JPH05268980A - Production of antibody and antibody-compounded dental caries-preventing agent - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain an anti-rPAc antibody useful as a dental caries-preventing agent, etc., by immunizing a mammalian, etc., with a specific rPAc antigen. CONSTITUTION:A mammalian or bird is immunized with the protein antigen (hereinafter referred to as rPAc) obtained from a microorganism [e.g. Streptococcus mutans GS-5 (K-3) (FERM P2437)] recombined with the gene of a protein antigen (hereinafter referred to as rPAc) having mol.wt. of approximately 190000 and existing in the surface layer of the S. mutans. The anti-rPAc antibody is obtained from the immunized mammalian or bird.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、う蝕を予防するのに有
効な抗体の製造方法およびこの抗体を含有した口腔用組
成物、食品などのう蝕予防剤に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for producing an antibody effective for preventing dental caries and an agent for preventing dental caries such as oral compositions and foods containing the antibody.

【０００２】[0002]

【従来の技術】う蝕と歯周病は口腔の２大疾患と言われ
ており、このうちう蝕はストレプトコッカス・ミュータ
ンス（以下Ｓ． ｍｕｔａｎｓと呼ぶ）が口腔内に定着
しさらに増殖することが大きな病因であることが知られ
ている。従って、う蝕の予防にはＳ． ｍｕｔａｎｓの
口腔内への定着を抑制することが重要である。2. Description of the Related Art Caries and periodontal disease are said to be the two major diseases of the oral cavity. Among these, caries are caused by Streptococcus mutans (hereinafter referred to as S. mutans ) colonizing in the oral cavity and further proliferating. Is known to be a major etiology. Therefore, S. It is important to suppress the colonization of mutans in the oral cavity.

【０００３】従来かかる観点から、Ｓ． ｍｕｔａｎｓ
の全菌または菌体成分で哺乳動物または鶏を免疫するこ
とにより得られる抗体を口腔用組成物あるいは食品に配
合し、上記細菌の口腔内への定着を抑制しう蝕を予防し
ようという試みがなされている。しかし、Ｓ． ｍｕｔ
ａｎｓの全菌または複数のタンパク質を含む分画物を抗
原とした場合、得られる抗体の均一性、さらにヒト組織
との交差性など安全性にも問題がある。また、Ｓ． ｍ
ｕｔａｎｓの特定のタンパク質を抗原とした場合、抗原
の調製に労力を要し、さらに量産性にも問題があり、未
だ実用には至っていない。Conventionally, from such a viewpoint, S. mutans
Attempts to prevent the caries by suppressing the colonization of the bacteria in the oral cavity by incorporating the antibody obtained by immunizing mammals or chickens with whole bacteria or bacterial cell components into the oral composition or food. Has been done. However, S. mut
When the whole bacterium of Ans or a fraction containing a plurality of proteins is used as an antigen, there is a problem in safety such as homogeneity of the obtained antibody and cross-reactivity with human tissues. Also, S. m
When a specific protein of utans is used as an antigen, labor is required for preparation of the antigen, and further there is a problem in mass productivity, and it has not yet been put into practical use.

【０００４】一方、Ｓ． ｍｕｔａｎｓ菌体表層物質の
うち分子量１９万のタンパク質（ＰＡｃ）がＳ． ｍｕ
ｔａｎｓの定着に深く関与しており、ＰＡｃがう蝕予防
に重要な鍵をにぎることが知られてきた。しかし、従来
ＰＡｃの精製には多大な労力と時間を要し、従ってＰＡ
ｃに対する抗体を産業的に利用することは困難であっ
た。このＰＡｃ発現遺伝子をＳ． ｍｕｔａｎｓ ＧＳ
−５株の染色体遺伝子中に導入し、ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔ ＰＡｃ（ｒＰＡｃ）を発現させることによりｒＰ
Ａｃの生産性の向上と精製作業の簡略化が可能となった
（特開平３−６８５２２号公報）。しかし、ｒＰＡｃを
利用した受動免疫（抗ｒＰＡｃ抗体）によるう蝕予防効
果は報告されていない。On the other hand, S. Among the surface layer substances of mutans cells, a protein (PAc) having a molecular weight of 190,000 is S. mu
has been deeply involved in the fixing of tans, PAc have been known to hold an important key to preventing dental caries. However, conventional purification of PAc requires a great deal of labor and time, and therefore PAc
It was difficult to industrially utilize the antibody against c. This PAc expression gene was transformed into S. mutans GS
-5 strain was introduced into the chromosomal gene, and recombina
rP by expressing nt PAc (rPAc)
It has become possible to improve the productivity of Ac and simplify the refining work (Japanese Patent Laid-Open No. 3-68522). However, a caries preventive effect by passive immunization (anti-rPAc antibody) using rPAc has not been reported.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、大量生産が
可能で精製も容易な抗原を用いて、均一性の高い抗体を
効率よく生産し、これを配合した有効性、安全性の高い
う蝕予防剤を提供するものである。The present invention efficiently produces highly uniform antibodies using an antigen that can be mass-produced and is easily purified, and it is highly effective and safe to combine these antibodies. It is intended to provide an anti-corrosion agent.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明の抗体の製造法
は、ストレプトコッカス・ミュータンスの表層に存在す
る分子量約１９万のタンパク質抗原（ＰＡｃ）の遺伝子
を組み込んだ微生物から得られた前記タンパク質抗原
（ｒＰＡｃ）で哺乳類または鳥類を免疫し、この免疫さ
れた哺乳類または鳥類の血液、乳あるいは卵から抗ｒＰ
Ａｃ抗体を回収することを特徴とする。Means for Solving the Problems The method for producing an antibody of the present invention is a method for producing a protein antigen (PAc) having a molecular weight of about 190,000 present in the surface layer of Streptococcus mutans. (RPAc) immunizes a mammal or bird, and the blood, milk or egg of the immunized mammal or bird is used for anti-rP.
It is characterized in that the Ac antibody is recovered.

【０００７】また、本発明のう蝕予防剤は、上記製造法
で得られた抗ｒＰＡｃ抗体を含有することを特徴とし、
口腔用組成物、食品などの形で用いられる。The caries preventive agent of the present invention is characterized by containing the anti-rPAc antibody obtained by the above-mentioned production method,
It is used in the form of oral compositions, foods and the like.

【０００８】[0008]

【発明の実施態様】本発明で用いる遺伝子組換えにより
得られたｒＰＡｃ産生株としては、例えばＳ． ｍｕｔ
ａｎｓ ＧＳ−５（Ｋ−３）［微工研条寄第２４３７
号］が挙げられる。ＧＳ−５（Ｋ−３）株では、ＰＡｃ
の発現遺伝子（ｐａｃ遺伝子）がＧＳ−５株の染色体中
に組み込まれていることから、ｐａｃ遺伝子が脱落しに
くく、またｒＰＡｃ産生能が高く、さらにｒＰＡｃが菌
体外に産生されるため、ｒＰＡｃの調製はＳ． ｍｕｔ
ａｎｓ ＧＳ−５（Ｋ−３）株の培養後の培養液を用い
るのが平易である。例えば、Ｓ． ｍｕｔａｎｓ ＧＳ
−５（Ｋ−３）株をブレインハートインフュージョン培
地（ＢＢＬ社、Ｄｉｆｃｏ社など）の透析外液で培養
後、その培養上清を６０％飽和硫酸アンモニウムにて塩
析し、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶
解、透析する。次いで、この緩衝液で平衡化したＤＥＡ
Ｅ−ＳｅｐｈａｃｅｌカラムおよびＳｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−６Ｂによるゲルろ過で分画を行ない、ｒＰＡｃ
溶出画分を分取して、精製ｒＰＡｃを得ることができ
る。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Examples of rPAc-producing strains obtained by gene recombination used in the present invention include S. mut
ans GS-5 (K-3) [Ministry of Mechanical Engineering, Article 2437
No.]. In the GS-5 (K-3) strain, PAc
Since the expression gene ( pac gene) of RPAc is integrated into the chromosome of the GS-5 strain, the pac gene is less likely to be shed, the rPAc-producing ability is high, and rPAc is produced extracellularly. The preparation of S. mut
It is easy to use the culture solution after culturing the ans GS-5 (K-3) strain. For example, S. mutans GS
After culturing the -5 (K-3) strain with an external dialysis solution of brain heart infusion medium (BBL, Difco, etc.), the culture supernatant is salted out with 60% saturated ammonium sulfate, and 50 mM Tris-HCl buffer Dissolve and dialyze at (pH 7.5). Then DEA equilibrated with this buffer
E-Sephacel column and Sepharose
Fractionation was performed by gel filtration with CL-6B and rPAc
The eluted fraction can be collected to obtain purified rPAc.

【０００９】この精製ｒＰＡｃに、必要に応じて例えば
フロイントのコンプリートアジュバント、インコンプリ
ートアジュバント、コレラトキシンＢサブユニットなど
のアジュバントやコール酸、グリココール酸などの吸収
促進剤、その他、粘結剤、保湿剤などを併用して動物に
免疫する。動物としては、哺乳類では牛、馬、ヤギ、ウ
サギ、羊等、鳥類では鶏、ウズラ等が挙げられる。また
免疫方法としては、皮下注射、筋肉注射、口腔内注射、
腹腔内投与、経鼻投与、経口投与、経口腔粘膜投与、経
眼投与などの方法で行なうことができる。免疫回数は、
２回以上が好適であり、好ましくは３〜６回である。抗
体価が十分に上昇した血液、乳または卵を採取し、本発
明の抗ｒＰＡｃ抗体を調製した。この際、抗体価の測定
はＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ等により行なう。
通常牛、馬では数年、鶏、ウズラでは数ケ月にわたり高
抗体価を維持するが、抗体価の低下が認められた場合、
追加免疫を行なうことにより再び高抗体価が得られる。If necessary, the purified rPAc may be supplemented with Freund's complete adjuvant, incomplete adjuvant, cholera toxin B subunit, etc., absorption promoters such as cholic acid, glycocholic acid, etc., caking agents, moisturizing agents, etc. Animals are immunized with a drug. Examples of animals include cows, horses, goats, rabbits, and sheep as mammals, and chickens and quails as birds. The immunization methods include subcutaneous injection, intramuscular injection, buccal injection,
It can be performed by intraperitoneal administration, nasal administration, oral administration, oral cavity mucosal administration, ocular administration and the like. The immunization frequency is
It is preferably twice or more, and preferably 3 to 6 times. Blood, milk or eggs with sufficiently elevated antibody titers were collected to prepare the anti-rPAc antibody of the present invention. At this time, the antibody titer is measured by ELISA, radioimmunoassay or the like.
Usually, high antibody titer is maintained for several years in cows and horses, and for several months in chickens and quail, but if a decrease in antibody titer is observed,
A high antibody titer can be obtained again by boosting.

【００１０】抗ｒＰＡｃ抗体の調製は、卵黄および乳か
らリポタンパク質を除いたものまたは血清を硫酸アンモ
ニウムで塩析し、緩衝液で透析する方法、あるいは、デ
キストラン硫酸やポリエチレングリコールを用いた沈澱
法、プロパノールやクロロホルムを用いた抽出法など通
常用いられている免疫グロブリンを抽出、分離できる種
々の方法が利用できる。さらに、粗精製された抗ｒＰＡ
ｃ抗体をアフィニティークロマトにより精製すると、非
常に純度の高い抗ｒＰＡｃ抗体を得ることができる。The anti-rPAc antibody can be prepared by a method in which lipoproteins are removed from egg yolk and milk or serum is salted out with ammonium sulfate and dialyzed with a buffer solution, or a precipitation method using dextran sulfate or polyethylene glycol, propanol. Various methods that can be used for extraction and separation of commonly used immunoglobulins, such as extraction method using chlorophyll and chloroform, can be used. Furthermore, crudely purified anti-rPA
When the c antibody is purified by affinity chromatography, a highly pure anti-rPAc antibody can be obtained.

【００１１】このようにして得られた抗ｒＰＡｃ抗体
は、Ｓ． ｍｕｔａｎｓに対し高い免疫活性を示し、
Ｓ． ｍｕｔａｎｓの口腔内への定着を抑制し、従って
う蝕予防効果を有する。The anti-rPAc antibody thus obtained was prepared by S. shows high immunoreactivity against mutans ,
S. It suppresses the colonization of mutans in the oral cavity and thus has a caries preventive effect.

【００１２】本発明のう蝕予防剤は、上記の抗ｒＰＡｃ
抗体を有効成分として含有し、種々の形に調製される。
例えば、口腔用組成物として歯磨剤、洗口剤、タブレッ
ト等、食品としてはガム、キャンディー、冷菓等が挙げ
られる。この際、抗ｒＰＡｃ抗体の配合量は、う蝕予防
剤の形態に応じて、有効性を発揮する量を含有させれば
良い。好ましくは、抗体価で２０／ｇ製剤〜５０万／ｇ
製剤、より好ましくは、２００／ｇ製剤〜５万／ｇ製剤
の範囲で配合される。また、他の有効成分、例えばクロ
ルヘキシジン、デキストラナーゼ、フッ素等との併用も
可能である。The caries preventive agent of the present invention is the above-mentioned anti-rPAc.
It contains an antibody as an active ingredient and is prepared in various forms.
For example, dentifrices, mouthwashes, tablets and the like as oral compositions, and gums, candies, frozen desserts and the like as foods. At this time, the compounding amount of the anti-rPAc antibody may be such that it exhibits effectiveness depending on the form of the dental caries preventive agent. Preferably, the antibody titer is 20 / g formulation to 500,000 / g
The formulation, more preferably 200 / g formulation to 50,000 / g formulation, is blended. It is also possible to use it in combination with other active ingredients such as chlorhexidine, dextranase and fluorine.

【００１３】[0013]

【発明の効果】本発明によればＳ． ｍｕｔａｎｓの口
腔内への定着を有効に阻害し、う蝕の予防に効果的に使
用されるとともに、抗原の量産性、調製の簡便化にも優
れ、安全性が高く安定して均一な抗体が得られ、その配
合性も良好であり、う蝕予防剤の調製上難点のないもの
である。According to the present invention, S. Mutant effectively inhibits colonization of mutans in the oral cavity and is effectively used for the prevention of dental caries, and is excellent in mass production of antigen and simplification of preparation. The obtained compound has good compoundability and has no difficulty in preparing a caries preventive agent.

【００１４】[0014]

【実施例】【Example】

実施例１：ｒＰＡｃの調製Ｓ ． ｍｕｔａｎｓ ＧＳ−５（Ｋ−３）株をブレイン
ハートインフュージョン培地の透析外液で培養後、培養
上清を硫酸アンモニウム６０％飽和濃度にて液析し、沈
渣を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５に溶解、透析
して、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロースカラム
に本標品を流す。同緩衝液をカラムに２ベッド体積流し
た後、０モルから０．５モルまでのＮａＣｌ濃度勾配溶
出を行なう。その結果、ＮａＣｌが０．２モル付近でｒ
ＰＡｃが溶出する。ＧＳ−５（Ｋ−３）株では、培養上
清中のｒＰＡｃ含量が非常に高いため、この溶出画分を
そのままｒＰＡｃの精製標品として使用することが可能
である。さらに精製度を増すためには、この後Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂによるゲル濾過で分画を行な
い、ｒＰＡｃ溶出画分を分取すれば良い。こうして得ら
れた画分は、ほぼ完全にｒＰＡｃの単一標品となる。Example 1: Preparation of rPAc S. After culturing the mutans GS-5 (K-3) strain in a dial heart external solution of brain heart infusion medium, the culture supernatant was subjected to liquid precipitation at 60% ammonium sulfate saturation concentration, and the precipitate was adjusted to 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5. Dissolve and dialyze, and run this sample on a DEAE cellulose column equilibrated with the same buffer. After flowing 2 beds of the same buffer by volume into the column, elution with a NaCl concentration gradient from 0 to 0.5 mol is performed. As a result, when NaCl was around 0.2 mol, r
PAc elutes. Since the GS-5 (K-3) strain has a very high rPAc content in the culture supernatant, it is possible to use this elution fraction as it is as a purified preparation of rPAc. In order to increase the degree of purification, Seph
Fractionation may be performed by gel filtration with arose CL-6B, and the rPAc elution fraction may be collected. The fraction thus obtained is almost completely a single preparation of rPAc.

【００１５】同様の方法で、組換えを行なっていない
Ｓ． ｍｕｔａｎｓ ＮＣＴＣ１０４４９株、ＧＳ−５
株（微工研条寄第２４３６号）の培養上清からＰＡｃを
精製し、ＧＳ−５（Ｋ−３）株から得られたｒＰＡｃと
ともに、ローリー法によりタンパク量を測定した。その
結果を下記表１に示した。No recombination was carried out by the same method
S. mutans NCTC10449 strain, GS-5
PAc was purified from the culture supernatant of the strain (Microtech Lab. No. 2436), and the protein amount was measured by the Lowry method together with rPAc obtained from the GS-5 (K-3) strain. The results are shown in Table 1 below.

【００１６】[0016]

【表１】 使 用 菌 株 (ｒ)ＰＡｃ産生量の割合(相対値) Ｓ． ｍｕｔａｎｓ ＮＣＴＣ１０４４９ 1 Ｓ． ｍｕｔａｎｓ ＧＳ−５ 0 Ｓ． ｍｕｔａｎｓ ＧＳ−５（Ｋ−３） 43 [Table 1] Used strain (r) Ratio of PAc production (relative value) S．mutans NCTC10449 1S．mutans GS-50 S. mutans GS-5 (K-3) 43

【００１７】実施例２：ｒＰＡｃによる免疫および抗体
価の確認 ｒＰＡｃ２５０ｍｇ、コレラトキシンＢサブユニット５
０ｍｇを１％グリココール酸溶液１ｍｌに溶解し、１ケ
月おきに３回乳牛の鼻に噴霧した。最終噴霧の２週間後
にこの乳牛から乳を採取した。Example 2: Confirmation of immunity and antibody titer by rPAc 250 mg of rPAc, cholera toxin B subunit 5
0 mg was dissolved in 1 ml of a 1% glycocholic acid solution and sprayed on the nose of a dairy cow three times every other month. Milk was collected from this cow two weeks after the final spray.

【００１８】また、ｒＰＡｃ１ｍｇを１％水酸化アルミ
ニウムを含む生理食塩水１ｍｌに溶解し、１０日おきに
４回鶏に筋肉注射した。最終免疫の１０日後にこの鶏が
産んだ卵を回収し、卵黄を分取した。In addition, 1 mg of rPAc was dissolved in 1 ml of physiological saline containing 1% aluminum hydroxide, and the chicken was intramuscularly injected four times every 10 days. Eggs laid by this chicken were collected 10 days after the final immunization, and the yolk was collected.

【００１９】さらに、ｒＰＡｃ０．５ｍｇを生理食塩水
０．５ｍｌに溶解し、同量のフロイントのコンプリート
アジュバントと混合し、エマルジョンとした。このエマ
ルジョンを２週間おきに３回ウサギに皮下注射した。最
終免疫の１週間後にこのウサギの耳から採血を行ない血
清を分離した。Further, 0.5 mg of rPAc was dissolved in 0.5 ml of physiological saline and mixed with the same amount of Freund's complete adjuvant to form an emulsion. This emulsion was subcutaneously injected into rabbits 3 times every 2 weeks. One week after the final immunization, blood was collected from the ears of the rabbit to separate serum.

【００２０】上記３サンプルの抗体価をｒＰＡｃを抗原
としたＥＬＩＳＡにより測定した。その結果を下記表２
に示した。なお、抗体価はＥＬＩＳＡの測定値（ＯＤ４
０５ｎｍ）が０．１以上となる最大希釈の逆数で示し
た。The antibody titer of the above 3 samples was measured by ELISA using rPAc as an antigen. The results are shown in Table 2 below.
It was shown to. The antibody titer is measured by ELISA (OD4
(05 nm) is shown as the reciprocal of the maximum dilution at which it becomes 0.1 or more.

【００２１】[0021]

【表２】 免疫した動物 免疫方法 採取したサンプル 抗体価 牛 経鼻噴霧 乳 1,200,000 鶏 筋肉注射 卵黄 600,000 ウサギ 皮下注射 血清 2,400,000 [Table 2] Immunized animals Immunization method Samples collected Antibody titer Nasal spray Milk 1,200,000 Chicken intramuscular injection Yolk 600,000 Rabbit subcutaneous injection Serum 2,400,000

【００２２】実施例３：抗ｒＰＡｃ抗体の調製 血液から抗ｒＰＡｃ抗体を精製する場合、まず採取した
血液を遠心して血清を得る。血清を３３％飽和硫安で塩
析した後、遠心分離により得られた沈渣を５ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ８．４）に溶解し、同緩衝液で透析し硫安
を除去する。これをＤＥ５２イオン交換カラムに流しイ
ムノグロブリン画分を吸着させ、その後このカラムに
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）を流しイムノグロ
ブリン画分を回収する。必要に応じこれを濃縮する。Example 3: Preparation of anti-rPAc antibody When purifying anti-rPAc antibody from blood, first, the collected blood is centrifuged to obtain serum. Serum is salted out with 33% saturated ammonium sulfate, and the precipitate obtained by centrifugation is dissolved in 5 mM phosphate buffer (pH 8.4) and dialyzed with the same buffer to remove ammonium sulfate. This is passed through a DE52 ion exchange column to adsorb the immunoglobulin fraction, and then 0.1 M phosphate buffer (pH 6.3) is passed through this column to collect the immunoglobulin fraction. Concentrate it if necessary.

【００２３】鶏卵から抗ｒＰＡｃ抗体を調製する場合、
まず鶏卵から卵黄のみを分離し、これに適量の水を加え
撹拌し、卵黄溶液とする。これにポリエチレングリコー
ルを添加し、リポタンパク質を沈澱除去する。上清から
血清と同様の操作でイムノグロブリン画分を得る。When an anti-rPAc antibody is prepared from chicken eggs,
First, only the egg yolk is separated from the chicken egg, an appropriate amount of water is added to this, and the mixture is stirred to form an yolk solution. Polyethylene glycol is added to this to precipitate and remove lipoproteins. An immunoglobulin fraction is obtained from the supernatant by the same procedure as for serum.

【００２４】実施例４：抗ｒＰＡｃ抗体のう蝕抑制効果 ウサギを用いて調製した３種の抗血清を用いてハムスタ
ーによるう蝕抑制実験を行なった。ハムスターは実験開
始時３週齢のオス各群７匹を、飼料はう蝕誘発性飼料Ｄ
ｉｅｔ２０００を、感染菌株はＳ． ｍｕｔａｎｓ Ｍ
Ｔ８１４８Ｒを用いた。実験期間は菌感染終了後３週間
で、その間、１日２回、凝集単位３単位に調製した抗血
清０．２ｍｌをハムスター口腔内に滴下した。う蝕の判
定はカイズの方法（Ｋｅｙｅｓ，Ｐ．Ｈ．：Ｊ．Ｄｅｎ
ｔ．Ｒｅｓ．，２３：４３９−４４４，１９４４）に準
じて行なった。抗血清の種類および実験結果を下記表３
に示した。Example 4: Anti-caries inhibitory effect of anti-rPAc antibody A caries inhibition experiment was carried out by hamsters using three kinds of antisera prepared in rabbits. The hamsters consisted of 3 males each 3 weeks old at the start of the experiment, and the diet was cariogenic diet D.
iet2000, the infecting strain was S. mutans M
T8148R was used. The experimental period was 3 weeks after the end of bacterial infection, during which 0.2 ml of antiserum prepared in 3 units of agglutinating unit was dripped into the hamster oral cavity twice a day. The caries determination is performed by the kais method (Keyes, PH: J. Den.
t. Res. , 23: 439-444, 1944). The types of antisera and the experimental results are shown in Table 3 below.
It was shown to.

【００２５】[0025]

【表３】 抗体の種類 カリエス・スコア う蝕抑制率 コントロール（ノーマル血清） 9.89／匹 0 ％ 抗Ｓ．ｍ．全菌血清 3.78／匹 61.8％ 抗ｒＰＡｃ血清 4.31／匹 56.4％ [Table 3] Antibody type Caries score Caries inhibition rate Control (normal serum) 9.89 / animal 0% Anti- S . m . Whole bacterial serum 3.78 / animal 61.8% Anti-rPAc serum 4.31 / animal 56.4%

【００２６】実施例５：各種剤型への抗ｒＰＡｃ抗体の
配合例 以下の処方により、各種のう蝕予防剤を調製した。Example 5: Combination Example of Anti-rPAc Antibody in Various Dosage Forms Various caries preventive agents were prepared by the following formulations.

【００２７】 （１） 歯磨剤 第２リン酸カルシウム・２水和物 50.0 ％ ソルビット 10.0 ％ グリセリン 10.0 ％ カラゲナン 1.0 ％ ソディウムラウリルサルフェート 1.0 ％ 香料 1.0 ％ サッカリン 0.1 ％ エタノール 2.0 ％ デキストラナーゼ 0.02％ 抗ｒＰＡｃヤギ乳抗体 0.2 ％ 水 残 (1) Dentifrice Dicalcium phosphate dihydrate 50.0% Sorbit 10.0% Glycerin 10.0% Carrageenan 1.0% Sodium lauryl sulfate 1.0% Fragrance 1.0% Saccharin 0.1% Ethanol 2.0% Dextranase 0.02% Anti-rPAc goat milk Antibody 0.2% Water residue

【００２８】 （２） 歯磨剤 無水ケイ酸 30.0 ％ グリセリン 30.0 ％ ソルビット 20.0 ％ カルボキシメチルセルロース 1.0 ％ ソディウムラウリルサルフェート 1.2 ％ 香料 1.0 ％ サッカリン 0.1 ％ エタノール 2.0 ％ フッ化ナトリウム 0.1 ％ 抗ｒＰＡｃ馬血清抗体 0.1 ％ 水 残 (2) Dentifrice Silic anhydride 30.0% Glycerin 30.0% Sorbit 20.0% Carboxymethylcellulose 1.0% Sodium lauryl sulfate 1.2% Fragrance 1.0% Saccharin 0.1% Ethanol 2.0% Sodium fluoride 0.1% Anti-rPAC horse serum antibody 0.1% Water The rest

【００２９】 （３） 歯磨剤 水酸化アルミニウム 45.0 ％ ソルビット 20.0 ％ カラゲナン 0.5 ％ カルボキシメチルセルロース 1.0 ％ ラウリルジエタノールアマイド 1.0 ％ ショ糖モノラウレート 2.0 ％ 香料 1.0 ％ サッカリン 0.1 ％ 抗ｒＰＡｃ牛乳抗体 0.3 ％ 水 残(3) Dentifrice Aluminum hydroxide 45.0% Sorbit 20.0% Carrageenan 0.5% Carboxymethyl cellulose 1.0% Lauryl diethanolamide 1.0% Sucrose monolaurate 2.0% Fragrance 1.0% Saccharin 0.1% Anti-rPAc milk antibody 0.3% Water residue

【００３０】 （４） 歯磨剤 第２リン酸カルシウム 45.0 ％ カルボキシメチルセルロースナトリウム 1.0 ％ カラゲナン 0.5 ％ ソルビット 35.0 ％ プロピレングリコール 3.0 ％ Ｎ−ラウロイルメチルタウリンナトリウム 0.5 ％ ゼラチン 1.0 ％ パラオキシ安息香酸エチル 0.2 ％ サッカリンナトリウム 0.1 ％ 香料 1.0 ％ モノフルオロリン酸ナトリウム 0.7 ％ 抗ｒＰＡｃ鶏卵抗体 0.4 ％ 水 残 (4) Dentifrice Dicalcium Phosphate 45.0% Sodium Carboxymethyl Cellulose 1.0% Carrageenan 0.5% Solbit 35.0% Propylene Glycol 3.0% N-Lauroylmethyltaurine Sodium 0.5% Gelatin 1.0% Ethyl Paraoxybenzoate 0.2% Saccharin Sodium 0.1% Perfume 1.0 % Sodium monofluorophosphate 0.7% Anti-rPAc chicken egg antibody 0.4% Water residue

【００３１】 （５） 歯磨剤 水酸化アルミニウム 40.0 ％ カルボキシメチルセルロースナトリウム 1.0 ％ カラゲナン 0.5 ％ ソルビット 35.0 ％ プロピレングリコール 3.0 ％ Ｎ−ミリストイルメチルタウリンナトリウム 0.5 ％ ペプタイド 1.0 ％ パラオキシ安息香酸メチル 0.2 ％ サッカリンナトリウム 0.1 ％ 香料 1.0 ％ 抗ｒＰＡｃ羊血清抗体 0.5 ％ 水 残 (5) Dentifrice Aluminum hydroxide 40.0% Carboxymethylcellulose sodium 1.0% Carrageenan 0.5% Solbit 35.0% Propylene glycol 3.0% N-myristoylmethyltaurine sodium 0.5% Peptide 1.0% Methyl paraoxybenzoate 0.2% Saccharin sodium 0.1% Perfume 1.0 % Anti-rPAc sheep serum antibody 0.5% residual water

【００３２】 （６） 歯磨剤 無水ケイ酸 20.0 ％ カルボキシメチルセルロースナトリウム 1.0 ％ ソルビット 50.0 ％ ポリエチレングリコール 5.0 ％ Ｎ−パルミトイルメチルタウリンナトリウム 0.5 ％ カゼイン 1.0 ％ パラオキシ安息香酸ナトリウム 0.2 ％ サッカリンナトリウム 0.1 ％ 香料 1.0 ％ フッ化ナトリウム 0.2 ％ 抗ｒＰＡｃ鶏卵抗体 0.3 ％ 水 残 (6) Dentifrice Silicic anhydride 20.0% Sodium carboxymethyl cellulose 1.0% Sorbit 50.0% Polyethylene glycol 5.0% N-palmitoylmethyl taurine sodium 0.5% Casein 1.0% Sodium paraoxybenzoate 0.2% Sodium saccharin 0.1% Perfume 1.0% Fluoride Sodium 0.2% Anti-rPAc chicken egg antibody 0.3% Water residue

【００３３】 （７） 洗口剤 エタノール 20.0 ％ 香料 1.0 ％ サッカリン 0.05％ ラウリルジエタノールアマイド 0.3 ％ クロルヘキシジングルコン酸塩 0.01％ 抗ｒＰＡｃ馬血清抗体 0.1 ％ 水 残 (7) Mouthwash Ethanol 20.0% Fragrance 1.0% Saccharin 0.05% Lauryl diethanolamide 0.3% Chlorhexidine gluconate 0.01% Anti-rPAc horse serum antibody 0.1% Water residue

【００３４】 （８） 洗口剤 ソルビット 10.0 ％ エタノール 20.0 ％ Ｎ−ミリストイルメチルタウリンナトリウム 0.5 ％ ショ糖ステアリン酸エステル 1.0 ％ ペプタイド 0.5 ％ パラオキシ安息香酸メチル 0.1 ％ ステビオサイド 0.1 ％ 香料 0.5 ％ デキストラナーゼ 0.2 ％ フッ化ナトリウム 0.2 ％ 抗ｒＰＡｃ鶏卵抗体 0.2 ％ 水 残 (8) Mouthwash Solbit 10.0% Ethanol 20.0% N-myristoylmethyl taurine sodium 0.5% Sucrose stearate 1.0% Peptide 0.5% Methyl paraoxybenzoate 0.1% Stevioside 0.1% Perfume 0.5% Dextranase 0.2% Sodium fluoride 0.2% Anti-rPAc chicken egg antibody 0.2% Water residue

【００３５】 （９） 洗口剤 ソルビット 10.0 ％ エタノール 20.0 ％ Ｎ−ステアロイルメチルタウリンナトリウム 0.5 ％ ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノオレート 1.0 ％ コラーゲン 0.5 ％ パラオキシ安息香酸メチル 0.1 ％ サッカリンナトリウム 0.1 ％ 香料 0.5 ％ 抗ｒＰＡｃ牛乳抗体 0.4 ％ 水 残 (9) Mouthwash Solbit 10.0% Ethanol 20.0% N-stearoylmethyltaurine sodium 0.5% POE (20) Sorbitan monooleate 1.0% Collagen 0.5% Methyl paraoxybenzoate 0.1% Sodium saccharin 0.1% Perfume 0.5% Anti-rPAc milk Antibody 0.4% Water residue

【００３６】 （１０） タブレット アラビアゴム 6.0 ％ ブドウ糖 72.0 ％ ゼラチン 3.0 ％ 香料 0.2 ％ ｌ−メントール 0.1 ％ スペアミントオイル 0.1 ％ アスコルビン酸ナトリウム 0.1 ％ 抗ｒＰＡｃ羊乳抗体 0.1 ％ 水 残 (10) Tablets Gum arabic 6.0% Glucose 72.0% Gelatin 3.0% Perfume 0.2% l-Menthol 0.1% Spearmint oil 0.1% Sodium ascorbate 0.1% Anti-rPAc sheep milk antibody 0.1% Water residue

【００３７】 （１１） ガム ガムベース 43.9 ％ 炭酸カルシウム 2.0 ％ 水アメ 15.0 ％ 砂糖 30.0 ％ ショ糖パルミテート 1.0 ％ フルクトース 4.0 ％ アルトース 3.0 ％ 香料 1.0 ％ 抗ｒＰＡｃ鶏卵抗体 0.1 ％(11) Gum Gum base 43.9% Calcium carbonate 2.0% Water candy 15.0% Sugar 30.0% Sucrose palmitate 1.0% Fructose 4.0% Altose 3.0% Fragrance 1.0% Anti-rPAc chicken egg antibody 0.1%

【００３８】 （１２） アイスクリーム クリーム(脂肪率50％) 16.84％ 無糖脱脂練乳 24.24％ 砂糖 11.25％ コーンシロップ 4.65％ 安定剤 0.35％ 抗ｒＰＡｃ抗体含有牛乳 37.67％ 抗ｒＰＡｃ抗体含有卵黄 5.00％(12) Ice cream (fat ratio 50%) 16.84% non-fat condensed milk without sugar 24.24% sugar 11.25% corn syrup 4.65% stabilizer 0.35% milk containing anti-rPAc antibody 37.67% anti-rPAc antibody containing egg yolk 5.00%

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【手続補正書】[Procedure amendment]

【提出日】平成４年５月１２日[Submission date] May 12, 1992

【手続補正１】[Procedure Amendment 1]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００１０[Correction target item name] 0010

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【００１０】抗ｒＰＡｃ抗体の調製は、卵黄および乳か
らリポタンパク質を除いたものまたは血清を硫酸アンモ
ニウムで塩析し、緩衝液で透析する方法、あるいは、デ
キストラン硫酸やポリエチレングリコールを用いた沈澱
法、プロパノールやクロロホルムを用いた抽出法など通
常用いられている免疫グロブリンを抽出、分離できる種
々の方法が利用できる。さらに、粗精製された抗ｒＰＡ
ｃ抗体をアフィニティークロマトグラフィーにより精製
すると、非常に純度の高い抗ｒＰＡｃ抗体を得ることが
できる。The anti-rPAc antibody can be prepared by a method in which lipoproteins are removed from egg yolk and milk or serum is salted out with ammonium sulfate and dialyzed with a buffer solution, or a precipitation method using dextran sulfate or polyethylene glycol, propanol. Various methods that can be used for extraction and separation of commonly used immunoglobulins, such as extraction method using chlorophyll and chloroform, can be used. Furthermore, crudely purified anti-rPA
When the c antibody is purified by affinity chromatography, a very pure anti-rPAc antibody can be obtained.

【手続補正２】[Procedure Amendment 2]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００１４[Correction target item name] 0014

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【００１４】[0014]

【実施例】 実施例１：ｒＰＡｃの調製Ｓ ． ｍｕｔａｎｓ ＧＳ−５（Ｋ−３）株をブレイン
ハートインフュージョン培地の透析外液で培養後、培養
上清を硫酸アンモニウム６０％飽和濃度にて塩析し、沈
渣を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５に溶解、透析
して、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロースカラム
に本標品を流す。同緩衝液をカラムに２ベッド体積流し
た後、０モルから０．５モルまでのＮａＣｌ濃度勾配溶
出を行なう。その結果、ＮａＣｌが０．２モル付近でｒ
ＰＡｃが溶出する。ＧＳ−５（Ｋ−３）株では、培養上
清中のｒＰＡｃ含量が非常に高いため、この溶出画分を
そのままｒＰＡｃの精製標品として使用することが可能
である。さらに精製度を増すためには、この後Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂによるゲル濾過で分画を行な
い、ｒＰＡｃ溶出画分を分取すれば良い。こうして得ら
れた画分は、ほぼ完全にｒＰＡｃの単一標品となる。Examples Example 1: Preparation of rPAc S. After culturing mutans GS-5 (K-3 ) strain dialysis external solution of brain-heart infusion medium, the culture supernatant was salted out with ammonium sulfate 60% saturation concentration, the sediment in 50mM Tris-HCl buffer pH7.5 Dissolve and dialyze, and run this sample on a DEAE cellulose column equilibrated with the same buffer. After flowing 2 beds of the same buffer by volume into the column, elution with a NaCl concentration gradient from 0 to 0.5 mol is performed. As a result, when NaCl was around 0.2 mol, r
PAc elutes. Since the GS-5 (K-3) strain has a very high rPAc content in the culture supernatant, it is possible to use this elution fraction as it is as a purified preparation of rPAc. In order to increase the degree of purification, Seph
Fractionation may be performed by gel filtration with arose CL-6B, and the rPAc elution fraction may be collected. The fraction thus obtained is almost completely a single preparation of rPAc.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 3/02 7731−4Ｈ 15/14 7731−4Ｈ // Ａ６１Ｋ 39/09 8413−4Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:46） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁵ Identification code Internal reference number FI Technical display location C07K 3/02 7731-4H 15/14 7731-4H // A61K 39/09 8413-4C (C12P 21 / 00 C12R 1:46)

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ストレプトコッカス・ミュータンスの表
層に存在する分子量約１９万のタンパク質抗原（以下、
ＰＡｃと呼ぶ）の遺伝子を組み込んだ微生物から得られ
た前記タンパク質抗原（以下、ｒＰＡｃと呼ぶ）で哺乳
類または鳥類を免疫し、この免疫された哺乳類または鳥
類の血液、乳あるいは卵から抗ｒＰＡｃ抗体を回収する
ことを特徴とする抗体の製造法。1. A protein antigen having a molecular weight of about 190,000 existing on the surface layer of Streptococcus mutans (hereinafter, referred to as
The protein antigen (hereinafter referred to as rPAc) obtained from a microorganism into which the gene of PAc) has been incorporated is used to immunize a mammal or bird, and anti-rPAc antibody is isolated from the blood, milk or egg of the immunized mammal or bird. A method for producing an antibody, which comprises recovering. 【請求項２】 請求項１に記載の製造法で得られた抗ｒ
ＰＡｃ抗体を含有することを特徴とする抗体配合う蝕予
防剤。2. An anti-r obtained by the production method according to claim 1.
An antibody-containing caries preventive agent comprising a PAc antibody.