JPH05296978A - Electrophoretic device - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain an electrophoretic device which can easily measure a sample subjected to molecular-weight separation with high sensitivity by measuring fluorescence or light absorption. CONSTITUTION:Two capillaries 1 and 2 filled with a gel are coaxially fixed in a fluorescent cell 4 so that a fixed gap 3 can be maintained between them. An electrophoretic passage is constituted through the gap 3 by injecting a buffer solution into the cell 4 so that the gap 3 can be filled with the buffer solution. Fluorescence or light absorption measurement is performed in the gap 3. Since the optical measurement is performed outside the gel, a highly sensitive electrophoretic device which can make fluorescence or light absorption measurement in such a state that the measurement is hardly affected by background light can be obtained. In addition, a fluorescence or light absorption measuring section composed of an electrolyte can be easily constituted without deteriorating the molecular weight separation ability when the gel makes electrophoresis.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、核酸、蛋白、糖等を分
離分析する電気泳動装置に関し、特にＤＮＡ（核酸）等
の検出に好適な電気泳動装置に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to an electrophoretic device for separating and analyzing nucleic acids, proteins, sugars and the like, and more particularly to an electrophoretic device suitable for detecting DNA (nucleic acid) and the like.

【０００２】[0002]

【従来の技術】蛍光標識された試料を電気泳動により分
子量分離し、解析する電気泳動装置としては、例えば蛍
光体を標識物にしたＤＮＡの塩基配列決定装置がある。
塩基配列決定方法は、周知のサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）
らのジデオキシ法による。つまり、解析するＤＮＡをベ
クターに導入して増幅し、変性させて一本鎖の鋳型ＤＮ
Ａをつくる。この鋳型ＤＮＡにプライマーＤＮＡを結合
させ、プライマーＤＮＡを起点とした相補鎖合成を行わ
せる。この際、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸の
他に、ターミネーターとなる特定の１種のジデオキシヌ
クレオチド三リン酸を加えておく。このジデオキシヌク
レオチド三リン酸が取り込まれたときに相補鎖合成が止
まるため、特定の塩基で止まった種々の長さのＤＮＡ断
片が得られる。そこで、アデニン（Ａ）、シトシン
（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）の４種の塩基に
対するジデオキシヌクレオチド三リン酸つまりｄｄＡＴ
Ｐ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰを使い、それ
ぞれ上記の相補鎖合成反応を行わせることで、末端塩基
がそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔである種々の長さのＤＮＡ断
片を得、これらを分子量分離し、分子量順に塩基種を読
むことで塩基配列が解析できる。分子量分離は、ポリア
クリルアミドゲルを使った電気泳動で行う。2. Description of the Related Art As an electrophoretic device for separating a molecular weight of a fluorescently labeled sample by electrophoresis and analyzing it, there is, for example, a DNA base sequencer for labeling a fluorescent substance.
The base sequence determination method is the well-known Sanger.
By the dideoxy method. That is, the DNA to be analyzed is introduced into a vector, amplified, and denatured to form a single-stranded template DN.
Make A. The primer DNA is bound to this template DNA, and complementary strand synthesis is carried out starting from the primer DNA. At this time, in addition to the four types of deoxynucleotide triphosphates, one specific type of dideoxynucleotide triphosphate serving as a terminator is added in advance. When the dideoxynucleotide triphosphate is incorporated, complementary strand synthesis is stopped, so that DNA fragments of various lengths stopped at specific bases can be obtained. Therefore, dideoxynucleotide triphosphates for four bases of adenine (A), cytosine (C), guanine (G), and thymine (T), that is, ddAT
By using P, ddCTP, ddGTP, and ddTTP to carry out the above complementary chain synthesis reactions, respectively, DNA fragments of various lengths having terminal bases A, C, G, and T were obtained, and these were separated by molecular weight. Then, the base sequence can be analyzed by reading the base species in the order of the molecular weight. Molecular weight separation is performed by electrophoresis using polyacrylamide gel.

【０００３】この方法に基づいた自動化装置は、主に電
気泳動部と解析部を自動化したものである。例えば「ネ
イチャー」誌、第３２１巻、第６７４〜６７９頁（１９
８６年）（Ｎａｔｕｒｅ、３２１、６７４〜６７９（１
９８６））に記載されている装置では、ＤＮＡ断片の末
端塩基の種類毎に４種の異なる蛍光体（フルオレセイ
ン、４−クロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１−
ジアゾール（ＮＢＤ）、テトラメチルローダミン、テキ
サスレッド（モレキュラプローブ社製品））で標識し、
内径が１〜２ｍｍのガラス製チューブを泳動路として泳
動し、分子量順に泳動されてくる断片をレーザ光で励起
して蛍光検出することで、塩基配列を決定する。４種の
蛍光体の最大蛍光波長は、５２０ｎｍ、５５０ｎｍ、５
７８ｎｍ、６０５ｎｍ付近であり、それぞれの波長域を
透過させる４種のバンドパス干渉フィルタによって各々
の蛍光を分離して検出している（第１の従来例）。ま
た、内径が１００μｍ以下のキャピラリーにゲルを作成
して電気泳動部とする方法がある。例えば「ニュークレ
イック アシッド リサーチ」誌、第１８巻、第１４１
５〜１４１９頁（１９９０年）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８、１４１５〜１４１９
（１９９０））に記載の方法では、図６に示すように、
内径７５μｍのキャピラリーを使用し、９ｋＶの高電圧
を印加することで、ＤＮＡ断片等の高速及び高分離検出
を図っている。この方法の検出部は、キャピラリーの軸
とレーザ光の照射軸とを、垂直方向から２５度程度傾斜
させ、レーザ光をキャピラリーの中心部に直径約２０μ
ｍに集光して照射し、生じる蛍光をバンドパス干渉フィ
ルタ等で分光して検出している（第２の従来例）。な
お、図６は上記従来例記載の装置を判りやすく改変した
ものである。An automated apparatus based on this method is mainly an automated electrophoretic section and analysis section. For example, "Nature" magazine, Volume 321, pages 674-679 (19
1986) (Nature, 321, 674-679 (1
986)), four different fluorophores (fluorescein, 4-chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1-) for each type of terminal base of the DNA fragment are used.
Labeled with diazole (NBD), tetramethylrhodamine, Texas red (product of Molecular Probes),
A glass tube having an inner diameter of 1 to 2 mm is used as a migration path, and fragments that are migrated in order of molecular weight are excited by laser light and fluorescence is detected to determine the base sequence. The maximum fluorescence wavelength of the four types of phosphors is 520 nm, 550 nm, 5
The wavelengths are near 78 nm and 605 nm, and each fluorescence is separated and detected by four types of bandpass interference filters that transmit each wavelength region (first conventional example). There is also a method of preparing a gel in a capillary having an inner diameter of 100 μm or less and using it as an electrophoresis part. For example, "Newclaic Acid Research", Vol. 18, 141.
Pp 5-1419 (1990) (Nucleic Ac
id Research, 18, 1415-1419
In the method described in (1990)), as shown in FIG.
By using a capillary with an inner diameter of 75 μm and applying a high voltage of 9 kV, high speed and high separation detection of DNA fragments and the like is achieved. In the detection part of this method, the axis of the capillary and the irradiation axis of the laser light are inclined by about 25 degrees from the vertical direction, and the diameter of the laser light is about 20 μm at the center of the capillary.
The light is condensed and irradiated on m, and the generated fluorescence is dispersed and detected by a bandpass interference filter or the like (second conventional example). Note that FIG. 6 is a modification of the apparatus described in the above-mentioned conventional example for easy understanding.

【０００４】さらに、「ジャーナル オブ クロマトグ
ラフィー」誌、第５１６巻、第６１〜６７頁（１９９０
年）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈｙ、５１６、６１〜６７（１９９０））にも、キャ
ピラリーゲル電気泳動法によってＤＮＡの塩基配列を決
定する方法が記載されている。この方法では、内径が５
０μｍのキャピラリーを使用してＤＮＡ断片を分子量分
離している。本例での測定装置は基本的には「サイエン
ス」誌、第２４２巻、第５６２〜５６４頁（１９８８
年）（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、５６２〜５６４（１９
８８））に記載されているものである。「サイエンス」
誌記載の装置に、判り易くするため、レーザ光源やシー
スフロー用のポンプ等を加えて編集した装置構成を図７
に示した。ＤＮＡ断片の検出は、分子量分離された分離
液を石英製フローチャンバー（内形２５０μｍ×２５０
μｍ）に導き、緩衝液をシース液としてポンプによりフ
ローさせてシースフロー状態にし、プローチャンバーの
ほぼ中心部を流れる分離液に対して、レーザ光を直径１
０μｍ程度に集光して照射し、分光フィルタ等を通して
ＤＮＡ断片からの蛍光を検出している（第３の従来
例）。Further, "Journal of Chromatography", Vol. 516, pp. 61-67 (1990).
Year) (Journal of Chromatogra
PHY, 516, 61-67 (1990)) also describes a method for determining the base sequence of DNA by capillary gel electrophoresis. With this method, the inner diameter is 5
The DNA fragments are separated by molecular weight using a 0 μm capillary. The measuring apparatus in this example is basically "Science" magazine, Volume 242, Pages 562-564 (1988).
Year (Science, 242, 562-564 (19
88)). "Science"
In order to make it easier to understand, the device described in the magazine was edited by adding a laser light source, a pump for sheath flow, etc.
It was shown to. For detection of DNA fragments, the separation liquid from which the molecular weight has been separated is used in a quartz flow chamber (internal shape 250 μm × 250
μm), and a buffer solution is used as a sheath liquid to flow by a pump into a sheath flow state, and a laser beam having a diameter of 1 is applied to the separated liquid flowing almost in the center of the Plow chamber.
The light is condensed and emitted to about 0 μm, and the fluorescence from the DNA fragment is detected through a spectral filter or the like (third conventional example).

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】電気泳動装置では、試
料の微量化等に伴い、検出の高感度化が望まれている。
一般に、電気泳動状態での蛍光測定では、目的とする蛍
光体自体からの蛍光の他に、背景光として、ゲルによる
励起光の散乱光（レーリー散乱など）及び蛍光、ゲルの
支持体例えばキャピラリーの内壁及び外壁での散乱光、
あるいはキャピラリー自体からの蛍光が生じる。そのた
め、バックグラウンドレベルが高くなり、検出感度の低
下を招くことになる。つまり、高感度な蛍光検出を達成
するには、このような背景光をいかに除去するかが重要
な課題となる。In the electrophoretic device, it is desired to increase the detection sensitivity as the amount of the sample is reduced.
Generally, in the fluorescence measurement in the electrophoretic state, in addition to the fluorescence from the target phosphor itself, scattered light of excitation light by the gel (Rayleigh scattering etc.) and fluorescence as the background light, and the support of the gel such as a capillary are used. Scattered light on the inner and outer walls,
Alternatively, fluorescence is generated from the capillary itself. Therefore, the background level becomes high and the detection sensitivity is lowered. In other words, how to remove such background light is an important issue for achieving highly sensitive fluorescence detection.

【０００６】上記第１の従来例では、バンドパス干渉フ
ィルタにより励起光（散乱光）と蛍光とを分離してい
る。しかし、干渉フィルタの特性上散乱光を完全に分離
することは困難である。また、ゲル及びガラス製チュー
ブ自体からも微弱ながらも蛍光が生じることがあり、バ
ンドパス干渉フィルタ等の分光のみでは十分に背景光を
除去することは困難である。In the above-mentioned first conventional example, the excitation light (scattered light) and the fluorescence are separated by the bandpass interference filter. However, it is difficult to completely separate the scattered light due to the characteristics of the interference filter. Further, fluorescence may be generated from the gel and the glass tube itself although they are weak, and it is difficult to sufficiently remove the background light only by spectroscopy using a bandpass interference filter or the like.

【０００７】第２の従来例では、バンドパス干渉フィル
タ等で分光して蛍光検出することに加えて、キャピラリ
ーの軸をレーザ光の照射軸と蛍光集光軸とを含む平面に
対して垂直から２５度程度傾斜させることで、レンズで
集光されるキャピラリーからの散乱光の割合を少なくし
ている。しかし、背景光の除去は十分とはいえない。例
えば、キャピラリーはその断面が円であり、励起光が散
乱しやすい形状である。また、キャピラリー径が小さい
ために散乱光の発生するキャピラリー内壁や外壁と試料
からの蛍光が発生する位置とが非常に近接し、空間的に
両者を分離することが困難になる。さらに、ゲルによる
散乱光・蛍光は上記方法では除去できない。また、泳動
方向に濃縮されてくる試料に対して斜めに励起光が照射
されるため、分離能が悪くなりやすいという問題もあ
る。In the second conventional example, in addition to spectral analysis with a bandpass interference filter or the like to detect fluorescence, the axis of the capillary is changed from a plane perpendicular to the plane including the irradiation axis of laser light and the fluorescence condensing axis. By inclining by about 25 degrees, the ratio of scattered light from the capillaries condensed by the lens is reduced. However, removal of background light is not sufficient. For example, a capillary has a circular cross section and has a shape in which excitation light is easily scattered. Further, since the capillary diameter is small, the inner wall or outer wall of the capillary where scattered light is generated and the position where fluorescence from the sample is generated are very close to each other, which makes it difficult to spatially separate the two. Furthermore, the scattered light and fluorescence from the gel cannot be removed by the above method. In addition, since the excitation light is obliquely irradiated to the sample concentrated in the migration direction, there is a problem that the resolution is likely to deteriorate.

【０００８】第３の従来例では、キャピラリーゲル端を
シースフローチャンバーのサンプル注入口とすること
で、キャピラリーゲル外に試料液を導出させ、シースフ
ロー下で蛍光測定を行うため、キャピラリー界面での散
乱光並びにゲルからの散乱光及び蛍光の発生がなくな
る。また、シースフローチャンバーでは、試料液はその
ほぼ中心を層流状態で流れ、フローチャンバーの内壁と
接触しないため、フローチャンバーからの散乱光と試料
からの蛍光とを空間的に分離することができ、蛍光強度
を高感度に検出することができる。しかし、シースフロ
ーを形成するために、緩衝液をシース液として液体クロ
マトグラフィー用ポンプ等でシースフローチャンバー内
に一定流量で常時フローさせる必要がある。そのため、
装置的に高価で、複雑になる等の問題がある。In the third conventional example, the end of the capillary gel is used as the sample injection port of the sheath flow chamber so that the sample liquid is led out of the capillary gel and the fluorescence measurement is performed under the sheath flow. Emission of scattered light and scattered light and fluorescence from the gel are eliminated. Further, in the sheath flow chamber, the sample solution flows in a laminar flow state almost at the center thereof and does not come into contact with the inner wall of the flow chamber, so that the scattered light from the flow chamber and the fluorescence from the sample can be spatially separated. The fluorescence intensity can be detected with high sensitivity. However, in order to form a sheath flow, it is necessary to constantly use a buffer solution as a sheath liquid to constantly flow in a sheath flow chamber at a constant flow rate by a liquid chromatography pump or the like. for that reason,
There is a problem that the device is expensive and complicated.

【０００９】本発明の目的は、上記した従来技術の問題
点を解決し、電気泳動により分離される試料の蛍光測定
または光吸収測定を高感度で簡便に行うことのできる電
気泳動装置を提供することにある。An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems of the prior art and to provide an electrophoretic device capable of easily performing fluorescence measurement or light absorption measurement of a sample separated by electrophoresis with high sensitivity. Especially.

【００１０】[0010]

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明は、蛍光体で標識された核酸断片等の試料を
電気泳動により分子量分離し、分子量分離された前記試
料を光学的に検出して試料を解析する電気泳動装置にお
いて、電気泳動路を、ゲルを充填した分子量分離部と、
電解液で満たされた光学的検出部とで構成する装置を提
供するものである。In order to achieve the above object, the present invention provides a method of subjecting a sample such as a nucleic acid fragment labeled with a fluorescent substance to molecular weight separation by electrophoresis, and optically separating the molecular weight separated sample. In an electrophoresis device for detecting and analyzing a sample, the electrophoresis path is composed of a gel-filled molecular weight separation section,
An optical detection unit filled with an electrolytic solution is provided.

【００１１】上記の分子量分離部はキャピラリーゲルで
構成することが望ましい。また、電解液で満たされた光
学的検出部は、２本のキャピラリーをその軸をほぼ一致
させて直線的に配置し、相対向するキャピラリー端をキ
ャピラリーの軸方向に一定のギャップを保って密接させ
ることによって形成することができる。この場合、少な
くとも電気泳動路の上流側に位置する一方のキャピラリ
ーが分子量分離部となり、ギャップの空間部が光学的検
出部となる。この光学的検出部において試料による蛍
光、あるいは光吸収を測定する。It is desirable that the above-mentioned molecular weight separating section is composed of a capillary gel. In addition, the optical detector filled with the electrolytic solution has two capillaries arranged linearly with their axes substantially coincident with each other, and the opposite ends of the capillaries are closely contacted with each other with a constant gap in the axial direction of the capillaries. Can be formed. In this case, at least one of the capillaries located on the upstream side of the electrophoretic path serves as the molecular weight separation unit, and the space in the gap serves as the optical detection unit. Fluorescence or light absorption by the sample is measured in this optical detector.

【００１２】また、ギャップの長さを１ｍｍ以下になる
ように構成するものである。なお、ギャップは、電気泳
動路の径より大きな内部寸法を有する光学セル内部に保
持することが望ましい。また、複数のキャピラリー対に
よって形成される複数の光学的検出部が、互いに電解液
を介して連結されるように構成することもできる。Further, the length of the gap is configured to be 1 mm or less. The gap is preferably held inside the optical cell having an internal dimension larger than the diameter of the electrophoresis path. It is also possible to configure a plurality of optical detectors formed by a plurality of capillary pairs so as to be connected to each other via an electrolytic solution.

【００１３】さらに、複数本のキャピラリーによる複数
の光学的検出部を１列に配置し、単一の励起光をこの列
方向に照射して上記複数の光学的検出部を同時に照射す
ることにより、上記複数の光学的検出部で同時に蛍光測
定を行うように構成することもできる。Furthermore, by arranging a plurality of optical detecting sections by a plurality of capillaries in one row, and irradiating a single excitation light in the row direction to irradiate the plurality of optical detecting sections simultaneously, It is also possible to configure the plurality of optical detection units to simultaneously perform fluorescence measurement.

【００１４】[0014]

【作用】蛍光体で標識された核酸断片等の試料を電気泳
動により分子量分離し、分子量分離された前記試料を光
学的に検出して試料を解析する電気泳動装置において、
電気泳動路を、ゲルを充填した分子量分離部と、ゲル外
部の電解液で満たされた光学的検出部とで構成し、試料
の蛍光または光吸収測定をゲルの無い電解液中で行うこ
とで、ゲルによる散乱光及び蛍光、並びにキャピラリー
等のゲル支持体からの散乱光及び蛍光の発生を回避する
ことができ、高感度な蛍光または光吸収検出が可能とな
る。しかも、電解液を機械的にフローさせる必要が無
く、簡便な装置構成となる。なお、ゲルからなる分子量
分離部を設けることで、従来通り、電気泳動による分子
量分離を行うことができる。In an electrophoretic device for separating a sample such as a nucleic acid fragment labeled with a fluorescent substance by electrophoretic analysis and optically detecting the sample subjected to the molecular weight separation to analyze the sample,
The electrophoresis path is composed of a molecular weight separation unit filled with gel and an optical detection unit filled with an electrolyte solution outside the gel, and fluorescence or light absorption measurement of the sample is performed in the gel-free electrolyte solution. It is possible to avoid generation of scattered light and fluorescence by the gel, scattered light and fluorescence from the gel support such as capillaries, and highly sensitive fluorescence or light absorption detection becomes possible. Moreover, there is no need to mechanically flow the electrolytic solution, and the device configuration is simple. In addition, by providing the molecular weight separation unit made of gel, the molecular weight separation by electrophoresis can be performed as usual.

【００１５】なお、分子量分離部をキャピラリーゲルで
構成することによって、高速分離が可能になる。また、
２本のキャピラリーをその軸をほぼ一致させて直線的に
配置し、相対向するキャピラリー端をキャピラリーの軸
方向に一定のギャップを保って密接させることにより、
簡便に分子量分離部と光学的検出部を構成することがで
きる。この場合、上記ギャップ空間が試料の蛍光または
光吸収を測定する光学的検出部となり、このギャップ空
間に電解液を満たすことで電気泳動が可能になり、ゲル
及びキャピラリーからの散乱光等の背景光を除くことが
できる。また、少なくとも一方のキャピラリーにゲルを
作成することで容易に分子量分離部が構成できる。If the molecular weight separating section is composed of a capillary gel, high speed separation is possible. Also,
By arranging the two capillaries linearly with their axes substantially coincident with each other, the capillaries facing each other are brought into close contact with each other while keeping a constant gap in the axial direction of the capillaries.
The molecular weight separation unit and the optical detection unit can be easily configured. In this case, the gap space serves as an optical detection unit for measuring fluorescence or light absorption of the sample, and electrophoresis can be performed by filling the gap space with an electrolytic solution, and background light such as scattered light from the gel and the capillary can be obtained. Can be excluded. Further, the molecular weight separation section can be easily constructed by forming a gel in at least one of the capillaries.

【００１６】ギャップ長は０．１ｍｍから１ｍｍとする
のが好ましい。一般にギャップ長を短くすればするほど
試料がギャップ空間を泳動しやすくなるため、基本的に
ギャップ長は短い方が好ましい。しかしながら、装置を
組立てる上で、ギャップ長が短すぎるとその調整が難し
くなるため、通常現実的には０．１ｍｍ以上が好まし
い。ただし、０．１ｍｍ以下に設定することも可能であ
って、その限界は、ギャップ部でのレーザ光等の励起光
束の幅により決定される。また逆に、ギャップ長を長く
すると、試料はギャップ空間を直線的に泳動せずに、ギ
ャップ部を拡散し、他方のキャピラリー等に泳動されな
くなる。ギャップ長が２〜３ｍｍ程度であれば、試料が
正常に泳動できることを確認したが、泳動電圧等の条件
によっては正常に泳動しなくなるため、実際的にギャッ
プ長は１ｍｍ程度以下が好ましい。つまり、ギャップ長
を０．１ｍｍから１ｍｍとすることで、試料を簡便に効
率よく電気泳動させることができる。The gap length is preferably 0.1 mm to 1 mm. Generally, the shorter the gap length, the easier the sample migrates in the gap space. Therefore, basically, the shorter gap length is preferable. However, in assembling the device, if the gap length is too short, it is difficult to adjust the gap length. However, it can be set to 0.1 mm or less, and its limit is determined by the width of the excitation light flux such as laser light in the gap portion. On the contrary, when the gap length is increased, the sample does not migrate linearly in the gap space but diffuses in the gap portion and is not migrated to the other capillary or the like. Although it has been confirmed that the sample can be electrophoresed normally when the gap length is about 2 to 3 mm, it does not electrophores normally depending on the conditions such as the electrophoretic voltage. Therefore, in practice, the gap length is preferably about 1 mm or less. That is, by setting the gap length to 0.1 mm to 1 mm, the sample can be easily and efficiently electrophoresed.

【００１７】また、ギャップを形成するキャピラリー端
を、電気泳動路の径より大きな内部寸法、例えばキャピ
ラリーの外径より大きな光路長及び光路幅を有する光学
セル内部に保持し、その内部を電解液で満たして試料を
電気泳動させることにより、試料はキャピラリーとキャ
ピラリーとを結ぶ線上を泳動し、光学セル内面と接触し
ないため、セル内面への吸着、及びセル内面からの散乱
光の影響を除去することができ、検出感度を向上させる
ことができる。Further, the ends of the capillaries forming the gap are held inside an optical cell having an inner dimension larger than the diameter of the electrophoresis path, for example, an optical path length and an optical path width larger than the outer diameter of the capillary, and the inside thereof is filled with an electrolytic solution. When the sample is filled and electrophoresed, the sample migrates on the line connecting the capillaries and does not come into contact with the inner surface of the optical cell, so the adsorption to the inner surface of the cell and the influence of scattered light from the inner surface of the cell should be removed. Therefore, the detection sensitivity can be improved.

【００１８】また、複数のキャピラリー対の各ギャップ
空間によって形成される複数の光学的検出部を、１つの
光学セル内部に保持するなどして互いに電解液を介して
連結させることにより、同時に複数の試料をほぼ同一条
件で検出することが可能になる。さらに、複数のキャピ
ラリー対を１列に配置することで、試料から発せられる
蛍光を測定する光学的検出部が列状に形成され、単一の
励起光により複数の光学的検出部を同時に照射して同時
に蛍光測定することが可能になる。さらに、複数の光学
的検出部を互いに電解液を介して連結させることによ
り、光散乱の少ない電解液を通して励起光を効率良く各
光学的検出部に導くことができ、高精度に蛍光を検出す
ることができる。Further, a plurality of optical detecting portions formed by the gap spaces of a plurality of capillary pairs are connected to each other through an electrolytic solution such as by being held inside one optical cell so that a plurality of optical detecting portions are simultaneously connected. The sample can be detected under almost the same conditions. Furthermore, by arranging a plurality of pairs of capillaries in a row, optical detection sections for measuring fluorescence emitted from the sample are formed in rows, and a plurality of optical detection sections are simultaneously irradiated by a single excitation light. It becomes possible to measure fluorescence simultaneously. Furthermore, by connecting a plurality of optical detection units to each other through an electrolytic solution, excitation light can be efficiently guided to each optical detection unit through an electrolytic solution with little light scattering, and fluorescence is detected with high accuracy. be able to.

【００１９】[0019]

【実施例】以下、実施例により本発明をより詳細に説明
する。 〔実施例１〕本実施例では、蛍光標識したＤＮＡ断片を
電気泳動により分子量分離し、蛍光によって検出を行
う。標識用の蛍光体として、フルオレセイン・イソチオ
シアネート（ＦＩＴＣ）を使用する場合について説明す
る。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. [Example 1] In this example, fluorescently labeled DNA fragments are subjected to molecular weight separation by electrophoresis, and detection is performed by fluorescence. A case where fluorescein isothiocyanate (FITC) is used as a fluorescent substance for labeling will be described.

【００２０】図１に、本実施例の電気泳動装置の構成図
を示す。内径１００μｍ、外径３７５μｍ、長さ３０ｃ
ｍのシリカ製のキャピラリー１及びそれと同じ内外径を
有する長さ５ｃｍのシリカ製のキャピラリー２の２本を
使用する。キャピラリー１には、変性剤の尿素を含む５
％ポリアクリルアミドゲルを作成する。まず、キャピラ
リー内部を洗浄し、シランカップリング処理する。次い
で、脱気した４．７５％のアクリルアミド、０．２５％
のビスアクリルアミド、７Ｍの尿素、２ｍＭのＥＤＴＡ
を含むトリス、ほう酸緩衝液にテトラメチルエチレンジ
アミン、過硫酸アンモニュウム溶液を加えキャピラリー
に注入して重合させ、アクリルアミドゲルを作成する。
キャピラリーはシランカップリング処理されているた
め、アクリルアミドゲルとキャピラリーとは化学的に結
合しており、泳動時にキャピラリーからゲルがはみでる
ことがない。FIG. 1 shows a block diagram of the electrophoresis apparatus of this embodiment. Inner diameter 100 μm, outer diameter 375 μm, length 30 c
Two m-silica capillaries 1 and 5 cm-long silica capillaries 2 having the same inner and outer diameters are used. Capillary 1 contains denaturant urea 5
Make a% polyacrylamide gel. First, the inside of the capillary is washed and subjected to silane coupling treatment. Then degassed 4.75% acrylamide, 0.25%
Bisacrylamide, 7M urea, 2mM EDTA
An aqueous solution of tetramethylethylenediamine and ammonium persulfate is added to a tris or borate buffer solution containing, and injected into a capillary to polymerize to prepare an acrylamide gel.
Since the capillaries have been subjected to silane coupling treatment, the acrylamide gel and the capillaries are chemically bound, and the gel does not stick out from the capillaries during migration.

【００２１】また、キャピラリー２はその内面が正の電
荷を有するように調整する。まず、キャピラリーに３−
（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラ
ン溶液を注入して反応させ、１１０℃で熱処理して、キ
ャピラリー内面をアミノシラン化して正の電荷を有する
ようにする。このようにすることでキャピラリー２内部
の電気浸透流の向きが負極から正極の向きになり、アク
リルアミドゲルを充填したキャピラリー１での試料の泳
動方向（負極→正極）と、キャピラリー２での試料の移
動方向（負極→正極）が一致し、試料の泳動が容易にな
る。Further, the capillary 2 is adjusted so that its inner surface has a positive charge. First, in the capillary 3-
A (2-aminoethylaminopropyl) trimethoxysilane solution is injected and reacted, and heat treatment is performed at 110 ° C. to aminosilanize the inner surface of the capillary so that it has a positive charge. By doing so, the direction of the electroosmotic flow inside the capillary 2 changes from the negative electrode to the positive electrode, and the migration direction of the sample in the capillary 1 filled with acrylamide gel (negative electrode → positive electrode) and the direction of the sample in the capillary 2 The movement direction (negative electrode → positive electrode) is the same, which facilitates sample migration.

【００２２】このキャピラリー１及び２のそれぞれの一
端を、光学セル内部に対向保持して試料を光学的に検出
する。ここでは蛍光により試料を検出するため、光学セ
ルとして蛍光セルを使用する。つまり、上記キャピラリ
ー１及び２のそれぞれの一端を角形の石英製蛍光セル４
（外形３ｍｍ角、内形１ｍｍ角）内部に、同軸に且つ
０．１ｍｍのギャップ３を形成して対向させて保持し、
ギャップ空間を光学的検出部とする。なお、キャピラリ
ー１及びキャピラリー２のそれぞれの他端は、緩衝液
（トリス、ほう酸、ＥＤＴＡを含む緩衝液）を入れた陰
極側電極槽５及び陽極側電極槽６に浸す。また、石英製
蛍光セル４内部にグリセリンを含む緩衝液を注入して、
ギャップ３を緩衝液で満たし、高電圧電源７により、陰
極側電極槽５と陽極側電極槽６の間に直流高電圧を印加
する。One end of each of the capillaries 1 and 2 is held opposite to the inside of the optical cell to optically detect the sample. Since a sample is detected by fluorescence here, a fluorescence cell is used as an optical cell. That is, one end of each of the capillaries 1 and 2 has a prismatic quartz fluorescent cell 4 at one end.
(Outer shape 3 mm square, Inner shape 1 mm square) Coaxially, form a gap 3 of 0.1 mm and hold them facing each other,
The gap space is used as the optical detection unit. The other ends of the capillaries 1 and 2 are immersed in a cathode-side electrode tank 5 and an anode-side electrode tank 6 containing a buffer solution (buffer solution containing Tris, boric acid, and EDTA). In addition, by injecting a buffer solution containing glycerin into the quartz fluorescent cell 4,
The gap 3 is filled with a buffer solution, and a high voltage power supply 7 applies a direct current high voltage between the cathode side electrode tank 5 and the anode side electrode tank 6.

【００２３】電圧印加により、キャピラリー２、ギャッ
プ３、及びキャピラリー１内を電流が流れる。ギャップ
３の長さは短く、ギャップ３ではキャピラリー２とキャ
ピラリー１の軸を結んだ線上を中心に電流が流れる。そ
のため、電気泳動される試料もキャピラリー１から流れ
出て、ギャップ３内をあまり拡散することなく通過し、
キャピラリー２に流れ込むことになる。つまり、試料は
蛍光セル４の内面に接触せずに泳動することになる。な
お、蛍光セル４内部つまりギャップ３にはグリセリンを
含む緩衝液を注入したが、グリセリンの添加は、緩衝液
の粘度が高まることによる対流の影響の低減、及びギャ
ップ３での電界強度の向上を目的とするものである。緩
衝液の対流を抑え、また電界強度を高めることにより、
試料のギャップ３内での拡散が抑えられ、試料をキャピ
ラリー１からキャピラリー２に容易に確実に泳動させる
ことができるようになる。When a voltage is applied, a current flows through the capillary 2, the gap 3 and the capillary 1. The length of the gap 3 is short, and in the gap 3, a current flows around the line connecting the axes of the capillaries 2 and 1. Therefore, the sample to be electrophoresed flows out from the capillary 1 and passes through the gap 3 without being diffused,
It will flow into the capillary 2. That is, the sample migrates without contacting the inner surface of the fluorescent cell 4. Although a buffer solution containing glycerin was injected into the inside of the fluorescent cell 4, that is, the gap 3, the addition of glycerin reduces the influence of convection due to the increase in the viscosity of the buffer solution and improves the electric field strength in the gap 3. It is intended. By suppressing the convection of the buffer solution and increasing the electric field strength,
The diffusion of the sample in the gap 3 is suppressed, and the sample can be easily and surely migrated from the capillary 1 to the capillary 2.

【００２４】本例では上記目的のためにグリセリンを使
用したが、粘性が高く電気泳動に使用できる物質であれ
ば同様に使用できる。例えば、ポリエチレングリコー
ル、シュークロースなどが使用できる。なお、ギャップ
３が狭ければ、グリセリン等を含まない通常の緩衝液で
も十分使用可能である。試料である蛍光標識ＤＮＡ断片
の導入は、陰極側のキャピラリー１の端を一時的に試料
液に浸し、試料液と陽極側電極槽６の間に５ｋＶの電圧
を２０秒間程度印加することで行う。その後キャピラリ
ー１の端を元の陰極側電極槽５に戻し、陰極側電極槽５
と陽極側電極槽６の間に１０ｋＶの直流電圧を印加する
と、試料はキャピラリー１内で陰極側から陽極側に向か
って分子量分離されつつ泳動され、ギャップ３を通過す
る。In this example, glycerin was used for the above purpose, but any substance that has a high viscosity and can be used for electrophoresis can be similarly used. For example, polyethylene glycol, sucrose and the like can be used. If the gap 3 is narrow, a normal buffer solution containing no glycerin or the like can be sufficiently used. The fluorescence-labeled DNA fragment as a sample is introduced by temporarily immersing the end of the capillary 1 on the cathode side in the sample solution and applying a voltage of 5 kV for about 20 seconds between the sample solution and the electrode tank 6 on the anode side. .. After that, the end of the capillary 1 is returned to the original cathode-side electrode tank 5, and the cathode-side electrode tank 5
When a DC voltage of 10 kV is applied between the anode side electrode tank 6 and the anode side electrode tank 6, the sample is migrated in the capillary 1 from the cathode side toward the anode side while the molecular weight is separated, and passes through the gap 3.

【００２５】ギャップ３を通過するＤＮＡ断片に対し
て、アルゴンレーザ光源８の波長４８８ｎｍのレーザ光
９をレンズ１０により２０μｍ程度に絞って照射する。
ＤＮＡ断片から発せられた蛍光１１は、レーザ光照射方
向と垂直方向からレンズ１２で集光され、干渉フィルタ
１３で散乱光などの背景光を除去され、レンズ１４でス
リツト１５に結像される。スリツト１５を通過する光を
光電子増倍管１６で検出し、増幅器１７で増幅し、コン
ピュータ等のデータ処理装置１８で泳動パターン等を処
理し、それらの結果をモニタ１９、プリンタ２０に出力
し、またメモリ２１に保存する。The DNA fragment passing through the gap 3 is irradiated with the laser beam 9 having a wavelength of 488 nm from the argon laser light source 8 after being narrowed down to about 20 μm by the lens 10.
The fluorescence 11 emitted from the DNA fragment is condensed by the lens 12 from the direction perpendicular to the laser light irradiation direction, the background light such as scattered light is removed by the interference filter 13, and the lens 14 forms an image on the slit 15. The light passing through the slit 15 is detected by the photomultiplier tube 16, amplified by the amplifier 17, processed by the data processing device 18 such as a computer for the electrophoretic pattern, and the results are output to the monitor 19 and the printer 20, It is also stored in the memory 21.

【００２６】干渉フィルタ１３としては、ＦＩＴＣから
の蛍光を効果的に検出するため、５００ｎｍ〜５４０ｎ
ｍの波長域を通過するバンドパス干渉フィルタを使用す
る。また、像倍率が等倍になるようにレンズ系１２、１
４を構成する。そしてスリット１５の開口部を泳動方向
に５０μｍ、レーザ光照射方向に１００μｍとし、ギャ
ップ３における蛍光像が開口部の中心にくるように調整
する。試料はギャップ３の近傍のみを泳動するため、こ
のように光学系を構成することで、レーザ光の石英製蛍
光セル４部での散乱光はスリット１５の開口部に結像さ
れず光電子増倍管１６で検出されなくなる。また、キャ
ピラリー及びゲルからの散乱光、蛍光も発生しないた
め、背景光強度が大幅に低減する。The interference filter 13 has a wavelength of 500 nm to 540 n in order to detect fluorescence from FITC effectively.
A bandpass interference filter that passes the wavelength range of m is used. In addition, the lens systems 12 and 1 are arranged so that the image magnification becomes equal.
Make up 4. The opening of the slit 15 is adjusted to 50 μm in the migration direction and 100 μm in the laser light irradiation direction so that the fluorescent image in the gap 3 is adjusted to the center of the opening. Since the sample migrates only in the vicinity of the gap 3, by constructing the optical system in this way, the scattered light of the laser light at the quartz fluorescent cell 4 is not imaged at the opening of the slit 15 and the photoelectron multiplication is performed. It will not be detected in tube 16. Further, since scattered light and fluorescence from the capillaries and gel are not generated, the background light intensity is significantly reduced.

【００２７】図２は、蛍光セル部の拡大断面図である。
石英製蛍光セル４は、キャピラリー保持具２３ａ及び２
３ｂで押さえられて固定される。また、蛍光セル４と保
持具２３ａ及び２３ｂの間に、シリコーンゴムパッキン
２２ａ及び２２ｂを挟むことにより、液漏れを防ぐ構造
とする。キャピラリー１は四ふっ化エチレン樹脂製のフ
ェラル２４ａと押しネジ２５ａで、キャピラリー保持具
２３ａに固定する。同様にキャピラリー２もフェラル２
４ｂと押しネジ２５ｂで固定する。キャピラリー１とキ
ャピラリー２の間隔は、キャピラリーのフェラルからの
長さを規定することで自由に調整することができ、本実
施例では前述のように０．１ｍｍとする。なお、蛍光セ
ル部には別に緩衝液などを注入するための導入口が設け
られており、また、それにはバルブ２６ａ及び２６ｂが
接続されている。これは、キャピラリーを固定した後、
蛍光セル４内に緩衝液を満たすのに使用される。なお、
緩衝液等の導入口は蛍光セルの保持具の部分に設けるこ
ともできる。FIG. 2 is an enlarged sectional view of the fluorescent cell portion.
The quartz fluorescent cell 4 includes capillary holders 23a and 23a.
It is pressed down and fixed by 3b. Further, by sandwiching the silicone rubber packings 22a and 22b between the fluorescent cell 4 and the holders 23a and 23b, a structure for preventing liquid leakage is provided. The capillary 1 is fixed to the capillary holder 23a with a ferrule 24a made of ethylene tetrafluoride resin and a push screw 25a. Similarly, capillary 2 is also ferrule 2.
Fix with 4b and push screw 25b. The distance between the capillaries 1 and 2 can be freely adjusted by defining the length from the ferrule of the capillaries, and in this embodiment, it is set to 0.1 mm as described above. The fluorescent cell section is provided with an inlet for injecting a buffer solution or the like, and valves 26a and 26b are connected to the inlet. This is after fixing the capillary,
It is used to fill the buffer in the fluorescent cell 4. In addition,
The inlet for the buffer solution or the like may be provided in the holder of the fluorescent cell.

【００２８】本実施例の装置により、蛍光標識ＤＮＡ断
片計測を試みる。蛍光標識ＤＮＡ断片は、周知のサンガ
ー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法により、蛍光標識
したプライマーを使い、ＤＮＡポリメラーゼ反応を行う
ことで調製する。プライマーとして、フルオレセイン・
イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が結合したプライマー
（標識プライマー）を使用する。まず、一本鎖ＤＮＡに
標識プライマーを加え、アニールして、一本鎖ＤＮＡに
標識プライマーを結合させる。次にｄＡＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄｄＡＴＰを加え、ＤＮＡ
ポリメラーゼ反応を行わせる。以上の操作で、末端がＡ
の種々の長さの蛍光標識ＤＮＡ断片を得る。An attempt is made to measure a fluorescence-labeled DNA fragment with the device of this embodiment. Fluorescently labeled DNA fragments are prepared by the well known Sanger et al. Dideoxy method using a fluorescently labeled primer to carry out a DNA polymerase reaction. As a primer, fluorescein
An isothiocyanate (FITC) -bound primer (labeled primer) is used. First, a labeled primer is added to the single-stranded DNA and annealed to bind the labeled primer to the single-stranded DNA. Next, dATP and dTT
DNA containing P, dCTP, dGTP and ddATP
Allow the polymerase reaction to occur. With the above operation, the end is A
Fluorescently labeled DNA fragments of various lengths are obtained.

【００２９】上述のように試料をキャピラリーに導入
し、ギャップ空間での蛍光強度を測定することで、ＤＮ
Ａ断片の分子量分離パターンを計測することができる。
しかも、図６の従来例のようにギャップを形成させるこ
となく蛍光検出する場合、例えば、長さ３５ｃｍの同様
の形状のキャピラリーを使い、泳動距離が３０ｃｍのと
ころのキャピラリーの保護膜をはがし、この部分で蛍光
検出する場合に比べ、本実施例では、検出される背景光
強度が１／１０程度以下になり、より低濃度の試料を検
出できるようになる。By introducing the sample into the capillary as described above and measuring the fluorescence intensity in the gap space, DN
The molecular weight separation pattern of the A fragment can be measured.
Moreover, when fluorescence is detected without forming a gap as in the conventional example of FIG. 6, for example, a capillary of the same shape having a length of 35 cm is used, and the protective film of the capillary at a migration distance of 30 cm is peeled off. In this embodiment, the background light intensity to be detected is about 1/10 or less as compared with the case where fluorescence is detected at a portion, and a sample having a lower concentration can be detected.

【００３０】本実施例によれば、ゲルを使用して分子量
分離特性を損なうことなく、高感度に試料を検出するこ
とができるようになる。しかもポンプ等を使って緩衝液
をフローさせることなく、蛍光検出用の蛍光セル内の特
定の部分のみに試料を泳動させることができ、簡便に装
置を構成することができる。なお、使用するレーザ装置
及び蛍光体は、アルゴンレーザ及びＦＩＴＣに限られる
ものではなく、任意の蛍光体及び適当なレーザ装置が使
用できる。また、１種の蛍光体だけでなく、同時に２種
以上の蛍光体からの蛍光を検出することも可能である。
その場合には、例えば図１においてレンズ１２、干渉フ
ィルタ１３、レンズ１４、スリット１５及び光電子増倍
管１６からなる光検出装置の組を蛍光体の数に一致する
数だけ設け、それぞれが別々の波長域の蛍光を検出する
ようにすればよい。または、蛍光を分光器に導き、ライ
ンセンサで受光することによっても可能である。According to the present embodiment, it becomes possible to detect a sample with high sensitivity without using the gel and impairing the molecular weight separation characteristics. Moreover, the sample can be made to migrate only to a specific portion in the fluorescence cell for fluorescence detection without causing the buffer solution to flow using a pump or the like, and the device can be simply configured. The laser device and the phosphor used are not limited to the argon laser and the FITC, and any phosphor and an appropriate laser device can be used. It is also possible to detect fluorescence from not only one type of fluorescent substance but also two or more types of fluorescent substances at the same time.
In that case, for example, in FIG. 1, a number of sets of photodetecting devices each including a lens 12, an interference filter 13, a lens 14, a slit 15, and a photomultiplier tube 16 are provided so as to correspond to the number of phosphors, and each set is different. It suffices to detect fluorescence in the wavelength range. Alternatively, it is also possible to guide the fluorescence to a spectroscope and receive the light with a line sensor.

【００３１】この装置を応用することで、ＤＮＡの塩基
配列も決定できる。つまり、末端塩基の種類毎に、異な
る蛍光体で標識したプライマーを使用し、それぞれＤＮ
Ａポリメラーゼ反応を行わせた後、反応液を混合し、電
気泳動させる。そして、ギャップ空間を通過するＤＮＡ
断片の蛍光を検出し、そのときの蛍光体の種類を識別す
ることで塩基種が同定でき、塩基配列が決定できる。な
お、蛍光体の種類を識別するには、図１において前述の
ように４種の蛍光波長域を検出する４組の光検出装置を
設ける等すればよい。By applying this device, the base sequence of DNA can also be determined. In other words, primers labeled with different fluorophores are used for each type of terminal base, and
After carrying out the A polymerase reaction, the reaction solutions are mixed and electrophoresed. And DNA that passes through the gap space
By detecting the fluorescence of the fragment and identifying the type of fluorophore at that time, the base species can be identified and the base sequence can be determined. In order to identify the type of phosphor, four sets of photodetectors for detecting four types of fluorescence wavelength ranges may be provided as described above in FIG.

【００３２】なお、本実施例では、ＤＮＡ断片の測定を
例にして説明したが、蛋白、糖等の分析にも当然のこと
ながら使用できる。また、本実施例では２本とも同じ内
径のキャピラリーを使用したが、異なる内径のキャピラ
リーの組合せも可能である。例えば、キャピラリー１の
内径よりキャピラリー２の内径を細くすれば、キャピラ
リー１端から泳動される試料がキャピラリー２に導入さ
れる時に絞られるため、試料液の濃度が高くなり、より
高感度に検出することができる。またキャピラリー１の
内径よりキャピラリー２の内径を太くすれば、キャピラ
リー１端から泳動される試料をより容易にかつ確実にキ
ャピラリー２に導入させることができる。In the present embodiment, the measurement of DNA fragments has been described as an example, but it can be naturally used for analysis of proteins, sugars and the like. Further, in the present embodiment, both capillaries having the same inner diameter are used, but capillaries having different inner diameters can be combined. For example, if the inner diameter of the capillary 2 is made smaller than the inner diameter of the capillary 1, the sample to be electrophoresed from the end of the capillary 1 is narrowed down when being introduced into the capillary 2, so that the concentration of the sample liquid becomes high and detection is performed with higher sensitivity. be able to. If the inner diameter of the capillary 2 is made larger than the inner diameter of the capillary 1, the sample migrated from the end of the capillary 1 can be introduced into the capillary 2 more easily and reliably.

【００３３】さらに、本実施例によれば、励起光をキャ
ピラリー部を透過させることなく試料からの蛍光を測定
できることから、キャピラリーが透明である必要はな
い。つまりキャピラリーの被覆を除去する必要がないた
め、取り扱いが容易になる。さらに四ふっ化エチレン樹
脂や三ふっ化塩化エチレン樹脂などの不透明なふっ素樹
脂製のキャピラリー等種々の材質のキャピラリーを使用
することも可能となる。ふっ素樹脂製のキャピラリーは
試料の吸着が少ないため、表面処理等の処理操作が不必
要であり、また破損がないため、操作性が向上する。ま
た耐薬品性に優れるので、幅広いｐＨ範囲の溶媒を使用
することが可能になる。Furthermore, according to the present embodiment, the fluorescence from the sample can be measured without transmitting the excitation light through the capillary portion, so that the capillary does not need to be transparent. That is, it is not necessary to remove the coating of the capillaries, which facilitates handling. Furthermore, it is possible to use capillaries made of various materials such as opaque fluororesin capillaries such as tetrafluoroethylene resin and trifluoroethylene chloride resin. Since the capillary made of fluororesin absorbs a small amount of a sample, it does not require a treatment operation such as surface treatment, and since it does not break, the operability is improved. Further, since it has excellent chemical resistance, it is possible to use a solvent having a wide pH range.

【００３４】〔実施例２〕次に、キャピラリーを４本並
べて同時に蛍光検出する装置について説明する。図３
は、本実施例の電気泳動装置の蛍光検出部の構成図であ
る。２７ａ、２７ｂ、２７ｃ及び２７ｄは内径１００μ
ｍ、外径３７５μｍ、長さ３０ｃｍのシリカ製のキャピ
ラリーであり、一端は（省略しているが）図１と同様に
陰極側電極槽に浸されている。また同様に、２８ａ、２
８ｂ、２８ｃ及び２８ｄは上記と同じ内外径を有する長
さ５ｃｍのシリカ製のキャピラリーであり、一端が陽極
側電極槽に浸されている。[Embodiment 2] Next, an apparatus for arranging four capillaries and detecting fluorescence simultaneously will be described. Figure 3
FIG. 3 is a configuration diagram of a fluorescence detection unit of the electrophoretic device of the present embodiment. 27a, 27b, 27c and 27d have an inner diameter of 100μ
m, outer diameter 375 μm, length 30 cm, made of silica, and one end (although not shown) is immersed in the cathode-side electrode tank as in FIG. 1. Similarly, 28a, 2
Reference numerals 8b, 28c and 28d are silica capillaries having the same inner and outer diameters as described above and a length of 5 cm, and one end thereof is immersed in the anode-side electrode tank.

【００３５】これらのキャピラリーには、第１の実施例
と同様の手法で変性剤の尿素を含む５％ポリアクリルア
ミドゲルを作成する。また各キャピラリーにはシランカ
ップリング処理を施し、アクリルアミドゲルとキャピラ
リーとを化学的に結合させ、泳動時にキャピラリーから
ゲルがはみでないように配慮する。この２７ａ〜２７ｄ
のキャピラリーと２８ａ〜２８ｄのキャピラリーは、角
形の石英製蛍光セル３０の内部に、第１の実施例と同様
に一定間隔のギャップ２９ａ〜２９ｄを保持して固定さ
れ、複数の光学的検出部を形成する。For these capillaries, 5% polyacrylamide gel containing urea as a denaturant is prepared in the same manner as in the first embodiment. In addition, each capillary is subjected to a silane coupling treatment to chemically bond the acrylamide gel and the capillary so that the gel does not stick out from the capillary during electrophoresis. These 27a-27d
And the capillaries 28a to 28d are fixed inside the prismatic quartz fluorescent cell 30 with the gaps 29a to 29d at regular intervals, as in the first embodiment. Form.

【００３６】キャピラリーの固定は、ふっ素樹脂、例え
ば四ふっ化エチレン樹脂製のブロックに一直線上に１ｍ
ｍ間隔で４箇所の垂直孔を設けたキャピラリー保持具４
２及び４３を使う。４箇所の垂直の孔に、１本ずつキャ
ピラリーを差し込み、２７ａと２８ａ、２７ｂと２８
ｂ、２７ｃと２８ｃ、２７ｄと２８ｄがそれぞれ同軸に
なるようにし、また、ギャップ２９ａ〜２９ｄの長さが
それぞれ０．２ｍｍになるように調整する。The capillaries are fixed to a block made of fluororesin, for example, ethylene tetrafluoride resin, in a straight line for 1 m.
Capillary holder 4 with 4 vertical holes at m intervals
Use 2 and 43. Insert one capillary into each of the four vertical holes, 27a and 28a, 27b and 28
b, 27c and 28c, 27d and 28d are coaxial with each other, and the gaps 29a to 29d are each adjusted to have a length of 0.2 mm.

【００３７】蛍光測定時には、石英製蛍光セル３０内部
にグリセリンを含む緩衝液を注入し、ギャップ２９ａ〜
２９ｄを緩衝液で満たす。この状態で電圧を印加する
と、キャピラリー２７ａに導入された試料はギャップ２
９ａへ、次にキャピラリー２８ａへと泳動していく。他
のキャピラリーに導入された試料も同様に泳動される。
なお、緩衝液中のグリセリンは第１の実施例と同様にギ
ャップ部の緩衝液の対流を抑え、試料をキャピラリー２
７ａ〜２７ｄからキャピラリー２８ａ〜２８ｄへ確実に
かつ容易に泳動させるために使用される。At the time of fluorescence measurement, a buffer solution containing glycerin is injected into the inside of the quartz fluorescence cell 30, and the gap 29a.about.
Fill 29d with buffer. When a voltage is applied in this state, the sample introduced into the capillary 27a has a gap 2
9a and then to the capillary 28a. Samples introduced into other capillaries are also electrophoresed in the same manner.
It should be noted that glycerin in the buffer solution suppresses convection of the buffer solution in the gap portion as in the first embodiment, and the sample is placed in the capillary 2.
Used to reliably and easily migrate from 7a-27d to capillaries 28a-28d.

【００３８】ギャップ２９ａ〜２９ｄを通過するＤＮＡ
断片の蛍光検出は次のように行う。まず、蛍光体励起用
のレーザ光源３１からのレーザ光３２をレンズ３３によ
り絞り、複数の光学的検出部即ちギャップ２９ａ〜２９
ｄを同時に照射するようにする。焦点の位置は、ギャッ
プ２９ｂと２９ｃの中間に設定し、ギャップ２９ａ〜２
９ｄの間で照射スポットサイズが最大直径１００μｍと
なるように調整する。例えば、レンズ３３として焦点距
離が１５０ｍｍ程度のレンズを使用することでギャップ
２９ａ〜２９ｄをほぼ同じスポットサイズで照射するこ
とができる。DNA passing through the gaps 29a to 29d
Fluorescence detection of fragments is performed as follows. First, the laser light 32 from the laser light source 31 for exciting the fluorescent substance is narrowed down by the lens 33, and a plurality of optical detecting portions, that is, the gaps 29a to 29 are formed.
Irradiate d at the same time. The position of the focal point is set in the middle of the gaps 29b and 29c, and the gaps 29a-2
The irradiation spot size is adjusted to have a maximum diameter of 100 μm during 9d. For example, by using a lens having a focal length of about 150 mm as the lens 33, it is possible to irradiate the gaps 29a to 29d with substantially the same spot size.

【００３９】各ギャップを通過するＤＮＡ断片から発せ
られた蛍光４４は、レーザ光照射方向と垂直の方向から
レンズ３４で集光し、干渉フィルタ３５で散乱光などの
背景光を除去し、レンズ３６で集光し、ＣＣＤカメラや
ホトダイオードアレイ等のラインセンサ３７面に結像さ
せる。ラインセンサ３７の出力から、コンピュータ等の
データ処理装置３８で泳動パターン等のデータ処理を行
い、それらの結果をモニタ３９、プリンタ４０に出力す
る。また、データはメモリ４１に保存する。The fluorescence 44 emitted from the DNA fragment passing through each gap is condensed by the lens 34 from the direction perpendicular to the laser light irradiation direction, and the interference filter 35 removes background light such as scattered light, and the lens 36. Then, the light is focused by and is focused on the surface of the line sensor 37 such as a CCD camera or a photodiode array. From the output of the line sensor 37, a data processing device 38 such as a computer processes data such as a migration pattern and outputs the results to a monitor 39 and a printer 40. The data is also stored in the memory 41.

【００４０】レーザ光として波長４８８ｎｍのアルゴン
レーザ光を、試料としてＦＩＴＣ溶液を使用し、各キャ
ピラリー２７ａ〜２７ｄ内を連続的に泳動させる。光学
的検出部であるギャップ空間を泳動する試料の蛍光像を
ラインセンサ３７で検出すれば、ギャップ２９ａ〜２９
ｄの４箇所、つまり各泳動路に対応する光学的検出部で
は、互いに他の光学的検出部と独立して強い蛍光が検出
されることになる。ラインセンサ上の各泳動路に対応す
る部分の信号強度を計測することで、それぞれのキャピ
ラリーを泳動する試料を連続的にさらに同時に検出する
ことができる。Argon laser light having a wavelength of 488 nm is used as laser light, and a FITC solution is used as a sample, and the capillaries 27a to 27d are continuously migrated. If the line sensor 37 detects the fluorescent image of the sample that migrates in the gap space that is the optical detection unit, the gaps 29a to 29a are detected.
At four points of d, that is, at the optical detection sections corresponding to each migration path, strong fluorescence is detected independently of the other optical detection sections. By measuring the signal intensity of the portion corresponding to each migration path on the line sensor, it is possible to successively and simultaneously detect the samples that migrate through the respective capillaries.

【００４１】本実施例により、複数の光学的検出部にお
いて同時に、またほぼ同一条件で泳動する試料からの蛍
光を検出することができ、例えば、ＤＮＡの塩基配列決
定、多試料ＤＮＡの塩基配列同時決定、蛍光体を利用し
た側鎖あるいは官能基の解析、液体クロマトグラフィー
で分離された試料の詳細な解析等の多項目にわたる解析
が可能となる。また、レンズ等の蛍光集光部が１個で済
むため、安価にしかも小型に構成することができる。According to the present embodiment, it is possible to detect fluorescence from a sample that migrates simultaneously in a plurality of optical detection sections and under substantially the same conditions. For example, determination of DNA base sequence and simultaneous measurement of base sequences of multiple sample DNA are possible. Multiple items of analysis such as determination, analysis of side chain or functional group using fluorescent substance, detailed analysis of sample separated by liquid chromatography and the like are possible. Moreover, since only one fluorescent light condensing unit such as a lens is required, it can be constructed at low cost and in a small size.

【００４２】さらに、本実施例のようにキャピラリー対
を１列に配して各ギャップ空間を一直線上に並べ、レー
ザ光をキャピラリーの存在しない各ギャップ空間に沿っ
て照射することにより、レーザー光がキャピラリーによ
る散乱または屈折を受けないため、各ギャップ空間をほ
ぼ同一強度、同一照射スポットサイズで照射することが
でき、効率よく複数の試料を励起することができ、複数
の試料を高感度に検出する装置を簡便に構成することが
できる。ギャップ部を設けずに複数のキャピラリーを並
べて同様の蛍光検出を行う場合、例えば、図６の従来例
と同様なキャピラリーを複数本使用し、被覆を除去した
部分をレーザー光の照射軸上に順に並べて蛍光検出を行
うような場合、個々のキャピラリーを通過する度にレー
ザ光が散乱または屈折をうけ、レーザ光路が曲がった
り、レーザ光束が拡がってしまい、各キャピラリーを同
一条件で照射することができなくなり、特に後側のキャ
ピラリーに対しては十分な励起レーザ光強度が得られな
くなる。そのため、このような場合キャピラリーを複数
本並べることは困難になる。しかし、本実施例の構成の
場合、キャピラリーを複数本並べてもそれぞれのキャピ
ラリー内を泳動する試料をすべて同一条件でしかも高感
度に検出することができることになる。そのため、多数
の試料の同時計測を容易に達成することができる。Further, as in this embodiment, the pair of capillaries is arranged in one row and the gap spaces are arranged in a straight line, and the laser light is irradiated along the gap spaces where no capillaries are present. Since it is not scattered or refracted by the capillaries, each gap space can be irradiated with almost the same intensity and the same irradiation spot size, multiple samples can be efficiently excited, and multiple samples can be detected with high sensitivity. The device can be simply configured. When performing similar fluorescence detection by arranging a plurality of capillaries without providing a gap portion, for example, a plurality of capillaries similar to those of the conventional example of FIG. 6 are used, and the portions where the coating is removed are sequentially placed on the irradiation axis of the laser light. When detecting fluorescence side by side, the laser light is scattered or refracted each time it passes through each capillary, the laser optical path is bent, the laser light flux is expanded, and each capillary can be irradiated under the same conditions. In particular, a sufficient pump laser light intensity cannot be obtained for the rear side capillary. Therefore, in such a case, it is difficult to arrange a plurality of capillaries. However, in the case of the configuration of the present embodiment, even if a plurality of capillaries are arranged, it is possible to detect all the samples that migrate in each capillary under the same conditions and with high sensitivity. Therefore, simultaneous measurement of a large number of samples can be easily achieved.

【００４３】次に、本装置でＤＮＡの塩基配列を決定す
る方法について説明する。周知のサンガー（Ｓａｎｇｅ
ｒ）らのジデオキシ法により、蛍光標識したプライマー
を使い、ＤＮＡポリメラーゼ反応を行って蛍光標識ＤＮ
Ａ断片を調製する。プライマーとして、ＦＩＴＣが結合
したプライマー（標識プライマー）を使用する。まず、
一本鎖ＤＮＡに標識プライマーを加え、アニール（２本
鎖形成）して、一本鎖ＤＮＡに標識プライマーを結合さ
せる。この反応液を４分割し、それぞれにＡ、Ｃ、Ｇ、
Ｔに対応したＤＮＡポリメラーゼ反応を行わせる。つま
り、標識プライマーの結合した一本鎖ＤＮＡに４種のデ
オキシヌクレオチド三りん酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ）とターミネータとなるｄｄＡＴＰを
加えポリメラーゼ反応を行わせる。この反応により、末
端がＡの種々の長さの蛍光標識ＤＮＡ断片を得る。同様
の反応をＣ、Ｇ、Ｔについても行う。Next, a method for determining the base sequence of DNA with this apparatus will be described. The well-known Sanger
According to the dideoxy method of r) et al., using a fluorescently labeled primer, a DNA polymerase reaction is carried out to obtain a fluorescently labeled DN.
Prepare the A fragment. A FITC-bound primer (labeled primer) is used as the primer. First,
A labeled primer is added to the single-stranded DNA and annealed (double-strand formation) to bind the labeled primer to the single-stranded DNA. This reaction solution was divided into four, and A, C, G, and
A DNA polymerase reaction corresponding to T is performed. That is, four kinds of deoxynucleotide triphosphates (dATP, dTTP, d) are attached to the single-stranded DNA bound with the labeled primer.
CTP, dGTP) and ddATP as a terminator are added to carry out a polymerase reaction. By this reaction, fluorescently labeled DNA fragments having various lengths with A at the ends are obtained. The same reaction is performed for C, G and T.

【００４４】上述のようにして得られる４つのＡ、Ｃ、
Ｇ、Ｔの反応液を、それぞれ４つのキャピラリー２７ａ
〜２７ｄに導入する。導入法は第１の実施例と同様で、
Ａ反応液を２７ａに、Ｃ反応液を２７ｂに、Ｇ反応液を
２７ｃに、Ｔ反応液を２７ｄに導入する。導入後約１０
ｋＶの電圧を印加することで電気泳動させる。波長４８
８ｎｍのアルゴンレーザ光を励起光として、各ギャップ
２９ａ〜２９ｄでの蛍光強度の時間変化を測定する。Ｄ
ＮＡ断片は分子量の小さい順に泳動されることから、蛍
光ピークの生じたギャップ位置を時間順に解析すること
で塩基配列が解析できる。Four A's, C's, obtained as described above,
The reaction liquids of G and T are each provided with four capillaries 27a.
~ 27d. The introduction method is the same as in the first embodiment,
A reaction solution is introduced into 27a, C reaction solution is introduced into 27b, G reaction solution is introduced into 27c, and T reaction solution is introduced into 27d. About 10 after introduction
Electrophoresis is performed by applying a voltage of kV. Wavelength 48
The time change of the fluorescence intensity in each of the gaps 29a to 29d is measured by using the argon laser light of 8 nm as the excitation light. D
Since the NA fragments are electrophoresed in ascending order of molecular weight, the base sequence can be analyzed by analyzing the gap positions where the fluorescence peaks occur in chronological order.

【００４５】本実施例でも、第１の実施例と同様に検出
される背景光強度が少なくなり、高感度に蛍光強度を検
出することができる。しかも簡便な装置構成で複数の試
料を同時に検出することができる。各塩基毎に蛍光体の
種類を変えて、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの各反応液を混合し、任
意の１本のキャピラリーに注入し、各蛍光体の蛍光波長
毎の蛍光強度の時間変化を複数のキャピラリーのそれぞ
れについて検出する装置構成とすれば、多数の試料のＤ
ＮＡの塩基配列を同時に計測することが可能になる。Also in this embodiment, the background light intensity detected is reduced as in the first embodiment, and the fluorescence intensity can be detected with high sensitivity. Moreover, it is possible to simultaneously detect a plurality of samples with a simple device configuration. The type of the fluorescent substance is changed for each base, the reaction liquids of A, C, G, and T are mixed and injected into one arbitrary capillary, and the temporal change of the fluorescent intensity of each fluorescent substance for each fluorescent wavelength is performed. If the device is configured to detect each of a plurality of capillaries, the D
It becomes possible to measure the base sequence of NA at the same time.

【００４６】〔実施例３〕上記第１の実施例及び第２に
実施例では、蛍光測定により試料を検出する装置につい
て説明したが、吸光度の測定、透過光強度の測定などの
光吸収測定の場合も同様に装置を構成することができ
る。図４に、光吸収測定の場合の電気泳動装置の構成図
を示す。泳動路として、内径１００μｍ、外径２００μ
ｍ、長さ３０ｃｍのシリカ製のキャピラリー５１及びそ
れと同じ内外径を有する長さ２０ｃｍのシリカ製のキャ
ピラリー５２の２本を使用する。キャピラリー５１及び
５２には、変性剤の尿素を含む５％ポリアクリルアミド
ゲルを作成する。ゲルの作成方法は第１の実施例と同様
であり、シランカップリング処理したキャピラリーにア
クリルアミドゲルを化学的に結合させた。[Embodiment 3] In the above-mentioned first and second embodiments, the apparatus for detecting the sample by the fluorescence measurement has been described. However, in the light absorption measurement such as the absorbance measurement and the transmitted light intensity measurement, In such a case, the device can be similarly configured. FIG. 4 shows a configuration diagram of the electrophoretic device in the case of light absorption measurement. As migration path, inner diameter 100μm, outer diameter 200μ
Two silica capillaries 51 of m and 30 cm in length and silica capillaries 52 of 20 cm in length having the same inner and outer diameters as those of silica are used. For the capillaries 51 and 52, 5% polyacrylamide gel containing urea as a denaturant is prepared. The method for preparing the gel was the same as in the first example, and an acrylamide gel was chemically bonded to the silane coupling-treated capillary.

【００４７】このキャピラリー５１及び５２のそれぞれ
の一端を、第１の実施例と同様に光学セル５４の内部に
保持して試料の吸収に基づく透過光強度を測定する。光
学セル５４としては上下端が解放している４面透明の角
形の光学セル（外形３ｍｍ角、内形１ｍｍ角）を使用
し、第１の実施例の図２と同様の構成で、上記キャピラ
リー５１及び５２のそれぞれの一端を、光学セル５４の
内部に、同軸にかつ０．２ｍｍのギャップ５３を形成す
るように保持する。One end of each of the capillaries 51 and 52 is held inside the optical cell 54 as in the first embodiment, and the transmitted light intensity based on the absorption of the sample is measured. As the optical cell 54, a four-sided transparent prismatic optical cell with open upper and lower ends (outer shape 3 mm square, inner shape 1 mm square) is used, and the above-mentioned capillary has the same configuration as that of FIG. One end of each of 51 and 52 is held inside the optical cell 54 so as to be coaxial and form a 0.2 mm gap 53.

【００４８】ギャップ５３空間を光学的検出部とする。
なお、キャピラリー５１及びキャピラリー５２のそれぞ
れの他端は、緩衝液（トリス、ほう酸、ＥＤＴＡを含む
緩衝液）を入れた陰極側電極槽５及び陽極側電極槽６に
浸す。光学セル５４の内部には緩衝液を注入してギャッ
プ５３を緩衝液で満たし、高電圧電源７により、陰極側
電極槽５と陽極側電極槽６の間に直流高電圧を印加す
る。電圧印加により、キャピラリー５２、ギャップ５
３、及びキャピラリー５１内を電流が流れ、試料がキャ
ピラリー５１、ギャップ５３、及びキャピラリー５２と
順に泳動する。The space of the gap 53 is used as an optical detector.
The other ends of the capillaries 51 and 52 are immersed in a cathode-side electrode tank 5 and an anode-side electrode tank 6 containing a buffer solution (buffer solution containing Tris, boric acid, and EDTA). A buffer solution is injected into the optical cell 54 to fill the gap 53 with the buffer solution, and a high voltage power supply 7 applies a high DC voltage between the cathode side electrode tank 5 and the anode side electrode tank 6. By applying voltage, the capillary 52 and the gap 5
3, a current flows through the inside of the capillary 51, and the sample migrates to the capillary 51, the gap 53, and the capillary 52 in order.

【００４９】試料、例えばＤＮＡの制限酵素切断断片の
導入は、陰極側のキャピラリー５１の端を一時的に試料
液に浸し、試料液と陽極側電極槽の間に５ｋＶの電圧を
１０秒間程度印加することで行う。その後キャピラリー
の端を元の陰極側電極槽に戻し、陰極側電極槽と陽極側
電極槽の間に１０ｋＶの直流電圧を印加することで、試
料は、キャピラリー５１部で陰極側から陽極側に向かっ
て分子量分離されつつ泳動され、ギャップ５３を通過
し、キャピラリー５２に導かれる。For the introduction of a sample, for example, a DNA fragment cleaved with a restriction enzyme, the end of the capillary 51 on the cathode side is temporarily immersed in the sample solution, and a voltage of 5 kV is applied for about 10 seconds between the sample solution and the electrode tank on the anode side. By doing. After that, the end of the capillary is returned to the original cathode-side electrode tank, and a DC voltage of 10 kV is applied between the cathode-side electrode tank and the anode-side electrode tank, so that the sample goes from the cathode side to the anode side at the capillary 51 part. It is electrophoresed while being separated by molecular weight, passes through the gap 53, and is guided to the capillary 52.

【００５０】ギャップ５３を通過するＤＮＡ断片に対し
て、キセノンランプやＤ₂ ランプ等の光源５５の光をモ
ノクロメータ５６を通し、レンズ５７で集光し、ギャッ
プ５３を照射する。照射する光波長は試料の吸収波長に
設定するのが通常であり、例えばＤＮＡ断片に対して
は、２６０ｎｍ程度が適当である。ＤＮＡ断片により光
吸収を受け透過した光は、再びレンズ５８で集光されて
光電子増倍管５９で検出される。光電子増倍管５９から
の出力信号は増幅器６０で増幅され、コンピュータ等の
データ処理装置６１で泳動パターン等を処理され、それ
らの結果はモニタ６２、プリンタ６３に出力され、また
メモリ６４に保存される。With respect to the DNA fragment passing through the gap 53, light from a light source 55 such as a xenon lamp or a D ₂ lamp is passed through a monochromator 56, condensed by a lens 57, and the gap 53 is illuminated. The light wavelength for irradiation is usually set to the absorption wavelength of the sample, and for DNA fragments, for example, about 260 nm is suitable. The light that has been absorbed by the DNA fragment and transmitted therethrough is collected again by the lens 58 and detected by the photomultiplier tube 59. The output signal from the photomultiplier tube 59 is amplified by the amplifier 60, the electrophoretic pattern is processed by the data processing device 61 such as a computer, and the results are output to the monitor 62, the printer 63, and stored in the memory 64. It

【００５１】本実施例のように、緩衝液を満たしたギャ
ップをキャピラリー間に設け、キャピラリー部を分子量
分離部、ギャップ空間を吸光度を測定する光学的検出部
と分けることで、照射光がキャピラリーで散乱されるこ
となく試料を効率よく照射することができ、高精度な吸
光度測定が可能になる。具体的には、本実施例のように
ギャップ部に光を入射させた時の透過光強度（試料が通
過しない場合で受光用のレンズの開口数が０．１９の場
合）を１とすると、従来のようにキャピラリーを透過さ
せる場合はその透過光強度が０．６程度に低下する。こ
れはキャピラリー自体及び電気泳動で分子量分離させる
ための媒体であるポリアクリルアミドゲル等のゲルが光
の散乱体であるため、その部分で入射光が散乱され、そ
の結果透過光が減少するためである。透過光強度が低下
することはその分だけ光検出器等のＳ／Ｎが低下するこ
とを意味し、測定精度が低下する。また、キャピラリー
の表面等で散乱や反射した光もその一部が検出されてし
まうが、これらの光は試料を照射することなく（試料に
よる吸収を受けずに）直接検出器に入射する。このよう
な試料の存在にかかわらずに検出される光成分がある
と、微小な光強度変化が測定しにくくなり、つまり精度
の高い吸光度測定が困難になる。As in this example, a gap filled with a buffer solution is provided between the capillaries, the capillary part is separated from the molecular weight separation part, and the gap space is separated from the optical detection part for measuring the absorbance. The sample can be efficiently irradiated without being scattered and highly accurate absorbance measurement can be performed. Specifically, when the transmitted light intensity (when the sample does not pass through and the numerical aperture of the light receiving lens is 0.19) when light is incident on the gap portion as in the present embodiment, When transmitting through a capillary as in the conventional case, the transmitted light intensity is reduced to about 0.6. This is because the capillary itself and a gel such as polyacrylamide gel, which is a medium for separating molecular weights by electrophoresis, are light scatterers, so that incident light is scattered at that portion, and as a result, transmitted light is reduced. .. A decrease in transmitted light intensity means a corresponding decrease in S / N ratio of the photodetector and the like, which results in a decrease in measurement accuracy. In addition, a part of the light scattered or reflected by the surface of the capillary is also detected, but these lights directly enter the detector without irradiating the sample (without being absorbed by the sample). If there is a light component that is detected regardless of the presence of such a sample, it becomes difficult to measure a minute change in light intensity, that is, it is difficult to measure the absorbance with high accuracy.

【００５２】本実施例では、光はギャップ空間を通過す
る、つまり光散乱の極めて少ない緩衝液中を透過するた
め、上記のようなキャピラリー自体及びゲル等による光
散乱の影響を受けることがなくなる。そのため、試料が
効率よく照射され、高精度な吸光度測定が可能になる。
なお、本実施例では、モノクロメータ５６を通した光
を、レンズによりギャップ部に集光して照射している
が、集光せずにほぼ平行光として照射し、ギャップ部を
通過した光のみを空間的に分離してその光強度を測定す
ることでも同様に測定が可能である。In this embodiment, the light passes through the gap space, that is, the light is transmitted through the buffer solution in which the light scattering is extremely small. Therefore, the influence of the light scattering by the capillary itself and the gel as described above is eliminated. Therefore, the sample is efficiently irradiated, and highly accurate absorbance measurement becomes possible.
In the present embodiment, the light that has passed through the monochromator 56 is condensed and emitted by the lens in the gap portion, but it is irradiated as substantially parallel light without being condensed and only the light that has passed through the gap portion is irradiated. Similarly, the measurement can be performed by spatially separating and measuring the light intensity.

【００５３】また、第２の実施例のように複数のキャピ
ラリー対を設け、同時に複数の試料の吸収を計測するこ
とも可能である。この場合、光の照射軸に対して垂直な
面内に複数のキャピラリー対を配置し、複数のギャップ
の個々の透過光強度を２次元センサ等で検出する装置構
成とすればよい。 〔実施例４〕上記第１から第３の実施例では、キャピラ
リー対によりギャップを形成したが、ギャップはキャピ
ラリー対のみによって形成されるものではない。例え
ば、分子量分離部を上記実施例と同じくキャピラリーと
し、このキャピラリー端と細孔を有した平板とでギャッ
プを形成することもできる。It is also possible to provide a plurality of capillary pairs and measure the absorption of a plurality of samples at the same time as in the second embodiment. In this case, a plurality of capillary pairs may be arranged in a plane perpendicular to the light irradiation axis, and a device configuration may be used in which the transmitted light intensity of each of the plurality of gaps is detected by a two-dimensional sensor or the like. [Embodiment 4] In the first to third embodiments, the gap is formed by the capillary pair, but the gap is not limited to the capillary pair. For example, the molecular weight separation section may be a capillary as in the above-mentioned embodiment, and a gap may be formed by the end of the capillary and a flat plate having pores.

【００５４】図５にキャピラリーと細孔を有した平板と
でギャップを形成した蛍光セル部の拡大断面図を示す。
第１の実施例と同様にポリアクリルアミドゲルを充填し
たキャピラリー７１と細孔７２を有する平板７３（例え
ば四ふっ化エチレン樹脂製の平板）を、キャピラリー７
１の軸と細孔７２の軸がほぼ一致するように対向させて
配置し、ギャップ７４を形成させる。これらを蛍光セル
７５の内部に保持する。蛍光セルは、上下端が開放して
いる例えば外形３ｍｍ角、内形１ｍｍ角の角形の蛍光セ
ルであり、上部から例えば四ふっ化エチレン樹脂製のブ
ロック７６で押さえ、また下部からは平板７３で押さえ
て固定され、セル内に緩衝液などを保持できるようにす
る。四ふっ化エチレン樹脂製ブロック７６にはキャピラ
リー７１の外形に一致する孔が設けられており、その孔
にキャピラリー７１を通してキャピラリー７１を保持
し、また、ギャップ７４の長さが０．１ｍｍから１ｍｍ
となるように調整できるようにする。キャピラリー７１
の他端は第１の実施例と同様に陰極側電極槽に浸され
る。また平板７３の下部には、チューブ固定具７８によ
り四ふっ化エチレン樹脂製チューブ７７を接続し、陽極
側電極槽に導かれる。なお、直接平板７３を陽極側電極
槽に接触させてもよい。FIG. 5 shows an enlarged sectional view of the fluorescent cell portion in which a gap is formed by a capillary and a flat plate having pores.
Similarly to the first embodiment, a capillary 71 filled with polyacrylamide gel and a flat plate 73 having pores 72 (for example, a flat plate made of tetrafluoroethylene resin) are attached to the capillary 7.
The gap 74 is formed by arranging them so as to face each other so that the axis of 1 and the axis of the pore 72 are substantially aligned. These are held inside the fluorescent cell 75. The fluorescent cell is, for example, a prismatic fluorescent cell having an outer shape of 3 mm square and an inner shape of 1 mm square, the upper and lower ends of which are open. It is pressed and fixed so that the buffer solution can be retained in the cell. The block 76 made of ethylene tetrafluoride resin is provided with a hole corresponding to the outer shape of the capillary 71, the capillary 71 is passed through the hole to hold the capillary 71, and the length of the gap 74 is 0.1 mm to 1 mm.
So that it can be adjusted. Capillary 71
The other end is immersed in the cathode-side electrode tank as in the first embodiment. A tube fixture 78 is connected to a lower portion of the flat plate 73, and a tetrafluoroethylene resin tube 77 is connected to the anode side electrode tank. The flat plate 73 may be brought into direct contact with the anode-side electrode tank.

【００５５】なお、図５では図示していないが図２と同
様に蛍光セル７５の内部に緩衝液等を注入するための注
入口が設けられており、泳動時にはバルブなどを介して
緩衝液を注入して蛍光セル７５の内部及びギャップ７４
空間及び四ふっ化エチレン樹脂製チューブ７７を満た
し、緩衝液の注入を止めた後、試料を電気泳動させる。
本実施例によれば、第１の実施例と同様に背景光強度の
少ない蛍光検出ができ、試料の高感度蛍光検出が可能に
なる。Although not shown in FIG. 5, an injection port for injecting a buffer solution or the like is provided inside the fluorescent cell 75 as in FIG. 2, and the buffer solution is supplied via a valve or the like during migration. Injected into the fluorescent cell 75 and the gap 74
After filling the space and the tetrafluoroethylene resin tube 77 and stopping the injection of the buffer solution, the sample is electrophoresed.
According to this embodiment, fluorescence detection with low background light intensity can be performed as in the first embodiment, and high-sensitivity fluorescence detection of a sample can be performed.

【００５６】また、平板７３に複数の細孔を一直線上に
配置すれば、第２の実施例と同様の効果を有する蛍光セ
ル部を構成することもできる。また、本実施例によれ
ば、一方が平板７３であるため、装置の組立てが容易に
なる。Further, by disposing a plurality of pores on the flat plate 73 in a straight line, a fluorescent cell portion having the same effect as that of the second embodiment can be constructed. In addition, according to the present embodiment, since one side is the flat plate 73, the assembly of the device becomes easy.

【００５７】[0057]

【発明の効果】本発明によれば、光学測定をキャピラリ
ーゲル等の分子量分離部の外で行うことにより、背景光
等の影響の少ない高感度な蛍光または光吸収計測が可能
な電気泳動装置が実現できる。また、ゲル電気泳動での
分子量分離性能を損なうことなく、電解液からなる蛍光
または光吸収測定部を簡便に構成でき、容易に装置化で
きる。According to the present invention, an electrophoretic device capable of highly sensitive fluorescence or optical absorption measurement with little influence of background light or the like is obtained by performing optical measurement outside a molecular weight separation unit such as a capillary gel. realizable. In addition, the fluorescence or light absorption measuring unit made of the electrolytic solution can be simply constructed without impairing the molecular weight separation performance in gel electrophoresis, and can be easily made into a device.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 本発明の第１の実施例の電気泳動装置の構成
図。FIG. 1 is a configuration diagram of an electrophoretic device according to a first embodiment of the present invention.

【図２】 本発明の第１の実施例の蛍光セル部の拡大断
面図。FIG. 2 is an enlarged sectional view of a fluorescent cell portion according to the first embodiment of the present invention.

【図３】 本発明の第２の実施例の電気泳動装置の蛍光
検出部の構成図。FIG. 3 is a configuration diagram of a fluorescence detection unit of the electrophoretic device according to the second embodiment of the present invention.

【図４】 本発明の第３の実施例の電気泳動装置の構成
図。FIG. 4 is a configuration diagram of an electrophoretic device according to a third embodiment of the present invention.

【図５】 本発明の第４の実施例の蛍光セル部の拡大断
面図。FIG. 5 is an enlarged sectional view of a fluorescent cell portion according to a fourth embodiment of the present invention.

【図６】 従来例のキャピラリーを使った電気泳動装置
の蛍光測定部の構成図。FIG. 6 is a configuration diagram of a fluorescence measurement unit of an electrophoresis device using a capillary of a conventional example.

【図７】 従来例のキャピラリーを使った電気泳動装置
のシースフローキュベットを使用した蛍光測定部の構成
図。FIG. 7 is a configuration diagram of a fluorescence measurement unit using a sheath flow cuvette of an electrophoresis device using a capillary of a conventional example.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

１…キャピラリー、２…キャピラリー、３…ギャップ、
４…蛍光セル、５…陰極側電極槽、６…陽極側電極槽、
７…高電圧電源、８…アルゴンレーザ光源、９…レーザ
光、１０…レンズ、１１…蛍光、１２…レンズ、１３…
干渉フィルタ、１４…レンズ、１５…スリツト、１６…
光電子増倍管、１７…増幅器、１８…データ処理装置、
１９…モニタ、２０…プリンタ、２１…メモリ、２２ａ
及び２２ｂ…シリコーンゴムパッキン、２３ａ及び２３
ｂ…キャピラリー保持具、２４ａ及び２４ｂ…フェラ
ル、２５ａ及び２５ｂ…押しネジ、２６ａ及び２６ｂ…
バルブ、２７ａ、２７ｂ、２７ｃ及び２７ｄ…キャピラ
リー、２８ａ、２８ｂ、２８ｃ及び２８ｄ…キャピラリ
ー、２９ａ、２９ｂ、２９ｃ及び２９ｄ…ギャップ、３
０…蛍光セル、３１…レーザ光源、３２…レーザ光、３
３…レンズ、３４…レンズ、３５…干渉フィルタ、３６
…レンズ、３７…ラインセンサ、３８…データ処理装
置、３９…モニタ、４０…プリンタ、４１…メモリ、４
２及び４３…キャピラリー保持具、４４…蛍光、５１…
キャピラリー、５２…キャピラリー、５３…ギャップ、
５４…光学セル、５５…光源、５６…モノクロメータ、
５７…レンズ、５８…レンズ、５９…光電子増倍管、６
０…増幅器、６１…データ処理装置、６２…モニタ、６
３…プリンタ、６４…メモリ、７１…キャピラリー、７
２…細孔、７３…平板、７４…ギャップ、７５…蛍光セ
ル、７６…四ふっ化エチレン樹脂製のブロック、７７…
四ふっ化エチレン樹脂製チューブ、７８…チューブ固定
具。1 ... Capillary, 2 ... Capillary, 3 ... Gap,
4 ... Fluorescent cell, 5 ... Cathode side electrode tank, 6 ... Anode side electrode tank,
7 ... High-voltage power supply, 8 ... Argon laser light source, 9 ... Laser light, 10 ... Lens, 11 ... Fluorescence, 12 ... Lens, 13 ...
Interference filter, 14 ... Lens, 15 ... Slit, 16 ...
Photomultiplier tube, 17 ... Amplifier, 18 ... Data processing device,
19 ... Monitor, 20 ... Printer, 21 ... Memory, 22a
And 22b ... Silicone rubber packing, 23a and 23
b ... Capillary holder, 24a and 24b ... Ferrule, 25a and 25b ... Push screw, 26a and 26b ...
Valve, 27a, 27b, 27c and 27d ... Capillary, 28a, 28b, 28c and 28d ... Capillary, 29a, 29b, 29c and 29d ... Gap, 3
0 ... Fluorescent cell, 31 ... Laser light source, 32 ... Laser light, 3
3 ... Lens, 34 ... Lens, 35 ... Interference filter, 36
... Lens, 37 ... Line sensor, 38 ... Data processing device, 39 ... Monitor, 40 ... Printer, 41 ... Memory, 4
2 and 43 ... Capillary holder, 44 ... Fluorescence, 51 ...
Capillary, 52 ... Capillary, 53 ... Gap,
54 ... Optical cell, 55 ... Light source, 56 ... Monochromator,
57 ... Lens, 58 ... Lens, 59 ... Photomultiplier tube, 6
0 ... Amplifier, 61 ... Data processing device, 62 ... Monitor, 6
3 ... Printer, 64 ... Memory, 71 ... Capillary, 7
2 ... Pore, 73 ... Flat plate, 74 ... Gap, 75 ... Fluorescent cell, 76 ... Block made of tetrafluoroethylene resin, 77 ...
Tube made of tetrafluoroethylene resin, 78 ... Tube fixing tool.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｍ 1/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 8114−4Ｂ ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁵ Identification code Office reference number FI technical display location // C12M 1/00 A C12Q 1/68 A 8114-4B

Claims (8)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 電源によって直流電圧を印加された陰極
電極槽と陽極電極槽の間に光学セルを貫通する泳動路を
形成し、少なくとも前記光学セルの上流側泳動路がキャ
ピラリーで規定されている電気泳動装置であって、前記
キャピラリーの一端を前記泳動路に直交する方向の内部
寸法が前記泳動路の径より大きく内部に電解液を満たし
た光学セル中に終端させ、前記光学セル中における前記
キャピラリー外の泳動路を光学的検出部とし、該光学的
検出部に光源から光照射して試料の検出を行うことを特
徴とする電気泳動装置。1. A migration path that penetrates an optical cell is formed between a cathode electrode tank and an anode electrode tank to which a DC voltage is applied by a power source, and at least the upstream migration path of the optical cell is defined by a capillary. In the electrophoretic device, one end of the capillary is terminated in an optical cell in which an internal dimension in a direction orthogonal to the migration path is larger than a diameter of the migration path and an electrolyte is filled therein, An electrophoretic device characterized in that a migration path outside a capillary is used as an optical detection section, and the optical detection section is irradiated with light from a light source to detect a sample. 【請求項２】 前記電気泳動路の試料分離部をキャピラ
リーゲルで構成することを特徴とする請求項１記載の電
気泳動装置。2. The electrophoresis apparatus according to claim 1, wherein the sample separation section of the electrophoresis path is formed of a capillary gel. 【請求項３】 一端がそれぞれ前記陰極電極槽または陽
極電極槽に接続された一対のキャピラリーの他端を前記
セル中にその軸をほぼ一致させ一定のギャップを形成し
て対向させて配置し、該ギャップを前記光学的検出部と
することを特徴とする請求項１または請求項２記載の電
気泳動装置。3. A pair of capillaries, one end of which is connected to the cathode electrode tank or the anode electrode tank, respectively, are arranged so that the other ends of the capillaries are opposed to each other in the cell with their axes being substantially aligned with each other to form a constant gap. The electrophoretic device according to claim 1 or 2, wherein the gap serves as the optical detection unit. 【請求項４】 前記ギャップの長さが１ｍｍ以下である
ことを特徴とする請求項３記載の電気泳動装置。4. The electrophoresis device according to claim 3, wherein the gap has a length of 1 mm or less. 【請求項５】 複数のキャピラリー対によって形成され
る複数の光学的検出部を単一の光学セル中に配置し、前
記複数の光学的検出部が互いに電解液を介して連結して
いることを特徴とする請求項３または請求項４記載の電
気泳動装置。5. A plurality of optical detection parts formed by a plurality of capillary pairs are arranged in a single optical cell, and the plurality of optical detection parts are connected to each other through an electrolytic solution. The electrophoretic device according to claim 3 or 4, which is characterized in that. 【請求項６】 前記光学的検出部は試料から発せられる
蛍光を検出するものであることを特徴とする請求項１〜
５のいずれか１項に記載の電気泳動装置。6. The optical detecting section is for detecting fluorescence emitted from a sample.
5. The electrophoretic device according to any one of 5 above. 【請求項７】 前記光学的検出部は試料による光吸収を
測定するものであることを特徴とする請求項１〜５のい
ずれか１項に記載の電気泳動装置。7. The electrophoretic device according to claim 1, wherein the optical detector measures light absorption by a sample. 【請求項８】 複数のキャピラリー対によって形成され
る複数の光学的検出部が一直線上に位置するように前記
複数のキャピラリー対を整列して配置し、全ての光学的
検出部を同時に照射するように単一の励起光を前記直線
に沿って照射して各キャピラリーに注入された試料から
発せられる蛍光を同時に検出することを特徴とする請求
項５記載の電気泳動装置。8. The plurality of pairs of capillaries are aligned so that the plurality of optical detectors formed by the plurality of pairs of capillaries are located on a straight line, and all the optical detectors are irradiated simultaneously. 6. The electrophoresis apparatus according to claim 5, wherein a single excitation light is irradiated along the straight line to simultaneously detect fluorescence emitted from the sample injected into each capillary.