JPH05284999A - Method for detecting polynucleotide - Google Patents

Method for detecting polynucleotide

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JPH05284999A
JPH05284999A JP9126592A JP9126592A JPH05284999A JP H05284999 A JPH05284999 A JP H05284999A JP 9126592 A JP9126592 A JP 9126592A JP 9126592 A JP9126592 A JP 9126592A JP H05284999 A JPH05284999 A JP H05284999A
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polynucleotide
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labeled
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Abstract

PURPOSE:To determine polynucleotide in high sensitivity and in high precision by associating different sites of polynucleotide chain with two or more mutually complementary labeled probes and measuring the number of formed complexes. CONSTITUTION:A polynucleotide as a substance to be measured is associated with two or more mutually complementary label probes at different sites of the polynucleotide. The number of complexes of the label probe and the substance to be measured is distinguished as existence of each molecule of the label probe and measured. Labeling of radioisotope is not required.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、疾病の原因となるウイ
ルス、リケッチャ、細菌等の外来性ポリヌクレオチド、
あるいは生物中の特定の遺伝情報を担うポリヌクレオチ
ドの有無およびその変異を検出することが容易に可能な
ポリヌクレオチド検出法、及び当該方法に使用する検出
装置に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an exogenous polynucleotide such as a virus, rickettsia or bacterium which causes a disease,
Alternatively, the present invention relates to a polynucleotide detection method capable of easily detecting the presence or absence of a polynucleotide carrying specific genetic information in an organism and its mutation, and a detection device used in the method.

【０００２】[0002]

【従来の技術】「Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.8
0, p278-282(1983)」において、標的となるポリヌクレ
オチド (ＤＮＡまたはＲＮＡ) 試料を直接固相に捕捉し
た後、あるいは標的ポリヌクレオチドと相補的な塩基配
列を含む他のポリヌクレオチドプローブを固相に固定し
たハイブリダイゼーション反応を用いて標的ポリヌクレ
オチドを固相に捕捉した後、標識物を結合した標識ポリ
ヌクレオチドを会合させることを特徴とするポリヌクレ
オチド検出法が開示されている。[Prior Art] "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.8
0, p278-282 (1983) ", a target polynucleotide (DNA or RNA) sample is directly captured on a solid phase, or another polynucleotide probe containing a base sequence complementary to the target polynucleotide is immobilized. Disclosed is a method for detecting a polynucleotide, which comprises capturing a target polynucleotide on a solid phase using a hybridization reaction immobilized on a phase, and then associating the labeled polynucleotide bound with a label.

【０００３】この方法は、１) 電気泳動により分子量分
離したポリヌクレオチド断片試料をニトロセルロース膜
に転写して固定した後に、当該ニトロセルロース膜を放
射性同位元素で標識したポリヌクレオチドプローブを含
む溶液に浸して会合反応を行ない、２) 反応後、未反応
の標識プローブ膜から洗い流した後に、膜に結合した残
留標識プローブの量をオートラジオグラフィーにより検
出することで標的ポリヌクレオチドの有無を判定する方
法である。In this method, 1) a sample of polynucleotide fragments whose molecular weights have been separated by electrophoresis is transferred to a nitrocellulose membrane and fixed, and then the nitrocellulose membrane is immersed in a solution containing a polynucleotide probe labeled with a radioisotope. 2) After reaction, after washing away from the unreacted labeled probe membrane, the amount of residual labeled probe bound to the membrane is detected by autoradiography to determine the presence or absence of the target polynucleotide. is there.

【０００４】また、血液や***物等の試料中の細菌やウ
イルス等の外来性の標的ポリヌクレオチドを検出する方
法が、特開昭58-31998に開示されている。この方法は、
１) 精製した試料中のポリヌクレオチドを加熱等により
変性させて一本鎖とした後、これを、ニトロセルロース
膜に固定し、次に、２) 検査したい細菌やウイルスのポ
リヌクレオチドと相補的な塩基配列を持つ放射性同位元
素標識されたポリヌクレオチドプローブを反応させた
後、この膜を洗浄し、後に膜に結合した残留標識プロー
ブの量をオートラジオグラフィーにより検出することで
標的ポリヌクレオチドの有無を判定する方法である。Further, a method for detecting an exogenous target polynucleotide such as a bacterium or virus in a sample such as blood or excrement is disclosed in JP-A-58-31998. This method
1) Polynucleotides in the purified sample are denatured by heating etc. to form single strands, which are then immobilized on a nitrocellulose membrane, and 2) complementary to the bacterial or viral polynucleotides to be examined. After reacting a polynucleotide probe labeled with a radioisotope having a base sequence, the membrane is washed, and the amount of residual labeled probe bound to the membrane is detected by autoradiography to detect the presence or absence of the target polynucleotide. This is the method of judgment.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
双方の検出法において標識に用いられている放射性同位
元素は、作業者の放射線被爆を最小限に抑えなければな
らないうえにトレーサー量しか用いることができず、プ
ローブ当りの比放射活性を高くすることが困難である上
に、ニトロセルロース膜に吸着した標識プローブから放
射線のバックグラウンドが生じやすく、検出に長時間を
要し、かつ検出感度が不足する場合が多い。そのため定
量的測定が困難で、ほとんどが標的ポリヌクレオチドの
有無の判定かせいぜいオートラジオグラムのフィルムの
黒化の程度を判定する半定量的測定が行なわれるにすぎ
ず、近時の産業界の要請に対しきれていない面があっ
た。さらにオートラジオグラフィーを用いるため検出の
自動化が困難であり、加えて上記のごとく作業者の放射
線被爆への考慮の必要があり、臨床フィールドで多量の
検体について測定するには不都合な面が指摘されてい
た。However, the radioisotope used for labeling in both of the above detection methods must minimize the radiation exposure of workers and use only tracer amounts. In addition, it is difficult to increase the specific activity per probe, and the background of radiation is easily generated from the labeled probe adsorbed on the nitrocellulose membrane, which requires a long time for detection and lacks detection sensitivity. I often do it. Therefore, quantitative measurement is difficult, and most of them only judge the presence or absence of the target polynucleotide, and at most semi-quantitative measurement to judge the degree of blackening of the film of the autoradiogram. There was an uneasy side to it. Furthermore, since autoradiography is used, it is difficult to automate the detection, and in addition to the above, it is necessary to consider the radiation exposure of the worker, and it is pointed out that it is inconvenient to measure a large amount of samples in the clinical field. Was there.

【０００６】そこで、本発明は、放射性同位元素の標識
を必要とせずに、高感度で精度が高く定量的な測定が可
能で、かつ自動化により単位時間あたりの測定サンプル
数を多くすることで臨床フィールドで多量の検体を検査
することが可能なポリヌクレオチド検出法及び当該方法
を用いた検出装置の提供を課題とする。[0006] Therefore, the present invention enables clinical measurement with high sensitivity, high accuracy and quantitative measurement without the need for labeling with radioactive isotopes, and by increasing the number of measurement samples per unit time by automation. An object of the present invention is to provide a polynucleotide detection method capable of inspecting a large amount of specimens in the field and a detection device using the method.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
つき鋭意検討した結果、下記 (１）〜（６) に示した発
明により、当該課題を解決し得ることを見出した。すな
わち本発明は、 (１) 被測定物であるポリヌクレオチド鎖と当該ポリヌ
クレオチド鎖と相補的なポリヌクレオチド鎖に標識物を
結合した標識プローブを会合させ、会合した標識プロー
ブの量を検出するポリヌクレオチド検出法において、被
測定物であるポリヌクレオチド鎖における異なる部位に
対して各々相補的な二種以上の標識プローブを会合さ
せ、当該標識プローブと被測定物の複合体の量を当該標
識プローブの存在として一分子毎に特定・検知すること
を特徴とするポリヌクレオチド検出法、 (２) (１) 記載のポリヌクレオチド検出法において、
被測定物であるポリヌクレオチド鎖に会合させた、二種
以上の標識プローブ同士を連結後、被測定物であるポリ
ヌクレオチドから解離させて、解離した標識プローブ連
結体の量を一分子毎に特定・検知することを特徴とする
ポリヌクレオチド検出法、 (３) 被測定物であるポリヌクレオチド鎖に相補的な
ポリヌクレオチド鎖を固定化した担体の当該ポリヌクレ
オチド鎖に被測定物であるポリヌクレオチド鎖を会合さ
せる第一工程、 第一工程において会合させた被測定物であるポリヌク
レオチド鎖に対して各々異なる部分に対して相補的な二
種以上の標識プローブを各々会合させる第二工程、 第二工程において会合させた二種以上の標識プローブ
同士を連結し、固定化標識プローブ複合体を調製する第
三工程、 第三工程により得られた固定化標識プローブ複合体に
おける被測定物であるポリヌクレオチド鎖及び標識プロ
ーブ連結体を解離・溶出し、当該溶出液中の標識プロー
ブ連結体の量を一分子毎に特定・検知する第四工程とか
らなる、ポリヌクレオチド検出法、 (４) 液相中で、被測定物であるポリヌクレオチド鎖
と当該ポリヌクレオチド鎖の異なる部分に対して各々相
補的な二種以上の標識プローブを会合させ、連結した標
識プローブ複合体を調製し、次いで当該標識プローブ複
合体における被測定物であるポリヌクレオチド鎖と標識
プローブ連結体を解離せしめる第一工程、 第一工程で得た反応溶液を、少なくとも上記二種以上
の標識プローブの連結部分のポリヌクレオチド鎖の全部
又は一部に相補的な部分を有するポリヌクレオチド鎖を
固定化した担体と混合し、ポリヌクレオチド鎖同士で会
合反応を行なわせしめ、固定化標識プローブ複合体を調
製する第二工程、 第二工程で調製した固定化標識プローブ複合体混合物
から、上記標識プローブ連結体以外のヌクレオチド鎖を
解離・除去する第三工程、 第三工程により得た上記標識プローブ連結体以外のヌ
クレオチド鎖を解離・除去した固定化標識プローブ複合
体から、当該標識プローブ連結体を解離・溶出し、当該
溶出液中の標識プローブ連結体の量を一分子毎に特定・
検知する第四工程とからなる、ポリヌクレオチド検出
法、 (５) 被測定物であるポリヌクレオチド鎖における異な
る部位に対して各々相補的な二種以上の標識プローブに
おける標識物が異なる蛍光色素であり、一方の蛍光色素
が発する蛍光が他方の蛍光色素を励起する蛍光色素同士
であり、かつ各々の蛍光色素同士の距離が50塩基長以内
であることを特徴とする (１) 記載のポリヌクレオチド
検出法、 (６) シースフローセル、少なくとも一種以上の励起光
を発射する光源と、シースフローセルの検出部に励起光
の焦点を合わせるための受光素子、シースフローセルの
検出部より発生された蛍光を検出するための蛍光検出機
構、及び当該蛍光検出機構からの信号を標識プローブ一
分子毎の存在として識別し計数する装置からなることを
特徴とする (１) 〜 (５) 記載のポリヌクレオチド検出
法に使用する検出装置、を提供するものである。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies on the above problems, the present inventor has found that the problems can be solved by the inventions shown in the following (1) to (6). That is, the present invention relates to (1) a polynucleotide chain, which is a measurement target, and a labeled probe having a labeled substance bound to a polynucleotide chain complementary to the polynucleotide chain, and the amount of the associated labeled probe is detected. In the nucleotide detection method, two or more kinds of labeled probes each complementary to different sites in the polynucleotide chain that is the object to be measured are associated with each other, and the amount of the complex of the labeled probe and the object to be measured is the amount of the labeled probe. A method for detecting a polynucleotide, characterized in that it is specified and detected for each molecule as the presence, (2) In the method for detecting a polynucleotide according to (1),
After ligating two or more types of labeled probes associated with the polynucleotide chain to be measured, and dissociating from the polynucleotide to be measured, the amount of the dissociated labeled probe conjugate is specified for each molecule. -Polynucleotide detection method characterized by detection, (3) Polynucleotide chain which is the object to be measured on the polynucleotide chain of a carrier on which a polynucleotide chain complementary to the polynucleotide chain which is the object to be measured is immobilized A second step of associating two or more kinds of labeled probes complementary to different parts respectively with respect to the polynucleotide chain which is the measurement target in the first step, The third step of preparing an immobilized labeled probe complex by linking two or more types of labeled probes associated in the step, the immobilized label obtained in the third step It consists of a fourth step of dissociating and eluting the polynucleotide chain and the labeled probe conjugate that are the analytes in the probe probe complex, and identifying and detecting the amount of the labeled probe conjugate in the eluate for each molecule. (4) A method for detecting a polynucleotide, (4) A label which is obtained by associating and linking two or more kinds of labeled probes, which are complementary to a polynucleotide chain to be measured and a different portion of the polynucleotide chain, in a liquid phase. Prepare a probe complex, then the first step of dissociating the labeled probe conjugate and the polynucleotide chain that is the object to be measured in the labeled probe complex, the reaction solution obtained in the first step, at least two or more of the above A polynucleotide chain having a portion complementary to all or part of the polynucleotide chain at the linking portion of the labeled probe is mixed with an immobilized carrier, A second step of allowing an association reaction between octido chains to prepare an immobilized labeled probe complex, from the immobilized labeled probe complex mixture prepared in the second step, dissociating nucleotide chains other than the labeled probe conjugate Third step of removing, from the immobilized labeled probe complex obtained by dissociating and removing the nucleotide chain other than the labeled probe conjugate obtained in the third step, dissociate and elute the labeled probe conjugate, in the eluate Specify the amount of labeled probe conjugate for each molecule
A method for detecting a polynucleotide, which comprises a fourth step of detecting, (5) a fluorescent dye in which two or more kinds of labeled probes each complementary to a different site in the polynucleotide chain to be measured are different in labeling , The fluorescence emitted by one of the fluorescent dyes is between the fluorescent dyes that excite the other fluorescent dye, and the distance between the respective fluorescent dyes is within 50 base lengths. (1) Polynucleotide detection Method (6) Sheath flow cell, light source for emitting at least one kind of excitation light, light receiving element for focusing excitation light on the detection portion of the sheath flow cell, and detecting fluorescence generated by the detection portion of the sheath flow cell And a device for identifying and counting the signal from the fluorescence detection mechanism as the presence of each molecule of the labeled probe. (1) to (5), which provides a detection device used in the method for detecting a polynucleotide.

【０００８】先ず、本発明ポリヌクレオチド検出法につ
いて説明する。 Ａ. 被測定物として本発明方法に供されるポリヌクレオ
チド鎖の種類は特に限定されず、例えば、疾病の原因と
なるウイルス、リケッチャ、細菌等の外来性ポリヌクレ
オチドはもちろん、生物中の特定の遺伝情報を担うポリ
ヌクレオチドの有無を調べる場合には内在性のポリヌク
レオチドを被測定物とすることができる。なお、二種の
プローブを会合させる必要上10塩基長以上の長さを当該
被測定ポリヌクレオチドは必要とする。First, the method for detecting a polynucleotide of the present invention will be described. A. The kind of the polynucleotide chain to be subjected to the method of the present invention as an object to be measured is not particularly limited. When examining the presence or absence of a polynucleotide that carries genetic information, an endogenous polynucleotide can be used as the substance to be measured. The polynucleotide to be measured requires a length of 10 bases or more in order to associate two types of probes.

【０００９】また、かかるポリヌクレオチドはＤＮＡで
あるとＲＮＡを問わず、その調製方法は、具体的被測定
対象の種類に応じた公知の方法を用いることができる。
被測定ポリヌクレオチド鎖と相補的なポリヌクレオチド
鎖に標識物を結合した標識プローブにおいて、「相補
的」とは、当該標識プローブが少なくとも被測定ポリヌ
クレオチド鎖に結合可能な程度に相互に水素結合をする
組合せの塩基が存在することをいい、かかる条件が満た
される限りにおいて必ずしもすべての塩基同士が相互に
水素結合をする組合せである必要はない。また、当該標
識プローブとして用いられるポリヌクレオチドの長さ
は、被測定ポリヌクレオチドとして何を用いるか、すな
わちどの程度の長さのポリヌクレオチドを標識プローブ
として用いれば目的のポリヌクレオチドを検出可能であ
るかによって決定され、その限りにおいて特に限定され
るものではない。そして当該標識プローブとして用いら
れるポリヌクレオチドは、ホスファイトトリエステル法
(Nature, 310, 105(1984))、ホスホアミダイド法(Mc B
ride,L.J.and Caruthers,M.H Tetrahedron Letters,vo
l.24,pp.245-248(1983))等の通常公知の方法によって化
学合成することが可能であり、また生物の特定遺伝子部
分をＰＣＲ法 (Saiki, R.K., et al., Science, vol.3
7, p170(1985)) 等の通常公知の方法により増幅して得
ることもできる。[0009] Further, regardless of whether the polynucleotide is DNA or RNA, as a method for preparing the polynucleotide, a known method can be used depending on the kind of the specific object to be measured.
In the labeled probe in which the labeled substance is bound to the polynucleotide strand complementary to the polynucleotide strand to be measured, the term “complementary” means that the labeled probes are mutually hydrogen-bonded to the extent that they can bind to at least the polynucleotide strand to be measured. The combination of the bases described above exists, and as long as such a condition is satisfied, it is not necessary that all the bases have a hydrogen bond with each other. Further, the length of the polynucleotide used as the labeled probe is what is used as the polynucleotide to be measured, that is, how long the polynucleotide can be used as the labeled probe to detect the target polynucleotide. It is determined by, and is not particularly limited in that respect. The polynucleotide used as the labeled probe is phosphite triester method.
(Nature, 310 , 105 (1984)), Phosphoamidide method (Mc B
ride, LJand Caruthers, MH Tetrahedron Letters, vo
l.24, pp.245-248 (1983)) and the like, and can be chemically synthesized by a generally known method, and a specific gene portion of an organism can be PCR-processed (Saiki, RK, et al., Science, vol. .3
It can also be obtained by amplification by a commonly known method such as 7, p170 (1985)).

【００１０】ここで用いられる標識物は、標識フローブ
の存在を後述する手段を用いて一分子毎に特定・検知す
ることができる限りにおいて特に限定されるものではな
い。そして、特に検出感度及び安全性の点から好ましく
は、蛍光分析用の蛍光色素を挙げることができる。用い
られる蛍光色素の種類は特に限定されず、例えばＢ−フ
ィコエリスリンやＲ−フィコエリスリン等のフィコビリ
プロテイン；ローダミン、フルオレッセイン、４−ニト
ロベンゾ−２−オキサ−１、３−ジアゾール、フタロシ
アニン等とこれらの誘導体；ならびにこれら蛍光体を含
むポリマーを用いることができる。ただし、フィコビリ
プロテインは熱安定性や変性剤に対する安定性に問題が
あるため、あらかじめ標的ポリヌクレオチドに会合した
プローブにビオチン−アビジンあるいは、ハプテン−抗
−ハプテン抗体等を用いて標識する必要がある。また、
蛍光体を含むポリマーは、特定の色素を公知方法により
ポリマーに感作して得ることもできるが、市販品を直接
用いることもできる。The label used here is not particularly limited as long as the presence of the labeled probe can be identified and detected for each molecule by the means described later. Further, particularly from the viewpoint of detection sensitivity and safety, a fluorescent dye for fluorescence analysis can be mentioned. The type of fluorescent dye used is not particularly limited, and examples thereof include phycobiliproteins such as B-phycoerythrin and R-phycoerythrin; rhodamine, fluorescein, 4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole, Phthalocyanine and the like and derivatives thereof; and polymers containing these phosphors can be used. However, since phycobiliprotein has problems in thermal stability and stability against denaturing agents, it is necessary to label the probe previously associated with the target polynucleotide with biotin-avidin or a hapten-anti-hapten antibody. .. Also,
The polymer containing the phosphor can be obtained by sensitizing a specific dye to the polymer by a known method, or a commercially available product can be directly used.

【００１１】上記の場合、各々異なる蛍光体を標識物と
して選択すること、各々異なる蛍光体の蛍光波長が十分
に異なること、及び散乱光の影響を少なくするためにあ
る程度波長の長い蛍光を発する蛍光体であることが、被
測定ポリヌクレオチドの検出を容易にし得るという点で
好ましい。すなわち、用いられる発光体の組合せはフル
オレッセイン系とローダミン系あるいはフィコビリタン
パク質とローダミン系の組合せであることが好ましく、
より具体的にはフルオレッセインとスルホローダミン10
1 等の組合せを好適なものとして挙げることができる。
なお、このフルオレッセインとスルホローダミン101 の
組合せは、後述するように前者の蛍光が後者を励起する
ことができるという点において特徴を有する。In the above case, different fluorescent substances are selected as the labeling substance, the fluorescent wavelengths of the different fluorescent substances are sufficiently different, and the fluorescent light having a certain long wavelength is emitted to reduce the influence of scattered light. The body is preferable in that the polynucleotide to be measured can be easily detected. That is, it is preferable that the combination of the luminescent materials used is a combination of a fluorescein system and a rhodamine system or a combination of a phycobiliprotein and a rhodamine system,
More specifically, fluorescein and sulforhodamine 10
A combination of 1 and the like can be mentioned as a preferable one.
The combination of fluorescein and sulforhodamine 101 is characterized in that the former fluorescence can excite the latter, as described later.

【００１２】これらの蛍光色素の標識プローブとするポ
リヌクレオチドへの結合方法は特に限定されるものでは
ない。例えば、アミノ基導入試薬を用いて核酸塩基に直
接蛍光体標識をする方法や特開昭61-44353号開示の方
法、すなわち、ポリヌクレオチドの蛍光体標識部位のリ
ン酸結合を官能基を有するホスホン酸結合に置き換え、
この官能基を蛍光体結合させることにより蛍光体標識を
実現し、ポリヌクレオチドの任意の位置に標識物を導入
する方法等を採用することができる。The method of binding these fluorescent dyes to a polynucleotide as a labeled probe is not particularly limited. For example, a method of directly labeling a nucleic acid base with a fluorophore using an amino group-introducing reagent or a method disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 61-44353, that is, a phosphon having a functional group for a phosphate bond at a fluorophore-labeled site of a polynucleotide. Replace with acid bond,
A method in which a fluorescent substance is labeled by binding this functional group to a fluorescent substance and a labeled substance is introduced into an arbitrary position of the polynucleotide can be employed.

【００１３】本発明方法においては、二種以上の標識プ
ローブを被測定物であるポリヌクレオチド鎖における異
なる部位に対して会合させることを必須とする。かかる
会合反応の様式は、特に限定されず、例えば固相に固定
化した被測定ポリヌクレオチドに標識プローブを会合さ
せることも可能であり、固定化せずに液相中で会合させ
ることも可能である。固定化被測定ポリヌクレオチドの
会合反応、液相中での会合反応双方共、通常公知の方法
に従う。In the method of the present invention, it is essential that two or more kinds of labeled probes are associated with different sites in the polynucleotide chain to be measured. The mode of such an association reaction is not particularly limited, and, for example, it is also possible to associate the labeled probe with the polynucleotide to be measured immobilized on the solid phase, or to associate in the liquid phase without immobilization. is there. Both the association reaction of the immobilized polynucleotide to be measured and the association reaction in the liquid phase follow generally known methods.

【００１４】前者の固定化被測定ポリヌクレオチドとの
会合反応において、ポリヌクレオチド鎖の反応担体への
結合方法は、公知の方法、例えば当該担体の表面に官能
基を結合させて、次いでこの官能基を活性化させ、当該
活性化官能基に結合する官能基を予め導入したポリヌク
レオチド鎖を接触させる方法により実行される。例え
ば、反応担体上の官能基とポリヌクレオチド鎖は、アミ
ド結合を介して担体表面のカルボキシル基と結合させる
ことができる。In the former association reaction with the immobilized polynucleotide to be measured, the method of binding the polynucleotide chain to the reaction carrier is known in the art, for example, a functional group is bonded to the surface of the carrier and then this functional group is bound. Is activated and a polynucleotide chain into which a functional group that binds to the activated functional group has been introduced is brought into contact. For example, the functional group on the reaction carrier and the polynucleotide chain can be bound to the carboxyl group on the surface of the carrier via an amide bond.

【００１５】かかる場合、被測定ポリヌクレオチドを直
接反応担体上に固定することも可能であるが、捕捉用プ
ローブを予め調製してこれを固定して用いるのが被測定
ポリヌクレオチドを選択的に補捉できる点において好ま
しい。また、会合反応は、カラム法かバッチ法によるか
の別を問うものではない。なお、上記反応担体及びこれ
を用いた反応装置として好適な態様を後記参考例にて記
載する。In such a case, it is possible to immobilize the polynucleotide to be measured directly on the reaction carrier, but it is preferable to prepare a capture probe in advance and immobilize it and use it to selectively complement the polynucleotide to be measured. It is preferable in that it can be captured. The association reaction does not matter whether it is a column method or a batch method. In addition, preferred embodiments of the above-mentioned reaction carrier and a reaction apparatus using the same will be described in the following reference examples.

【００１６】前者の液相中での固相を用いないハイブリ
ダイゼーョンの条件は通常の条件に従う。 Ｂ. 次に、会合済の標識プローブと被測定物の複合体又
は標識プローブ連結体の量を当該標識プローブの存在と
して一分子毎に特定・検知することが必要である。The former conditions for hybridization in a liquid phase without using a solid phase follow the usual conditions. B. Next, it is necessary to identify and detect, for each molecule, the amount of the complex of the labeled probe and the complex to be measured or the conjugate of the labeled probe as the presence of the labeled probe.

【００１７】かかる特定・検知する方法としては、液相
中で固定されていない上記被測定ポリヌクレオチドと標
識プローブの複合体を直接特定・検知することも可能で
あり、複数の標識プローブを連結させた標識プローブ連
結体の量として特定・検知することも可能である。どち
らの方法を採るのが好ましいかは、被測定ポリヌクレオ
チドと標識プローブの双方の性質に応じて異なるが、一
般的には、二本鎖ポリヌクレオチドが試料の場合には、
試料ポリヌクレオチド分子同士がポリマー状に会合して
しまい、そのポリマー状会合体に標識プローブが複数個
結合してしまうため、定量性に悪影響を及ぼすことがあ
る。このため、この場合には連結体の量として特定・検
知するのが好ましい。無論、試料ポリペプチドが一本鎖
の場合はこの限りではない。As such a method for specifying / detecting, it is also possible to directly specify / detect a complex of the above-mentioned polynucleotide to be measured and a labeled probe which is not fixed in a liquid phase, and to connect a plurality of labeled probes. It is also possible to identify and detect the amount of the labeled probe conjugate. Which method is preferable is different depending on the properties of both the polynucleotide to be measured and the labeled probe, but in general, when the double-stranded polynucleotide is a sample,
Since the sample polynucleotide molecules are associated with each other in a polymer form and a plurality of labeled probes are bound to the polymer-associated aggregate, the quantitative property may be adversely affected. Therefore, in this case, it is preferable to identify and detect the amount of the connected body. Of course, this is not the case when the sample polypeptide is a single chain.

【００１８】後者の複数の標識プローブを連結させた標
識プローブ連結体の量として検知する場合には、被測定
ポリヌクレオチド上で標識プローブを連結させる必要が
ある。かかる連結手段としては、複数の標識プローブと
して被測定ポリヌクレオチド上で隣接するポリヌクレオ
チド同士を選択した場合には、直接ＤＮＡリガーゼの作
用により連結することが可能である。すなわち、被測定
ポリヌクレオチドの上流と結合し得る一方のプローブの
3'末端が水酸基で、下流に結合し得る他方のプローブの
5'末端がリン酸基であれば、ＤＮＡリガーゼを用いて両
プローブをホスホジエステル結合で連結することができ
る。ＤＮＡリガーゼとして E.coli ＤＮＡリガーゼを用
いれば、一方のプローブの3'水酸基と他方のプローブの
5'リン酸基が隣接しているときのみホスホジエステル結
合による連結反応が起こる確率が高く、一本鎖同士や距
離的に離れた位置のポリヌクレオチド間で連結反応が起
こる確率が極めて低く好適である。また、標識プローブ
同士が被測定ポリヌクレオチド上で隣接しない場合に
は、被測定ポリヌクレオチドの上流に結合し得る一方の
プローブをプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼで下流
方向にポリヌクレオチド鎖を伸長させ、下流に結合させ
た他方のプライマーとのギャップを上記リガーゼ反応で
埋めることで連結することができる。なお標識プローブ
同士の被測定ポリヌクレオチド上における距離は可能な
限り短いのが好ましく、ＤＮＡリガーゼの活性の限界を
考慮すれば2000塩基長以内、さらに好ましくは600 〜70
0 塩基長以内であることが望ましい。When the latter is detected as the amount of the labeled probe linked body in which a plurality of labeled probes are linked, it is necessary to link the labeled probes on the polynucleotide to be measured. As such a ligation means, when adjacent polynucleotides on the polynucleotide to be measured are selected as the plurality of labeled probes, they can be ligated directly by the action of DNA ligase. That is, one of the probes that can bind to the upstream of the polynucleotide to be measured
The 3'end is a hydroxyl group, and the other probe
If the 5'end is a phosphate group, both probes can be linked with a phosphodiester bond using DNA ligase. If E. coli DNA ligase is used as the DNA ligase, the 3'hydroxyl group of one probe and that of the other probe
There is a high probability that the ligation reaction due to the phosphodiester bond will occur only when the 5'phosphate groups are adjacent to each other, and the ligation reaction between the single strands or between the polynucleotides located at a distance is extremely low, which is preferable. is there. When the labeled probes are not adjacent to each other on the polynucleotide to be measured, one of the probes that can bind upstream of the polynucleotide to be measured is used as a primer to extend the polynucleotide chain in the downstream direction with a DNA polymerase and bind to the downstream. The gap with the other primer thus prepared can be ligated by filling the gap with the above ligase reaction. The distance between the labeled probes on the polynucleotide to be measured is preferably as short as possible. Considering the limit of the activity of DNA ligase, the length is 2000 bases or less, more preferably 600 to 70 bases.
It is preferably within 0 base length.

【００１９】そして、得られた標識プローブ連結体を被
測定ポリヌクレオチドから解離・溶出させて、標識ポリ
ヌクレオチドを一分子毎に特定・検知する手段を用い
て、標識ポリヌクレオチド一分子毎の標識の種類と強さ
を特定・検知することにより被測定ポリヌクレオチド量
を検出することができる。すなわち、非特異的吸着した
標識プローブは上記連結反応が起こらないので一種の標
識体しか有さず、上記標識プローブ連結体と明確に標識
の種類又は強さで区別することが可能である。The resulting labeled probe conjugate is dissociated and eluted from the polynucleotide to be measured, and a means for identifying and detecting the labeled polynucleotide for each molecule is used to label the labeled polynucleotide for each molecule. The amount of polynucleotide to be measured can be detected by identifying and detecting the type and strength. That is, since the nonspecifically adsorbed labeled probe does not undergo the ligation reaction, it has only one kind of labeled body, and can be clearly distinguished from the labeled probe conjugated body by the kind or strength of the label.

【００２０】また、標識ポリヌクレオチドと標識プロー
ブの会合、及び標識プローブの連結反応を溶液中で行な
う場合には、反応後に未反応標識プローブと連結された
プローブを分離することが望ましい。この場合には、解
離・溶出させた標識プローブ連結体を含有する反応液を
少なくとも上記二種以上の標識プローブの連結部分のポ
リヌクレオチド鎖の全部又は一部に相補的な部分を有す
るポリヌクレオチド鎖を固定化した担体と混合し、ポリ
ヌクレオチド鎖同士で会合反応を行なわせしめて固定化
標識プローブ複合体を調製して、固定化標識プローブ複
合体混合物から、上記標識プローブ連結体以外のヌクレ
オチド鎖を解離・除去後、標識プローブ連結体を解離・
溶出し、当該溶出液中の標識プローブ連結体の量を一分
子毎に特定・検知する方法を採ることも可能である。When the association between the labeled polynucleotide and the labeled probe and the ligation reaction of the labeled probe are carried out in a solution, it is desirable to separate the probe linked to the unreacted labeled probe after the reaction. In this case, the reaction solution containing the dissociated and eluted labeled probe conjugate is at least a polynucleotide chain having a portion complementary to all or part of the polynucleotide chain of the linking portion of the two or more labeled probes. Was mixed with an immobilized carrier to prepare an immobilized labeled probe complex by causing an association reaction between polynucleotide chains, and from the immobilized labeled probe complex mixture, a nucleotide chain other than the labeled probe conjugate was prepared. After dissociation and removal, the labeled probe conjugate is dissociated and
It is also possible to adopt a method in which the amount of labeled probe conjugate in the eluate is identified and detected for each molecule by elution.

【００２１】なお、被測定ポリヌクレオチドと標識プロ
ーブの複合体を直接特定・検知し、前記の連結反応をプ
ロセスとして行なわない系においては、標識プローブ同
士の被測定ポリヌクレオチド上における距離は、複合体
一分子として特定することが可能な限りにおいて特に限
定されない。そして、標識物として複数の蛍光色素を用
い、かつ一方の蛍光色素が発する蛍光が他方の蛍光色素
を蛍光体間の隣接効果により励起する組合せである場合
においては、当該蛍光色素同士の距離は励起光の種類・
強度と励起する蛍光色素の種類に応じて決定され、かつ
少なくとも50塩基長内であることが必要である。なお、
一方の蛍光色素が発する蛍光が他方の蛍光色素を励起す
る蛍光同士の組合せとしては、上記隣接効果を奏する蛍
光色素同士の組合せである限り特に限定されず、例えば
前記したフルオレッセインとスルホローダミン101 の組
合せを挙げることができる。図１にヘテロジニアス反応
を用いた本発明標識ヌクレオチド法の概念図を、図２に
同じくホモジニアス反応を用いた概念図を示す。In the system in which the complex of the polynucleotide to be measured and the labeled probe is directly identified and detected and the ligation reaction is not performed as a process, the distance between the labeled probes on the polynucleotide to be measured is the complex. It is not particularly limited as long as it can be specified as one molecule. Then, when a plurality of fluorescent dyes are used as the labeling substance, and the fluorescence emitted by one of the fluorescent dyes is a combination of exciting the other fluorescent dye by the adjacency effect between the fluorescent substances, the distance between the fluorescent dyes is excited. Type of light
It should be determined depending on the intensity and the type of fluorescent dye to be excited, and it should be at least 50 base lengths. In addition,
The combination of the fluorescence emitted from one of the fluorescent dyes to excite the other fluorescent dye is not particularly limited as long as it is a combination of the fluorescent dyes exhibiting the adjacent effect, for example, the above-mentioned fluorescein and sulforhodamine 101. Can be mentioned. FIG. 1 shows a conceptual diagram of the labeled nucleotide method of the present invention using a heterogeneous reaction, and FIG. 2 shows a conceptual diagram also using the homogeneous reaction.

【００２２】標識プローブの存在として一分子毎に会合
済の複合体又は標識プローブ連結体の量を特定する方法
は特に限定されないが、シースフローセル (Nguyen,D.
C.etal.,Anal.Chem,vol.59,pp.2158-2161(1987)）を用
いて行なうのが好適である。なお、かかるシースフロー
セルを用いた検出装置、すなわち、シースフローセル、
少なくとも一種以上の励起光を発射する光源と、シース
フローセルの検出部に励起光の焦点を合わせるための集
光装置、シースフローセルの検出部より発生された蛍光
を検出するための蛍光検出機構、及び当該蛍光検出機構
からの信号を標識プローブ一分子毎の存在として識別し
計数する装置からなることを特徴とする検出装置を本発
明者は用いた。当該検出装置については、後述の実施例
で具体的に説明する。There is no particular limitation on the method for specifying the amount of the complex or the linked structure of the labeled probes that has been associated with each molecule as the presence of the labeled probe, but the sheath flow cell (Nguyen, D.
C. et al., Anal. Chem, vol. 59, pp. 2158-2161 (1987)) is preferably used. A detecting device using such a sheath flow cell, that is, a sheath flow cell,
A light source that emits at least one kind of excitation light, a condenser for focusing the excitation light on the detection unit of the sheath flow cell, a fluorescence detection mechanism for detecting fluorescence generated by the detection unit of the sheath flow cell, and The present inventor used a detection device characterized by comprising a device for identifying and counting the signal from the fluorescence detection mechanism as the presence of each molecule of the labeled probe. The detection device will be specifically described in Examples below.

【００２３】[0023]

【実施例】以下、参考例及び実施例を挙げて本発明を具
体的に説明する。 ＜参考例１＞ 反応担体 図３は、本発明方法の実施過程において用いる反応担体
の一実施態様である。平板上に、反応部31、試料添加部
32、及び反応残液排出部33が設けられ、試料添加部32と
反応残液排出部33は、溝状の反応部31を介して連結され
ている。The present invention will be described in detail below with reference to reference examples and examples. Reference Example 1 Reaction Carrier FIG. 3 shows one embodiment of the reaction carrier used in the process of carrying out the method of the present invention. Reaction part 31 and sample addition part on a flat plate
32 and a reaction residual liquid discharge part 33 are provided, and the sample addition part 32 and the reaction residual liquid discharge part 33 are connected via a groove-shaped reaction part 31.

【００２４】かかる反応担体の素材は、反応部における
標識信号を検出可能な限りにおいて特に限定されるもの
ではない。例えば標識物として蛍光色素を用いる場合に
は、光学的に平坦な素材、例えば、ガラス、シリコンウ
エハー、又は光学的に平坦な構造を有するプラスチック
を用いるのが好ましい。これら反応担体の上面34は反応
部等の反応液等を保持する目的で提状にフッ素樹脂、例
えばポリテトラフルオルエチレンでコーティングされて
いる。The material of the reaction carrier is not particularly limited as long as the labeling signal in the reaction section can be detected. For example, when a fluorescent dye is used as the labeling substance, it is preferable to use an optically flat material such as glass, a silicon wafer, or a plastic having an optically flat structure. The upper surface 34 of these reaction carriers is coated with a fluororesin, for example, polytetrafluoroethylene, in the shape of a strip for the purpose of holding the reaction liquid in the reaction section and the like.

【００２５】通常各部は直線上に連結され、各部はそれ
ぞれ等しい深さであるが、反応液等の流出速度等を調節
するために、部分的に深くしたり、浅くしたりすること
も可能であり、さらに蛇行させることも可能である。と
ころで、本発明反応担体における反応部等及び溝の形状
は、試料添加後、当該試料を前記した反応・排出工程に
付することができる限りにおいて特に限定されない。例
えば、反応部等と試料添加部及び反応残液排出部をそれ
ぞれ独立して設け、それぞれ溝を介して連結する構造も
許容される。Usually, each part is connected in a straight line, and each part has the same depth, but it can be partially deepened or shallowed in order to adjust the outflow rate of the reaction solution and the like. Yes, it is possible to make it meander. By the way, the shapes of the reaction part and the like and the groove in the reaction carrier of the present invention are not particularly limited as long as the sample can be subjected to the reaction / discharge step described above after the sample is added. For example, a structure in which a reaction part and the like, a sample addition part, and a reaction residual liquid discharge part are independently provided and connected via grooves is also acceptable.

【００２６】反応部31には、使用に際して若しくは予
め、前記したように、反応部31の表面に官能基を結合さ
せて、次いで、この官能基を活性化させ、当該活性化官
能基に結合する他の官能基を予め導入した被測定ポリヌ
クレオチド鎖を接触させる方法に代表される公知方法に
より被測定ポリヌクレオチド鎖が固定される。なお、か
かる固定化の実行に際して、担体中の他の部分はテープ
等でマスクをするのが好ましい。In the reaction section 31, before use or in advance, as described above, a functional group is bound to the surface of the reaction section 31, and then this functional group is activated and bound to the activated functional group. The polynucleotide chain to be measured is immobilized by a known method represented by a method of contacting the polynucleotide chain to be measured to which another functional group has been introduced in advance. When performing such immobilization, it is preferable to mask the other part of the carrier with tape or the like.

【００２７】試料添加部32には、例えば次記参考例２に
おける反応装置によって、標識プローブを含む試料が添
加され、本発明反応担体を揺り動かして当該試料を溝を
介して反応部31に移行させ、反応後生じる反応残液を前
記同様溝を介して反応残液排出部33に移行させ、当該反
応残液排出部33における反応残液を例えば巻き取り式の
ろ紙等によって排出・除去を行ない得る。A sample containing a labeled probe is added to the sample adding section 32 by, for example, the reaction apparatus in Reference Example 2 below, and the reaction carrier of the present invention is shaken to move the sample to the reaction section 31 through the groove. The reaction residual liquid generated after the reaction can be transferred to the reaction residual liquid discharging unit 33 through the groove as described above, and the reaction residual liquid in the reaction residual liquid discharging unit 33 can be discharged and removed by, for example, a roll-up type filter paper. ..

【００２８】＜参考例２＞ 反応装置 (１) 図４は、本発明方法の実施に際して用いられる担
体上に捕捉した物と反応した物との分離（Ｂ／Ｆ分離）
が必要なヘテロジニアス反応を行なうための反応装置の
一定実施態様である。試料を容器100 にいれ、これを容
器保持ステージ102 にセットする。標識プローブ等も同
様の容器にいれ容器保持ステージ102 にセットする。容
器ステージには各反応容器毎に専用の使い捨てピペット
チップ103 が装着されている。容器100 中の試料等は加
熱器104 により必要に応じて加熱され、試料等を変性さ
せ１本鎖オリゴヌクレオチドにすることができる。容器
保持ステージ102 は円盤状で、ステッピングモーター10
5 で回転させることができ、任意の容器を自動ピペット
106 の位置にセットすることができる。自動ピペット10
6 はＸ軸 (左右軸) ステージ107 とＺ軸 (縦軸) ステー
ジ108 によりＸ軸方向と縦軸 (Ｚ軸) 方向に移動するこ
とができる。まず、自動ピペット106 をＸ軸方向に移動
させ、ピペットチップ103 をセットする。次に、容器10
0 中の試料を吸い上げ、反応担体ステージ109 にセット
した一標識プローブを固定した反応担体110 の試料添加
部 (図３記載の32) に添加し、反応部に試料溶液を導入
する。使用済みのピペットチップはチップ破棄箱150 に
捨てられる。さらに、容器保持ステージ102 に装着した
他の容器から一標識プローブと他標識プローブを分注し
反応担体110 に添加する。ここでは、２種の標識プロー
ブを別々に添加しても、あるいは、２種の標識プローブ
をあらかじめ混合しておき一回のピペット操作で同時に
添加しても良い。反応担体ステージ109 はＹ軸方向 (紙
面の手前方向) に移動できる構造になっており、複数の
反応担体の添加部に順次試料溶液を添加できる。さら
に、反応担体ステージ109 は内部に加熱器を持つ構造
で、反応担体を一定温度に保つことができる。当該温度
は用いる試料と標識プローブの組合せに応じて適宜設定
することができる。反応担体ステージ109 はステッピン
グモーター111 で上下に傾けることができる構造になっ
ている。かかる傾斜角度は、企図する反応時間に応じ適
宜決定されるが通常15〜30℃程度が好ましい。この機構
を用いて、一定時間おきに反応担体を傾けた試料溶液を
反応部に出し入れすることで反応液をゆるやかに攪拌す
る。反応後、反応残液を参考例１記載の反応担体の反応
残液排出部 (図３の33記載) にろ紙112 をあてがい排出
する。ろ紙112 はロール状のものを用い、ローラー113
で交換することができる。試料等の反応中はろ紙は反応
担体からはれなているが、反応残液排出時にはローラー
114 が反応担体上の反応残液排出部に移動する。<Reference Example 2> Reactor (1) FIG. 4 shows separation of a substance trapped on a carrier used in the method of the present invention and a reacted substance (B / F separation).
Are certain embodiments of reactors for performing the required heterogeneous reaction. The sample is placed in the container 100 and set on the container holding stage 102. A labeled probe and the like are also placed in the same container and set on the container holding stage 102. A disposable pipette tip 103 dedicated to each reaction container is attached to the container stage. The sample or the like in the container 100 is heated by the heater 104 as needed, and the sample or the like can be denatured to form a single-stranded oligonucleotide. The container holding stage 102 has a disk shape, and the stepping motor 10
Can be rotated by 5 and automatically pipette any container
Can be set in 106 positions. Automatic pipette 10
6 can be moved in the X-axis direction and the vertical axis (Z-axis) direction by the X-axis (horizontal axis) stage 107 and the Z-axis (vertical axis) stage 108. First, the automatic pipette 106 is moved in the X-axis direction to set the pipette tip 103. Next, container 10
The sample in 0 is sucked up, the one-labeled probe set on the reaction carrier stage 109 is added to the sample addition section (32 in FIG. 3) of the fixed reaction carrier 110, and the sample solution is introduced into the reaction section. Used pipette tips are discarded in the tip discard bin 150. Further, the one-labeled probe and the other-labeled probe are dispensed from another container mounted on the container holding stage 102 and added to the reaction carrier 110. Here, the two types of labeled probes may be added separately, or the two types of labeled probes may be mixed in advance and added simultaneously by a single pipetting operation. The reaction carrier stage 109 has a structure that can move in the Y-axis direction (front side of the paper surface), and sample solutions can be sequentially added to a plurality of reaction carrier addition portions. Further, the reaction carrier stage 109 has a structure having a heater inside, so that the reaction carrier can be kept at a constant temperature. The temperature can be appropriately set according to the combination of the sample and the labeled probe used. The reaction carrier stage 109 has a structure that can be tilted up and down by a stepping motor 111. The inclination angle is appropriately determined according to the intended reaction time, but is usually preferably about 15 to 30 ° C. Using this mechanism, the reaction solution is gently stirred by inserting and removing the sample solution in which the reaction carrier is tilted into and out of the reaction section at regular intervals. After the reaction, the reaction residual liquid is applied to the reaction residual liquid discharge part (described in 33 of FIG. 3) of the reaction carrier described in Reference Example 1 by applying the filter paper 112. Use a roll of filter paper 112, and use a roller 113
Can be exchanged at. The filter paper is peeled from the reaction carrier during the reaction of the sample, etc.
114 moves to the reaction residual liquid discharge part on the reaction carrier.

【００２９】ろ紙をあてがったままの状態で、Ｚ軸ステ
ージ115 に装着した洗浄液ノズル116 を反応担体の添加
部に移動しポンプ117 を用いて洗浄液を添加する。洗浄
液は予め42〜65℃程度の適当な温度に加温しておく。洗
浄液は反応部を通過し、ろ紙により排出される。使用済
みのろ紙はろ紙破棄箱151 に捨てられる。図４には洗浄
液を保持する容器118 の一種類しか書かれていないが、
実際には複数の洗浄液がバルブ119 を介してつなげるこ
とも可能である。With the filter paper still applied, the cleaning liquid nozzle 116 mounted on the Z-axis stage 115 is moved to the reaction carrier addition section, and the cleaning liquid is added using the pump 117. Preheat the cleaning solution to an appropriate temperature of 42-65 ℃. The cleaning liquid passes through the reaction section and is discharged by the filter paper. The used filter paper is discarded in the filter paper discard box 151. Although FIG. 4 shows only one type of container 118 for holding the cleaning liquid,
Actually, it is possible to connect a plurality of cleaning liquids via the valve 119.

【００３０】(２) 図５は、本発明方法の実施に際して
用いられる、Ｂ／Ｆ分離が不要なホモジニアス反応を行
なうための反応装置の一実施態様である。試料を容器20
1 にいれ、これを容器保持ステージ202 にセットする。
標識プローブ等も同様の容器にいれ容器保持ステージ20
2 にセットする。容器ステージは各反応容器毎に専用の
使い捨てピペットチップ203 が装着されている。容器20
1中の試料等は前記参考例２ (１) と同様に加熱器204
により必要に応じて加熱され、試料等を変性させ１本鎖
オリゴヌクレオチドにすることができる。容器保持ステ
ージ202 は円盤状で、ステッピングモーター205 で回転
させることができ、任意の容器に自動ピペット206 の位
置にセットすることができる。自動ピペット206 は、ス
テッピングモーター207 により回転と上下動が可能で、
容器保持ステージ202 と反応ステージ209 の間を自由に
行き来できる。まず、自動ピペット206 を移動させ、ピ
ペットチップ203 をセットする。次に、容器201 中の試
料を吸い上げ、反応ステージ209 にセットした反応容器
208 に添加する。使用済みのピペットチップはチップ破
棄箱250 に捨てられる。さらに、容器保持ステージ202
に装着した他の容器から第１の標識プローブと第２の標
識プローブを分注し反応容器208 に添加する。ここで
は、２種の標識プローブを別々に添加しても、あるい
は、２種の標識プローブをあらかじめ混合しておき一回
のピペット操作で同時に添加しても良い。反応ステージ
209 はステッピングモーター210 で回転できる構造にな
っており、複数の反応容器に順次試料溶液と標識プロー
ブを添加できる。さらに、前記参考例２ (１) と同様に
反応ステージ209 は内部に加熱器204 を持つ構造で、反
応担体を一定温度に保つことができる。(2) FIG. 5 shows one embodiment of a reaction apparatus used for carrying out the method of the present invention for carrying out a homogeneous reaction which does not require B / F separation. Sample container 20
Put it in 1 and set it on the container holding stage 202.
Place the labeled probe in the same container and hold the container 20
Set to 2. A dedicated disposable pipette tip 203 is attached to each reaction container on the container stage. Container 20
Samples in 1 are heated in the same manner as in Reference Example 2 (1) above.
Thus, the sample or the like can be denatured into a single-stranded oligonucleotide by heating as necessary. The container holding stage 202 has a disc shape, can be rotated by a stepping motor 205, and can be set at a position of the automatic pipette 206 in an arbitrary container. The automatic pipette 206 can be rotated and moved up and down by the stepping motor 207.
It is possible to freely move between the container holding stage 202 and the reaction stage 209. First, the automatic pipette 206 is moved to set the pipette tip 203. Next, the sample in the container 201 is sucked up and set in the reaction stage 209.
Add to 208. The used pipette tips are discarded in the tip discard box 250. In addition, the container holding stage 202
The first labeled probe and the second labeled probe are dispensed from another container attached to the reaction vessel 208 and added to the reaction vessel 208. Here, the two types of labeled probes may be added separately, or the two types of labeled probes may be mixed in advance and added simultaneously by a single pipetting operation. Reaction stage
209 has a structure that can be rotated by a stepping motor 210, and a sample solution and a labeled probe can be sequentially added to a plurality of reaction vessels. Further, as in Reference Example 2 (1), the reaction stage 209 has a heater 204 inside so that the reaction carrier can be kept at a constant temperature.

【００３１】上記反応終了後、以下の方法で反応液を第
３のプローブを固定した連結標識プローブ捕捉用カラム
215 に導入する。まず、吸引ノズル211 を昇降装置212
を用いて反応容器208 に入れる。ポンプ220 を作動さ
せ、反応液を連結標識プローブ捕捉用カラム215 に導入
する。連結標識プローブ捕捉用カラム215 は加温装置21
6 で一定温度に保たれている。なお当該温度は42〜65℃
程度が好ましい。バルブ213 を切り替え、洗浄液214 で
未連結標識プローブを洗い流す。次に、カラム温度を95
℃に上昇させ、捕捉した連結標識プローブを溶出して、
シースフローセルに導き蛍光を経時的に測定する。シー
スフローセルを用いた蛍光測定は後記実施例１に示す装
置で行うのが好ましい。After the above reaction is completed, the reaction solution is subjected to the following method and the third probe is immobilized on the ligation-labeled probe capturing column.
Installed in 215. First, attach the suction nozzle 211 to the lifting device 212.
To the reaction vessel 208 using. The pump 220 is operated to introduce the reaction solution into the column 215 for capturing the linked labeled probe. Column 215 for capturing the linked labeled probe is a heating device 21
The temperature is kept constant at 6. The temperature is 42 ~ 65 ℃
A degree is preferable. Switch the valve 213, and wash away the unbound labeled probe with the washing solution 214. Then change the column temperature to 95
C. to elute the captured ligated labeled probe,
It is introduced into a sheath flow cell and fluorescence is measured with time. The fluorescence measurement using the sheath flow cell is preferably performed by the device described in Example 1 below.

【００３２】[0032]

【実施例１】 本発明検出装置 図６は本発明検出装置の一実施態様を示したものであ
る。シースフローセル300 には、液送ポンプ354 でシー
ス液355 が常に流れている。かかるシース液の線速は特
に限定されないが通常10m/sec 程度に調整するのが好ま
しい。試料溶液はカットバルブ350 を介して注入口351
から添加される。試料溶液はパルスモーター353 で駆動
されるシリンジポンプ352 でシースフローセル300 に送
りこまれる。ここで、蛍光プローブは分子ごとに配列さ
れる。各蛍光プローブ分子はレーザー光で照射される。
レーザー発振器301 及び他レーザー発振器302 から出た
レーザー光は、レーザー発振器301 のレーザー光を反射
しレーザー発振器302 から出たレーザー光を透過するダ
イクロイックミラー303 で合成された後、レンズ304 及
び305 からなるビームエキスパンダーでビーム径を拡張
させ、集光レンズ306 で集光されて、シースフローセル
の検出部307 を通過する。通過したレーザー光はビーム
ストッパー314 に吸収される。Embodiment 1 Detection Device of the Present Invention FIG. 6 shows an embodiment of the detection device of the present invention. The sheath liquid 355 is constantly flowing through the sheath flow cell 300 by the liquid feed pump 354. Although the linear velocity of the sheath liquid is not particularly limited, it is usually preferable to adjust it to about 10 m / sec. Sample solution is injected through cut valve 350 into inlet 351
Added from. The sample solution is sent to the sheath flow cell 300 by the syringe pump 352 driven by the pulse motor 353. Here, the fluorescent probes are arranged for each molecule. Each fluorescent probe molecule is illuminated with laser light.
The laser light emitted from the laser oscillator 301 and the other laser oscillator 302 is composed of the lenses 304 and 305 after being combined by the dichroic mirror 303 that reflects the laser light of the laser oscillator 301 and transmits the laser light emitted from the laser oscillator 302. The beam diameter is expanded by the beam expander, condensed by the condenser lens 306, and passed through the detection unit 307 of the sheath flow cell. The passed laser light is absorbed by the beam stopper 314.

【００３３】蛍光標識プローブからレーザービームに接
触するときに発する発光は、集光レンズ308 あるいは30
9 で集められ、一標識プローブから生じる蛍光が選択的
に通過するバンドパスフィルター310 あるいは、他標識
プローブから生じる蛍光が選択的に通過するバンドパス
フィルター311 を介して光電子増倍管312 あるいは313
で検出される。光電子増倍管がとらえた信号はマイクロ
プロセッサー357 で時系列に処理される。一蛍光色素由
来の蛍光発光時刻と他蛍光色素由来の蛍光発光時刻の一
致する場合は標的ＤＮＡに標識プローブがハイブリダイ
ゼーションしていると判断し、標的ＤＮＡの分子として
計数とする。いずれか一方の蛍光団由来の蛍光しか検出
されない部位には標識プローブが非特異的に吸着してい
るとみなし計数の交換から除外する。Light emitted from the fluorescent-labeled probe upon contact with the laser beam is collected by the condenser lens 308 or 30.
The band-pass filter 310 which collects the fluorescence generated from one labeled probe and selectively passes the fluorescence generated from the other labeled probe or the photomultiplier tube 312 or 313 which passes through the band-pass filter 311 which selectively passes the fluorescence generated from another labeled probe.
Detected in. The signals captured by the photomultiplier tube are processed in time series by the microprocessor 357. When the fluorescent emission time derived from one fluorescent dye and the fluorescent emission time derived from another fluorescent dye are coincident with each other, it is judged that the labeled probe is hybridized with the target DNA and counted as a molecule of the target DNA. The labeled probe is considered to be non-specifically adsorbed at the site where only fluorescence from one of the fluorophores is detected, and is excluded from the exchange of counting.

【００３４】[0034]

【実施例２】 ポリヌクレオチドの検出 (１) (１) 本実施例においては、検出の対象となる標的ポリ
ヌクレオチド試料として、バクテリオファージλのＤＮ
Ａを用いた。そして、当該バクテリオファージλのＤＮ
Ａに対して、３種類のプローブを用いて、かかる標的ポ
リヌクレオチド試料を検出した。Example 2 Detection of Polynucleotides (1) (1) In this example, a bacteriophage λ DN was used as a target polynucleotide sample to be detected.
A was used. And the DN of the bacteriophage λ
For A, three target probes were used to detect such target polynucleotide samples.

【００３５】第１のプローブとなるポリヌクレオチド
は、配列番号１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチ
ド鎖であって、標的となるバクテリオファージλのＤＮ
Ａの塩基配列の6601番から6875番の各塩基に対して、相
補的に結合するポリヌクレオチド鎖である。第２のプロ
ーブとなるポリヌクレオチドは、配列番号２に示す塩基
配列を有するポリヌクレオチド鎖であって第１のプロー
ブとは異なる部位に相補的に結合するポリヌクレオチド
鎖である。第３のプローブとなるポリヌクレオチドは、
配列番号３に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド鎖
であって、標的ポリヌクレオチド上で第２のプローブの
3'末端側に隣接し、かつ第１のプローブの結合位置とは
異なる。The polynucleotide serving as the first probe is a polynucleotide chain having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and is the DN of the target bacteriophage λ.
It is a polynucleotide chain that complementarily binds to each of bases 6601 to 6875 of the base sequence A. The polynucleotide serving as the second probe is a polynucleotide chain having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and is a polynucleotide chain that complementarily binds to a site different from that of the first probe. The polynucleotide that serves as the third probe is
A polynucleotide chain having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, wherein the second probe on the target polynucleotide is
It is adjacent to the 3'-terminal side and is different from the binding position of the first probe.

【００３６】なお、第１のプローブは標的ポリヌクレオ
チドの捕捉用で、参考例１に示した反応担体に固定して
使用した。第２・第３のプローブは標識用で、第２のプ
ローブの5'末端にポリＴスペーサーを介してスルホロー
ダミン101 様蛍光団が結合しており、第３のプローブの
3'末端にポリＴスペーサーを介してフルオレッセイン様
蛍光団が結合している。The first probe was for capturing the target polynucleotide, and was used by being immobilized on the reaction carrier shown in Reference Example 1. The second and third probes are for labeling, and the sulforhodamine 101-like fluorophore is bound to the 5'end of the second probe via a poly T spacer,
A fluorescein-like fluorophore is bound to the 3'end via a poly-T spacer.

【００３７】(２) そして、上記の標的ポリヌクレオ
チド試料である、バクテリオファージλのＤＮＡとして
は、λＤＮＡ(Bacteriophageλ cI857 Sam 7由来)(宝酒
造社製) を用いた。 第１のプローブとなるポリヌクレオチド鎖は、ホスホ
アミダイド法に従い合成した。 前記のごとく第２のプローブとなるポリヌクレオチド
鎖の5'末端には、ポリＴスペーサーを介してスルホロー
ダミン101 様の蛍光団が結合している。本実施例におい
ては、かかるスルホローダミン101 様と思われる蛍光団
が結合した直径0.02μm の表面にカルボキシル基を有す
る粒子ポリマーを用いた。かかる粒子ポリマーとして
は、Molecular Probes,INC.製のCarboxylate-modified
Latex red(580/605)を用いた。当該スルホローダミン10
1 様の蛍光粒子によるポリヌクレオチドプローブの標識
は、ホスホアミダイド法によるポリヌクレオチドの合成
最終段階に、Ｎ−モノメトキシトリチルアミノヘキサ−
６−オキシ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピ
ルアミノホスアミダイドを反応させて5'末端にアミノ基
を導入したプローブに、水溶性カルボジイミドで当該粒
子のカルボキシル基を活性化して結合させた。そして、
結合後、弱アルカリ条件下で未反応のカルボキシル基を
再生した。(2) As the target polynucleotide sample, bacteriophage λ DNA, λDNA (Bacteriophage λ cI857 Sam 7 derived) (Takara Shuzo) was used. The polynucleotide chain serving as the first probe was synthesized according to the phosphoamidide method. As described above, a fluorophore such as sulforhodamine 101 is bound to the 5'end of the polynucleotide chain serving as the second probe via the poly T spacer. In this example, a particle polymer having a carboxyl group on the surface having a diameter of 0.02 μm, to which a fluorophore which seems to be sulforhodamine 101 was bound, was used. As such a particle polymer, Carboxylate-modified manufactured by Molecular Probes, INC.
Latex red (580/605) was used. The sulforhodamine 10
Labeling of a polynucleotide probe with 1-like fluorescent particles is carried out by N-monomethoxytritylaminohexa-
6-oxy-β-cyanoethyl-N, N-diisopropylaminophosamidide was reacted and a probe having an amino group introduced at the 5'-terminal was activated and bound with a carboxyl group of the particle with a water-soluble carbodiimide. And
After binding, unreacted carboxyl groups were regenerated under weak alkaline conditions.

【００３８】前記のごとく、第３の標識用プローブと
して用いられるポリヌクレオチドの3'末端にはポリＴス
ペーサーを介してフルオレッセイン様蛍光団が結合して
いる。本実施例においては、かかるフルオレッセイン様
と思われる蛍光団を含む直径0.02μm の表面にカルボキ
シル基を有する粒子ポリマーを用いた。具体的には、当
該粒子ポリマーとして、Molecular Probes, INC.製のCa
rboxylate modified Lafex Yellow-green(490/515)を用
いた。当該フルオレッセイン様蛍光粒子による第３のプ
ローブの標識は、ポリヌクレオチドの合成後に、アナリ
ティカルバイオケミストリー記載のラリー イー. モリ
ソン等の方法 (Larry E. Morrison et al., Analytical
Biochemistry, 183, pp.231-244(1989))に従い、ター
ミナルデオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼを
用いて８− (６−アミノヘキシル) アミノアデノシンと
結合して、ポリヌクレオチドの3'末端にアミノ基を導入
した当該プローブに、水溶性カルボジイミドで当該粒子
のカルボキシル基を活性化して、当該蛍光団を結合させ
た。そして、結合後、弱アルカリ条件下で未反応のカル
ボキシル基を再生した。As described above, the fluorescein-like fluorophore is bound to the 3'end of the polynucleotide used as the third labeling probe via the poly-T spacer. In the present example, a particle polymer having a carboxyl group on the surface having a diameter of 0.02 μm and containing such a fluorophore-like fluorophore was used. Specifically, as the particle polymer, Ca produced by Molecular Probes, INC.
rboxylate modified Lafex Yellow-green (490/515) was used. The labeling of the third probe with the fluorescein-like fluorescent particles is carried out by the method of Larry E. Morrison et al., Analytical described in Analytical Biochemistry, after the synthesis of the polynucleotide.
Biochemistry, 183, pp.231-244 (1989)), and coupled with 8- (6-aminohexyl) aminoadenosine using terminal deoxynucleotidyl transferase to introduce an amino group at the 3'end of the polynucleotide. The fluorophore was bound to the probe by activating the carboxyl group of the particle with water-soluble carbodiimide. After the binding, unreacted carboxyl groups were regenerated under weak alkaline conditions.

【００３９】調製したこれら第２・第３の標識プローブ
は、0.5 ％ＳＤＳ、 100μg/mlのキャリヤーＤＮＡ (変
性サケスペルマＤＮＡ)、5mg/ml 牛血清アルブミン、50
％ホルムアミド、0.5M NaClを含む50mM Tris・HCl（pH
７）のハイブリダイゼーションバッファーに懸濁して保
存した。 (３) 標的ポリヌクレオチドの捕捉用のプローブである
配列番号１に示す塩基配列を有する第１のプローブの反
応担体への固定は以下の様に行なった。The prepared second and third labeled probes were: 0.5% SDS, 100 μg / ml carrier DNA (denatured salmon sperm DNA), 5 mg / ml bovine serum albumin, 50
% Formamide, 0.5 mM NaCl in 50 mM Tris ・ HCl (pH
It was suspended and stored in the hybridization buffer of 7). (3) Immobilization of the first probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, which is a probe for capturing the target polynucleotide, on the reaction carrier was performed as follows.

【００４０】まず、ガラス製の参考例１に示す反応担体
の表面を十分に洗浄し、３− (２−アミノエチルアミノ
プロピル) トリメトキシフラン32mmol/lを反応部 (図３
・31) に作用させて、当該反応部にアミノ基を導入し
た。このアミノシラン化した反応担体を、アナリティカ
ル バイオケミストリー (1991年) 198巻、 138頁から
142頁記載のショーレン リチャード ラスムッセン等
(Soren Richard Rasmuseen et al, Analitical Bioch
emistry 198, 138-142 (1991)の方法に従い、１−メチ
ルイミダゾールと１エチル−３ (３−ジメチルアミノプ
ロピル) −カルボジイミドを用いて第１のプローブを固
定した。この担体は、0.1 ％ＳＤＳ、100μg/mlキャリ
ヤーＤＮＡ (変性サケスペルマＤＮＡ) 、5mMEDTA 及び
0.15M NaClを含むpH７の50mM Tris・HCl緩衝液に懸濁し
て保存した。First, the surface of the reaction carrier shown in Reference Example 1 made of glass was thoroughly washed, and 32 mmol / l of 3- (2-aminoethylaminopropyl) trimethoxyfuran was added to the reaction part (FIG. 3).
・ 31) was introduced to introduce an amino group into the reaction part. This aminosilanized reaction carrier was prepared from Analytical Biochemistry (1991), vol. 198, p. 138.
Schoren Richard Rasmussen et al., P. 142
(Soren Richard Rasmuseen et al, Analitical Bioch
The first probe was immobilized with 1-methylimidazole and 1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide according to the method of emistry 198, 138-142 (1991). This carrier was 0.1% SDS, 100 μg / ml carrier DNA (denatured salmon sperm DNA), 5 mM EDTA and
It was suspended and stored in 50 mM Tris.HCl buffer of pH 7 containing 0.15 M NaCl.

【００４１】(４) ハイブリダイゼーション反応は、参
考例２ (１) に示す装置を用いて、以下の手順に従い行
なった。試料となるバクテリオファージλの濃度はモル
分子吸光係数＝5.18×108 M-1・cm-1として求めた。キ
ャリアーＤＮＡとして 100μg/mlの変性サケスペルマＤ
ＮＡを含む各種濃度のバクテリオファージλ溶液を容器
100 にいれ、これを容器保持ステージ102 にセットす
る。標識プローブ等も同様の容器にいれ容器保持ステー
ジ102 にセットした。容器100 中の試料等は加熱器104
により95℃に加熱され、バクテリオファージλＤＮＡを
変性して一本鎖状態とした。次に容器100 中の試料を50
μl 吸い上げ、反応担体ステージ109 にセットした前記
(３) において第１のプローブを固定した反応担体110
の試料添加部 (図３・32) に添加し、反応部に試料溶液
を導入した。使用済みのピペットチップはチップ破棄箱
150 に捨てられる。さらに、容器保持ステージ102 に装
着した他の容器から第１の標識プローブと第２の標識プ
ローブを分注し反応担体110 に添加した。ここでは、２
種の標識プローブはあらかじめ混合され一回のピペット
操作で同時に添加した。なお、反応担体ステージ109 は
内部に加熱器を持つ構造で、ここでは55℃に設定した。
反応担体ステージ109 をステッピングモーター111 で約
30°傾斜させて、反応部 (図３・31) に試料溶液を導入
した。そして30秒毎に反応担体110 を傾け試料溶液を反
応部に出し入れすることで、当該試料溶液をゆるやかに
攪拌した。４時間後、反応残液を反応担体の反応残液排
出部 (図３・33) にろ紙112 をあてがい排出した。ろ紙
をあてがったままの状態で、Ｚ軸ステージ115 に装着し
た洗浄液ノズル116 を反応担体の添加部に移動しポンプ
117 を用いて洗浄液を添加した。すなわち、0.１％ドデ
シル硫酸ナトリウム、5mg/ml牛血清アルブミン、0.5MNa
Cl、0.3Mクエン酸緩衝液（pH7.0）中で25℃で洗浄した
後、さらに、0.１％ドデシル硫酸ナトリウム、2mM ＥＤ
ＴＡ、３M テトラメチルアンモニウム、トリス塩酸 (pH
8.０) 溶液で58℃で洗浄した。図４には洗浄液を保持す
る容器は118 の一種類しか書かれていないが、実際には
複数の洗浄液がバルブ119 を介してつながれている。そ
して、洗浄後、上記洗浄液はろ紙により排出され、使用
済みのろ紙はろ紙破棄箱151 に廃棄した。(4) The hybridization reaction was carried out by the following procedure using the apparatus shown in Reference Example 2 (1). The concentration of the bacteriophage λ used as a sample was determined as the molar molecular extinction coefficient = 5.18 × 10 8 M -1 · cm -1 . 100 μg / ml denatured salmon sperma D as carrier DNA
Container for various concentrations of bacteriophage λ solution containing NA
Put it in 100 and set it on the container holding stage 102. A labeled probe and the like were put in the same container and set on the container holding stage 102. Samples in container 100 are heated by heater 104
Was heated to 95 ° C. to denature the bacteriophage λ DNA into a single-stranded state. Then 50 samples in container 100
μl was sucked up and set on the reaction carrier stage 109
The reaction carrier 110 having the first probe immobilized thereon in (3)
Was added to the sample addition part (Fig. 3 ・ 32) and the sample solution was introduced into the reaction part. Used pipette tips are in tip discard box
Abandoned to 150. Further, the first labeled probe and the second labeled probe were dispensed from another container mounted on the container holding stage 102 and added to the reaction carrier 110. Here, 2
The labeled probes of the species were premixed and added simultaneously with a single pipetting operation. The reaction carrier stage 109 had a heater inside, and was set at 55 ° C. here.
Approximately move the reaction carrier stage 109 with the stepping motor 111.
The sample solution was introduced into the reaction part (Fig. 3.31) with an inclination of 30 °. Then, by tilting the reaction carrier 110 every 30 seconds and putting the sample solution into and out of the reaction section, the sample solution was gently stirred. After 4 hours, the reaction residual liquid was applied to the reaction residual liquid discharge part (Fig. 3.33) of the reaction carrier by applying the filter paper 112. With the filter paper still applied, move the cleaning liquid nozzle 116 mounted on the Z-axis stage 115 to the reaction carrier addition section and pump.
Wash solution was added using 117. That is, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 5 mg / ml bovine serum albumin, 0.5 MNa
After washing in Cl, 0.3M citrate buffer (pH 7.0) at 25 ° C, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 2mM ED was further added.
TA, 3M tetramethylammonium, Tris hydrochloric acid (pH
8.0) Washed with solution at 58 ° C. Although only one type of container holding the cleaning liquid is shown in FIG. 4, a plurality of cleaning liquids are actually connected via the valve 119. Then, after cleaning, the cleaning liquid was discharged by a filter paper, and the used filter paper was discarded in the filter paper discard box 151.

【００４２】次に、 E.coli ＤＮＡリガーゼを反応さ
せ、標的ポリヌクレオチドであるλファージＤＮＡの上
の隣接する部位に結合した２種の標識ポリヌクレオチド
プローブを連結した。すなわち、10ユニットの E.coli
ＤＮＡリガーゼを含む５mg/ml牛血清アルブミン、 26mM
ＮＡＤ、10mM硫酸アンモニウム、１mMジチオスレイト
ール、1.2mM ＥＤＴＡ、４mM塩化マグネシウムを含む30
mMトリス塩酸緩衝液 (pH８) 10μl を反応担体に加え、
25℃で１時間反応させた後、10mMＥＤＴＡを含む30mMト
リス塩酸緩衝液 (pH８) で洗浄した。さらに当該洗浄液
50μl を加え、反応担体を90℃に加熱しながら５分間攪
拌した。反応容器を傾け連結した標識プローブを含む溶
液を排出部に集めた。なお、リガーゼの添加、反応等の
操作は、上記標識プローブ等の反応方法と同様な装置で
行った。Next, E. coli DNA ligase was reacted to ligate two kinds of labeled polynucleotide probes bound to adjacent sites on the target polynucleotide, λ phage DNA. Ie 10 units of E. coli
5 mg / ml bovine serum albumin containing DNA ligase, 26 mM
Contains NAD, 10 mM ammonium sulfate, 1 mM dithiothreitol, 1.2 mM EDTA, 4 mM magnesium chloride 30
Add 10 μl of mM Tris-HCl buffer (pH 8) to the reaction carrier,
After reacting for 1 hour at 25 ° C., it was washed with 30 mM Tris-HCl buffer (pH 8) containing 10 mM EDTA. Furthermore the cleaning liquid
50 μl was added and the reaction carrier was stirred for 5 minutes while heating to 90 ° C. The solution containing the labeled probe in which the reaction container was tilted and connected was collected in the discharge part. The operations such as the addition of ligase and the reaction were carried out in the same device as in the reaction method of the labeled probe.

【００４３】さらに、溶出させた連結標識プローブを含
む溶液を図６記載の２色のレーザー光を用いるフローセ
ルタイプの蛍光計数装置で分析した。シースフローセル
300には、液送ポンプ354 でシース液 (蒸留水) 355 が
常時一定流速で流れている。かかる流速は、シースフロ
ーセルの検出部における流速が線速10m/秒となるように
設定した。Further, the eluted solution containing the ligation-labeled probe was analyzed by a flow cell type fluorescence counter using a two-color laser beam shown in FIG. Sheath flow cell
In the 300, the sheath liquid (distilled water) 355 is constantly flowing at a constant flow rate by the liquid feed pump 354. This flow velocity was set so that the flow velocity at the detection portion of the sheath flow cell would be a linear velocity of 10 m / sec.

【００４４】試料溶液をカットバルブ350 を介して注入
口351 から添加し、パルスモーター353 で駆動されるシ
リンジポンプ352 でシースフローセル300 に送りこま
れ、蛍光プローブは分子ごとに配列した。これらの蛍光
プローブ分子を励起するレーザー発振器としてアルゴン
レーザー発振器 (波長488nm)(301) 及びアルゴンレーザ
ーで励起した可変波長色素レーザー発振器 (波長590nm)
(302) を採用した。ダイクロイックミラー303 として
は、488nm の光を反射し、590nm の光を透過する性質の
ものを採用した。バンドパスフィルター310 又は311 と
しては、標識された蛍光色素由来の２種類の蛍光を選択
的に透過する性質のもの、具体的には、アルゴーレーザ
ー・フルオレッセイン由来の蛍光波長である510nm から
540nm の光が通過するバンドパスフィルターあるいは、
前記可変波長色素レーザー・スルホローダミン101 由来
の蛍光波長である605nm から650nm の光が透過するバン
ドパスフィルターを用いた。The sample solution was added from the injection port 351 via the cut valve 350, and was sent to the sheath flow cell 300 by the syringe pump 352 driven by the pulse motor 353, and the fluorescent probes were arranged for each molecule. Argon laser oscillator (wavelength 488 nm) (301) as a laser oscillator for exciting these fluorescent probe molecules and variable wavelength dye laser oscillator (wavelength 590 nm) excited by an argon laser
(302) was adopted. The dichroic mirror 303 has a property of reflecting 488 nm light and transmitting 590 nm light. The bandpass filter 310 or 311 has a property of selectively transmitting two types of fluorescence derived from a labeled fluorescent dye, specifically, from 510 nm which is a fluorescence wavelength derived from Argolaser fluorescein.
Bandpass filter that passes 540nm light, or
A bandpass filter that transmits light of 605 nm to 650 nm, which is the fluorescence wavelength derived from the variable wavelength dye laser sulforhodamine 101, was used.

【００４５】図７に、蛍光発光の経時変化を示す。その
結果光電子増倍管312 がとらえたフルオレッセイン様色
素由来の蛍光と、光電子増倍管313 がとらえたスルホロ
ーダミン101様色素由来の蛍光が同時に測定される場
合、即ち連結標識プローブと、どちらか一方の蛍光体の
みが検出される場合が明瞭に識別できることが判明し
た。よって、非特異的に反応した蛍光プローブと、標識
ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイゼーションし
リガーゼにより連結された蛍光プローブが分離できるの
で、標的ポリヌクレオチドを高感度に検出できることが
判明した。FIG. 7 shows changes in fluorescence emission with time. As a result, when the fluorescence derived from the fluorescein-like dye captured by the photomultiplier tube 312 and the fluorescence derived from the sulforhodamine 101-like dye captured by the photomultiplier tube 313 are simultaneously measured, that is, a linked probe, which is It was revealed that the case where only one of the phosphors was detected was clearly distinguishable. Therefore, it was revealed that the non-specifically reacted fluorescent probe and the fluorescent probe specifically hybridized to the labeled polynucleotide and linked by the ligase can be separated, so that the target polynucleotide can be detected with high sensitivity.

【００４６】[0046]

【実施例３】 ポリヌクレオチドの検出 (２) (１) 本実施例においては、実施例２と同様に標的ポリ
ヌクレオチド試料として、バクテリオファージλのＤＮ
Ａを用いた。そして、当該バクテリオファージλのＤＮ
Ａに対して、３種類のプローブを用いて、かかる標的ポ
リヌクレオチド試料を検出した。Example 3 Detection of Polynucleotides (2) (1) In this example, as in Example 2, the target polynucleotide sample was DN of bacteriophage λ.
A was used. And the DN of the bacteriophage λ
For A, three target probes were used to detect such target polynucleotide samples.

【００４７】第一のプローブは、実施例２における第２
の標識プローブと第２の標識プローブは実施例２におけ
る第３の標識プローブと同一であり、その調製方法も実
施例２に記載の方法に準じた。第３のプローブは配列番
号４に示される塩基配列を有する第１・第２の標識プロ
ーブ連結体の捕捉用プローブであり、ホスホアミダイド
法に従い合成した。合成した捕捉用プローブを合成する
最終段階にＮ−モノメトキシトリチルアミノヘキサ−６
−オキシ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル
アミノホスホアミダイドを反応させて５’末端をアミノ
化した。これとは別に直径400 μm のガラスビーズを36
mMの３−(2−アミノエチルアミノプロピル) トリメトキ
シシラン水溶液を用いてアミノシラン化し、次に50mM無
水コハク酸を作用させてガラスビーズ表面にカルボキシ
ル基を導入した。アミノ基を導入した上記捕捉用プロー
ブをこれに混合し、２％ 1−エチル−３（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミドを用いて縮合反応を行
わせしめて捕捉用プローブをガラスビーズ表面に固定し
て、これを捕捉用カラムとして使用した。The first probe is the second probe in the second embodiment.
The labeled probe of No. 2 and the second labeled probe are the same as those of the third labeled probe in Example 2, and the preparation method thereof was also according to the method described in Example 2. The third probe is a capture probe for the first and second labeled probe conjugates having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, and was synthesized according to the phosphoamidide method. N-monomethoxytritylaminohexa-6 was added to the final step of synthesizing the synthesized capture probe.
The 5'end was aminated by reacting with -oxy-β-cyanoethyl-N, N-diisopropylaminophosphoamidide. Separately, 36 glass beads with a diameter of 400 μm
Aminosilanization was carried out using an aqueous solution of 3- (2-aminoethylaminopropyl) trimethoxysilane in mM, and then 50 mM succinic anhydride was allowed to act on the surface of the glass beads to introduce carboxyl groups. The above-mentioned capture probe into which an amino group was introduced was mixed with this, and a condensation reaction was carried out using 2% 1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide to immobilize the capture probe on the surface of the glass beads. , Which was used as the capture column.

【００４８】(２) ハイブリダイゼーション反応は、参
考例２ (２) に示す装置を用いて、以下の手順に従い行
なった。キャリアーＤＮＡとして 100μg/mlの変性サケ
スペルマＤＮＡを含む各種濃度のバクテリオファージλ
溶液を容器201 にいれ、これを容器保持ステージ202 に
セットした。標識プローブ等も同様の容器にいれ容器保
持ステージ202 にセットした。容器201 中の試料等は加
熱器204 により加熱され、バクテリオファージλＤＮＡ
を変性させて一本鎖状態とした。まず、自動ピペット
206 を移動させ、ピペットチップ203 をセットした。次
に、容器201 中の試料を50μl 吸い上げ、反応ステージ
209 にセットした反応容器208 に添加した。使用済みの
ピペットチップはチップ破棄箱250 に廃棄した。さら
に、容器保持ステージ202 に装着した他の容器から第１
の標識プローブと第２の標識プローブを分注し反応容器
208 に添加した。本実施例においては、２種の標識プロ
ーブをあらかじめ混合しておき一回のピペット操作で同
時に添加した。なお、反応ステージ209 は内部に加熱器
204 を持つ構造で、ここでは55℃にて設定し４時間反応
させた後、95℃で５分間加熱した。(2) The hybridization reaction was carried out by the following procedure using the device shown in Reference Example 2 (2). Various concentrations of bacteriophage λ containing 100 μg / ml denatured salmon sperma DNA as carrier DNA
The solution was placed in a container 201 and set on the container holding stage 202. The labeled probe and the like were put in the same container and set on the container holding stage 202. The sample in the container 201 is heated by the heater 204, and the bacteriophage λDNA
Was denatured into a single-stranded state. First, an automatic pipette
The 206 was moved and the pipette tip 203 was set. Next, suck up 50 μl of the sample in container 201, and
It was added to the reaction vessel 208 set to 209. The used pipette tips were discarded in the tip discard box 250. In addition, the other containers mounted on the container holding stage 202 are
Dispense the labeled probe and the second labeled probe from
It was added to 208. In this example, two types of labeled probes were mixed in advance and added simultaneously by one pipetting operation. The reaction stage 209 has a heater inside.
It has a structure having 204, and was set at 55 ° C. here, reacted for 4 hours, and then heated at 95 ° C. for 5 minutes.

【００４９】反応終了後、反応液を第３のプローブを固
定した連結標識プローブ捕捉用カラム215 に導入した。
すなわち、吸引ノズル211 を昇降装置212 を用いて反応
容器208 に入れ、次いでポンプ220 を作動させ、反応液
を連結標識プローブ捕捉用カラム215 に導入した。な
お、連結標識プローブ捕捉用カラム215 は加温装置216
で45℃に保たれている。そして、バルブ213 を切り替
え、62℃に加熱した0.05％Tween 20、5mg/ml牛血清アル
ブミン、0.5M NaCl 、10％ホルムアミドを含む0.3Mクエ
ン酸緩衝液（pH7）で未連結標識プローブを洗い流した
後、カラム温度を95℃にして、捕捉した連結標識プロー
ブを溶出させ、シースフローセルに導き蛍光を経時的に
測定した。シースフローセルを用いた蛍光測定は実施例
１に示した装置を用いて実施例２と同様の方法で行なっ
た。After completion of the reaction, the reaction solution was introduced into the column 215 for capturing the linked labeled probe on which the third probe was immobilized.
That is, the suction nozzle 211 was put into the reaction container 208 using the elevating device 212, and then the pump 220 was operated to introduce the reaction liquid into the column 215 for capturing the linked labeled probe. The column 215 for capturing the linked labeled probe is a heating device 216.
It is kept at 45 ℃. Then, the valve 213 was switched, and the unbound labeled probe was washed away with 0.3 M citrate buffer (pH 7) containing 0.05% Tween 20, 5 mg / ml bovine serum albumin, 0.5 M NaCl, and 10% formamide heated to 62 ° C. Then, the column temperature was raised to 95 ° C. to elute the captured ligated labeled probe, which was introduced into a sheath flow cell and fluorescence was measured over time. Fluorescence measurement using the sheath flow cell was performed in the same manner as in Example 2 using the apparatus shown in Example 1.

【００５０】その結果、実施例２と同様に連結標識プロ
ーブをどちらか一方のプローブと明瞭に分別して検出で
きた。この結果より、本実施例においてはホモジニアス
系で反応を行わせたときに問題になる過剰量の未連結蛍
光プローブを大部分取り除けることが判明した。すなわ
ち、本法を用いればシースフローセルで個々の蛍光プロ
ーブ分子を分離検出できる程度まで未連結蛍光プローブ
を除くことが可能であるため本実施例でも実施例２に示
すのと同様に、非特異的に反応した蛍光プローブと、標
的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイゼーション
しリガーゼにより連結された蛍光プローブが分離可能で
あり、標的ポリヌクレオチドを高感度に検出できること
が判明した。As a result, as in Example 2, the ligation-labeled probe could be clearly separated from either one of the probes and detected. From this result, it was found that in this example, most of the excess unlinked fluorescent probe, which becomes a problem when the reaction is carried out in a homogeneous system, can be removed. That is, using this method, unbound fluorescent probes can be removed to the extent that individual fluorescent probe molecules can be separated and detected in a sheath flow cell, so that in this example as well as in Example 2, nonspecific It was revealed that the fluorescent probe reacted with the above-described protein and the fluorescent probe specifically hybridized to the target polynucleotide and ligated with ligase can be separated, and the target polynucleotide can be detected with high sensitivity.

【００５１】[0051]

【実施例４】 ポリヌクレオチドの検出 (３) (１) 本実施例では、実施例２・３と同様に、標的ポリ
ヌクレオチド試料として、バクテリオファージλのＤＮ
Ａを用いた。ここでは、異なる蛍光団を結合した２種の
プローブを用い、一方の蛍光団を励起したときにエネル
ギー移動により他方の蛍光団が発光する現象を用いて標
的ポリヌクレオチドを検出した。第１のプローブは捕捉
用プローブで、実施例２で用いた捕捉用の第１のプロー
ブと同一の塩基配列を有し、参考例１に示した反応担体
に固定して用いる。かかる固定化法は、実施例２ (３)
と同様の方法でアミノシラン化した反応体にＮ−スクシ
ンイミジル３− (２−ピリジルジチオ) プロピオン酸を
反応させた後、還元剤であるジチオスレイトールを反応
させたスルフィド基を担体に導入した。これとは別に配
列番号１で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド
のホスホアミダイド法による合成の最終段階にＮ−モノ
メトキシトリチルアミノヘキサ−６−オキシ−β−シア
ノエチル−Ｎ, Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホアミダ
イドを反応させて5'末端にアミノ基を導入し、Ｎ−スク
シンイミジル３− (２−ピリジルジチオ) プロピオン酸
を反応させ、5'末端のアミノ基を修飾した。反応液にエ
タノールを加え、修飾された第１のプローブを沈澱させ
て未反応の試薬を除いた後修飾した前記ポリヌクレオチ
ドをスルフィド基を導入した担体に加えて、ジスルフィ
ド交換反応により第１のプローブが担体に固定された。Example 4 Detection of Polynucleotide (3) (1) In this example, as in Examples 2 and 3, the target polynucleotide sample was DN of bacteriophage λ.
A was used. Here, two kinds of probes having different fluorophores bound to each other were used, and the target polynucleotide was detected by using a phenomenon that when one fluorophore is excited, the other fluorophore emits light by energy transfer. The first probe is a capture probe, has the same base sequence as the capture first probe used in Example 2, and is used by being immobilized on the reaction carrier shown in Reference Example 1. Such an immobilization method is described in Example 2 (3).
The reaction product aminosilane-ized by the same method as described above was reacted with N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionic acid, and then a sulfide group reacted with dithiothreitol as a reducing agent was introduced into the carrier. Separately from this, N-monomethoxytritylaminohex-6-oxy-β-cyanoethyl-N, N-diisopropylaminophosphoamidide is used in the final step of the synthesis of the polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 by the phosphoamidide method. Was reacted to introduce an amino group at the 5'-terminal, and N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionic acid was reacted to modify the amino group at the 5'-terminal. Ethanol is added to the reaction solution to precipitate the modified first probe to remove unreacted reagents, and then the modified polynucleotide is added to a carrier having a sulfide group introduced therein, and the first probe is subjected to a disulfide exchange reaction. Were fixed to the carrier.

【００５２】第２・第３のプローブは標識用で、配列番
号５及び配列番号６のポリヌクレオチドを有する。第３
のプローブは、バクテリオファージλのＤＮＡ上で第２
のプローブの3'末端側に隣接する。第２のプローブに
は、5'末端から55番目のＣと56番目のＴの間のリンの部
分にスルホローダミン101 蛍光団が結合している。第３
のプローブには、5'末端から５番目のＣと６番目Ｔの間
のリンの部分にフルオレッセインが結合している。これ
ら蛍光団のポリヌクレオチドプローブへの標識法は特開
昭61-44353に開示の方法に従った。この方法は、ポリヌ
クレオチドの蛍光体標識部位のリン酸結合を官能基を有
するホスホン酸基に置き換え、この官能基と蛍光団を結
合させることにより蛍光標識ポリヌクレオチドプローブ
を得る手法で、任意の位置に標識物を導入できる方法で
ある。The second and third probes are for labeling and have the polynucleotides of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6. Third
Of the second probe on the DNA of bacteriophage λ
Adjacent to the 3'end side of the probe. In the second probe, the sulforhodamine 101 fluorophore is bound to the phosphorus moiety between the 55th C and the 56th T from the 5'end. Third
Fluorescein is bound to the portion of the phosphorus between the 5th C and the 6th T from the 5'end in the probe. The method for labeling the polynucleotide probe with these fluorophores was according to the method disclosed in JP-A-61-44353. This method replaces the phosphate bond at the fluorophore labeling site of the polynucleotide with a phosphonate group having a functional group, and binds this functional group to the fluorophore to obtain a fluorescently labeled polynucleotide probe. It is a method that can introduce a labeled substance into.

【００５３】実施例２と同様に第１のプローブを固定し
た担体に試料であるバクテリオファージλのＤＮＡを反
応させた後、上記２種のプローブをハイブリダイズさせ
た。洗浄により未反応のプローブ等を除いた後、ジチオ
スレイトールで還元してプローブの結合した標的ポリヌ
クレオチドを遊離させた。これをシースフローセルに導
き、実施例１に示す検出装置でアルゴンレーザー(488n
m) により発光する600nmから650nm の光を検出した。そ
して、その経時的変化を図８に示した。As in Example 2, the carrier of the first probe was allowed to react with the sample DNA of bacteriophage λ, and then the above-mentioned two kinds of probes were hybridized. After removing unreacted probe and the like by washing, it was reduced with dithiothreitol to release the target polynucleotide to which the probe was bound. This was introduced into a sheath flow cell, and the argon laser (488n
The light from 600 nm to 650 nm emitted by m) was detected. The change over time is shown in FIG.

【００５４】その結果、488nm で励起した時に通常では
検出されない600 〜650nm の蛍光が検出された。スルホ
ローダミン101 蛍光団単独の蛍光はアルゴンレーザー(4
88nm) で励起した場合弱く、また単独のフルオレッセイ
ンからの蛍光はフィルターで除去できるので、アルゴン
レーザー(488nm) で発光する600nm から650nm の光はフ
ルオレッセイン蛍光団とスルホローダミン101 の間での
エキルギー移動に由来するものであることは明らかであ
る。よって、蛍光団スルホローダミン101 蛍光団とフル
オレッセイン蛍光団の両者が隣接して結合している標的
バクテリオファージλのＤＮＡのみが検出されているこ
とは明らかである。As a result, when excited at 488 nm, fluorescence at 600 to 650 nm which was not usually detected was detected. The fluorescence of the sulforhodamine 101 fluorophore alone is determined by the argon laser (4
The fluorescence from the fluorescein alone, which is weak when excited at (88 nm) and can be filtered out, causes the 600 nm to 650 nm light emitted by the argon laser (488 nm) between the fluorescein fluorophore and the sulforhodamine 101. It is clear that this is due to the movement of Ekirugyi. Thus, it is clear that only the DNA of the target bacteriophage λ, to which both the fluorophore sulforhodamine 101 fluorophore and the fluorescein fluorophore are bound adjacent, is detected.

【００５５】本実施例では、使用するレーザーが１種類
ですむという大きな利点がある。This embodiment has a great advantage that only one type of laser is used.

【００５６】[0056]

【発明の効果】本発明により、放射性同位元素の標識を
必要とせずに、高感度で精度が高く、定量的な測定が可
能で、かつ自動化により単位時間あたりの測定サンプル
数を多くすることで臨床フィールドで多量の検体を検査
することが可能なポリヌクレオチド検出法、及び当該方
法を用いた検出装置が提供される。EFFECTS OF THE INVENTION According to the present invention, it is possible to perform high-sensitivity, high-accuracy, quantitative measurement without the need for labeling with radioactive isotopes, and to increase the number of measurement samples per unit time by automation. Provided are a polynucleotide detection method capable of testing a large amount of specimens in a clinical field, and a detection device using the method.

【００５７】[0057]

【配列表】[Sequence list]

配列番号 ：１ 配列の長さ：２７５ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ポリヌクレオチド 配列 ：ＡＴＣＧＣＣＡＴＡＣＡＴＣＣＣＣＴＴＡＴＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣ ＴＴＴＧＣＣＣＡＧＧＴＣＴＴＴＣＡＣＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＣＴＣＧＧＡ ＡＴＴＡＧＡＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＧＡＴＴＣＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＧＡＣ ＧＧＣＴＴＴＧＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧ ＡＴＣＧＡＡＣＡＣＧＡＴＧＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＣＡＣＣＧＣＴＧＧＣＧＴＴ ＣＡＧＣＧＣＧＴＡＧＧＣＴＴＣＧＡＴＡＴＣＧＴＣＧＧＴＣＧＧＧＴＣＡＴＡ ＣＧＴＧＧＡＣＴＴＧＴＣＡＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＣＣ ＧＧＡＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＴＴＡＴＴＣＴＣＣＴＣＡＣＴＧＣ 配列番号 ：２ 配列の長さ：６５ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 他の構造体を含むポリヌクレオ
チド 配列の特徴：１ スルホローダミン１０１様蛍光団 配列 ：ＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＡＴＧＡＡＴＧＧＣＣＴＴ ＧＴＴＧＡＴＣＧＣＧＣＴＴＴＧＡＴＡＴＡＣＧＣＣＧＡＧＡＴＣＴＴＴＡＧ 配列番号 ：３ 配列の長さ：６５ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 他の構造体を含む合成ポリヌク
レオチド 配列の特徴：６５ フルオレッセイン様蛍光団 配列 ：ＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＴＴＧＣＣＣＡＡＡＧＣＧＣＡＴＴＧＣＡＴ ＡＡＴＣＴＴＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＧＣＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴＡＣＴＴＴＴＴ 配列番号 ：４ 配列の長さ：３５ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ポリヌクレオチド 配列 ：５’ＴＴＴＴＴＧＧＣＡＡＡＣＣＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＡＡＧＡＴ ＣＴＣＧＧＣＧ ３’ 配列番号 ：５ 配列の長さ：６０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 他の構造体を含む合成ポリヌク
レオチド 配列の特徴：５５−５６ スルホローダミン１０１様蛍
光団 配列 ：ＴＣＴＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＡＴＧＡＡＴＧＧＣＣＴＴＧＴＴＧＡ ＴＣＧＣＧＣＴＴＴＧＡＴＡＴＡＣＧＣＣＧＡＧＡＴＣＴＴＴＡＧ 配列番号 ：６ 配列の長さ：６０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 他の構造体を含む合成ポリヌク
レオチド 配列の特徴：５−６ フルオレッセイン様蛍光団 配列 ：ＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＴＴＧＣＣＣＡＡＡＧＣＧＣＡＴＴＧＣＡＴ ＡＡＴＣＴＴＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＧＣＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴＡＣSEQ ID NO: 1 Length of sequence: 275 SEQ types: the number of nucleic acid strand: single strand Topology: linear sequence type: other sequences synthetic polynucleotide sequences: ATCGCCATACATCCCCTTATAGGACACCGC TTTGCCCAGGTCTTTCACCGCTGTCTCCAGCTCGGA ATTAGAGCCACGACGGGATTCCAGCTTCTCCTTGAC GGCTTTGAAGGAACGGAACAGCGCCCAGCCTTTCGG ATCGAACACGATGATATTCACCACACCGCTGGCGTT CAGCGCGTAGGCTTCGATATCGTCGGTCGGGTCATA CGTGGACTTGTCACGCTTGCTCCACTCCGTGCCGCC GGACTGCGTGATGTTATTCT CTCACTGC SEQ ID NO: 2 Sequence length: 65 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: 1 strand Topology: Linear Sequence type: Other sequence Polynucleotide containing other structure Sequence characteristics: 1 Sulforhodamine 101-like fluorophore Sequence: TTTTTTCTTTTCGGCCTGCCATGAATGGCCTT GTTGATCGCGCTTTGATATACGCCGAGATCTTTTAG SEQ ID NO: 3 Sequence length: 65 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Type of synthetic sequence: Linear sequence Other type Nucleotide Sequence features: 65 Fluorescein-like fluorophore sequence: CTGTCTTGGTTTGCCCAAAACGCGCATGCAT AATCTTTCAGGGTTATGCGTTGTTCCATACTTTTT SEQ ID NO: 4 Length: 35 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other sequence Synthetic polynucleotide Sequence: 5'TTTTTTGGCAAACCAAGACAGCTAAAGAT CTCGGGCG 3'SEQ ID NO: 5 Sequence length: 60 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: 1 Strand Topology: Linear Sequence type: Other sequence Synthetic polynucleotide containing other structure Sequence characteristics: 55-56 Sulforhodamine 101-like fluorophore Sequence: TCTTTCCGGCCTTGCATGAATGGCTTTGTTGA TCCGCGCTTTGATACTAGCCGA SEQ ID NO: 6 Sequence length: 60 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: 1 strand Topology: Linear Sequence type: Other sequence Synthetic polynucleotide containing other structure Sequence characteristics: 5-6 full Ressein like fluorophores array: CTGTCTTGGTTTGCCCAAAGCGCATTGCAT AATCTTTCAGGGTTATGCGTTGTTCCATAC

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】ヘテロジニアス反応を用いた本発明の標的ポリ
ヌクレオチド検出法の概念図。FIG. 1 is a conceptual diagram of a target polynucleotide detection method of the present invention using a heterogeneous reaction.

【図２】ホモジニアス反応を用いた本発明の他の標的ポ
リヌクレオチド検出法の概念図。FIG. 2 is a conceptual diagram of another method for detecting a target polynucleotide of the present invention using a homogeneous reaction.

【図３】反応担体の模式図。FIG. 3 is a schematic diagram of a reaction carrier.

【図４】ヘテロジニアス反応を行うための反応装置の模
式図。FIG. 4 is a schematic diagram of a reaction apparatus for performing a heterogeneous reaction.

【図５】ホモジニアス反応を行うための本発明の他の反
応装置の概念図。FIG. 5 is a conceptual diagram of another reaction apparatus of the present invention for carrying out a homogeneous reaction.

【図６】シースフロ−セルを用いた多色蛍光測定装置。FIG. 6 is a multicolor fluorescence measurement apparatus using a sheath flow cell.

【図７】測定結果例を示す図。FIG. 7 is a diagram showing an example of measurement results.

【図８】他測定結果例を示す図。FIG. 8 is a diagram showing another measurement result example.

フロントページの続き (72)発明者 永井 啓一 東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内Front page continued (72) Inventor Keiichi Nagai 1-280 Higashi Koikekubo, Kokubunji, Tokyo Inside the Central Research Laboratory, Hitachi, Ltd.

Claims (6)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 被測定物であるポリヌクレオチド鎖と当
該ポリヌクレオチド鎖と相補的なポリヌクレオチド鎖に
標識物を結合した標識プローブを会合させ、会合した標
識プローブの量を検出するポリヌクレオチド検出法にお
いて、被測定物であるポリヌクレオチド鎖における異な
る部位に対して各々相補的な二種以上の標識プローブを
会合させ、当該標識プローブと被測定物の複合体の量を
当該標識プローブの存在として一分子毎に特定・検知す
ることを特徴とするポリヌクレオチド検出法。1. A method for detecting a polynucleotide in which a polynucleotide chain as a substance to be measured and a labeled probe having a labeled substance bound to a polynucleotide chain complementary to the polynucleotide chain are associated with each other, and the amount of the associated labeled probe is detected. In the above, two or more kinds of labeled probes each complementary to different sites in the polynucleotide chain as the measurement target are associated with each other, and the amount of the complex of the labeling probe and the measurement target is regarded as the presence of the labeling probe. A method for detecting a polynucleotide, which is characterized by identifying and detecting each molecule. 【請求項２】 請求項１記載のポリヌクレオチド検出法
において、被測定物であるポリヌクレオチド鎖に会合さ
せた、二種以上の標識プローブ同士を連結後、被測定物
であるポリヌクレオチドから解離させて、解離した標識
プローブ連結体の量を一分子毎に特定・検知することを
特徴とするポリヌクレオチド検出法。2. The method for detecting a polynucleotide according to claim 1, wherein two or more kinds of labeled probes associated with a polynucleotide chain which is an object to be measured are linked and then dissociated from the polynucleotide which is an object to be measured. A method for detecting a polynucleotide, which comprises identifying and detecting the amount of the dissociated labeled probe conjugate for each molecule. 【請求項３】(１) 被測定物であるポリヌクレオチド鎖
に相補的なポリヌクレオチド鎖を固定化した担体の当該
ポリヌクレオチド鎖に被測定物であるポリヌクレオチド
鎖を会合させる第一工程、(２) 第一工程において会合
させた被測定物であるポリヌクレオチド鎖に対して各々
異なる部分に対して相補的な二種以上の標識プローブを
各々会合させる第二工程、(３) 第二工程において会合
させた二種以上の標識プローブ同士を連結し、固定化標
識プローブ複合体を調製する第三工程、(４) 第三工程
により得られた固定化標識プローブ複合体における被測
定物であるポリヌクレオチド鎖及び標識プローブ連結体
を解離・溶出し、当該溶出液中の標識プローブ連結体の
量を一分子毎に特定・検知する第四工程とからなる、ポ
リヌクレオチド検出法。(1) A first step of associating a polynucleotide chain to be measured with the polynucleotide chain of a carrier on which a polynucleotide chain complementary to the polynucleotide chain to be measured is immobilized, 2) A second step of associating two or more kinds of labeled probes complementary to different parts with respect to the polynucleotide chain, which is the analyte to be associated in the first step, (3) In the second step The third step of preparing an immobilized labeled probe complex by ligating two or more kinds of associated labeled probes to each other, (4) the poly-drug to be measured in the immobilized labeled probe complex obtained in the third step. A polynucleotide detection method comprising a fourth step of dissociating and eluting the nucleotide chain and the labeled probe conjugate, and identifying and detecting the amount of the labeled probe conjugate in the eluate for each molecule. 【請求項４】(１) 液相中で、被測定物であるポリヌク
レオチド鎖と当該ポリヌクレオチド鎖の異なる部分に対
して各々相補的な二種以上の標識プローブを会合させ、
連結した標識プローブ複合体を調製し、次いで当該標識
プローブ複合体における被測定物であるポリヌクレオチ
ド鎖と標識プローブ連結体を解離せしめる第一工程、
(２) 第一工程で得た反応溶液を、少なくとも上記二種
以上の標識プローブの連結部分のポリヌクレオチド鎖の
全部又は一部に相補的な部分を有するポリヌクレオチド
鎖を固定化した担体と混合し、ポリヌクレオチド鎖同士
で会合反応を行なわせしめて固定化標識プローブ複合体
を調製する第二工程、(３) 第二工程で調製した固定化
標識プローブ複合体混合物から、上記標識プローブ連結
体以外のヌクレオチド鎖を解離・除去する第三工程、
(４) 第三工程により得た上記標識プローブ連結体以外
のヌクレオチド鎖を解離・除去した固定化標識プローブ
複合体から、当該標識プローブ連結体を解離・溶出し、
当該溶出液中の標識プローブ連結体の量を一分子毎に特
定・検知する第四工程とからなる、ポリヌクレオチド検
出法。4. (1) In a liquid phase, two or more kinds of labeled probes each complementary to a polynucleotide chain as an object to be measured and a different portion of the polynucleotide chain are associated with each other,
Prepare a linked labeled probe complex, then the first step of dissociating the labeled probe conjugate with the polynucleotide chain that is the object to be measured in the labeled probe complex,
(2) Mixing the reaction solution obtained in the first step with a carrier on which a polynucleotide chain having a portion complementary to all or a part of the polynucleotide chain of at least the linking portion of the above-mentioned two or more kinds of labeled probes is immobilized Then, a second step of preparing an immobilized labeled probe complex by causing an association reaction between the polynucleotide chains, (3) From the immobilized labeled probe complex mixture prepared in the second step, other than the labeled probe conjugate The third step of dissociating and removing the nucleotide chain of
(4) Dissociate and elute the labeled probe conjugate from the immobilized labeled probe complex obtained by dissociating and removing nucleotide chains other than the labeled probe conjugate obtained in the third step,
A polynucleotide detection method, which comprises a fourth step of identifying and detecting the amount of the labeled probe conjugate in the eluate for each molecule. 【請求項５】 被測定物であるポリヌクレオチド鎖にお
ける異なる部位に対して各々相補的な二種以上の標識プ
ローブにおける標識物が異なる蛍光色素であり、一方の
蛍光色素が発する蛍光が他方の蛍光色素を励起する蛍光
色素同士であり、かつ各々の蛍光色素同士の距離が50塩
基長以内であることを特徴とする請求項１記載のポリヌ
クレオチド検出法。5. The fluorescent substances emitted from one of the fluorescent dyes are different from each other, and the labeling substances of two or more types of labeled probes complementary to different sites in a polynucleotide chain to be measured are different fluorescent dyes. The method for detecting a polynucleotide according to claim 1, wherein the fluorescent dyes excite the dyes, and the distance between the fluorescent dyes is within 50 bases. 【請求項６】 シースフローセル、少なくとも一種以上
の励起光を発射する光源と、シースフローセルの検出部
に励起光の焦点を合わせるための受光素子、シースフロ
ーセルの検出部より発生された蛍光を検出するための蛍
光検出機構、及び当該蛍光検出機構からの信号を標識プ
ローブ一分子毎の存在として識別し計数する装置からな
ることを特徴とする請求項１、請求項２、請求項３、請
求項４、又は請求項５記載のポリヌクレオチド検出法に
使用する検出装置。6. A sheath flow cell, a light source that emits at least one or more kinds of excitation light, a light receiving element for focusing the excitation light on a detection portion of the sheath flow cell, and fluorescence generated by the detection portion of the sheath flow cell is detected. 5. A fluorescence detection mechanism for determining the presence of a fluorescent probe, and a device for identifying and counting the signal from the fluorescence detection mechanism as the presence of each labeled probe molecule, and claim 1, claim 2, claim 3, and claim 4. Or a detection device used in the method for detecting a polynucleotide according to claim 5.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2002171974A (en) * 2000-12-07 2002-06-18 Aloka Co Ltd Method and apparatus for examining difference of base sequence
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