JPH05271091A - Cytopenia-improving agent - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide the subject medicinal agent containing interleukin-1alpha or its derivative as an active ingredient and capable of stimulating the multiplication and differentiation of undifferentiated hematinic cell precursors to remarkably promote the restoration of erythroid cells. CONSTITUTION:The objective medicinal agent contains a compound selected from interleukin-1alpha (IL-1alpha) and its derivatives as an active ingredient. The IL-1alpha is obtained e.g. by forming such a recombinant DNA that a gene coding the IL-1alpha can be expressed in a host cell, introducing the recombinant DNA into a vector, transforming the host cell with the vector and subsequently culturing the transformant to express the IL-1alpha. A mild method such as an osmotic pressure shock method is preferable as a method for extracting the IL-1alpha from the host cell from a viewpoint for holding its high order structure. The medicinal agent is preferably administered so that the dose of the active ingredient is 0.01mug to 10 mg per adult a day.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は血球減少改善剤に関す
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an agent for improving cytopenia.

【０００２】[0002]

【従来技術とその課題】本発明者らは、従来よりインタ
ーロイキン−１（ＩＬ−１）につき、医薬分野での応用
のための薬理作用を主として、その遺伝子組換え技術に
従う誘導体の開発をも含めて、鋭意検討を重ねてきた結
果、上記ＩＬ−１αがその本来の生物活性であるＬＡＦ
活性や、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロ
ン（ＩＦＮ）等のサイトカイン（cytokine）類の産生促
進活性等に基づいて、免疫刺激剤、抗腫瘍剤、抗炎症剤
等の医薬品として有用であるに加えて、血小板減少症治
療剤（特開平２−１３８２２４号公報）、ＩＬ−６産生
誘導剤（特開平３−１９７４３３号公報）、肝炎予防及
び治療剤（特願昭２−２１２９４１号）等としても有効
であることを見出した。PRIOR ART AND PROBLEMS The present inventors have heretofore developed a derivative of interleukin-1 (IL-1) mainly for its pharmacological action for application in the pharmaceutical field and according to its gene recombination technology. As a result of intensive studies including the above, the above-mentioned IL-1α is LAF whose original biological activity is LAF.
In addition to its usefulness as a drug such as an immunostimulant, an antitumor agent, an anti-inflammatory agent, etc. based on its activity and the activity of promoting the production of cytokines such as colony stimulating factor (CSF) and interferon (IFN) As a therapeutic agent for thrombocytopenia (JP-A-2-138224), an IL-6 production inducer (JP-A-3-197433), hepatitis preventive and therapeutic agent (Japanese Patent Application No. 2-212941), etc. It was found to be effective.

【０００３】之等ＩＬ−１αの医薬用途は、いずれもＩ
Ｌ−１αに固有の生物活性に基づくものと考えられる
が、それら相互の関連性については、現在尚解明されて
いない現状にある。The pharmaceutical uses of IL-1α are all I
Although it is considered to be based on the biological activity specific to L-1α, the mutual relationship between them is still unknown at present.

【０００４】本発明者らは更に引き続き鋭意研究を重ね
た結果、上記ＩＬ−１αが、それに個有の各種造血因子
の産生誘導作用及び造血幹細胞刺激活性（分化初期段階
の造血前駆細胞を活性化して造血因子に対する反応性を
誘導する作用）に基づいて、血球減少の改善作用を発揮
するという新しい事実を見出した。本発明はこの事実の
発見に基づき完成されたものである。As a result of further intensive studies conducted by the present inventors, the above-mentioned IL-1α has an action of inducing the production of various hematopoietic factors unique thereto and a hematopoietic stem cell stimulating activity (activating hematopoietic progenitor cells in the early stage of differentiation). The present inventors have found a new fact that it exerts an ameliorating action on cytopenia based on the action of inducing reactivity to hematopoietic factors. The present invention has been completed based on the discovery of this fact.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】即ち、本発明はＩＬ−１
α及びその誘導体から選ばれる少なくとも１種を有効成
分として含有することを特徴とする血球減少改善剤に係
わる。That is, the present invention relates to IL-1.
The present invention relates to a cytopenia-improving agent containing at least one selected from α and its derivatives as an active ingredient.

【０００６】本発明の血球減少改善剤は、上記の通りＩ
Ｌ−１α及びその誘導体を有効成分とすることを必須の
要件とし、これに基いて顕著な血球減少改善作用を発揮
し、かくして血球減少改善剤として医薬分野で非常に有
効である。The cytopenia-improving agent of the present invention is as described above.
It is essential to use L-1α and its derivative as an active ingredient, and based on this, a remarkable cytopenic effect is exhibited, and thus it is very effective in the pharmaceutical field as a cytopenic agent.

【０００７】しかして、従来ＩＬ−１α及びその誘導体
がＬＡＦ活性；腫瘍細胞増殖抑制活性（ＧＩＦ活性）；
ＣＳＦ、ＩＦＮ、インターロイキン２（ＩＬ−２）、イ
ンターロイキン３（ＩＬ−３）等の種々のサイトカイン
類の産生促進活性；抗炎症活性；放射線障害防止作用等
を有することは知られているが、之等が血球減少の改善
効果を有することは報告がなく、勿論この血球減少改善
効果と上記公知の各種作用との関連性についても何ら報
告はない。However, conventional IL-1α and its derivatives have LAF activity; tumor cell growth inhibitory activity (GIF activity);
Although it is known to have a production promoting activity for various cytokines such as CSF, IFN, interleukin 2 (IL-2) and interleukin 3 (IL-3); anti-inflammatory activity; , And the like have not been reported to have an effect of improving cytopenia, and of course, there is no report on the relationship between the effect of improving cytopenia and the above-mentioned various known actions.

【０００８】本発明改善剤の有効成分とするＩＬ−１α
とは、ＬＡＦ（Lymphocyte Activating Factor）活性を
有するポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列から
同定された１５９個のアミノ酸配列を有するＩＬ−１α
（Proc. Natl. Acad. Sci.,Vol. 81,7907-7911 (198
4)；Nature, Vol.315, 641 (1985) ；Nucleic Acid Res
earch, Vol.13, (16) 5869 (1985) 等参照）を意味す
る。これはその産生細胞から通常の方法により抽出、単
離される天然型であってもよく、また遺伝子工学的手法
により得られる組換え型であってもよい。IL-1α as an active ingredient of the improving agent of the present invention
Means IL-1α having a 159 amino acid sequence identified from the nucleotide sequence of a gene encoding a polypeptide having LAF (Lymphocyte Activating Factor) activity.
(Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 81, 7907-7911 (198
4); Nature, Vol. 315, 641 (1985); Nucleic Acid Res
earch, Vol. 13, (16) 5869 (1985), etc.). This may be a natural type extracted and isolated from the producing cell by a usual method, or a recombinant type obtained by a genetic engineering technique.

【０００９】また上記ＩＬ−１αの誘導体には、各種の
ものが含まれ、その代表例としては本願人らの先の出願
に係わる各種のアミノ酸配列を有するＩＬ−１α誘導体
が包含される（特開平２−１６７２９８号公報、欧州特
許公開１８７９９１号等参照）。The above-mentioned derivatives of IL-1α include various ones, and representative examples thereof include IL-1α derivatives having various amino acid sequences according to the applicant's earlier application (special features). See Kaihei 2-167298, European Patent Publication No. 187991, etc.).

【００１０】上記ＩＬ−１α誘導体としては、より詳し
くは１５９個のアミノ酸配列からなる天然型ＩＬ−１α
の該アミノ酸配列の３６位Asn 及び１４１位Cys の少な
くとも一つのアミノ酸残基が欠失されているか又は他の
アミノ酸残基で置換されている改変されたアミノ酸配列
を有する誘導体を例示できる。該ＩＬ−１α誘導体に
は、上記改変されたアミノ酸配列を有するＩＬ−１α誘
導体アミノ酸配列を更に改変して、その１６位Arg が欠
失されていること、該１６位Arg が他のアミノ酸残基で
置換されていること、１位Ser から１４位Phe に至るア
ミノ酸配列が欠失されていること及び１位Ser から１５
位Met に至るアミノ酸配列が欠失されていることから選
ばれる条件の少なくとも１つを充足させたアミノ酸配列
を有する誘導体が包含される。More specifically, the IL-1α derivative is a naturally-occurring IL-1α consisting of a 159 amino acid sequence.
A derivative having a modified amino acid sequence in which at least one amino acid residue of Asn at position 36 and Cys at position 141 of the amino acid sequence is deleted or is substituted with another amino acid residue. In the IL-1α derivative, the IL-1α derivative amino acid sequence having the above-mentioned modified amino acid sequence is further modified so that the 16th position Arg is deleted, and the 16th position Arg is another amino acid residue. Is substituted with, the amino acid sequence from Ser at position 1 to Phe at position 14 is deleted, and from Ser at position 15 to 15
A derivative having an amino acid sequence satisfying at least one of the conditions selected from the fact that the amino acid sequence up to the Met position is deleted is included.

【００１１】上記及び以下の本明細書におけるアミノ酸
及びポリペプチドの表示は、ＩＵＰＡＣ及びＩＵＰＡＣ
−ＩＵＢによる命名法又は規則における略号乃至当該分
野で慣用されている略号による表示法に従うものとす
る。The designations of amino acids and polypeptides herein above and below refer to IUPAC and IUPAC.
-The abbreviations in the IUB nomenclature or rules or the abbreviations commonly used in the art shall be followed.

【００１２】上記改変を行ない得る他のアミノ酸残基と
しては、特に好ましくは、例えば１６位Arg の場合はGl
y を、３６位Asn の場合はAsp を、１４１位置Cys の場
合はSer をそれぞれ例示できる。The other amino acid residue which can be modified is particularly preferably Gl in the case of Arg at position 16, for example.
Examples of y include Asp in the 36-position Asn, and Ser in the 141-position Cys.

【００１３】本発明改善剤において有効成分とする各種
のＩＬ−１α誘導体は、前記した各公報等に記載される
ように公知であり、一般的な遺伝子工学的手法により、
即ち、前記特定のポリペプチドをコードする遺伝子（以
下「目的遺伝子」という）を利用して、該目的遺伝子が
宿主細胞中で発現できるような組換えＤＮＡを作成し、
これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体の
培養によって、上記目的遺伝子を複製、転写、翻訳、発
現させることにより製造できる。Various IL-1α derivatives as active ingredients in the improving agent of the present invention are known as described in the above-mentioned publications and the like, and by a general genetic engineering method,
That is, a gene encoding the specific polypeptide (hereinafter referred to as "target gene") is used to prepare a recombinant DNA capable of expressing the target gene in a host cell,
It can be produced by introducing this into a host cell to transform it, and culturing the transformant to replicate, transcrib, translate, and express the above-mentioned target gene.

【００１４】該製造法において用いられる遺伝子は、例
えばホスファイト トリエステル法（Nature, 310, 105
(1984) ）等の常法に従い、核酸の化学合成により全合
成することもできるが、ＩＬ−１もしくはその前駆体を
コードする遺伝子を利用して合成するのが簡便であり、
例えば該遺伝子より上記化学合成手段を含む常法に従
い、前記特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列に改
変すること等により容易に製造できる。ＩＬ−１α又は
その前駆体をコードする遺伝子としては公知のものをい
ずれも利用できる（例えば特開昭６２−１７４０２２号
公報参照）。上記核酸（塩基）配列の改変操作も公知方
法に従えばよく、目的とするポリペプチドのアミノ酸配
列に応じて実施される（遺伝子工学的手法としては、例
えばMolecular Cloning Cold Spring Harbor Laborator
y (1982)参照）。The gene used in the production method is, for example, the phosphite triester method (Nature, 310, 105).
(1984)) or the like, it can be totally synthesized by chemical synthesis of nucleic acid, but it is convenient to synthesize it using a gene encoding IL-1 or its precursor,
For example, the gene can be easily produced by modifying the nucleic acid sequence encoding the specific amino acid sequence according to a conventional method including the above-mentioned chemical synthesis means. Any known gene can be used as a gene encoding IL-1α or its precursor (see, for example, JP-A-62-174022). The modification operation of the nucleic acid (base) sequence may be carried out according to a known method, and is carried out according to the amino acid sequence of the desired polypeptide (as a genetic engineering method, for example, Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laborator
y (1982)).

【００１５】上記形質転換体の創製に当り、宿主細胞と
しては、真核生物及び原核生物のいずれをも利用でき、
該真核生物の細胞には脊椎動物、酵母等の細胞が含ま
れ、脊椎動物細胞としては、例えばサルの細胞であるＣ
ＯＳ細胞（Y. Gluzman, Cell,23, 175-182 (1981)）や
チヤイニーズ・ハムスター卵巣細胞のジヒドロ葉酸レダ
クターゼ欠損株（G. Urlaub and L. A. Chasin, Proc.
Natl. Acad. Sci., U.S.A., 77, 4216-4220 (1980)）等
がよく用いられるがこれらに限定はされない。脊椎動物
細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺
伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライ
ス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有
するものを使用でき、これは更に必要により複製起源を
保有していてもよい。該発現ベクターの例としては、Ｓ
Ｖ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２dhfr（S.
Subramani, R. Mulligan and P. Berg, Mol. Cell. Bi
ol.,1, (9), 854-864(1981)）等を例示できるがこれに
限定されない。また、真核微生物としては酵母が一般に
よく用いられ、その中でもサッカロミセス属酵母を有利
に利用できる。該酵母等の真核微生物の発現ベクターと
しては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロ
モーターを持つｐＡＭ８２（A. Miyanohara etal., Pro
c. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 80, 1-5 (1983)）等を
好ましく利用できる。In creating the above transformant, either a eukaryote or a prokaryote can be used as a host cell,
The eukaryotic cells include cells such as vertebrates and yeasts, and examples of the vertebrate cells include monkey cells such as C
Dihydrofolate reductase-deficient strains of OS cells (Y. Gluzman, Cell, 23 , 175-182 (1981)) and Chinese hamster ovary cells (G. Urlaub and LA Chasin, Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 77 , 4216-4220 (1980)) and the like are often used, but not limited thereto. As a vertebrate cell expression vector, a vector having a promoter located upstream of a gene to be expressed, an RNA splice site, a polyadenylation site, a transcription termination sequence and the like can be used. May be owned. Examples of the expression vector include S
PSV2dhfr (S.
Subramani, R. Mulligan and P. Berg, Mol. Cell. Bi
ol., 1 , (9), 854-864 (1981)) and the like, but are not limited thereto. Further, yeast is generally often used as a eukaryotic microorganism, and among them, yeast of the genus Saccharomyces can be advantageously used. Examples of the expression vector for eukaryotic microorganisms such as yeast include pAM82 (A. Miyanohara et al., Pro, which has a promoter for the acid phosphatase gene).
c. Natl. Acad. Sci., USA, 80 , 1-5 (1983)) and the like can be preferably used.

【００１６】原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌
が一般によく用いられ、例えば該宿主菌中で複製可能な
プラスミドベクターを用い、このベクター中に目的遺伝
子が発現できるように、該遺伝子の上流にプロモーター
及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、
更に蛋白合成開始に必要なＡＴＧを付与した発現プラス
ミドが使用できる。上記宿主菌としての大腸菌としては
エシエリヒア・コリ（Ｅscherichia coli ）Ｋ１２株等
がよく用いられ、ベクターとしては一般にｐＢＲ３２２
がよく用いられるが、これらに限定されず、公知の各種
の菌株及びベクターをいずれも利用できる。プロモータ
ーとしては、例えばトリプトファン・プロモーター、Ｐ
_L プロモーター、lac プロモーター、lpp プロモーター
等を使用でき、いずれの場合にも目的遺伝子を発現させ
得る。As a prokaryotic host, Escherichia coli and Bacillus subtilis are commonly used. For example, a plasmid vector capable of replicating in the host bacterium is used, and the target gene can be expressed in this vector upstream of the gene. And a promoter and SD (Shine and Dalgarno) nucleotide sequence,
Furthermore, an expression plasmid having ATG necessary for initiation of protein synthesis can be used. As Escherichia coli as the above-mentioned host bacterium, Escherichia coli K12 strain and the like are often used, and as a vector, pBR322 is generally used.
However, the present invention is not limited to these, and various known strains and vectors can be used. Examples of the promoter include tryptophan promoter, P
_L promoter, lac promoter, lpp promoter and the like can be used, and in any case, the target gene can be expressed.

【００１７】発現ベクターの宿主細胞への導入及びこれ
による形質転換の方法としては、一般に用いられている
方法、例えば主として対数増殖期にある細胞を集め、Ｃ
ａＣｌ₂ 処理して自然にＤＮＡを取り込みやすい状態に
して、ベクターを取込ませる方法等を採用できる。上記
方法においては、通常知られているように形質転換の効
率を一層向上させるためにＭｇＣｌ₂ やＲｂＣｌを培地
に更に共存させることもできる。また、宿主細胞をスフ
エロプラスト又はプロトプラスト化後に形質転換させる
方法も採用できる。As a method for introducing an expression vector into a host cell and transforming the host cell by the method, a generally used method is used, for example, cells in a logarithmic growth phase are mainly collected, and C
It is possible to employ a method in which a vector is incorporated by treating with aCl _{2 so} as to naturally incorporate DNA. In the above method, MgCl ₂ or RbCl can be further coexisted in the medium in order to further improve the efficiency of transformation, as is commonly known. Alternatively, a method of transforming host cells after forming spheroplasts or protoplasts can be adopted.

【００１８】所望の形質転換株は、常法に従い培養で
き、該培養により所望のポリペプチドが生産、蓄積され
る。該培養に用いられる培地は、通常の細胞培養に慣用
される各種の培地のいずれでもよく、その具体例として
は、例えばＬ培地、Ｅ培地、Ｍ９培地等及び之等に通常
知られている各種の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン
類等を添加した培地を例示できる。尚、上記トリプトフ
ァン・プロモーターを用いた場合には、一般に該プロモ
ーターが働くようにするためにカザミノ酸を添加した、
例えばＭ９最小培地を用いて培養することができ、該培
地中には培養の適当な時期にインドールアクリル酸等の
トリプトファン・プロモーターの働きを強めるための薬
剤を添加することもできる。The desired transformant can be cultured according to a conventional method, and the desired polypeptide is produced and accumulated by the culture. The medium used for the culture may be any of various types of medium commonly used for ordinary cell culture, and specific examples thereof include, for example, L medium, E medium, M9 medium and the like, and various types commonly known in the art. Examples of the medium include a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, vitamins and the like. When the tryptophan promoter is used, casamino acid is generally added to make the promoter work.
For example, M9 minimal medium can be used for culturing, and an agent for enhancing the function of the tryptophan promoter such as indoleacrylic acid can be added to the medium at an appropriate time during culturing.

【００１９】かくして得られる活性物を含有する培養物
からの目的ポリペプチド、即ち前記特定のＩＬ−１α誘
導体の精製、単離は常法に従い行ない得る。尚、該ポリ
ペプチドを宿主から抽出するに当っては、例えば浸透圧
ショック法等の温和な条件を採用するのがその高次構造
保持の面からより好ましい。Purification and isolation of the desired polypeptide, that is, the above-mentioned specific IL-1α derivative from the culture containing the thus obtained active substance can be carried out by a conventional method. In extracting the polypeptide from the host, it is preferable to use mild conditions such as osmotic shock method from the viewpoint of maintaining the higher order structure.

【００２０】上記精製、単離は、例えば当該ポリペプチ
ドの物理、化学的性質を利用した各種の処理操作に従い
実施できる（例えば「生化学データーブックII」pp1175
-1259 、第１版第１刷、1980年 6月23日、株式会社東京
化学同人発行参照）。該方法としては具体的には例えば
通常の蛋白沈澱剤による処理、限外濾過、分子ふるいク
ロマトグラフィー（ゲル濾過）、液体クロマトグラフィ
ー、遠心分離、電気泳動、アフィニティクロマトグラフ
ィー、透析法、之等の組合等を採用できる。The above purification and isolation can be carried out, for example, according to various processing operations utilizing the physical and chemical properties of the polypeptide (for example, "Biochemical Data Book II" pp1175).
-1259, 1st edition, 1st printing, June 23, 1980, issued by Tokyo Kagaku Doujin Co., Ltd.). Specific examples of the method include treatment with an ordinary protein precipitant, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), liquid chromatography, centrifugation, electrophoresis, affinity chromatography, dialysis method, and the like. Unions can be adopted.

【００２１】本発明の血球減少改善剤は、ＩＬ−１α及
びその誘導体を有効成分として含有させることを必須と
し、他は通常の医薬組成物と同様とすることができ、他
に薬理的有効成分や製剤上の慣用成分等を任意に配合
し、常法に従いその適用に適した薬理組成物形態に調製
される。The cytopenia-improving agent of the present invention is required to contain IL-1α and its derivative as an active ingredient, and can be the same as a usual pharmaceutical composition except for the pharmacologically active ingredient. Ordinarily used ingredients in preparations are arbitrarily mixed and prepared into a pharmaceutical composition form suitable for its application according to a conventional method.

【００２２】上記薬理組成物に配合できる他の成分とし
ては、特にＩＬ−１α活性物の安定化の面より、例えば
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等のアルブミン類や通常
のＬ−型アミノ酸、好ましくはシステイン、グリシン等
を例示できる。之等の添加量は、特に制限されるもので
はないが、ＩＬ−１α活性物１μｇ当りアルブミン類で
は約０．０１〜１０ｍｇ程度、アミノ酸は約０．００１
〜１０ｍｇ程度（２種以上のアミノ酸を併用する場合は
それらの合計量）とするのが適当である。また上記薬理
組成物には、更に必要に応じて、糖類例えばグルコー
ス、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マン
ニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコー
ル類、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキスト
ラン、ヒドロキシプロピルスターチ等の多糖等、好まし
くはショ糖、マルトース、マンニトール、イノシトー
ル、デキストラン等や、イオン性及び非イオン性界面活
性剤、就中ポリオキシエチレングリコールソルビタンア
ルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテ
ル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセ
リド系等の界面活性剤を配合することもできる。上記糖
類はＩＬ−１α活性物１μｇ当り約０．１ｍｇ程度以
上、好ましくは約１〜１００ｍｇ程度の範囲、界面活性
剤は同活性物１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度以上、
好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲で添加
されるのが適当である。Other components that can be added to the above-mentioned pharmaceutical composition include albumins such as human serum albumin (HSA) and ordinary L-type amino acids, preferably from the viewpoint of stabilizing IL-1α active substances. Examples include cysteine and glycine. Although the addition amount thereof is not particularly limited, about 0.01 to 10 mg of albumin and about 0.001 of amino acid are added per 1 μg of the IL-1α active substance.
It is suitable to be about 10 mg (total amount of two or more amino acids when used together). Further, in the above pharmaceutical composition, if necessary, further sugars such as glucose, mannose, galactose, monosaccharides such as fructose, mannitol, inositol, sugar alcohols such as xylitol, sucrose, maltose, disaccharides such as lactose, Dextran, polysaccharides such as hydroxypropyl starch, etc., preferably sucrose, maltose, mannitol, inositol, dextran, etc., ionic and nonionic surfactants, especially polyoxyethylene glycol sorbitan alkyl ester type, polyoxyethylene alkyl A surfactant such as an ether type, a sorbitan monoacyl ester type, a fatty acid glyceride type or the like may be blended. The above-mentioned saccharides are in the range of about 0.1 mg or more, preferably about 1 to 100 mg, per 1 μg of IL-1α active substance, and the surfactant is about 0.0001 mg or more per 1 μg of the same,
It is suitable to add in the range of about 0.001 to 0.1 mg.

【００２３】本発明改善剤の調製方法につき詳述すれ
ば、該改善剤は、一般に薬理有効量のＩＬ−１活性物
（ＩＬ−１α及びその誘導体）及び必要に応じ配合され
得る上記成分と共に、適当な医薬製剤担体を配合して製
剤組成物の形態に調製される。該製剤担体としては使用
形態に応じた製剤の調製に通常慣用される充填剤、増量
剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤等の賦形剤乃至希釈剤をい
ずれも使用できる。製剤組成物の形態は、これが有効成
分であるＩＬ−１活性物を効果的に含有する状態であれ
ば特に限定はなく、例えば錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤
等の固剤であってもよく、液剤、懸濁剤、乳剤等の注射
剤形態であってもよい。またこれは使用前に適当な担体
の添加により液状となし得る乾燥品とすることもでき
る。之等の製剤組成物はいずれも常法に従い調製され得
る。The method for preparing the improving agent of the present invention will be described in detail. The improving agent is generally a pharmacologically effective amount of IL-1 active substance (IL-1α and its derivative) and the above-mentioned components which can be optionally blended. It is prepared in the form of a pharmaceutical composition by mixing an appropriate pharmaceutical carrier. As the pharmaceutical carrier, any of fillers, fillers, binders, moisturizers, disintegrators, and other excipients or diluents that are commonly used for the preparation of pharmaceutical preparations depending on the form of use can be used. The form of the pharmaceutical composition is not particularly limited as long as it effectively contains the IL-1 active substance as an active ingredient, and for example, it is a solid formulation such as tablets, powders, granules and pills. Alternatively, it may be in the form of an injection such as a solution, suspension or emulsion. It may also be made into a dried product which can be made into a liquid by adding a suitable carrier before use. Each of these pharmaceutical compositions can be prepared according to a conventional method.

【００２４】尚、上記において担体として採用し得る緩
衝液としては、特に限定されるものではないが、例えば
クエン酸−リン酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナト
リウム、酢酸−酢酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム−
リン酸一ナトリウム、クエン酸−ホウ砂等のｐＨ４〜
８、より好ましくはｐＨ５〜６の各緩衝液を例示するこ
とができる。The buffer solution that can be used as the carrier in the above is not particularly limited, but for example, citric acid-sodium phosphate, citric acid-sodium citrate, acetic acid-sodium acetate, disodium phosphate. −
PH 4 of monosodium phosphate, citric acid-borax, etc.
8, and more preferably, each buffer solution having a pH of 5 to 6 can be exemplified.

【００２５】得られる医薬製剤は、該製剤組成物の形態
に応じた適当な投与経路、例えば注射剤形態の医薬製剤
は静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等により投
与され、固剤形態の医薬製剤は経口乃至は経腸投与され
得る。医薬製剤中の有効成分の量及び該製剤の投与量
は、該製剤の投与方法、投与形態、使用目的、之を適用
される患者の症状等に応じて適宜選択され一定ではない
が、通常有効成分を約０．００００１〜８０重量％程度
含有する製剤形態に調製して、この製剤をこれに含有さ
れる有効成分量が１日成人１人当り約０．０１μｇ〜１
０ｍｇ程度となる範囲で投与するのが望ましい。該投与
は１日１回である必要はなく１日３〜４回に分けること
もできる。The obtained pharmaceutical preparation is administered by a suitable administration route depending on the form of the pharmaceutical composition, for example, the pharmaceutical preparation in the form of injection is administered by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal administration, etc., The solid dosage form of the pharmaceutical preparation may be administered orally or enterally. The amount of the active ingredient in the pharmaceutical preparation and the dose of the preparation are appropriately selected depending on the administration method of the preparation, the dosage form, the purpose of use, the symptoms of the patient to which the preparation is applied, etc. The composition is prepared in a formulation form containing about 0.00001 to 80% by weight, and the formulation contains the active ingredient in an amount of about 0.01 μg to 1 per adult per day.
It is desirable to administer it within a range of about 0 mg. The administration does not have to be once a day and can be divided into 3 to 4 times a day.

【００２６】[0026]

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説
明する。尚、各例において生理活性は、特開平２−１６
７２９８号公報記載の方法により測定したものである。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to examples. In each case, the physiological activity is
It was measured by the method described in Japanese Patent No. 7298.

【００２７】また、ＩＬ−１α誘導体としては、ヨーロ
ッパ特許公開第２３７０７３号公報記載のプラスミドp
trp ＩＬ−１α−３６Ｄ・１４１Ｓ（これを保有する大
腸菌ＨＢ１０１株は、微工研に「Escherichia coli HB1
01/ IL-1α-36D 141S 」なる名称で微工研条寄第１２９
５号（ＦＥＲＭ ＢＰ１２９５）として寄託されてい
る）を利用して、同公開公報記載の方法により得られた
もの（以下「ＩＬ−１α［３６Ｄ・１４１Ｓ］」とい
う）を用いた。As the IL-1α derivative, the plasmid p described in European Patent Publication No. 237073 is used.
trp IL-1α-36D · 141S (Escherichia coli HB101 strain which carries this is referred to Escherichia coli HB1
01 / IL-1α-36D 141S ”
No. 5 (deposited as FERM BP1295) was used, and the one obtained by the method described in the publication (hereinafter referred to as “IL-1α [36D · 141S]”) was used.

【００２８】[0028]

【実施例１】血球減少改善剤の調製 ＩＬ−１α誘導体（ＩＬ−１α［３６Ｄ・１４１Ｓ］）
の生理食塩水溶液（ＧＩＦ活性として１×１０⁶ 単位／
ｍｌ）に、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を０．５％と
なるように添加して、濾過（０．２２μｍメンブランフ
ィルター使用）後、これを無菌的に１ｍｌずつバイアル
瓶に分注して、凍結乾燥し、注射用製剤を調整した。か
くして得られた製剤は、これを用時注射用蒸留水１ｍｌ
に溶解して利用される。Example 1 Preparation of cytopenicity improving agent IL-1α derivative (IL-1α [36D · 141S])
Saline solution (1 × 10 ⁶ units as GIF activity /
human serum albumin (HSA) to 0.5%, and after filtration (using a 0.22 μm membrane filter), 1 ml of this is aseptically dispensed into vials and frozen. Dried and conditioned for injection. The preparation thus obtained is 1 ml of distilled water for injection before use.
It is dissolved in and used.

【００２９】[0029]

【実施例２】 汎血球減少症モデルマウスに対するＩＬ
−１α誘導体の薬理効果試験 この例は、本発明血球減少改善剤有効成分化合物として
のＩＬ−１α及びその誘導体の汎血球減少症モデルマウ
スに対する効果を試験したものである。Example 2 IL for pancytopenia model mouse
1. Pharmacological effect test of -1α derivative In this example, the effect of IL-1α as an active ingredient compound of the cytopenicity-improving agent of the present invention and its derivative on pancytopenia model mice was tested.

【００３０】ＢＡＬＢ／ｃマウスに、６００Rad.のＸ線
を全身照射して汎血球減少症モデルマウスを作成し、該
マウス（１群４匹）にＸ線照射の翌日より、ＩＬ−１α
誘導体の１０μｇ／ｋｇ／日を連日７日間皮下投与し
た。BALB / c mice were whole-body irradiated with 600 Rads of X-rays to prepare pancytopenia model mice, and the mice (4 mice per group) were treated with IL-1α from the day after the X-ray irradiation.
10 μg / kg / day of the derivative was subcutaneously administered every day for 7 days.

【００３１】尚、対照としてＩＬ−１α誘導体投与に代
えて、従来より血球減少の改善作用を奏することが知ら
れているエリスロポエチン（ＥＰＯ、「エスポー」、三
共社製）の１００Ｕ／ｋｇ／日を連日１４日間皮下投与
した。As a control, 100 U / kg / day of erythropoietin (EPO, "Espo", manufactured by Sankyo Co., Ltd.), which has been known to have an effect of improving cytopenia, was used instead of IL-1α derivative administration. Subcutaneous administration was performed every day for 14 days.

【００３２】Ｘ線照射後、経日的に下大静脈より採血
し、末梢血血球数を自動血球計測装置（コールター社
製）により測定し、また網状赤血球数を、血液塗抹標本
を作成後、ブリリアント・クレシルブルー染色して、顕
微鏡下で測定した。更に骨髄及び脾臓中のＣＦＵ−Ｅ数
を、血漿凝縮塊法により３日間培養後、ベンチジン−ヘ
マトキシリン染色により測定し、ＣＦＵ−ＧＭ数及びＣ
ＦＵ−Ｍｅｇ数を軟寒天培養後、アセチルコリンエステ
ラーゼ、ヘマトキシリン染色により測定した。After X-ray irradiation, blood was collected daily from the inferior vena cava, peripheral blood blood cell count was measured by an automatic blood cell counter (manufactured by Coulter, Inc.), and reticulocyte count was prepared after preparing a blood smear. Brilliant Cresyl Blue was stained and measured under a microscope. Further, the CFU-E number in bone marrow and spleen was measured by benzidine-hematoxylin staining after culturing for 3 days by the plasma condensation mass method, and the CFU-GM number and C
The FU-Meg number was measured by acetylcholinesterase and hematoxylin staining after soft agar culture.

【００３３】コントロールとして溶媒投与群を作成し、
該群に対する有意差検定をｔ−検定により実施した
（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ
＜０．００１）。As a control, a solvent administration group was prepared,
A significant difference test for the group was performed by t-test (*: p <0.05, **: p <0.01, ***: p.
<0.001).

【００３４】供試薬剤投与スケジュールと共に、得られ
た結果を、図１及び図２に示す。The results obtained are shown in FIGS. 1 and 2 together with the reagent agent administration schedule.

【００３５】図１は経日的末梢血血球数変化を示す図
（縦軸：末梢血赤血球数、×１０⁶ ／ｍｍ³ 、横軸：Ｘ
線放射後日数、日）であり、図２は経日的網状赤血球数
変化を示す図（縦軸：網状赤血球数、％、横軸：Ｘ線放
射後日数、日）である。FIG. 1 is a graph showing changes in the peripheral blood blood cell count over time (vertical axis: peripheral blood red blood cell count, × 10 ⁶ / mm ³ , horizontal axis: X).
2 is a diagram showing changes in reticulocyte count over time (vertical axis: reticulocyte count,%, horizontal axis: days after X-ray radiation, day).

【００３６】上記各図より、ＩＬ−１の投与によれば、
Ｘ線照射１５日目より投与量依存的に赤血球数の著しい
回復促進効果が認められることが明らかである。From the above figures, according to the administration of IL-1,
From the 15th day of X-ray irradiation, it is clear that a remarkable recovery-promoting effect on the red blood cell count is observed in a dose-dependent manner.

【００３７】また、同時に調べられた大腿骨骨髄細胞及
び脾臓細胞中の有核細胞数とＣＦＵ−Ｅ数とから、上記
ＩＬ−１α誘導体投与による赤血球数の著しい増加は、
之等有核細胞数及びＣＦＵ−Ｅ数の増加に伴って認めら
れることが明らかとなった。之等の効果は、ＥＰＯの投
与に比べても遥かに有意であった。From the number of nucleated cells and the number of CFU-E in the bone marrow cells and spleen cells of the femur examined at the same time, a marked increase in the number of red blood cells due to the administration of the above IL-1α derivative was
It was clarified that it was observed as the number of nucleated cells and the number of CFU-E increased. These effects were much more significant than administration of EPO.

【００３８】更に、上記試験において、ＩＬ−１α誘導
体の投与と、ＥＰＯ１００Ｕ／ｋｇ／日）投与とを組合
せた場合、ＩＬ−１α誘導体の単独投与の場合と同様の
結果が得られた。Furthermore, in the above test, when the administration of the IL-1α derivative and the administration of EPO of 100 U / kg / day) were combined, the same result as the case of the single administration of the IL-1α derivative was obtained.

【００３９】以上の結果より、ＥＰＯでは充分な貧血改
善が得られないような重篤な骨髄障害を誘発したマウス
モデルにおいては、ＩＬ−１α誘導体が、未分化な造血
前駆細胞の増殖、分化を促進することによって、赤血球
系細胞の回復を顕著に促進することが明らかとなった。From the above results, in a mouse model inducing a serious bone marrow disorder in which EPO cannot sufficiently improve anemia, the IL-1α derivative causes the proliferation and differentiation of undifferentiated hematopoietic progenitor cells. It was revealed that the stimulation markedly promotes the recovery of erythroid cells.

【００４０】[0040]

【発明の効果】本発明によれば、血球減少改善剤を提供
することができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide an agent for improving cytopenia.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】実施例２に従い行なわれた汎血球減少症モデル
マウスに対するＩＬ−１α誘導体の薬理効果試験におけ
る経日的末梢血血球数変化を示す。FIG. 1 shows daily changes in peripheral blood cell count in a pharmacological effect test of an IL-1α derivative on a pancytopenia model mouse performed according to Example 2.

【図２】実施例２に従い行なわれた汎血球減少症モデル
マウスに対するＩＬ−１α誘導体の薬理効果試験におけ
る経日的網状赤血球数変化を示す。FIG. 2 shows daily reticulocyte count changes in a pharmacological effect test of an IL-1α derivative on a pancytopenia model mouse performed according to Example 2.

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】インターロイキン−１α及びその誘導体か
ら選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有するこ
とを特徴とする血球減少改善剤。1. A cytopenic agent comprising at least one selected from interleukin-1α and its derivatives as an active ingredient. 【請求項２】インターロイキン−１α誘導体がヒト組換
え型ＩＬ−１α［３６Ｄ・１４１Ｓ］である請求項１に
記載の血球減少改善剤。2. The cytopenia-improving agent according to claim 1, wherein the interleukin-1α derivative is human recombinant IL-1α [36D · 141S].