JPH05199893A - Sheep lfa-3 and tm region-deleted lfa-3 protein - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide sheep LFA-3 protein which has high affinity to human T-cells, thus being useful as a diagnostic reagent for detecting T-cells, by culturing the cells transformed with a vector including the DNA sequence coding the sheep LFA-3 and collecting the product after cultivation. CONSTITUTION:RNA is extracted from sheep leukocytes with guanidine thiocyanate and the extract is treated with oligo (dT) cellulose column to isolate mRNA and cDNA is synthesized using it as a template and further prepare cDNA library. Then cloning is effected using it as a probe to collect the gene encoding sheep LFA-3 protein. The gene is multiplied by the PCR(polymerase- chain reaction) process and treated with a restriction enzyme to link to a suitable vector and introduced into host cells such as Escherichia coli and transformed. The transformed cells are cultured in a medium to enable high- efficient production of the objective sheep LFA-3 protein in high efficiency.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、新規細胞接着タンパク
質、該タンパク質をコードする遺伝子および該タンパク
質の生産法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel cell adhesion protein, a gene encoding the protein and a method for producing the protein.

【０００２】[0002]

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ヒツ
ジ赤血球とのロゼット形成は、従来よりヒトＴ細胞の特
異的な反応の一つとされている。現在、ヒツジ赤血球と
ヒトＴ細胞とのロゼット形成は、ヒトＴ細胞のＣＤ２抗
原（Ｔ11抗原とも呼ばれる）とヒツジ赤血球のＣＤ２抗
原受容体との高い新和性に起因する結合反応と理解され
ている。ヒトＴ細胞がなぜヒツジ赤血球とよくロゼット
を形成するのかということに対し明確な解答はえられて
いないが、ヒツジＣＤ２抗原受容体の構造そのもののな
かに、ヒトにおけるヒトＣＤ２抗原に対する受容体であ
るヒトＬＦＡ−３とは異なる機能が存在する可能性もあ
る。現在、配列番号３に示すヒツジ赤血球のＣＤ２抗原
受容体の一部決定されたＮ末端アミノ酸配列はヒトのＣ
Ｄ２抗原受容体であるＬＦＡ−３のそれと約50％の相同
性がある（特開昭６３−１５０２２８号公報参照）こと
は知られているが、ヒツジ赤血球のＣＤ２抗原受容体が
どのような全構造をもっているかは知られていない。ヒ
トＬＦＡ−３分子については免疫グロブリンスーパーフ
ァミリーに属する細胞接着蛋白質として分類されており
（エー エフ ウイリアムズとエー エヌ バークレ
イ、アニュアル レビュー オブ イムノロジー、６
巻、381 頁、1988年(A.F.Williams and A.N.Barclay,An
nu.Rev.Immunol.6,381,1988)参照）、Ｎ末端から免疫グ
ロプリン様ドメイン１（Ｄ１領域）、免疫グロブリン様
ドメイン２（Ｄ２領域）、膜貫通領域（ＴＭ領域）、細
胞質領域（Ｃ領域）から構成されていることが知られて
いる（ビー ピー ウォルナーら、ジャーナルオブ エ
クスペリメンタル メディスン、166 巻、923 頁、1987
年(B.P.Wallner et al.,J.Exp.Med.166,923,1987) 参
照）。またＤ１領域、Ｄ２領域を有し膜とグリコシル・
フォスファチジルイノシトールを介して結合しているヒ
トＬＦＡ−３分子も知られている（ビー シード、ネー
チャー、329 巻、840 頁、1987年(B.Seed,Nature 329,8
40,1987)参照）。したがって本明細書中ではＮ末端から
Ｄ１領域−Ｄ２領域−ＴＭ領域−Ｃ領域の構造を有する
ＣＤ２抗原受容体あるいはＤ１領域−Ｄ２領域を有し膜
とグリコシル・フォスファチジルイノシトールを介して
結合するＣＤ２抗原受容体をＬＦＡ−３と呼び、構造が
明らかでないヒツジのＣＤ２抗原受容体はそのままＣＤ
２抗原受容体と呼ぶ。2. Description of the Related Art Rosette formation with sheep erythrocytes has hitherto been regarded as one of the specific reactions of human T cells. At present, rosette formation between sheep erythrocytes and human T cells is understood to be a binding reaction resulting from high relevance of CD2 antigen of human T cells (also called T11 antigen) and CD2 antigen receptor of sheep erythrocytes. . Although there is no clear answer as to why human T cells form rosettes with sheep erythrocytes well, it is the human CD2 antigen receptor in the human CD2 antigen receptor structure itself. It is possible that a function different from that of human LFA-3 exists. Currently, the partially determined N-terminal amino acid sequence of the CD2 antigen receptor of sheep erythrocytes shown in SEQ ID NO: 3 is human C
It is known that there is about 50% homology with that of LFA-3, which is a D2 antigen receptor (see Japanese Patent Laid-Open No. 150228/1988), but it is known that the CD2 antigen receptor of sheep erythrocytes has all kinds of homology. It is not known if it has a structure. The human LFA-3 molecule has been classified as a cell adhesion protein belonging to the immunoglobulin superfamily (AF Williams and N Berkeley, Annual Review of Immunology, 6
Volume, p. 381, 1988 (AFWilliams and ANBarclay, An
nu.Rev.Immunol.6,381,1988)), from the N-terminus to immunoglobin-like domain 1 (D1 region), immunoglobulin-like domain 2 (D2 region), transmembrane region (TM region), cytoplasmic region (C region) (BW Walner et al., Journal of Experimental Medicine, 166, 923, 1987).
Year (see BP Wallner et al., J. Exp. Med. 166, 923, 1987)). It also has a D1 region and a D2 region,
A human LFA-3 molecule linked via phosphatidylinositol is also known (Bee Seed, Nature, 329, 840, 1987 (B. Seed, Nature 329,8.
40, 1987)). Therefore, in the present specification, the CD2 antigen receptor having a structure of D1 region-D2 region-TM region-C region from the N-terminus or the D1 region-D2 region has a structure and is bound to a membrane through glycosylphosphatidylinositol. The CD2 antigen receptor is called LFA-3, and the CD2 antigen receptor of sheep whose structure is not clear is CD as it is.
It is called a 2-antigen receptor.

【０００３】ヒトＴ細胞のＣＤ２抗原と高い親和性を持
つヒツジＣＤ２抗原受容体には、Ｔ細胞の検出のための
試薬、多くの種類の細胞の混合物からＴ細胞を分離する
ためのリガンドとしての用途がある。またＣＤ２抗原は
Ｔ細胞の機能としての多くの免疫反応に関与しているこ
とが知られており、したがってＣＤ２抗原と親和性のあ
るヒツジＣＤ２抗原受容体は免疫調節剤として利用可能
であり、さらにそのＴ細胞との親和性を利用したＴ細胞
系腫瘍または白血病のターゲッティング治療薬としての
用途がある。The sheep CD2 antigen receptor, which has a high affinity for the CD2 antigen of human T cells, is used as a reagent for detecting T cells and as a ligand for separating T cells from a mixture of many types of cells. There are uses. Further, it is known that the CD2 antigen is involved in many immune reactions as a function of T cells, and therefore the sheep CD2 antigen receptor having affinity with the CD2 antigen can be used as an immunomodulator, and There is a use as a targeting therapeutic agent for T-cell tumors or leukemias, which utilizes its affinity with T cells.

【０００４】ヒツジＣＤ２抗原受容体はヒツジ赤血球か
らえることができる。ヒツジＣＤ２抗原受容体およびそ
の誘導体の生産法としては、ヒツジ赤血球から界面活性
剤によって可溶化させ、抗体によるアフィニティー・ク
ロマトグラフィーによって精製する方法（特開昭６３−
１５０２２８号公報参照）、ヒツジ赤血球からトリプシ
ンによって可溶化させる方法（ティー キタオら、ジャ
ーナル オブ イムノロジー117 巻、310 頁、1976年
(T.Kitao et al.,J.Immunol.117,310,1976) 参照）が知
られている。しかし、ヒツジ赤血球におけるヒツジＣＤ
２抗原受容体の含量はきわめて低く、前記の用途のため
に大量のヒツジＣＤ２抗原受容体を調製することは困難
な仕事である。The sheep CD2 antigen receptor can be obtained from sheep red blood cells. The sheep CD2 antigen receptor and its derivatives can be produced by solubilizing sheep erythrocytes with a detergent and purifying them by affinity chromatography with an antibody (JP-A-63-63).
150228), a method of solubilizing sheep erythrocytes with trypsin (Tikitao et al., Journal of Immunology 117, 310, 1976).
(See T. Kitao et al., J. Immunol. 117, 310, 1976)). However, sheep CD in sheep red blood cells
The content of the biantigen receptor is extremely low and preparing large quantities of sheep CD2 antigen receptor for the above applications is a difficult task.

【０００５】現在、遺伝子工学の技術により微量しか存
在しないタンパク質を安価かつ大量に生産することがで
きるが、ヒツジＣＤ２抗原受容体を遺伝子工学的に生産
するためには、必要なヒツジＣＤ２抗原受容体遺伝子を
まず単離（クローニング）する必要がある。しかしなが
ら、現在までに、ヒツジＣＤ２抗原受容体の完全なアミ
ノ酸配列は知られておらず、またヒツジＣＤ２抗原受容
体がＬＦＡ−３すなわちＮ末端からＤ１領域−Ｄ２領域
−ＴＭ領域−Ｃ領域の構造を有するＣＤ２抗原受容体あ
るいはＤ１領域−Ｄ２領域を有し膜とグリコシル・フォ
スファチジルイノシトールを介して結合するＣＤ２抗原
受容体であるか、または別の構造を有するのかについて
は一切知られていなかった。したがってヒツジＬＦＡ−
３遺伝子やｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）の検出、
ヒツジＬＦＡ−３遺伝子のクローニングおよびヒツジＬ
ＦＡ−３の遺伝子工学的生産は不可能であった。[0005] At present, it is possible to inexpensively produce a large amount of a protein which is present in a small amount by genetic engineering techniques. However, in order to genetically engineer the sheep CD2 antigen receptor, the sheep CD2 antigen receptor is necessary. The gene must first be isolated (cloned). However, to date, the complete amino acid sequence of the sheep CD2 antigen receptor has not been known, and the sheep CD2 antigen receptor has LFA-3, that is, the structure of the D1 region-D2 region-TM region-C region from the N terminus. It is not known at all whether it is a CD2 antigen receptor having D1 region-D2 region or a CD2 antigen receptor having a D2 region and bound to a membrane through glycosylphosphatidylinositol or having another structure. It was Therefore sheep LFA-
Detection of 3 genes and mRNA (messenger RNA),
Cloning of the sheep LFA-3 gene and sheep L
Genetic engineering production of FA-3 was not possible.

【０００６】ヒツジＬＦＡ−３をコードする遺伝子のク
ローニングには、いくつかの方法について利用可能性が
考えられる。たとえば、現在知られているヒツジＣＤ２
抗原受容体について29アミノ酸残基からなるＮ末端アミ
ノ酸部分配列（配列番号３）から推定したＤＮＡプロー
ブの混合物（ミックスドプローブ）によって、ヒツジＬ
ＦＡ−３を発現している細胞に由来したｃＤＮＡライブ
ラリーからヒツジＬＦＡ−３ｃＤＮＡをスクリーニング
できるかもしれない。しかし、混合したＤＮＡプローブ
で選択したｃＤＮＡは、塩基配列を決定しなければ真に
ヒツジＬＦＡ−３遺伝子との確認ができない。また混合
したＤＮＡプローブは、ヒツジＬＦＡ−３遺伝子の検出
に適さない。また、ラセ(Lathe) らの方法（ラセら、ジ
ャーナルオブ モレキュラー バイオロジー 183 巻、
１頁1985年(Lathe et al.J. Molec.Biol.183,1,1985)に
よって予想、作製したＤＮＡプローブが常に遺伝子のク
ローニングのために有効であるとはいえない。ヒツジＣ
Ｄ２抗原受容体に対するモノクローナル抗体がえられて
おり、放射性物質でラベルした該抗体を用いて遺伝子発
現ライブラリーをスクリーニングし目的遺伝子のクロー
ニングが達成できる可能性も考えられるが、真に該モノ
クローナル抗体がクローニングに利用できるという報告
はない。したがって、現在まで、確実にヒツジＬＦＡ−
３遺伝子をクローニングする手段が知られていないとい
うことができる。ヒツジＬＦＡ−３遺伝子の確実なクロ
ーニングに有効なＤＮＡプローブは、ＬＦＡ−３遺伝子
配列をそのまま有しているＤＮＡプローブである。その
ようなＤＮＡプローブはヒツジＬＦＡ−３遺伝子あるい
はｍＲＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それらの検
出に大いに有効である。The cloning of the gene encoding sheep LFA-3 may have several possible uses. For example, the currently known sheep CD2
The mixture of DNA probes (mixed probe) deduced from the N-terminal amino acid partial sequence consisting of 29 amino acid residues (SEQ ID NO: 3) for the antigen receptor was used to prepare sheep L
It may be possible to screen sheep LFA-3 cDNA from a cDNA library derived from cells expressing FA-3. However, the cDNA selected by the mixed DNA probe cannot be truly confirmed as the sheep LFA-3 gene unless the nucleotide sequence is determined. In addition, the mixed DNA probe is not suitable for detecting the sheep LFA-3 gene. In addition, the method of Lathe et al. (Lace et al., Journal of Molecular Biology, Vol. 183,
It cannot be said that the DNA probe predicted and prepared by p. 1 1985 (Lathe et al. J. Molec. Biol. 183, 1, 1985) is always effective for gene cloning. Sheep c
A monoclonal antibody against the D2 antigen receptor has been obtained, and it is considered that cloning of the target gene can be achieved by screening a gene expression library using the antibody labeled with a radioactive substance. There is no report that it can be used for cloning. Therefore, to date, the sheep LFA-
It can be said that the means for cloning the 3 genes is not known. A DNA probe effective for reliable cloning of the sheep LFA-3 gene is a DNA probe having the LFA-3 gene sequence as it is. Such a DNA probe can selectively hybridize with sheep LFA-3 gene or mRNA, and is highly effective in detecting them.

【０００７】本発明の目的は、そのようなヒツジＬＦＡ
−３遺伝子を容易かつ確実にクローニングするためのＤ
ＮＡプローブの配列を提供することであり、該プローブ
を用いてクローニングされたヒツジＬＦＡ−３遺伝子と
その塩基配列を提供すること、さらにヒツジＬＦＡ−３
タンパク質を提供することである。また別の目的は、さ
らに遺伝子工学的生産に適した性質を有するＬＦＡ−３
類似体およびその遺伝子を提供することである。本発明
は、さらに提供された塩基配列によってもたされる情報
により、ヒツジＬＦＡ−３およびその類似体を遺伝子工
学的に生産する方法を提供することを目的とする。It is an object of the present invention to provide such sheep LFA.
-3 for easy and reliable cloning of gene
Providing the sequence of an NA probe, providing the sheep LFA-3 gene cloned using the probe and its nucleotide sequence, and further providing the sheep LFA-3.
Providing protein. Still another object is LFA-3 having properties suitable for genetic engineering production.
To provide an analog and its gene. It is an object of the present invention to provide a method for producing sheep LFA-3 and its analogs by genetic engineering based on the information provided by the provided nucleotide sequence.

【０００８】[0008]

【課題を解決するための手段】本発明はヒツジＬＦＡ−
３タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子および
該タンパク質の生産法に関する。さらに、本発明はＴＭ
領域欠失型ＬＦＡ−３様タンパク質、該タンパク質をコ
ードする遺伝子および該タンパク質の生産法に関する。The present invention is directed to sheep LFA-
3 protein, a gene encoding the protein, and a method for producing the protein. Further, the present invention is TM
The present invention relates to a region-deleted LFA-3-like protein, a gene encoding the protein, and a method for producing the protein.

【０００９】[0009]

【実施例】本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検
討を重ねた結果、既知のヒツジＣＤ２抗原受容体のアミ
ノ酸部分配列を利用し、ＰＣＲ（ポリメラーゼ チェイ
ンリアクション）法（モレキュラー クローニング 第
２版(Molecular Cloning 2nd edition）ジェイ サムブ
ルーク(J.Sambrook)ら編 コールド スプリングハーバ
ー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)
（1989年）；ケイ ノス(K.Knoth) ら（1988年）ヌクレ
イック アシッズ リサーチ（Nucleic AcidsResearch)
16 巻、10932 頁））を用いて、ヒツジＬＦＡ−３をコ
ードする遺伝子の部分であるｃＤＮＡを増幅する方法を
見い出し、このｃＤＮＡの塩基配列を決定することによ
り確実にヒツジＬＦＡ−３遺伝子をクローニングするた
めの有効なＤＮＡプローブをえることにより、また、今
までに知られていないヒツジのＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−
３様タンパク質のｃＤＮＡクローンを見いだし、該ｃＤ
ＮＡの塩基配列を解明し、該配列よりヒトＴＭ領域欠失
型タンパク質の一次構造を決定し、さらに該タンパク質
を遺伝子工学的に生産することにより本発明を完成する
にいたった。[Examples] As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors used the amino acid partial sequence of a known sheep CD2 antigen receptor to carry out PCR (polymerase chain reaction) method (Molecular Cloning No. 2). Edition (Molecular Cloning 2nd edition) J. Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory
(1989); K. Knoth et al. (1988) Nucleic Acids Research
16, page 10932)) and found a method for amplifying a cDNA which is a part of a gene encoding sheep LFA-3, and determined the nucleotide sequence of this cDNA to reliably clone the sheep LFA-3 gene. By obtaining an effective DNA probe for this purpose, it is also known that sheep TM region-deficient LFA-
A cDNA clone for a 3-like protein was found, and the cDNA
The present invention has been completed by elucidating the base sequence of NA, determining the primary structure of the human TM region deleted protein from the sequence, and further producing the protein by genetic engineering.

【００１０】本発明の遺伝子をえるための方法について
説明する。まず、ヒツジＬＦＡ−３のｍＲＮＡを調製す
る。ヒツジＬＦＡ−３のｍＲＮＡは、ヒツジＬＦＡ−３
を発現しているヒツジの細胞あるいは臓器、たとえば白
血球細胞、肝細胞から通常の方法、たとえば、チオシア
ン酸グアニジン法またはホットフェノール法により抽出
され、さらにオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムによりポ
リ（Ａ）^＋ＲＮＡとして調製することができる（ラボマ
ニュアル遺伝子工学、村松正実編、丸善1988年）。The method for obtaining the gene of the present invention will be described. First, sheep LFA-3 mRNA is prepared. The mRNA of sheep LFA-3 is similar to that of sheep LFA-3.
Are extracted from sheep cells or organs that express A. coli, such as white blood cells and hepatocytes, by a conventional method, for example, the guanidine thiocyanate method or the hot phenol method, and poly (A) ⁺ RNA by an oligo (dT) cellulose column. (Lab Manual Genetic Engineering, edited by Masami Muramatsu, Maruzen 1988).

【００１１】つぎに、えられたｍＲＮＡから通常の方法
あるいは市販のキットを用いてヒツジＬＦＡ−３のｃＤ
ＮＡを調製する。Then, the cDNA of sheep LFA-3 was prepared from the obtained mRNA by a conventional method or a commercially available kit.
Prepare NA.

【００１２】既知のヒツジＣＤ２抗原受容体アミノ酸部
分配列のアミノ末端もしくはカルボキシル末端の配列か
ら予測されるプライマーを合成する。この合成された混
合プライマーを用いてＰＣＲ法により前記でえられたｃ
ＤＮＡを増幅する。ＰＣＲ法による増幅はあとに行なう
クローニングのための充分な量のｃＤＮＡがえられるよ
うなサイクル数行なえばよい。増幅されたｃＤＮＡを通
常のゲル電気泳動たとえば、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により検出し、抽出を行なう。A primer predicted from the amino-terminal or carboxyl-terminal sequence of the known sheep CD2 antigen receptor amino acid partial sequence is synthesized. C obtained by the PCR method using this synthesized mixed primer
Amplify DNA. Amplification by the PCR method may be carried out by the number of cycles so as to obtain a sufficient amount of cDNA for subsequent cloning. The amplified cDNA is detected by ordinary gel electrophoresis, for example, polyacrylamide gel electrophoresis, and extracted.

【００１３】抽出されたＤＮＡは、適切なベクターたと
えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８またはＭ１３ｍｐ１９
などを用いて、これに対して適切な宿主たとえば、大腸
菌ＪＭ１０９などによりクローニングし、通常の方法た
とえばサンガー法などにより塩基配列決定できる。The extracted DNA can be transformed into a suitable vector such as pBR322, pUC18 or M13mp19.
Can be cloned using an appropriate host, such as Escherichia coli JM109, and the nucleotide sequence can be determined by an ordinary method such as the Sanger method.

【００１４】このようにして決定されたヒツジＬＦＡ−
３のＤＮＡ配列を有するＤＮＡは、ヒツジＬＦＡ−３遺
伝子およびｍＲＮＡの検出に有用なプローブとして用い
ることができる。すなわち、ヒツジＬＦＡ−３の全長の
ｃＤＮＡはヒツジｃＤＮＡライブラリーからそのプロー
ブを用いて容易に検出することができる。また、決定さ
れた配列を有するプライマーを用いたＰＣＲ法により増
幅し、クローニングすることができる。クローニングさ
れたヒツジＬＦＡ−３のｃＤＮＡは制限酵素による解析
あるいは塩基配列を決定することにより特徴づけされ
る。The sheep LFA-determined in this way
The DNA having the DNA sequence of 3 can be used as a probe useful for detecting the sheep LFA-3 gene and mRNA. That is, the full-length cDNA of sheep LFA-3 can be easily detected from the sheep cDNA library using the probe. In addition, it can be amplified and cloned by a PCR method using a primer having the determined sequence. The cloned ovine LFA-3 cDNA is characterized by analysis with restriction enzymes or by determining the base sequence.

【００１５】こうしてえられたヒツジＬＦＡ−３のｃＤ
ＮＡもしくは該タンパク質をコードするＤＮＡ、適切な
ベクターおよびこれに対して適切な宿主たとえば大腸菌
やバチラスなどのバクテリア、酵母、カビまたは動植物
培養細胞などを用いて、これを培養することにより、ヒ
ツジＬＦＡ−３をえることができる。CD of sheep LFA-3 thus obtained
Sheep LFA-by culturing this using NA or DNA encoding the protein, a suitable vector, and a suitable host such as bacteria such as Escherichia coli and Bacillus, yeast, fungi or animal and plant cultured cells You can get 3.

【００１６】本発明のタンパク質であるヒツジＬＦＡ−
３タンパク質は、ヒツジ由来である、Ｄ１領域−Ｄ２領
域−ＴＭ領域−Ｃ領域の構造を有するＣＤ２抗原受容体
をいう。さらに詳しくは配列番号２で示されるアミノ酸
配列からなるタンパク質をいう。The protein of the present invention, sheep LFA-
The 3 protein refers to a CD2 antigen receptor derived from sheep and having a structure of D1 region-D2 region-TM region-C region. More specifically, it refers to a protein consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2.

【００１７】ヒツジＬＦＡ−３タンパク質は、その構造
が修飾された構造を有していてもよい。そのようなもの
の例としては、たとえば、大腸菌を宿主として生産され
たために末端にメチオニン残基を有するもの、または動
物培養細胞を宿主として生産されたために糖修飾をうけ
たものなどのような、生産する宿主細胞に依存した修飾
を有するものがあげられる。The sheep LFA-3 protein may have a modified structure. Examples of such products include those that have a methionine residue at the end because they were produced using Escherichia coli as a host, or those that have been subjected to sugar modification because they were produced using animal culture cells as hosts, and the like. Those having a modification depending on the host cell.

【００１８】また、はじめにＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−３
様タンパク質を発現しているヒツジ細胞あるいは臓器を
用いて同様の操作を行なうことにより、ヒツジＴＭ領域
欠失型ＬＦＡ−３様タンパク質をえることもできる。First, TM region deleted type LFA-3
A sheep TM region-deficient LFA-3 like protein can also be obtained by performing the same operation using sheep cells or organs expressing such a protein.

【００１９】ヒトＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−３様タンパク
質のｃＤＮＡは、ヒトＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−３様タン
パク質のｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリーから、Ｄ
１領域の塩基配列をもつプローブで選択されＴＭ領域の
プローブで選択されないクローンとしてスクリーニング
される。他の動物のＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−３様タンパ
ク質の遺伝子は、ヒツジＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−３様タ
ンパク質の遺伝子あるいはヒトＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−
３タンパク質の遺伝子とハイブリダイズするｃＤＮＡク
ローンのうち、ＴＭ領域をコードする配列をもたないｃ
ＤＮＡとして選択される。The human TM region-deficient LFA-3-like protein cDNA was cloned from a cDNA library containing the human TM region-deficient LFA-3-like protein cDNA.
It is screened as a clone selected with a probe having a nucleotide sequence of 1 region and not selected with a probe of TM region. Genes of TM region-deficient LFA-3-like proteins of other animals include sheep TM region-defective LFA-3-like protein genes or human TM region-deficient LFA-
Among the cDNA clones that hybridize with the gene of 3 proteins, the clones that do not have the sequence encoding the TM region
Selected as DNA.

【００２０】本発明のタンパク質であるＴＭ領域欠失型
ＬＦＡ−３様タンパク質すなわちＴＭ領域のアミノ酸配
列を有しないＬＦＡ−３様タンパク質は、一本鎖のポリ
ペプチドで分子量約22,000のタンパク質で、また糖質を
有するより高分子量のものもあり、ＬＦＡ−３タンパク
質からＴＭ領域を欠いた構造を有する。ここでＴＭ領域
とは、膜タンパクが有する疎水性アミノ酸に富む領域で
あるが、ヒトでは配列番号８に示した188 番目のTyr か
ら212 番目のCys までの配列と推定される。The TM region-deficient LFA-3-like protein of the present invention, ie, the LFA-3-like protein having no TM region amino acid sequence, is a single-chain polypeptide having a molecular weight of about 22,000. Some have higher molecular weights with carbohydrates and have a structure lacking the TM region from the LFA-3 protein. Here, the TM region is a region rich in hydrophobic amino acids possessed by a membrane protein, but in humans, it is presumed to be the sequence from the 188th Tyr to the 212th Cys shown in SEQ ID NO: 8.

【００２１】ＴＭ領域欠失ＬＦＡ−３様タンパク質は、
その構造が修飾された構造を有していてもよい。そのよ
うなものの例としては、たとえば、大腸菌を宿主として
生産されたために末端メチオニン残基を有するもの、ま
たは動物培養細胞を宿主として生産されたために糖修飾
をうけたものなどのような、生産する宿主細胞に依存し
た修飾を有するものがあげられる。The TM region-deficient LFA-3-like protein is
The structure may have a modified structure. Examples of such products include those having a terminal methionine residue because they were produced in Escherichia coli as a host, or those that were subjected to sugar modification because they were produced in an animal culture cell as a host. Those having modifications depending on the host cell are included.

【００２２】ＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−３様タンパク質は
ＬＦＡ−３に比べ低分子量であり、また膜貫通領域を有
さない。したがって、本発明のタンパク質は抗原性が低
く、天然型の可溶性ＬＦＡ−３様タンパク質であり、遺
伝子組換え技術において生産する上で、膜結合タンパク
質であるＬＦＡ−３に比較して動物培養細胞、酵母など
で分泌生産が可能であることから大変有利である。The TM region deleted type LFA-3-like protein has a lower molecular weight than LFA-3 and does not have a transmembrane region. Therefore, the protein of the present invention has a low antigenicity and is a natural soluble LFA-3-like protein, and when it is produced by gene recombination technology, it is compared with the membrane-bound protein LFA-3 in animal culture cells, It is very advantageous because it can be secreted and produced by yeast or the like.

【００２３】つぎに本発明のＤＮＡおよびタンパク質の
生産方法を実施例にもとづいて説明するが、本発明はも
とよりかかる実施例のみに限定されるものではない。Next, the method for producing DNA and protein of the present invention will be explained based on Examples, but the present invention is not limited to such Examples as a matter of course.

【００２４】実施例１ ａ．ヒツジＬＦＡ−３ｃＤＮＡのＰＣＲ用プライマーの
合成 ヒツジＣＤ２抗原受容体については配列番号３に示した
ように29アミノ酸残基からなるＮ末端アミノ酸配列が開
示されている（特開昭６３−１５０２２８号公報参
照）。ヒツジＬＦＡ−３ｃＤＮＡのＰＣＲ用プライマー
として、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を含む配列と引
き続く配列番号３の１番から７番のアミノ酸配列から予
想されるＤＮＡ配列とを有する配列番号４で示される混
合プライマー、および制限酵素ＰｓｔＩの認識配列を含
む配列と引き続く配列番号３の27番から22番のアミノ酸
配列から予想されるＤＮＡ配列と相補的関係にある配列
を有する配列番号５で示される混合プライマーをＤＮＡ
合成機（アプライドバイオシステムズ社、モデル３８１
Ａ）を使用し合成した。Example 1 a. Synthesis of PCR Primer for Sheep LFA-3 cDNA For sheep CD2 antigen receptor, an N-terminal amino acid sequence consisting of 29 amino acid residues is disclosed as shown in SEQ ID NO: 3 (see JP-A-63-150228). ). As a primer for PCR of sheep LFA-3 cDNA, a mixed primer represented by SEQ ID NO: 4 having a sequence containing a recognition sequence of a restriction enzyme BamHI and a DNA sequence predicted from the amino acid sequence 1 to 7 of SEQ ID NO: 3 , And a mixed primer represented by SEQ ID NO: 5 having a sequence having a complementary sequence to the DNA sequence predicted from the sequence containing the recognition sequence of the restriction enzyme PstI and the subsequent 27th to 22nd amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
Synthesizer (Applied Biosystems, Model 381)
It was synthesized using A).

【００２５】ｂ．ヒツジ細胞由来二重鎖ｃＤＮＡの調製 ヒツジから血液100 mlをヘパリン採血し、350 Ｇ、10分
の遠心によりバフィーコート画分をえた。赤血球溶解液
で赤血球を溶解後、等張リン酸緩衝液で２回洗浄しヒツ
ジ白血球細胞をえた。つぎにヒツジ白血球細胞からチオ
シアン酸グアニジン法によりＲＮＡを抽出し、さらにオ
リゴ（ｄＴ）セルロースカラムによりポリ（Ａ）^＋ＲＮ
Ａを精製した（ラボマニュアル遺伝子工学、村松正実
編、丸善1988年）。ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡからの二重鎖ｃ
ＤＮＡの合成は市販のキット（ファルマシア社製ｃＤＮ
Ａ合成キット＃27-9260-01）を用いて合成した。同様に
市販のヒツジ肝臓ｍＲＮＡ（クローンテック社製）より
二重鎖ｃＤＮＡを合成した。B. Preparation of double-stranded cDNA derived from sheep cells 100 ml of blood was collected from sheep using heparin and centrifuged at 350 G for 10 minutes to obtain a buffy coat fraction. Erythrocytes were lysed with an erythrocyte lysate and washed twice with an isotonic phosphate buffer to obtain sheep leukocytes. Next, RNA was extracted from sheep white blood cells by the guanidine thiocyanate method, and poly (A) ⁺ RN was further extracted by an oligo (dT) cellulose column.
A was purified (Lab Manual Genetic Engineering, edited by Masami Muramatsu, Maruzen 1988). Duplex c from poly (A) ⁺ RNA
A commercially available kit is used for synthesizing DNA (cDN manufactured by Pharmacia).
A synthesis kit # 27-9260-01). Similarly, double-stranded cDNA was synthesized from commercially available sheep liver mRNA (Clontech).

【００２６】ｃ．ヒツジＬＦＡ−３のｃＤＮＡ配列のＰ
ＣＲ法による増幅とクローニング ヒツジＬＦＡ−３のｃＤＮＡをＰＣＲ法によって試験管
内で増幅した。すなわち10mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ8.
3 ），100mM 塩化カリウム，1.5mM 塩化マグネシウム，
0.01％ゼラチン、前記ａで合成した２種類の混合プライ
マー各々10μＭ、前記ｂで調製したヒツジ白血球ｃＤＮ
Ａあるいはヒツジ肝臓ｃＤＮＡ 10ng、0.2mM ４種のデ
オキシヌクレオチド三リン酸、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼ 2.5単位を含む反応混合物 100μｌを94℃１分、37
℃２分、72℃２分の反応条件で35サイクルのＰＣＲを行
なった。反応後、ＰＣＲ生成物の大きさをポリアクリル
アミドゲル電気泳動により測定した結果、ヒツジ白血球
ｃＤＮＡおよびヒツジ肝臓ｃＤＮＡから、ともに約100
塩基対のＤＮＡが増幅されていることを認めた。この約
100 塩基対のＤＮＡをゲルから抽出し、制限酵素Ｂａｍ
ＨＩ，ＰｓｔＩ処理後、Ｍ１３ｍｐ１９ファージベクタ
ー（宝酒造製）のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位に組み込
み、大腸菌ＪＭ１０９を宿主として用いてクローニング
した。C. P of the cDNA sequence of sheep LFA-3
Amplification and cloning by CR method Sheep LFA-3 cDNA was amplified in vitro by PCR. That is, 10 mM Tris-HCl (pH 8.
3), 100mM potassium chloride, 1.5mM magnesium chloride,
0.01% gelatin, 10 μM each of the two kinds of mixed primers synthesized in a above, and sheep leukocyte cDNA prepared in b above
100 μl of a reaction mixture containing 10 ng of A or sheep liver cDNA, 0.2 mM four kinds of deoxynucleotide triphosphates and 2.5 units of Taq DNA polymerase at 94 ° C. for 1 minute, 37
35 cycles of PCR were performed under the reaction conditions of 2 ° C. for 2 minutes and 72 ° C. for 2 minutes. After the reaction, the size of the PCR product was measured by polyacrylamide gel electrophoresis.
It was confirmed that the base pair DNA was amplified. This about
DNA of 100 base pairs was extracted from the gel and the restriction enzyme Bam was used.
After treatment with HI and PstI, it was incorporated into the BamHI-PstI site of the M13mp19 phage vector (Takara Shuzo) and cloned using E. coli JM109 as a host.

【００２７】ｄ．ＰＣＲによって増幅された遺伝子の配
列決定 前記ｃでえられた陽性クローンから調製した約100 塩基
対のＤＮＡの配列をダイデオキシヌクレオチド三リン酸
を用いた常法により決定した。その結果、ＰＣＲに用い
た２種のプライマー間の配列は、白血球ｃＤＮＡおよび
肝臓ｃＤＮＡのＰＣＲ生成物がともに、配列番号１（お
よび配列番号１２）の19番から66番までの塩基配列であ
ると決定された。この配列はヒツジＣＤ２抗原受容体の
既知の部分アミノ酸配列である配列番号３の７番のGly
から22番のPro に対応しており、ヒツジＬＦＡ−３のｃ
ＤＮＡが前記の塩基配列を有することを示している。こ
のＤＮＡ配列は配列番号２（および配列番号１３）の７
番から22番のアミノ酸をコードしている。D. Sequencing of Gene Amplified by PCR The sequence of DNA of about 100 base pairs prepared from the positive clone obtained in the above c was determined by a conventional method using dideoxynucleotide triphosphate. As a result, the sequence between the two primers used in PCR was that the PCR products of leukocyte cDNA and liver cDNA were the nucleotide sequences from No. 19 to No. 66 of SEQ ID NO: 1 (and SEQ ID NO: 12). It has been determined. This sequence is a known partial amino acid sequence of sheep CD2 antigen receptor, Gly at position 7 in SEQ ID NO: 3.
It corresponds to the No. 22 to Pro and is c of sheep LFA-3.
It shows that the DNA has the above-mentioned nucleotide sequence. This DNA sequence is 7 of SEQ ID NO: 2 (and SEQ ID NO: 13).
It encodes amino acids numbered 22.

【００２８】ｅ．ヒツジＬＦＡ−３および類似タンパク
質のｃＤＮＡの取得 ヒツジＬＦＡ−３および類似タンパク質の全長のｃＤＮ
Ａをクローニングするために、前記ｄで決定したヒツジ
ＬＦＡ−３のＮ末端のｃＤＮＡ配列をプローブとしてヒ
ツジｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。すな
わち、前記ｂで作ったヒツジ白血球由来の二重鎖ｃＤＮ
ＡをＤＮＡポリメラーゼ処理で平滑末端にし、ＥｃｏＲ
Ｉリンカー（ファルマシア社製）を接続し、さらにＥｃ
ｏＲＩで切断し、アルカリフォスファターゼ処理したλ
ｇｔｌｌ（ストラタジーン社製）の左右のアームを接続
した。インビトロパッケージングを行ないｃＤＮＡライ
ブラリーを作製した。ヒツジＬＦＡ−３のＮ末端近傍の
ｃＤＮＡ配列を有するプローブ、配列番号６および配列
番号７を合成した。約20万の組換えファージをこれらの
プローブでスクリーニングした結果、1.0 kb（キロベー
ス）〜1.2 kbのインサートｃＤＮＡを含有する３株の陽
性クローン（ＳＬ−６、ＳＬ−40、ＳＬ−43）をえた。E. Acquisition of cDNAs for sheep LFA-3 and similar proteins Full length cDNA of sheep LFA-3 and similar proteins
To clone A, a sheep cDNA library was screened using the N-terminal cDNA sequence of sheep LFA-3 determined in d above as a probe. That is, double-stranded cDNA derived from sheep leukocytes prepared in the above b.
A is made blunt by treatment with DNA polymerase and EcoR
I Linker (Pharmacia) is connected, and further Ec
λ cut with oRI and treated with alkaline phosphatase
The left and right arms of gtll (Stratagene) were connected. In vitro packaging was performed to prepare a cDNA library. A probe having a cDNA sequence near the N-terminal of sheep LFA-3, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, was synthesized. As a result of screening about 200,000 recombinant phages with these probes, three positive clones (SL-6, SL-40, SL-43) containing 1.0 kb (kilobase) to 1.2 kb of insert cDNA were found. I got it.

【００２９】実施例２ ｆ．ヒツジＬＦＡ−３のｃＤＮＡの塩基配列決定 実施例１でえられた陽性クローンのうち、ＳＬ−６のｃ
ＤＮＡ配列をＭ13ファージを用いたダイデオキシ法によ
り決定した結果、配列番号１の塩基配列に示される配列
が見いだされた。この塩基配列および塩基配列から推定
されたアミノ酸配列は、ヒツジＬＦＡ−３のＮ末端のア
ミノ配列であるVal からＣ末端のアミノ酸であるPro に
対応している。また、このアミノ酸配列をヒトＬＦＡ−
３のアミノ酸配列と比較したところ、Ｄ１領域、Ｄ２領
域、ＴＭ領域、Ｃ領域にそれぞれ対応する領域を有する
ことがわかる。Example 2 f. Nucleotide sequencing of cDNA of sheep LFA-3 Among the positive clones obtained in Example 1, c of SL-6 was detected.
As a result of the determination of the DNA sequence by the dideoxy method using M13 phage, the sequence shown in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 was found. This base sequence and the amino acid sequence deduced from the base sequence correspond to the N-terminal amino sequence Val of sheep LFA-3 to the C-terminal amino acid Pro. In addition, this amino acid sequence is
Comparison with the amino acid sequence of 3 reveals that it has regions corresponding to the D1 region, D2 region, TM region, and C region, respectively.

【００３０】ｇ．ヒツジＬＦＡ−３タンパク質の大腸菌
発現ベクターの作製 ヒツジＬＦＡ−３タンパク質を大腸菌で発現させるため
に発現ベクターを構築した。実施例１でえられたｃＤＮ
ＡクローンＳＬ−６に含まれるインサートＤＮＡを制限
酵素ＥｃｏＲＩで切り出し、プラスミドｐＵＣ１８のＥ
ｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。つぎに、このプ
ラスミドを鋳型としてＰＣＲを行なった。使用した５´
側プライマーは配列番号１４に示されている。このプラ
イマーはＢａｍＨＩ認識配列、ＮｃｏＩ認識配列および
配列番号２の１番から７番のアミノ酸配列から予想され
るＤＮＡ配列とから構成されている。使用した３´側プ
ライマーは配列番号１５に示されている。このプライマ
ーはＰｓｔＩ認識配列、終止コドンに相当する配列およ
び配列番号２の219 番目から225 番目のアミノ酸配列か
ら予想されるＤＮＡ配列とから構成されている。配列番
号１４のＤＮＡと配列番号１５のＤＮＡをプライマーと
してＰＣＲを行ない、増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素
ＢａｍＨＩとＰｓｔＩで切断した。この断片をＭ13ｍｐ
19ファージベクターのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入
し、ダイデオキシ法により導入されたＤＮＡの塩基配列
を確認した。つぎに、それぞれのＭ１３ファージベクタ
ーからヒツジＬＦＡ−３タンパク質の遺伝子を制限酵素
ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩで切り出し、発現ベクターｐＫ
Ｋ２３３−２（ファルマシア社製）のＮｃｏＩ−Ｐｓｔ
Ｉ部位に接続し、発現ベクターｐＫＳＬを作製した。G. Preparation of Escherichia coli Expression Vector of Sheep LFA-3 Protein An expression vector was constructed to express the sheep LFA-3 protein in E. coli. CDN obtained in Example 1
The insert DNA contained in the A clone SL-6 was cut out with the restriction enzyme EcoRI to obtain E of the plasmid pUC18.
Subcloned into the coRI site. Next, PCR was performed using this plasmid as a template. Used 5 '
The side primer is shown in SEQ ID NO: 14. This primer is composed of a BamHI recognition sequence, an NcoI recognition sequence, and a DNA sequence predicted from the amino acid sequences 1 to 7 of SEQ ID NO: 2. The 3'side primer used is shown in SEQ ID NO: 15. This primer is composed of a PstI recognition sequence, a sequence corresponding to the stop codon, and a DNA sequence predicted from the 219th to 225th amino acid sequences of SEQ ID NO: 2. PCR was performed using the DNAs of SEQ ID NO: 14 and the DNA of SEQ ID NO: 15 as primers, and the amplified DNA fragment was digested with restriction enzymes BamHI and PstI. This fragment is M13mp
The nucleotide sequence of the DNA introduced by the dideoxy method was confirmed by inserting it into the BamHI-PstI site of the 19 phage vector. Next, the gene of the sheep LFA-3 protein was excised from each M13 phage vector with the restriction enzymes NcoI and PstI, and the expression vector pK
K233-2 (Pharmacia) NcoI-Pst
The expression vector pKSL was constructed by connecting to the I site.

【００３１】ｈ．大腸菌を宿主としたヒツジＬＦＡ−３
タンパク質の生産 ヒツジＬＦＡ−３タンパク質の発現ベクターｐＫＳＬを
持つ大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造製）を前培養後、10mgの
アンピシリンを含む100ml のＬＢ培地に接種し、500ml
の坂口フラスコで600nm の吸光度が0.3 になるまで37℃
で振とう培養した。つぎにＩＰＴＧ（イソプロピル−β
−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド、和光純薬製）を終濃
度１mMとなるように加え、さらに６時間培養した。培養
した菌体を遠心により集め、50m Ｍ ＥＤＴＡ、５％Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ−100 、８％ショ糖を含有する50mMＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ8.0 ）10mlに懸濁し、リゾチームを終
濃度0.1 ％加えた。この菌体懸濁液を超音波処理、遠心
分離し不溶性の沈殿画分をえた。この沈殿を50％グリセ
ロール、エタノールで洗浄し、生産されたヒツジＬＦＡ
−３タンパク質の顆粒体をえた。この顆粒体をＳＤＳで
溶解させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動する
と、分子量25,000〜27,000のバンドが検出された。H. Sheep LFA-3 with E. coli as host
Protein Production After pre-culturing Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) containing the sheep LFA-3 protein expression vector pKSL, it was inoculated into 100 ml of LB medium containing 10 mg of ampicillin to give 500 ml.
Sakaguchi flask at 37 ℃ until the absorbance at 600nm becomes 0.3
The cells were shaken and cultured. Next, IPTG (isopropyl-β
-D-thio-galactopyranoside, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added so that the final concentration was 1 mM, and the cells were further cultured for 6 hours. The cultured cells were collected by centrifugation, 50 mM EDTA, 5% T
rtonX-100, 50 mM Tri containing 8% sucrose
It was suspended in 10 ml of s-HCl (pH 8.0) and lysozyme was added to a final concentration of 0.1%. This cell suspension was sonicated and centrifuged to obtain an insoluble precipitate fraction. This precipitate was washed with 50% glycerol and ethanol to produce sheep LFA.
-3 protein granules were obtained. When this granule was dissolved in SDS and subjected to SDS-polyacrylamide electrophoresis, a band having a molecular weight of 25,000 to 27,000 was detected.

【００３２】実施例３ ｉ．ヒツジＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−３様タンパク質（以
下、ヒツジ△ＴＭタンパク質と呼ぶ）ｃＤＮＡの塩基配
列決定 実施例１でえられた陽性クローンのうち、ＳＬ−４３の
ｃＤＮＡ配列をＭ13ファージを用いたダイデオキシ法に
より決定した結果、配列番号１２の塩基配列に示される
配列が見いだされた。この塩基配列および塩基配列から
決定されたアミノ酸配列は、配列番号１３に示したヒツ
ジ△ＴＭタンパク質のＮ末端のアミノ酸であるVal から
Ｃ末端のアミノ酸であるSer に対応している。また塩基
配列の決定の結果、ヒツジ△ＴＭタンパク質はメチオニ
ンから始まる28アミノ酸残基のシグナルペプチドを有す
ることもわかった。このえられたヒツジ△ＴＭタンパク
質のｃＤＮＡおよび塩基配列の情報にもとづき天然型の
ヒツジ△ＴＭタンパク質および誘導体を、遺伝子工学的
に組換え体で生産できる。図１は、配列番号１３のヒツ
ジ△ＴＭタンパク質のアミノ酸配列と配列番号８のヒト
ＬＦＡ−３のアミノ酸配列を比較した図であるが、△Ｔ
Ｍタンパク質がヒトＬＦＡ−３にあるＴＭ領域（下線を
引いた部分）を欠いていることが理解される。Example 3 i. Nucleotide sequence determination of sheep TM region deleted LFA-3-like protein (hereinafter referred to as sheep ΔTM protein) cDNA Among the positive clones obtained in Example 1, the SL-43 cDNA sequence was used for M13 phage. As a result of determination by the dideoxy method, the sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 was found. The base sequence and the amino acid sequence determined from the base sequence correspond to the N-terminal amino acid Val of the sheep ΔTM protein shown in SEQ ID NO: 13 to the C-terminal amino acid Ser. As a result of determining the nucleotide sequence, it was also found that the sheep ΔTM protein has a signal peptide of 28 amino acid residues starting from methionine. Based on the obtained cDNA and nucleotide sequence information of the sheep ΔTM protein, natural sheep ΔTM protein and derivatives can be recombinantly produced by genetic engineering. FIG. 1 is a diagram comparing the amino acid sequence of the sheep ΔTM protein of SEQ ID NO: 13 with the amino acid sequence of human LFA-3 of SEQ ID NO: 8
It is understood that the M protein lacks the TM region (underlined) in human LFA-3.

【００３３】ｊ．ヒツジ△ＴＭタンパク質の大腸菌の発
現ベクターの作製 ヒツジ△ＴＭタンパク質を大腸菌で発現するための発現
ベクターを構築した。実施例１でえられたｃＤＮＡクロ
ーンＳＬ−４３に含まれるインサートＤＮＡを制限酵素
ＥｃｏＲＩで切り出し、プラスミドｐＵＣ18のＥｃｏＲ
Ｉ部位にサブクローニンクした。つぎに、このプラスミ
ドについてＰＣＲを行なった。使用した５´側プライマ
ーは配列番号９および10に示されている。これらのプラ
イマーはＢａｍＨＩ認識配列、ＮｃｏＩ認識配列および
配列番号１３の１番から７番のアミノ酸配列から予想さ
れるＤＮＡ配列とから構成されている。使用した３´側
プライマーは配列番号１１に示されている。このプライ
マーはＳａｌＩ認識配列、ＰｓｔＩ認識配列、終止コド
ンの配列および配列番号１３の199 番から193 番のアミ
ノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列とから構成されてい
る。配列番号９と１１のプライマーまたは配列番号１０
と１１のプライマーを用いてＰＣＲを行ない、増幅され
たＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断
し、それぞれＭ13ｍｐ19ファージベクターのＢａｍＨＩ
−ＳａｌＩ部位に挿入し、ダイデオキシ法により導入さ
れたＤＮＡの塩基配列が目的の配列を有していることを
確認した。つぎにそれぞれのＭ13ファージベクターから
ヒツジ△ＴＭタンパク質の遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩお
よびＰｓｔＩで切りだし、発現用ベクターｐＫＫ２３３
−２（ファルマシア社製）のＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ部位に
接続し、発現ベクターを作製した。配列番号９と１１の
プライマーを使用して作製した発現ベクターをｐＫＳＬ
△ＴＭ−０と呼び、配列番号１０と１１のプライマーを
使用して作製した発現ベクターをｐＫＳＬ△ＴＭ−１と
呼ぶ。J. Preparation of Escherichia coli Expression Vector for Sheep ΔTM Protein An expression vector for expressing sheep ΔTM protein in E. coli was constructed. The insert DNA contained in the cDNA clone SL-43 obtained in Example 1 was cut out with a restriction enzyme EcoRI, and EcoR of the plasmid pUC18 was cut out.
Subcloning was performed at the I site. Next, PCR was performed on this plasmid. The 5'side primers used are shown in SEQ ID NOs: 9 and 10. These primers are composed of a BamHI recognition sequence, an NcoI recognition sequence, and a DNA sequence predicted from the amino acid sequences 1 to 7 of SEQ ID NO: 13. The 3'side primer used is shown in SEQ ID NO: 11. This primer is composed of a SalI recognition sequence, a PstI recognition sequence, a stop codon sequence and a DNA sequence predicted from the amino acid sequences 199 to 193 of SEQ ID NO: 13. SEQ ID NOS: 9 and 11 or SEQ ID NO: 10
PCR was carried out using the primers Nos. 11 and 11, and the amplified DNA fragment was cleaved with restriction enzymes BamHI and SalI.
It was confirmed that the nucleotide sequence of the DNA inserted into the -SalI site and introduced by the dideoxy method had the desired sequence. Next, the gene of the sheep ΔTM protein was cut out from each M13 phage vector with the restriction enzymes NcoI and PstI, and the expression vector pKK233.
-2 (Pharmacia) was connected to the NcoI-PstI site to prepare an expression vector. The expression vector prepared using the primers of SEQ ID NOs: 9 and 11 was designated as pKSL.
The expression vector prepared by using the primers of SEQ ID NOs: 10 and 11 is called ΔTM-0, and is called pKSLΔTM-1.

【００３４】ｋ．大腸菌を宿主としたヒツジ△ＴＭタン
パク質の生産 ヒツジ△ＴＭタンパク質の発現ベクターｐＫＳＬ△ＴＭ
−０または；ｐＫＳＬ△ＴＭ−１を持つ大腸菌ＪＭ109
（宝酒造製）を前培養後、10mgのアンピシリンを含む10
0ml のＬＢ培地に接種し、500ml の坂口フラスコでＡ
₆₀₀ が0.3 になるまで37℃で振とう培養した。つぎにＩ
ＰＴＧを終濃度１mMで加え、さらに６時間培養した。培
養した菌体を遠心により集め、50mMＥＤＴＡ、５％Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−100 、８％ショ糖を含有する50mMＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ8.0 ）10mlに懸濁し、リゾチームを終濃
度0.1 ％加えた。この菌体懸濁液を超音波処理、遠心分
離し不溶性の沈殿画分をえた。この沈殿を50％グリセロ
ール、エタノールで洗浄し、生産されたヒツジ△ＴＭタ
ンパク質の顆粒体をえた。生産性はｐＫＳＬ△ＴＭ−０
よりもｐＫＳＬ△ＴＭ−１の方が高かった。K. Production of sheep ΔTM protein using Escherichia coli as a host Expression vector of sheep ΔTM protein pKSLΔTM
-0 or; Escherichia coli JM109 having pKSLΔTM-1
Pre-incubated (Takara Shuzo) with 10 mg ampicillin 10
Inoculate 0 ml of LB medium and use A in a 500 ml Sakaguchi flask.
_{The cells} were cultivated with shaking at 37 ° C until ₆₀₀ reached 0.3. Next I
PTG was added at a final concentration of 1 mM, and the cells were further cultured for 6 hours. The cultured cells were collected by centrifugation, 50 mM EDTA, 5% Tr
50 mM Tris containing itonX-100 and 8% sucrose
-Suspended in 10 ml of HCl (pH 8.0) and added lysozyme at a final concentration of 0.1%. This cell suspension was sonicated and centrifuged to obtain an insoluble precipitate fraction. The precipitate was washed with 50% glycerol and ethanol to obtain the produced sheep ΔTM protein granules. Productivity is pKSL △ TM-0
PKSLΔTM-1 was higher than pKSLΔTM-1.

【００３５】ｌ．ヒツジ△ＴＭタンパク質顆粒体の可溶
化と再活性化 前記ｎでえられた顆粒体を８Ｍ尿素、20mM酢酸アンモニ
ウム、0.4 mMシステイン、0.04mMシスチン（ｐＨ 9.5）
で溶解し、遠心後上清をとった。上清を８Ｍ尿素でＡ
₂₈₀ が0.1 になるように希釈し、10倍量の20mM酢酸アン
モニウム、0.4 mMシステイン、0.04mMシスチン（ｐＨ
9.5）に透析した。さらに等張リン酸緩衝液に透析し、
可溶性のヒツジ△ＴＭタンパク質の溶液をえた。このタ
ンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動すると
分子量が23,000〜25,000のバンドが検出された。この分
子量からも、えられたタンパク質がヒツジ△ＴＭタンパ
ク質であることが確認された。このようにして調製した
ヒツジ△ＴＭタンパク質25〜０μｇを等張リン酸緩衝液
で洗浄した50μｌのＪｕｒｋａｔ細胞（ユー シュナイ
ダー(U.Suhneider,)ら、1977年、インターナショナル
ジャーナル オブ キャンサー(Int.J.Cancer.)19 巻、
621 頁）と混合後、ヒツジ赤血球を加えロゼットの形成
に対する影響を観察した。その結果、ヒツジ△ＴＭタン
パク質は用量依存的にＪｕｒｋａｔ細胞とヒツジ赤血球
のロゼット形成を阻害することが分かった。ロゼット形
成を50％阻害する濃度は約20μｇ/ml であった。L. Solubilization and reactivation of sheep ΔTM protein granules The granules obtained in n above were treated with 8M urea, 20mM ammonium acetate, 0.4mM cysteine, 0.04mM cystine (pH 9.5).
It was dissolved in, and after centrifugation, the supernatant was taken. Supernatant A with 8M urea
Dilute ₂₈₀ to 0.1 and add 10 volumes of 20 mM ammonium acetate, 0.4 mM cysteine, 0.04 mM cystine (pH
It was dialyzed to 9.5). Further dialysis against isotonic phosphate buffer,
A solution of soluble sheep ΔTM protein was obtained. When this protein was subjected to SDS-polyacrylamide electrophoresis, a band having a molecular weight of 23,000 to 25,000 was detected. From this molecular weight, it was confirmed that the obtained protein was sheep ΔTM protein. 25 to 0 μg of sheep ΔTM protein thus prepared was washed with an isotonic phosphate buffer solution and 50 μl of Jurkat cells (U. Suhneider, et al., 1977, International
19 volumes of Journal of Cancer (Int.J.Cancer.),
(Page 621) and after mixing with sheep red blood cells, the effect on rosette formation was observed. As a result, it was found that sheep ΔTM protein inhibits rosette formation of Jurkat cells and sheep erythrocytes in a dose-dependent manner. The concentration at which rosette formation was inhibited by 50% was about 20 μg / ml.

【００３６】[0036]

【発明の効果】本発明のヒツジＬＦＡ−３ｃＤＮＡがえ
られ、その全塩基配列がえられたことにより、ヒツジＬ
ＦＡ−３の全アミノ酸配列がわかった。これにより、ヒ
ツジのゲノムのＬＦＡ−３遺伝子の解析やクローニング
が可能である。ゲノム性のＤＮＡには、イントロンが含
まれていることがあり、動物培養細胞を宿主としたヒツ
ジＬＦＡ−３の遺伝子工学的生産に有用である。また、
ヒツジＬＦＡ−３の遺伝子工学的生産が可能となった。EFFECT OF THE INVENTION The sheep LFA-3 cDNA of the present invention was obtained, and its entire base sequence was obtained.
The entire amino acid sequence of FA-3 was found. This allows the analysis and cloning of the LFA-3 gene of the sheep genome. The genomic DNA may contain introns and is useful for genetically engineered production of sheep LFA-3 using animal cultured cells as a host. Also,
Genetic engineering production of sheep LFA-3 has become possible.

【００３７】遺伝子工学的なヒツジＬＦＡ−３の生産で
は、天然に存在するヒツジＬＦＡ−３のアミノ酸配列を
有する分子ばかりでなく、人為的に１つ以上のアミノ酸
の置換、挿入、欠失をもつ変異体、他のタンパクとの融
合タンパクを生産することができる。またそれらを化学
的あるいは酵素的に修飾した誘導体を作ることができ
る。それらの中にはＬＦＡ−３の生理的なリガンドであ
るＣＤ２抗原との親和性が異なるものや動物培養細胞で
分泌生産されたとき膜に結合しない可溶性のものが含ま
れる。In genetically engineered production of sheep LFA-3, not only a molecule having a naturally occurring amino acid sequence of sheep LFA-3 but also artificially one or more amino acid substitutions, insertions or deletions are included. Mutants and fusion proteins with other proteins can be produced. In addition, a derivative obtained by chemically or enzymatically modifying them can be prepared. Among them are those having different affinity for CD2 antigen, which is a physiological ligand of LFA-3, and soluble ones which do not bind to the membrane when secreted and produced in animal cultured cells.

【００３８】遺伝子工学的に生産されたヒツジＬＦＡ−
３およびその変異体またはそれらの誘導体は、ヒトＴ細
胞との親和性があれば、Ｔ細胞の検出のための診断試薬
になりうる。診断試薬としては、酵素、蛍光試薬あるい
はアイソトープで標識したものが利用可能である。また
Ｔ細胞との親和性があれば、それらを化学的または物理
的に固定化した担体を作製しＴ細胞の分離（単離、除
去）のために供することができる。ヒツジＬＦＡ−３お
よびその誘導体、他のタンパク質との融合タンパクから
は、それらのＴ細胞との親和性を利用したＴ細胞系腫瘍
や白血病のターゲッティング治療薬としての用途があ
る。たとえばリシンなどの毒素とのコンジュゲートは治
療薬となる。Sheep LFA produced genetically
3 and its mutants or their derivatives can be diagnostic reagents for the detection of T cells if they have an affinity for human T cells. As the diagnostic reagent, one labeled with an enzyme, a fluorescent reagent or an isotope can be used. In addition, if it has affinity with T cells, it can be used for separation (isolation, removal) of T cells by preparing a carrier on which they are chemically or physically immobilized. From sheep LFA-3 and its derivatives, and fusion proteins with other proteins, there are uses as targeting therapeutic agents for T-cell tumors and leukemias that utilize their affinity for T cells. For example, conjugates with toxins such as ricin are therapeutic agents.

【００３９】ＬＦＡ−３の天然リガンドであるＣＤ２抗
原はＴ細胞の機能としての多くの免疫反応に関与してい
ることが知られており、したがってＣＤ２と親和性のあ
るヒツジＬＦＡ−３およびその変異体またはそれらの誘
導体は免疫反応を抑制あるいは活性化する薬剤、すなわ
ち免疫調節剤として利用できる。The CD2 antigen, which is the natural ligand of LFA-3, is known to be involved in many immune responses as a function of T cells, and therefore sheep LFA-3 and its mutations that have an affinity for CD2. The body or a derivative thereof can be used as an agent that suppresses or activates an immune response, that is, an immunomodulator.

【００４０】また、ヒツジＬＦＡ−３のｃＤＮＡの解析
を通して、ヒトＬＦＡ−３との差が明白になり、ヒツジ
赤血球とヒトＴ細胞のロゼット形成のしやすさの原因な
らびにヒツジＬＦＡ−３独特の機能が明らかになる可能
性がある。Further, through the analysis of the cDNA of sheep LFA-3, the difference from human LFA-3 was clarified, and the cause of rosette formation between sheep erythrocytes and human T cells and the unique functions of sheep LFA-3 were revealed. May be revealed.

【００４１】さらに本発明により、ヒトＴ細胞のＣＤ２
抗原に対する高い親和性を有するタンパク質であって、
遺伝子工学的な生産に適するＬＦＡ−３様タンパク質で
あるＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−３様タンパク質がえられ
る。Further in accordance with the present invention, human T cell CD2
A protein having a high affinity for an antigen,
A TM region-deficient LFA-3-like protein, which is an LFA-3-like protein suitable for genetic engineering production, can be obtained.

【００４２】また、本発明により該タンパク質をコード
するＤＮＡがえられる。したがって、ヒツジＴＭ領域欠
失型ＬＦＡ−３様タンパク質の遺伝子工学的生産が可能
となり、一方、天然に存在するヒツジＴＭ領域欠失型Ｌ
ＦＡ−３様タンパク質のアミノ酸配列を持つ分子ばかり
でなく、人為的に一つ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠
失をもつ変異体、他のタンパクとの融合タンパクを生産
することができる。またそれらを化学的あるいは酵素的
に修飾した誘導体を作ることができる。それらの中には
ＬＦＡ−３の天然のリガンドであるＣＤ２抗原との親和
性が異なるものが含まれる。The present invention also provides a DNA encoding the protein. Therefore, it becomes possible to genetically produce a sheep TM region-deficient LFA-3-like protein, while naturally occurring sheep TM region-deficient L
Not only a molecule having the amino acid sequence of FA-3-like protein, but also a mutant having artificially one or more amino acid substitutions, insertions, and deletions, and a fusion protein with another protein can be produced. In addition, a derivative obtained by chemically or enzymatically modifying them can be prepared. Among them are those that have different affinities with the CD2 antigen, which is the natural ligand of LFA-3.

【００４３】遺伝子工学的に生産されたヒツジＴＭ領域
欠失型ＬＦＡ−３様タンパク質およびその変異体あるい
はそれらの誘導体は、ヒトＴ細胞との親和性があれば、
Ｔ細胞の検出のための診断試薬になりうる。診断試薬と
しては、酵素、蛍光試薬あるいはアイソトープで標識し
たものが利用可能である。またＴ細胞との親和性があれ
ば、それらを化学的あるいは物理的に固定化した担体を
作製しＴ細胞の分離（単離、除去）のために供すること
ができる。ヒツジＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−３様タンパク
質およびその誘導体、他のタンパク質との融合タンパク
には、それらのＴ細胞との親和性を利用したＴ細胞系腫
瘍や白血球のターゲッティング治療薬としての用途があ
る。たとえばリシンなどの毒素とのコンジュゲートは治
療薬となる。If the sheep TM region-deficient LFA-3-like protein and its mutants or their derivatives produced by genetic engineering have affinity for human T cells,
It can be a diagnostic reagent for the detection of T cells. As the diagnostic reagent, one labeled with an enzyme, a fluorescent reagent or an isotope can be used. In addition, if it has affinity with T cells, it can be used for the separation (isolation, removal) of T cells by preparing a carrier on which they are chemically or physically immobilized. The sheep TM region-deficient LFA-3-like protein and its derivatives, and fusion proteins with other proteins can be used as therapeutic agents for targeting T-cell tumors and leukocytes utilizing their affinity for T cells. is there. For example, conjugates with toxins such as ricin are therapeutic agents.

【００４４】ＬＦＡ−３の天然のリガンドであるＣＤ２
抗原はＴ細胞の機能としての多くの免疫反応に関与して
いることが知られており、したがってＣＤ２抗原と親和
性のあるヒツジＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−３様タンパク質
およびその変異体あるいはそれらの誘導体は免疫反応を
抑制あるいは活性化する薬剤、すなわち免疫調節剤とし
て利用できる。CD2, the natural ligand of LFA-3
Antigens are known to be involved in many immune reactions as a function of T cells, and therefore, sheep TM region-deficient LFA-3 like proteins and their mutants or their variants that have affinity for the CD2 antigen. The derivative can be used as a drug that suppresses or activates an immune reaction, that is, an immunomodulator.

【００４５】また、ヒツジＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−３様
タンパク質のアミノ酸配列とヒトＬＦＡ−３のアミノ酸
配列を比較すると（図１）、ヒトＴＭ領域欠失型ＬＦＡ
−３様タンパク質は、配列番号８で示したヒトＬＦＡ−
３のアミノ酸配列の 188番から 212番のアミノ酸配列を
欠失したもの、あるいは配列番号８の 188番から 212番
のアミノ酸を欠失し、さらに 213番から 222番のアミノ
酸配列に１つ以上のアミノ酸の置換を有するタンパク質
であると構造が推定される。Further, comparing the amino acid sequence of sheep TM region deleted LFA-3-like protein with the amino acid sequence of human LFA-3 (FIG. 1), human TM region deleted LFA-3
The -3-like protein is human LFA-shown in SEQ ID NO: 8.
No. 3 to the amino acid sequence 188 to 212 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 or deletion of the amino acid sequence 188 to 212 of SEQ ID NO: 8 and more than one in the amino acid sequence 213 to 222 The structure is presumed to be a protein having amino acid substitutions.

【００４６】[0046]

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：675 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：No 起 源 生物名：オーヴィス（Ovis） 細胞の種類：白血球細胞 配 列 GTT TCC CAA GAT ATT TAT GGA GCT ATG AAT GGG AAT GTA ACC TTT TAC 48 Val Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe Tyr 1 5 10 15 GTT TCA GAG TCT CAA CCG TTT ACA GAG ATT ATG TGG AAG AAG GGG AAG 96 Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Trp Lys Lys Gly Lys 20 25 30 GAT AAA GTT GTA GAA TGG GAT CAA ACA TCT GGA CTC GAA GCT TTT CAG 144 Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gln Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe Gln 35 40 45 TCT TTT AAA AAT AGA GTT CAT TTA GAC ATT GTG TCA GGT AAC CTC ACC 192 Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp Ile Val Ser Gly Asn Leu Thr 50 55 60 ATC ACC GGG TTA ACA AAA TTA GAT GAA GAT GTG TAT GAA ATT GAA TCC 240 Ile Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu Ile Glu Ser 65 70 75 80 CCA AGT GTT AAA AAG AGC TCC CAG TTC CAC CTC AGA GTG ATT GAA CCT 288 Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gln Phe His Leu Arg Val Ile Glu Pro 85 90 95 CCT CCA ACA CCG TCA GCA TCT TGC TTC TTG ACT GAG GGT GGA AAC ATT 336 Pro Pro Thr Pro Ser Ala Ser Cys Phe Leu Thr Glu Gly Gly Asn Ile 100 105 110 ACT CTC ACC TGC TCG ATC CCG GAA GGT GAC CCC AAA GAG CTC GAT GAT 384 Thr Leu Thr Cys Ser Ile Pro Glu Gly Asp Pro Lys Glu Leu Asp Asp 115 120 125 AGT GAC CTA ATA CGG TAT TTG TGG GAA TGT CCG CCA ACA ATA CAG TGT 432 Ser Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Trp Glu Cys Pro Pro Thr Ile Gln Cys 130 135 140 CAC CGT GGC TCG ATT TCA TCT GAA GCC TTT GTC TCA GCG GAA AGT GAT 480 His Arg Gly Ser Ile Ser Ser Glu Ala Phe Val Ser Ala Glu Ser Asp 145 150 155 160 CTT TCA CAG AAT GTT CAG TGT ATC GTT AGC AAT CCA TTG TTC AGA ACA 528 Leu Ser Gln Asn Val Gln Cys Ile Val Ser Asn Pro Leu Phe Arg Thr 165 170 175 TCA GCT TCC GTC TCT TTG TCA ACC TGT TTG CCA GAG GAT TAT GCA AGG 576 Ser Ala Ser Val Ser Leu Ser Thr Cys Leu Pro Glu Asp Tyr Ala Arg 180 185 190 CAT AGG TAT GTG CTT TTT GCC ATA CTG CCA GCA GTA ATA TGT GGC TTG 624 His Arg Tyr Val Leu Phe Ala Ile Leu Pro Ala Val Ile Cys Gly Leu 195 200 205 CTG TTT TTA AAA TGT TTT CTG GGA CGT CGT AGC CAA CGA AAC TCA GGG 672 Leu Phe Leu Lys Cys Phe Leu Gly Arg Arg Ser Gln Arg Asn Ser Gly 210 215 220 CCC 675 Pro 225 [Sequence Listing] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 675 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Sequence type: cDNA to mRNA Hypothetical sequence: No Origin organism name: Ovis Type: White blood cell array GTT TCC CAA GAT ATT TAT GGA GCT ATG AAT GGG AAT GTA ACC TTT TAC 48 Val Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe Tyr 1 5 10 15 GTT TCA GAG TCT CAA CCG TTT ACA GAG ATT ATG TGG AAG AAG GGG AAG 96 Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Trp Lys Lys Gly Lys 20 25 30 GAT AAA GTT GTA GAA TGG GAT CAA ACA TCT GGA CTC GAA GCT TTT CAG 144 Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gln Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe Gln 35 40 45 TCT TTT AAA AAT AGA GTT CAT TTA GAC ATT GTG TCA GGT AAC CTC ACC 192 Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp Ile Val Ser Gly Asn Leu Thr 50 55 60 ATC ACC GGG TTA ACA AAA TTA GAT GAA GAT GTG TAT GAA ATT GAA TCC 240 Ile Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu Ile Glu Ser 65 70 75 80 CCA AGT GTT AAA AAG AGC TCC CAG TTC CA C CTC AGA GTG ATT GAA CCT 288 Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gln Phe His Leu Arg Val Ile Glu Pro 85 90 95 CCT CCA ACA CCG TCA GCA TCT TGC TTC TTG ACT GAG GGT GGA AAC ATT 336 Pro Pro Thr Pro Ser Ala Ser Cys Phe Leu Thr Glu Gly Gly Asn Ile 100 105 110 ACT CTC ACC TGC TCG ATC CCG GAA GGT GAC CCC AAA GAG CTC GAT GAT 384 Thr Leu Thr Cys Ser Ile Pro Glu Gly Asp Pro Lys Glu Leu Asp Asp 115 120 125 AGT GAC CTA ATA CGG TAT TTG TGG GAA TGT CCG CCA ACA ATA CAG TGT 432 Ser Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Trp Glu Cys Pro Pro Thr Ile Gln Cys 130 135 140 CAC CGT GGC TCG ATT TCA TCT GAA GCC TTT GTC TCA GCG GAA AGT GAT 480 His Arg Gly Ser Ile Ser Ser Glu Ala Phe Val Ser Ala Glu Ser Asp 145 150 155 160 CTT TCA CAG AAT GTT CAG TGT ATC GTT AGC AAT CCA TTG TTC AGA ACA 528 Leu Ser Gln Asn Val Gln Cys Ile Val Ser Asn Pro Leu Phe Arg Thr 165 170 175 TCA GCT TCC GTC TCT TTG TCA ACC TGT TTG CCA GAG GAT TAT GCA AGG 576 Ser Ala Ser Val Ser Leu Ser Thr Cys Leu Pro Glu Asp Tyr Ala Arg 180 185 190 CAT AGG TAT GTG CTT TTT GCC A TA CTG CCA GCA GTA ATA TGT GGC TTG 624 His Arg Tyr Val Leu Phe Ala Ile Leu Pro Ala Val Ile Cys Gly Leu 195 200 205 CTG TTT TTA AAA TGT TTT CTG GGA CGT CGT AGC CAA CGA AAC TCA GGG 672 Leu Phe Leu Lys Cys Phe Leu Gly Arg Arg Ser Gln Arg Asn Ser Gly 210 215 220 CCC 675 Pro 225

【００４７】配列番号：２ 配列の長さ：225 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル配列：Yes 配 列 Val Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe Tyr 1 5 10 15 Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Trp Lys Lys Gly Lys 20 25 30 Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gln Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe Gln 35 40 45 Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp Ile Val Ser Gly Asn Leu Thr 50 55 60 Ile Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu Ile Glu Ser 65 70 75 80 Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gln Phe His Leu Arg Val Ile Glu Pro 85 90 95 Pro Pro Thr Pro Ser Ala Ser Cys Phe Leu Thr Glu Gly Gly Asn Ile 100 105 110 Thr Leu Thr Cys Ser Ile Pro Glu Gly Asp Pro Lys Glu Leu Asp Asp 115 120 125 Ser Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Trp Glu Cys Pro Pro Thr Ile Gln Cys 130 135 140 His Arg Gly Ser Ile Ser Ser Glu Ala Phe Val Ser Ala Glu Ser Asp 145 150 155 160 Leu Ser Gln Asn Val Gln Cys Ile Val Ser Asn Pro Leu Phe Arg Thr 165 170 175 Ser Ala Ser Val Ser Leu Ser Thr Cys Leu Pro Glu Asp Tyr Ala Arg 180 185 190 His Arg Tyr Val Leu Phe Ala Ile Leu Pro Ala Val Ile Cys Gly Leu 195 200 205 Leu Phe Leu Lys Cys Phe Leu Gly Arg Arg Ser Gln Arg Asn Ser Gly 210 215 220 Pro 225 SEQ ID NO: 2 Sequence length: 225 Sequence type: Amino acid Sequence type: Peptide Hypothetical sequence: Yes Sequence Val Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe Tyr 1 5 10 15 Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Trp Lys Lys Gly Lys 20 25 30 Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gln Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe Gln 35 40 45 Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp Ile Val Ser Gly Asn Leu Thr 50 55 60 Ile Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu Ile Glu Ser 65 70 75 80 Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gln Phe His Leu Arg Val Ile Glu Pro 85 90 95 Pro Pro Thr Pro Ser Ala Ser Cys Phe Leu Thr Glu Gly Gly Asn Ile 100 105 110 Thr Leu Thr Cys Ser Ile Pro Glu Gly Asp Pro Lys Glu Leu Asp Asp 115 120 125 Ser Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Trp Glu Cys Pro Pro Thr Ile Gln Cys 130 135 140 His Arg Gly Ser Ile Ser Ser Glu Ala Phe Val Ser Ala Glu Ser Asp 145 150 155 160 Leu Ser Gln Asn Val Gln Cys Ile Val Ser Asn Pro Leu Phe Arg Thr 165 170 175 Ser Ala Se r Val Ser Leu Ser Thr Cys Leu Pro Glu Asp Tyr Ala Arg 180 185 190 His Arg Tyr Val Leu Phe Ala Ile Leu Pro Ala Val Ile Cys Gly Leu 195 200 205 Leu Phe Leu Lys Cys Phe Leu Gly Arg Arg Ser Gln Arg Asn Ser Gly 210 215 220 Pro 225

【００４８】配列番号：３ 配列の長さ：29 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル配列：Yes フラグメント型：Ｎ末端ペプチド 配列の特徴 配列中、12番目および28番目のXaa は天然に存在するア
ミノ酸を表わし、ここで12番目のXaa は好ましくはセリ
ンである。１番目のアミノ酸はバリンまたはフェニルア
ラニン、３番目のアミノ酸はグルタミンまたはセリンで
ある。 配 列 Val/Phe Ser Gln/Ser Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Xaa Val Thr Phe Tyr 1 5 10 15 Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Xaa Lys 20 25SEQ ID NO: 3 Sequence length: 29 Sequence type: Amino acid Topology: Unknown Sequence type: Peptide Hypothetical sequence: Yes Fragment type: N-terminal peptide Sequence characteristics 12th and 28th sequences Xaa represents a naturally occurring amino acid, wherein the 12th Xaa is preferably serine. The first amino acid is valine or phenylalanine and the third amino acid is glutamine or serine. Arrangement Val / Phe Ser Gln / Ser Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Xaa Val Thr Phe Tyr 1 5 10 15 Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Xaa Lys 20 25

【００４９】配列番号：４ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA ハイポセティカル配列：No 配 列 GTTGGATCCT TYWSNCARGA YATHTAYGG 29 SEQ ID NO: 4 Sequence length: 29 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Hypothetical sequence: No Sequence GTTGGATCCT TYWSNCARGA YATHTAYGG 29

【００５０】配列番号：５ 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Yes 配 列 ACACTGCAGC ATDATYTCNG TRAANGG 27 SEQ ID NO: 5 Sequence length: 27 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Hypothetical sequence: No Antisense: Yes Row ACACTGCAGC ATDATYTCNG TRAANGG 27

【００５１】配列番号：６ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA ハイポセティカル配列：No 配 列 AGCTATGAAC GGGAATGTAA CCTT 24 SEQ ID NO: 6 Sequence length: 24 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Hypothetical sequence: No Sequence AGCTATGAAC GGGAATGTAA CCTT twenty four

【００５２】配列番号：７ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA ハイポセティカル配列：No 配 列 ACCTTTTACG TTTCAGAGTC TCAA 24 SEQ ID NO: 7 Sequence Length: 24 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Other Nucleic Acid Synthetic DNA Hypothetical Sequence: No Sequence ACCTTTTACG TTTCAGAGTC TCAA twenty four

【００５３】配列番号：８ 配列の長さ：222 配列の型：アミノ酸 ハイポセティカル配列：No 起源 生物名：ホモ サピエンス(Homo sapiens) 細胞の種類：PBL （末梢血リンパ球(Peripheral Blood
Lymphocytes)） 配 列 Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His 5 10 15 Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys 20 25 30 Asp Lys Val Ala Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser 35 40 45 Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile 50 55 60 Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro 65 70 75 80 Asn Ile Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly Ser Ile Glu Val 100 105 110 Gln Cys Met Ile Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg Gly Leu Ile Met 115 120 125 Tyr Ser Trp Asp Cys Pro Met Glu Gln Cys Lys Arg Asn Ser Thr Ser 130 135 140 Ile Tyr Phe Lys Met Glu Asn Asp Leu Pro Gln Lys Ile Gln Cys Thr 145 150 155 160 Leu Ser Asn Pro Leu Phe Asn Thr Thr Ser Ser Ile Ile Leu Thr Thr 165 170 175 Cys Ile Pro Ser Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala Leu Ile Pro 180 185 190 Ile Pro Leu Ala Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr Met Asn Gly 195 200 205 Ile Leu Lys Cys Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn 210 215 220 SEQ ID NO: 8 Sequence length: 222 Sequence type: Amino acid Hypothetical sequence: No Origin organism name: Homo sapiens Cell type: PBL (Peripheral Blood lymphocytes
Lymphocytes)) Sequence Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His 5 10 15 Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys 20 25 30 Asp Lys Val Ala Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser 35 40 45 Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile 50 55 60 Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro 65 70 75 80 Asn Ile Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly Ser Ile Glu Val 100 105 110 Gln Cys Met Ile Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg Gly Leu Ile Met 115 120 125 Tyr Ser Trp Asp Cys Pro Met Glu Gln Cys Lys Arg Asn Ser Thr Ser 130 135 140 Ile Tyr Phe Lys Met Glu Asn Asp Leu Pro Gln Lys Ile Gln Cys Thr 145 150 155 160 Leu Ser Asn Pro Leu Phe Asn Thr Thr Ser Ser Ile Ile Leu Thr Thr 165 170 175 Cys Ile Pro Ser Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala Leu Ile Pro 180 185 190 Ile Pro Leu Ala Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr Met Asn Gly 195 200 205 Ile Leu Lys Cys Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn 210 215 220

【００５４】配列番号：９ 配列の長さ：33 配列の形：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA ハイポセティカル配列：No 配列 TTGGGGATCC ATGGTTTCCC AAGATATTTA TGG 33 SEQ ID NO: 9 Sequence length: 33 Sequence form: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Hypothetical sequence: No Sequence TTGGGGATCC ATGGTTTCCC AAGATATTTA TGG 33

【００５５】配列番号：１０ 配列の長さ：33 配列の形：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA ハイポセティカル配列：No 配列 TTGGGGATCC ATGGTAAGTC AAGATATTTA TGG 33 SEQ ID NO: 10 Sequence length: 33 Sequence form: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Hypothetical sequence: No Sequence TTGGGGATCC ATGGTAAGTC AAGATATTTA TGG 33

【００５６】配列番号：１１ 配列の長さ：36 配列の形：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA ハイポセティカル配列：No 配列 GTCGACCTGC AGCTACGACG TCCCAGAAAA CCTATG 36 SEQ ID NO: 11 Sequence length: 36 Sequence form: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Hypothetical sequence: No sequence GTCGACCTGC AGCTACGACG TCCCAGAAAA CCTATG 36

【００５７】配列番号：１２ 配列の長さ：597 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：No 起 源 生物名：オーヴィス(Ovis) 細胞の種類：白血球細胞 配 列 GTT TCC CAA GAT ATT TAT GGA GCT ATG AAT GGG AAT GTA ACC TTT TAC 48 Val Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe Tyr 1 5 10 15 GTT TCA GAG TCT CAA CCG TTT ACA GAG ATT ATG TGG AAG AAG GGG AAG 96 Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Trp Lys Lys Gly Lys 20 25 30 GAT AAA GTT GTA GAA TGG GAT CAA ACA TCT GGA CTC GAA GCT TTT CAG 144 Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gln Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe Gln 35 40 45 TCT TTT AAA AAT AGA GTT CAT TTA GAC ATT GTG TCA GGT AAC CTC ACC 192 Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp Ile Val Ser Gly Asn Leu Thr 50 55 60 ATC ACC GGG TTA ACA AAA TTA GAT GAA GAT GTG TAT GAA ATT GAA TCC 240 Ile Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu Ile Glu Ser 65 70 75 80 CCA AGT GTT AAA AAG AGC TCC CAG TTC CAC CTC AGA GTG ATT GAA CCT 288 Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gln Phe His Leu Arg Val Ile Glu Pro 85 90 95 CCT CCA ACA CCG TCA GCA TCT TGC TTC TTG ACT GAG GGT GGA AAC ATT 336 Pro Pro Thr Pro Ser Ala Ser Cys Phe Leu Thr Glu Gly Gly Asn Ile 100 105 110 ACT CTC ACC TGC TCG ATC CCG GAA GGT GAC CCC AAA GAG CTC GAT GAT 384 Thr Leu Thr Cys Ser Ile Pro Glu Gly Asp Pro Lys Glu Leu Asp Asp 115 120 125 AGT GAC CTA ATA CGG TAT TTG TGG GAA TGT CCG CCA ACA ATA CAG TGT 432 Ser Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Trp Glu Cys Pro Pro Thr Ile Gly Cys 130 135 140 CAC CGT GGC TCG ATT TCA TCT GAA GCC TTT GTC TCA GCG GAA AGT GAT 480 His Arg Gly Ser Ile Ser Ser Glu Ala Phe Val Ser Ala Glu Ser Asp 145 150 155 160 CTT TCA CAG AAT GTT CAG TGT ATC GTT AGC AAT CCA TTG TTC AGA ACA 528 Leu Ser Gln Asn Val Gln Cys Ile Val Ser Asn Pro Leu Phe Arg Thr 165 170 175 TCA GCT TCC GTC TCT TTG TCA ACC TGT TTG CCA GAG GAT TAT GCA AGG 576 Ser Ala Ser Val Ser Leu Ser Thr Cys Leu Pro Glu Asp Tyr Ala Arg 180 185 190 CAT AGG TTT TCT GGG ACG TCG 597 His Arg Phe Ser Gly Thr Ser 195 SEQ ID NO: 12 Sequence length: 597 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Sequence type: cDNA to mRNA Hypothetical sequence: No Origin organism name: Ovis Cell type : White blood cell array GTT TCC CAA GAT ATT TAT GGA GCT ATG AAT GGG AAT GTA ACC TTT TAC 48 Val Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe Tyr 1 5 10 15 GTT TCA GAG TCT CAA CCG TTT ACA GAG ATT ATG TGG AAG AAG GGG AAG 96 Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Trp Lys Lys Gly Lys 20 25 30 GAT AAA GTT GTA GAA TGG GAT CAA ACA TCT GGA CTC GAA GCT TTT CAG 144 Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gln Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe Gln 35 40 45 TCT TTT AAA AAT AGA GTT CAT TTA GAC ATT GTG TCA GGT AAC CTC ACC 192 Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp Ile Val Ser Gly Asn Leu Thr 50 55 60 ATC ACC GGG TTA ACA AAA TTA GAT GAA GAT GTG TAT GAA ATT GAA TCC 240 Ile Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu Ile Glu Ser 65 70 75 80 CCA AGT GTT AAA AAG AGC TCC CAG TTC CAC CTC AGA GTG ATT GAA CCT 288 Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gln Phe His Leu Arg Val Ile Glu Pro 85 90 95 CCT CCA ACA CCG TCA GCA TCT TGC TTC TTG ACT GAG GGT GGA AAC ATT 336 Pro Pro Thr Pro Ser Ala Ser Cys Phe Leu Thr Glu Gly Gly Asn Ile 100 105 110 ACT CTC ACC TGC TCG ATC CCG GAA GGT GAC CCC AAA GAG CTC GAT GAT 384 Thr Leu Thr Cys Ser Ile Pro Glu Gly Asp Pro Lys Glu Leu Asp Asp 115 120 125 AGT GAC CTA ATA CGG TAT TTG TGG GAA TGT CCG CCA ACA ATA CAG TGT 432 Ser Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Trp Glu Cys Pro Pro Thr Ile Gly Cys 130 135 140 CAC CGT GGC TCG ATT TCA TCT GAA GCC TTT GTC TCA GCG GAA AGT GAT 480 His Arg Gly Ser Ile Ser Ser Glu Ala Phe Val Ser Ala Glu Ser Asp 145 150 155 160 CTT TCA CAG AAT GTT CAG TGT ATC GTT AGC AAT CCA TTG TTC AGA ACA 528 Leu Ser Gln Asn Val Gln Cys Ile Val Ser Asn Pro Leu Phe Arg Thr 165 170 175 TCA GCT TCC GTC TCT TTG TCA ACC TGT TTG CCA GAG GAT TAT GCA AGG 576 Ser Ala Ser Val Ser Leu Ser Thr Cys Leu Pro Glu Asp Tyr Ala Arg 180 185 190 CAT AGG TTT TCT GGG ACG T CG 597 His Arg Phe Ser Gly Thr Ser 195

【００５８】配列番号：１３ 配列の長さ：199 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル配列：Yes 配 列 Val Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe Tyr 1 5 10 15 Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Trp Lys Lys Gly Lys 20 25 30 Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gln Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe Gln 35 40 45 Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp Ile Val Ser Gly Asn Leu Thr 50 55 60 Ile Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu Ile Glu Ser 65 70 75 80 Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gln Phe His Leu Arg Val Ile Glu Pro 85 90 95 Pro Pro Thr Pro Ser Ala Ser Cys Phe Leu Thr Glu Gly Gly Asn Ile 100 105 110 Thr Leu Thr Cys Ser Ile Pro Glu Gly Asp Pro Lys Glu Leu Asp Asp 115 120 125 Ser Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Trp Glu Cys Pro Pro Thr Ile Gln Cys 130 135 140 His Arg Gly Ser Ile Ser Ser Glu Ala Phe Val Ser Ala Glu Ser Asp 145 150 155 160 Leu Ser Gln Asn Val Gln Cys Ile Val Ser Asn Pro Leu Phe Arg Thr 165 170 175 Ser Ala Ser Val Ser Leu Ser Thr Cys Leu Pro Glu Asp Tyr Ala Arg 180 185 190 His Arg Phe Ser Gly Thr Ser 195 SEQ ID NO: 13 Sequence length: 199 Sequence type: Amino acid Sequence type: Protein Hypothetical sequence: Yes Sequence Val Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe Tyr 1 5 10 15 Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Trp Lys Lys Gly Lys 20 25 30 Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gln Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe Gln 35 40 45 Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp Ile Val Ser Gly Asn Leu Thr 50 55 60 Ile Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu Ile Glu Ser 65 70 75 80 Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gln Phe His Leu Arg Val Ile Glu Pro 85 90 95 Pro Pro Thr Pro Ser Ala Ser Cys Phe Leu Thr Glu Gly Gly Asn Ile 100 105 110 Thr Leu Thr Cys Ser Ile Pro Glu Gly Asp Pro Lys Glu Leu Asp Asp 115 120 125 Ser Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Trp Glu Cys Pro Pro Thr Ile Gln Cys 130 135 140 His Arg Gly Ser Ile Ser Ser Glu Ala Phe Val Ser Ala Glu Ser Asp 145 150 155 160 Leu Ser Gln Asn Val Gln Cys Ile Val Ser Asn Pro Leu Phe Arg Thr 165 170 175 Ser Ala Ser Val Ser Leu Ser Thr Cys Leu Pro Glu Asp Tyr Ala Arg 180 185 190 His Arg Phe Ser Gly Thr Ser 195

【００５９】配列番号：１４ 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA ハイポセティカル配列：No 配列 TGGGGATCCA TGGTAAGTCA AGATATTTAT GG 32 SEQ ID NO: 14 Sequence Length: 32 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Other Nucleic Acid Synthetic DNA Hypothetical Sequence: No Sequence TGGGGATCCA TGGTAAGTCA AGATATTTAT GG 32

【００６０】配列番号：１５ 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA ハイポセティカル配列：Ｎｏ 配列 ＣＣＣＣＴＧＣＡＧＣ ＴＡＧＧＧＣＣＣＴＧ ＡＧＴＴＴＣＧＴＴＧ ＧＣＴ
33SEQ ID NO: 15 Sequence length: 33 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Hypothetical sequence: No sequence CCCCTGCAGC TAGGGCCCTG AGTTTCGTTG GCT
33

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】ヒトＬＦＡ−３のアミノ酸配列を、ヒツジＴＭ
領域欠失型ＬＦＡ−３様タンパク質のアミノ酸配列に対
比させた図である。図中の番号は、ヒトＬＦＡ−３のＮ
末端からのアミノ酸番号である。−は片方の配列にはな
いアミノ酸を示す。配列間で相同なアミノ酸はコロンで
示した。下線を引いた部分の配列がＴＭ領域であり、ヒ
トＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−３様タンパク質は、この下線
を引いた部分の配列を持たない。FIG. 1 shows the amino acid sequence of human LFA-3
It is a figure contrasted with the amino acid sequence of a region deletion type LFA-3-like protein. The numbers in the figure are N of human LFA-3.
It is the amino acid number from the end. -Indicates an amino acid not present in one of the sequences. Amino acids that are homologous between the sequences are indicated by colons. The sequence of the underlined portion is the TM region, and the human TM region-deleted LFA-3-like protein does not have the sequence of the underlined portion.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 特願平3−315709 (32)優先日 平３(1991)11月29日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (72)発明者 福地 健 兵庫県明石市西明石北町３−３−26 エル コーポ２番館307 (72)発明者 枝村 忠廣 兵庫県明石市藤江1625−１ シャルムシー サイド明石117号 (72)発明者 角谷 徹 兵庫県加古川市別府町新野辺90−43─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁵ Identification code Internal reference number FI technical display part (C12P 21/02 C12R 1:19) (31) Priority claim number Japanese Patent Application No. 3-315709 (32 ) Priority Hihei 3 (1991) November 29 (33) Priority claiming country Japan (JP) (72) Inventor Ken Fukuchi 3-3-26 Nishi-Akashikita-cho, Akashi City, Hyogo Prefecture El Corp 2nd Building 307 (72) Invention Person Tadahiro Edamura 1625-1 Fujie, Akashi City, Hyogo Prefecture Sharm Seaside Akashi 117 (72) Inventor Toru Sumiya 90-43 Shinnobe, Beppu Town, Kakogawa City, Hyogo Prefecture

Claims (19)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ヒツジＬＦＡ−３タンパク質。1. A sheep LFA-3 protein. 【請求項２】 配列番号２で示されるアミノ酸配列から
なる請求項１記載のタンパク質。2. The protein according to claim 1, which consists of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2. 【請求項３】 ヒツジＬＦＡ−３タンパク質をコードす
る遺伝子。3. A gene encoding a sheep LFA-3 protein. 【請求項４】 配列番号２で示されるアミノ酸配列をコ
ードする請求項３記載の遺伝子。4. The gene according to claim 3, which encodes the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2. 【請求項５】 配列番号１で示される請求項３または４
記載の遺伝子。5. The method according to claim 3, which is represented by SEQ ID NO: 1.
The described gene. 【請求項６】 ヒツジＬＦＡ−３タンパク質の生産法。6. A method for producing sheep LFA-3 protein. 【請求項７】 ＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−３様タンパク
質。7. A TM region-deficient LFA-3-like protein. 【請求項８】 ヒツジに由来する請求項７記載のタンパ
ク質。8. The protein according to claim 7, which is derived from sheep. 【請求項９】 配列番号１３で示されるアミノ酸配列か
らなる請求項８記載のタンパク質。9. The protein according to claim 8, which consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13. 【請求項１０】 ヒトに由来する請求項７記載のタンパ
ク質。10. The protein according to claim 7, which is derived from human. 【請求項１１】 ＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−３様タンパク
質をコードする遺伝子。11. A gene encoding a TM region deleted LFA-3-like protein. 【請求項１２】 ヒツジに由来する請求項１１記載の遺
伝子。12. The gene according to claim 11, which is derived from sheep. 【請求項１３】 配列番号１３で示されるアミノ酸配列
をコードする請求項１１または１２記載の遺伝子。13. The gene according to claim 11 or 12, which encodes the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 13. 【請求項１４】 配列番号１２で示される請求項１１、
１２または１３記載の遺伝子。14. The method according to claim 11, which is represented by SEQ ID NO: 12.
The gene according to 12 or 13. 【請求項１５】 ＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−３様タンパク
質の生産法。15. A method for producing a TM region-deleted LFA-3-like protein. 【請求項１６】 ＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−３様タンパク
質をコードするＤＮＡ配列を含むベクターで形質転換さ
れた細胞を培養し、次いで生産されたＴＭ領域欠失型Ｌ
ＦＡ−３様タンパク質を分離することを特徴とする請求
項１５記載のＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−３様タンパク質の
生産法。16. A cell transformed with a vector containing a DNA sequence encoding a TM region-deficient LFA-3-like protein is cultured, and then the produced TM region-deficient L is produced.
The method for producing a TM region-deficient LFA-3-like protein according to claim 15, wherein the FA-3-like protein is separated. 【請求項１７】 形質転換された細胞が大腸菌である請
求項１６記載の生産法。17. The production method according to claim 16, wherein the transformed cell is Escherichia coli. 【請求項１８】 ＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−３様タンパク
質がヒツジに由来する請求項１５、１６または１７記載
の生産法。18. The production method according to claim 15, 16 or 17, wherein the TM region-deficient LFA-3-like protein is derived from sheep. 【請求項１９】 ＴＭ領域欠失型ＬＦＡ−３様タンパク
質がヒトに由来する請求項１５、１６または１７記載の
生産法。19. The method according to claim 15, 16 or 17, wherein the TM region deleted LFA-3-like protein is derived from human.