate culture method in such a case, and most of them are carried out using a commercial kit. More specifically, for example, by culturing a predetermined amount of a sample on an agar plate medium or the like at about 37 ° C. for about 24 hours, the number of colonies produced is determined, and the number of bacteria is measured from the number of colonies. ing. Also,
The distinction between Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria is performed by staining a sample in which the above-mentioned bacterial growth is confirmed by the Gram staining method or the like. Furthermore, with regard to urinary bacteria that are considered to be particularly important, the current situation is that pathogenic bacteria are identified using various commercially available kits. However, in these methods, even if the doctor collects the urine of the patient, the test result will be known the next day. Therefore, there is a problem that it is not possible to carry out prompt and appropriate emergency treatment in accordance with the medical condition, such as delaying the treatment by waiting for the test result and worsening the medical condition. In addition, patients cannot receive treatment on the same day, which imposes a heavy time or financial burden.
【０００３】また、細菌がグラム陽性菌か陰性菌かどう
かの識別判定は、上記のようにグラム染色法等により染
色することにより行なわれているが、この識別判定法に
ついても問題がある。すなわち、グラム陽性菌と陰性菌
の識別判定法のうちのグラム染色法として、例えば西
岡法（特公平２−３３３５８号公報参照）が挙げられ
る。この方法では、まず、細菌をオブジェクトグラスに
塗布し、乾燥後火炎固定した後、ビクトリアブルー溶液
入りバットに入れて染色し、次いで水洗し、ピクリン酸
入りエタノール溶液に出し入れする。この操作をビクト
リアブルーＢの溶出がなくなるまで繰り返し行なった
後、水洗し、対比染色液（フクシン液）に入れて染色
し、さらに水洗し、乾燥することにより、グラム陽性菌
は濃青色に、グラム陰性菌は赤色に染色するものであ
る。また、同様の技術として、ハッカー変法〔発酵協
会誌、第２０巻，Ｎｏ４，１４頁（１９６２年）〕が知
られている。この方法は、色素としてクリスタルバイオ
レットを用い、かつ、媒染剤としてルゴール液を用い、
９５ｖｏｌ％エタノール溶液に出し入れすること以外
は、西岡法と同様の方法である。しかしながら、これら
の方法は、いずれも顕微鏡で観察する必要があり、熟練
した技術と経験に基づく高度の専門的な知識が必要とさ
れる。[0003] Further, although the determination of whether a bacterium is a Gram-positive bacterium or a negative bacterium is performed by staining by the Gram staining method or the like as described above, this identification-determination method also has a problem. That is, as a Gram staining method among the methods for distinguishing between Gram-positive bacteria and Negative bacteria, the Nishioka method (see Japanese Patent Publication No. 2-33358) can be mentioned. In this method, first, bacteria are applied to an object glass, dried, flame-fixed, put in a vat containing a Victoria blue solution for staining, then washed with water, and put into and taken out from an ethanol solution containing picric acid. After repeating this operation until the elution of Victoria Blue B disappeared, the product was washed with water, put in a counterstain (fuchsin solution) for staining, further washed with water, and dried to give Gram-positive bacteria a dark blue Negative bacteria stain red. Further, as a similar technique, a modified hacker method [Fermentation Association magazine, Vol. 20, No. 4, p. 14 (1962)] is known. This method uses crystal violet as a pigment, and Lugol's solution as a mordant,
The method is the same as the Nishioka method except that it is put in and taken out from a 95 vol% ethanol solution. However, all of these methods require observation under a microscope, and require highly specialized knowledge based on skill and experience.
【０００４】さらに、グラム陽性菌と陰性菌の識別判定
法として、正に帯電した半透膜のエボキシ−ガラス繊維
フィルターを用いて染色法により検出する方法（米国特
許第４３３６３３７号明細書）が知られている。しかし
ながら、この方法では、染色にキレート剤の添加が必要
であると共に、過剰色素の除去に、真空ポンプ又は吸引
する設備が必要であり、装置が大掛かりとなる上に、使
用する場所も限定されるという欠点があった。したがっ
て、これらの方法は、設備の整った大病院でのみ実施が
可能であり、我が国で大多数を占める小規模な病院或い
は診療所では、実際上実施することが困難であった。Further, as a method for discriminating between Gram-positive bacteria and negative bacteria, there is known a method (US Pat. No. 4,336,337) of detecting by a staining method using an epoxy-glass fiber filter having a positively charged semipermeable membrane. Has been. However, in this method, addition of a chelating agent is required for dyeing, and a vacuum pump or suction equipment is required for removing excess dye, which requires a large-scale device and a limited place for use. There was a drawback. Therefore, these methods can be carried out only in well-equipped large hospitals, and practically it was difficult to carry out in small hospitals or clinics that make up the majority in Japan.
【０００５】本発明は、このような従来の欠点を解消
し、熟練した技術や専門的な知識、特別な設備などを必
要とせず、しかも迅速、かつ、簡便に試料中の全細菌数
とグラム陽性細菌数を測定しうる方法、並びにその測定
キットを提供することを目的とするものである。The present invention eliminates the above-mentioned conventional drawbacks, does not require skilled techniques, specialized knowledge, special equipment, etc., and is swift and simple, and the total number of bacteria and gram in the sample are It is an object of the present invention to provide a method capable of measuring the number of positive bacteria and a measurement kit therefor.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は第１
に、試料中のグラム陽性細菌数を測定するにあたり、グ
ラム陽性細菌染色用色素を用いてグラム陽性細菌を染色
した後に疎水性フィルターに捕集するか、或いは疎水性
フィルターに捕集した後にグラム陽性細菌染色用色素を
用いてグラム陽性細菌を染色し、次に該フィルター上で
媒染剤を用いて媒染し、次いで過剰のグラム陽性細菌染
色用色素及び媒染剤を洗浄により除去した後、該フィル
ター上のグラム陽性細菌の着色度から試料中のグラム陽
性菌の細菌数を測定することを特徴とするグラム陽性細
菌数の迅速測定方法を提供するものである。That is, the first aspect of the present invention is
In addition, when measuring the number of Gram-positive bacteria in a sample, collect it on a hydrophobic filter after staining the Gram-positive bacteria with a dye for staining Gram-positive bacteria, or collect it on a hydrophobic filter and then Gram-positive bacteria. Gram-positive bacteria were stained with a bacterial staining dye, then mordanted with a mordant on the filter, and then excess Gram-positive bacterial staining dye and mordant were removed by washing before gram on the filter. The present invention provides a rapid method for measuring the number of Gram-positive bacteria, which comprises measuring the number of Gram-positive bacteria in a sample from the degree of coloring of positive bacteria.
【０００７】このような本発明の第１の方法は、疎水性
フィルター，該フィルターを装着しうる注射筒，グラム
陽性細菌染色用色素液，媒染剤，グラム陽性細菌染色用
色素及び媒染剤の洗浄液及び色対照表よりなるグラム陽
性細菌数の測定キットを用いることにより、容易に実施
することができる。The first method of the present invention as described above comprises a hydrophobic filter, a syringe capable of mounting the filter, a dye solution for staining Gram-positive bacteria, a mordant, a washing solution and a color for the dye for staining Gram-positive bacteria and mordant. It can be easily carried out by using a gram-positive bacteria count measuring kit consisting of a control table.
【０００８】また、本発明は第２に、試料中の全細菌数
及びグラム陽性細菌数を測定するにあたり、細菌染色用
色素を用いて細菌を染色した後に疎水性フィルターに捕
集するか、或いは疎水性フィルターに捕集した後に細菌
染色用色素を用いて細菌を染色し、次いで過剰の細菌染
色用色素を洗浄により除去した後、該フィルター上の細
菌の着色度から試料中の全細菌数を測定し、次いで該フ
ィルター上に捕集された細菌をグラム陽性細菌染色用色
素で染色し、次に媒染剤を用いて媒染し、次いで過剰の
グラム陽性細菌染色用色素及び媒染剤を洗浄により除去
した後、該フィルター上のグラム陽性細菌の着色度から
試料中のグラム陽性細菌数を測定することを特徴とす
る、全細菌数及びグラム陽性細菌数の迅速測定方法を提
供するものである。本発明の第２は、予め試料中の全細
菌数を測定した後に、本発明の第１と同様にして、試料
中のグラム陽性菌の細菌数を測定することにより、全細
菌数及びグラム陽性細菌数を測定することを特徴とす
る。Secondly, according to the present invention, in measuring the total number of bacteria and the number of Gram-positive bacteria in a sample, the bacteria are dyed with a dye for staining bacteria and then collected on a hydrophobic filter, or After being collected on a hydrophobic filter, the bacteria were stained with a dye for staining the bacteria, and then excess dye for staining the bacteria was removed by washing, and then the number of bacteria in the sample was determined from the degree of coloring of the bacteria on the filter. After measuring and then staining the bacteria collected on the filter with Gram-positive bacteria staining dye, then mordant with mordant, and then removing excess Gram-positive bacteria staining dye and mordant by washing The present invention provides a rapid method for measuring the total number of bacteria and the number of Gram-positive bacteria, which comprises measuring the number of Gram-positive bacteria in a sample from the degree of coloration of Gram-positive bacteria on the filter. In the second aspect of the present invention, after measuring the total number of bacteria in the sample in advance, the number of gram-positive bacteria in the sample is measured in the same manner as in the first aspect of the present invention to obtain the total number of bacteria and gram-positive bacteria. Characterized by measuring the number of bacteria.
【０００９】このような本発明の第２の方法は、疎水性
フィルター，該フィルターを装着しうる注射筒，細菌染
色用色素液，グラム陽性細菌染色用色素液，媒染剤，細
菌染色用色素の洗浄液，グラム陽性細菌染色用色素及び
媒染剤の洗浄液及び色対照表よりなる、全細菌数及びグ
ラム陽性細菌数の測定キットを用いることにより、容易
に実施することができる。The second method of the present invention as described above comprises a hydrophobic filter, an injection barrel to which the filter can be attached, a dye solution for staining bacteria, a dye solution for staining Gram-positive bacteria, a mordant, and a washing solution for dyeing bacteria. It can be easily carried out by using a kit for measuring the total number of bacteria and the number of gram-positive bacteria, which comprises a washing solution of a dye for staining Gram-positive bacteria and a mordant and a color control table.
【００１０】以下、本発明の第１と第２について、共通
する点は、まとめて説明する。まず本発明を適用するこ
とができる試料は、その中に細菌を含んでいる液状体で
あれば特に制限はなく、例えば人間や動物の尿等の***
物や、血液，リンパ液等の体液を典型的なものとして挙
げることができる。本発明の第１は、このような試料中
のグラム陽性細菌を対象とするものであり、本発明の第
２は、このような試料中の全細菌とグラム陽性細菌を対
象とするものである。ここでグラム陽性細菌としては、
例えば球菌の大部分が該当し、スタフィロコッカス( St
aphylococcus )属、サルシナ( sarcina ) 属、ストレプ
トコッカス(Streptcoccus )属などに属するものが挙げ
られ、具体的にはスタフィロコッカス・アウレウス( St
aphylococcus aureus ) （ブドウ球菌），ストレプトコ
ッカス( Streptcoccus )（腸球菌）などが挙げられる。
なお、グラム陰性細菌としては、例えば大腸菌、プロテ
ウス（ Proteus )菌などが挙げられる。The common points between the first and second aspects of the present invention will be described below. First, the sample to which the present invention can be applied is not particularly limited as long as it is a liquid containing bacteria therein, and examples thereof include excrements such as human and animal urine, and body fluids such as blood and lymph. It can be listed as an example. The first of the present invention is directed to Gram-positive bacteria in such a sample, and the second of the present invention is directed to all bacteria and Gram-positive bacteria in such a sample. .. Here, as Gram-positive bacteria,
For example, most of the cocci are relevant, and Staphylococcus (St
aphylococcus genus, sarcina (sarcina) genus, Streptcoccus genus, and the like, specifically, Staphylococcus aureus (St
aphylococcus aureus) (staphylococcus), Streptcoccus (enterococcus) and the like.
Examples of Gram-negative bacteria include Escherichia coli and Proteus bacteria.
【００１１】上記したように、本発明の第２は、予め試
料中の全細菌数を測定した後に、本発明の第１と同様に
して、試料中のグラム陽性菌の細菌数を測定することに
より、全細菌数とグラム陽性細菌数の両方を測定するも
のである。したがって、説明上からは、まず本発明の第
２について述べるのが良いと思われるので、以下、本発
明の第２について述べ、その中で本発明の第１について
述べることとする。As described above, in the second aspect of the present invention, after measuring the total number of bacteria in the sample in advance, the number of gram-positive bacteria in the sample is measured in the same manner as in the first aspect of the present invention. It measures both the total number of bacteria and the number of Gram-positive bacteria. Therefore, from the viewpoint of description, it is considered that the second aspect of the present invention should be described first. Therefore, the second aspect of the present invention will be described below, and the first aspect of the present invention will be described therein.
【００１２】本発明の第２では、細菌染色用色素を用い
て細菌を染色した後に疎水性フィルターに捕集するか、
或いは疎水性フィルターに捕集した後に細菌染色用色素
を用いて細菌を染色し、次いで過剰の細菌染色用色素を
洗浄により除去した後、フィルター上の細菌の着色度か
ら、まず試料中の全細菌数を測定する。In the second aspect of the present invention, bacteria are dyed with a dye for staining bacteria and then collected on a hydrophobic filter, or
Alternatively, after collecting on a hydrophobic filter, stain the bacteria with a dye for staining the bacteria, and then remove excess dye for staining the bacteria by washing. Measure the number.
【００１３】以下、分説すると、まず細菌染色用色素を
用いて細菌を染色した後に疎水性フィルターに捕集する
か、或いは疎水性フィルターに捕集した後に細菌染色用
色素を用いて細菌を染色する。すなわち、細菌の染色の
前後のいずれかの時期に、疎水性フィルターで捕集を行
なう。操作工程の簡便さから、予め試料と色素液とを混
合し、細菌を染色した後に、疎水性フィルターに捕集す
る手法が好ましい。[0013] In the following, the bacteria are first stained with a dye for staining bacteria and then collected on a hydrophobic filter, or they are collected on a hydrophobic filter and then stained with a dye for staining bacteria. To do. That is, collection is performed with a hydrophobic filter either before or after the staining of bacteria. A method of mixing the sample and the dye solution in advance, staining the bacteria, and then collecting the sample on the hydrophobic filter is preferable from the viewpoint of simplicity of the operation process.
【００１４】ここで細菌の染色は、細菌染色用色素を用
いることにより行なわれる。より具体的には、各種の細
菌染色用色素を用い、これを色素液とし、この細菌染色
用色素液を、フィルターで細菌を捕集する前、或いは捕
集した後のフィルター上の試料に添加することにより行
なう。細菌染色用色素としては、細菌の染色に使用可能
な色素であれば特に制限はない。しかしながら、後で行
なう、グラム陽性細菌染色用色素及び媒染剤を用いての
グラム陽性細菌の染色を考慮すると、ここでの細菌染色
用色素（すなわち、全細菌染色用色素）としては、特に
過剰の色素の除去のし易さの点より、サフラニン，フク
シンが好ましい。Staining of bacteria is carried out by using a dye for staining bacteria. More specifically, various dyes for staining bacteria are used, and this is used as a dye solution, and this dye solution for staining bacteria is added to the sample on the filter before or after collecting the bacteria with the filter. By doing. The dye for staining bacteria is not particularly limited as long as it can be used for staining bacteria. However, in consideration of the later-described Gram-positive bacteria staining dye and staining of Gram-positive bacteria with a mordant, the dye for bacterial staining (that is, the dye for staining all bacteria) used here is particularly excessive. Safranin and fuchsin are preferable from the viewpoint of easy removal.
【００１５】上記細菌染色用色素は、水溶液（色素液）
として使用される。色素液とする際には、必要に応じ
て、エタノール、界面活性剤等を添加することもでき
る。ここで細菌染色用色素液の色素の濃度は、例えばフ
クシンを用いた場合には、0.0005〜2.0 重量％、好まし
くは 0.002〜１重量％とする。ここで細菌染色用色素液
（フクシン）の濃度が、0.0005％重量未満であると着色
が不充分となり、一方、細菌染色用色素液（フクシン）
の濃度が2.0 重量％を超えると過剰の色素の除去が困難
となるため、いずれも好ましくない。なお、必要に応じ
て、上記の細菌染色用色素液にエタノール、界面活性剤
を添加する場合には、それぞれ細菌染色用色素液の0.5
〜10重量％、0.0001〜1.0 重量％の割合で添加すればよ
い。また、細菌染色用色素液の色素の濃度は、サフラニ
ンの場合には、その濃度はフクシンと同様でよい。The above-mentioned dye for staining bacteria is an aqueous solution (dye liquid)
Used as. If necessary, ethanol, a surfactant or the like can be added to the dye solution. Here, the concentration of the dye in the dye solution for bacterial staining is 0.0005 to 2.0% by weight, preferably 0.002 to 1% by weight when fuchsin is used. If the concentration of the bacterial dyeing solution (fuchsin) is less than 0.0005% by weight, coloring will be insufficient, while the bacterial dyeing solution (fuchsin) will be insufficient.
If the concentration exceeds 2.0% by weight, it becomes difficult to remove the excess dye, and thus both are not preferable. If necessary, when adding ethanol or a surfactant to the above-described bacterial staining dye solution, 0.5% of the bacterial staining dye solution is used.
It may be added in an amount of 10 to 10% by weight and 0.0001 to 1.0% by weight. Further, in the case of safranin, the concentration of the dye in the dye solution for staining bacteria may be the same as that of fuchsin.
【００１６】上記細菌染色用色素液の調製にあたって
は、予め所定濃度の色素液を作製しておき、これを後述
する如き洗浄液を用いて希釈して、所望する濃度のもの
としてもよい。また、試料液量当たりの細菌染色用色素
液量比（容積比）は１以上、好ましくは２以上とする。
ここで試料液量当たりの細菌染色用色素液量比が１未満
であると、着色が不充分となってしまい好ましくない。In the preparation of the above dye solution for staining bacteria, a dye solution having a predetermined concentration may be prepared in advance, and the dye solution may be diluted with a washing solution to be described later to obtain a desired concentration. Further, the ratio of the amount of dye liquid for staining bacteria (volume ratio) per amount of sample liquid is 1 or more, preferably 2 or more.
If the ratio of the amount of dye liquid for staining bacteria to the amount of sample liquid is less than 1, coloring is insufficient, which is not preferable.
【００１７】次に、本発明で用いる疎水性フィルターと
しては、ナイロン系、ポリテトラフルオロエチレン（商
品名テフロン）等のフッ素系ポリマーや、ポリオレフィ
ン系，ニトロセルロース系，ポリカーボネート系，ポリ
プロピレン系等のポリマーを材料とするものが用いら
れ、特にポリテトラフルオロエチレンやポリオレフィン
を材料とするものが、過剰の色素を除去するのが容易で
あるため好ましい。この疎水性フィルターの濾過孔径
は、対象とする細菌の種類に応じて適宜選定すればよ
く、例えば0.2 〜0.5 μｍの孔径のものを用いることが
好ましい。なお、尿中には細菌以外に、３０〜４０μｍ
程度の大きさの各種細胞や、８〜１２μｍ程度の大きさ
のリンパ球等が多量存在する場合がある。そのような場
合には、濾過孔径が３〜５μｍのフィルターで前処理濾
過を行なえばよい。Next, as the hydrophobic filter used in the present invention, a fluorinated polymer such as nylon or polytetrafluoroethylene (trade name Teflon), or a polymer such as polyolefin, nitrocellulose, polycarbonate or polypropylene Are used, and those made of polytetrafluoroethylene or polyolefin are particularly preferable because it is easy to remove an excess dye. The filtration pore size of this hydrophobic filter may be appropriately selected according to the type of the target bacterium, and for example, a pore size of 0.2 to 0.5 μm is preferably used. In addition to bacteria, it is 30-40 μm in urine.
There may be a large amount of various types of cells or lymphocytes of about 8 to 12 μm in size. In such a case, pretreatment filtration may be performed with a filter having a filtration pore size of 3 to 5 μm.
【００１８】この疎水性フィルターの大きさは特に制限
はない。この疎水性フィルターは注射筒に装着して用い
る場合には、その口径（直径）が 13 〜 25 ｍｍ程度の
ものが好ましい。この疎水性フィルターの色としては、
用いる色素を考慮し、判定容易な色を定めればよい。着
色の程度を容易に判定するためには、白色のフィルター
が好ましい。また、透明，半透明のフィルターを用いる
ことができるが、白色用紙の上にフィルターを載せて判
定すると、判定が容易となる。The size of this hydrophobic filter is not particularly limited. When this hydrophobic filter is attached to an injection cylinder for use, it preferably has a diameter (diameter) of about 13 to 25 mm. As the color of this hydrophobic filter,
A color that can be easily determined may be set in consideration of the dye used. A white filter is preferable for easily determining the degree of coloring. Further, a transparent or semi-transparent filter can be used, but if the filter is placed on a white paper for determination, the determination becomes easy.
【００１９】上記の如き疎水性フィルターを用いて試料
中の細菌を捕集する。通常は、疎水性フィルターを注射
筒に装着し、この注射筒に、事前に染色された試料或い
は染色前の試料を入れ、加圧濾過することにより、細菌
を捕集する。染色前の試料を入れた場合には、濾過の後
に染色するが、事前に染色された試料を加圧濾過する方
法が、操作工程が簡単で好ましいことは前述した通りで
ある。Bacteria in the sample are collected using the hydrophobic filter as described above. Usually, a hydrophobic filter is attached to a syringe, and a prestained sample or a sample before staining is put in this syringe and pressure filtration is performed to collect bacteria. When the sample before dyeing is added, it is dyed after filtration, but the method of pressurizing and filtering the sample dyed in advance is preferable because of its simple operation steps.
【００２０】このようにして染色され、かつ、疎水性フ
ィルターに捕集された試料から、過剰の色素を洗浄によ
り除去する。ここで細菌染色用色素洗浄液（細菌総数染
色用色素の洗浄液）としては、水，各種緩衝液（ｐＨ６
〜８程度のもの）等を使用することができる。さらに、
必要に応じて各種界面活性剤を添加したものを用いても
よい。界面活性剤の濃度は、0.0001〜1.0 ％重量の割合
が好ましい。洗浄液の使用量は、疎水性フィルターの口
径に依存するが、例えば疎水性フィルターの口径が１３
ｍｍであれば、１〜５ｍｌ（ミリリットル）、好ましく
は２〜３ｍｌである。この場合、洗浄液の使用量が１ｍ
ｌ未満であると洗浄が不充分であり、一方、洗浄液の使
用量が５ｍｌを超えると細菌から色素が漏出する可能性
がある。なお、洗浄液の使用量は、色の対照表や、検量
線を作成する際の使用量と、細菌数未知試料を洗浄する
際の使用量とを等量にすることが、誤差を抑える意味で
好ましい。過剰の色素の除去は、具体的には例えば、前
記の如く染色され、かつ、疎水性フィルターに捕集され
た試料が入った注射筒に、上記の如き洗浄液をとり、加
圧濾過によって、除去することにより行なえばよい。Excess dye is removed by washing from the sample thus stained and collected on the hydrophobic filter. Here, as the dye-staining solution for staining bacteria (washing solution for dyeing the total number of bacteria), various buffer solutions (pH 6) are used.
Up to about 8) and the like can be used. further,
You may use what added various surface active agents as needed. The concentration of the surfactant is preferably 0.0001 to 1.0% by weight. The amount of the cleaning liquid used depends on the diameter of the hydrophobic filter.
If it is mm, it is 1 to 5 ml (milliliter), preferably 2 to 3 ml. In this case, the amount of cleaning liquid used is 1 m
If the amount is less than 1, the washing is insufficient, while if the amount of the washing solution used exceeds 5 ml, the dye may leak from the bacteria. The amount of the washing solution used should be equal to the amount used when creating a color control table and calibration curve, and the amount used when washing a sample with unknown bacterial count, in order to reduce errors. preferable. Excess dye is specifically removed by, for example, applying the washing liquid as described above to the syringe containing the sample dyed as described above and collected by the hydrophobic filter, and removing it by pressure filtration. This can be done by doing.
【００２１】このようにして過剰の色素が除去された試
料中の細菌の着色度から、試料中の総細菌数を測定す
る。この細菌数の測定は、目視（色の対照表）によ
り、或いは光学密度（Ｏ．Ｄ．）測定による比色定量
等により行なえばよい。The total number of bacteria in the sample is determined from the degree of coloration of the bacteria in the sample from which the excess dye has been removed in this way. The number of bacteria may be measured visually (color control table) or by colorimetric quantification by optical density (OD) measurement.
【００２２】上記の目視による細菌数の測定は、具体
的には、疎水性フィルター上に存在する細菌の着色度、
すなわち色の強度を、細菌数が既知の試料を用いて、予
め作成しておいた色の対照表と比較することにより行な
えばよい。色の対照表は、細菌数が既知の試料を用い、
本発明の方法で染色，洗浄した疎水性フィルターをカラ
ー写真に撮ることにより、又は、この疎水性フィルター
と同程度に濾紙等を着色したり、或いは同程度の色を紙
に印刷することにより、作成することができる。例え
ば、尿中の細菌数を測定する場合には、次のようにして
色の対照表を作成する。すなわち、尿中細菌は健常人の
尿中にも少数〔１ｍｌ（ミリリットル）当り１万個未
満〕存在するが、１ｍｌ当り１０万個以上存在した場合
には明らかに細菌尿症と診断される。従って、この値の
前後で検出できる色対照表を作成すればよい。例えば、
１万個／１ｍｌ以下、１０万個／１ｍｌ程度、１００万
個／１ｍｌ以上の３点の色対照表を作成すればよい。The above-mentioned visual determination of the number of bacteria is carried out by specifically measuring the degree of coloring of the bacteria present on the hydrophobic filter,
That is, it may be performed by comparing the color intensity with a previously prepared color control table using a sample having a known number of bacteria. The color control table uses samples with known bacterial numbers,
By taking a color photograph of the hydrophobic filter dyed and washed by the method of the present invention, or by coloring the filter paper or the like to the same extent as this hydrophobic filter, or by printing the same color on the paper, Can be created. For example, when measuring the number of bacteria in urine, a color control table is prepared as follows. That is, a small amount of urinary bacteria (less than 10,000 per 1 ml (milliliter)) is also present in the urine of a healthy person, but when 100,000 or more per 1 ml is present, it is clearly diagnosed as bacteriuria. Therefore, it suffices to create a color contrast table that can be detected before and after this value. For example,
It suffices to create a three-point color reference table of 10,000 pieces / 1 ml or less, 100,000 pieces / 1 ml, or 1 million pieces / 1 ml or more.
【００２３】また、上記の光学密度（Ｏ．Ｄ．）測定
による比色定量は、疎水性フィルター上に存在する細菌
に着色した色素を、溶剤を用いて溶出させ、溶出液の着
色度を吸光度を測定して光学密度（Ｏ．Ｄ．）を求め、
この測定値を予め作成した光学密度と細菌数との検量線
を用いて定量すればよい。吸光度測定時の波長は、用い
る色素により、適宜定めればよい。この測定で用いる溶
剤としては、各種アルコール類を使用することができる
が、特にエタノールが好ましい。Further, the colorimetric determination by the above optical density (OD) measurement is carried out by eluting a bacterium-colored pigment present on a hydrophobic filter with a solvent and measuring the degree of coloring of the eluate by the absorbance. To obtain the optical density (OD),
This measured value may be quantified using a calibration curve of the optical density and the number of bacteria prepared in advance. The wavelength at the time of measuring the absorbance may be appropriately determined depending on the dye used. As the solvent used in this measurement, various alcohols can be used, but ethanol is particularly preferable.
【００２４】なお、検量線の作成は、例えば次のように
して行なえばよい。即ち、色素としてフクシンを用いた
場合には、各種の濃度に希釈した試料の着色度を、マイ
クロプレートリーダーを用いて、着色度を４９２ｎｍの
光線を用いて光学密度（Ｏ．Ｄ．）を測定し、一方、各
種の濃度に希釈した試料溶液中の細菌数を、予め算出し
ておき、両者の結果から細菌数と光学密度の検量線を作
成すればよい。The calibration curve may be created, for example, as follows. That is, when fuchsin is used as a dye, the optical density (OD) of the sample diluted to various concentrations is measured using a microplate reader and a light beam of 492 nm. On the other hand, the number of bacteria in the sample solution diluted to various concentrations may be calculated in advance, and a calibration curve of the number of bacteria and the optical density may be created from the results of both.
【００２５】本発明の第２においては、まずこのような
方法で全細菌数（細菌総数）測定しておく。次に、本発
明の第２においては、このようにして全細菌数の測定さ
れた試料について、媒染剤を用いる工程以外は、前記の
如き全細菌数の測定法と同様にして、グラム陽性細菌数
を測定する。すなわち、グラム陽性細菌染色用色素を用
いてグラム陽性細菌を染色した後に疎水性フィルターに
捕集するか、或いは疎水性フィルターに捕集した後にグ
ラム陽性細菌染色用色素を用いてグラム陽性細菌を染色
し、次に媒染剤を用いて媒染し、次いで過剰のグラム陽
性細菌染色用色素及び媒染剤を洗浄により除去した後、
該フィルター上のグラム陽性細菌の着色度から試料中の
グラム陽性細菌数を測定する。この結果、試料中の全細
菌数及びグラム陽性細菌数を測定することができる。In the second aspect of the present invention, first, the total number of bacteria (total number of bacteria) is measured by such a method. Next, in the second aspect of the present invention, with respect to the sample for which the total number of bacteria has been measured in this manner, the number of Gram-positive bacteria is determined in the same manner as in the method for measuring the total number of bacteria described above, except for the step of using a mordant. To measure. That is, Gram-positive bacteria are stained with a Gram-positive bacteria staining dye and then collected on a hydrophobic filter, or collected on a hydrophobic filter and then Gram-positive bacteria are stained using a Gram-positive bacteria staining dye. And then mordanting with a mordant, then removing excess dye and mordant for Gram-positive bacteria by washing,
The number of Gram-positive bacteria in the sample is determined from the degree of coloration of Gram-positive bacteria on the filter. As a result, the total number of bacteria and the number of Gram-positive bacteria in the sample can be measured.
【００２６】本発明の第２においては、グラム陽性細菌
染色用色素を用いてグラム陽性細菌を染色した後に疎水
性フィルターに捕集するか、或いは疎水性フィルターに
捕集した後にグラム陽性細菌染色用色素を用いてグラム
陽性細菌を染色する。すなわち、グラム陽性細菌の染色
のいずれかの時期に、疎水性フィルターで捕集を行なう
ことが必要である。但し、本発明の第２では、既に前記
の如き工程において、既に疎水性フィルター上に全細菌
が捕集されている。したがって、通常は、これをそのま
ま利用すればよい。すなわち、全細菌が捕集されている
疎水性フィルターをそのまま用い、このフィルターを、
前もってグラム陽性細菌染色用色素が入れられている注
射筒に装着し、加圧濾過することにより、グラム陽性細
菌を染色し、次いで媒染剤の入っている注射筒にフィル
ターをすげかえて加圧濾過により媒染すればよい。つま
り、この工程で用いる疎水性フィルターとしては、前記
の如き工程において用いられた疎水性フィルターと同様
のもの、或いは全く同一のものをそのまま使用すること
ができる。なお、この工程は本発明の第１に相当するの
で、以下では、疎水性フィルターでの細菌の捕集から説
明する。In the second aspect of the present invention, a gram-positive bacterium-staining dye is used to stain gram-positive bacteria and then collected on a hydrophobic filter, or a gram-positive bacterium-stained dye for gram-positive bacteria staining. Stain Gram-positive bacteria with a dye. That is, it is necessary to collect with a hydrophobic filter at any time of staining of Gram-positive bacteria. However, in the second aspect of the present invention, all bacteria have already been trapped on the hydrophobic filter in the above-mentioned steps. Therefore, normally, this can be used as it is. That is, using a hydrophobic filter that collects all bacteria as it is,
Gram-positive bacteria are dyed by attaching to a syringe containing dye for staining Gram-positive bacteria in advance, and filtering under pressure to replace Gram-positive bacteria, and then replacing the filter with a syringe containing mordant by pressure filtration. You can mord it. That is, the hydrophobic filter used in this step may be the same as the hydrophobic filter used in the above-mentioned step, or the same filter as it is. Since this step corresponds to the first aspect of the present invention, the following will describe the collection of bacteria with a hydrophobic filter.
【００２７】上記のように、まずグラム陽性細菌染色用
色素を用いてグラム陽性細菌を染色した後に疎水性フィ
ルターに捕集するか、或いは疎水性フィルターに捕集し
た後にグラム陽性細菌染色用色素を用いてグラム陽性細
菌を染色する。すなわち、グラム陽性細菌の染色の前後
のいずれかの時期に、疎水性フィルターで捕集を行な
う。操作工程の簡便さから、予め試料と色素液とを混合
し、グラム陽性細菌を染色した後に、疎水性フィルター
に捕集する手法が好ましい。As described above, first, a Gram-positive bacterium-staining dye is used to stain Gram-positive bacteria and then collected on a hydrophobic filter, or a gram-positive bacterium-staining dye is collected on a hydrophobic filter. Used to stain Gram-positive bacteria. That is, collection is performed with a hydrophobic filter either before or after staining of Gram-positive bacteria. A method of mixing the sample and the dye solution in advance, staining the Gram-positive bacteria, and then collecting them on the hydrophobic filter is preferable from the viewpoint of the convenience of the operation steps.
【００２８】ここでグラム陽性細菌の染色は、グラム陽
性細菌染色用色素を用いることにより行なわれる。より
具体的には、各種のグラム陽性細菌染色用色素を用い、
これを色素液とし、このグラム陽性細菌染色用色素液
を、フィルターで細菌を捕集する前、或いはフィルター
に捕集した後の試料に添加することにより行なう。グラ
ム陽性細菌染色用色素としては、グラム陽性細菌の染色
に使用可能な色素であれば特に制限はない。しかしなが
ら、本発明の第２の場合には、前記工程で行なった全細
菌染色用色素を用いての全細菌の染色時に使用する全細
菌染色用色素（例えば、サフラニン，フクシンなど）を
考慮すると、クリスタルバイオレット，ビクトリアブル
ーＢなどが媒染のし易さの点からみても好ましい。Staining of Gram-positive bacteria is carried out by using a dye for staining Gram-positive bacteria. More specifically, using various Gram-positive bacterial staining dyes,
This is used as a dye solution, and the dye solution for staining Gram-positive bacteria is added to the sample before the bacteria are collected by the filter or after being collected by the filter. The dye for staining Gram-positive bacteria is not particularly limited as long as it can be used for staining Gram-positive bacteria. However, in the second case of the present invention, in consideration of the total bacteria staining dye (for example, safranine, fuchsin, etc.) used when staining all bacteria using the total bacteria staining dye performed in the above step, Crystal violet, Victoria Blue B and the like are also preferable from the viewpoint of mordability.
【００２９】上記グラム陽性細菌染色用色素は、水溶液
（色素液）として使用される。色素液として、クリスタ
ルバイオレットの水溶液を用いた場合には、色素液の濃
度は0.001 〜２重量％、好ましくは0.01〜１重量％とす
る。この場合、必要に応じてフェノールまたはシュウ酸
アンモニウムを添加することもでき、その場合の添加量
は0.01〜５重量％とすればよい。また、色素液としてビ
クトリアブルーＢの水溶液を用いた場合には、色素液の
濃度は、0.001 〜１重量％、好ましくは0.01〜0.５重量
％とする。この場合、必要に応じてシュウ酸アンモニウ
ムを添加することもでき、その場合の添加量は0.05〜１
重量％添加とすればよい。The above-mentioned Gram-positive bacteria staining dye is used as an aqueous solution (dye liquid). When an aqueous solution of crystal violet is used as the dye solution, the concentration of the dye solution is 0.001 to 2% by weight, preferably 0.01 to 1% by weight. In this case, phenol or ammonium oxalate may be added if necessary, and the addition amount in that case may be 0.01 to 5% by weight. When an aqueous solution of Victoria Blue B is used as the dye solution, the concentration of the dye solution is 0.001 to 1% by weight, preferably 0.01 to 0.5% by weight. In this case, ammonium oxalate can be added if necessary, and the addition amount is 0.05 to 1
It may be added by weight%.
【００３０】上記グラム陽性細菌染色用色素液の調製に
あたっては、予め所定濃度の色素液を作製しておき、こ
れを後述する如き洗浄液を用いて希釈して、所望する濃
度のものとしてもよい。このようなグラム陽性細菌染色
用色素液の液量は、１〜５ｍｌ、好ましくは２〜３ｍｌ
である。ここでグラム陽性細菌染色用色素液の液量が１
ｍｌ未満であると、着色が不充分となってしまい好まし
くない。In the preparation of the dye solution for staining Gram-positive bacteria, a dye solution having a predetermined concentration may be prepared in advance, and the dye solution may be diluted with a washing solution as described below to obtain a desired concentration. The amount of such a dye solution for staining Gram-positive bacteria is 1 to 5 ml, preferably 2 to 3 ml.
Is. Here, the amount of dye liquid for staining Gram-positive bacteria is 1
When it is less than ml, coloring becomes insufficient, which is not preferable.
【００３１】本発明では、グラム陽性細菌のみを染色す
るために、上記のグラム陽性細菌染色用色素液で染色し
た後、媒染剤による媒染を行なう。ここで媒染を行なわ
ないと、グラム陽性細菌に染色を固定できない。In the present invention, in order to stain only Gram-positive bacteria, mordant with a mordant is carried out after staining with the above-described Gram-positive bacteria staining dye solution. Without mordanting, the stain cannot be fixed on Gram-positive bacteria.
【００３２】媒染剤としては、ルゴール液，ピクリン酸
含有アルコール等を使用することができるが、グラム陽
性細菌染色用色素としてクリスタルバイオレットを用い
た場合には、媒染剤としてルゴール液を用いることが好
ましい。また、グラム陽性細菌染色用色素としてビクト
リアブルーＢを用いた場合には、媒染剤としてピクリン
酸含有エタノールを用いることが好ましい。ここでルゴ
ール液としては、通常、細菌の媒染に使用されるもので
良く、媒染に使用する液量は0.2 〜５ｍｌ、好ましくは
0.5 〜３ｍｌである。一方、ピクリン酸含有アルコール
について、ピクリン酸のアルコール中の濃度は0.1 〜５
重量％、好ましくは0.5 〜２重量％である。また、媒染
に使用する液量は0.2 ｍｌ以上、好ましくは１ｍｌ以上
である。As the mordant, Lugol's solution, picric acid-containing alcohol, etc. can be used, but when crystal violet is used as the dye for staining Gram-positive bacteria, Lugol's solution is preferably used as the mordant. Further, when Victoria Blue B is used as the dye for staining Gram-positive bacteria, it is preferable to use picric acid-containing ethanol as the mordant. Here, the Lugol's solution may be one normally used for mordant of bacteria, and the amount of the solution used for mordant is 0.2 to 5 ml, preferably
It is 0.5 to 3 ml. On the other hand, regarding the picric acid-containing alcohol, the concentration of picric acid in the alcohol is 0.1 to 5
%, Preferably 0.5-2% by weight. The amount of liquid used for mordant is 0.2 ml or more, preferably 1 ml or more.
【００３３】次に、本発明の第１及び本発明の第２の当
該工程で用いられる疎水性フィルターとしては、本発明
の第２の前記工程の説明中で示したものと同様のもの、
或いは同一のものを用いればよいことは、前述した通り
である。Next, the hydrophobic filter used in the first and second steps of the present invention is the same as that shown in the description of the second step of the present invention,
Alternatively, the same one may be used as described above.
【００３４】上記の如き疎水性フィルターを用いて、細
菌の染色のいずれかの時期に、細菌の捕集を行なう。こ
の疎水性フィルターでの細菌の捕集は、前述した捕集の
仕方と同様に行なえばよい。但し、本発明の第２では、
既に前記の如き工程において、疎水性フィルター上に全
細菌が捕集されているので、これをそのまま利用すれば
よいことは、前述した通りである。すなわち、全細菌が
捕集されている疎水性フィルターをそのまま用い、この
フィルターを、前もってグラム陽性細菌染色用色素の入
った注射筒に装着し、加圧濾過し、次いでこのフィルタ
ーを媒染剤が入れられている注射筒に装着し、加圧濾過
することにより、細菌を染色すればよい。The hydrophobic filter as described above is used to collect the bacteria at any time during the staining of the bacteria. The collection of bacteria with this hydrophobic filter may be performed in the same manner as the collection method described above. However, in the second aspect of the present invention,
As described above, since all the bacteria have already been collected on the hydrophobic filter in the steps as described above, they can be used as they are. That is, a hydrophobic filter in which all bacteria are collected is used as it is, and this filter is attached to a syringe containing a dye for staining Gram-positive bacteria in advance, pressure-filtered, and then this filter is added with a mordant. The bacteria may be stained by mounting the syringe in a syringe and filtering under pressure.
【００３５】このようにして染色され、かつ、疎水性フ
ィルターに捕集された試料から、過剰の色素及び媒染剤
を洗浄により除去する。ここでグラム陽性細菌染色用色
素の洗浄液としては、種々のものがあるが、例えば媒染
剤として、ピクリン酸含有アルコールを用いた場合に
は、アルコール含有水を使用すればよい。この場合のア
ルコール濃度は１０〜４０容積％、好ましくは２０〜３
０容積％である。アルコールとしては、メタノール，エ
タノール，プロパノール等が挙げられるが、特にエタノ
ールが好ましい。なお、前述した通り、洗浄液の使用量
は、疎水性フィルターの口径に依存するが、例えば疎水
性フィルターの口径が１３ｍｍであれば、１〜５ｍｌ
（ミリリットル）、好ましくは２〜３ｍｌである。この
場合、洗浄液の使用量が１ｍｌ未満であると洗浄が不充
分であり、一方、洗浄液の使用量が５ｍｌを超えると細
菌から色素が漏出する可能性がある。また、洗浄液の使
用量は、色の対照表や、検量線を作成する際の使用量
と、細菌数未知試料を洗浄する際の使用量とを等量にす
ることが、誤差を抑える意味で好ましい。一方、媒染剤
としてルゴール液を用いた場合には、色素および高濃度
アルコール溶液（例えば９５容積％エタノール溶液な
ど）の洗浄は水でよい。この場合の水の使用量は１〜１
０ｍｌ、好ましくは２〜５ｍｌである。ここで水の使用
量が１ｍｌ未満では洗浄が不充分となり、一方、１０ｍ
ｌを超えて使用しても、ほとんど洗浄効果に差が見られ
ない。Excess dye and mordant are removed by washing from the sample thus dyed and collected on the hydrophobic filter. Here, there are various types of washing solutions for dyes for staining Gram-positive bacteria. For example, when picric acid-containing alcohol is used as a mordant, alcohol-containing water may be used. The alcohol concentration in this case is 10 to 40% by volume, preferably 20 to 3
It is 0% by volume. Examples of alcohols include methanol, ethanol and propanol, with ethanol being particularly preferred. As described above, the amount of the cleaning liquid used depends on the diameter of the hydrophobic filter, but if the diameter of the hydrophobic filter is 13 mm, for example, 1 to 5 ml.
(Ml), preferably 2-3 ml. In this case, if the amount of the washing liquid used is less than 1 ml, the washing is insufficient, while if the amount of the washing liquid used exceeds 5 ml, the dye may leak from the bacteria. In addition, the amount of washing solution used should be equal to the amount used when creating a color control table or calibration curve, and the amount used when washing a sample with unknown bacterial count, in order to reduce errors. preferable. On the other hand, when Lugol's solution is used as the mordant, the dye and the high-concentration alcohol solution (for example, 95% by volume ethanol solution) may be washed with water. The amount of water used in this case is 1 to 1
It is 0 ml, preferably 2 to 5 ml. If the amount of water used is less than 1 ml, the cleaning will be inadequate.
Even if it is used over 1, there is almost no difference in the cleaning effect.
【００３６】過剰の色素の除去は、具体的には例えば、
前記の如く染色され、かつ、疎水性フィルターに捕集さ
れた試料が入った注射筒に、上記の如き洗浄液をとり、
加圧濾過によって、除去することにより行なえばよい。The removal of the excess dye is specifically carried out, for example, by
Take the washing solution as described above into the syringe containing the sample dyed as described above and collected by the hydrophobic filter,
It may be carried out by removing it by pressure filtration.
【００３７】このようにして過剰の色素が除去された試
料中の細菌の着色度から、試料中のグラム陽性細菌数を
測定する。このグラム陽性細菌数の測定は、目視（色
の対照表）により、或いは光学密度（Ｏ．Ｄ．）測定
による比色定量等により行なえばよい。これらについて
は、前述の記載通りである。The number of Gram-positive bacteria in the sample is determined from the degree of coloration of the bacteria in the sample from which the excess dye has been removed in this way. The number of Gram-positive bacteria may be measured visually (color control table) or by colorimetric determination by optical density (OD) measurement. These are as described above.
【００３８】ここで本発明の第２において、色の対照表
を用いる場合には、前記した疎水性フィルター，該フィ
ルターに装着しうる注射筒，細菌染色用色素液，グラム
陽性細菌染色用色素液，媒染剤，細菌染色用色素の洗浄
液，グラム陽性細菌染色用色素及び媒染剤の洗浄液と組
み合わせて、試料中の細菌数を迅速、かつ、簡便に測定
しうる測定キットを用いるのが好適である。なお、注射
筒は疎水性フィルターと組み合わせて加圧濾過できるも
のであればよく、特に制限はない。また、その材質は、
ガラス製，プラスチック製のいずれも使用することがで
きる。さらに、その容量は、使用する洗浄液等の液量に
応じて選択すればよい。また、このように色の対照表を
用いる場合において、本発明の第１のように、グラム陽
性細菌数のみを測定するときには、細菌染色用色素液及
び細菌染色用色素の洗浄液は不要である。すなわち、前
記した疎水性フィルター，該フィルターに装着しうる注
射筒，グラム陽性細菌染色用色素液，媒染剤，グラム陽
性細菌染色用色素及び媒染剤の洗浄液と組み合わせて、
試料中のグラム陽性細菌数を迅速、かつ、簡便に測定し
うる測定キットを用いればよい。このようにして、試料
中のグラム陽性細菌数（本発明の第１）、或いは試料中
の全細菌数及びグラム陽性細菌数（本発明の第２）を測
定することができる。また、全細菌数とグラム陽性細菌
数との差から、グラム陰性細菌数を求めることもでき
る。Here, in the second aspect of the present invention, when a color control table is used, the above-mentioned hydrophobic filter, syringe which can be attached to the filter, dye solution for staining bacteria, dye solution for staining Gram-positive bacteria are used. It is preferable to use a measurement kit capable of quickly and simply measuring the number of bacteria in a sample in combination with a mordant, a washing solution for staining bacteria, a washing solution for staining Gram-positive bacteria and a washing solution for mordants. The syringe is not particularly limited as long as it can be pressure-filtered in combination with a hydrophobic filter. Also, the material is
Both glass and plastic can be used. Further, the volume may be selected according to the amount of the cleaning liquid or the like used. Further, in the case of using the color control table as described above, when only the number of Gram-positive bacteria is measured as in the first aspect of the present invention, the bacterial dyeing dye solution and the bacterial dyeing wash solution are not necessary. That is, in combination with the above-mentioned hydrophobic filter, a syringe that can be attached to the filter, a dye solution for staining Gram-positive bacteria, a mordant, a dye for staining Gram-positive bacteria and a cleaning solution for mordant,
A measurement kit that can quickly and easily measure the number of Gram-positive bacteria in a sample may be used. In this way, the number of Gram-positive bacteria in the sample (first of the present invention) or the total number of bacteria and the number of Gram-positive bacteria in the sample (second of the present invention) can be measured. Further, the number of Gram-negative bacteria can be obtained from the difference between the total number of bacteria and the number of Gram-positive bacteria.
【００３９】[0039]
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１（全細菌数測定用色対照表の作成） 種菌として、大腸菌（エシェリヒア・コリ）(Escherich
ia coli)(ATCC 11303)及びブドウ球菌（スタフィロコッ
カス・アウレウス）(Staphylococcus aureus )(IFO 318
3)を用いて、以下の試験を行なった。肉汁ブイヨン培地
に種菌を接種して、３７℃で２４時間の静置培養を行な
い、標準試料用菌懸濁液とした。一方、健常人男子の放
出尿を採取し、０．５μｍのポリテトラフルオロエチレ
ン（ＰＴＦＥ）製フィルターで濾過して、細菌希釈用溶
液を調製した。この細菌希釈用溶液と、前記標準試料用
菌懸濁液を用いて、各細菌数が１万個／ｍｌ程度、
10万個／ｍｌ程度、100 万個／ｍｌ程度になるよう
に、前記希釈液を用いて３種の標準試料を調製した。な
お、細菌数は、ＣＬＥＤ寒天平地培地で２７℃で２４時
間培養した際のコロニー数により計数した。EXAMPLES Next, the present invention will be described in more detail by way of examples. Example 1 (Creation of a color control table for measuring the total number of bacteria) Escherichia coli (Escherichia coli) was used as an inoculum.
ia coli) (ATCC 11303) and Staphylococcus aureus (IFO 318
The following tests were conducted using 3). The broth broth medium was inoculated with the inoculum, and static culture was performed at 37 ° C. for 24 hours to obtain a bacterial suspension for standard sample. On the other hand, the discharged urine of a healthy male was collected and filtered with a 0.5 μm polytetrafluoroethylene (PTFE) filter to prepare a solution for bacterial dilution. Using this bacterial dilution solution and the standard sample bacterial suspension, the number of each bacteria was about 10,000 / ml,
Three kinds of standard samples were prepared by using the above-mentioned diluted solutions so that the concentration was about 100,000 cells / ml and about 1 million cells / ml. The number of bacteria was counted by the number of colonies when cultured in CLED agar flat medium at 27 ° C. for 24 hours.
【００４０】次に、フクシン染色液( フクシン濃度：２
０ｍｇ／１００ｍｌ、日水製薬製）０．５ｍｌに、水
１．０ｍｌを添加した染色液を５ｍｌ用チューブにと
り、これに上記の如くして調製された標準試料０．５ｍ
ｌを添加して細菌を染色した。１〜２秒間攪拌した後、
孔径０．５μｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦ
Ｅ）製フィルター (口径１３ｍｍ、東洋濾紙製) を装着
した５ｍｌ容の注射筒に入れて、加圧濾過することによ
り、該フィルターに細菌を捕集した（なお、捕集状態を
示す参考図を図１に示す。図中、符号１は注射筒、符号
２は試料、符号３はフィルターを示す。）。Next, a fuchsin stain (fuchsin concentration: 2
0 mg / 100 ml, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), and 1.0 ml of water was added to 0.5 ml of the staining solution, and a standard sample 0.5 m prepared as described above was added to the 5 ml tube.
1 was added to stain the bacteria. After stirring for 1-2 seconds,
Polytetrafluoroethylene with a pore size of 0.5 μm (PTF
E) A filter (caliber 13 mm, made by Toyo Roshi Kaisha, Ltd.) was placed in a 5 ml syringe, and pressure filtration was performed to collect bacteria (refer to the reference diagram showing the collection state. It shows in Drawing 1. In the figure, the code 1 shows a syringe, the code 2 shows a sample, and the code 3 shows a filter.
【００４１】次いで、該フィルターを注射筒から分離
し、前もって洗浄液（0.01重量％ツイーン２０添加ＰＢ
Ｓ緩衝液、ｐＨ７．０）３．０ｍｌを入れておいた別の
５ｍｌ容の注射筒に、再度該フィルターを装着し、洗
浄, 濾過して過剰の色素を除去した。 該フィルター上
に捕集された細菌の着色度（着色の強弱）を目視により
観察した結果、下記の第１表の通りであった。なお、菌
無添加の試料では着色しなかった。また、ここで用いた
色素液は使用に際し、前もって上記と同様の孔径０．５
μｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）製フィ
ルターで濾過した。実施例２以降の実験においても同様
の濾過操作を実施した。Then, the filter was separated from the syringe, and the washing liquid (PB containing 0.01% by weight of Tween 20 was previously added).
The filter was attached again to another 5 ml-volume syringe containing 3.0 ml of S buffer solution (pH 7.0), and the excess dye was removed by washing and filtering. The degree of coloring (strength of coloring) of the bacteria collected on the filter was visually observed, and the results are shown in Table 1 below. It should be noted that the sample without the addition of the bacteria was not colored. In addition, the dye solution used here has a similar pore size of 0.5 to the above before use.
It was filtered with a filter made of polytetrafluoroethylene (PTFE) having a thickness of μm. The same filtering operation was carried out in the experiments after Example 2.
【００４２】[0042]
【表１】 これらの着色したフィルターを、標準サンプルとしてカ
ラー写真にとり、色の対照表とした。なお、大腸菌, ブ
ドウ球菌の間で着色の程度に大差はなかった。[Table 1] These colored filters were color photographed as standard samples and used as a color control table. There was no great difference in the degree of coloring between E. coli and Staphylococcus.
【００４３】実施例２（グラム陽性細菌数測定用色対照
表の作成） 実施例１で使用した３種類のブドウ球菌の標準試料を用
いて実験を行なった。すなわち、次のような操作によ
り、２種類のグラム陽性細菌数測定用の色対照表を作成
した。 ビクトリアブルーＢ染色の例 まず標準試料０．５ｍｌを５ｍｌ容の注射筒にとり、こ
れに実施例１と同様のポリテトラフルオロエチレン（Ｐ
ＴＦＥ）製フィルター (口径１３ｍｍ、東洋濾紙製) を
装着し、加圧濾過することにより、該フィルターに細菌
を捕集した。次に、ビクトリアブルーＢ液（色素０．２
ｇ、シュウ酸アンモニウム０．８ｇ、エタノール２０ｍ
ｌ、水８０ｍｌからなる液) ０．５ｍｌに水１．５ｍｌ
を添加して２ｍｌの色素液を調製した。次いで、この色
素液を、上記のように細菌が捕集されているフィルター
の装着された注射筒に入れ、加圧濾過して、染色した。
さらに、媒染剤としてピクリン酸含有エタノール( ピク
リン酸濃度２重量％)２ｍｌの入った注射筒に、このフ
ィルターを移しかえて加圧濾過し、最後に注射筒を用い
て２０容積％エタノール溶液で２回洗浄して、過剰の色
素と媒染剤を除去した。該フィルター上に捕集されたグ
ラム陽性細菌の着色度（着色の強弱）を目視により観察
した結果、下記の第２表の通りであった。Example 2 (Preparation of Color Control Table for Gram-Positive Bacteria Count) Experiments were carried out using the standard samples of the three types of staphylococci used in Example 1. That is, two types of color control tables for measuring the number of Gram-positive bacteria were prepared by the following operations. Example of Victoria Blue B staining First, 0.5 ml of a standard sample was placed in a 5 ml syringe, and the same polytetrafluoroethylene (P) as in Example 1 (P
A TFE) filter (diameter 13 mm, manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd.) was attached, and bacteria were collected in the filter by pressure filtration. Next, Victoria Blue B liquid (pigment 0.2
g, ammonium oxalate 0.8g, ethanol 20m
1, a liquid consisting of 80 ml of water) 1.5 ml of water to 0.5 ml
Was added to prepare 2 ml of dye solution. Next, this dye solution was put into an injection cylinder equipped with a filter in which bacteria were collected as described above, filtered under pressure, and stained.
Furthermore, this filter was transferred to a syringe containing 2 ml of picric acid-containing ethanol (picric acid concentration: 2% by weight) as a mordant, and pressure filtration was performed. Finally, using a syringe, use a 20% by volume ethanol solution twice. Wash to remove excess dye and mordant. The degree of coloring (strength of coloring) of the Gram-positive bacteria collected on the filter was visually observed, and the results are shown in Table 2 below.
【００４４】 クリスタルバイオレット染色の例 まず標準試料０．５ｍｌを５ｍｌ容の注射筒にとり、こ
れに実施例１と同様のポリテトラフルオロエチレン（Ｐ
ＴＦＥ）製フィルター (口径１３ｍｍ、東洋濾紙製) を
装着し、加圧濾過することにより、該フィルターに細菌
を捕集した。次に、クリスタルバイオレット液（１００
ｍｌ当たり、色素１ｇ、フェノール０．４ｇを含有する
水溶液）０．４ｍｌに水１．６ｍｌを添加して２ｍｌの
色素液を調製した。次いで、この色素液を、上記のよう
に細菌が捕集されているフィルターの装着された注射筒
に入れ、加圧濾過して、染色した。さらに、注射筒を用
いて、３ｍｌの水で濾過により水洗した後、媒染剤とし
てルゴール液２ｍｌで同様な濾過操作を行なった。次い
で、３ｍｌの９５容積％エタノール溶液で同様に洗浄し
てから、３ｍｌの水で洗浄して、過剰の色素と媒染剤を
除去した。該フィルター上に捕集されたグラム陽性細菌
の着色度（着色の強弱）を目視により観察した結果、下
記の第２表の通りであった。Example of Crystal Violet Staining First, 0.5 ml of a standard sample was placed in a 5 ml syringe, and the same polytetrafluoroethylene (P) as in Example 1 (P
A TFE) filter (diameter 13 mm, manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd.) was attached, and bacteria were collected in the filter by pressure filtration. Next, crystal violet liquid (100
2 ml of a dye solution was prepared by adding 1.6 ml of water to 0.4 ml of an aqueous solution containing 1 g of dye and 0.4 g of phenol per ml. Next, this dye solution was put into an injection cylinder equipped with a filter in which bacteria were collected as described above, filtered under pressure, and stained. Furthermore, after using a syringe to wash with 3 ml of water by filtration, the same filtration operation was performed with 2 ml of Lugol's solution as a mordant. It was then similarly washed with 3 ml of 95% by volume ethanol solution and then with 3 ml of water to remove excess dye and mordant. The degree of coloring (strength of coloring) of the Gram-positive bacteria collected on the filter was visually observed, and the results are shown in Table 2 below.
【００４５】[0045]
【表２】 これらの着色フィルターを、標準サンプルとしてカラー
写真にとり、色の対照表とした。[Table 2] These color filters were color photographed as standard samples and used as a color control table.
【００４６】実施例３（細菌数の判定） 実施例１で調製した細菌希釈液に、実施例１で用いたと
同じ大腸菌或いはブドウ球菌を、第３表に示す量添加し
た試料を調製した。なお、この添加細菌数は、ＣＬＥＤ
寒天平板培地を用いて、３７℃で２４時間培養したとき
のコロニー数により計数した。次に、この試料につい
て、実施例１と同様にして、フクシン染色液を用いて染
色した。すなわち、フクシン染色液( フクシン濃度：２
０ｍｇ／１００ｍｌ、日水製薬製）０．５ｍｌに、水
１．０ｍｌを添加した染色液を５ｍｌ用チューブにと
り、これに上記の如くして調製された試料０．５ｍｌを
添加して細菌を染色した。１〜２秒間攪拌した後、孔径
０．５μｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）
製フィルター (口径１３ｍｍ、東洋濾紙製) を装着した
５ｍｌ容の注射筒に入れて、加圧濾過することにより、
該フィルターに細菌を捕集した。次いで、該フィルター
を注射筒から分離し、前もって洗浄液（0.01重量％ツイ
ーン２０添加ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．０）３．０ｍｌを
入れておいた別の５ｍｌ容の注射筒に、再度該フィルタ
ーを装着し、洗浄, 濾過して過剰の色素を除去した。
該フィルター上に捕集された全細菌の着色度（着色の強
弱）を目視により観察し、色対照表と比較した結果、細
菌総数は下記の第３表の通りであった。Example 3 (Determination of the number of bacteria) A sample was prepared by adding the same Escherichia coli or Staphylococcus as used in Example 1 to the diluted diluent prepared in Example 1 in the amounts shown in Table 3. In addition, the number of bacteria added is CLED
The number of colonies when cultured at 37 ° C. for 24 hours using an agar plate medium was counted. Next, this sample was dyed with a fuchsin dye solution in the same manner as in Example 1. That is, fuchsin stain (fuchsin concentration: 2
(0 mg / 100 ml, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) 0.5 ml, and 1.0 ml of water was added to a 5 ml tube, and 0.5 ml of the sample prepared as described above was added to this to stain bacteria. did. After stirring for 1-2 seconds, polytetrafluoroethylene (PTFE) with a pore size of 0.5 μm
By putting it in a 5 ml injection cylinder equipped with a filter (13 mm in diameter, manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd.) and filtering under pressure,
Bacteria were collected on the filter. Then, the filter was separated from the syringe, and the filter was attached again to another syringe having a volume of 5 ml containing 3.0 ml of the washing solution (PBS buffer solution containing 0.01% by weight Tween 20, pH 7.0) in advance. Then, it was washed and filtered to remove excess dye.
As a result of visually observing the degree of coloring (strength of coloring) of all the bacteria collected on the filter and comparing with the color control table, the total number of bacteria was as shown in Table 3 below.
【００４７】引続き、実施例２と同様にして、ビクトリ
アブルーＢ染色を行なった。すなわち、ビクトリアブル
ーＢ液（色素０．２ｇ、シュウ酸アンモニウム０．８
ｇ、エタノール２０ｍｌ、水８０ｍｌからなる液) ０．
５ｍｌに水１．５ｍｌを添加して２ｍｌの色素液を調製
した。次いで、上記のように細菌が捕集されているフィ
ルターを注射筒に装着し、この細菌が捕集されているフ
ィルターの装着された注射筒に、この色素液を入れ、加
圧濾過して、染色した。さらに、媒染剤としてピクリン
酸含有エタノール( ピクリン酸濃度２重量％)２ｍｌの
入った注射筒に、このフィルターを移しかえて加圧濾過
し、最後に注射筒を用いて２０％エタノール溶液で２回
洗浄して、過剰の色素と媒染剤を除去した。該フィルタ
ー上に捕集されたグラム陽性細菌の着色度（着色の強
弱）を目視により観察し、色対照表と比較した結果、グ
ラム陽性細菌数は下記の第３表の通りであった。Subsequently, in the same manner as in Example 2, Victoria Blue B dyeing was performed. That is, Victoria Blue B liquid (pigment 0.2 g, ammonium oxalate 0.8
g, 20 ml of ethanol, 80 ml of water).
1.5 ml of water was added to 5 ml to prepare 2 ml of dye solution. Next, as described above, the filter in which the bacteria are collected is attached to the syringe, the syringe in which the filter in which the bacteria is collected is attached, and the pigment solution is put therein, and the mixture is filtered under pressure. Stained. Furthermore, this filter was transferred to a syringe containing 2 ml of ethanol containing picric acid (picric acid concentration: 2% by weight) as a mordant, and pressure filtration was performed. Finally, the syringe was used to wash twice with a 20% ethanol solution. To remove excess dye and mordant. As a result of visually observing the degree of coloring (strength of coloring) of the Gram-positive bacteria collected on the filter and comparing it with the color control table, the number of Gram-positive bacteria was as shown in Table 3 below.
【００４８】[0048]
【表３】 [Table 3]
【００４９】＊：Ａ・・・１万程度又はそれ以上 Ｂ・・・１０万程度 Ｃ・・・１００万程度又はそれ以上*: A ... about 10,000 or more B ... about 100,000 C ... about 1 million or more
【００５０】実施例４ 膀胱炎患者１名（女性５０才）の放出尿（治療前後の尿
を使用）と、健常人２名（男性５３才、女性２０才）の
放出尿を試料として測定した。これら放出尿を、孔径が
３μｍのポリテトラフルオロエチレン製フィルター（東
洋製紙製）で濾過した尿を、試料として用いたこと以外
は、実施例３と同様にして行なった。結果を第４表に示
す。なお、ＣＬＥＤ寒天平板法で測定する際には放出尿
を直接使用した。Example 4 The urine released from one cystitis patient (female 50 years old) (using urine before and after treatment) and the urine released from two healthy persons (53 years old male, 20 years old female) were measured as samples. .. The released urine was filtered in the same manner as in Example 3 except that urine obtained by filtering a polytetrafluoroethylene filter having a pore size of 3 μm (manufactured by Toyo Paper Co., Ltd.) was used as a sample. The results are shown in Table 4. Note that the released urine was directly used when measuring by the CLED agar plate method.
【００５１】[0051]
【表４】 [Table 4]
【００５２】＊：Ａ・・・１万程度又はそれ以上 Ｂ・・・１０万程度 Ｃ・・・１００万程度又はそれ以上*: A ... about 10,000 or more B ... about 100,000 C ... about 1 million or more
【００５３】[0053]
【発明の作用・効果】本発明の方法によれば、専門的な
技術や知識を必要とせず、しかも、１０分程度の短時間
で、迅速、かつ、簡便に試料中の細菌数及びグラム陽性
菌数を測定することができる。従って、グラム陽性菌
か、グラム陰性菌かを識別することができ、しかもグラ
ム陰性菌数も算出することができる。それ故、医者は即
座に細菌尿症患者に対して薬剤の選択が可能となり、緊
急処置が可能となるという利点がある。また、本発明の
方法においては、特別な機器を必要としないので、小規
模な病院或いは診療所でも測定することができる。さら
に、本発明の方法は、疎水性フィルターの濾過孔径を選
択することにより、種々の細菌に適用できるので、応用
範囲も極めて広い。また、本発明の測定キットは、極め
て簡単、かつ、安価なものであって、特別な機器を必要
としないので、どのような現場においても使用すること
ができるという利点がある。従って、本発明は、尿検査
分野（診断分野）をはじめ、各種検査に広く利用するこ
とができる。EFFECTS OF THE INVENTION According to the method of the present invention, specialized techniques and knowledge are not required, and in a short time of about 10 minutes, the number of bacteria in a sample and the gram positive value are easily and easily obtained. The number of bacteria can be measured. Therefore, it is possible to distinguish between Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria, and it is also possible to calculate the number of Gram-negative bacteria. Therefore, there is an advantage that the doctor can immediately select the drug for the bacteriuria patient and can perform the emergency treatment. Further, since the method of the present invention does not require any special equipment, it can be measured even in a small hospital or clinic. Furthermore, the method of the present invention can be applied to various bacteria by selecting the filtration pore size of the hydrophobic filter, so that the application range is extremely wide. Further, the measurement kit of the present invention is extremely simple and inexpensive, and does not require any special equipment, so that it has an advantage that it can be used in any field. Therefore, the present invention can be widely used for various tests including the field of urinalysis (field of diagnosis).
【図１】図１は、注射筒に疎水性フィルターを装着した
図である。FIG. 1 is a view in which a hydrophobic filter is attached to an injection cylinder.
符号１は注射筒、符号２は試料、符号３は疎水性フィル
ターである。Reference numeral 1 is a syringe, reference numeral 2 is a sample, and reference numeral 3 is a hydrophobic filter.
Claims (4)
あたり、グラム陽性細菌染色用色素を用いてグラム陽性
細菌を染色した後に疎水性フィルターに捕集するか、或
いは疎水性フィルターに捕集した後にグラム陽性細菌染
色用色素を用いてグラム陽性細菌を染色し、次に該フィ
ルター上で媒染剤を用いて媒染し、次いで過剰のグラム
陽性細菌染色用色素及び媒染剤を洗浄により除去した
後、該フィルター上のグラム陽性細菌の着色度から試料
中のグラム陽性菌の細菌数を測定することを特徴とする
グラム陽性細菌数の迅速測定方法。1. When measuring the number of Gram-positive bacteria in a sample, Gram-positive bacteria are dyed with a dye for staining Gram-positive bacteria and then collected on a hydrophobic filter or collected on a hydrophobic filter. The Gram-positive bacteria are subsequently stained with a Gram-positive bacteria staining dye, then mordanted on the filter with a mordant, and then the excess Gram-positive bacteria staining dye and mordant are removed by washing before the filter. A method for rapid measurement of the number of Gram-positive bacteria, which comprises measuring the number of Gram-positive bacteria in a sample from the degree of coloration of the above-mentioned Gram-positive bacteria.
しうる注射筒，グラム陽性細菌染色用色素液，媒染剤，
グラム陽性細菌染色用色素及び媒染剤の洗浄液及び色対
照表よりなる、グラム陽性細菌数の測定キット。2. A hydrophobic filter, a syringe capable of mounting the filter, a dye solution for staining Gram-positive bacteria, a mordant,
A kit for measuring the number of Gram-positive bacteria, which comprises a washing solution of a dye for staining Gram-positive bacteria and a mordant, and a color control table.
を測定するにあたり、細菌染色用色素を用いて細菌を染
色した後に疎水性フィルターに捕集するか、或いは疎水
性フィルターに捕集した後に細菌染色用色素を用いて細
菌を染色し、次いで過剰の細菌染色用色素を洗浄により
除去した後、該フィルター上の細菌の着色度から試料中
の全細菌数を測定し、次いで該フィルター上に捕集され
た細菌をグラム陽性細菌染色用色素で染色し、次に媒染
剤を用いて媒染し、次いで過剰のグラム陽性細菌染色用
色素及び媒染剤を洗浄により除去した後、該フィルター
上のグラム陽性細菌の着色度から試料中のグラム陽性細
菌数を測定することを特徴とする、全細菌数及びグラム
陽性細菌数の迅速測定方法。3. When measuring the total number of bacteria and the number of Gram-positive bacteria in a sample, the bacteria are dyed with a dye for staining bacteria and then collected on a hydrophobic filter or collected on a hydrophobic filter. After staining the bacteria with a bacterial staining dye and then removing excess bacterial staining dye by washing, the total number of bacteria in the sample was determined from the degree of staining of the bacteria on the filter, and then on the filter. The bacteria collected in the above are stained with a gram-positive bacterium staining dye, then mordanted with a mordant, and then excess gram-positive bacterium staining dye and mordant are removed by washing, and then gram-positive on the filter. A method for rapid measurement of the total number of bacteria and the number of Gram-positive bacteria, which comprises measuring the number of Gram-positive bacteria in a sample from the degree of coloring of bacteria.
しうる注射筒，細菌染色用色素液，グラム陽性細菌染色
用色素液，媒染剤，細菌染色用色素の洗浄液，グラム陽
性細菌染色用色素及び媒染剤の洗浄液及び色対照表より
なる、全細菌数及びグラム陽性細菌数の測定キット。4. A hydrophobic filter, a syringe capable of mounting the filter, a dye solution for staining bacteria, a dye solution for staining Gram-positive bacteria, a mordant, a washing solution for dyeing bacteria, a dye for staining Gram-positive bacteria and a mordant. A kit for measuring the total number of bacteria and the number of gram-positive bacteria, which comprises a washing solution and a color control table.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13965592A JPH05308997A (en) | 1992-05-06 | 1992-05-06 | Method for rapidly measuring of bacterial number and gram-positive bacterial number and measurement kit |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13965592A JPH05308997A (en) | 1992-05-06 | 1992-05-06 | Method for rapidly measuring of bacterial number and gram-positive bacterial number and measurement kit |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05308997A true JPH05308997A (en) | 1993-11-22 |
Family
ID=15250330
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13965592A Pending JPH05308997A (en) | 1992-05-06 | 1992-05-06 | Method for rapidly measuring of bacterial number and gram-positive bacterial number and measurement kit |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05308997A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0818540A1 (en) * | 1995-03-28 | 1998-01-14 | Idemitsu Kosan Company Limited | Method for rapidly determining number of bacteria and equipment for determining number of bacteria |
| JP2022000051A (en) * | 2013-12-04 | 2022-01-04 | ポカード・ディアグノスティクス・リミテッドPocared Diagnostics, Ltd. | Method and device for processing and analyzing particles extracted by tangential filtering |
-
1992
- 1992-05-06 JP JP13965592A patent/JPH05308997A/en active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0818540A1 (en) * | 1995-03-28 | 1998-01-14 | Idemitsu Kosan Company Limited | Method for rapidly determining number of bacteria and equipment for determining number of bacteria |
| EP0818540A4 (en) * | 1995-03-28 | 2004-09-15 | Idemitsu Kosan Co | Method for rapidly determining number of bacteria and equipment for determining number of bacteria |
| JP2022000051A (en) * | 2013-12-04 | 2022-01-04 | ポカード・ディアグノスティクス・リミテッドPocared Diagnostics, Ltd. | Method and device for processing and analyzing particles extracted by tangential filtering |
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