JPH05236985A - Cellulase-inhibiting agent and its productiohn - Google Patents
Cellulase-inhibiting agent and its productiohnInfo
- Publication number
- JPH05236985A JPH05236985A JP4076318A JP7631892A JPH05236985A JP H05236985 A JPH05236985 A JP H05236985A JP 4076318 A JP4076318 A JP 4076318A JP 7631892 A JP7631892 A JP 7631892A JP H05236985 A JPH05236985 A JP H05236985A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cellulase
- inhibitor
- reaction
- cellooligosaccharide
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は次の一般式(1)The present invention relates to the following general formula (1)
【0002】[0002]
【化7】 [Chemical 7]
【0003】(但し、nは0または整数を示す。)およ
び次の一般式(2)(Where n is 0 or an integer) and the following general formula (2):
【0004】[0004]
【化8】 [Chemical 8]
【0005】(但し、nは0または整数を示す。)で表
される新規なセルラーゼ阻害剤および該阻害剤の製造法
に関する。更に詳細にはセロオリゴ糖に1−デオキシノ
ジリマイシンがβ−1,4結合した1−デオキシノジリ
マイシン・セロオリゴ糖(以下、総称して阻害剤A群と
する)及びβ−1,6結合した1−デオキシノジリマイ
シン・セロオリゴ糖(以下、総称して阻害剤B群とす
る)およびセルラーゼの糖転移反応を利用してセロオリ
ゴ糖と1−デオキシノジリマイシンから当該阻害剤A群
或いは阻害剤B群を製造する方法に関する。The present invention relates to a novel cellulase inhibitor represented by (n is 0 or an integer) and a method for producing the inhibitor. More specifically, 1-deoxynojirimycin / cellooligosaccharide in which 1-deoxynojirimycin is β-1,4 linked to cellooligosaccharide (hereinafter collectively referred to as inhibitor group A) and β-1,6 linked 1 -Deoxynojirimycin / cellooligosaccharide (hereinafter collectively referred to as inhibitor B group) and cellulase transglycosylation reaction are used to select the inhibitor A group or inhibitor B group from cellooligosaccharide and 1-deoxynojirimycin. It relates to a method of manufacturing.
【0006】本発明で得られたセルラーゼ阻害剤は各種
のセルラーゼを強く阻害し、バイオマス産業、繊維産
業、食品産業及び白蟻等の害虫駆除に利用される。つま
り。バイオマス産業においては天然セルロースにセルラ
ーゼを作用させ、アルコールやその他の燃料化合物、化
学工業燃料、微生物蛋白への転換利用などが試みられて
いるが、その過程で本発明のセルラーゼ阻害剤を利用す
ることによってセルラーゼ作用を適宜にコントロールす
ることができる。繊維産業においては、例えばセルロー
ス繊維質の素材に対してセルラーゼを作用させてその風
合いを良くする方法等に本発明の阻害剤を用いることに
よって、その処理強度をコントロールすることが可能で
ある。また、食品産業においては天然繊維質を有する食
品をセルラーゼ処理して繊維質の含まれる食品を製造す
る方法などで本発明の阻害剤を用いることによって、そ
の作用をコントロールすることができ、各種の食品を製
造することができる。また、白蟻はその体内に共生する
原生動物のセルラーゼによって木材などのセルロースを
分解して栄養として取り込むことができるとされている
が、本発明の阻害剤を用いることによって、白蟻の駆除
に応用することも可能である。The cellulase inhibitor obtained by the present invention strongly inhibits various cellulases and is used for controlling pests such as biomass industry, textile industry, food industry and termites. That is. In the biomass industry, it has been attempted to make cellulase act on natural cellulose to convert it into alcohol or other fuel compounds, chemical industrial fuel, microbial protein, etc., but in the process, use the cellulase inhibitor of the present invention. The cellulase action can be appropriately controlled by. In the textile industry, for example, the treatment strength can be controlled by using the inhibitor of the present invention in a method of making cellulase act on a cellulosic fibrous material to improve its texture. Further, in the food industry, by using the inhibitor of the present invention in a method for producing a food containing fiber by subjecting a food having natural fiber to a cellulase treatment, its action can be controlled, and Food can be produced. In addition, termites are said to be capable of degrading cellulose such as wood by taking in cellulase as a nutrient by cellulase of a protozoan symbiotic in the body, and by applying the inhibitor of the present invention, it is applied to the control of termites It is also possible.
【0007】[0007]
【従来の技術】セルラーゼ阻害剤としては従来より数々
の物質が報告されている。つまり、各種のフェノール化
合物、例えばp−クマリン酸、フェルラ酸、バニリン或
いはタンニン酸、ロイコアントシアニン、N−ブロモサ
クシンイミド等、更にグルコースやエタノール等が知ら
れている。それらは不可逆性阻害剤であり、また、アス
ペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)の小麦
ぬか培養中のセルラーゼ阻害因子〔Can. J. Microbio
l.,27巻,12号,1334-1340(1981年)〕、植物の葉由
来の阻害物質〔Siol Biol. Biochem.,19巻,719-725
(1987)〕が報告されているが、それらは単離精製され
ておらず、その詳細な性質についても分かっていない。2. Description of the Related Art Various substances have been reported as cellulase inhibitors. That is, various phenol compounds such as p-coumaric acid, ferulic acid, vanillin or tannic acid, leucoanthocyanin, N-bromosuccinimide, etc., and glucose, ethanol, etc. are known. They are irreversible inhibitors, and also cellulase inhibitors in Aspergillus terreus wheat bran culture [Can. J. Microbio
L., Vol. 27, No. 12, 1334-1340 (1981)], an inhibitor derived from plant leaves [Siol Biol. Biochem., Vol. 19, 719-725].
(1987)], but they have not been isolated and purified, and their detailed properties are not known.
【0008】[0008]
【発明が解決しようとする課題】セルラーゼはセルロー
スをグルコースにまで加水分解する酵素として知られ、
原生動物、線虫類、軟体動物、細菌、菌類、高等植物な
ど生物界全般に分布している。通常セルラーゼとはエン
ド型酵素(EC 3.2.1.4として分類されるエンド−1,4
−β−D−グルカン グルカノヒドロラーゼ、CM−セ
ルラーゼ、CX)、エキソ型酵素(EC 3.2.1.91として分
類されるエキソ−1,4−β−D−グルカン セロビオ
ヒドロラーゼ、アビセラーゼ、C1)、β−グルコシダ
ーゼ(EC3.2.1.21として分類されるセロビアーゼ)など
に分類されている。これら3種の酵素が互いに相乗して
天然セルロースを分解すると考えられている。Cellulase is known as an enzyme that hydrolyzes cellulose into glucose,
It is distributed throughout the living world such as protozoa, nematodes, molluscs, bacteria, fungi, and higher plants. Ordinary cellulases are endo-type enzymes (endo-1,4 classified as EC 3.2.1.4)
-Β-D-glucan glucanohydrolase, CM-cellulase, C X ), exo-type enzyme (exo-1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase, avicelase, C 1 classified as EC 3.2.1.91) , Β-glucosidase (cellobiase classified as EC3.2.1.21) and the like. It is believed that these three enzymes synergize with each other to degrade natural cellulose.
【0009】特に微生物の産生するセルラーゼが工業的
に利用されている。例えばセルロース糖化という面から
みて強力なものを生産するものにはトリコデルマ(Tric
hoderma)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、ペリ
キュラリア(Pellicularia)属、ペニシリウム(Penici
llium)属、アクレモニウム(Acremonium)属などの糸
状菌に属するものが多い。しかし、その生産されるセル
ラーゼの性質は上記に述べたように多種多様である。In particular, cellulases produced by microorganisms are industrially used. For example, Tricoderma (Tric
hoderma), Aspergillus, Pellicularia, Penicillium
llium), Acremonium (Acremonium) genus and many of the filamentous fungi. However, the properties of the cellulases produced are diverse, as mentioned above.
【0010】このような各種のセルラーゼに対する従来
報告されている各種の阻害剤の作用は、あまり満足でき
るものではなかった。つまり、その酵素の起源により従
来の阻害剤の作用は一様ではなく、またその阻害活性も
充分とはいえなかった。The actions of various inhibitors reported so far on such various cellulases have not been very satisfactory. That is, the action of the conventional inhibitor was not uniform due to the origin of the enzyme, and its inhibitory activity was not sufficient.
【0011】[0011]
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは従来
の阻害剤に代え、 低分子性の物質 酵素の活性部位に結合するもの−基質アナログであ
ること− 阻害の特異性が高いもの といった点を兼ね備えた新規な阻害剤を創製することを
目的として鋭意研究をした。Therefore, the present inventors have replaced conventional inhibitors with low molecular weight substances that bind to the active site of an enzyme-that they are substrate analogs-that have a high inhibitory specificity. We conducted diligent research for the purpose of creating a new inhibitor that combines both points.
【0012】即ち、本発明者らは次の一般式(1)That is, the present inventors have the following general formula (1):
【0013】[0013]
【化9】 [Chemical 9]
【0014】(但し、nは0または整数を示す。)及び
次の一般式(2)(Where n is 0 or an integer) and the following general formula (2):
【0015】[0015]
【化10】 [Chemical 10]
【0016】(但し、nは0または整数を示す。)で表
される阻害剤A群および阻害剤B群を創製し、本物質が
上記目的を満たすセルラーゼ阻害剤であることを見いだ
し本発明を完成した。The inventors have created an inhibitor group A and an inhibitor group B represented by (wherein n is 0 or an integer), and found that this substance is a cellulase inhibitor satisfying the above-mentioned object. completed.
【0017】1−デオキシノジリマイシン(以下、SG
Iとする)はα、β−グルコシダーゼやグルコアミラー
ゼ等に対して強い阻害作用を有する物質として知られて
いる。本発明者はセルラーゼを用いてこのSGIをセロ
オリゴ糖に位置特異的に付加することに成功した。即
ち、一般式(3)1-deoxynojirimycin (hereinafter SG
I) is known as a substance having a strong inhibitory effect on α, β-glucosidase, glucoamylase and the like. The present inventor succeeded in site-specifically adding this SGI to cellooligosaccharides using cellulase. That is, the general formula (3)
【0018】[0018]
【化11】 [Chemical 11]
【0019】(但し、nは0または整数を示す。)で表
されるセロオリゴ糖とSGIに糖転移反応を触媒する能
力のあるセルラーゼを作用させ、一般式(1)A cellulase having the ability to catalyze a transglycosylation reaction is allowed to act on the cellooligosaccharide represented by (where n represents 0 or an integer) and SGI to give a compound represented by the general formula (1).
【0020】[0020]
【化12】 [Chemical 12]
【0021】(但し、nは0または整数を示す。)或い
は、一般式(2)(Where n is 0 or an integer) or the general formula (2)
【0022】[0022]
【化13】 [Chemical 13]
【0023】(但し、nは0または整数を示す。)で表
される阻害剤A群或いは阻害剤B群を製造することがで
きる。The inhibitor group A or the inhibitor group B represented by (wherein n is 0 or an integer) can be produced.
【0024】本発明に利用できるセルラーゼは、糖転移
反応を触媒する能力のあるセルラーゼであればその起源
は問わないが、トリコデルマ(Trichoderma)属の生産
するセルラーゼ、とりわけトリコデルマ・ビリデ(Tric
hoderma viride)の生産するセルラーゼが好適に使用で
きる。具体的には、例えばセルラーゼT「アマノ」(商
品名:天野製薬製)、メイセラーゼ(商品名:明治製菓
製)等が挙げられる。The cellulase which can be used in the present invention may be of any origin as long as it has the ability to catalyze a glycosyl transfer reaction, but the cellulase produced by the genus Trichoderma, especially Trichoderma viride (Tric
Cellulase produced by hoderma viride) can be preferably used. Specific examples thereof include cellulase T "Amano" (trade name: manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) and macerase (trade name: manufactured by Meiji Seika).
【0025】反応の基質である一般式(3)に示される
セロオリゴ糖は、例えば坂本らの方法〔Methods in Car
bohydrate Chemistry, 3巻, 134頁(1963)〕に従って
調製できる。さらに特公平1−256394号公報記載の方法
なども応用できる。The cellooligosaccharide represented by the general formula (3), which is a substrate for the reaction, can be prepared by, for example, the method of Sakamoto et al. [Methods in Car
bohydrate Chemistry, Vol. 3, p. 134 (1963)]. Furthermore, the method described in Japanese Patent Publication No. 1-256394 can be applied.
【0026】セロオリゴ糖としては前記した方法で得ら
れた各種のセロオリゴ等が利用できるが、特にセロトリ
オース、セロテトラオース、セロペンタオース、セロヘ
キサオース、セロヘプタオース等の重合度3〜7の水溶
性セロオリゴ糖が好適に用いられる。これらの純度は本
発明に利用し得る程度に精製されていれば良く、更に混
合物であっても良い。As the cellooligosaccharides, various cellooligos obtained by the above-mentioned method can be used, and in particular, water-soluble cellooligosaccharides having a degree of polymerization of 3 to 7 such as cellotriose, cellotetraose, cellopentaose, cellohexaose and celloheptaose. Sugar is preferably used. These may be purified so long as they can be used in the present invention, and may be a mixture.
【0027】SGIは、例えば村尾らの方法〔Agric. B
iol. Chem.,44巻,219頁(1980)〕に従って調製でき
る。The SGI is, for example, the method of Murao et al. [Agric. B
iol. Chem., 44, 219 (1980)].
【0028】反応は各種の溶媒中で行われる。例えば、
水溶液中、各種の有機溶媒と水との混合物中である。よ
り好ましくは、ジメチルスルフォキシド(以下、DMS
Oとする)30%中で反応する方法である。The reaction is carried out in various solvents. For example,
In an aqueous solution, in a mixture of various organic solvents and water. More preferably, dimethyl sulfoxide (hereinafter referred to as DMS
It is a method of reacting in 30%.
【0029】反応温度や反応pHとしては、用いられる
セルラーゼの糖転移活性にとって好ましい温度であれば
よいが、前記したトリコデルマ属由来であれば、37℃付
近、pH5.0付近である。The reaction temperature or reaction pH may be any temperature that is preferable for the transglycosylation activity of the cellulase used, but if it is derived from the genus Trichoderma, it is around 37 ° C. and around pH 5.0.
【0030】用いるセルラーゼ濃度としては、その糖転
移活性が発揮される濃度であれば良く、更に用いられる
セルラーゼの精製度合いにより異なるが、0.1〜10%が
使用される。The cellulase concentration to be used may be any concentration as long as it exerts its transglycosylation activity, and varies depending on the degree of purification of the cellulase used, but 0.1-10% is used.
【0031】以下実験例、実施例等で本発明を詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、以下の実験例、実施例に用いた試薬及び測定法は
特に指定する以外は次のとおりである。The present invention will be described in detail below with reference to experimental examples and examples, but the present invention is not limited thereto.
The reagents and measuring methods used in the following experimental examples and examples are as follows, unless otherwise specified.
【0032】 阻害活性の検定用セルラーゼとしては
アスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatu
s)の産生するセルラーゼ(以下、FI-CMCaseとする)を
用い、村尾らの方法に従って精製した〔Method in Enzy
mol.,160巻,274−299(1988)〕。As cellulase for assaying inhibitory activity, Aspergillus aculeatu (Aspergillus aculeatu)
s) cellulase (hereinafter referred to as FI-CMCase) produced according to the method of Murao et al. [Method in Enzy
mol., 160 volumes, 274-299 (1988)].
【0033】 セルラーゼ阻害活性の測定法はセルラ
ーゼ溶液は、FI-CMCaseを100mM酢酸緩衝液(pH5.0)中
で80munits/mlの濃度になるように調製した。基質溶液
は、カルボキシメチルセルロース(和光純薬製、置換度
0.65、平均重合度500)を、100mM酢酸緩衝液(pH5.0)
に1.0%(W/V)に溶解したものを用いた。A cellulase solution was prepared by measuring FI-CMCase in 100 mM acetate buffer (pH 5.0) to a concentration of 80 munits / ml. Substrate solution is carboxymethyl cellulose (Wako Pure Chemical Industries, substitution degree
0.65, average degree of polymerization 500), 100 mM acetate buffer (pH 5.0)
The one dissolved in 1.0% (W / V) was used.
【0034】セルラーゼ溶液0.25mlに、阻害剤溶液0.25
mlを加え、37℃で10分間作用させた後、基質溶液0.5ml
を加え、37℃で10分間酵素反応させる。その後、1mlの
アルカリ銅溶液を加えて反応を停止する。これを密栓し
て15分間、沸騰水浴中で加熱した後3分間水冷する。さ
らにネルソン試薬を1ml加えて20分間発色させ、10mlに
定容して500nmの吸光度(T)を測定する。0.25 ml of cellulase solution and 0.25 ml of inhibitor solution
After adding ml and letting it work at 37 ℃ for 10 minutes, 0.5 ml of substrate solution
Is added and the enzyme reaction is carried out at 37 ° C for 10 minutes. Then, the reaction is stopped by adding 1 ml of an alkaline copper solution. This is tightly closed, heated in a boiling water bath for 15 minutes, and then cooled in water for 3 minutes. Further, 1 ml of Nelson's reagent is added, color is developed for 20 minutes, and the volume is adjusted to 10 ml, and the absorbance (T) at 500 nm is measured.
【0035】スタンダードとして、阻害剤溶液の代わり
に、蒸留水0.25mlを加えて同様に操作して、吸光度
(S)を測定する。As a standard, 0.25 ml of distilled water was added instead of the inhibitor solution, and the same operation was performed to measure the absorbance (S).
【0036】コントロールとして、基質溶液とアルカリ
銅溶液に添加順序を逆にして同様に操作した後、吸光度
(C)を測定する。As a control, the substrate solution and the alkali copper solution were added in reverse order and the same operation was performed, and then the absorbance (C) was measured.
【0037】ブランクとして、阻害剤溶液の代わりに、
蒸留水0.25mlを加え、コントロール測定と同様に操作し
て、吸光度(B)を測定する。As a blank, instead of the inhibitor solution,
Distilled water (0.25 ml) is added, and the absorbance (B) is measured in the same manner as the control measurement.
【0038】阻害率は次式に従って求め、阻害剤の阻害
活性の1単位は50%の阻害率を示す阻害剤量とした。 阻害率(%)=〔(S−B)−(T−C)〕/(S−
B)×100The inhibition rate was determined according to the following formula, and one unit of the inhibitory activity of the inhibitor was the amount of the inhibitor showing a 50% inhibition rate. Inhibition rate (%) = [(SB)-(TC)] / (S-
B) x 100
【0039】 酵素合成に用いるセルラーゼとしては
トリコデルマ・ビリデ由来のセルラーゼ(以下、セルラ
ーゼTとする)を使用した。Cellulase derived from Trichoderma viride (hereinafter referred to as cellulase T) was used as the cellulase used in the enzyme synthesis.
【0040】 SGIは前述した村尾等の方法に従っ
て調製した。SGI was prepared according to the method of Murao et al.
【0041】 セロオリゴ糖混合物は、前述した坂本
らの方法に従って調製した。The cellooligosaccharide mixture was prepared according to the method of Sakamoto et al.
【0042】実験例1 基質の種類の影響 10%の各種セロオリゴ糖、2%SGI、1%セルラーゼ
Tを50%のDMSOを含む100mM酢酸緩衝液(pH5.0)中
で37℃、24時間反応させた。反応液を15分間沸騰水浴中
で加熱して反応を停止した後、阻害活性を調べた。 Experimental Example 1 Effect of type of substrate 10% various cellooligosaccharides, 2% SGI, 1% cellulase T were reacted in 100 mM acetate buffer (pH 5.0) containing 50% DMSO at 37 ° C. for 24 hours. Let The reaction solution was heated in a boiling water bath for 15 minutes to stop the reaction, and then the inhibitory activity was examined.
【0043】セロオリゴ糖としては、セロビオース、セ
ロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、
セロヘキサオース、セロヘプタオースの水溶性セロオリ
ゴ糖および不溶性セロオリゴ糖を用いた。その結果を表
1に示す。The cellooligosaccharides include cellobiose, cellotriose, cellotetraose, cellopentaose,
Water-soluble cellooligosaccharides and insoluble cellooligosaccharides of cellohexaose and celloheptaose were used. The results are shown in Table 1.
【0044】[0044]
【表1】 [Table 1]
【0045】基質にセロビオース、不溶性セロオリゴ糖
を用いたときには阻害活性はみられなかった。不溶性セ
ロオリゴ糖の場合には反応物が沈殿物として反応液から
取り除かれたのではないかと思われる。また、セロビオ
ースの場合は糖転移に関与する酵素の基質として適当で
ないか、或いは生成物が検定対象セルラーゼとしたFI-C
MCaseを阻害しないためではないかと思われる。No inhibitory activity was observed when cellobiose or insoluble cellooligosaccharide was used as the substrate. In the case of insoluble cellooligosaccharide, the reaction product may have been removed from the reaction solution as a precipitate. In the case of cellobiose, it is not suitable as a substrate for the enzyme involved in glycosyl transfer, or the product is FI-C
Probably because it does not inhibit MCase.
【0046】実験例2 溶媒の影響(1) 各種の溶媒と100mM酢酸緩衝液(pH5.0)とを1:1或い
は3:7の比で混合した混合溶媒中に、10%のセロオリ
ゴ糖混合物、2%SGI、1%セルラーゼTを加え、37
℃で24時間反応を行い。生成した阻害剤の阻害活性を求
めた。阻害活性としてはSGI 100μgから生成した
阻害剤のユニット数として求めた。その結果を表2に示
す。 Experimental Example 2 Effect of Solvent (1) 10% cellooligosaccharide mixture in a mixed solvent prepared by mixing various solvents with 100 mM acetate buffer (pH 5.0) at a ratio of 1: 1 or 3: 7. Add 2% SGI, 1% cellulase T, 37
Perform the reaction for 24 hours at ℃. The inhibitory activity of the produced inhibitor was determined. The inhibitory activity was determined as the number of units of the inhibitor produced from 100 μg of SGI. The results are shown in Table 2.
【0047】[0047]
【表2】 [Table 2]
【0048】30%DMSOを含む酢酸緩衝液中で行うの
が最も効果的であった。次いで30%メタノールが良かっ
た。また、有機溶媒を全く含まない酢酸緩衝液そのもの
でも高い阻害活性が認められた。It was most effective when carried out in an acetate buffer containing 30% DMSO. Then 30% methanol was good. Further, a high inhibitory activity was observed even in the acetate buffer itself containing no organic solvent.
【0049】実験例3 溶媒の影響(2) 実験例2の結果より、溶媒にはDMSOを含んだ混合溶
媒系を用いることにし、続いて阻害剤生産に対するDM
SOの濃度の影響を調べた。100mM酢酸緩衝液(pH5.0)
にDMSOをいろいろな混合比で加えた混合溶媒中に、
10%セロオリゴ糖混合物、2%SGI、1%セルラーゼ
T加え37℃で48時間反応を行い、阻害活性の時間経過に
伴う変化を調べた。その結果を図1に示す。阻害剤の生
産は全反応を通して30%DMSOを含んだ溶媒中で最も
効果的に行われていた。また阻害活性は約48時間で最高
に達していると考えられる。 Experimental Example 3 Effect of Solvent (2) From the results of Experimental Example 2, it was decided to use a mixed solvent system containing DMSO as the solvent, and subsequently DM for inhibitor production.
The effect of SO concentration was investigated. 100 mM acetate buffer (pH 5.0)
In DMSO at various mixing ratios,
A 10% cellooligosaccharide mixture, 2% SGI, and 1% cellulase T were added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 48 hours, and the change in inhibitory activity with time was examined. The result is shown in FIG. Inhibitor production was most efficient in solvents containing 30% DMSO throughout the reaction. Moreover, the inhibitory activity is considered to have reached the maximum in about 48 hours.
【0050】実験例4 反応温度の影響 実験例3の結果より、反応の溶媒としては30%DMSO
を含んだ混合溶媒系を用いることに設定し、各温度にお
ける阻害剤の生産量を調べた。30%DMSOを含む100m
M酢酸緩衝液(pH5.0)中で10%セロオリゴ糖混合物、2
%SGI、1%セルラーゼTを用いて反応を行った。阻
害活性の時間経過に伴う変化を調べた。その結果を図2
に示す。阻害活性は37℃で最も高かった。50℃での反応
では反応液の粘性の低下などから推測すると、加水分解
の反応の方が進行していると考えられる。 Experimental Example 4 Effect of Reaction Temperature From the results of Experimental Example 3, 30% DMSO was used as the reaction solvent.
The production amount of the inhibitor at each temperature was examined by setting to use a mixed solvent system containing 100m including 30% DMSO
10% cellooligosaccharide mixture in M acetate buffer (pH 5.0), 2
The reaction was performed using% SGI, 1% cellulase T. The change in inhibitory activity with time was examined. The result is shown in Figure 2.
Shown in. The inhibitory activity was highest at 37 ° C. In the reaction at 50 ° C, it is considered that the hydrolysis reaction is progressing, as inferred from the decrease in the viscosity of the reaction solution.
【0051】実験例5 pHの影響 30%DMSOを含むいろいろなpHの緩衝液中に10%セロ
オリゴ糖混合物、2%SGI、1%セルラーゼTを加え
て37℃で反応を行い、阻害活性の時間経過に伴う変化を
調べた。その結果を図3に示す。使用した緩衝液は、pH
3.0;酢酸ナトリウム−HCl緩衝液、pH4.0,pH5.0;酢酸
ナトリウム−酢酸緩衝液、pH6.0;リン酸ナトリウム緩
衝液である。pH5.0のときに生成する阻害剤量が最大と
なった。 Experimental Example 5 Effect of pH 10% cellooligosaccharide mixture, 2% SGI and 1% cellulase T were added to buffers of various pH containing 30% DMSO and the reaction was carried out at 37 ° C. The changes with time were examined. The result is shown in FIG. The buffer used is pH
3.0; sodium acetate-HCl buffer, pH 4.0, pH 5.0; sodium acetate-acetate buffer, pH 6.0; sodium phosphate buffer. The maximum amount of inhibitor produced was at pH 5.0.
【0052】実験例6 酵素濃度の影響 30%DMSOを含む酢酸緩衝液(pH5.0)中で10%セロ
オリゴ糖混合物、2%SGIを用いた37℃での反応で、
酵素濃度を変化させてそれぞれの阻害剤活性の時間経過
に伴う増加を調べた。その結果を図4に示す。生成した
阻害剤量は2.5%セルラーゼTの時に最も多かった。酵
素濃度を4.0%まで増やすと、加水分解が進み過ぎて転
移反応の基質が減少してしまった可能性が考えられる。 Experimental Example 6 Effect of enzyme concentration In a reaction at 37 ° C. using a 10% cellooligosaccharide mixture and 2% SGI in an acetate buffer (pH 5.0) containing 30% DMSO,
The enzyme concentration was changed to examine the increase in each inhibitor activity over time. The result is shown in FIG. The amount of inhibitor produced was highest at 2.5% Cellulase T. When the enzyme concentration was increased to 4.0%, it is possible that the hydrolysis proceeded too much and the substrate for the transfer reaction decreased.
【0053】以上、実験例1〜実験例5の反応条件につ
いての検討の結果、下記の様な最適反応条件が設定され
た。この最適条件では生産される阻害活性は110単位/m
l反応液となった。As a result of the examination of the reaction conditions of Experimental Examples 1 to 5, the following optimum reaction conditions were set. The inhibitory activity produced under these optimal conditions is 110 units / m
l became the reaction solution.
【0054】 セロオリゴ糖混合物 10 % SGI 2 % セルラーゼT 2.5 % 30%DMSO含有100mM酢酸緩衝液(pH5.0)、37℃、48
時間反応する。Cellooligosaccharide mixture 10% SGI 2% Cellulase T 2.5% 30% DMSO-containing 100 mM acetate buffer (pH 5.0), 37 ° C., 48
React on time.
【0055】実験例7 上記の最適条件で得られた阻害
剤の樹脂に対する吸着性 得られた阻害剤がセロオリゴ糖の加水分解でできた中性
糖によるものでないかを確かめるために、イオン交換樹
脂に対する吸着性について検討した。まずDowex 50W X4
(H+-form)に対する吸着性について調べたところ、阻
害活性は吸着画分に認められた。続いてDowex 1 X8(OH
--form)に対する吸着性について調べたところ阻害活性
は非吸着画分に存在することがわかった。さらにSGI
そのものではセルラーゼは阻害しない。そこで、この阻
害性物質はSGIに由来した反応産物であると判断し
た。 Experimental Example 7 Inhibition obtained under the above optimum conditions
Adsorption of the agent to the resin In order to confirm whether or not the obtained inhibitor is due to the neutral sugar formed by the hydrolysis of cellooligosaccharide, the adsorption to the ion exchange resin was examined. First Dowex 50W X4
When the adsorptivity to (H + -form) was examined, the inhibitory activity was found in the adsorbed fraction. Then Dowex 1 X8 (OH
- The inhibitory activity was examined for the adsorption against -form) was found to be present in the non-adsorbed fraction. Further SGI
It does not inhibit cellulase by itself. Therefore, it was determined that this inhibitory substance was a reaction product derived from SGI.
【0056】[0056]
【実施例】 実施例1 阻害剤の生産及び精製 セロオリゴ糖混合物 5.0 g SGI 1.0 g セルラーゼT 1.3 g 100mM酢酸緩衝液(pH5.0)(30%DMSO含有) 50 ml 37℃、48時間反応を行い、沸騰水浴中で15分間煮沸して
反応を停止したのち、その上清を下記のようにして精製
した。Example 1 Production and Purification of Inhibitor Cellooligosaccharide Mixture 5.0 g SGI 1.0 g Cellulase T 1.3 g 100 mM Acetate Buffer (pH 5.0) (containing 30% DMSO) 50 ml Reaction at 37 ° C. for 48 hours After stopping the reaction by boiling for 15 minutes in a boiling water bath, the supernatant was purified as follows.
【0057】阻害剤の精製用カラム充填剤には、Dowex
50W X4、Dowex 1 X8(ダウケミカル社)、Bio-Gel P-2
(Bio-Rad社)を用い、分取ペーパークロマトグラフィ
ーにはWhatman 3MM chr. paper(Whatman社)を、薄層
クロマトグラフィーには、Kieselgel 60 F254(Merck
社)を用いた。Column packings for inhibitor purification include Dowex
50W X4, Dowex 1 X8 (Dow Chemical Company), Bio-Gel P-2
(Bio-Rad) using Whatman 3MM chr. Paper (Whatman) for preparative paper chromatography and Kieselgel 60 F254 (Merck) for thin layer chromatography.
Company) was used.
【0058】ペーパーおよび薄層クロマトグラフィーに
おける検出は下記の試薬を用いた。アルカリ性−硝酸銀試薬 飽和AgNO3水溶液1mlにアセトン200mlを加え、生じた沈
殿を水(約5ml)を加えて溶解させる。この液を濾紙ま
たは薄層に噴霧して乾かし、0.5N NaOH−エタノール
溶液を噴霧して、スポットが鮮明になったら5% Na2S
2O3に浸して洗う。The following reagents were used for detection in paper and thin layer chromatography. 200 ml of acetone is added to 1 ml of an aqueous solution of AgNO 3 saturated with an alkaline-silver nitrate reagent , and the resulting precipitate is dissolved by adding water (about 5 ml). This solution is sprayed on filter paper or a thin layer to dry it, and sprayed with 0.5N NaOH-ethanol solution. When the spot becomes clear, 5% Na 2 S is added.
Soak in 2 O 3 and wash.
【0059】バニリン−硫酸試薬 バニリン0.6gを20mlのエタノールに溶かし、さらにこ
の溶液に濃硫酸0.6mlを加える。この液を薄層に噴霧し1
00〜110℃で数分間加熱する。 Vanillin-sulfuric acid reagent 0.6 g of vanillin is dissolved in 20 ml of ethanol, and 0.6 ml of concentrated sulfuric acid is further added to this solution. Spray this solution into a thin layer 1
Heat at 00-110 ° C for a few minutes.
【0060】ステップA Dowex 50W X4(H+-form)カ
ラムクロマトグラフィー 精製の出発物質である反応上清50mlをあらかじめ蒸留水
で洗浄したDowex 50W X4カラム(H+-form,1.5×18cm)
に吸着させ、300mlの蒸留水で洗浄後、0.5Nアンモニア
水300mlで溶出させ、溶出液は10mlずつに分画して集め
た。 Step A Dowex 50W X4 (H + -form)
Dowex 50W X4 column (H + -form, 1.5 x 18 cm) in which 50 ml of the reaction supernatant, which is the starting material for the ram chromatography purification, was washed with distilled water beforehand.
It was adsorbed on and washed with 300 ml of distilled water and then eluted with 300 ml of 0.5N ammonia water. The eluate was fractionated into 10 ml and collected.
【0061】阻害活性は吸着画分に認められ、活性画分
約200mlをエバポレーターで濃縮し褐色のシラップ2.2g
を得た。The inhibitory activity was observed in the adsorbed fraction, and about 200 ml of the active fraction was concentrated with an evaporator to obtain 2.2 g of brown syrup.
Got
【0062】ステップB Dowex 1 X8(OH--form)カラ
ムクロマトグラフィー ステップAで得られたシラップを10mlの蒸留水に溶解
し、あらかじめ蒸留水で洗浄したDowex 1 X8カラム(OH
--form,1.5×10cm)に添加し、蒸留水200mlで溶出させ
た。阻害活性は非吸着画分に認められ、活性画分150ml
をエバポレーターで濃縮し褐色のシラップ1.8gを得
た。 Step B Dowex 1 X8 (OH -- form) Color
Chromatography Step A The syrup obtained in Step A was dissolved in 10 ml of distilled water, and the Dowex 1 X8 column (OH
- -form, was added to 1.5 × 10 cm), eluted with distilled water 200 ml. Inhibitory activity was found in non-adsorbed fraction, active fraction 150 ml
Was concentrated with an evaporator to obtain 1.8 g of brown syrup.
【0063】ステップC Bio-Gel P-2によるゲル濾過 ステップBで得られたシラップを、3mlの10%ピリジン
溶液に溶解し、あらかじめ10%ピリジン溶液で平衡化し
たBio-Gel P-2(2.5×90 cm)のカラムに添加しゲル濾
過を行った。なお、展開液としては、同じ10%ピリジン
溶液を用い、溶出液は5mlづつ分画して集めた。 Step C Gel filtration with Bio-Gel P-2 Bio-Gel P-2 (2.5%) prepared by dissolving the syrup obtained in Step B in 3 ml of 10% pyridine solution and previously equilibrated with 10% pyridine solution. It was added to a column of × 90 cm) and gel filtration was performed. The same 10% pyridine solution was used as the developing solution, and the eluate was fractionated into 5 ml and collected.
【0064】阻害活性は4つの区分(F-I、F-II、F-III
及びF-IV)に分離された。すなわち、分子量の異なる少
なくとも4種類以上の阻害剤が存在することがわかっ
た。このうちF-I、F-II画分については活性が低く、さ
らに各フラクションについてTLCをn−ブタノール:
エタノール:クロロホルム:28%アンモニア水=4:
5:2:8の展開溶媒を用いて行った結果、量も少なく
またさらに多くの阻害剤の混合物であることがうかがえ
たので、以後F-III、F-IVについて精製を進めた。Inhibitory activity is divided into four categories (FI, F-II, F-III
And F-IV). That is, it was found that there are at least four types of inhibitors having different molecular weights. Of these, the activity was low in the FI and F-II fractions, and the TLC was analyzed by n-butanol:
Ethanol: chloroform: 28% ammonia water = 4:
As a result of carrying out with a developing solvent of 5: 2: 8, it was confirmed that the mixture was a small amount and a larger amount of the inhibitor. Therefore, purification of F-III and F-IV was proceeded thereafter.
【0065】それぞれのフラクションをエバポレーター
を用いて濃縮しシラップ状の物質を、F-III画分につい
ては41mg、F-IV画分については75mg得ることができた。Each fraction was concentrated using an evaporator to obtain a syrupy substance (41 mg for F-III fraction and 75 mg for F-IV fraction).
【0066】ステップD Whatman 3MM chr. paperによ
る分取ペーパークロマトグラフィー ステップCで得られたF-III、F-IVそれぞれを最少量の
蒸留水に溶解し、Whatman 3MM chr. paper(20×40cm)
による分取ペーパークロマトグラフィーを行った。展開
溶媒にはn−ブタノール:ピリジン:水=6:4:3を
用い、多重展開法により展開した。 Step D According to Whatman 3MM chr. Paper
Preparative Paper Chromatography F-III and F-IV obtained in Step C are each dissolved in a minimum amount of distilled water, and Whatman 3MM chr. Paper (20 × 40 cm)
Preparative paper chromatography was performed. N-Butanol: pyridine: water = 6: 4: 3 was used as the developing solvent, and the solvent was developed by the multiple developing method.
【0067】展開終了したペーパーの一部をアルカリ性
−硝酸銀溶液を用いて発色させ、それぞれに対応する部
分を蒸留水で抽出した。結果としてF-IIIより2種類、F
-IVより2種類の活性物質を得たので、それぞれのペー
パークロマトグラフィーでのRf値の大きなほうをF-II
I-1、F-IV-1に、小さなほうをF-III-2、F-IV-2とした。
それぞれをエバポレーターを用いて溶媒を除去し、F-II
I-1を14.7mg、F-III-2を12.2mg、F-IV-1を43.3mg、F-IV
-2を16.4mg得た。A part of the developed paper was developed with an alkaline-silver nitrate solution, and the corresponding parts were extracted with distilled water. As a result, two types from F-III, F
Since two kinds of active substances were obtained from -IV, the one with the larger Rf value in each paper chromatography was F-II.
The smaller ones were designated as I-1, F-IV-1 and F-III-2, F-IV-2.
Remove the solvent from each using an evaporator and use F-II
I-1 14.7 mg, F-III-2 12.2 mg, F-IV-1 43.3 mg, F-IV
16.4 mg of -2 was obtained.
【0068】ステップE Dowex 1 X8(OH--form)カラ
ムクロマトグラフィー ステップDで得られたそれぞれの画分を1mlの蒸留水に
溶解し、あらかじめ蒸留水で洗浄したDowex 1 X8カラム
(OH--form,1.5×5cm)に添加し、蒸留水40mlで溶出
させた。それぞれをエバポレーターを用いて溶媒を除去
し、F-III-1を8.6mg、F-III-2を7.0 mg、F-IV-1を32.0m
g、F-IV-2を10.4mg得た。 Step E Dowex 1 X8 (OH -- form) Color
The respective fractions obtained in Step D of Chromatography were dissolved in 1 ml of distilled water and added to a Dowex 1 X8 column (OH -- form, 1.5 x 5 cm) which had been washed with distilled water in advance, and 40 ml of distilled water was added. It was eluted. The solvent was removed from each using an evaporator, and F-III-1 was 8.6 mg, F-III-2 was 7.0 mg, and F-IV-1 was 32.0 m.
10.4 mg of g and F-IV-2 was obtained.
【0069】精製した阻害剤の単一性を、シリカゲルを
用いた薄層クロマトグラフィー(TLC)により検討し
た。The homogeneity of the purified inhibitors was investigated by thin layer chromatography (TLC) on silica gel.
【0070】実験方法 TLCの担体としては、市販のKieselgel 60F plate(M
erck社製)を用いた。展開溶媒としては、次の組成の2
つの溶媒系を用い、室温で展開した。 A:クロロホルム:メタノール:18.7%アンモニア水=
4:5:3 B:n−ブタノール:エタノール: クロロホルム:28
%アンモニア水=4:5:2:8 Experimental method As a carrier for TLC, commercially available Kieselgel 60F plate (M
erck) was used. As the developing solvent, 2 of the following composition
It was developed at room temperature using two solvent systems. A: Chloroform: Methanol: 18.7% ammonia water =
4: 5: 3 B: n-butanol: ethanol: chloroform: 28
% Ammonia water = 4: 5: 2: 8
【0071】発色法としては、バニリン−硫酸発色法及
びアルカリ性−硝酸銀発色法を用いた。その結果、どち
らの溶媒系においてもそれぞれ単一のスポットとして認
められた。As the coloring method, a vanillin-sulfuric acid coloring method and an alkaline-silver nitrate coloring method were used. As a result, it was recognized as a single spot in both solvent systems.
【0072】実施例2 実施例1で得られた各種の阻害
剤の構造決定ガスクロマトグラフィー(GLC)による分析 実験方法 各阻害剤200μgを1mlの2N−HClに溶解し、100℃で
2時間加水分解を行った。溶媒を減圧濃縮で取り除いた
後、福原らの方法〔Agric . Biol. Chem.,46巻,2021-
2030(1982)〕に準じてトリメチルシリル化(TMS
化)を行い、糖およびSGIをTMS誘導体としてGL
Cで分析した。TMS化は乾燥させた試料に200μlの
混合溶液(トリメチルクロルシラン:ヘキサメチルシラ
ザン:N,O−ビス(トリメチルシリル)アセトアミ
ド:ピリジン=1:2:2:10)を加え溶解させ、30秒
間激しく攪拌した後、80℃で30分間加熱した。その溶液
をGLC用の試料とした。また組成比の検定用としてグ
ルコースとSGIのモル比がグルコース/SGI=1,
2,3及び4である試料を調製しこれをTMS化してG
LCで分析した。Example 2 Structure Determination of Various Inhibitors Obtained in Example 1 Analysis by Gas Chromatography (GLC) Experimental Method 200 μg of each inhibitor was dissolved in 1 ml of 2N-HCl and hydrolyzed at 100 ° C. for 2 hours. It was disassembled. After removing the solvent by vacuum concentration, the method of Fukuhara et al. [Agric. Biol. Chem., 46, 2021-
2030 (1982)] and trimethylsilylation (TMS
), And sugar and SGI as GL as TMS derivative
Analyzed in C. For TMS conversion, 200 μl of a mixed solution (trimethylchlorosilane: hexamethylsilazane: N, O-bis (trimethylsilyl) acetamide: pyridine = 1: 2: 2: 10) was added to the dried sample and dissolved, followed by vigorous stirring for 30 seconds. After that, it was heated at 80 ° C. for 30 minutes. The solution was used as a sample for GLC. Also, for the purpose of assaying the composition ratio, the molar ratio of glucose and SGI is glucose / SGI = 1,
Samples of 2, 3, and 4 were prepared, and this was converted into TMS to obtain G
Analyzed by LC.
【0073】GLCは水素炎イオン検出器(FID)を
取り付けた日立G3000ガスクロマトグラフを用い、カラ
ムは直径2.2mm×220cmのステンレス−スチールカラム
に、4%SE-52をコートしたクロモソルブW(60〜80メ
ッシュ)を充填したものを用いた。カラム温度は、140
℃より開始し、1分間に5℃の割合で昇温させ、最終的
に190℃まで加温した。キャリアーガスとしては、窒素
ガスを用い、流速30ml/minの条件で行った。GLCに
おけるそれぞれの阻害剤の分析結果を図5、図6、図7
及び図8に示す。As the GLC, a Hitachi G3000 gas chromatograph equipped with a hydrogen flame ion detector (FID) was used. The column was a stainless steel column having a diameter of 2.2 mm × 220 cm and 4% SE-52 coated Chromosolve W (60- 80 mesh) was used. Column temperature is 140
Starting from ° C, the temperature was raised at a rate of 5 ° C per minute, and finally heated to 190 ° C. Nitrogen gas was used as the carrier gas, and the flow rate was 30 ml / min. The analysis results of each inhibitor in GLC are shown in FIG. 5, FIG. 6, and FIG.
And shown in FIG.
【0074】すべての阻害剤においてその保持時間より
グルコースとSGIであると考えられるピークが確認さ
れ、それ以外にはピークは確認されなかった。In all the inhibitors, the peaks considered to be glucose and SGI were confirmed from the retention times, and no other peaks were confirmed.
【0075】さらにそれらの組成比を調べるためにグル
コースとSGIを種々の混合比で調製した試料につい
て、そのモル比とFIDのピーク面積比についてプロッ
トしたものが図9である。この検量曲線からそれぞれの
阻害剤についてそのモル比を求めた結果を表3に示す。Further, FIG. 9 is a plot of the molar ratio and the peak area ratio of FID for samples prepared with various mixing ratios of glucose and SGI in order to investigate their composition ratio. Table 3 shows the results of obtaining the molar ratio of each inhibitor from this calibration curve.
【0076】[0076]
【表3】 [Table 3]
【0077】以上のとおり、すべての阻害剤はグルコー
スとSGIにより構成され、そのモル比が1から3のも
のであることが明らかとなった。As described above, it was revealed that all the inhibitors were composed of glucose and SGI, and the molar ratio thereof was 1 to 3.
【0078】阻害剤の還元末端残基 グルコースはソモギー・ネルソン試薬に対して陽性、S
GIは陰性である。この性質の違いを利用して、その還
元末端残基が何であるかについて検討した。実験方法 各阻害剤20μgを1mlの蒸留水に溶解させ、その還元糖
量をソモギー・ネルソン法によりグルコースを標準物質
として比色定量した。 The reducing terminal residue glucose of the inhibitor was positive for Somogy Nelson's reagent, S
GI is negative. Taking advantage of this difference in properties, we examined what the reducing end residue is. Experimental method 20 μg of each inhibitor was dissolved in 1 ml of distilled water, and the reducing sugar amount was colorimetrically determined by the Somogy Nelson method using glucose as a standard substance.
【0079】その結果、4種の阻害剤は全てドモギー・
ネルソン反応に陰性であった。これより阻害剤は全てそ
の還元末端にSGIをもつものであると考えられる。As a result, all four inhibitors were dominated
Nelson reaction was negative. From this, it is considered that all the inhibitors have SGI at their reducing ends.
【0080】セルラーゼ阻害剤のβ−グルコシダーゼに
よる分解 グルコースとSGIとのモル比が2:1あるいは3:1
である3つの阻害剤、F-III-1、F-III-2およびF-IV-2に
ついてβ−グルコシダーゼによる分解を行い、どのよう
な分解産物を生成するのかを、反応液の一部を一定時間
ごとに取りTLCによる同定を試みた。For cellulase inhibitor β-glucosidase
The decomposed glucose and SGI have a molar ratio of 2: 1 or 3: 1.
The three inhibitors, F-III-1, F-III-2 and F-IV-2, are decomposed by β-glucosidase, and what kind of decomposition product is produced Attempts were made at regular intervals to identify by TLC.
【0081】実験方法 各阻害剤200μgを50μlの蒸留水に溶解させ、これに1
00mM酢酸緩衝液(pH5.0)に1mg/mlの濃度で溶解させ
たアーモンドβ−グルコシダーゼ(シグマ社製)50μl
を加え37℃で26時間(F-III -2)または12時間( F-III
-1,F-IV-2)反応を行った。反 応液の一部を取り熱処
理(100℃,15分間)した後、TLC分析に供した 。
TLC分析は担体としてKieselgel 60F254(Merck社
製)を、展開溶媒としてはn−ブタノール:エタノー
ル:クロロホルム:28 %アンモニア水=4:5:2:
8を用いた。発色はバニリン硫酸発色で行った。なお、
標準物質としてグルコース、F-IV-1,F-IV-2およびF- I
II-1を同時に展開した。 Experimental Method 200 μg of each inhibitor was dissolved in 50 μl of distilled water, and
50 μl of almond β-glucosidase (manufactured by Sigma) dissolved in 00 mM acetate buffer (pH 5.0) at a concentration of 1 mg / ml.
And at 37 ℃ for 26 hours (F-III -2) or 12 hours (F-III
-1, F-IV-2) reaction was performed. A part of the reaction solution was taken and heat-treated (100 ° C, 15 minutes), and then subjected to TLC analysis.
TLC analysis was performed using Kieselgel 60F254 (Merck) as a carrier.
As a developing solvent, n-butanol: ethanol: chloroform: 28% aqueous ammonia = 4: 5: 2:
8 was used. The color was developed by vanillin sulfate color development. In addition,
Glucose, F-IV-1, F-IV-2 and F-I as standards
II-1 was deployed at the same time.
【0082】F-III-2のβ−グルコシダーゼによる分解
の結果を図10に示す。反応開始後4時間でRf値より判
断し、グルコースとF-IV-2と同定できるスポットが検出
された。さらに反応が進むとF-IV-2からさらにグルコー
スが取り除かれたものと思われるスポットも認められた
が、これは今回単離したどの阻害剤ともRf値が一致し
なかった。反応は14時間目から26時間目の間ではもはや
ほとんど進んでいないようであった。これは今回未同定
の物質がさらに分解をうけて放出されたわずかのSGI
によりβ−グルコシダーゼが阻害されたためであると考
えられる。β−グルコシダーゼは非還元末端側からグル
コースを放出していく酵素であるので、これらのことか
らF-III-2はF-IV-2の非還元末端側にグルコース残基が
ひとつ、β−グルコシド結合でつながったものであると
考えられる。また、F-IV-2のβ−グルコシダーゼによる
分解の結果を図11に示す。F-III-2の時と同様、β−グ
ルコシダーゼによる分解反応により、F-IV-2よりグルコ
ースと今回未同定の物質のスポットが検出された。この
ことからも、やはりF-IV-2はF-III-2の部分構造を形成
していると考えられる。The results of the decomposition of F-III-2 by β-glucosidase are shown in FIG. Judging from the Rf value 4 hours after the start of the reaction, spots capable of identifying glucose and F-IV-2 were detected. As the reaction proceeded further, some spots were observed in which glucose was further removed from F-IV-2, but this did not match the Rf value with any of the inhibitors isolated this time. The reaction appeared to be almost gone between 14 and 26 hours. This is a small amount of SGI that was released after the unidentified substance was further decomposed.
It is considered that this is because β-glucosidase was inhibited by Since β-glucosidase is an enzyme that releases glucose from the non-reducing end side, these results indicate that F-III-2 has one glucose residue on the non-reducing end side of F-IV-2, β-glucoside. It is considered that they are connected by a bond. In addition, the results of the decomposition of F-IV-2 by β-glucosidase are shown in FIG. Similar to the case of F-III-2, spots of glucose and unidentified substance were detected from F-IV-2 by the decomposition reaction with β-glucosidase. From this, it is considered that F-IV-2 also forms a partial structure of F-III-2.
【0083】F-III-1のβ−グルコシダーゼによる分解
の結果を図12に示した。反応開始6時間後にはβ−グル
コシダーゼによる分解産物のスポットが検出された。用
いた展開溶媒でのグルコースとF-IV-1のRf値が非常に
近く、これらをきれいに分離する良い展開溶媒を見付け
られなかったためはっきりとは言い難いがバニリン硫酸
発色での両者の発色が若干異なることから、この分解産
物はグルコースとF-IV-1であると考えられる。よって、
F-III-1はF-IV-1の非還元末端にグルコース残基がひと
つβ−グルコシド結合でつながったものであると考えら
れる。The results of the decomposition of F-III-1 by β-glucosidase are shown in FIG. Six hours after the start of the reaction, spots of decomposition products of β-glucosidase were detected. The Rf values of glucose and F-IV-1 in the developing solvent used were very close to each other, and it was difficult to say clearly because a good developing solvent that could separate them was not found. Since they are different, this degradation product is considered to be glucose and F-IV-1. Therefore,
F-III-1 is considered to have one glucose residue linked to the non-reducing end of F-IV-1 by a β-glucoside bond.
【0084】NMRによる構造解析 実験方法 1 H及び13C−NMRは内部標準にTSP(Trimethylsily
lpropanesulfonicacid)を添加して、D2O中で日本電子G
X-270を使用して測定した。グルコースおよびSGIの
ケミカルシフトと比較し、それぞれのシグナルを帰属し
た。 Structural analysis experimental method by NMR 1 H and 13 C-NMR were analyzed using TSP (Trimethylsily) as an internal standard.
lpropanesulfonic acid) and added to JEOL G in D 2 O.
It was measured using X-270. The respective signals were assigned by comparison with the chemical shifts of glucose and SGI.
【0085】[0085]
【表4】 [Table 4]
【0086】そしてそれらのケミカルシフトの変化をい
ろいろなグルコオリゴ糖のケミカルシフト値〔J. Chem.
Soc.,2425-2432(1973)〕と照らし合わせたところ、 F-IV-1 G−(1→4)−SGI F-IV-2 G−(1→4)−G−(1→6)−SGI F-III-1 G−(1→4)−G−(1→4)−SGI (G:グルコース) といった、結合様式のグルコシド結合からなっていると
考えられる。また、F-III-1、F-IV-1及びF-IV-2の1H−
NMRスペクトルにおけるアノメリックなプロトンのケ
ミカルシフトおよび結合定数を示す。Then, the changes in these chemical shifts were determined by changing the chemical shift values of various glucooligosaccharides [J. Chem.
Soc., 2425-2432 (1973)], F-IV-1 G- (1 → 4) -SGI F-IV-2 G- (1 → 4) -G- (1 → 6) -SGI F-III-1 G- (1 → 4) -G- (1 → 4) -SGI (G: glucose) is considered to be composed of a glucoside bond in a binding mode. In addition, 1 H- of F-III-1, F-IV-1 and F-IV-2
The chemical shift and the coupling constant of an anomeric proton in an NMR spectrum are shown.
【0087】[0087]
【表5】 [Table 5]
【0088】これらの値を各種グルコオリゴ糖の結合定
数〔Cabohyd. Res.,33巻,105-116(1974)〕と比較し
たところ、これらの阻害剤を構成するグルコシド結合は
すべてβ結合からなっていると考えられる。When these values were compared with the binding constants of various glucooligosaccharides [Cabohyd. Res., 33, 105-116 (1974)], the glucoside bonds constituting these inhibitors were all β bonds. It is believed that
【0089】これまでに得られた知見をもとに考えられ
る各阻害剤の推定構造を化14〜化16に示した。F-III-2
についてはNMRによる分析は行わなかったが、β−グ
ルコシダーゼによりF-IV-2とグルコースに分解されたこ
とや他の阻害剤の構造から考えていろいろな大きさのセ
ロオリゴ糖の還元末端にSGIが付加しているとから考
え、化17に示したような構造をもっていると考えられ
る。The putative structures of the respective inhibitors, which are considered based on the findings obtained so far, are shown in Chemical formulas 14 to 16. F-III-2
Was not analyzed by NMR, but considering that it was decomposed into F-IV-2 and glucose by β-glucosidase and the structure of other inhibitors, SGI was found at the reducing end of cellooligosaccharides of various sizes. Considering that they are added, it is considered that they have the structure shown in Chemical formula 17.
【0090】[0090]
【化14】 [Chemical 14]
【0091】[0091]
【化15】 [Chemical 15]
【0092】[0092]
【化16】 [Chemical 16]
【0093】[0093]
【化17】 [Chemical 17]
【0094】実施例3 阻害剤のセルラーゼに対する阻
害作用 阻害定数の測定は酵素液0.5mlに基質溶液0.5mlを加え、
37℃で10分間反応させた時に放出される還元糖量をソモ
ギー・ネルソン法により測定し、グルコースを同様の系
で発色させて得た標準曲線よりグルコース換算として求
めた。なお、酵素活性の1単位は、1分間に1μmolの
グルコースを放出させる酵素量と規定した。また、セル
ラーゼとF-III-1との結合によって生じる紫外部の差吸
収スペクトルは日立 320型 Spectrophotometerを用い
て測定した。Example 3 Inhibitory Effect of Inhibitors on Cellulase The inhibition constant was measured by adding 0.5 ml of the substrate solution to 0.5 ml of the enzyme solution.
The amount of reducing sugar released when the reaction was carried out at 37 ° C. for 10 minutes was measured by the Somogy Nelson method, and glucose was calculated from a standard curve obtained by coloring glucose in the same system. One unit of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that released 1 μmol glucose per minute. In addition, the ultraviolet differential absorption spectrum generated by the binding of cellulase and F-III-1 was measured using Hitachi 320 type Spectrophotometer.
【0095】4種の阻害剤溶液を作用させ、酵素のCarb
oxymethyl cellulose(以下、CMCという)分解活性
に対する阻害度を求めた。酵素液は100mM酢酸緩衝液(p
H5.0)中で80ミリ単位/mlの濃度になるように調製し
た。阻害剤溶液としては、蒸留水中で4.0×10-4Mの濃
度で溶解したものを用いた。基質としてはCMCを100m
M同緩衝液に1.0%(W/V)に溶解したものを用いた。酵
素液0.25mlに阻害剤溶液0.25mlを加え、37℃で10分間プ
レインキュベートした後、基質0.5mlを加え37℃で10分
間反応させ阻害度を測定した。結果を表6に示す。The enzyme Carb was reacted with four kinds of inhibitor solutions.
The degree of inhibition of oxymethyl cellulose (hereinafter referred to as CMC) decomposition activity was determined. The enzyme solution is 100 mM acetate buffer (p
It was prepared in H5.0) to a concentration of 80 milliunits / ml. As the inhibitor solution, a solution dissolved in distilled water at a concentration of 4.0 × 10 −4 M was used. CMC 100m as a substrate
A solution of 1.0% (W / V) in the same buffer was used. After adding 0.25 ml of the inhibitor solution to 0.25 ml of the enzyme solution and pre-incubating at 37 ° C for 10 minutes, 0.5 ml of the substrate was added and reacted at 37 ° C for 10 minutes to measure the degree of inhibition. The results are shown in Table 6.
【0096】[0096]
【表6】 [Table 6]
【0097】FI-CMCaseに対する阻害度はF-III-1が最も
強く、次いでF-III-2、F-IV-1、F-IV-2の順であった。
これを見るとセルラーゼの基質特異性同様、β−1,4
グルコシド結合をもつものに対して親和性が高いことが
分かる。また、この酵素はエンド型であるためかグルコ
ース鎖の長い阻害剤に対し親和性が高かった。The degree of inhibition of FI-CMCase was highest in F-III-1, followed by F-III-2, F-IV-1, and F-IV-2 in that order.
This shows β-1,4 as well as the substrate specificity of cellulase.
It can be seen that it has a high affinity for those having a glucosidic bond. In addition, probably due to the endo-type of this enzyme, it had a high affinity for inhibitors with long glucose chains.
【0098】FI-CMCaseに対するF-III-1の阻害定数(K
i)を、Dixon Plot〔Biochem. J.,55巻,170(195
3)〕により求めた。基質溶液としてCMCを100mM酢酸
緩衝液中に1.0%および1.8%の2種の濃度に溶解したも
のを用いた。酵素液および測定条件は前記と同じ方法に
従って行った。結果を図13に示す。このグラフからF-II
I-1のFI-CMCaseに対する阻害定数は6.9×10-6Mと求め
られた。Inhibition constant of F-III-1 against FI-CMCase (K
i) to Dixon Plot [Biochem. J., 55, 170 (195
3)]. As a substrate solution, CMC dissolved in 100 mM acetate buffer at two concentrations of 1.0% and 1.8% was used. The enzyme solution and the measurement conditions were the same as described above. The results are shown in Fig. 13. From this graph, F-II
The inhibition constant of FI-CMCase of I-1 was determined to be 6.9 × 10 −6 M.
【0099】実施例4 CMCを基質とした分解活性に
対する各阻害剤の阻害度実験方法 使用した酵素(8種) カビ由来 酵素a アスペルギルス・アクレタス FI-CMCase 酵素b トリコデルマ・ビリデ Cellulase I-a2 酵素c クリプトコッカス・フラバス CMCase 酵素d イルペックス・ラクテウス Endo-type Cellul
ase 細菌由来 酵素e バチルス・ズブチリス Cellulase(BSC) 酵素f バチルス・エスピー N-4 Cellulase(NK1) 酵素g クロストリヂウム・セルロリチカム Endo-β-
1,4-glucanase 酵素h セルロモナス・ウダ CB4 CMCaseExample 4 Inhibition Degree of Each Inhibitor against Degradation Activity Using CMC as a Substrate Experimental Method Enzymes (8 kinds) Fungus-derived enzyme a Aspergillus acretas FI-CMCase enzyme b Trichoderma viride Cellulase Ia 2 enzyme c Cryptococcus・ Flavus CMCase Enzyme d Irpex ・ Lacteus Endo-type Cellul
ase Bacteria-derived enzyme e Bacillus subtilis Cellulase (BSC) enzyme f Bacillus sp. N-4 Cellulase (NK1) enzyme g Clostridium cellulolyticum Endo-β-
1,4-glucanase enzyme h Cellulomonas uda CB4 CMCase
【0100】CMC糖化型でさらにエンド型の酵素であ
るといわれている各種セルラーゼについて実施例1で得
られた4種の阻害剤溶液を作用させ、酵素のCMCase活性
に対する阻害度を求めた。酵素液はそれぞれ適当な緩衝
液中で80ミリ単位/mlの濃度になるように調製した。阻
害剤溶液としては蒸留水中で4.0×10-4Mの濃度で溶解
したものを用いた。基質としてはCMCを100mMの同じ
緩衝液に1.0%(W/V)に溶解したものを用いた。酵素液
0.25mlに阻害剤溶液0.25mlを加え37℃で10分間プレイン
キュベートした後、基質0.5mlを加え37℃で10分間反応
させ阻害度を測定した。結果を表7に示す。With respect to various cellulases which are said to be CMC saccharified type and further endo type enzymes, the four kinds of the inhibitor solutions obtained in Example 1 were allowed to act to determine the degree of inhibition of CMCase activity of the enzyme. Each enzyme solution was prepared in an appropriate buffer so as to have a concentration of 80 milliunit / ml. As the inhibitor solution, one dissolved in distilled water at a concentration of 4.0 × 10 −4 M was used. As a substrate, CMC dissolved in the same buffer solution of 100 mM at 1.0% (W / V) was used. Enzyme solution
After adding 0.25 ml of the inhibitor solution to 0.25 ml and pre-incubating at 37 ° C for 10 minutes, 0.5 ml of the substrate was added and reacted at 37 ° C for 10 minutes to measure the degree of inhibition. The results are shown in Table 7.
【0101】[0101]
【表7】 [Table 7]
【0102】どのセルラーゼに対してもF-III-1が最も
強い阻害活性を示した。その他の阻害剤による阻害は各
セルラーゼによりまちまちであったが、酵素dはF-IV-2
やF-III-2といったβ−1,6結合を持つものによって
は阻害を受けなかった。また、このセルラーゼや酵素h
は他のセルラーゼに比べると阻害剤による阻害を受けに
くいことが分かった。F-III-1 showed the strongest inhibitory activity against any cellulase. Inhibition by other inhibitors was different depending on each cellulase, but the enzyme d was F-IV-2.
It was not inhibited by those with β-1,6 bond such as F-III-2 and F-III-2. In addition, this cellulase and enzyme h
Was found to be less susceptible to inhibition by inhibitors than other cellulases.
【0103】実施例5 不溶性セロオリゴ糖を基質とし
た分解活性に対する各阻害剤の阻害度実験方法 使用した酵素(4種) カビ由来 酵素a アスペルギルス・アクレタス FI-CMCase 酵素i アスペルギルス・アクレタス FI-Avicelase 酵素j アスペルギルス・アクレタス FIII-Avicelase 酵素k イルペックス・ラクテウス Exo-type Cellula
seExample 5 Inhibition Degree of Each Inhibitor against Degradation Activity Using Insoluble Cellooligosaccharide as Substrate Experimental Method Enzymes (Four Kinds ) Mold Derived Enzyme a Aspergillus acretas FI-CMCase Enzyme i Aspergillus acretus FI-Avicelase Enzyme j Aspergillus acretas FIII-Avicelase enzyme k Ilpex lacuteus Exo-type Cellula
se
【0104】不溶性セロオリゴ糖の調製 不溶性セロオリゴ糖は前述の阪本の方法に従い調製した
もの(平均重合度=18)を使用した。 Preparation of insoluble cellooligosaccharide As the insoluble cellooligosaccharide, the one prepared according to the above-mentioned method of Sakamoto (average degree of polymerization = 18) was used.
【0105】不溶性セロオリゴ糖分解活性に対する阻害
活性測定 各酵素液をそれぞれ適当な緩衝液に溶解した溶液0.1ml
に同じ緩衝液に1%濃度に懸濁した不溶性セロオリゴ糖
0.1mlを加えて37℃、10分間反応させた。 Inhibition on insoluble cellooligosaccharide degrading activity
Activity measurement 0.1 ml of each enzyme solution dissolved in an appropriate buffer
Insoluble cellooligosaccharides suspended in the same buffer at 1% concentration
0.1 ml was added and reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
【0106】反応を停止した後、そこへ0.8mlの同じ緩
衝液を加え全量を2mlとし、以後、CMCase活性の場合と
同様の方法で測定した。After stopping the reaction, 0.8 ml of the same buffer was added to make the total volume 2 ml, and thereafter, the measurement was carried out in the same manner as in the case of CMCase activity.
【0107】酵素液は各緩衝液で240ミリ単位/mlの濃
度になるように調製した。阻害剤溶液としては 蒸留水
中で4.0×10-4Mの濃度で溶解したものを用いた。ま
た、CMC糖化型セルラーゼとの比較として酵素aにつ
いても測定した。結果を表8に示す。The enzyme solution was prepared so as to have a concentration of 240 milliunits / ml with each buffer solution. As the inhibitor solution, one dissolved in distilled water at a concentration of 4.0 × 10 −4 M was used. In addition, enzyme a was also measured as a comparison with CMC saccharified cellulase. The results are shown in Table 8.
【0108】[0108]
【表8】 [Table 8]
【0109】FI-CMCaseに対して各阻害剤はCMCase活性
の時とよく似た阻害のバランスを示し、加えた酵素量は
こちらのほうが多いにもかかわらずCMCを基質とした
とき以上の阻害活性を示した。これに比べてエキソ型酵
素においてはCMC糖化型と比べて阻害作用はかなり異
なっている。酵素i及び酵素jはどの阻害剤にも非常に
阻害されにくい。また、酵素kはβ−1,6結合を持つ
F-IV-2やF-III-2により強く阻害された。CMC糖化型
セルラーゼとアビセル糖化型セルラーゼの活性部位の構
造または分解機構にかなりの違いがあるということも考
えられる。Each inhibitor against FI-CMCase showed a similar inhibitory balance to that of CMCase activity, and the inhibitory activity was higher than that when CMC was used as a substrate although the amount of added enzyme was higher. showed that. In contrast, the inhibitory effect of the exo-type enzyme is considerably different from that of the glycated CMC. Enzyme i and enzyme j are very unlikely to be inhibited by any inhibitor. The enzyme k has β-1,6 bond.
It was strongly inhibited by F-IV-2 and F-III-2. It is also possible that there is a considerable difference in the structure or degradation mechanism of the active site between CMC saccharified cellulase and Avicel saccharified cellulase.
【0110】[0110]
【発明の効果】本発明で得られたセルラーゼ阻害剤は各
種のセルラーゼを強く阻害し、バイオマス産業、繊維産
業、食品産業及び白蟻等の害虫駆除に利用される。The cellulase inhibitor obtained by the present invention strongly inhibits various cellulases and is used for controlling pests such as biomass industry, textile industry, food industry and termites.
【図1】実験例3の結果を示すグラフであり、図中で黒
丸は10%濃度、白丸は20%濃度、黒三角は30%濃度、白
三角は40%濃度の結果を示す。FIG. 1 is a graph showing the results of Experimental Example 3, in which black circles show 10% concentration, white circles show 20% concentration, black triangles show 30% concentration, and white triangles show 40% concentration.
【図2】実験例4の結果を示すグラフであり、図中で黒
丸は30℃反応、白丸は37℃反応、白三角は50℃反応の結
果を示す。FIG. 2 is a graph showing the results of Experimental Example 4, in which the black circles indicate the results of 30 ° C. reaction, the white circles indicate the 37 ° C. reaction, and the white triangles indicate the 50 ° C. reaction.
【図3】実験例5の結果を示すグラフであり、図中で黒
丸はpH3.0、白丸はpH4.0、黒三角はpH5.0、白三角はpH
6.0の結果を示す。FIG. 3 is a graph showing the results of Experimental Example 5, in which black circles represent pH 3.0, white circles represent pH 4.0, black triangles represent pH 5.0, and white triangles represent pH.
The result of 6.0 is shown.
【図4】実験例6の結果を示すグラフであり、図中で黒
丸は1.0%、白丸は2.5%、白三角は4.0%の結果を示
す。FIG. 4 is a graph showing the results of Experimental Example 6, in which black circles are 1.0%, white circles are 2.5%, and white triangles are 4.0%.
【図5】阻害剤F-III-1を加水分解したのちTMS誘導
体としたガスクロマトグラフィーの結果を示し、図中で
Aはグルコース、BはSGIの吸収を示す。FIG. 5 shows the results of gas chromatography in which the inhibitor F-III-1 was hydrolyzed and then used as a TMS derivative. In the figure, A indicates glucose and B indicates SGI absorption.
【図6】阻害剤F-III-2を加水分解したのちTMS誘導
体としたガスクロマトグラフィーの結果を示し、図中で
Aはグルコース、BはSGIの吸収を示す。FIG. 6 shows the results of gas chromatography in which the inhibitor F-III-2 was hydrolyzed and then used as a TMS derivative. In the figure, A shows absorption of glucose and B shows absorption of SGI.
【図7】阻害剤F-IV-1を加水分解したのちTMS誘導体
としたガスクロマトグラフィーの結果を示し、図中でA
はグルコース、BはSGIの吸収を示す。FIG. 7 shows the results of gas chromatography in which the inhibitor F-IV-1 was hydrolyzed and then used as a TMS derivative.
Indicates glucose and B indicates SGI absorption.
【図8】阻害剤F-IV-2を加水分解したのちTMS誘導体
としたガスクロマトグラフィーの結果を示し、図中でA
はグルコース、BはSGIの吸収を示す。FIG. 8 shows the results of gas chromatography in which the inhibitor F-IV-2 was hydrolyzed and then used as a TMS derivative.
Indicates glucose and B indicates SGI absorption.
【図9】グルコースとSGIを種々の混合比で調製した
試料についてのガスクロマトグラフィーの結果より、そ
のモル比とFIDのピーク面積比についてプロットした
グラフである。図中で1)はF-III-1、2)はF-III-2、3)は
F-IV-1、4)はF-IV-2を示す。FIG. 9 is a graph in which the molar ratio and the peak area ratio of FID are plotted from the results of gas chromatography of samples prepared with various mixing ratios of glucose and SGI. In the figure, 1) is F-III-1, 2) is F-III-2, and 3) is
F-IV-1, 4) represents F-IV-2.
【図10】阻害剤F-III-2のβ−グルコシダーゼによる
分解と反応時間のTCLパターンを示す。図中でS1はグ
ルコース、S2の上スポットはF-IV-1、下スポットはF-IV
-2、S3の上スポットはグルコース、下スポットはF-III-
1を示す。また、0,6,12は反応時間を示す。FIG. 10 shows a TCL pattern of degradation of the inhibitor F-III-2 by β-glucosidase and reaction time. In the figure, S1 is glucose, the upper spot of S2 is F-IV-1, and the lower spot is F-IV.
-2, S3 upper spot glucose, lower spot F-III-
Indicates 1. Moreover, 0, 6, and 12 show reaction time.
【図11】阻害剤F-IV-2のβ−グルコシダーゼによる分
解と反応時間のTCLパターンを示す。図中でS1はグル
コース、S2はF-IV-1、S3の上スポットはF-IV-1、下スポ
ットはF-III-1を示す。また、0,6,12は反応時間を示
す。FIG. 11 shows a TCL pattern of degradation of the inhibitor F-IV-2 by β-glucosidase and reaction time. In the figure, S1 is glucose, S2 is F-IV-1, the upper spot of S3 is F-IV-1, and the lower spot is F-III-1. Moreover, 0, 6, and 12 show reaction time.
【図12】阻害剤F-III-1のβ−グルコシダーゼによる
分解と反応時間のTCLパターンを示す。図中でS1はグ
ルコース、S2の上スポットはF-IV-1、シタスポットはF-
IV-2、S3の上スポットはグルコース、下スポットはF-II
I-1を示す。また、0,6,12は反応時間を示す。FIG. 12 shows the TCL pattern of the decomposition of the inhibitor F-III-1 by β-glucosidase and the reaction time. In the figure, S1 is glucose, the upper spot of S2 is F-IV-1, and the spot of Sita is F-
IV-2, S3 upper spot glucose, lower spot F-II
Indicates I-1. Moreover, 0, 6, and 12 show reaction time.
【図13】FI-CMCaseに対するF-III-1の阻害定数算定の
ためのDixon Plotの結果を示す。図中で黒丸はCMC濃
度1.0%、白丸はCMC濃度1.8%の結果を示す。FIG. 13 shows the results of Dixon Plot for calculating the inhibition constant of F-III-1 for FI-CMCase. In the figure, the black circles indicate the CMC concentration of 1.0%, and the white circles indicate the CMC concentration of 1.8%.
Claims (4)
オキシノジリマイシン・セロオリゴ糖。1. The following general formula (1): (However, n shows 0 or an integer.) 1-deoxynojirimycin cellooligosaccharide.
オキシノジリマイシン・セロオリゴ糖。2. The following general formula (2): (However, n shows 0 or an integer.) 1-deoxynojirimycin cellooligosaccharide.
リゴ糖と1−デオキシノジリマイシンに作用させ、一般
式(1) 【化4】 (但し、nは0または整数を示す。)で表される1−デ
オキシノジリマイシン・セロオリゴ糖を製造する方法。3. Cellulase is represented by the following general formula (3): (However, n represents 0 or an integer.) It is reacted with 1-deoxynojirimycin and a cellooligosaccharide represented by the general formula (1) (However, n represents 0 or an integer.) A method for producing 1-deoxynojirimycin cellooligosaccharide.
リゴ糖と1−デオキシノジリマイシンに作用させ、一般
式(2) 【化6】 (但し、nは0または整数を示す。)で表される1−デ
オキシノジリマイシン・セロオリゴ糖を製造する方法。4. Cellulase is represented by the following general formula (3): (However, n represents 0 or an integer.) The compound is reacted with 1-deoxynojirimycin and a cellooligosaccharide represented by the general formula (2): (However, n represents 0 or an integer.) A method for producing 1-deoxynojirimycin cellooligosaccharide.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4076318A JPH05236985A (en) | 1992-02-26 | 1992-02-26 | Cellulase-inhibiting agent and its productiohn |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4076318A JPH05236985A (en) | 1992-02-26 | 1992-02-26 | Cellulase-inhibiting agent and its productiohn |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH05236985A true JPH05236985A (en) | 1993-09-17 |
Family
ID=13602025
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4076318A Pending JPH05236985A (en) | 1992-02-26 | 1992-02-26 | Cellulase-inhibiting agent and its productiohn |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH05236985A (en) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1997031928A1 (en) * | 1996-03-01 | 1997-09-04 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | Trisaccharide 1-deoxymannojirimycin derivatives |
US6716421B2 (en) | 2001-03-05 | 2004-04-06 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Devices and methods for eliminating termite colonies |
US6969512B2 (en) | 2001-03-05 | 2005-11-29 | The University Of Florida Research Foundation, Inc. | Devices and methods for eliminating termite colonies |
US7030156B2 (en) | 2001-03-05 | 2006-04-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc | Devices and methods for eliminating termite colonies |
CN108707595A (en) * | 2018-07-03 | 2018-10-26 | 华东理工大学 | A method of improving Cellulase-producing Fungi yield |
-
1992
- 1992-02-26 JP JP4076318A patent/JPH05236985A/en active Pending
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1997031928A1 (en) * | 1996-03-01 | 1997-09-04 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | Trisaccharide 1-deoxymannojirimycin derivatives |
US6716421B2 (en) | 2001-03-05 | 2004-04-06 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Devices and methods for eliminating termite colonies |
US6969512B2 (en) | 2001-03-05 | 2005-11-29 | The University Of Florida Research Foundation, Inc. | Devices and methods for eliminating termite colonies |
US7030156B2 (en) | 2001-03-05 | 2006-04-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc | Devices and methods for eliminating termite colonies |
US7157078B2 (en) | 2001-03-05 | 2007-01-02 | The University Of Florida Research Foundation, Inc. | Devices and methods for eliminating termite colonies |
CN108707595A (en) * | 2018-07-03 | 2018-10-26 | 华东理工大学 | A method of improving Cellulase-producing Fungi yield |
CN108707595B (en) * | 2018-07-03 | 2021-07-27 | 华东理工大学 | Method for improving yield of cellulase produced by fungi |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wood et al. | Methods for measuring cellulase activities | |
Tuohy et al. | Kinetic parameters and mode of action of the cellobiohydrolases produced by Talaromyces emersonii | |
Claeyssens et al. | Studies of the cellulolytic system of the filamentous fungus Trichoderma reesei QM 9414. Substrate specificity and transfer activity of endoglucanase I | |
Schou et al. | Stereochemistry, specificity and kinetics of the hydrolysis of reduced cellodextrins by nine cellulases | |
Eriksson et al. | A model explaining declining rate in hydrolysis of lignocellulose substrates with cellobiohydrolase I (Cel7A) and endoglucanase I (Cel7B) of Trichoderma reesei | |
Ståhlberg et al. | Trichoderma reesei has no true exo-cellulase: all intact and truncated cellulases produce new reducing end groups on cellulose | |
FI61718C (en) | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV XYLOS GENOM ENZYMATISK HYDROLYS AV XYLANER | |
Brillouet et al. | Investigation of the structure of a heteroxylan from the outer pericarp (beeswing bran) of wheat kernel | |
Mallek-Fakhfakh et al. | Physicochemical properties of thermotolerant extracellular β-glucosidase from Talaromyces thermophilus and enzymatic synthesis of cello-oligosaccharides | |
US8524471B2 (en) | Generation of chemical building blocks from plant biomass by selective depolymerization | |
Shepherd et al. | Substrate specificity and mode of action of the cellulases from the thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus | |
KR20120036883A (en) | Method for production of fermentable sugars from biomass | |
Biely et al. | Inverting character of α-glucuronidase A from Aspergillus tubingensis | |
Bhat et al. | Study of the mode of action and site-specificity of the endo-(1→ 4)-β-d-glucanases of the fungus Penicillium pinophilum with normal, 1-3H-labelled, reduced and chromogenic cello-oligosaccharides | |
Bukhtojarov et al. | Cellulase complex of the fungus Chrysosporium lucknowense: isolation and characterization of endoglucanases and cellobiohydrolases | |
Shabalin et al. | Enzymatic properties of α-galactosidase from Trichoderma reesei in the hydrolysis of galactooligosaccharides | |
Halliwell et al. | The action on cellulose and its derivatives of a purified 1, 4-β-glucanase from Trichoderma koningii | |
Christakopoulos et al. | Purification and mode of action of a low molecular mass endo-1, 4-β-D-glucanase from Fusarium oxysporum | |
Deshpande et al. | 1, 4-β-Glucosidases of Sporotrichum pulverulentum | |
McCleary et al. | Measurement of endo-1, 4-β-glucanase | |
JPH05236985A (en) | Cellulase-inhibiting agent and its productiohn | |
Fort et al. | Stepwise synthesis of cellodextrins assisted by a mutant cellulase | |
Henriksson et al. | Hydrolysis of barley (1→ 3),(1→ 4)-β-d-glucan by a cellobiohydrolase II preparation from Trichoderma reesei | |
Malet et al. | A specific chromophoric substrate for activity assays of 1, 3-1, 4-β-D-glucan 4-glucanohydrolases | |
Kono et al. | Structural analyses of new tri-and tetrasaccharides produced from disaccharides by transglycosylation of purified Trichoderma viride β-glucosidase |