JPH05304988A - Hd-resistant monoclonal antibody and cell stain producing the same - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide the novel monoclonal antibody useful for immunological therapies, etc., for cancer cells. CONSTITUTION:The HD-resistant human monoclonal IgG antibody uniquely reacting with a HD antigen. The HD antigen includes a HD3 antigen. The HD human monoclonal IgG antibody uniquely reacting with the HD3 antibody is produced from SHHD1 (FERM P-12696).

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、ＨＤ抗原(Hanganutziu
-Deicher抗原）と特異的に反応するヒトモノクローナル
抗体及びそれを産生する細胞株に関する。The present invention relates to HD antigen (Hanganutziu).
-Deicher antigen) specifically reacting with human monoclonal antibody and cell line producing the same.

【０００２】[0002]

【従来の技術】ＨＤ抗原は、糖脂質であり、動物の組織
や血清中に存在するが、ヒト及びニワトリの正常組織や
正常血清中には存在しない。しかしながら、ヒトであっ
ても、癌細胞の表面や癌患者の血清中に見出される。Ｈ
Ｄ抗原には、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）におけ
る移動度の順にＨＤ３、ＨＤ５及びＨＤ７抗原がある
が、とりわけ、ＨＤ３抗原は肝臓癌、メラノーマ、レチ
ノブラストーマ等に特異的に存在する。従って、ＨＤ抗
原に特異的に反応するモノクローナル抗体が存在すれば
癌の診断及び治療に利用することができると考えられ
る。2. Description of the Related Art HD antigen is a glycolipid, which is present in animal tissues and serum, but not in normal human or chicken tissues or normal serum. However, even in humans, it is found on the surface of cancer cells and in the serum of cancer patients. H
The D antigen includes HD3, HD5, and HD7 antigens in the order of mobility in thin layer chromatography (TLC), and in particular, the HD3 antigen is specifically present in liver cancer, melanoma, retinoblastoma and the like. Therefore, it is considered that the presence of a monoclonal antibody that specifically reacts with the HD antigen can be used for diagnosis and treatment of cancer.

【０００３】通常、特定の抗原に対するモノクローナル
抗体は、該抗原でマウスやウサギのような動物を免疫
し、該動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合さ
せてハイブリドーマを得、このハイブリドーマからモノ
クローナル抗体を得ることができる。しかしながら、Ｈ
Ｄ抗原は、ヒト及びニワトリ以外の動物には存在するた
め、マウス等を用いる通常のモノクローナル抗体の生産
方法をそのまま適用して得ることはできない。Usually, a monoclonal antibody against a specific antigen is obtained by immunizing an animal such as a mouse or a rabbit with the antigen and fusing the antibody-producing cells of the animal with myeloma cells to obtain a hybridoma. From this hybridoma, a monoclonal antibody is obtained. Can be obtained. However, H
Since the D antigen exists in animals other than humans and chickens, it cannot be obtained by directly applying the usual method for producing a monoclonal antibody using a mouse or the like.

【０００４】抗ＨＤ抗原モノクローナル抗体としては、
ニワトリ型親株を作り、これをＨＤ抗原で免疫したニワ
トリのリンパ球と融合させて得たハイブリドーマにより
生産されるモノクローナル抗体が知られている（Ohashi
ら、Manganutziu-Delcherheterophile antigen in huma
n retinoblastoma cells, Am. J. Ophthamol., 96:32
1）。しかしながら、ここで得られたニワトリ型ハイブ
リドーマは不安定であり、また、ニワトリ型であるため
にヒトの治療に用いることができないという欠点を有す
る。As the anti-HD antigen monoclonal antibody,
A monoclonal antibody produced by a hybridoma obtained by making a chicken type parent strain and fusing it with chicken lymphocytes immunized with HD antigen is known (Ohashi
Et al., Manganutziu-Delcherheterophile antigen in huma
n retinoblastoma cells, Am. J. Ophthamol., 96:32
1). However, the chicken hybridomas obtained here have the disadvantages that they are unstable and cannot be used for human treatment because they are chicken.

【０００５】また、特開平１−２０２２９５号には、ヒ
トリンパ球をインビトロでＨＤ抗原により免疫後、融合
することにより抗ＨＤ抗原ヒトモノクローナル抗体を生
産する方法が開示されている。しかしながら、このいわ
ゆるインビトロ感作法では、十分な免疫化を行なうこと
ができず、感度が低いという問題がある。また、インビ
トロ感作法で生産される抗体はＩｇＭであるが、ＩｇＭ
は不安定であり、精製が困難であるという問題点があ
る。抗体としてはＩｇＧが好ましい。Further, JP-A-1-202295 discloses a method for producing an anti-HD antigen human monoclonal antibody by immunizing human lymphocytes with an HD antigen in vitro and then fusing them. However, this so-called in vitro sensitization method has a problem in that sufficient immunization cannot be performed and sensitivity is low. Although the antibody produced by the in vitro sensitization method is IgM,
Is unstable and difficult to purify. IgG is preferable as the antibody.

【０００６】[0006]

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、抗ＨＤヒトモノクローナルＩｇＧ抗体を提供するこ
とである。Accordingly, it is an object of the present invention to provide anti-HD human monoclonal IgG antibodies.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】本願出願人は、先に、ヒ
トリンパ球を免疫不全症動物に移植して生着させ、次い
で該動物を所望の抗原で免疫し、該抗原に対する抗体を
産生するヒトリンパ球を生成せしめた後、該リンパ球を
採取し、さらに該リンパ球をエプシュタイン−バールウ
イルス（ＥＢＶ）によるトランスフォーメーションによ
り、又は、ミエローマ細胞との融合等により不死化処理
して不死化抗体産生ヒト由来リンパ球を得、これをクロ
ーン化することによりヒトモノクローナル抗体、とりわ
け、ヒトＩｇＧ及びＩｇＡモノクローナル抗体を産生す
る方法を発明し、特許出願した（特願平３−３１１６６
５号）。The present applicant firstly transplanted human lymphocytes into an immunodeficient animal to make them engraft, and then immunize the animal with a desired antigen to produce an antibody against the antigen. After producing human lymphocytes, the lymphocytes are collected, and further the lymphocytes are immortalized by transformation with Epstein-Barr virus (EBV) or by fusion with myeloma cells, etc. A method for producing human monoclonal antibodies, in particular, human IgG and IgA monoclonal antibodies by obtaining producing human-derived lymphocytes and cloning them was invented and applied for a patent (Japanese Patent Application No. 3-31166).
No. 5).

【０００８】本願発明者らは、この方法に基づき、抗Ｈ
Ｄ抗原ヒトモノクローナルＩｇＧ抗体を得ることに成功
し、本発明を完成した。Based on this method, the present inventors have conducted anti-H
The present invention has been completed by successfully obtaining a D antigen human monoclonal IgG antibody.

【０００９】すなわち、本発明は、ＨＤ抗原と特異的に
反応する抗ＨＤヒトモノクローナルＩｇＧ抗体及び該抗
体を産生する細胞株を提供する。That is, the present invention provides an anti-HD human monoclonal IgG antibody that specifically reacts with an HD antigen, and a cell line producing the antibody.

【００１０】本発明の細胞株及びモノクローナル抗体は
次のようにして得ることができる。先ず、ヒトの末梢血
又はリンパ球を分離し、これを免疫不全症動物に生着さ
せる。本発明で用いる免疫不全症動物は、ヒトリンパ球
を移植した時、拒絶反応を起こさない動物である。この
ような動物は物理的、化学的又は生物的な処理により人
為的に作製し得る。免疫不全症動物は広く知られてお
り、医薬品の研究等で広く用いられている。免疫不全症
動物であれば、いずれのものをも用いることができる
が、入手容易性の点からＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉ
ｄマウス（Ｇ．Ｃ．Ｂｏｓｍａら、Ｎａｔｕｒｅ，３０
１ ５２７（１９８３））が好ましい。ヒトリンパ球を
免疫不全症動物に生着させる方法は、単にヒトリンパ球
を該動物に投与することにより行なうことができる。投
与経路は皮下、静脈内、腹腔内等、特に限定されない
が、マウスを用いる場合は腹腔内に移植することが好都
合である。また、ヒトリンパ球の投与量も特に限定され
ないが、通常１０⁶ 個ないし１０⁸ 個程度である。The cell line and monoclonal antibody of the present invention can be obtained as follows. First, human peripheral blood or lymphocytes are separated and engrafted on immunodeficient animals. The immunodeficiency animal used in the present invention is an animal that does not cause rejection when human lymphocytes are transplanted. Such animals can be artificially produced by physical, chemical or biological treatments. Immunodeficient animals are widely known and widely used in drug research and the like. Although any animal can be used as long as it is an immunodeficient animal, C.I. B-17 / Icr-sci
d mouse (GC Bosma et al., Nature, 30.
1 527 (1983)) is preferred. The method for engrafting human lymphocytes in an immunodeficient animal can be carried out by simply administering human lymphocytes to the animal. The administration route is not particularly limited, such as subcutaneous, intravenous, intraperitoneal, etc., but when using a mouse, it is convenient to transplant into the abdominal cavity. The dose of human lymphocytes is not particularly limited, but is usually about 10 ⁶ to 10 ⁸ .

【００１１】次いで、免疫不全症動物をＨＤ抗原で免疫
する。免疫方法自体は、モノクローナル抗体の分野にお
いて周知の方法により行なうことができ、例えば「富山
朔二・安東民衛編「単クローン抗体実験マニュアル 講
談社サイエンティフィック（１９８７））に記載された
方法を用いることができるが、特に好ましい態様では、
ＨＤ抗原１０〜５００μｇを２〜３週間おきにアジュバ
ントと等量混合して腹腔に接種し、さらにＨＤ抗原１０
〜５００μｇを生理食塩水に懸濁し腹腔又は静脈に投与
する。ＨＤ抗原は容易に入手することができ、例えば、
Higashi et al,Biochem. Biophys. Res. Commun., 79,
388(1977)に記載の方法によりウマ赤血球から単離精製
したＨＤ３抗原やウシ赤血球から単離精製したＨＤ５抗
原、ＨＤ７抗原を用いることができる。Then, the immunodeficient animal is immunized with the HD antigen. The immunization method itself can be carried out by a method well known in the field of monoclonal antibodies, for example, using the method described in “Sakuji Tomiyama / Tamie Ando, Ed., Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)”. However, in a particularly preferred embodiment,
HD antigen 10-500 μg is mixed with an equal amount of an adjuvant every 2-3 weeks and inoculated into the abdominal cavity.
Approximately 500 μg is suspended in physiological saline and administered intraperitoneally or intravenously. HD antigens are readily available, eg
Higashi et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 79,
HD3 antigen isolated and purified from horse red blood cells and HD5 antigen and HD7 antigen isolated and purified from bovine red blood cells by the method described in 388 (1977) can be used.

【００１２】免疫終了後、動物の脾臓、胸腺若しくは腸
間膜リンパ節又はその他のリンパ球組織よりヒトリンパ
球を回収する。回収は、上記した特に好ましい態様で免
疫を行なう場合、最終免疫の３〜４日後が好ましい。リ
ンパ球の回収は、例えば、先ず、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐ
ａｑｕｅ（比重１．０７７）遠心法により単核球を分離
し、さらにｐｌａｓｔｉｃ ｄｉｓｈ付着法等で単球を
除去する。混入する動物由来細胞の除去は、この動物細
胞に特異的な抗血清を用いることにより行なうことがで
きる。この抗血清は、例えば、その動物の脾細胞を抗原
として他の動物に免疫し、免疫した動物から血清を分離
することにより得ることができる。この抗血清による処
理は、リンパ球分離のどの過程で行なっても差し支えな
い。また、細胞表面に発現しているヒト免疫グロブリン
をマーカーにした免疫学的な手法によってもヒトリンパ
球を分離することが可能である。上記方法により、ＨＤ
抗原に対する主としてＩｇＧ抗体を産生するヒト由来リ
ンパ球を得ることができる。After completion of immunization, human lymphocytes are collected from the spleen, thymus or mesenteric lymph node of the animal or other lymphocyte tissue. When the immunization is carried out in the above particularly preferred embodiment, the recovery is preferably 3 to 4 days after the final immunization. Lymphocytes can be collected, for example, by first using Ficoll-Hyp.
The mononuclear cells are separated by the aque (specific gravity 1.077) centrifugation method, and the monocytes are removed by the plastic dish attachment method or the like. Removal of contaminated animal-derived cells can be performed by using an antiserum specific to the animal cells. This antiserum can be obtained, for example, by immunizing another animal with spleen cells of the animal as an antigen and separating the serum from the immunized animal. The treatment with the antiserum may be performed at any stage of lymphocyte separation. Human lymphocytes can also be isolated by an immunological method using a human immunoglobulin expressed on the cell surface as a marker. By the above method, HD
Human-derived lymphocytes that produce mainly IgG antibodies against the antigen can be obtained.

【００１３】得られたヒト由来リンパ球からヒトモノク
ローナル抗体を得る場合には、先ず、該ヒト由来リンパ
球を不死化する。不死化の方法自体は公知であり、例え
ば、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）を用いた
トランスフォーム法（Ｄ．Ｋｏｚｂｏｒら、Methods in
Enzymology, 121 140 (1986))により、若しくはモノク
ローナル抗体の作製において常用されている細胞融合法
（Ｔ．Ｋｕｄｏら、Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ．ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１５４，３４５（１９８８））により、又はこれら
の組合せにより行なうことができる。あるいは、免疫終
了後に、免疫不全症動物に直接ＥＢＶを接種し、トラン
スフォームされたヒト由来リンパ球を体内から分離する
ことも可能である。特に好ましい態様は、上記トランス
フォーム法と細胞融合法を組合せた方法である。すなわ
ち、例えば、上記方法により得たリンパ球をリン酸緩衝
液で洗浄後、ＥＢＶを感染させてトランスフォームし、
培養上清中の抗体の反応性をＨＤ抗原を用いたＥＬＩＳ
Ａ法で確認し、反応性の高かったものを培養増殖させ、
ヒト又はマウス由来の親株と融合させる。親株として
は、公知のミエローマ細胞を用いることができ、例えば
ヒト由来の親株としてＫＲ−１２（J. Immunol. 133, 3
001 (1984)）及びＷ１Ｌ−２ＮＳ等（ＡＴＣＣＣＲＬ８
／５５，Cancer 22:517-524 (1968)）、マウス由来の親
株としてＳＰ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８００６、J. V
irol. 36:547-555(1980)）、Ｐ３ｘ６３（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ１５８０，J. Immunol. 123:1548-1550(1979) 及び
ＮＳ−１（ＡＴＣＣ Ｔ１Ｂ１８、Eur. J. Immunol.
6:511 (1976) ）等、ヒト／マウス雑種親株としてＳＨ
Ｍ−Ｄ３３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６８）等を挙げるこ
とができる。When a human monoclonal antibody is obtained from the obtained human-derived lymphocytes, the human-derived lymphocytes are first immortalized. The immortalization method itself is known, and for example, a transform method using Epstein-Barr virus (EBV) (D. Kozbor et al., Methods in
Enzymology, 121 140 (1986)) or a cell fusion method commonly used in the production of monoclonal antibodies (T. Kudo et al., Tohoku J. exp. Me.
d. 154 , 345 (1988)), or a combination thereof. Alternatively, after completion of immunization, it is also possible to directly inoculate the immunodeficient animal with EBV and isolate the transformed human-derived lymphocytes from the body. A particularly preferred embodiment is a method combining the transform method and the cell fusion method. That is, for example, the lymphocytes obtained by the above method are washed with a phosphate buffer solution, infected with EBV, and transformed,
The reactivity of the antibody in the culture supernatant was determined by ELISA using HD antigen.
After confirming with method A, the highly reactive one was cultured and proliferated,
It is fused with a parent strain derived from human or mouse. As the parent strain, known myeloma cells can be used. For example, as the human-derived parent strain, KR-12 (J. Immunol. 133, 3
001 (1984)) and W1L-2NS etc. (ATCC CRL8
/ 55, Cancer 22: 517-524 (1968)), SP2 / 0 (ATCC CRL8006, J. V.) as a parent strain derived from a mouse.
irol. 36: 547-555 (1980)), P3x63 (ATCC C
RL1580, J. Immunol. 123: 1548-1550 (1979) and NS-1 (ATCC T1B18, Eur. J. Immunol.
6: 511 (1976)), etc. as a human / mouse hybrid parent strain SH
M-D33 (ATCC CRL1668) and the like can be mentioned.

【００１４】不死化細胞からモノクローナル抗体を回収
する方法は、モノクローナル抗体の作製において常用さ
れている周知の方法により行なうことができる。すなわ
ち、不死化したリンパ球を限界希釈法等でクローン化
し、所望の抗体を産生するものを選択し、それを培地中
又は動物の腹腔内で培養して増殖させ、その培養上清又
は腹水中から所望のモノクローナル抗体を採取すること
ができる。The method for recovering the monoclonal antibody from the immortalized cells can be carried out by a well-known method that is commonly used in the production of monoclonal antibodies. That is, an immortalized lymphocyte is cloned by a limiting dilution method or the like, and one that produces the desired antibody is selected, and then it is cultured in the medium or in the abdominal cavity of an animal to be proliferated, and its culture supernatant or ascites fluid is used. The desired monoclonal antibody can be collected from

【００１５】本発明のモノクローナル抗体ＩｇＧには、
その等価物例えば検出し得るシグナルを供することがで
きるラベルによりラベルされた該抗体やその断片あるい
は細胞毒性を有する毒素によりラベルされた該抗体やそ
の断片も含まれる。これらは公知の方法によりモノクロ
ーナル抗体ＩｇＧより容易に調製できる。The monoclonal antibody IgG of the present invention comprises:
The equivalent thereof, for example, the antibody or fragment thereof labeled with a label capable of providing a detectable signal or the antibody or fragment thereof labeled with a cytotoxic toxin is also included. These can be easily prepared from the monoclonal antibody IgG by a known method.

【００１６】[0016]

【実施例】次いで、実施例に基づき本発明をより具体的
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。EXAMPLES Next, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.

【００１７】ヒト末梢血１０ｍｌよりリンパ球１０⁷ 個
を分離した。これをＳＣＩＤマウス（FOX CHASE SCID
C,B-17/Icr-scid Jcl、（クレア社より購入））メス、
５週令の腹腔に移植した。ＨＤ３抗原（Higashi らの方
法（上掲）によりウマ赤血球より調製）１００μｇを
０．５ｍｌのフロイントの不完全アジュバント（ギブコ
社製）と混合し、腹腔に免疫した。２週間後、同じ操作
を繰り返した。さらに２週間後、５０μｇのＨＤ３抗原
を生理食塩水１ｍｌに懸濁し、腹腔内に投与した。３日
後にマウスを屠殺し、腸間膜リンパ球を摘出した。これ
をリン酸緩衝液にて３回洗浄後、工藤の方法（Tohoku
J. exp. Med. 154,345-355, 1988)に従いＥＢＶでトラ
ンスフォームした。トランスフォーマントの培養上清を
ＨＤ３抗原を用いて抗ＨＤ３抗原抗体産生株、６株を得
た。中でも反応性の高かった株ＳＨＨＤ（微工研菌寄第
１２６５５号）をＳＨＭ−Ｄ３３（ヒトマウス雑種親
株：ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６８）と工藤の方法（上掲）
に従い融合した。得られたハイブリドーマをＨＤ３抗原
を用いてスクリーニングし、反応性の高い株について限
界希釈法によりクローニングを行ないＳＨＨＤ１を得
た。ＳＨＨＤ１は微工研に寄託され、その受託番号は微
工研菌寄第１２６９６号である。なお、ＳＨＨＤ１を公
知の細胞融合により抗ＨＤヒトモノクローナル抗体Ｉｇ
Ｇ抗体産生ハイブリドーマに誘導することもできる。10 ⁷ lymphocytes were isolated from 10 ml of human peripheral blood. This is a SCID mouse (FOX CHASE SCID
C, B-17 / Icr-scid Jcl, (purchased from Claire)) female,
It was transplanted into the abdominal cavity of 5 weeks old. 100 μg of HD3 antigen (prepared from horse red blood cells by the method of Higashi et al. (Supra)) was mixed with 0.5 ml of Freund's incomplete adjuvant (manufactured by Gibco) and immunized intraperitoneally. Two weeks later, the same operation was repeated. After 2 weeks, 50 μg of HD3 antigen was suspended in 1 ml of physiological saline and intraperitoneally administered. After 3 days, the mice were sacrificed and mesenteric lymphocytes were extracted. After washing this three times with phosphate buffer, Kudo's method (Tohoku
EBV transformation according to J. exp. Med. 154, 345-355, 1988). Using the HD3 antigen in the culture supernatant of the transformants, 6 strains of anti-HD3 antigen antibody-producing strains were obtained. Among them, the highly reactive strain SHHD (Microtechnology Research Institute, No. 12655) was used as a method of SHM-D33 (human mouse hybrid parent strain: ATCC CRL1668) and Kudo (above).
Fused according to. The obtained hybridomas were screened using the HD3 antigen, and highly reactive strains were cloned by the limiting dilution method to obtain SHHD1. SHHD1 has been deposited with the Institute of Microtechnology, and the deposit number is Microorganism Institute No. 12696. It should be noted that SHHD1 was prepared by known cell fusion using anti-HD human monoclonal antibody Ig.
It can also be induced into G antibody-producing hybridomas.

【００１８】ＳＨＨＤ１株の培養上清中に生産されるモ
ノクローナル抗体のＨＤ３抗原に対する反応性をＥＬＩ
ＳＡにより調べた。すなわち、１００μｌのＨＤ３抗原
（１μｇ／ｍｌ）をマイクロタイタープレートのウェル
に入れ、抗原を固定した。次いで油分を遠心除去したオ
ブアルブミン１％ＰＢＳ液で非特異的吸着部位をブロッ
キングし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）ＰＢＳ
で洗浄した。次いでＳＨＨＤ１株の培養上清又はＰＢＳ
を用い種々の希釈率で希釈したその希釈物５０μｌを添
加し、上記と同様に洗浄した。次いで、ペルオキシダー
ゼ標識した抗ヒトＩｇＧを加え、上記と同様に洗浄し
た。次いで、オルソフェニレンジアミン溶液及び硫酸を
加えて発色させ、４９２ｎｍにおける吸光度を測定し
た。また、対照として、培養上清に代えて標準ＩｇＧを
用いた場合も同様に測定を行なった。結果を図１に示
す。The reactivity of the monoclonal antibody produced in the culture supernatant of the SHHD1 strain with the HD3 antigen was determined by ELI.
Checked by SA. That is, 100 μl of HD3 antigen (1 μg / ml) was placed in the well of a microtiter plate to immobilize the antigen. Then, non-specific adsorption sites were blocked with 1% PBS solution of ovalbumin from which oil was removed by centrifugation, and 0.05% Tween 20 (trade name) PBS was used.
Washed with. Then culture supernatant of SHHD1 strain or PBS
50 .mu.l of the dilution diluted with various dilution ratios were added and washed in the same manner as above. Then, peroxidase-labeled anti-human IgG was added and washed as described above. Then, an orthophenylenediamine solution and sulfuric acid were added to develop color, and the absorbance at 492 nm was measured. Further, as a control, the same measurement was performed when standard IgG was used instead of the culture supernatant. The results are shown in Figure 1.

【００１９】図１から明らかなように、ＳＨＨＤ１株培
養上清のＨＤ３抗原に対する反応性は濃度に依存して変
化しており、培養上清中に抗ＨＤ３モノクローナル抗体
が生産されていることが明らかになった。As is clear from FIG. 1, the reactivity of the SHHD1 strain culture supernatant with the HD3 antigen varies depending on the concentration, and it is clear that anti-HD3 monoclonal antibody is produced in the culture supernatant. Became.

【００２０】また、該モノクローナル抗体のクラスをオ
クタロニー法により調べたところ、ＩｇＧであることが
確認された。When the class of the monoclonal antibody was examined by the Ouchterlony method, it was confirmed to be IgG.

【００２１】精製酵素標識ＳＨＨＤ１の反応性をＴＬＣ
−イムノステイニング法により調べた。すなわち、３μ
ｇのＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＨＤ３抗原をＨＰＴＬＣ
プレート（Ｍｅｒｃｋ社製）で展開し、次いでプレート
をポリイソブチルメタクリレート液にて処理後、１００
μｇ／ｍｌの酵素標識ＳＨＨＤ１を１％ニワトリ血清で
希釈したものを１時間反応させ、ＰＢＳで洗浄後、ジア
ミノベンチジン溶液を加えて発色させた。結果を図２の
ｂに示す。なお、図２のａは同様にＴＬＣを行った後オ
ルシノール硫酸にて糖脂質を発色させたものである。The reactivity of the purified enzyme-labeled SHHD1 was measured by TLC.
-Investigated by the immunostaining method. That is, 3μ
g of GM1, GM2, GM3 and HD3 antigens by HPTLC
Develop on a plate (Merck), then treat the plate with a polyisobutyl methacrylate solution, then add 100
A μg / ml enzyme-labeled SHHD1 diluted with 1% chicken serum was reacted for 1 hour, washed with PBS, and a diaminobenzidine solution was added to develop color. The results are shown in b of FIG. In addition, in FIG. 2A, glycolipids are colored with orcinol sulfate after similarly performing TLC.

【００２２】図２から明らかなように、ＳＨＨＤ１はＨ
Ｄ３に特異的に反応することが確認された。As is apparent from FIG. 2, SHHD1 is H
It was confirmed to react specifically with D3.

【００２３】ニワトリで作製した抗ＨＤポリクローナル
抗体１０μｇ／ｍｌをマイクロタイタープレートのウェ
ルに入れ、下部抗体とした。次いで、油分を超遠心除去
したオブアルブミン１％ＰＢＳにて非特異的な吸着部位
をブロッキングし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（商品
名）ＰＢＳで洗浄した。次いで、ＨＤ３抗原を、ＰＢＳ
を用い種々の希釈率で希釈したその希釈物及び正常ヒト
血清、メラノーマ患者血清をＰＢＳで希釈した希釈物を
５０μｌずつ添加し、上記と同様に洗浄した。次いで、
ペルオキシダーゼ標識したＳＨＨＤ１抗体を加え、上記
と同様に洗浄した。次いで、オルソフェニレンジアミン
溶液及び硫酸を加えて発色させ、４９２ｎｍにおける吸
光度を測定した。また、対照としてＨＤ３抗原に代えて
ＰＢＳを用いた場合も同様に測定を行った。結果を図３
及び表１に示す。10 μg / ml of the anti-HD polyclonal antibody prepared from chicken was placed in the well of the microtiter plate and used as the lower antibody. Next, non-specific adsorption sites were blocked with ovalbumin 1% PBS from which oil was removed by ultracentrifugation, and washed with 0.05% Tween 20 (trade name) PBS. Then, the HD3 antigen was added to PBS.
50 .mu.l each of the dilutions diluted with various dilution ratios, normal human serum and melanoma patient serum diluted with PBS were added and washed in the same manner as above. Then
A peroxidase-labeled SHHD1 antibody was added and washed in the same manner as above. Then, an orthophenylenediamine solution and sulfuric acid were added to develop color, and the absorbance at 492 nm was measured. Moreover, when PBS was used instead of the HD3 antigen as a control, the same measurement was performed. The result is shown in Figure 3.
And shown in Table 1.

【表１】 [Table 1]

【００２４】図３及び表１から明らかなように、この抗
体を用いて血中ＨＤ抗原の定量が可能であり、かつ、メ
ラノーマ患者において有意に血中濃度の上昇がみられ
た。これは、癌細胞の検出が可能であることを示してい
る。As is clear from FIG. 3 and Table 1, blood HD antigen can be quantified using this antibody, and a significant increase in blood concentration was observed in melanoma patients. This indicates that cancer cells can be detected.

【００２５】凝集したウマ膵臓及びメラノーマ切片を薄
切りし、スライドグラスに貼り付けたものを４％パラホ
ルムアルデヒドにて固定し、過酸化水素０．３％にて内
因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した後、１％トリ血清
ＰＢＳで希釈したペルオキシダーゼ標識ＳＨＨＤ１抗体
を加え反応させた。次いで、ＰＢＳにて十分に洗浄し、
ジアミノベンチジン溶液を加えて発色させた。また、対
照として、ペルオキシダーゼ標識したヒトＩｇＧを用い
た場合も同様に測定を行った。結果を表２に示す。Agglutinated equine pancreas and melanoma slices were sliced and fixed on a slide glass, fixed with 4% paraformaldehyde, and the endogenous peroxidase activity was inhibited with hydrogen peroxide 0.3%. Peroxidase-labeled SHHD1 antibody diluted with% avian serum PBS was added and reacted. Then, thoroughly wash with PBS,
A color was developed by adding a diaminobenzidine solution. In addition, as a control, the same measurement was performed when peroxidase-labeled human IgG was used. The results are shown in Table 2.

【表２】 [Table 2]

【００２６】表２から明らかなように、この抗体を用い
て組織中のＨＤの存在を免疫組織化学的に見ることがで
きる。また、メラノーマ患者切片にＨＤ抗原が発現して
いることがわかった。As is evident from Table 2, the presence of HD in tissues can be seen immunohistochemically using this antibody. Further, it was found that the HD antigen was expressed in the melanoma patient section.

【００２７】メラノーマ細胞を移植したヌードマウスに
標準ＩｇＧ、ＳＨＨＤ１、リシン結合ＳＨＨＤ１をそれ
ぞれ１ｍｇ／ｍｌ投与し、５日毎に腫瘍径（mean tumor
volume)を計測していった。径はｄ₁ ｘｄ₂ ｘｄ₃ ｘπ
／２により算出した。結果を図４に示す。Standard IgG, SHHD1, and lysine-bound SHHD1 were each administered to nude mice transplanted with melanoma cells at 1 mg / ml, and the tumor diameter (mean tumor) was measured every 5 days.
I measured the volume). The diameter is d ₁ xd ₂ xd ₃ xπ
Calculated by / 2. The results are shown in Fig. 4.

【００２８】図４より明らかなように、ＳＨＨＤ１、リ
シンＳＨＨＤ１は抗腫瘍効果を示している。このことよ
り、本発明のモノクローナル抗体ＩｇＧを宿主体内に投
与することにより癌細胞に対する免疫療法を行うことが
できる。As is clear from FIG. 4, SHHD1 and ricin SHHD1 show antitumor effects. From this, the immunotherapy for cancer cells can be performed by administering the monoclonal antibody IgG of the present invention into the host body.

【００２９】[0029]

【発明の効果】本発明により、抗ＨＤヒトモノクローナ
ルＩｇＧ抗体及びそれを産生する細胞株が提供された。
本発明のモノクローナル抗体はＩｇＧであるので安定性
が高く、また、精製も容易である。また、本発明のモノ
クローナル抗体は、生産の過程において十分な免疫化を
行なうことができるので、抗原に対する特異性が高い。INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides an anti-HD human monoclonal IgG antibody and a cell line producing the same.
Since the monoclonal antibody of the present invention is IgG, it has high stability and is easy to purify. Further, the monoclonal antibody of the present invention can perform sufficient immunization in the course of production, and thus has high specificity for the antigen.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】ＳＨＨＤ１株の培養上清中に生産されるモノク
ローナル抗体のＨＤ３抗原に対する反応性をＥＬＩＳＡ
により調べた結果を示す図である。FIG. 1 is an ELISA showing the reactivity of the monoclonal antibody produced in the culture supernatant of the SHHD1 strain with the HD3 antigen.
It is a figure which shows the result investigated by.

【図２】ＳＨＨＤ１抗体の各種ガングリオシドに対する
反応性をＴＬＣイムノステイニングにより調べた結果を
示す図である。FIG. 2 is a diagram showing the results of investigating the reactivity of SHHD1 antibody with various gangliosides by TLC immunostaining.

【図３】ＳＨＨＤ１により作成したＨＤ抗原アッセイ用
検量線である。FIG. 3 is a standard curve for HD antigen assay prepared by SHHD1.

【図４】各種抗体投与ヌードマウスの腫瘍径を示す図で
ある。FIG. 4 is a diagram showing tumor diameters of nude mice administered with various antibodies.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｄ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁵ Identification number Office reference number FI technical display location G01N 33/574 D 9015-2J 33/577 B 9015-2J // C12N 15/08 (C12P 21 / 08 C12R 1:91)

Claims (6)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ＨＤ抗原と特異的に反応する抗ＨＤヒト
モノクローナルＩｇＧ抗体。1. An anti-HD human monoclonal IgG antibody that specifically reacts with an HD antigen. 【請求項２】 前記ＨＤ抗原はＨＤ３抗原である請求項
１記載のモノクローナル抗体。2. The monoclonal antibody according to claim 1, wherein the HD antigen is HD3 antigen. 【請求項３】 請求項１記載のモノクローナル抗体を産
生する細胞株。3. A cell line producing the monoclonal antibody according to claim 1. 【請求項４】 ＳＨＨＤ１（微工研菌寄第１２６９６
号）である請求項３記載の細胞株。4. SHHD1 (Ministry of Industrial Science, Microbiology Research Institute No. 12696)
No.). 【請求項５】 癌細胞を検出する方法であって、試料に
請求項１又は２記載のモノクローナル抗体を混合した
後、該モノクローナル抗体とＨＤ抗原との結合の存在を
検出する癌細胞検出方法。5. A method for detecting cancer cells, which comprises mixing the sample with the monoclonal antibody according to claim 1 or 2 and detecting the presence of binding between the monoclonal antibody and HD antigen. 【請求項６】 ＳＨＨＤ１から誘導される、請求項１記
載のモノクローナル抗体を産生する細胞株。6. A cell line producing the monoclonal antibody according to claim 1, which is derived from SHHD1.