JPH05232117A - 体液中のだ液α−アミラーゼの存在下にすいぞうα−アミラーゼを特異的に測定する方法 - Google Patents

体液中のだ液α−アミラーゼの存在下にすいぞうα−アミラーゼを特異的に測定する方法

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JPH05232117A
JPH05232117A JP3136054A JP13605491A JPH05232117A JP H05232117 A JPH05232117 A JP H05232117A JP 3136054 A JP3136054 A JP 3136054A JP 13605491 A JP13605491 A JP 13605491A JP H05232117 A JPH05232117 A JP H05232117A
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ゲルハルト ヴィリー
Christa Huebner-Parajsz
ヒュープナー−パライスツ クリスタ
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ヴルフ カール
Herbert Jungfer
ユングファー ヘルベルト
Helmut Lenz
レンツ ヘルムート
Winfried Albert
アルベルト ヴィンフリート
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 体液中のだ液のα−アミラーゼの存在下にす
いぞうのα−アミラーゼを測定する方法。 【構成】 すいぞうのα−アミラーゼに対して５％以下
の交叉反応度を有するだ液のα−アミラーゼに対するモ
ノクロン抗体を添加して、α−アミラーゼの検出系との
反応により、体液中の、だ液のα−アミラーゼの存在下
にすいぞうのα−アミラーゼを測定する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、だ液α−アミラーゼの
存在下に、すいぞうα−アミラーゼを特異的に測定する
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】α−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．
１）は、１，４−ｄ−グリコシド結合のオリゴー及びポ
リサッカライドを、主として１，４−ｄ−グリコシド結
合のマルトース及びマルトーオリゴサッカライドへの加
水分解によって分解する。酵素は工業的発酵技術と共
に、臨床分析及び診断法で著しい重要性を有する。即ち
多くの発病では、体液、例えば血清、尿又は十二指腸分
泌液中のα−アミラーゼ含量が変化する。しかしなが
ら、体内では主として２種のα−アミラーゼ酵素、即ち
すいぞうの酵素及びだ液の酵素が生じる。診断上の重要
性はすいぞうの酵素であるのに過ぎないので、この両方
（まれではあると共に、わずかな量で生じるのに過ぎな
い他のイソ酵素）のα−アミラーゼを分析上区別する課
題が存在する。この場合、難点は、両方の多発形は類似
構造を有し、免疫学上同一なことである［Ｋ．Ｌｏｒｅ
ｎｔｚ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍｓｂｌａｅｔｔｅｒ
３２：１１８（１９８２年）］。だ液の酵素の活性を除
去するためには、陰イオン交換剤の吸着、小麦の蛋白質
による抑制又は電気泳動又は電気焦点集中を使用するこ
とは公知である。しかしこれらの方法は、その分離作用
が不十分であるか又は日常の診断には費用がかかる。前
記方法では、単にＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２８／７巻、１
５２５〜１５２７頁（１９８２年）に記載されているだ
液系酵素の抑制法は、小麦の芽から得られた抑制剤によ
って日常の診断上引受けられる時間を伴なうが、選択度
は不十分である。抑制剤の最適濃度の場合でも、だ液系
の酵素の活性約１３％が得られるが、すいぞうの酵素の
活性は約８１％に減少する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】それ故、本発明の課題
はこの欠点を除去し、体液のだ液系のα−アミラーゼの
存在下に、すいぞうのα−アミラーゼの迅速で簡単なか
つ確実な測定が可能な方法を得ることである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】この課題は、本発明によ
れば体液、殊に血清、十二指腸分泌液又は尿のだ液のα
−アミラーゼの存在下にすいぞうのα−アミラーゼを、
α−アミラーゼの検出系とだ液のα−アミラーゼの抑制
物質の存在で反応させて特異的に測定する方法によって
解決される。この方法は抑制物質の代りに、すいぞうの
α−アミラーゼに対して５％以下の交叉反応度を有する
モノクロン抗体を添加する。
【０００５】本発明方法は、すいぞうの酵素に対して著
しくわずかな交叉反応度を有するモノクロン抗体の驚異
的発見に基づく。このことは予期することができなかっ
た。それというのもだ液とすいぞうとの酵素は免疫学上
同一であることは公知だったからである（Ｇｅｒｈａｒ
ｄ Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ，Ｌａｂ．Ｍｅｄ，７巻、１
８９〜１９３頁；Ｋ．Ｌｏｒｅｎｔｚ ｌｏｃ．ｃｉ
ｔ．）。このようにして、モルトン・シュバルツ（Ｍｏ
ｒｔｏｎ Ｋ．Ｓｃｈｗａｒｚ）［“Ｉｍｍｕｎｏａｓ
ｓａｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅｓ−ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅ
ｗ”（１９８３年）、４〜９頁］によって、人間のだ液
α−アミラーゼに対する抗体はだ液系の酵素を７８％、
すいぞうの酵素を７５％抑制することが記載されてい
る。それ故、実際に免疫学的基礎での両酵素の定量的区
別が可能になる方法を解明することは予期されなかっ
た。
【０００６】本発明方法に使用した新規モノクロン抗体
は、ＮＣＡＣＣ［ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｓ，ポートン・ダウン（Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ）、英
国］に寄託された： クロン ７９ ＝ＮＣＡＣＣ ８４１１１３０５、 クロン １Ａ８１３Ｅ１０ ＝ＮＣＡＣＣ ８４１１１３０４、 クロン １Ａ８１４Ａ ７ ＝ＮＣＡＣＣ ８４１１１３０３、 クロン ３２Ｃ５１６Ｅ３ ＝ＮＣＡＣＣ ８４１１１３０２、 クロン ３２Ｃ５１８Ｆ１１ ＝ＮＣＡＣＣ ８４１１１３０１ 本発明によれば、これは実験動物を自然又は変性された
だ液のα−アミラーゼで免疫し、このようにして得られ
た免疫動物のＢ−リンパ球を形質転換因子と融合し、ク
ローニングし、このようにして形成したモノクロン抗体
を生じる混合細胞を培養し、モノクロン抗体を単離して
得ることができる。だ液のα−アミラーゼ抗体を製造す
るための特に適当な動物は、ねずみ及びはつかねずみで
ある。免疫は、人間の自然のだ液のα−アミラーゼか又
は変性されただ液α−アミラーゼで行なう。自然の酵素
を使用する場合には、市場で得られる電気泳動による均
一な調剤が適当である。化学的に変性されただ液のα−
アミラーゼは、同じようにして、例えばドイツ特許公開
公報第２８４３９９４号に記載されている酵素変性の公
知方法によって得ることができる。適当な変性剤は、例
えば蛋白質のトリプトファン基の酸化［ＢＢＡ、１４３
巻（１９６７年）、４６２〜４７２頁］、主としてヒス
チジンに作用する酢酸ヨード（ＩＡＡ）でのカルボキシ
メチル化又はテトラニトロメタンでのニトロ化［Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３８巻（１９６３年）３３０７
頁］、ジアゾ化スルファニル酸のジアゾ化［Ｍｅｔｈ．
Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５巻（１９７２年）、５１５〜５３
１頁］並びにジニトロフルオルベンゾール（ＤＮＦＢ）
と反応［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３巻（１９６８
年）、５３４４〜２５３頁］させたＮ−ブロムサクシン
イミド（ＮＢＳ）である。この場合、自然の酵素は別と
して、ＤＮＦＢで変性した酵素が最も適当であることが
判明した。
【０００７】免疫は、自然又は変性された酵素の、好ま
しくはアジュバントと組合せた常用の投与によって行な
う。好ましくはアジュバントとしては、水酸化アルミニ
ウムをボトダテラ・ペルトウシイス（Ｂｏｒｄａｔｅｌ
ｌａ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）と一緒に使用する。
【０００８】免疫に自然のだ液のα−アミラーゼを使用
する場合には、免疫は好ましくは少くとも９ケ月にわた
って少くとも７回の免疫（注入Ｉ．Ｐ．）で行なう。変
性されただ液α−アミラーゼを使用する場合には、免疫
の１部分を試験管内で行なうのが有利であることが判明
した。しかしながら試験管内での免疫を行なう前に、生
体内の免疫を少くとも２回行なわなければならない。試
験管内の免疫の場合には、免疫動物のＢ−リンパ球を胸
腺細胞で調整した培地で培養し、培地に抗原を添加す
る。
【０００９】免疫後に、免疫動物のＢ−リンパ球を、常
法で形質転換因子と融合させる。本発明範囲内で使用す
ることのできる形質転換因子の例は、骨髄腫細胞、形質
転換ウィルス、例えばＥ−Ｂウィルス又はドイツ公開特
許第３２４５６６５号明細書に記載されている因子であ
る。融合は、ケーラー（Ｋｏｅｈｌｅｒ）及びミルシュ
タイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）の公知方法［Ｎａｔｕｒｅ
２５６巻（１９７５年）、４９５〜９９７頁］によって
行なう。この場合形成した混合細胞は公知方法で、例え
ば市場で得られるセルソルター（Ｚｅｌｌｓｏｒｔｅ
ｒ）を使用してクローニングし、所望のモノクロン抗体
を形成するクロンも培養する。混合細胞の癌腫状の成長
に基づいて、これは不定時間で培養し、所望のモノクロ
ン抗体を任意の量で生じることができる。このようにし
て得られたモノクロン抗体で体液からのだ液のα−アミ
ラーゼを大量に吸着することができるので、残留するア
ミラーゼの活性はすいぞうのα−アミラーゼに関係ずけ
ることができる。
【００１０】本発明による測定法のためには、モノクロ
ン抗体を、そのままか又はその相応する免疫学的性質を
有するフラグメント（ＦCフラグメント）として使用す
ることができる。それ故、この場合“モノクロン抗体”
とは、フラグメントでもある。完全な抗体並びにそのフ
ラグメントは固定形で使用することができる。
【００１１】意外なことにも本発明によって使用したモ
ノクロン抗体は、すいぞうのα−アミラーゼに対して５
％以下の交叉反応度を有し、多くの場合にはなお１％に
過ぎない交叉反応度に達する。それ故、この抗体は小麦
の芽から得られた公知抑制物質の代りに、体液のすいぞ
うのα−アミラーゼの特異的測定に適当である。
【００１２】α−アミラーゼそのものの測定は、公知法
によって行なう。本発明によるモノクロン抗体は選択的
にだ液系のα−アミラーゼを結合し、これをこのように
して酵素活性の測定から取上げるので、α−アミラーゼ
の測定の際モノクロン抗体の存在で得られた値は、単に
すいぞうの酵素に該当する活性に相応する。
【００１３】好ましくは本発明方法は、分子にグルコー
ス基４〜７個を有するマルトポリオース、マルトースホ
スホリラーゼ、β−ホスホグルコムターゼ、グルコース
−６−ホスファトデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤを含有す
るα−アミラーゼ検出系で実施する。
【００１４】本発明範囲内で好ましく使用したα−アミ
ラーゼの他の検出系は、分子にグルコース基４〜７個を
有するニトロフェニルマルトポリオース及びα−グルコ
シダーゼからなる。
【００１５】α−アミラーゼのもう１つの好ましい検出
系は、一定の基で変性されている澱粉からなる。変性さ
れている澱粉とは、例えば一定の基で変性されている澱
粉、例えば“ファデバス（Ｐｈａｄｅｂａｓ）”として
市場で得られる生成物［スエーデンのファルマジア（Ｐ
ｈａｒｍａｚｉｓ）社製］並びにドイツ公開特許第２８
１２１５４号明細書に記載されている生成物並びに分解
挙動が変えられている澱粉、例えばカルボキシメチル澱
粉及び終極デキストリンである。これらのすべての系は
公知であり、それ故詳説は不必要である。
【００１６】本発明方法を実施するためには、試料の液
体に本発明による抗体を、好ましくは懸濁液の形で添加
し、次いで不溶物を好ましくは短時間の遠心分離によっ
て分離する。透明な上澄みを、常用のα−アミラーゼ試
験で使用する。
【００１７】本発明により使用される試薬の範囲内で
は、モノクロン抗体は、完全な形並びにフラグメントの
形で固体担体、例えば免疫吸着性紙又はプラスチックの
小管又はホースの表面に存在していてもよい。この方法
では、だ液系のα−アミラーゼは担体、即ち固相に結合
し、それ故液相では他に分離しないですいぞうの酵素に
基づく残りの活性の測定を行なうことができる。
【００１８】本発明範囲内で特に良好な結果は、数種の
異なるクロンによって得られるモノクロン抗体から混合
しているモノクロン抗体調剤を使用する場合に得られ
る。
【００１９】モノクロン抗体を固定形で使用しない場合
には、モノクロン抗体及びその抗原、だ液のα−アミラ
ーゼから形成した錯体は可溶であるので、その分離のた
めの他の方法は、付加的にモノクロン抗体又は免疫の際
に実験動物から形成した抗体の沈降因子を添加すること
である。この場合には不溶錯体が形成し、これはだ液の
α−アミラーゼ、モノクロン抗体及び沈降因子を含有す
る。
【００２０】沈降因子としては、好ましくはモノクロン
抗体に対するか又は実験動物から免疫の際に形成した抗
体の抗体（つまり抗−抗体）を使用する。他の可能性
は、蛋白質Ａの好ましくは固定形での添加である。
【００２１】本発明方法のこの実施形式を行なう好まし
い方法は、先づモノクロン抗体と抗抗体とからなる錯体
を形成し、次いでこれをα−アミラーゼを含有する被験
液に添加することである。しかしながら選択的に、先づ
モノクロン抗体だけを添加し、培養後に、だ液のα−ア
ミラーゼとの抗原−抗体−錯体を形成するために、抗−
抗体を添加して不溶性錯体を形成してもよい。
【００２２】抗−抗体を使用する本発明方法の実施形式
には、原則としてモノクロン抗体又は実験動物から形成
した抗体に対して調整されたすべての抗−抗体が適当で
ある。好ましくははつかねずみ又はねずみを使用する場
合、抗−だ液−α−アミラーゼ−血清を作るためには羊
から形成した抗−抗体を使用する。
【００２３】本発明で使用される試薬は、α−アミラー
ゼの検出系及びだ液のα−アミラーゼの抑制物質を含有
する、体液、殊に血清、十二指腸分泌液、血漿又は尿の
だ液のα−アミラーゼと共にすいぞうのα−アミラーゼ
を特別に測定する試薬であり、この試薬は抑制物質の代
りに、すいぞうのα−アミラーゼに対して５％以下の交
叉反応度を有するモノクロン抗体を含有する。
【００２４】本発明により使用される試薬中に含有され
たα−アミラーゼの検出系及びその他の条件に関して
は、方法に関する前記詳述があてはまる。
【００２５】本発明によって、大きい特異性を有する体
液のだ液系のα−アミラーゼと共にすいぞうのα−アミ
ラーゼの簡単で迅速な測定が得られ、これによって臨床
診断法が改良される。
【００２６】
【実施例】
例 １ （Ａ） バルブ（Ｂａｌｂ）／ｃ−はつかねずみを、人
間のだ液のアミラーゼ１００μｇでボルデテラ・ペルト
ウシス（ＢＯＲＤＥＴＥＬＬＡ ＰＥＲＴＵＳＳＩＳ）
を有する水酸化アルミニウムで免疫する。約８週間のリ
ズムで、人間のだ液のアミラーゼそれぞれ５０μｇで同
じアジュバントで３〜４回更に免疫する。融合前の４日
間に最後の免疫を、生理学的食塩水にとかしただ液のア
ミラーゼ５０μｇで静脈内で行なう。
【００２７】（Ｂ） 脾ぞう細胞とＡｇ８．６５４（Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）又はＳＰ２／０（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１５８１）骨髄腫細胞との融合を、Ｊ．ｏｆ Ｉ
ｍｍ．Ｍｅｔｈ．、３９巻、２８５〜３０８頁による標
準法によって行なう。脾ぞう細胞と骨髄腫細胞との融合
割合は５：１である。融合生成物をＮｏ．２４の培養シ
ャーレ［コスタール（Ｃｏｓｔａｒ）社製］１０個に入
れ、培養シャーレ１個当りペリトネアル・エクシュダト
（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ−ｅｘｓｕｄａｔ）細胞５×１
０4を与える。ポジチブの１次培養物（例３参照）を、
融合後３〜４週間に蛍光活性のセルソルター（Ｚｅｌｌ
ｓｏｒｔｅｒ）を用いてクローニングする。細胞を個別
にＮｏ．９６のコスタール（Ｃｏｓｔａｒ）のプレート
に入れ、ペリトネアル・エクシュダト（ｐｅｒｉｔｏｎ
ｅａｌ−ｅｘｓｕｄａｔ）細胞２×１０4を与える。
【００２８】例 ２ ジニトロフルオルベンゾールでのα−アミラーゼの変性 だ液のアミラーゼ２０μモル／ｌ及びジニトロフルオル
ベンゾール２０ｍモル／ｌ（わずかなエタノールに溶
解）を混合し、室温で１０分間恒温に保つ。次いで溶液
を、燐酸塩緩衝液（５０ｍモル／ｌ、ｐＨ６．８）に対
して２０時間透析させる（冷室）。透析液は、差異スペ
クトルで波長３６０ｎｍで吸光の増大値０．０７０を示
す。溶液を、免疫まで冷凍する。透析液中の蛋白質の濃
度は１５μモル／ｌである。
【００２９】このようにして得られた変性α−アミラー
ゼで、はつかねずみを例１のようにして免疫した。変性
アミラーゼで免疫したはつかねずみは、第２の免疫後に
すべて死ぬ。それ故このはつかねずみの脾ぞう細胞を第
１のブースト（Ｂｏｏｓｔ）後に培養し、ルベン（Ｌｕ
ｂｅｎ）の方法［Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、
１７巻（１９８０年）、６３５〜６３９頁］によって、
培地３０ｍｌにとかした抗原１００μｇの存在で“試験
管内”でなお４日間免疫する。４日間後に、細胞を、例
１によって得られた脾ぞう細胞のようにして融合させ、
処理する。
【００３０】例 ３ 免疫ははつかねずみの血清中又は混合細胞の培養の上澄
み中又は腹水中のアミラーゼ結合性抗体の濃度及び特異
性を検出するために、エリサ（ＥＬＩＳＡ）を試験原理
として使用する。このためにＮｏ．９６のエリサ（ＥＬ
ＩＳＡ）（ＮＵＮＣ社製）に羊−抗−はつかねずみ−Ｆ
C−抗体を被覆する。非特異結合を減少するために、牛
の血清−アルブミン（生理学的食塩水にとかした２％）
を後被覆する。次いで抗体を含有する試料とか又はその
異なる希釈液と培養する。
【００３１】これに続く培養を、だ液のアミラーゼ−ペ
ルオキシダーゼ−（ＰＯＤ）−結合物又はすいぞうのア
ミラーゼ−ＰＯＤ−結合物で行なう。結合したＰＯＤの
活性を、ＡＢＴＳ（２，２′−アジノジ−／３−エチル
ベンズチアゾリンスルホネート（６）／）（ｐＨ４．
４）で測定し、吸光を、結合したはつかねずみの抗体の
尺度として直接に採用する。交叉反応を測定するため
に、それぞれの試料に対してだ液−ＰＯＤ及びすいぞう
のアミラーゼ−ＰＯＤの結合を別々に測定し、だ液のア
ミラーゼ−ＰＯＤで得られた吸光を結合１００％とす
る。同時に得られたすいぞうのアミラーゼ−ＰＯＤでの
吸光によって、だ液のアミラーゼ−ＰＯＤの吸光の％で
試料の交叉反応が判明する。
【００３２】一般にすいぞうのα−アミラーゼ−ＰＯＤ
の結合が行なわれなかったクロン４個及び交叉反応１．
５〜５％を有するクロン５個が判明した。スクリーニン
グ後に得られたクロンを拡大する。
【００３３】ＲＰＭＩ−培地は、Ｊ．Ａ．Ｍ．Ａ．１９
９巻（１９５７年）５１９頁に記載されており、市場で
得られる。
【００３４】例 ４ 羊−抗−はつかねずみ−ＡＫによるモノクロン抗体（Ｍ
ＡＫ）の固定及び続くだ液のアミラーゼの結合 はつかねずみからの腹水 羊−抗−はつかねずみ−ＡＫ（ＩｇＧＦｃγ）：１９ｇ
／ｌ燐酸塩緩衝液、ｐＨ＝７．０；０．０５モル／ｌ牛
の血清アルブミン２％を有する燐酸塩緩衝液、 ｐＨ＝
７．０；０．０５モル／ｌ 人間のだ液のアミラーゼ：１０００Ｕ／ｌ（基質変換量
μモル／ｍｌ／分（３７℃）、基質としての４−ニトロ
フェニルマルトヘプタオシドを有する） 人間のすいぞうのアミラーゼ：１０００Ｕ／ｌ 酢酸：０．５モル／ｌ 硫酸水素二カリウム溶液：２モル／ｌ 腹水からのＭＡＫを、羊−抗−はつかねずみの抗体と
１：１００の割合で混合する。この混合物を燐酸塩緩衝
液で１：２で希釈し、３７℃で１５分間振盪する。得ら
れた沈澱物を緩衝液で２回洗浄し、次いで酢酸（出発容
量の約１／５）に溶解する。５分間振盪後にＫ2ＨＰＯ4
溶液を１：２の割合で添加する。再び沈澱物が生じる。
これを、ＲＳＡ（牛の血清アルブミン）を有する燐酸緩
衝液で２回、次いで緩衝液だけで２回洗浄する。続いて
沈澱物を、出発容量の１／５に緩衝液で懸濁させる。沈
澱物５０μｌをだ液又はすいぞうのアミラーゼ５０μｌ
に添加し、室温で１５分間恒温に保つ。次いで沈澱物を
遠心分離して除き、上澄みを例７によって処理する。対
照物としては、沈澱物の代りに緩衝液５０μｌで処理し
たアミラーゼ試料が役立つ。
【００３５】例 ５ だ液のアミラーゼに対するＭＡＫの結合及び続く羊−抗
−はつかねずみの抗体での沈澱 モノクロン抗体を有する腹水を、緩衝液で１：５０の割
合で希釈する。この溶液５０μｌを、だ液又はすいぞう
のアミラーゼ５０μｌと室温で１５分間振盪する。対照
物としては、１方では緩衝液での腹水希釈からなる混合
物（腹水の空試験）、他方ではアミラーゼと緩衝液とか
らなる混合物（アミラーゼ活性の対照物）が役立つ。続
いて沈澱性抗−抗体５０μｌを添加する。室温で１０分
間後に、沈澱物を遠心分離して除き、上澄みを例７によ
って処理する。
【００３６】例 ６ 羊−抗−はつかねずみ−抗体によるＭＡＫの固定及び続
くだ液及びすいぞうのアミラーゼの混合物からの人間の
だ液のアミラーゼの結合 例５に相応して、人間のすいぞう及びだ液のアミラーゼ
（それぞれ１０００Ｕ／ｌ）からなる混合物を、予処理
した沈澱物と培養する。遠心分離後に、上澄みを例７に
相応して処理する。
【００３７】例 ７ 残留するすいぞうのアミラーゼの測定 例４〜６による上澄み５０μｌを市場で得られる試薬１
ｍｌに、α−アミラーゼを、基質としての４−ニトロフ
ェニルマルトヘプタオシド（ベーリンガー社製、Ｎｏ．
５６８５８９）で測定するために添加する。上澄みの活
性度を、導入後に３７℃で測定する。残留活性度が、そ
れぞれ同拌する対照物に対する活性度（％）として測定
される。例４での残留活性度は、だ液のアミラーゼでは
０〜５％であり、すいぞうのアミラーゼでは７０〜９５
％である。例５による試験によって、だ液のアミラーゼ
での残留活性度０〜５％すいぞうのアミラーゼでの残留
活性度８０〜９５％が得られる。両酵素の同時の存在
（例６）によって、だ液のアミラーゼの選択的低下が得
られ、すいぞうのアミラーゼは活性であり、８０〜９５
％測定することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ヴィリー ゲルハルト スウェーデン国 ヘルシングボルグ ハラ ンズガーテン９ (72)発明者 クリスタ ヒュープナー−パライスツ ドイツ連邦共和国 トゥツィング マリエ ンシュトラーセ 11 (72)発明者 カール ヴルフ ドイツ連邦共和国 ヴァイルハイム ピュ トリヒシュトラーセ 18 (72)発明者 ヘルベルト ユングファー ドイツ連邦共和国 トゥツィング ベリン ガーヴェーク10 (72)発明者 ヘルムート レンツ ドイツ連邦共和国 トゥツィング ヴァル トシュミットシュトラーセ ７ (72)発明者 ヴィンフリート アルベルト ドイツ連邦共和国 ペール モースシュト ラーセ 10 (72)発明者 アウグスト ヴィルヘルム ヴァーレフェ ルト ドイツ連邦共和国 ホーエンパイセンベル ク アルペンブリックシュトラーセ 25

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 だ液α−アミラーゼの抑制物質の存在下
    におけるα−アミラーゼの検出系との反応により、体液
    中のだ液α−アミラーゼの存在下ですいぞうα−アミラ
    ーゼを特異的に測定する方法において、抑制物質の代り
    に、すいぞうα−アミラーゼに対して５％以下の交叉反
    応度を有するだ液α−アミラーゼに対するモノクロン抗
    体を添加することを特徴とする、体液中のだ液α−アミ
    ラーゼの存在下にすいぞうα−アミラーゼを特異的に測
    定する方法。
  2. 【請求項２】 実験動物を、自然又は変性されただ液α
    −アミラーゼで免疫し、免疫動物のＢ−リンパ球と形質
    転換因子とを融合させ、クローニングし、このようにし
    て形成した混合細胞を培養し、これからモノクロン抗体
    を単離することによって得られたモノクロン抗体を使用
    する、特許項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 実験動物としてねずみ又ははつかねずみ
    を使用する、請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 免疫を、アジュバントとしての水酸化ア
    ルミニウム及びボルダテラ・ペルトウシス（Ｂｏｒｄａ
    ｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）で行なう、請求項２
    又は３記載の方法。
  5. 【請求項５】 自然のだ液α−アミラーゼで免疫し、こ
    の免疫を少くとも９ケ月にわたって少くとも７回行な
    う、請求項２から４までのいずれか１項記載の方法。
  6. 【請求項６】 免疫を、変性されただ液α−アミラーゼ
    で行ない、生体内の免疫を少くとも２回、続いて少くと
    もＢ−リンパ球を胸腺細胞で調整した培地で培養する試
    験管内の免疫を１回行なう、請求項２から４までのいず
    れか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】 形質転換因子として骨髄腫細胞を使用す
    る、請求項２から６までのいずれか１項記載の方法。
  8. 【請求項８】 モノクロン抗体を固定形で使用する、請
    求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
  9. 【請求項９】 付加的に沈降性因子を添加し、形成した
    だ液α−アミラーゼ、モノクロン抗体及び抗−抗体から
    なる不溶性錯体を溶液から分離する、請求項１から７ま
    でのいずれか１項記載の方法。
  10. 【請求項１０】 沈降性因子として、モノクロン抗体か
    又は実験動物から形成された抗体の抗体（抗−抗体）を
    添加する、請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 沈降性因子として蛋白質Ａを添加す
    る、請求項９記載の方法。
  12. 【請求項１２】 予め形成されたモノクロン抗体と抗抗
    体とからなる錯体を添加する、請求項９から１１までの
    いずれか１項記載の方法。
  13. 【請求項１３】 先づモノクロン抗体を添加し、培養
    し、次いでこの錯体を、抗−抗体を添加して不溶性にす
    る、請求項９記載の方法。
  14. 【請求項１４】 羊の抗−抗体を使用する、請求項９か
    ら１３までのいずれか１項記載の方法。
  15. 【請求項１５】 α−アミラーゼの検出系として、グル
    コース基４〜７個を有するマルトポリオース、マルトー
    スホスホリラーゼ、β−ホスホグルコムターゼ、グルコ
    ース−６−ホスファトデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤを使
    用する、請求項１から１４までのいずれか１項記載の方
    法。
  16. 【請求項１６】 α−アミラーゼの検出系として、分子
    にグルコース単位４〜７個を有するニトロフェニルマル
    トポリオースをα−グルコシダーゼと一緒に使用する、
    請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法。
  17. 【請求項１７】 α−アミラーゼの検出系として測定可
    能な基で変性されている澱粉を使用する、請求項１から
    １４までのいずれか１項記載の方法。
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