JPH05271099A - Phospholipase c inhibitor - Google Patents

Abstract

PURPOSE: To provide a new phospholipase C inhibitor composed of a peptide lactone collected from a cultured liquid of an Actinomadura sp., and useful as an agent for the treatment of diseases caused by immunosthenia, an antiinflammatory agent, an agent for suppressing the increase in blood pressure, etc. CONSTITUTION: The objective phospholipase C inhibitor consisting of Q12713 substance having a melting point of 152-156 deg.C, a molecular weight m/z of 894 (M-H) by FAB-MS and a specific rotation of [α]D<20> =-49.7 deg. (c=0.1, methanol) is produced by culturing Actinomadura sp. Q12713 strain (FERM P-12723) in a medium at 28 deg.C for 96hr under shaking to obtain a seed culture liquid, inoculating the seed liquid to a new medium, subjecting to the main culture at 28 deg.C for 120hr, filtering the cultured liquid to remove bacterial cells, extraction- treating the filtrate with ethyl acetate, concentrating the extract under reduced pressure to obtain a brown oily substance, purifying the substance by thin-layer silica gel chromatography and finally subjecting the active fraction to silica gel column chromatography.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は，Ｑ１２７１３物質を有
効成分とするフォスフォリパーゼＣ阻害剤に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a phospholipase C inhibitor containing a Q12713 substance as an active ingredient.

【０００２】[0002]

【従来の技術】特開平３−２１８３９４号公報にはアク
チノマジュラ ベルコソスポラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕ
ｒａ ｖｅｒｒｕｃｏｓｏｓｐｏｒａ）の培養液からＢ
Ｕ−３９８３Ｔと名づけられるペプチドを単離したこと
が報告され，同公報にはこの化合物が，抗腫瘍作用を有
することおよび溶液中では下式で示される互変異性体と
して存在することが記載されている。2. Description of the Related Art Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 3-218394 discloses an actinomajura velcosospora.
B. from the culture fluid of R. ver verrucosospora
It was reported that a peptide named U-3983T was isolated, and the publication describes that this compound has an antitumor activity and exists in solution as a tautomer represented by the following formula. ing.

【０００３】[0003]

【化１】 [Chemical 1]

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは，中華人
民共和国，ショウ洲で採取した土壌より分離された微生
物を培養し，培養物の薬理活性について検討したとこ
ろ，この培養物がフォスフォリパーゼＣ阻害活性を示す
ことを見出した。そして，さらにこの培養物について研
究を重ね，フォスフォリパーゼＣ阻害作用を有する成分
を純粋に単離することに成功し，同定を行ったところ，
この化合物は，上述したＢＵ−３９８３Ｔと同一物質で
あることが判明した。DISCLOSURE OF INVENTION Problems to be Solved by the Invention The present inventors cultivated a microorganism isolated from soil collected in Zhouzhou, People's Republic of China, and investigated the pharmacological activity of the culture. It was found that it exhibits lipase C inhibitory activity. After further research on this culture, we succeeded in purely isolating the component having phospholipase C inhibitory action and identified it.
This compound was found to be the same substance as BU-3983T described above.

【０００５】しかし，前述のようにこの化合物のフォス
フォリパーゼＣ阻害活性は何も知られておらず，本発明
者らはこの面での薬理作用の検討を行って，本発明を完
成した。However, as described above, nothing is known about the phospholipase C inhibitory activity of this compound, and the present inventors have completed the present invention by examining the pharmacological action in this respect.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】すなわち，本発明は，つ
ぎの理化学的性状を有するＱ１２７１３物質を有効成分
として含有するフォスフォリパーゼＣ阻害剤に関する。
本発明医薬の有効成分は，ＢＵ−３９８３Ｔと同様，互
変異性体が存在することが高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）及び核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）によ
って確認されており，本発明医薬は，これらの分離され
た異性体および混合物を包含する。本発明医薬成分の薬
理効果（フォスフォリパーゼＣ阻害作用）はつぎの様に
して測定されたものである。That is, the present invention relates to a phospholipase C inhibitor containing a Q12713 substance having the following physicochemical properties as an active ingredient.
Like BU-3983T, the active ingredient of the drug of the present invention has been confirmed to have tautomers by high performance liquid chromatography (HPLC) and nuclear magnetic resonance spectrum (NMR). Including separated isomers and mixtures of. The pharmacological effect (phospholipase C inhibitory action) of the pharmaceutical ingredient of the present invention is measured as follows.

【０００７】フォスフォリパーゼＣの活性測定法 所定量のＱ１２７１３物質を溶解した基準溶液^１）２５
μｌに酵素溶液^２）２５μｌを加え，３７℃，１５分反
応させる。１０％トリクロロ酢酸２００μｌを上記反応
液に加え，４℃で３０分放置する。１６，０００ｒｐｍ
５分間遠心分離を行い，上澄を液体レンチレーションカ
ウンターで測定する。Method for measuring the activity of phospholipase C Reference solution ¹⁾ in which a predetermined amount of Q12713 substance was dissolved 25
Add 25 μl of Enzyme Solution ^{2) to} μl and incubate at 37 ° C for 15 minutes. 200 μl of 10% trichloroacetic acid is added to the above reaction solution and left at 4 ° C. for 30 minutes. 16,000 rpm
Centrifuge for 5 minutes and measure the supernatant with a liquid lentilation counter.

【０００８】 １）基準溶液 イノシトール−２−^３Ｈ−ＰＩＰ_２（ＣＨＣｌ_３中） １μｌ フォスファチジ−ルコリン（２０ｍｇ／ｍｌ）（ＣＨＣｌ_３中）２μｌ ０．５Ｍ−Ｈｅｐｅｓナトリウム １０μｌ 水 １０μｌ １０％ナトリウム・コーレイト ５μｌ ───────────────────────────────── 全 量 ２５μｌ （溶液作製後，クロロホルムを除去する。）[0008] 1) reference solutions inositol ^-2- 3 _^H-PIP 2 (in CHCl ₃₎ 1 [mu] l Fosufachiji - Rukorin (20 mg / ml) (in CHCl ₃₎ 2μl 0.5M-Hepes sodium 10 [mu] l water 10 [mu] l 10% sodium Koreito 5 μl ───────────────────────────────── Total volume 25 μl (Remove the chloroform after preparing the solution.)

【０００９】 ２）酵素溶液 １０ｍＭ 塩化マグネシウム ５μｌ １０ｍＭ 塩化カルシウム ５μｌ １％ ＢＳＡ ５μｌ １０ｍＭ ＤＴＴ（ゾチオスライトール） ５μｌ 牛脳フォスフォリパーゼーＣ ０．５μｌ 水 ２μｌ １Ｍ 塩化カリウム ２．５μｌ ─────────────────────────────── 全 量 ２５μｌ 測定結果を表１に示す。2) Enzyme solution 10 mM magnesium chloride 5 μl 10 mM calcium chloride 5 μl 1% BSA 5 μl 10 mM DTT (zothiothreitol) 5 μl bovine brain phospholipase C 0.5 μl water 2 μl 1 M potassium chloride 2.5 μl ──── ─────────────────────────── Total volume 25 μl Table 1 shows the measurement results.

【００１０】[0010]

【表１】 [Table 1]

【００１１】つぎに，Ｑ１２７１３物質の毒性（ＬＤ
_５０）は，雌性ＩＣＲマウスに腹腔内投与した場合，３
ｍｇ／ｋｇであった。以上の薬理実験の結果，Ｑ１２７
１３物質は，フォスフォリパーゼＣ阻害作用を有するこ
とが明らかである。従って，本発明医薬は，特にＴ細胞
及びＢ細胞の増殖抑制作用があることより免疫亢進によ
ってもたらされる種々の病態の治療剤，また，白血球の
貧食能の抑制による抗炎症剤，アセチルコリンの作用抑
制による血圧上昇の抑制剤などとして有用である。本発
明において，これらの薬剤を調製するには，有効成分を
それ自体公知の薬学的に許容される担体，賦形剤などと
混合して錠剤，カプセル，散剤，顆粒剤あるいは丸剤と
する。投与量は，投与対象，投与ルート，症状により異
なるが，通常成人１日当り経口投与で１０ｍｇ〜１ｇ，
非経口投与で１〜１００ｍｇであり，これを２〜３回に
分けて投与する。Next, the toxicity of the Q12713 substance (LD
₅₀ ), when administered intraperitoneally to female ICR mice,
It was mg / kg. As a result of the above pharmacological experiments, Q127
It is clear that 13 substances have a phospholipase C inhibitory action. Therefore, the pharmaceutical agent of the present invention has a suppressive action on T cells and B cells in particular, and is therefore a therapeutic agent for various pathological conditions brought about by immune enhancement, and the action of acetylcholine, an anti-inflammatory agent by suppressing leukocyte phagocytosis. It is useful as an inhibitor of blood pressure increase due to inhibition. In the present invention, to prepare these drugs, the active ingredient is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or the like known per se to give tablets, capsules, powders, granules or pills. The dose varies depending on the administration subject, administration route, and symptoms, but it is usually 10 mg to 1 g by oral administration per day for adults.
It is 1 to 100 mg by parenteral administration, and this is administered in 2 to 3 divided doses.

【００１２】つぎに，薬効成分であるＱ１２７１３物質
の産生菌，該菌の培養法およびＱ１２７１３物質の採取
法を説明する。 Ｑ１２７１３物質産生菌株の菌学的性質 本菌株は中華人民共和国，ショウ洲で採取された土壌よ
り分離された微生物でつぎのような菌学的性質を有す
る。Next, a bacterium producing the Q12713 substance which is a medicinal component, a method for culturing the bacterium and a method for collecting the Q12713 substance will be described. Bacteriological Properties of Q12713 Substance-Producing Strain This strain is a microorganism isolated from the soil collected in Zhouzhou, People's Republic of China, and has the following mycological properties.

【００１３】１．形態 本菌株は各種有機及び無機培地において良く生育し，基
生菌糸の色調は黄灰〜淡黄茶である。気菌糸は，イース
ト・麦芽寒天培地，栄養寒天培地，スターチ・無機塩寒
天培地，チロシン寒天培地上に良く形成され，灰白〜明
るい灰色を呈する。気菌糸から分岐した胞子柄上に１５
〜３０個の胞子が連鎖し，成熟に従って湾曲しコイル状
になる。液体培養で，基生菌糸の断片化は見られない。
電子顕微鏡による観察では，胞子の形状の円筒形，大き
さは０．７〜０．９μｍ×０．８〜１．２μｍで，その
表面はいぼ状である。胞子のう，運動性脱子等の特殊な
器官は観察されない。1. Morphology This strain grows well in various organic and inorganic media, and the color of the basic hyphae is yellowish gray to light yellow tea. Aerial mycelia are well formed on yeast / malt agar medium, nutrient agar medium, starch / inorganic salt agar medium, and tyrosine agar medium, and are grayish to light gray. 15 on spore stalk branched from aerial mycelium
~ 30 spores are linked, curving and coiling as they mature. Fragmentation of basal hypha is not observed in liquid culture.
Observation by an electron microscope shows that the spores are cylindrical and have a size of 0.7 to 0.9 μm × 0.8 to 1.2 μm, and the surface is wart-like. No special organs such as sporangia and motile sporangia are observed.

【００１４】２．各種寒天培地上の性状 各種寒天培地上の性状は，表２に示すとおりである。特
に記載しないかぎり，２７℃で２１日間培養し，常法に
従って観察したものである。色調の記載については色の
標準（日本色彩研究所）によった。2. Properties on various agar media Properties on various agar media are shown in Table 2. Unless otherwise specified, the cells were cultured at 27 ° C. for 21 days and observed according to a conventional method. The description of the color tone was based on the color standard (Japan Color Research Institute).

【００１５】[0015]

【表２】 [Table 2]

【００１６】（注） Ｇ；生育程度 Ａ；気菌糸の
着生及びその色相 Ｒ；裏面の色相 Ｓ；可溶性色素 ３．生理的性質(Note) G: degree of growth A: aerial mycelium settlement and its hue R: rear surface hue S; soluble pigment Physiological properties

【００１７】[0017]

【表３】 [Table 3]

【００１８】（注）生育温度は各温度（５，１０，１
５，２０，２４，２７，３０，３３，３７，４０，４
５，５０℃）で７−２１日までの観察結果，ミルクに対
する作用は３７℃で３−２１日までの観察結果，それ以
外は，特に指摘のないかぎり２７℃で２週間後の観察結
果を示す。 ４．炭素源の資化性（プリドハム・ゴドリーブ寒天培
地，２７℃培養）(Note) The growth temperature depends on each temperature (5, 10, 1
5,20,24,27,30,33,37,40,4
The results of observation up to 7-21 days at 5,50 ° C., the effects on milk were observed at 37 ° C. for 3-21 days, and otherwise, the observation results after 2 weeks at 27 ° C. were used unless otherwise specified. Show. 4. Utilization of carbon source (Pridham-Godlieve agar medium, 27 ° C culture)

【００１９】[0019]

【表４】 [Table 4]

【００２０】５．菌体成分の化学分析 ＬＥＣＨＶＡＬＩＥＲらの方法（ＬＥＣＨＶＡＬＩＥ
Ｒ，ＭＰ，ｅｔ ａｌ；ＰＰ２７７−２３８ ｉｎ Ｄ
ＩＥＴＺ，Ａ ｅｔ ａｌ ｅｄ．，Ａｃｔｉｎｏｍｙ
ｃｅｔｅ Ｔａｘｏｎｏｍｙ，ＳＩＭ Ｓｐｅｃｉａｌ
Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．６，１９８０）に従
い本菌株の酸加水分解物の分析を行った結果，ｍｅｓｏ
−ジアミノピメリン酸が検出された。また，特徴的な全
菌体糖成分としてマジュロースが検出された（細胞壁タ
イプＩＩＩ−Ｂ）。主要な菌体メナキノンは，ＭＫ−９
（Ｈ６）及びＭＫ−９（Ｈ８）であった。5. Chemical analysis of cell components LECHVALIER and other methods (LECHVALIE
R, MP, et al; PP277-238 in D
IETZ, A et al ed. , Actinomy
cete Taxonomy, SIM Special
Publication No. 6, 1980), the acid hydrolyzate of this strain was analyzed.
-Diaminopimelic acid was detected. Moreover, majurose was detected as a characteristic whole cell sugar component (cell wall type III-B). The major bacterial menaquinone is MK-9
(H6) and MK-9 (H8).

【００２１】以上よりＱ１２７１３株の性状を要約する
と，色調は，基生菌糸が黄灰〜淡黄茶で気菌糸が灰白〜
明るい灰である。気菌糸上に１５〜３０個の胞子連鎖を
作り，基生菌糸は断片化しない。細胞壁タイプＩＩＩ−
Ｂ，主要なメナキノンはＭＫ−９（６Ｈ），ＭＫ−９
（Ｈ８）である。上記諸性状を有する菌種を各種文献
（Ｂｅｒｇｅ’ｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔ
ｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．
４，１９８９等）により検索すると，本菌株はアクチノ
マデュラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）属に属す菌株と
判断される。そこで，本菌株をアクチノマデュラ エス
ピー（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｓｐ．）Ｑ１２７１
３と命名した。本菌株は，工業技術院微生物工業研究所
に微工研菌寄第１２７２３号として寄記されている。From the above, the characteristics of the Q12713 strain are summarized as follows: the basic mycelia are yellow ash to pale yellow brown and aerial mycelia are gray to white.
It is a bright ash. 15 to 30 spore chains are formed on the aerial hyphae, and the basal hyphae are not fragmented. Cell wall type III-
B, the major menaquinone is MK-9 (6H), MK-9
(H8). Bacterial species having the above-mentioned various properties are described in various documents (Berge'y's Manual of System).
electronic Bacteriology vol.
4, 1989), the strain is judged to belong to the genus Actinomadura . Therefore, this strain was designated as Actinomadura sp. Q1271.
It was named 3. This strain has been registered in the Institute for Microbial Industry, Institute of Industrial Science and Technology as Microorganism Research Institute No. 12723.

【００２２】培養法およびＱ１２７１３物質の採取法 アクチノマデュラ エスピーＱ１２７１３株を栄養源を
含有する培地に接種し，好気的に発育させることによ
り，Ｑ１２７１３化合物を含む培養物が得られる。栄養
物としては，微生物の栄養源として公知のものを使用す
ればよい。たとえば市販されているペプトン，肉エキ
ス，コーン・スティーブリカー，綿実粉，落花生粉，大
豆粉，酵母エキス，ＮＺ−アミン，カゼインの水解物，
魚粉，硝酸ソーダー，硝酸アンモニウム等の無機または
有機の窒素源，市販されている糖蜜，澱粉，デキストリ
ン，蔗糖，グルコース，マルトース，フラクトース，キ
シロース，ラムノース，マンニトール，グリセリン等の
炭水化物あるいは脂肪等の炭素源が使用できる。また金
属塩として，Ｎａ，Ｋ，Ｍｇ，Ｃａ，Ｚｎ，Ｆｅ等の硫
酸塩，塩酸塩，硝酸塩，燐酸塩，炭酸塩等が必要に応じ
て添加される。さらに必要に応じてバリン，ロイシン，
イソロイシン，スレオニン，フェニルアラニン，トリプ
トファン，メチオニン，リジン，アルギニン，システイ
ン，シスチン等の他，通常知られているアミノ酸類や，
オレイン酸メチル，ラード油，シリコン油，界面活性剤
等のＱ１２７１３物質生成促進物質または消泡剤が適宜
使用される。これらのもの以外でも，該生産菌が利用
し，Ｑ１２７１３物質の生産に役立つものであれば何れ
でも使用することができる。培養法としては，一般の放
射菌の生産方法と同様に行えばよく，その培養方法は固
体培養でも液体培養でもよい。液体培養の場合は静置培
養，撹拌培養，振盪培養等のいずれを実施してもよい
が，特に通気撹拌培養が好ましい。また，培養温度は生
産菌が発育し，Ｑ１２７１３物質を生産する温度，すな
わち２０℃〜４５℃の範囲で適宜変更出来るが，およそ
２８℃が好ましい。培地のｐＨは４〜９の範囲で適宜変
更できるが，できればｐＨ６〜８が好ましい。培養時間
は種々の条件によって異なり，１０時間〜１６８時間で
あるが，通常２４時間〜１２０時間程度で培養液中に蓄
積される目的化合物が最高力価に達する。Culture Method and Collection Method of Q12713 Substance A culture containing the Q12713 compound can be obtained by inoculating Actinomadura sp. Q12713 strain into a medium containing a nutrient source and aerobically growing. As the nutrients, those known as nutrient sources for microorganisms may be used. For example, commercially available peptone, meat extract, corn steep liquor, cottonseed flour, peanut flour, soybean flour, yeast extract, NZ-amine, casein hydrolyzate,
Inorganic or organic nitrogen sources such as fish meal, sodium nitrate and ammonium nitrate, commercially available molasses, starch, dextrin, sucrose, glucose, maltose, fructose, xylose, rhamnose, mannitol, glycerol and other carbohydrates or fats and other carbon sources Can be used. Further, as metal salts, sulfates such as Na, K, Mg, Ca, Zn, and Fe, hydrochlorides, nitrates, phosphates, carbonates, etc. are added as necessary. If necessary, valine, leucine,
Isoleucine, threonine, phenylalanine, tryptophan, methionine, lysine, arginine, cysteine, cystine, and other commonly known amino acids,
A Q12713 substance production-promoting substance such as methyl oleate, lard oil, silicone oil, or a surfactant or a defoaming agent is appropriately used. Other than these, any one can be used as long as it can be used by the producing bacterium and is useful for the production of the Q12713 substance. The culturing method may be the same as the method for producing a general radiobacterium, and the culturing method may be solid culture or liquid culture. In the case of liquid culture, any of static culture, stirring culture, shaking culture and the like may be carried out, but aeration stirring culture is particularly preferable. The culturing temperature can be appropriately changed within the range of 20 ° C to 45 ° C, that is, the temperature at which the producing bacterium grows to produce the Q12713 substance, which is preferably 28 ° C. The pH of the medium can be appropriately changed within the range of 4 to 9, but pH 6 to 8 is preferable if possible. The culture time varies depending on various conditions and is 10 hours to 168 hours. Usually, the target compound accumulated in the culture solution reaches the highest titer in about 24 hours to 120 hours.

【００２３】培養物から目的とする化合物を採取するに
は，微生物の生産する代謝産物に用いる通常の抽出，分
離，精製の手段が適宜利用される。培養液中の目的化合
物は培養液をそのままか，又は遠心分離あるいは培養液
に濾過助剤を加え濾過して得られた培養濾液に，酢酸エ
チル，クロロホルム，ベンゼン，トルエン等の水と混和
しない有機溶媒を加えて抽出する。また培養濾液を適宜
の担体に接触させ，濾液中の目的化合物を吸着させ，次
いで適当な溶媒で溶出する事により目的化合物を抽出す
る事ができる。更に詳しく述べるならば，例えばアンバ
ーライトＸＡＤ−２，ダイヤイオンＨＰ２０，ダイヤイ
オンＣＨＰ２０ＰまたはダイヤイオンＳＰ９００のごと
き多孔性吸着樹脂に接触させて目的化合物を吸着させ
る。ついでメタノール，エタノール，アセトン，アセト
ニトリル等の有機溶剤と水の混合液を用いて目的物を溶
出させる。この時の溶媒の混合比は，目的化合物が最も
効率よく溶出しうる値にすることはいうまでもない。す
なわち溶媒比率を低濃度より段階的，または連続的に高
濃度まで上げて行くことにより，目的化合物の含まれる
比率の，より高い画分を得ることが出来る。酢酸エチ
ル，クロロホルム等の有機溶媒で抽出する場合には培養
濾液にこれらの溶媒を加え，よく振盪し，目的化合物を
抽出する。つぎに上記の各操作法を用いて得られた目的
化合物含有画分は常用の吸着担体，例えば活性炭，アル
ミナ，シリカゲル，セルロース等を担体に用いたカラム
クロマトグラフィーや，シリカゲル系ＯＤＳ逆相担体の
カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等の常法に
より，更に純粋に分離精製することができる。In order to collect the desired compound from the culture, the usual means for extraction, separation and purification used for metabolites produced by microorganisms are appropriately used. The target compound in the culture solution is an organic compound that is immiscible with water, such as ethyl acetate, chloroform, benzene, and toluene, in the culture filtrate obtained by filtering the culture solution as it is or by centrifuging or adding a filter aid to the culture solution. Extract by adding a solvent. Further, the target compound can be extracted by bringing the culture filtrate into contact with an appropriate carrier to adsorb the target compound in the filtrate and then eluting with a suitable solvent. More specifically, the target compound is adsorbed by contacting it with a porous adsorption resin such as Amberlite XAD-2, Diaion HP20, Diaion CHP20P or Diaion SP900. Then, the target substance is eluted with a mixed solution of water with an organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, or acetonitrile. Needless to say, the mixing ratio of the solvent at this time is set to a value at which the target compound can be most efficiently eluted. That is, by increasing the solvent ratio stepwise or continuously from a low concentration to a high concentration, it is possible to obtain a fraction having a higher ratio of the target compound. When extracting with an organic solvent such as ethyl acetate or chloroform, add these solvents to the culture filtrate and shake well to extract the target compound. Next, the fraction containing the target compound obtained by each of the above-mentioned operation methods is subjected to column chromatography using a conventional adsorption carrier such as activated carbon, alumina, silica gel, cellulose, or a silica gel-based ODS reverse phase carrier. Further pure separation and purification can be carried out by a conventional method such as high performance liquid chromatography using a column.

【００２４】以上，Ｑ１２７１３物質の製造法について
説明したが，以下に実施例により更に具体的に説明す
る。The method for producing the Q12713 substance has been described above, but it will be described more specifically below with reference to Examples.

【実施例】グルコース１．０％，ポテトスターチ２．０
％，酵母エキス０．５％，ポリペプトン０．５％，炭酸
カルシウム０．４％を含む培地（ｐＨ７．０）を作成
し，これを５００ｍｌの三角フラスコに各６０ｍｌずつ
分注し，１２０℃で２０分間滅菌したものを種培地と
し，これにベネット寒天上によく生育させたアクチノマ
デュラ エスピー Ｑ１２７１３株の菌糸をかき取って
接種し，２８℃で９６時間振盪培養を行ない，種培養液
とした。Example: Glucose 1.0%, potato starch 2.0
%, Yeast extract 0.5%, polypeptone 0.5%, calcium carbonate 0.4%, a medium (pH 7.0) was prepared, and 60 ml of each was dispensed into a 500 ml Erlenmeyer flask at 120 ° C. What was sterilized for 20 minutes was used as a seed medium, and the mycelia of Actinomadura sp. Q12713 strain well grown on Bennett's agar were scraped and inoculated, and shake culture was performed at 28 ° C for 96 hours to obtain a seed culture solution.

【００２５】つぎに本培養は，ポテトスターチ１．０
％，ポリペプトン１．０％，ローストホイートジャーム
０．５％，コプラミール１．０％，キャロットミール
０．５％，炭酸カルシウム０．１５％を含む培地（ｐＨ
７．０）を作成し，これを５００ｍｌの三角フラスコ５
０本に各１００ｍｌずつ分注し，１２０℃で２０分間滅
菌しておいた。これに上記種培養液４ｍｌを各フラスコ
に接種し，２８℃で１２０時間培養した。Next, the main culture was carried out with potato starch 1.0.
%, Polypeptone 1.0%, roasted wheat germ 0.5%, copra meal 1.0%, carrot meal 0.5%, calcium carbonate 0.15% (pH)
7.0) was prepared, and this was added to a 500 ml Erlenmeyer flask 5
100 ml of each was dispensed into 0 bottles and sterilized at 120 ° C. for 20 minutes. 4 ml of the seed culture solution was inoculated into each flask and cultured at 28 ° C. for 120 hours.

【００２６】培養液を濾過により菌体を除去し，３．７
リットルの濾液を得た。この濾液をｐＨ７．０に調整
し，酢酸エチル４リットルで２回抽出し酢酸エチル層を
無水硫酸ナトリウムにより脱水し，その濾液を減圧濃縮
し２６１ｍｇの褐色油状物質を得た。薄層シリカゲルク
ロマトグラフィー｛Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ_２５４
（メルク社製）｝に供する。酢酸エチル：メタノール＝
９：１で展開，溶出する。活性画分を集めて減圧濃縮す
ると６５．３ｍｇの活性物質Ａが得られる。The culture solution was filtered to remove the bacterial cells, and 3.7
1 liter of filtrate was obtained. The filtrate was adjusted to pH 7.0, extracted twice with 4 liters of ethyl acetate, the ethyl acetate layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate, and the filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain 261 mg of a brown oily substance. Thin layer silica gel chromatography {Kieselgel 60F ₂₅₄
(Manufactured by Merck)}. Ethyl acetate: Methanol =
Deploy and elute at 9: 1. The active fractions are collected and concentrated under reduced pressure to obtain 65.3 mg of active substance A.

【００２７】これをシリカゲルカラムクロマトグラフィ
ーに供する。まずクロロホルム２０ｍｌ，次いでクロロ
ホルム：メタノール＝９９：１からクロロホルム：メタ
ノール＝９０：１０のグラジエント溶出を行い活性画分
を集め減圧濃縮して２９ｍｇの活性物質を得る。この活
性物質を，あらかじめ０．５Ｍのリン酸バッファー（ｐ
Ｈ４．２）でシリカゲルプレート（Ｋｉｅｓｉｌｇｅｌ
６０Ｆ_２５４メルク社製）を処理し，活性化（１２０
℃，３０分）したプレートに供し，クロロホルム：メタ
ノール＝９：１水飽和溶液で展開，溶出する。活性画分
を集めて減圧濃縮すると２０．２ｍｇの活性物質が得ら
れた。This is subjected to silica gel column chromatography. First, 20 ml of chloroform and then a gradient elution of chloroform: methanol = 99: 1 to chloroform: methanol = 90: 10 are performed, and active fractions are collected and concentrated under reduced pressure to obtain 29 mg of an active substance. This active substance was previously added to 0.5 M phosphate buffer (p
H4.2) silica gel plate (Kiesilgel)
60F ₂₅₄ manufactured by Merck Ltd. is treated and activated (120
(30 ° C., 30 minutes), and develop and elute with a chloroform: methanol = 9: 1 water saturated solution. The active fractions were collected and concentrated under reduced pressure to obtain 20.2 mg of active substance.

【００２８】この活性物質を高速液体クロマトグラフィ
ー（ジーエルサイエンス社製，Ｉｎｅｒｔｓｉｌ Ｐｒ
ｅｐ ＯＤＳ ２０ｍｍφ×２５０ｍｍ）に供する。８
０％アセトニトリルを移動相として１０ｍｌ／分の流速
で溶出する。９．９分及び１２．３分にみられる活性ピ
ークを分取し，減圧濃縮して，それぞれＱ１２７１３Ａ
（９．９分）０．１５ｍｇ及びＱ１２７１３Ｂ（１２．
３分）２．１３ｍｇを得た。これらの物質は，ＨＰＬＣ
及びＮＭＲの挙動から互変異性体であると考えられる。
本物質の理化学性状を以下に示す。This active substance was analyzed by high performance liquid chromatography (Inertsil Pr manufactured by GL Sciences Inc.).
ep ODS 20 mmφ × 250 mm). 8
Elute with 0% acetonitrile as the mobile phase at a flow rate of 10 ml / min. The activity peaks at 9.9 minutes and 12.3 minutes were collected and concentrated under reduced pressure to obtain Q12713A, respectively.
(9.9 min) 0.15 mg and Q12713B (12.
3 minutes) 2.13 mg was obtained. These substances are
And the behavior of NMR, it is considered to be a tautomer.
The physicochemical properties of this substance are shown below.

【００２９】融点 ：１５２〜１５６℃ 〔α〕^２０ _Ｄ ：−４９．７℃（Ｃ０．１，ＭｅＯＨ） 分子量 ：ＦＡＢ ＭＳ ｍ／ｚ ８９４（Ｍ−
Ｈ）⁻ ＩＲ ：図１^１ Ｈ−ＮＭＲ：図２^１３ Ｃ−ＮＭＲ：図３Melting point: 152-156 ° C. [α] ²⁰ _D : -49.7 ° C. (C0.1, MeOH) Molecular weight: FAB MS m / z 894 (M-
^H) - IR: FIG ^{1 1} H-NMR: FIG ² 13 C-NMR: FIG

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】Ｑ１２７１３物質の赤外線吸収スペクトルを示
す。FIG. 1 shows an infrared absorption spectrum of Q12713 substance.

【図２】Ｑ１２７１３物質の^１Ｈ−核磁気共鳴スペクト
ルを示す。FIG. 2 shows a ¹ H-nuclear magnetic resonance spectrum of a Q12713 substance.

【図３】Ｑ１２７１３物質の^１３Ｃ−核磁気共鳴スペク
トルを示す。FIG. 3 shows a ¹³ C-nuclear magnetic resonance spectrum of a Q12713 substance.

【図４】Ｑ１２７１３物質の高速液体クロマトグラフィ
ーによる溶出パターンを示す。FIG. 4 shows an elution pattern of Q12713 substance by high performance liquid chromatography.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 5/08 8018−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡ Ａ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:03） (72)発明者 小河原 宏 東京都文京区湯島２−33−９ (72)発明者 東 恭一郎 神奈川県川崎市高津区二子84 エステート タマ205 (72)発明者 田中 幸一 東京都中野区本町１−30−３ (72)発明者 永井 浩二 東京都板橋区蓮根３−16−１ 山之内製薬 株式会社蓮根寮 (72)発明者 清水 靖代 東京都国立市富士見台２一１−30 国立社 宅２−102 (72)発明者 リャン スー ファン 中華人民共和国 シャンハイ市200031 ユ ーヤンロード 319 シャンハイ インス チテュート オブ マテリア メディカ アカデミア シニカ 内 (72)発明者 ワン フー チン 中華人民共和国 シャンハイ市200031 ユ ーヤンロード 319 シャンハイ インス チテュート オブ マテリア メディカ アカデミア シニカ 内 (72)発明者 ツァン ウェイ ウェン 中華人民共和国 シャンハイ市200031 ユ ーヤンロード 319 シャンハイ インス チテュート オブ マテリア メディカ アカデミア シニカ 内 (72)発明者 リュー チャー ウェイ 中華人民共和国 シャンハイ市200031 ユ ーヤンロード 319 シャンハイ インス チテュート オブ マテリア メディカ アカデミア シニカ 内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁵ Identification code Internal reference number FI Technical display location // C07K 5/08 8018-4H C12P 21/02 ZNA A 8214-4B (C12P 21/02 C12R 1 : 03) (72) Inventor Hiroshi Ogawara 2-33-9 Yushima, Bunkyo-ku, Tokyo (72) Inventor Kyoichiro Higashi 84 Futako, Takatsu-ku, Kawasaki-shi, Kanagawa 84 Estate Tama 205 (72) Inventor Koichi Tanaka Honcho, Nakano-ku, Tokyo 1-30-3 (72) Inventor Koji Nagai 3-16-1 Hasune, Itabashi-ku, Tokyo Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. Hasune Dormitory (72) Inventor Yasuyo Shimizu 21-11 Fujimidai, Kunitachi, Tokyo 2 −102 (72) Inventor Liangsu Fan Shanghai, China 200031 Yu Yang Road 319 Shanghai Institute of Materia Medica In Cademia Sinica (72) Inventor Wang Fu Ching Shanghai 200031 Yuyang Road 319 Shanghai Institut Of Materia Medica In Academia Sinica (72) Inventor Tsang Wei Wen People's Republic Of Shanghai 200031 Yuyang Road 319 Shanghai Inchi Materia Medica Academia Sinica (72) Inventor Leucha Way People's Republic of China Shanghai City 2000 31 Yu Yang Road 319 Shanghai Institute of Materia Medica Academia Sinica

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 つぎの理化学的性状によって特徴づけら
れるＱ１２７１３物質を有効成分として含有するフォス
フォリパーゼＣ阻害剤 融点 ：１５２〜１５６℃ 分子量 ：ＦＡＢ ＭＳ ｍ／ｚ ８９４ （Ｍ−Ｈ）
⁻ 比旋光度：〔α〕^２０ _Ｄ＝−４９．７°（Ｃ＝０．１，
メタノール） 赤外線吸収スペクトル ：図１のとうり^１ Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：図２のとうり^１３ Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：図３のとうり1. A phospholipase C inhibitor containing, as an active ingredient, a Q12713 substance characterized by the following physicochemical properties: Melting point: 152-156 ° C. Molecular weight: FAB MS m / z 894 (MH)
^- Specific rotation: [α] _{^{20 D = -49.7 ° (C =}} 0.1,
Methanol) Infrared absorption spectrum: Tori ^{1 in} FIG. 1 H-nuclear magnetic resonance spectrum: Tori ^{13 in} FIG. 2 C-Nuclear magnetic resonance spectrum: Tori in FIG.