JPH05192200A - Detection of human papilloma virus - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To determine the DNA region of human papilloma virus (HPV) common to benign type and/or malignant type and to provide a method for detecting the sequence and a kit therefor. CONSTITUTION:A benign type and/or malignant type HPV can be detected by detecting the DNA sequence of the E6 and/or E7 region of HPV. The HPV detection kit contains a specific primer for amplifying the HPV region and a probe for detecting the amplified DNA. The kit enables easy typing of each HPV.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトパピローマウイル
ス（以下ＨＰＶと略記する）の検出方法に関し、更に詳
細には良性型及び／又は悪性型ＨＰＶの特異的な検出方
法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for detecting human papillomavirus (hereinafter abbreviated as HPV), and more specifically to a method for specifically detecting benign and / or malignant HPV.

【０００２】[0002]

【従来の技術】ＨＰＶは、パポバウイルス(papova viru
s)科に属する小型ＤＮＡウイルスで、ヒトの皮膚のい
ぼ、口腔、肛門、性器の尖圭コンジローマなどから分離
され、昔からいぼをつくるウイルスとして知られてき
た。ＨＰＶは、現在６０種以上もの異なったタイプが見
つかっている。このうちＨＰＶ６、ＨＰＶ１１は尖圭コ
ンジローマ等、主に性器に良性の腫瘍を引起こす良性型
ＨＰＶである。またがんに至る悪性腫瘍を引起こす代表
的ＨＰＶとして、以前よりＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８が知
られていたが、現在ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３等の悪性型
ＨＰＶの存在が知られている〔デ ビラース(de Villie
rs) 、ジャーナル オブ ビロロジー(Jounalof Virolo
gy)、第63巻、第４８９８〜４９０３頁（１９８
９）〕。ＨＰＶが子宮頸がんを引起こす要因の一つであ
る〔Ｍ．デュルスト(M.Duerst)ほか、プロシーディング
ス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエ
ンシーズ オブ ザ ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci.
ＵＳＡ) 、第８０巻、第３８１２〜３８１５頁（１９８
３）〕という報告がなされて以来、子宮頸部組織からＨ
ＰＶを検出する様々な試みが行われてきた。残念なが
ら、ＨＰＶはいまだウイルス粒子での存在が認められ
ず、試験管内増殖系を持たないため、その検出は抗体に
よる方法とウイルスＤＮＡを検出する方法が取られてい
る。ＨＰＶ ＤＮＡを検出する代表的方法として、従来
よりサザンハイブリダイゼーション法がとられている。
実際、Ｍ．デュルストらはこの方法で、子宮頸がん組織
より約６０％の試料にＨＰＶ１６型あるいは１８型ＤＮ
Ａを検出している。更に簡便で高感度な検出方法とし
て、ＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction）法がある〔メ
ソッズ イン エンザイモロジー( Methods in Enzymol
ogy)、第１５５巻、第３３５〜３５０頁（１９８
７）〕。ＰＣＲ法は、増幅したいＤＮＡ領域の両端に一
対のオリゴヌクレオチドプライマーを設定し、耐熱性タ
ックポリメラーゼを用いて、目的ＤＮＡを指数的に増幅
させる方法である。ＤＮＡの変性→プライマーＤＮＡの
アニーリング→ＤＮＡ相補鎖の酵素的合成といった温度
サイクルを２５回繰返せば、目的ＤＮＡは約１０万倍に
増幅される。2. Description of the Related Art HPV is a papova virus.
s) A small DNA virus belonging to the family, isolated from human skin warts, oral cavity, anus, genital warts, etc., and has long been known as a wart-producing virus. At present, more than 60 different types of HPV have been found. Of these, HPV6 and HPV11 are benign HPVs that cause benign tumors mainly in the genitals, such as Condyloma acuminata. Further, HPV16 and HPV18 have been known as typical HPVs that cause malignant tumors leading to cancer, but the existence of malignant HPVs such as HPV31 and HPV33 is now known [de Villie (de Villie
rs), Jounal of Virolo
gy), 63, 4898-4903 (198)
9)]. HPV is one of the factors that cause cervical cancer [M. M. Duerst and other Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA), 80, 3812-3815 (198).
3)] has been reported since the cervical tissue
Various attempts have been made to detect PV. Unfortunately, HPV has not yet been found to be present in viral particles and does not have an in vitro growth system, so its detection is performed by an antibody method or a method of detecting viral DNA. As a typical method for detecting HPV DNA, the Southern hybridization method has been conventionally used.
In fact, M. Durst et al. Used this method to measure HPV type 16 or 18 type DN in approximately 60% of cervical cancer tissue samples.
A is detected. A more convenient and highly sensitive detection method is the PCR (Polymerase Chain Reaction) method [Methods in Enzymol
ogy), 155, 335-350 (198)
7)]. The PCR method is a method in which a pair of oligonucleotide primers are set at both ends of a DNA region to be amplified and a target DNA is exponentially amplified using a thermostable tack polymerase. If the temperature cycle of denaturation of DNA → annealing of primer DNA → enzymatic synthesis of complementary DNA strand is repeated 25 times, the target DNA is amplified about 100,000 times.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】前述のＨＰＶ検出方法
のうち、ＨＰＶ抗体を用いる方法は操作が煩雑で、また
感度の点で問題がある。一方、ヒト性器や子宮頸部組織
よりＨＰＶ ＤＮＡを検出する際、従来のサザンハイブ
リダイゼーション法やＰＣＲ法では、一種類のＨＰＶに
限定してプローブやプライマー対を設定するため、特定
の型しか検出できない。このため、複数種のＨＰＶを検
出するにはその都度プローブやプライマー対を設定し別
々の反応系で行わねばならず、操作が煩雑になる。性器
腫瘍に数多くのＨＰＶが関与することが認められている
現状において、一回の反応系でできるだけ多種のＨＰＶ
を検出することが求められている。すなわち、本発明の
目的は、良性型及び／又は悪性型に共通なＨＰＶのＤＮ
Ａ領域を決定し、その配列の検出方法及びキットを提供
することにある。Among the above-mentioned HPV detection methods, the method using the HPV antibody is complicated in operation and has a problem in sensitivity. On the other hand, when detecting HPV DNA from human genitals or cervical tissues, the conventional Southern hybridization method or PCR method limits the probe or primer pair to one type of HPV, so that only a specific type is detected. Can not. Therefore, in order to detect a plurality of types of HPV, it is necessary to set a probe and a primer pair each time and perform them in separate reaction systems, which complicates the operation. In the present situation in which many HPVs are recognized to be involved in genital tumors, one reaction system allows as many types of HPVs as possible.
Is required to be detected. That is, the object of the present invention is to provide DN of HPV common to benign and / or malignant types.
An object is to provide a method and kit for determining the A region and detecting its sequence.

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はＨＰＶの検出方法に関し、良性型及
び／又は悪性型ＨＰＶの検出方法において、良性型及び
／又は悪性型ＨＰＶのＥ６及び／又はＥ７領域のＤＮＡ
配列を検出することを特徴とする。また、本発明の第２
の発明は第１の発明の方法を用いて検出を行うための検
出キットに関し、ヒトパピローマウイルスのＥ６及び／
又はＥ７領域を増幅させるための特定のプライマー及び
増幅されたＤＮＡを検出するためのプローブを含有して
いることを特徴とする。The first aspect of the present invention relates to a method for detecting HPV. In the method for detecting benign and / or malignant HPV, a benign and / or malignant type is detected. DNA of E6 and / or E7 region of HPV
It is characterized by detecting a sequence. The second aspect of the present invention
The present invention relates to a detection kit for performing detection using the method of the first invention, which comprises human papillomavirus E6 and / or
Alternatively, it is characterized by containing a specific primer for amplifying the E7 region and a probe for detecting the amplified DNA.

【０００５】子宮頸がん組織中のＨＰＶ ＤＮＡは、エ
ピソーム状態のほかヒトゲノム中に挿入された形で存在
することが明らかとなっており、しかも組込まれたＨＰ
ＶＤＮＡは、通常多くの欠損がみられ、完全に保存され
ているのは初期遺伝子Ｅ６及びＥ７の領域のみである例
が多く見出されている〔Ｅ．シュワルツ(E.Schwarz)ほ
か、ネーチャー(Nature)、第３１４巻、第１１１〜１１
４頁（１９８５）〕。本発明において、良性型及び／又
は悪性型のＨＰＶのＤＮＡの検出に用いる領域は、Ｅ６
及び／又はＥ７領域より、そのホモロジーの高い配列を
含む領域（高ホモロジー領域）を選択する。良性型のＨ
ＰＶとしては、例えばＨＰＶ６、ＨＰＶ１１等が、悪性
型のＨＰＶとしては、例えばＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、
ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰ５２ｂ及びＨＰＶ５８等
があり、その一部については以下の様にＤＮＡ塩基配列
が知られている〔ＨＰＶ６；Ｅ．シュワルツほか、ジエ
ンボ ジャーナル(the EMBO J.）第２巻、第２３４１頁
（１９８３）、ＨＰＶ11；Ｋ. ダートマン(K.Dartmann)
ほか、ビロロジー(Virology)、第１５１巻、第１２４頁
（１９８６）、ＨＰＶ１６；Ｋ．シードルフ(K.Seedor
f) ほか、ビロロジー、第１４５巻、第１８１頁 (１９
８５) 、ＨＰＶ３１；Ｓ．Ｔ．コール(S.T.Cole）ほ
か、ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー(
J.Mol. Biol.)、第１９３巻、第５９９頁（１９８
７）、ＨＰＶ３１；Ｍ. Ｄ．ゴールズボロー( M.D.Gold
sborough) ほか、ビロロジー、第１７１巻、第３０６頁
（１９８９）、ＨＰＶ３３；Ｓ．Ｔ．コールほか、ジャ
ーナル オブ ビロロジー、第５８巻、第９９１頁（１
９８６）〕。It has been clarified that HPV DNA in cervical cancer tissue exists not only in the episomal state but also in the inserted form in the human genome, and the integrated HP
Many defects are usually found in VDNA, and it is often found that only the regions of early genes E6 and E7 are completely conserved [E. E. Schwarz et al., Nature, Volume 314, 111-11
P. 4 (1985)]. In the present invention, the region used for detection of benign and / or malignant HPV DNA is E6.
And / or E7 region, a region containing a sequence with high homology (high homology region) is selected. Benign type H
Examples of PV include HPV6 and HPV11, and examples of malignant HPV include HPV16 and HPV18.
There are HPV31, HPV33, HP52b, HPV58 and the like, and some of them have DNA base sequences known as follows [HPV6; Schwartz et al., The EMBO J. Vol. 2, pp. 2341 (1983), HPV 11; K. Dartmann.
Virology, Vol. 151, p. 124 (1986), HPV16; K. Seedor
f) et al., Birology, Vol. 145, p. 181 (19
85), HPV31; T. Journal of Molecular Biology (STCole) and others
J. Mol. Biol.), 193, 599 (198).
7), HPV31; MD. Goldsborough (MD Gold
sborough) et al., Birology, Vol. 171, p. 306 (1989), HPV33; T. Cole et al., Journal of Birology, Volume 58, page 991 (1
986)].

【０００６】ＨＰＶ６とＨＰＶ１１等のＥ６・Ｅ７領域
中の高ホモロジー領域、あるいはＨＰＶ１６とＨＰＶ１
８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３等のＥ６・Ｅ７領域中の高
ホモロジー領域は、例えばＤＮＡシーケンス入力解析シ
ステムＤＮＡＳＩＳ（宝酒造社）を用いて検索すること
ができる。High homology region in E6 / E7 region such as HPV6 and HPV11 or HPV16 and HPV1
The high homology region in the E6 / E7 region of 8, HPV31, HPV33, etc. can be searched using, for example, the DNA sequence input analysis system DNASIS (Takara Shuzo).

【０００７】それぞれのＨＰＶの種類について、これら
の高ホモロジー領域として利用できる塩基配列の例を配
列表の配列番号１〜２３に示す。すなわち、配列表の配
列番号１〜４はＨＰＶ６、配列番号５〜８はＨＰＶ１
１、配列番号９〜１２はＨＰＶ１６、配列番号１３〜１
５はＨＰＶ１８、配列番号１６〜１９はＨＰＶ３１、配
列番号２０〜２３はＨＰＶ３３についてそれぞれ高ホモ
ロジー領域として利用できる塩基配列の例を示すもので
ある。また、これらの塩基配列を、ホモロジーの高い部
分ごとにまとめた例を表１及び表２に示す。なお配列表
の各配列及び表１及び表２において示した塩基番号は前
述の引用文献に記載されたものと一致する。[0007] For each type of HPV, examples of base sequences that can be used as these high homology regions are shown in SEQ ID NOS: 1 to 23 of the sequence listing. That is, SEQ ID NOS: 1 to 4 of the sequence listing are HPV6, and SEQ ID NOS: 5 to 8 are HPV1.
1, SEQ ID NOS: 9-12 are HPV16, SEQ ID NOS: 13-1
5 is HPV18, SEQ ID NOs: 16 to 19 are HPV31, and SEQ ID NOs: 20 to 23 are examples of base sequences that can be used as high homology regions for HPV33, respectively. In addition, Tables 1 and 2 show examples in which these base sequences are grouped for each portion having high homology. The sequences in the sequence listing and the base numbers shown in Table 1 and Table 2 are the same as those described in the above cited document.

【０００８】[0008]

【表１】 [Table 1]

【０００９】[0009]

【表２】 [Table 2]

【００１０】これらのＤＮＡ領域を検出する方法として
は、例えば、ＰＣＲ法を簡便で高感度な方法として用い
ることができる。すなわち、良性型及び／又は悪性型Ｈ
ＰＶの高ホモロジー領域について共通プライマーを選定
し、これを用いてＤＮＡ配列を増幅し、検出すれば良
い。各共通プライマーは、例えばＤＮＡ合成機で合成
し、ＨＰＬＣで精製して、用いることができる。この様
なプライマーの例を配列表の配列番号２４〜２８に示
す。As a method for detecting these DNA regions, for example, the PCR method can be used as a simple and highly sensitive method. That is, benign and / or malignant H
A common primer may be selected for the high homology region of PV, and the DNA sequence may be amplified and detected using this. Each common primer can be used by, for example, synthesizing with a DNA synthesizer and purifying with HPLC. Examples of such primers are shown in SEQ ID NOs: 24-28 of the sequence listing.

【００１１】すなわち、上記プライマーのうち、配列表
の配列番号２４，２５でそれぞれ表されるｐＵ−Ｏ、ｐ
１６−１は表１及び表２に示した高ホモロジー領域のＩ
の塩基配列に、配列表の配列番号２６で表されるｐＵ−
３１Ｂは領域Ｖの塩基配列に、配列表の配列番号２７で
表されるｐＵ−１Ｍは領域III の塩基配列に、配列表の
配列番号２８で表されるｐＵ−２Ｒは領域IIの塩基配列
の相補的配列にそれぞれ相同性が高い配列を有してお
り、これらのプライマーは共通プライマーとして有効で
ある。配列表の配列番号２４〜２８に示した５種のプラ
イマーのうち、例えばｐＵ−Ｏ又はｐ１６−１とｐＵ−
２Ｒの対を用いればＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１
６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３のＤＮＡ配列
を、ｐＵ−３１ＢとｐＵ−２Ｒの対を用いれば良性型Ｈ
ＰＶであるＨＰＶ６、ＨＰＶ１１のＤＮＡ配列を、ｐＵ
−１ＭとｐＵ−２Ｒの対を用いれば悪性型ＨＰＶである
ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３のＤ
ＮＡ配列を特異的に増幅させることができる。That is, among the above primers, pU-O and pU represented by SEQ ID NOS: 24 and 25 of the sequence listing, respectively.
16-1 is I of the high homology region shown in Table 1 and Table 2.
PU-, which is represented by SEQ ID NO: 26 in the sequence listing,
31B is the nucleotide sequence of region V, pU-1M represented by SEQ ID NO: 27 in the sequence listing is the nucleotide sequence of region III, and pU-2R represented by SEQ ID NO: 28 of the sequence listing is the nucleotide sequence of region II. The complementary sequences have highly homologous sequences, and these primers are effective as common primers. Among the 5 types of primers shown in SEQ ID NOS: 24 to 28 of the sequence listing, for example, pU-O or p16-1 and pU-
HPR6, HPV11, HPV1 with 2R pair
6, HPV18, HPV31, HPV33 DNA sequences, benign type H by using the pair of pU-31B and pU-2R
The DNA sequences of HPV6 and HPV11 which are PV are
-1M and pU-2R pair D of malignant HPV HPV16, HPV18, HPV31, HPV33
The NA sequence can be specifically amplified.

【００１２】検出する試料としては、例えばＨＰＶをク
ローニングしたプラスミド、尖圭コンジローマ、子宮頸
がん及び前がん病変等の病理試料等を用いることができ
る。また、細胞、組織からのＤＮＡの調製は、公知の確
立された方法を用いればよい。As the sample to be detected, for example, a plasmid obtained by cloning HPV, a condyloma acuminata, a pathological sample such as cervical cancer and precancerous lesion can be used. For the preparation of DNA from cells and tissues, known and established methods may be used.

【００１３】ＰＣＲ法については、タックポリメラーゼ
を含む遺伝子増幅キット及び自動遺伝子増幅装置が、宝
酒造社から市販されており、上記のプライマー対を用
い、特定のＤＮＡ領域の増幅反応を行えば良い。増幅後
のＨＰＶ ＤＮＡは、例えばアガロースゲル電気泳動と
エチジウムブロマイド染色にて検出することができる。
アガロースゲル電気泳動、エチジウムブロマイド染色で
増幅領域を確認できないときは、例えばドットハイブリ
ダイゼーション法を用いて検出することができる。Regarding the PCR method, a gene amplification kit containing tack polymerase and an automatic gene amplification device are commercially available from Takara Shuzo, and it is sufficient to carry out an amplification reaction of a specific DNA region using the above-mentioned primer pair. The HPV DNA after amplification can be detected by, for example, agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining.
When the amplified region cannot be confirmed by agarose gel electrophoresis or ethidium bromide staining, it can be detected using, for example, the dot hybridization method.

【００１４】プライマー対で増幅したサンプルをドット
ハイブリダイゼーションするとき、例えば増幅領域内で
プライマー部位とは別の高いホモロジーを有する部位を
元にデザインした各型共通のオリゴヌクレオチドプロー
ブ（ユニバーサルプローブ）等を用いると便利である。
このプローブはハイブリダイゼーションにおける特異性
を高めるため、ミスマッチの起こりうる箇所に塩基を重
複させたミックスプローブ、あるいはその様な箇所をイ
ノシンに置き換えたプローブにすればよい。その様な配
列の例を配列表の配列番号２９〜３１に示す。When a sample amplified with a primer pair is subjected to dot hybridization, for example, an oligonucleotide probe (universal probe) common to each type designed based on a site having a high homology different from the primer site in the amplification region is used. It is convenient to use.
In order to enhance specificity in hybridization, this probe may be a mixed probe in which bases overlap in a position where a mismatch may occur, or a probe in which such a position is replaced with inosine. Examples of such sequences are shown in SEQ ID NOs: 29 to 31 of the sequence listing.

【００１５】上記のプローブのうち、配列表の配列番号
２９で表されるｐＢＵ−１は、表２に示した高ホモロジ
ー領域のIVの塩基配列部分、配列表の配列番号３１で表
されるｐＢＵ−３はIVの塩基配列部分を認識する共通プ
ローブである。また、配列表の配列番号３０で表される
ｐＢＵ−２はＨＰＶ１８の特異的塩基配列であり、前出
の文献記載の塩基番号の６３５〜６６３の部分に相当す
る。例えば、悪性型の４種のＨＰＶを同時に検出したい
場合には、ｐＢＵ−１とｐＢＵ−２を混合して使用すれ
ばよい。Among the above probes, pBU-1 represented by SEQ ID NO: 29 in the sequence listing is the nucleotide sequence portion of IV in the high homology region shown in Table 2, pBU represented by SEQ ID NO: 31 in the sequence listing. -3 is a common probe that recognizes the base sequence portion of IV. Further, pBU-2 represented by SEQ ID NO: 30 in the sequence listing is a specific base sequence of HPV18 and corresponds to the portion of base numbers 635 to 663 described in the above literature. For example, when it is desired to simultaneously detect four types of malignant HPV, pBU-1 and pBU-2 may be mixed and used.

【００１６】増幅された各ＨＰＶ由来のＤＮＡについ
て、型の同定を行うには、例えば各型に特異的なオリゴ
ヌクレオチドプローブを用いればよい。悪性ＨＰＶの各
型に特異的なオリゴヌクレオチドプローブの例を配列表
の配列番号３２〜３５に示す。配列表の配列番号３２で
表されるｐＳＢ−１６はＨＰＶ１６に、配列表の配列番
号３３で表されるｐＳＢ−１８はＨＰＶ１８に、配列表
の配列番３４で表されるｐＳＢ−３１はＨＰＶ３１に、
配列表の配列番号３５で表されるｐＳＢ−３３はＨＰＶ
３３に、それぞれ特異的なプローブである。To identify the type of each amplified HPV-derived DNA, for example, an oligonucleotide probe specific to each type may be used. Examples of oligonucleotide probes specific to each type of malignant HPV are shown in SEQ ID NOs: 32 to 35 of the sequence listing. PSB-16 represented by SEQ ID NO: 32 of the sequence listing is HPV16, pSB-18 represented by SEQ ID NO: 33 of the sequence listing is HPV18, and pSB-31 represented by SEQ ID NO: 34 of the sequence listing is HPV31. ,
PSB-33 represented by SEQ ID NO: 35 in the sequence listing is HPV
33 are specific probes.

【００１７】また、配列表の配列番号２４〜２８に示し
たプライマー対を用いて、各ＨＰＶＤＮＡをＰＣＲ法で
増幅させたフラグメントを各ＨＰＶに特異的なプローブ
として用いることもできる。Further, it is also possible to use a fragment obtained by amplifying each HPV DNA by the PCR method using the primer pairs shown in SEQ ID NOS: 24 to 28 of the sequence listing as a probe specific to each HPV.

【００１８】これらのプローブＤＮＡは、前記プライマ
ーＤＮＡと同様の方法で合成・精製することができる。
該プローブＤＮＡは標識化することにより、高感度な検
出が可能となる。標識化の方法としては、公知の方法な
らなんでもよいが、例えばＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いプローブＤＮＡの５′末端を³²Ｐで標識化する
アイソトープ標識方法でも良いし、プローブＤＮＡの酵
素標識、ビオチン−アビジン系での標識、またケミプロ
ーブのようにプローブＤＮＡにスルホン基を導入し、そ
れを抗体を用いて認識するような方法での標識方法等
の、非アイソトープ標識方法でも良い。These probe DNAs can be synthesized and purified in the same manner as the above-mentioned primer DNAs.
Labeling the probe DNA enables highly sensitive detection. The labeling method may be any known method, for example, an isotope labeling method in which the 5'end of the probe DNA is labeled with ³² P using T4 polynucleotide kinase, or an enzyme labeling of the probe DNA, biotin- A non-isotope labeling method such as avidin-based labeling or a labeling method in which a sulfone group is introduced into probe DNA such as a chemiprobe and the antibody is used to recognize the sulfone group may be used.

【００１９】更に、これらのプローブＤＮＡを用いて、
従来行われているハイブリダイゼーション法によるＨＰ
Ｖ ＤＮＡ配列の検出を行うこともできる。この場合、
配列表の配列番号２４〜２８に示した各共通プライマー
もプローブとして用いることができる。すなわち、ｐＵ
−Ｏ、ｐ１６−１若しくはｐＵ−２Ｒを用いればＨＰＶ
６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、Ｈ ＰＶ１８、ＨＰＶ３
１、ＨＰＶ３３を、ｐＵ−３１Ｂを用いればＨＰＶ６、
ＨＰＶ１１を、ｐＵ−１Ｍを用いればＨＰＶ１６、ＨＰ
Ｖ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３を検出することができ
る。本発明の方法により検出することができるＨＰＶの
うち、悪性型ＨＰＶとしては、前述のＨＰＶ１６、ＨＰ
Ｖ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３のほかに、例えばイト
ウら、又はマツクラらにより報告され、そのＨＰＶ Ｄ
ＮＡがクローニングされている、ＨＰＶ５２ｂ、ＨＰＶ
５８等があり〔キャンサー リサーチ(Cancer Res.) 、
第４８巻、第７１６４頁（１９８８）、1990年５月３０
日、日本癌学会発行、第４９回 日本癌学会総会記事第
１２３頁、講演番号第３７０番〕、これらのＨＰＶＤＮ
Ａも、本発明の方法により効率よく増幅され、検出され
うる。Further, using these probe DNAs,
HP by the conventional hybridization method
It is also possible to detect V DNA sequences. in this case,
Each common primer shown in SEQ ID NOs: 24 to 28 in the sequence listing can also be used as a probe. That is, pU
HPV with -O, p16-1 or pU-2R
6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV3
1, HPV33, HPU6 with pU-31B,
HPV11, HPU16, HP if pU-1M is used
V18, HPV31, HPV33 can be detected. Among the HPVs that can be detected by the method of the present invention, the malignant HPVs include HPV16 and HPP described above.
In addition to V18, HPV31, and HPV33, HPV D reported by, for example, Ito et al. Or Matsukura et al.
HPV52b, HPV in which NA is cloned
58 etc. [Cancer Research (Cancer Res.),
Vol. 48, p. 7164 (1988), May 30, 1990
Japan, Japanese Cancer Society, 49th Annual Meeting of the Japanese Cancer Society, page 123, lecture number 370], these HPVDN
A can also be efficiently amplified and detected by the method of the present invention.

【００２０】また、通常の方法でＰＣＲを行った（１次
ＰＣＲ）後、更に内側のプライマー対により再びＰＣＲ
を行い（２次ＰＣＲ）、感度よく目的ＤＮＡを検出する
方法すなわち二重ＰＣＲ法を用いて、ＨＰＶ ＤＮＡの
検出の感度をより高めることができる。すなわち、例え
ばプライマーｐＵ−Ｏ又はｐ１６−１と、プライマーｐ
Ｕ−２Ｒを用いて１次ＰＣＲを行い、良性型及び悪性型
ＨＰＶのＤＮＡを増幅し、更に、プライマーｐＵ−３１
Ｂ及びｐＵ−２Ｒを用いた２次ＰＣＲで良性型のＨＰＶ
ＤＮＡを、プライマーｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒを用
いた２次ＰＣＲで良性型のＨＰＶ ＤＮＡを、より効率
よく増幅し、感度よくＨＰＶ ＤＮＡを検出することが
できる。After performing PCR by the usual method (primary PCR), PCR is performed again with the inner primer pair.
(Secondary PCR) to detect the target DNA with high sensitivity, that is, the double PCR method can be used to further increase the sensitivity of detection of HPV DNA. That is, for example, the primer pU-O or p16-1, and the primer p
Primary PCR is performed using U-2R to amplify DNA of benign and malignant HPV, and further, primer pU-31 is used.
Benign HPV in secondary PCR using B and pU-2R
Benign HPV DNA can be amplified more efficiently by secondary PCR using DNAs with primers pU-1M and pU-2R, and HPV DNA can be detected with high sensitivity.

【００２１】更に、ＰＣＲで増幅された各ＨＰＶ ＤＮ
Ａを特定の制限酵素で処理した後、その切断パターン
を、例えば、アガロースゲル電気泳動とエチジウムブロ
マイド染色により解析することにより、各ＨＰＶのタイ
ピングを行うことができる。例えば、ｐ１６−１とｐＵ
−２Ｒの１次ＰＣＲ後にｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒによ
り増幅されたＨＰＶ１６ＤＮＡは、制限酵素ＡvaIIによ
り切断され、電気泳動によって157 bp及び８１bpのＤＮ
Ａ断片が特異的に検出されて、増幅されたＨＰＶＤＮＡ
がＨＰＶ１６であることが確認できる。ｐＵ−１Ｍ及び
ｐＵ−２Ｒ又はｐＵ−３１Ｂ及びｐＵ−２Ｒにより増幅
された各ＨＰＶ ＤＮＡと制限酵素の組合せの例及び検
出されたＤＮＡ断片の例を表３に示す（表中−は制限酵
素が作用しないことを示す）。Furthermore, each HPV DN amplified by PCR
After treating A with a specific restriction enzyme, the cleavage pattern thereof is analyzed by, for example, agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining, whereby each HPV can be typed. For example, p16-1 and pU
The HPV16 DNA amplified by pU-1M and pU-2R after the primary PCR of -2R was cleaved with the restriction enzyme AvaII and electrophoresed to DN of 157 bp and 81 bp.
HPV DNA amplified by specifically detecting the A fragment
Can be confirmed to be HPV16. Examples of combinations of each HPV DNA amplified with pU-1M and pU-2R or pU-31B and pU-2R and a restriction enzyme and examples of detected DNA fragments are shown in Table 3 (-in the table, Indicates that it does not work).

【００２２】[0022]

【表３】 表 ３ ───────────────────────────────── ＨＰＶ 増幅鎖長 制限酵素、 切断パターン(bd) (bp) Ava II Rsa I Bgl II Acc I ───────────────────────────────── HPV 6 230 − 134 、96 − − HPV11 230 − 166 、64 − − HPV16 238 157、81 − − − HPV18 268 172、96 − − − HPV31 232 − 118、114 − − HPV33 244 136、108 − − − HPV52b 231 − − 176 、55 − HPV58 244 − − − 126 、118 ─────────────────────────────────[Table 3] Table 3 ───────────────────────────────── HPV Amplified chain length restriction enzyme, cleavage pattern (bd ) (bp) Ava II Rsa I Bgl II Acc I ───────────────────────────────── HPV 6 230 − 134 , 96 − − HPV11 230 − 166, 64 − − HPV16 238 157, 81 − − − HPV18 268 172, 96 − − − HPV31 232 − 118, 114 − − HPV33 244 136, 108 − − − HPV52b 231 − − 176, 55 − HPV58 244 − − − 126, 118 ──────────────────────────────────

【００２３】ＰＣＲで増幅され、増幅ＤＮＡの制限酵素
による切断パターンにより同定されなかったＨＰＶは、
例えば、その未同定ＨＰＶが検出された試料より、ヒト
ゲノムＤＮＡを調製し、好適なベクターを用いライブラ
リーを作成し、クローニングし、目的のＤＮＡの塩基配
列を決定する。その結果、この未同定のＨＰＶは、新し
いタイプのウイルスと同定され、本発明者らは、この新
種をＨＰＶ−Sapporoと命名した。配列表の配列番号３
６にＨＰＶ−Sapporo の塩基配列及びその対応するアミ
ノ酸配列を示す。この塩基配列又は一部の配列、これら
の塩基配列にハイプリダイズ可能な塩基配列はＨＰＶ−
Sapporo を検出するための有用な新規配列である。また
ＨＰＶ−Sapporo 遺伝子がコードするタンパク質、その
一部のポリペプチド等も種々の分野において有用であ
る。HPV amplified by PCR and not identified by the restriction enzyme cleavage pattern of the amplified DNA was
For example, a human genomic DNA is prepared from a sample in which the unidentified HPV is detected, a library is prepared using a suitable vector, cloned, and the nucleotide sequence of the target DNA is determined. As a result, this unidentified HPV was identified as a new type of virus, and the present inventors named this new strain HPV-Sapporo. Sequence number 3 in the sequence listing
6 shows the base sequence of HPV-Sapporo and its corresponding amino acid sequence. This base sequence or a part of this base sequence, and a base sequence that can be hybridized to these base sequences are HPV-
This is a useful new sequence for detecting Sapporo. In addition, proteins encoded by the HPV-Sapporo gene, partial polypeptides thereof, and the like are also useful in various fields.

【００２４】配列表の配列番号３７にＨＰＶ−Sapporo
を本発明の共通プライマー対、ｐＵ−１ＭとｐＵ−２Ｒ
で増幅させたＤＮＡを検出するためのプローブの例、す
なわちｐＳＢ−Ｓの塩基配列、配列表の配列番号３８、
３９にＨＰＶ−Sapporo に特異的なＰＣＲ用の一対のプ
ライマーの例、ｐＳ−１及びｐＳ−２Ｒの塩基配列、配
列表の配列番号４０に、該プライマー対で増幅されたＤ
ＮＡ検出用のプローブの例、ｐＢＳ−１の塩基配列をそ
れぞれ示す。なお、これらのプライマーは、ＨＰＶ−Sa
pporo を特異的に増幅できるものであれば良く、プロー
ブとしては、増幅されたＤＮＡを特異的に検出できるも
のであれば良い。HPV-Sapporo is shown in SEQ ID NO: 37 of the sequence listing.
To the common primer pair of the present invention, pU-1M and pU-2R
An example of a probe for detecting the DNA amplified in step 1, that is, the base sequence of pSB-S, SEQ ID NO: 38 in the sequence listing,
39, an example of a pair of primers for PCR specific to HPV-Sapporo, nucleotide sequences of pS-1 and pS-2R, and SEQ ID NO: 40 in the sequence listing, and D amplified by the primer pair.
An example of a probe for NA detection and a base sequence of pBS-1 are shown, respectively. In addition, these primers are HPV-Sa
Any probe that can specifically amplify pporo may be used, and a probe may be any one that can specifically detect the amplified DNA.

【００２５】また本発明の良性型及び／又は悪性型ＨＰ
ＶのＤＮＡを増幅させるためのプライマー対をそろえて
キットとしておくことで、各型のＨＰＶＤＮＡを効率よ
く検出することができる。また、キット中にはユニバー
サルプローブ、各ＨＰＶ型特異的プローブ、制限酵素等
を含有させておいても良い。なお、キットに用いる試薬
は溶液状でも良いし、凍結乾燥物でも良い。Further, the benign and / or malignant HP of the present invention
By preparing a kit including a pair of primers for amplifying V DNA, each type of HPV DNA can be efficiently detected. In addition, the kit may contain universal probes, HPV type-specific probes, restriction enzymes and the like. The reagents used in the kit may be in the form of solution or lyophilized product.

【００２６】以上詳細に述べた様に、本発明の方法によ
れば試料中に存在する複数種のＨＰＶ ＤＮＡを一回の
反応で検出することができ、また、特定の制限酵素の切
断パターンや、型特異的なオリゴヌクレオチドプローブ
を用いて、各ＨＰＶ型の簡便なタイピングが可能とな
る。更に、本発明のキットは新種のＨＰＶのスクリーニ
ングにおいても有力な手段となる。As described in detail above, according to the method of the present invention, a plurality of types of HPV DNA present in a sample can be detected in one reaction, and the cleavage pattern of a specific restriction enzyme or By using a type-specific oligonucleotide probe, simple typing of each HPV type becomes possible. Furthermore, the kit of the present invention is a powerful tool for screening new types of HPV.

【００２７】[0027]

【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。EXAMPLES The present invention will now be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

【００２８】実施例１ 共通プライマーを用いた、ＰＣ
Ｒ法によるＨＰＶ ＤＮＡ特定領域の増幅Example 1 PC using common primers
Amplification of HPV DNA specific region by R method

【００２９】（１−１） オリゴヌクレオチドプライマ
ーＤＮＡ及びプローブＤＮＡの合成及び精製 ＰＣＲ法により特定のＤＮＡ配列を増幅させるには、そ
の領域の５′末端より約２０塩基のセンス配列及び３′
末端より約２０塩基のアンチセンス配列のオリゴヌクレ
オチドプライマーＤＮＡが必要である。またドットハイ
ブリダイゼーション法により感度良くＨＰＶ ＤＮＡを
検出する共通のオリゴヌクレオチドプローブＤＮＡや、
タイピング用の型特異的オリゴヌクレオチドプローブＤ
ＮＡが必要である。配列表の配列番号２４〜３５でそれ
ぞれ表されるプライマーＤＮＡ及びプローブＤＮＡをア
プライドバイオシステムズ社のＤＮＡ合成機を用いて合
成し、脱保護の後、イオン交換ＨＰＬＣ（ＴＳＫゲル、
ＤＥＡＥ−２ＳＷカラム）で精製し、セプ パク(Sep−
pak)Ｃ１８（ウォーターズ社）で脱塩し、各ＤＮＡ約５
０μｇを得た。(1-1) Synthesis and Purification of Oligonucleotide Primer DNA and Probe DNA To amplify a specific DNA sequence by the PCR method, a sense sequence of about 20 bases and 3'from the 5'end of the region are amplified.
An oligonucleotide primer DNA having an antisense sequence of about 20 bases from the end is required. In addition, a common oligonucleotide probe DNA that detects HPV DNA with high sensitivity by the dot hybridization method,
Type-specific oligonucleotide probe D for typing
NA is required. The primer DNAs and probe DNAs represented by SEQ ID NOS: 24 to 35 in the sequence listing were synthesized using a DNA synthesizer of Applied Biosystems, and after deprotection, ion exchange HPLC (TSK gel,
Purified by DEAE-2SW column) and separated by Sepak (Sep-
pak) C18 (Waters) desalted, each DNA about 5
0 μg was obtained.

【００３０】（１−２） ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒを
用いたＨＰＶ ＤＮＡ特定領域のＰＣＲ法による増幅 それぞれＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１
８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５２ｂ、ＨＰＶ５
８ＤＮＡの全長が挿入されているプラスミド８種類を入
手した。なお、例えばＨＰＶ６ ＤＮＡ全長が挿入され
たプラスミドは、ｐＨＰＶ６というように命名した〔ｐ
ＨＰＶ６；ジャーナル オブ ビロロジー、第４０巻、
第９３２頁（１９８１）、ｐＨＰＶ１１；ジャーナル
オブ ビロロジー、第４４巻、第３９３頁（１９８
２）、ｐＨＰＶ１６；プロシーディングス オブ ザナ
ショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ
ザ ＵＳＡ、第８０巻、第３８１２頁 （１９８
４）、ｐＨＰＶ１８；ジ エンボ ジャーナル、第３
巻、第１１５１頁（１９８４）、ｐＨＰＶ３１；ジャー
ナル オブ ビロロジー、第５８巻、第２２５頁（１９
８６）、ｐＨＰＶ３３；ネーチャー、第３２１巻、第２
４６頁 （１９８６）、ｐＨＰＶ５２ｂ；キャンサー
リサーチ(Cancer Res.)、第４８巻、第７１６４頁（１
９８８）、ｐＨＰＶ５８；１９９０年５月３０日、日本
癌学会発行、第４９回 日本癌学会総会記事第１２３
頁、講演番号第３７０番、及び同年７月３日に行われた
同総会での講演参照〕。これらプラスミドＤＮＡ１ng
を、0.５ml用チューブ（バイオビック社）に取り、９４
℃、10分加熱処理した後、ジーン アンプ キット (G
ene Amp ^TM Kit)（宝酒造社）中の１０μl の１０×増
幅用バッファー〔１００mM トリス・HCl、ｐＨ 8.
３、５００mM KCl 、１５mM MgCl₂ 、0.１％(w/v) ゼ
ラチン〕、１０μｌの1.２５mM ｄＮＴＰの混合液（ｄ
ＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、１μl の２
０μM ｐＵ−１Ｍプライマー、１μl の２０μM ｐＵ−
２Ｒプライマー、0.５μｌの５ユニット／μｌのタック
ポリメラーゼを加え、更に滅菌水を加えて１００μｌの
溶液にした。この反応液は上層に１００μｌのミネラル
オイル（シグマ社）を加えた後、自動遺伝子増幅装置サ
ーマルサイクラー（宝酒造社）により増幅反応を行っ
た。反応条件は９４℃、１分の変性→５５℃、２分間の
プライマーのアニーリング→７２℃、２分間の合成反応
のサイクルを３０サイクル行った。反応後上層のミネラ
ルオイルを除去した後、反応液の１０μｌを取り、３％
ヌシーブ(Nusieve)ＧＴＧアガロース−１％シーケム(Se
aKem)アガロース（ＦＭＣ社）ゲル電気泳動を行い、エ
チジウムブロマイドでＤＮＡを染色し、増幅されたＤＮ
Ａを確認した。前記８種類のＨＰＶプラスミドＤＮＡを
鋳型とした場合、ｐＨＰＶ１６、ｐＨＰＶ１８、ｐＨＰ
Ｖ３１、ｐＨＰＶ３３、ｐＨＰＶ５２ｂ、ｐＨＰＶ５８
からそれぞれ２３８bp、２６８bp、２３２bp、２４４b
p、２３１bp、２４４bpのバンドが検出された。ｐＨＰ
Ｖ６、ｐＨＰＶ１１からはバンドが検出されなかった。
すなわちプライマー対ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒは、悪
性腫瘍で広く見出されている悪性型ＨＰＶ16、ＨＰＶ１
８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ52ｂ、ＨＰＶ５８
ＤＮＡを特異的に増幅していた。(1-2) Amplification of HPV DNA specific region using pU-1M and pU-2R by PCR method HPV6, HPV11, HPV16, HPV1 respectively.
8, HPV31, HPV33, HPV52b, HPV5
Eight types of plasmid having the full length of 8 DNA inserted were obtained. In addition, for example, the plasmid into which the full length HPV6 DNA was inserted was named as pHPV6 [p
HPV6; Journal of Birology, Volume 40,
P. 932 (1981), pHPV11; Journal
Of Birology, Vol. 44, p. 393 (198
2), pHPV16; Proceedings of the National Academy of Sciences of
The USA, 80, 3812 (198).
4), pHPV18; Diembo Journal, No. 3
Vol., 1151 (1984), pHPV31; Journal of Virology, 58, 225 (19).
86), pHPV33; Nature, Volume 321, Second.
P. 46 (1986), pHPV52b; Cancer
Research (Cancer Res.), Vol. 48, p. 7164 (1
988), pHPV58; May 30, 1990, published by The Cancer Society of Japan, 49th Annual Meeting of the Cancer Society of Japan, Article 123
Page, Lecture No. 370, and Lecture at the General Assembly held on July 3 of the same year]. 1 ng of these plasmid DNAs
In a 0.5 ml tube (Biobic) to give 94
After heating at ℃ for 10 minutes, the Gene Amp Kit (G
ene Amp ^™ Kit) (Takara Shuzo) 10 μl of 10 × amplification buffer [100 mM Tris-HCl, pH 8.
3,500 mM KCl, 15 mM MgCl ₂ , 0.1% (w / v) gelatin], 10 μl of 1.25 mM dNTP mixture (d
ATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1 μl of 2
0 μM pU-1M primer, 1 μl of 20 μM pU-
The 2R primer and 0.5 μl of 5 units / μl of tack polymerase were added, and sterilized water was further added to make a 100 μl solution. After 100 μl of mineral oil (Sigma Co.) was added to the upper layer of this reaction solution, an amplification reaction was carried out by an automatic gene amplification device Thermal Cycler (Takara Shuzo). The reaction conditions were 94 ° C., 1 minute denaturation → 55 ° C., 2 minute primer annealing → 72 ° C., 2 minute synthesis reaction cycle, 30 cycles. After the reaction, remove the upper layer mineral oil, and take 10 μl of the reaction solution and
Nusieve GTG Agarose-1% Seachem (Se
aKem) Agarose (FMC) gel electrophoresis, staining DNA with ethidium bromide, amplified DN
A was confirmed. When using the above eight kinds of HPV plasmid DNAs as templates, pHPV16, pHPV18, pHP
V31, pHPV33, pHPV52b, pHPV58
From 238bp, 268bp, 232bp, 244b respectively
Bands of p, 231 bp and 244 bp were detected. pHP
No band was detected from V6 and pHPV11.
That is, the primer pairs pU-1M and pU-2R are the malignant HPV16 and HPV1 which are widely found in malignant tumors.
8, HPV31, HPV33, HPV52b, HPV58
The DNA was specifically amplified.

【００３１】（１−３） 制限酵素切断パターンによる
タイピング （１−２）で増幅したＤＮＡ断片を含む反応液９０μｌ
に、フェノールとクロロホルムの等量混合液９０μｌを
加え、静かにかくはんし、１２０００rpm 、５分間遠心
後、水層を分離した。この水層に９０μｌのクロロホル
ムを加え、静かにかくはんし、同様に遠心して水層を分
離した。この水層に９μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、２０
０μｌのエタノールを加え、充分かくはんし、−７０
℃、１５分間放置後、１２０００rpm 、１０分間遠心
し、ＤＮＡ断片を精製、回収した。沈殿は８０％エタノ
ールでリンスした後、乾燥させ、３４μｌの滅菌水に溶
解した。このＤＮＡ溶液８．５μｌに１０×ＡvaII反応
用バッファー〔１００mM トリス・HCl 、ｐＨ８．０、
７０mM MgCl₂ 、６００mM NaCl、７０mM２−メルカプ
トエタノール〕１μｌ、制限酵素ＡvaII０．５μｌを加
え、全量を１０μｌの溶液にした。この液を３７℃、２
時間反応させた後、反応液全量を前記の３％ヌシーブＧ
ＴＧアガロース−１％シーケムアガロース電気泳動し、
エチジウムブロマイド染色後、ＤＮＡの切断パターンを
観察した。その結果、ｐＨＰＶ１６由来の断片は、１５
７bpと８１bpに、ｐＨＰＶ１８由来の断片は１７２bpと
９６bpに、ｐＨＰＶ３３由来の断片は、１３６bpと１０
８bpに切断され、３者の切断パターンははっきりと区別
された。ｐＨＰＶ３１、ｐＨＰＶ５２ｂ、ｐＨＰＶ５８
由来の断片は切断されなかった。次にこれら６種類をＲ
saＩで反応させたところ、ｐＨＰＶ３１由来の断片のみ
が１１８bpと１１４bpに切断された。同様にこれら６種
類をＢglIIで反応させたところ、ｐＨＰＶ５２ｂ由来の
断片のみが１７６bpと５５bpに切断された。最後にこれ
ら６種類をＡccＩで反応させたところ、ｐＨＰＶ５８由
来の断片のみが１２６bpと１１８bpに切断された。した
がってＡvaII、ＲsaＩ、ＢglII、ＡccＩの４種類の制限
酵素を組合せることにより、プライマー対ｐＵ−１Ｍ及
びｐＵ−２Ｒ由来の６種のＤＮＡ断片は、すべてタイピ
ングできることが確認された。(1-3) Typing by restriction enzyme cleavage pattern 90 μl of reaction solution containing the DNA fragment amplified in (1-2)
90 μl of an equal volume mixture of phenol and chloroform was added to the mixture, the mixture was gently stirred, centrifuged at 12000 rpm for 5 minutes, and the aqueous layer was separated. 90 μl of chloroform was added to this aqueous layer, the mixture was gently stirred, and similarly centrifuged to separate the aqueous layer. 9 μl of 3M sodium acetate, 20
Add 0 μl of ethanol and stir well, -70
After leaving it at 15 ° C. for 15 minutes, it was centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes to purify and collect the DNA fragment. The precipitate was rinsed with 80% ethanol, dried, and dissolved in 34 μl of sterilized water. 8.5 μl of this DNA solution was added to 10 × AvaII reaction buffer [100 mM Tris.HCl, pH 8.0,
1 μl of 70 mM MgCl ₂ , 600 mM NaCl, 70 mM _2- mercaptoethanol] and 0.5 μl of the restriction enzyme AvaII were added to make a total volume of 10 μl. This liquid at 37 ℃, 2
After reacting for a period of time, the whole amount of the reaction solution is mixed with the above-mentioned 3% Nusibe G.
TG agarose-1% Seachem agarose electrophoresis,
After staining with ethidium bromide, the DNA cleavage pattern was observed. As a result, the pHPV16-derived fragment was 15
7 bp and 81 bp, pHPV18-derived fragments were 172 bp and 96 bp, and pHPV33-derived fragments were 136 bp and 10 bp.
It was cleaved to 8 bp and the cleavage patterns of the three were clearly distinguished. pHPV31, pHPV52b, pHPV58
The derived fragment was not cleaved. Next, these 6 types
When reacted with saI, only the fragment derived from pHPV31 was cleaved to 118 bp and 114 bp. Similarly, when these 6 kinds were reacted with BglII, only the fragment derived from pHPV52b was cleaved into 176 bp and 55 bp. Finally, when these 6 kinds were reacted with AccI, only the fragment derived from pHPV58 was cleaved to 126 bp and 118 bp. Therefore, it was confirmed that by combining four types of restriction enzymes, AvaII, RsaI, BglII, and AccI, all six types of DNA fragments derived from the primer pair pU-1M and pU-2R can be typed.

【００３２】（１−４） ｐＵ−３１Ｂ及びｐＵ−２Ｒ
を用いたＨＰＶ ＤＮＡ特定領域のＰＣＲ法による増幅
とタイピング （１−２）に記したＨＰＶ ＤＮＡ全長が挿入されたプ
ラスミド８種類を鋳型に、プライマー対ｐＵ−３１Ｂ及
びｐＵ−２Ｒを用いてＰＣＲを行った。反応液の組成、
温度サイクル、電気泳動法等は、（１−２）と全く同様
に行った。その結果、ｐＨＰＶ６、ｐＨＰＶ１１を鋳型
にしたときに、両者とも２３０bpのバンドが検出され
た。ｐＨＰＶ１６、ｐＨＰＶ１８、ｐＨＰＶ３１、ｐＨ
ＰＶ３３、ｐＨＰＶ５２ｂ、ｐＨＰＶ５８からはいずれ
もバンドは検出されなかった。すなわちプライマー対ｐ
Ｕ−３１Ｂ及びｐＵ−２Ｒは、良性腫瘍で広く見出され
る良性型ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１ＤＮＡを特異的に増幅し
ていた。更にｐＨＰＶ６、１１由来の増幅ＤＮＡ断片を
制限酵素ＲsaＩで反応させたところ、ｐＨＰＶ６由来の
断片は１３４bpと９６bpに、ｐＨＰＶ１１由来の断片は
１６６bpと６４bpに切断され、両者の切断パターンは、
はっきり区別された。これによりｐＵ−３１Ｂ及びｐＵ
−２Ｒ由来の２種類のＤＮＡ断片は、制限酵素ＲsaＩで
タイピングできることが確認された。(1-4) pU-31B and pU-2R
Amplification and typing of HPV DNA specific region using PCR using 8 types of plasmids into which full-length HPV DNA described in (1-2) was inserted as a template and primer pair pU-31B and pU-2R. went. Composition of reaction solution,
The temperature cycle, the electrophoresis method, etc. were performed in exactly the same manner as (1-2). As a result, when pHPV6 and pHPV11 were used as templates, a band of 230 bp was detected in both. pHPV16, pHPV18, pHPV31, pH
No band was detected from PV33, pHPV52b, or pHPV58. That is, primer pair p
U-31B and pU-2R specifically amplified benign HPV6 and HPV11 DNAs widely found in benign tumors. Furthermore, when the amplified DNA fragments derived from pHPV6 and 11 were reacted with a restriction enzyme RsaI, the pHPV6-derived fragment was cleaved to 134 bp and 96 bp, and the pHPV11-derived fragment was cleaved to 166 bp and 64 bp.
It was clearly distinguished. This gives pU-31B and pU
It was confirmed that the two types of DNA fragments derived from -2R can be typed with the restriction enzyme RsaI.

【００３３】（１−５） 型共通オリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いたｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒ増幅断片の
高感度検出 ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒ増幅断片がアガロースゲル電
気泳動とエチジウムブロマイド染色で確認できないと
き、検出感度を上げるため、配列表の配列番号２９〜３
１に示した型共通オリゴヌクレオチドプローブを用い
て、ドットハイブリダイゼーションを行った。まず型共
通プローブが、ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒ増幅断片との
み特異的にハイブリダイズすることを検討した。子宮筋
腫患者より得た健常な子宮頸部組織片１００mgを解剖は
さみで充分細かく切った後、ポリスチレン製チューブに
回収した。このチューブに１００μｇ／mlになるように
プロテネースＫを加えたＴＥバッファー５mlを加え、７
０℃、２時間処理した。この後（１−３) で示したよう
なフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿を行
い、約１００μｇのゲノムＤＮＡを回収し、１μｇ／１
μｌとなるようにＴＥバッファーに溶かした。この健常
組織ＤＮＡ液と、（１−２) 、（１−４）で得たＰＣＲ
反応液を９４℃、１０分間処理し、氷中で急冷してＤＮ
Ａを変性させた。これらＤＮＡ液１μｌ分をナイロンメ
ンブラン（シュライヘルウントシュエル）上にスポット
し、紫外線トランスイルミネーター（２５４nm) に１０
分照射し、ＤＮＡをメンブランに固定した。このメンブ
ランは、プレハイブリダイゼーションバッファー（５×
デンハーツ液、５×ＳＳＣ、１００μｇ／mlサケ***Ｄ
ＮＡ）１０ml中で５０℃、４時間プレハイブリダイゼー
ションを行った。次に³²Ｐにて５′末端をラベルしたプ
ローブＤＮＡｐＢＵ−１、ｐＢＵ−２を加え、５０℃、
２時間ハイブリダイゼーションを行った。プローブの³²
Ｐラベルはメガラベルキット（宝酒造社）を用いて次の
ように行った。１０pmol／μｌのプローブＤＮＡ１μ
ｌ、１μｌの×１０リン酸化バッファー、１０μCi／μ
ｌの〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ（アマシャム）５μｌ、１０ユ
ニットのＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ１μｌを含む
反応液に滅菌水２μｌを加えて１０μｌにし、３７℃、
３０分間反応させた。反応後６５℃、１０分間処理し、
この反応液の２μｌ（約１０⁸ cpm)をハイブリダイゼー
ションに用いた。ハイブリダイゼーション後メンブラン
を６×ＳＳＣ、0.５％ＳＤＳを含む洗浄液１で室温で数
分洗浄し、続いて、２×ＳＳＣ、0.１％ＳＤＳを含む洗
浄液２で５０℃、１０分間で２回洗浄した。メンブラン
は乾燥させた後、Ｘ線フィルム（富士フィルム）を入れ
たカセット内で−７０℃、１時間感光させ、オートラジ
オグラフをとった。この結果、ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２
Ｒで増幅したｐＨＰＶ１６、ｐＨＰＶ１８、ｐＨＰＶ３
１、ｐＨＰＶ３３、ｐＨＰＶ５２ｂ、ｐＨＰＶ５８由来
のＤＮＡ断片はｐＢＵ−１、ｐＢＵ−２混合プローブと
ハイブリダイズし、ドットが現れた。その他ｐＵ−３１
Ｂ及びｐＵ−２Ｒで増幅したｐＨＰＶ６、ｐＨＰＶ１１
由来のＤＮＡ断片や、健常子宮頸部組織ＤＮＡからは、
ハイブリダイゼーションは全く認められなった。この結
果は、混合プローブｐＢＵ−１、ｐＢＵ−２により、悪
性腫瘍で広く見出されるＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰ
Ｖ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５２ｂ、ＨＰＶ５８ＤＮＡ
が特異的に検出できることを示すものである。そこで、
このプローブのドットハイブリダイゼーションによる検
出限界を、ｐＨＰＶ１６を用いたモデル実験系をつく
り、検定した。ヒトの全ゲノムＤＮＡの鎖長を３×１０
⁹ bpとして、ｐＨＰＶ１６が１０コピー／ゲノムＤＮＡ
となるように、ｐＨＰＶ１６を健常な子宮頸部から上述
で得たゲノムＤＮＡにて希釈した。すなわち、４０６ｐ
ｇのｐＨＰＶ１６を１０μｇの健常なゲノムＤＮＡで希
釈した。これを健常なゲノムＤＮＡで順次１０倍希釈
し、ｐＨＰＶ１６の１０〜１０^-6コピー／ゲノムＤＮＡ
のモデルテンプレートＤＮＡを段階的に調製した。各モ
デルテンプレートＤＮＡ１μｇを用いて、（１−２）に
示した方法でＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅させた。更
に上述に示した方法で、ドットハイブリダイゼーション
を行った。この結果１０^-6コピー／ゲノムＤＮＡまでド
ットが検出された。ｐＨＰＶ１８、ｐＨＰＶ３１、ｐＨ
ＰＶ３３、ｐＨＰＶ５２ｂ、ｐＨＰＶ５８についても同
様のモデル実験を行ったが、同じ結果を得た。すなわ
ち、ｐＢＵ−１、ｐＢＵ−２の混合プローブを用いれ
ば、ＰＣＲ後のドットハイブリダイゼーションにより、
細胞当り１０^-6コピーのＨＰＶ ＤＮＡの検出が可能で
あることが確認された。Highly sensitive detection of pU-1M and pU-2R amplified fragments using the (1-5) type common oligonucleotide primer pU-1M and pU-2R amplified fragments cannot be confirmed by agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining. At this time, in order to increase detection sensitivity, SEQ ID NOs: 29 to 3 in the sequence listing
Dot hybridization was performed using the type-common oligonucleotide probe shown in 1. First, it was examined that the type-common probe specifically hybridizes only with the pU-1M and pU-2R amplified fragments. A 100 mg portion of a healthy cervical tissue obtained from a patient with uterine fibroids was cut into fine pieces with dissecting scissors and then collected in a polystyrene tube. To this tube, add 5 ml of TE buffer containing proteinase K to 100 μg / ml, and
It was treated at 0 ° C. for 2 hours. After this, phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation as shown in (1-3) were performed to recover about 100 μg of genomic DNA, and 1 μg / 1
It was dissolved in TE buffer to give a volume of μl. This healthy tissue DNA solution and PCR obtained in (1-2) and (1-4)
The reaction solution is treated at 94 ° C for 10 minutes and then rapidly cooled in ice to DN.
A was denatured. A 1 μl aliquot of these DNA solutions was spotted on a nylon membrane (Schleihel und Schuell), and the UV transilluminator (254 nm) was used for 10 times.
It was irradiated for minutes and the DNA was immobilized on the membrane. This membrane contains prehybridization buffer (5 x
Den Hearts solution, 5 × SSC, 100 μg / ml salmon sperm D
Prehybridization was carried out in 10 ml of NA) at 50 ° C. for 4 hours. Next, probe DNAs pBU-1 and pBU-2 labeled at the 5'end with ³² P are added, and the mixture is heated to 50 ° C.
Hybridization was performed for 2 hours. ^{32 of the} probe
P labeling was performed as follows using a Mega Label kit (Takara Shuzo). 10 pmol / μl probe DNA 1μ
l, 1 μl × 10 phosphorylation buffer, 10 μCi / μ
2 [mu] l of sterilized water was added to a reaction solution containing 5 [mu] l of [[gamma]-< ³² > P] ATP (Amersham), 1 [mu] l of 10 units of T4-polynucleotide kinase to make 10 [mu] l,
It was allowed to react for 30 minutes. After the reaction, treat at 65 ° C for 10 minutes,
2 μl (about 10 ⁸ cpm) of this reaction solution was used for hybridization. After hybridization, the membrane is washed with a washing solution 1 containing 6 × SSC and 0.5% SDS at room temperature for several minutes, and then with a washing solution 2 containing 2 × SSC and 0.1% SDS at 50 ° C. for 10 minutes. Washed twice. After the membrane was dried, it was exposed to -70 ° C for 1 hour in a cassette containing an X-ray film (Fuji Film), and an autoradiograph was taken. As a result, pU-1M and pU-2
PHPV16, pHPV18, pHPV3 amplified by R
DNA fragments derived from 1, pHPV33, pHPV52b, and pHPV58 hybridized with the pBU-1, pBU-2 mixed probe, and dots appeared. Other pU-31
PHPV6 and pHPV11 amplified with B and pU-2R
From the derived DNA fragments and normal cervical tissue DNA,
No hybridization was observed. This result indicates that HPV16, HPV18, HP which are widely found in malignant tumors are observed by the mixed probes pBU-1, pBU-2.
V31, HPV33, HPV52b, HPV58DNA
Shows that can be specifically detected. Therefore,
The detection limit of this probe by dot hybridization was tested by making a model experimental system using pHPV16. The chain length of human whole genomic DNA is 3 × 10
^{As 9} bp, 10 copies of pHPV16 / genomic DNA
PHPV16 was diluted with the genomic DNA obtained above from a healthy cervix so that That is, 406p
g of pHPV16 was diluted with 10 μg of healthy genomic DNA. This is serially diluted 10-fold with healthy genomic DNA, and 10 to 10 ^-6 copies of pHPV16 / genomic DNA
The model template DNA of was prepared stepwise. Using 1 μg of each model template DNA, a DNA fragment was amplified by PCR by the method shown in (1-2). Furthermore, dot hybridization was performed by the method described above. As a result, dots were detected up to 10 ⁻⁶ copies / genomic DNA. pHPV18, pHPV31, pH
Similar model experiments were performed for PV33, pHPV52b, and pHPV58, but the same results were obtained. That is, if a mixed probe of pBU-1 and pBU-2 is used, by dot hybridization after PCR,
It was confirmed that it was possible to detect 10 ⁻⁶ copies of HPV DNA per cell.

【００３４】（１−６) 特異的オリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いたドットハイブリダイゼーションによる
タイピング ｐＢＵ−１、ｐＢＵ−２混合プローブにより型に関係な
く検出してきた試料をタイピングするため、配列表の配
列番号３２〜３５に示した型特異的オリゴヌクレオチド
プローブを用いた。上述のｐＨＰＶ ＤＮＡ８種類各１
ngを鋳型として、（１−２) で示した方法でプライマー
対ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２ＲによりＰＣＲを行った。こ
の反応液及び（１−５) で調製した健常子宮頸部組織Ｄ
ＮＡ各１μｌをナイロンメンブランにスポットした。同
じメンブランを４枚準備し、配列表の配列番号３２〜３
５に示すプローブｐＳＢ−１６、ｐＳＢ−１８、ｐＳＢ
−３１、ｐＳＢ−３３を、順に各メンブランと別々にハ
イブリダイズさせた。この結果、順にｐＨＰＶ１６、ｐ
ＨＰＶ１８、ｐＨＰＶ３１、ｐＨＰＶ３３由来増幅断片
をスポットした箇所にのみ強いドットが現れ、他の箇所
には全くハイブリダイゼーションは認められなかった。
これらより、配列表の配列番号３２〜３５の型特異的オ
リゴヌクレオチドプローブ群は、配列表の配列番号２９
〜３１のユニバーサルプローブでの検出後のタイピング
に有効であることが確認された。(1-6) Typing by dot hybridization using a specific oligonucleotide primer In order to type a sample detected by the pBU-1 and pBU-2 mixed probes regardless of type, SEQ ID NO: 32 in the sequence listing is used. The type-specific oligonucleotide probes shown in ~ 35 were used. Each of the above 8 types of pHPV DNA
PCR was performed using the ng as a template and the primer pair pU-1M and pU-2R by the method shown in (1-2). Healthy cervical tissue D prepared from this reaction solution and (1-5)
1 μl of each NA was spotted on a nylon membrane. Prepare 4 sheets of the same membrane, SEQ ID Nos. 32 to 3 in the sequence listing
5 probes pSB-16, pSB-18, pSB
−31 and pSB-33 were sequentially hybridized with each membrane separately. As a result, pHPV16, p
Strong dots appeared only in the spots where the amplified fragments derived from HPV18, pHPV31, and pHPV33 were spotted, and no hybridization was observed in other spots.
From these, the type-specific oligonucleotide probe groups of SEQ ID NOs: 32 to 35 in the sequence listing are
It was confirmed to be effective for typing after detection with ~ 31 universal probe.

【００３５】（１−７） 二重ＰＣＲ法による増幅 １対のプライマーを用いて通常の方法でＰＣＲを行った
（１次ＰＣＲ）後、更に内側のプライマー対により再び
ＰＣＲを行い（２次ＰＣＲ）、感度よく目的ＤＮＡを検
出する方法、すなわち二重ＰＣＲ法が知られている。二
重ＰＣＲ法によるＨＰＶの検出を行うために、（１−
２) で示したプラスミド ｐＨＰＶ６、ｐＨＰＶ１１、
ｐＨＰＶ１６、ｐＨＰＶ１８、ｐＨＰＶ３１、ｐＨＰＶ
３３、ｐＨＰＶ５２ｂ、ｐＨＰＶ５８それぞれ１ngをプ
ライマーｐ１６−１及びｐＵ−２Ｒを１次ＰＣＲ用プラ
イマーとして用いて（１−２) に示した方法で３０サイ
クルＰＣＲを行った。次に、１次ＰＣＲの反応液0.５μ
ｌを新しい0.５ml用チューブ（バイオビック社）によ
り、（１−２) と同様にプライマーｐＵ−１Ｍ、ｐＵ−
２Ｒを用いて、１５サイクル２次ＰＣＲを行った。その
結果、ｐＨＰＶ１６、１８、３１、３３、５２ｂ及び５
８からそれぞれ増幅ＤＮＡが認められた。更に、それぞ
れのウイルス型は（１−３) と同様に制限酵素、ＡvaI
I、ＲsaＩ、Ｂgl II 及びＡccＩの切断パターンにより
同定できた。また、２次ＰＣＲにおいて、プライマーと
してｐＵ−３１Ｂ及びｐＵ−２Ｒを用い、（１−４) と
同様に１５サイクル２次ＰＣＲを行った結果、ｐＨＰＶ
６及びｐＨＰＶ１１のみに増幅が認められ、更に、Ｒsa
Ｉの切断パターンによりＨＰＶ６とＨＰＶ１１が識別で
きた。また、ｐ１６−１のかわりにｐＵ−Ｏを用いた場
合、その検出感度は１０倍に上昇した。(1-7) Amplification by double PCR method After PCR was carried out by a usual method using one pair of primers (primary PCR), PCR was further carried out by the inner primer pair (secondary PCR). ), A method for detecting a target DNA with high sensitivity, that is, a double PCR method is known. In order to detect HPV by the double PCR method, (1-
2) the plasmids pHPV6, pHPV11,
pHPV16, pHPV18, pHPV31, pHPV
Thirty cycles of PCR were carried out by the method shown in (1-2) using 1 ng of each of 33, pHPV52b and pHPV58 as primers p16-1 and pU-2R for the primary PCR. Next, the reaction solution of the primary PCR is 0.5μ
1 in a new 0.5 ml tube (Biobic) in the same manner as (1-2), using primers pU-1M and pU-.
A 15 cycle secondary PCR was performed using 2R. As a result, pHPV 16, 18, 31, 33, 52b and 5
Amplified DNA was observed from 8 respectively. Furthermore, each virus type has the same restriction enzyme, AvaI, as in (1-3).
It could be identified by the cleavage patterns of I, RsaI, BglII and AccI. In the secondary PCR, pU-31B and pU-2R were used as primers, and 15 cycles of secondary PCR were performed in the same manner as in (1-4). As a result, pHPV was obtained.
Amplification was observed only in 6 and pHPV11.
HPV6 and HPV11 could be identified by the cutting pattern of I. When pU-O was used instead of p16-1, the detection sensitivity was increased 10 times.

【００３６】実施例２ 子宮頸がん組織におけるＨＰＶ
ＤＭＡの検出 ３９例の子宮頸がん摘出組織約１００mgより（１−５)
の方法により、ゲノムＤＮＡを約１００μｇ得た。これ
らのゲノムＤＮＡ１ｇを９４℃、１０分間熱変性させた
後、ジーン アンプ キット中の１０μｌの×１０バッ
ファー、１６μｌの１．２５mM ｄＮＴＰ混合液、0.５
μｌの５ユニット／μｌタックポリメラーゼ、及びセン
スプライマーｐＵ−１Ｍ １μｌ、アンチセンスプライ
マーｐＵ−２Ｒ １μｌを加え、滅菌水を加えて１００
μｌの液を調製した。（１−２) の方法によりＰＣＲと
その後のアガロースゲル電気泳動、制限酵素によるタイ
ピングを行った。Example 2 HPV in cervical cancer tissue
Detection of DMA Approximately 100 mg of tissue excised from cervical cancer in 39 cases (1-5)
By the method described above, about 100 μg of genomic DNA was obtained. After heat denaturing 1 g of these genomic DNAs at 94 ° C. for 10 minutes, 10 μl of × 10 buffer in Gene Amp Kit, 16 μl of 1.25 mM dNTP mixture, 0.5
μl of 5 units / μl tack polymerase, sense primer pU-1M 1 μl, antisense primer pU-2R 1 μl were added, and sterile water was added to give 100
A μl solution was prepared. PCR was performed by the method of (1-2), followed by agarose gel electrophoresis and typing with a restriction enzyme.

【００３７】表４に示すように子宮頸がん組織３９例よ
り、全体で３３例（８4.６％）にＨＰＶ ＤＮＡを検出
した。As shown in Table 4, HPV DNA was detected in 33 cases (84.6%) out of 39 cases of cervical cancer tissues.

【００３８】[0038]

【表４】 表 ４ ────────────────────────────────── ＨＰＶ１６ ＨＰＶ１８ ＨＰＶ３１ ＨＰＶ３３ ＨＰＶ 52b １９／３９ ５／３９ ２／３９ ２／３９ １／３９ (48.7%) (12.8%) (5.1%) (5.1%) (2.6%) ＨＰＶ５８ 未同定HPV 全 体 ３／３９ ４／３９ ３３／３９ (7.7%) (10.3%) (84.6%) ──────────────────────────────────[Table 4] Table 4 ────────────────────────────────── HPV16 HPV18 HPV31 HPV33 HPV 52b 19/395 / 39 2/39 2/39 1/39 (48.7%) (12.8%) (5.1%) (5.1%) (2.6%) HPV58 unidentified HPV whole 3/39 4/39 33/39 (7.7%) (10.3%) (84.6%) ──────────────────────────────────

【００３９】なお表中３試料が複合感染（ＨＰＶ１６＋
ＨＰＶ１８、ＨＰＶ１８＋ＨＰＶ３３、ＨＰＶ18＋ＨＰ
Ｖ５８）であり、４試料中からＨＰＶ16、ＨＰＶ１８、
ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５２ｂ、ＨＰＶ５８以
外の悪性型ＨＰＶが検出された。3 samples in the table are combined infections (HPV16 +
HPV18, HPV18 + HPV33, HPV18 + HP
V58), and HPV16, HPV18,
Malignant HPVs other than HPV31, HPV33, HPV52b, and HPV58 were detected.

【００４０】また表５に示すように、前がん病変組織２
５例中より、全体で１３例（５２．０％）ＨＰＶＤＮＡ
を検出することができた。Further, as shown in Table 5, precancerous lesion tissue 2
13 out of 5 cases (52.0%) HPV DNA
Was able to be detected.

【００４１】[0041]

【表５】 表 ５ ────────────────────────────────── ＨＰＶ１６ ＨＰＶ１８ ＨＰＶ３１ ＨＰＶ３３ ＨＰＶ 52b ９／２５ ０／２５ ３／２５ ０／２５ ０／２５ ＨＰＶ５８ 未同定HPV 全 体 ２／２５ １／２５ １３／２５ (52.0%) ──────────────────────────────────[Table 5] Table 5 ────────────────────────────────── HPV16 HPV18 HPV31 HPV33 HPV 52b 9/250 / 25 3/25 0/25 0/25 HPV58 Unidentified HPV Total 2/25 1/25 13/25 (52.0%) ───────────────────── ──────────────

【００４２】なお表中２試料が複合感染（ＨＰＶ１６＋
ＨＰＶ５８、ＨＰＶ１６＋ＨＰＶTwo samples in the table are combined infections (HPV16 +
HPV58, HPV16 + HPV

【００４３】実施例３ 未同定ＨＰＶのクローニングと
シークエンシング （３−１） 未同定ＨＰＶのクローニング ライブラリー作製用のベクターには、シャロミド（ Cha
romid ) ９−３６（ニッポンジーン社）を用い、ライブ
ラリー作製法は斉藤らの方法〔斉藤Ｉ. ( Saito, I. ）
及びスタークＥ．Ｒ．( Stark, E. R. )、プロシーディ
ングス オブザ ナショナル アカデミー オブ サイ
エンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第８３巻、第８６６４
頁（１９８６）〕に従った。まず、実施例２に示した未
同定ＨＰＶＤＮＡを含むヒトゲノムＤＮＡ１０μｇをHi
ndIII で完全分解した。この試料を０．８％アガロース
ゲル中で電気泳動し、８kb付近を切り出し、透析チュー
ブで用いてＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡを１０μ
ｌのＴＥバッファーに溶かし、その一部を用いて２６０
nm紫外吸収を基にＤＮＡ濃度を測定したところ、約３０
０ng／μｌの濃度であった。次に、シャロミド９−３６
ベクター２μｇを HindIII数ユニットで完全に分解し
た。反応液全量は５０μｌとした。反応終了後０．５Ｍ
ＥＤＴＡ１．５μｌを加え酵素の働きを止め、更に７
０℃１０分熱処理して酵素を失活させた。このベクター
液２６μｌ（１μｇ）に先程のヒトゲノムからの回収Ｄ
ＮＡ１μｌ（３００ng）を加え、次にエタノール沈殿を
行った。沈殿は８０％エタノールでリンスした後、直ち
に４、５μｌのＴＥバッファーに溶かした。更に１０×
Ｔ４ＤＮＡリガーゼバッファー０．７μｌ、１mM ＡＴ
Ｐ０．７μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．７μｌ加え、１
６℃で一晩反応させた。翌日インビトロパッケージング
を、GIGAPACK II パッケージングエキストラクト（スト
ラトジーン社）を用いて次の手順で行った。まず反応液
１μｌをキット中の凍結融解液（ Freeze/thaw extract
)に加え、直ちにソニック・エキストラクト液（ Sonic
extract )１５μｌを加えた。そしてチップの先で良く
かくはんした後、室温で２時間放置した。その後ＳＭバ
ッファーを５００μｌとクロロホルム２μｌを加え、ゲ
ノムライブラリー液とした。一方、前日より大腸菌株Ｄ
Ｈ５を０．７％マルトースを含むＬブロス液体培地中で
一晩振とう培養し、培養液１mlより遠心分離により菌体
を回収し、１０mMＭｇＳＯ₄ 液０．５mlに懸濁した。こ
の指示菌液１００μｌに、先程のライブラリー液１００
μｌを加え、２５℃１５分放置することによりファージ
を大腸菌に感染させた。感染後Ｌブロス培地１mlを加え
３７℃で３０分放置した。この液の１／２００量（６μ
ｌ）、１／２０量（６０μｌ）、１／２量（６００μ
ｌ）をアンピシリン５０μｇ／mlを含むＬブロスプレー
トにそれぞれ播種し、３７℃一晩培養した。その結果、
６μｌ播種したプレートに約７００個のコロニーが現
れ、ベクター１μｇ当り約４．９×１０⁶ 個のコロニー
形成能をもつライブラリーが作製できた。そこでこのラ
イブラリーより目的のクローンを見つけるために、標識
プローブを用いたスクリーニングを行った。まずプレー
トあたり約７００個のコロニーが現れるよう、１０枚の
プレートにライブラリーのファージを播種した。このプ
レートの上にナイロンメンブランをおき、約１分静置後
メンブランをはがしてコロニーをメンブランに張り付け
た。トランスファーの終わったプレートは３時間ほど３
７℃でインキュベートし、再びコロニーを大きくしてか
ら同様の操作を繰返した。すなわち、１枚のプレートよ
り２枚のレプリカが作製された。これらのメンブラン
を、２００mlの変性液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ
ＮａＣｌ）で７分間変性し、２００mlの中和液（０．５
Ｍ トリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１．５Ｍ ＮａＣ
ｌ）で５分間中和後、紫外線を５分間照射しＤＮＡを固
定した。これらのメンブランをプレハイブリダイゼーシ
ョンバッファー（５×デンハーツ液、６×ＳＳＣ、０．
５％ＳＤＳ、１００μｇ／mlサケ***ＤＮＡ）１０ml中
で６５℃で６時間処理し、プレハイブリダイゼーション
を行った。他方、実施例２で得られたＰＣＲで増幅した
ＨＰＶＤＮＡフラグメントを１０μｌのＴＥバッファー
に溶かして４％アガロースゲル中で電気泳動した。泳動
終了後ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ＨＰＶＤ
ＮＡフラグメントのバンド付近を切り出した。このゲル
断片を少量の泳動バッファーと共に透析チューブに入
れ、ゲル内のＤＮＡがチューブ内液に出てくるまで電気
泳動を行った。その後このチューブ内液を回収し、フェ
ノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿とリンス
及び乾燥を行いＤＮＡを精製した。これを３μｌのＴＥ
バッファーに溶かし、標識ＤＮＡプローブ作製用の鋳型
とした。ＤＮＡプローブの標識法はファインバーらの方
法〔ファインバー Ａ．Ｐ. (Feinber, A.P. ) 及びフ
ォーゲルシュタイン Ｂ．( Vogelstein, B. )、アナリ
チカル バイオケミストリー（ Anal. Biochem. ) 、第
１３２巻、第６頁（１９８３）〕に従い、ランダムプラ
イマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造社）を用いて行
った。上記の精製ＨＰＶＤＮＡフラグメント３μｌにキ
ット中のランダムプライマー液２μｌを加え、９４℃で
３分熱処理後氷中で急冷した。次いで１０×バッファー
２．５μｌ、ｄＮＴＰ混合液２．５μｌ、水９μｌ、
〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／mM；アマシャム
社）５μｌ、クレノウ酵素１μｌを順次加え全量を２５
μｌとした。酵素反応を３７℃で３時間行った後再び９
４℃３分熱処理し、標識ＤＮＡプローブとして用いた。
ハイブリダイゼーションは、プレハイブリダイゼーショ
ンと同じ液３mlに標識プローブを加え、６５℃で１２時
間行った。ハイブリダイゼーション後メンブランを２×
ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを含む洗浄液１で室温で５分、
続いて２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む洗浄液２で室
温で１５分、更に０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを含
む洗浄液３で３７℃で３０分、最後に洗浄液３で６５℃
で３０分洗浄した。メンブランは乾燥させた後、Ｘ線フ
ィルム（コダック社）を入れたカセット内で−８０℃で
７時間感光させオートラジオグラフをとった。こうして
約７０００個のコロニーをスクリーニングした結果、１
つのポジティブシグナルが見つかり、シグナル付近の各
々独立したコロニー約５０個をマスタープレートに植え
継ぎ、２次スクリーニングをして最終的に目的のクロー
ンを単離した。Example 3 Cloning and Sequencing of Unidentified HPV (3-1) Cloning of Unidentified HPV A vector for constructing a library includes charomide (Cha).
romid) 9-36 (Nippon Gene Co., Ltd.), and the method for preparing the library is the method of Saito et al. [Saito, I.]
And Stark E. R. (Stark, ER), Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, Volume 83, 8664
Page (1986)]. First, 10 μg of human genomic DNA containing unidentified HPV DNA shown in Example 2 was used as Hi.
Completely decomposed with ndIII. This sample was electrophoresed in a 0.8% agarose gel to cut out around 8 kb and used in a dialysis tube to purify DNA. 10μ of purified DNA
260 ml using a part of it
When the DNA concentration was measured based on the UV absorption, it was about 30
The concentration was 0 ng / μl. Next, Charomide 9-36
2 μg of vector was completely digested with several units of HindIII. The total volume of the reaction solution was 50 μl. 0.5M after reaction
Add 1.5 μl of EDTA to stop the action of the enzyme, and
The enzyme was inactivated by heat treatment at 0 ° C for 10 minutes. 26 μl (1 μg) of this vector solution was recovered from the human genome D
NA1 μl (300 ng) was added, followed by ethanol precipitation. The precipitate was rinsed with 80% ethanol and immediately dissolved in 4,5 μl of TE buffer. 10x more
T4 DNA ligase buffer 0.7 μl, 1 mM AT
Add 0.7 μl of P and 0.7 μl of T4 DNA ligase to 1
The reaction was carried out at 6 ° C overnight. The next day, in vitro packaging was performed using GIGAPACK II packaging extract (Stratogene) according to the following procedure. First, add 1 μl of the reaction solution to the freeze-thaw solution in the kit (Freeze / thaw extract
), As well as Sonic extract solution (Sonic
15 μl of extract) was added. After stirring well with the tip of the chip, it was left at room temperature for 2 hours. Thereafter, 500 μl of SM buffer and 2 μl of chloroform were added to prepare a genomic library solution. On the other hand, from the day before E. coli strain D
H5 was shake-cultured overnight in an L broth liquid medium containing 0.7% maltose, the cells were recovered from 1 ml of the culture solution by centrifugation, and suspended in 0.5 ml of 10 mM MgSO ₄ solution. To 100 μl of this indicator bacterial solution, add 100 μl of the above library solution.
E. coli was infected with the phage by adding μl and leaving it at 25 ° C. for 15 minutes. After infection, 1 ml of L broth medium was added and the mixture was left at 37 ° C. for 30 minutes. 1/200 volume of this solution (6μ
l), 1/20 volume (60 μl), 1/2 volume (600 μl)
1) was inoculated on each L broth plate containing 50 μg / ml of ampicillin, and cultured overnight at 37 ° C. as a result,
About 700 colonies appeared on the plate seeded with 6 μl, and a library having a colony forming ability of about 4.9 × 10 ⁶ colonies per 1 μg of vector was prepared. Therefore, screening using a labeled probe was performed in order to find the desired clone from this library. First, the phages of the library were seeded on 10 plates so that about 700 colonies appeared per plate. A nylon membrane was placed on this plate, allowed to stand for about 1 minute and then peeled off to attach the colony to the membrane. The plate after transfer is 3 hours for 3 hours
The same operation was repeated after incubating at 7 ° C. to enlarge the colonies again. That is, two replicas were produced from one plate. These membranes were mixed with 200 ml of denaturing solution (0.5M NaOH, 1.5M
After denaturing with NaCl for 7 minutes, 200 ml of neutralization solution (0.5
M Tris.HCl, pH 7.5, 1.5M NaC
After neutralizing with l) for 5 minutes, the DNA was fixed by irradiating with ultraviolet rays for 5 minutes. Pre-hybridization buffer (5 x Denhardt's solution, 6 x SSC, 0.
Pre-hybridization was performed by treating the cells in 10 ml of 5% SDS, 100 μg / ml salmon sperm DNA) at 65 ° C. for 6 hours. On the other hand, the HPV DNA fragment amplified by PCR obtained in Example 2 was dissolved in 10 μl of TE buffer and electrophoresed in a 4% agarose gel. After the electrophoresis, the gel was stained with ethidium bromide and then HPVD
The vicinity of the NA fragment band was cut out. This gel fragment was put into a dialysis tube together with a small amount of electrophoresis buffer, and electrophoresed until the DNA in the gel came out into the solution in the tube. Thereafter, the liquid in the tube was recovered, extracted with phenol / chloroform, precipitated with ethanol, rinsed and dried to purify the DNA. Add this to 3 μl of TE
It was dissolved in a buffer and used as a template for preparing a labeled DNA probe. The method for labeling the DNA probe is the method of Fine Bar et al. [Fine Bar A. P. (Feinber, AP) and Vogelstein B. (Vogelstein, B.), Analytical Biochemistry (Anal. Biochem.), Volume 132, page 6 (1983)], using a random primer DNA labeling kit (Takara Shuzo). 2 μl of the random primer solution in the kit was added to 3 μl of the above-mentioned purified HPV DNA fragment, heat-treated at 94 ° C. for 3 minutes, and then rapidly cooled in ice. Next, 2.5 μl of 10 × buffer, 2.5 μl of dNTP mixture, 9 μl of water,
[Α- ³² P] dCTP (3000 Ci / mM; Amersham Co.) 5 μl and Klenow enzyme 1 μl were sequentially added to bring the total amount to 25.
μl. The enzyme reaction was carried out at 37 ° C for 3 hours and then again 9
It was heat-treated at 4 ° C. for 3 minutes and used as a labeled DNA probe.
Hybridization was carried out by adding a labeled probe to 3 ml of the same solution used for prehybridization at 65 ° C. for 12 hours. 2x membrane after hybridization
Wash solution 1 containing SSC and 0.5% SDS at room temperature for 5 minutes,
Subsequently, the washing solution 2 containing 2 × SSC and 0.1% SDS was used at room temperature for 15 minutes, the washing solution 3 containing 0.1 × SSC and 0.5% SDS was used at 37 ° C. for 30 minutes, and finally the washing solution 3 was used to give 65 ℃
For 30 minutes. After drying the membrane, it was exposed to light at -80 ° C for 7 hours in a cassette containing an X-ray film (Kodak Co., Ltd.) and an autoradiograph was taken. As a result of screening about 7,000 colonies in this way, 1
One positive signal was found, and about 50 independent colonies near the signal were subcultured on a master plate and subjected to secondary screening to finally isolate a target clone.

【００４４】（３−２） クローン化したＨＰＶＤＮＡ
のｐＵＣ１１９ＨindIIIサイトへのサブクローニング
と、制限酵素切断地図の作製 （３−１）で最終的に単離したコロニーは、５０μｇ／
mlアンピシリン入りブロス液体培地５ml中で３７℃一晩
振とう培養し、以下の手順によりアルカリ法を用いてプ
ラスミドを調製した。まず培養液１．５mlを１５０００
回転で１分間遠心し、菌体を回収した。この菌体に１０
０μｌのグルコース−リゾチーム液（５０mM グルコー
ス、１０mM ＥＤＴＡ、２５mM トリス・ＨＣｌ ｐＨ
８．０、４mg／ml リゾチーム）、２００μｌのアルカ
リ液（０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）、１５０μｌ
の５Ｍ 酢酸カリウム溶液（ｐＨ４．８）を順次加えた
後、１５０００回転で１０分間遠心して上清を回収し
た。上清をフェノール／クロロホルムで抽出後、エタノ
ール沈殿と８０％エタノールリンス及び乾燥をしてプラ
スミドＤＮＡを精製した。これを５０μｇ／ml ＲＮas
e Ａを含むＴＥ２０μｌに溶かし、そのうち５μｌを H
indIIIで切断した。切断後反応液を０．８％アガロース
中で電気泳動したところ、約８kbの挿入断片が確認でき
たので、これを切り出し、透析チューブを用いてＤＮＡ
を精製した。一方マルチクローニングサイトにある Hin
dIIIサイトで同酵素で切断したプラスミドＤＮＡｐＵＣ
１１９を用意し、ライゲーションキット（宝酒造社）を
用いて精製ＤＮＡとライゲーションさせた。この組換え
プラスミドでＪＭ１０９コンピテントセルをトランスフ
ォーメーションし、５０μｇ／mlのアンピシリンを含む
Ｌブロスプレート上でコロニーを形成させた後、幾つか
のコロニーから再びアルカリ法によりプラスミドを精
製、回収した。こうして構築したプラスミドは、８kbの
ＨＰＶＤＮＡ挿入断片が各々逆向きにサブクローニング
された２種類があることが予想された。実際、 HindIII
で切断したときは８kbの挿入断片が切り出されるが、Ba
mHＩで切断したとき、一方は約１．４kbの断片が、もう
一方は約６．６kbの断片が切り出されてくる場合があっ
た。そこでBamHＩで約１．４kbが切り出されてくるプラ
スミドをｐＨＰＶ−Sapporo 、６．６kbが切り出されて
くるプラスミドをｐＨＰＶ−Sapporo −Ｒと命名した。
制限酵素切断地図の作製については、例えばＰｓｔＩの
切断位置は次のように決めた。ｐＨＰＶ−Sapporo をＰ
stＩで切断すると１．２kb、４．７kb、５．２kbの３本
のＤＮＡフラグメントに分かれる。ｐＵＣ１１９自身は
ＰstＩ切断点をマルチクローニングサイトに一か所持つ
ので、ＨＰＶＤＮＡ自身は２か所のＰstＩサイトを持つ
ことが予想される。また３本のフラグメントのうち一つ
が、ｐＵＣ１１９ＤＮＡほぼすべてとＨＰＶＤＮＡの一
部をつながったものであることが予想される。一方、ｐ
ＨＰＶ−Sapporo −ＲをＰstＩで切断すると２．１kb、
４．３kb、４．７kbの３本のＤＮＡフラグメントに分か
れる。このようにどちらのプラスミドからも４．７kbフ
ラグメントが切り出されているので、これはＨＰＶＤＮ
Ａ内部から切り出され、プラスミドＤＮＡを含まないこ
とが分かる。こうした予想から、この２種のプラスミド
内のＰstＩの切断位置は一通りのみが考えられる。この
ようにして幾つかの制限酵素について切断地図を作製し
た（図１）。またこのＨＰＶＤＮＡはＨpaＩ、ＳalＩ、
ＳmaＩ、ＸhoＩの認識部位を持たないこともわかった。
この切断地図と、従来既にクローニングされて論文に発
表されている６０種近いＨＰＶＤＮＡの切断地図を比較
した結果、このＨＰＶは既に発表されているどのＨＰＶ
にも当てはまらないことが判明した。したがってこのＨ
ＰＶは、新しい遺伝子型である。また、実施例２の表４
に示した未同定のＨＰＶ４種はすべて同じ制限酵素地図
を有し、同じタイプであった。(3-2) Cloned HPV DNA
Subcloning of pUC119 to the pUC119HindIII site and the restriction enzyme cleavage map (3-1), the colony finally isolated was 50 μg /
After culturing with shaking in 5 ml of broth liquid medium containing ml ampicillin at 37 ° C. overnight, a plasmid was prepared by the following procedure using the alkaline method. First, add 1.5 ml of culture solution to 15,000
The cells were collected by centrifugation for 1 minute by rotation. 10 to this fungus body
0 μl glucose-lysozyme solution (50 mM glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris · HCl pH
8.0, 4 mg / ml lysozyme), 200 μl of alkaline solution (0.2 N NaOH, 1% SDS), 150 μl
5M potassium acetate solution (pH 4.8) was sequentially added and then centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes to collect the supernatant. After the supernatant was extracted with phenol / chloroform, ethanol precipitation, 80% ethanol rinse and drying were performed to purify the plasmid DNA. 50 μg / ml RNas
Dissolve in 20 μl of TE containing eA, and add 5 μl of it to H
It cut with indIII. After cleavage, the reaction mixture was electrophoresed in 0.8% agarose, and an insert fragment of approximately 8 kb was confirmed.
Was purified. On the other hand, Hin at the multi-cloning site
Plasmid DNA pUC cleaved with the same enzyme at the dIII site
119 was prepared and ligated with purified DNA using a ligation kit (Takara Shuzo). JM109 competent cells were transformed with this recombinant plasmid to form colonies on an L broth plate containing 50 μg / ml of ampicillin, and then the plasmid was purified and recovered from some colonies by the alkaline method. It was expected that there were two types of plasmids thus constructed, in which the HPV DNA insert of 8 kb was subcloned in the opposite direction. In fact, HindIII
The 8 kb insert is cut out when digested with
When cleaved with mHI, a fragment of about 1.4 kb might be cut out on one side and a fragment of about 6.6 kb on the other side. Therefore, a plasmid from which about 1.4 kb was excised with BamHI was named pHPV-Sapporo, and a plasmid from which 6.6 kb was excised was named pHPV-Sapporo-R.
Regarding the construction of the restriction enzyme digestion map, for example, the digestion position of PstI was determined as follows. pH PV-Sapporo to P
When cleaved with stI, it is divided into three DNA fragments of 1.2 kb, 4.7 kb and 5.2 kb. Since pUC119 itself has one PstI cleavage point at the multicloning site, it is expected that HPV DNA itself has two PstI sites. In addition, it is expected that one of the three fragments connects almost all of pUC119 DNA and part of HPV DNA. On the other hand, p
When HPV-Sapporo-R was cut with PstI, 2.1 kb,
It is divided into three DNA fragments of 4.3 kb and 4.7 kb. Thus, the 4.7 kb fragment was excised from both plasmids.
It can be seen that it was cut out from inside A and contained no plasmid DNA. From these predictions, it is considered that there is only one cleavage position of PstI in these two types of plasmids. In this way, cleavage maps were prepared for several restriction enzymes (Fig. 1). Also, this HPV DNA contains HpaI, SalI,
It was also found that it has no recognition site for SmaI or XhoI.
As a result of comparing this cleavage map with the cleavage maps of nearly 60 types of HPV DNA that have been cloned and published in the paper, this HPV is the same as any previously published HPV.
It turns out that this is not the case. Therefore, this H
PV is a new genotype. In addition, Table 4 of Example 2
All of the unidentified HPV4 species shown in 3) had the same restriction map and were of the same type.

【００４５】（３−３） クローン化したＨＰＶＤＮＡ
Ｅ６及びＥ７領域の塩基配列の決定 図１に示した制限酵素地図において、１．２kbのＰstＩ
断片にＥ６及びＥ７領域が含まれると予想された。そこ
で（３−２）で得られたプラスミドｐＨＰＶ−Sapporo
をＰstＩ及び HindIIIで切断し、得られた１．２kbの断
片を（３−２）に示した方法と同様にＭ１３ｍｐ１９Ｒ
ＦＤＮＡのＰstＩ及び HindIII部位にサブクローニング
した。このプラスミドから、ヘニコフの方法〔ヘニコフ
Ｓ. (Henikoff, Ｓ )、ジーン( Gene )、第２８巻、
第３５１頁（１９８４）〕に従い、キロシークエンス用
デレーションキット（宝酒造社）を用いて、挿入断片の
３′末端から様々の長さのＤＮＡが欠失した変異体を作
製した。まずこのプラスミドを（３−２）と同様にアル
カリ法で精製した後、その１０μｇをＫpnＩとＸbaＩで
同時に切断した。これをフェノール／クロロホルム抽
出、エタノール沈殿、８０％エタノールリンスと乾燥を
して精製した。これをキット中のＥxoIII バッファー１
００μｌに溶かし、ＥxoIII ヌクレアーゼ１μｌを加え
２５℃で反応した。反応開始後、３０秒ごとにあらかじ
め用意したキット中のマングビーンバッファー１００μ
ｌに１０μｌずつ移し、５分後に全量を移し終えて反応
液全量は２００μｌとなった。これを６５℃５分熱処理
してＥxoIII ヌクレアーゼを失活させたあと、マングビ
ーンヌクレアーゼ２μｌを加え、３７℃６０分反応させ
ＤＮＡの末端を平滑化した。この液のＤＮＡをもう一度
精製後、キット中のクレノウバッファー５０μｌに溶か
し、クレノウ酵素１μｌを加え３７℃１５分反応し、再
度ＤＮＡを精製した。このＤＮＡを２０μｌのＴＥバッ
ファーに溶かし、ライゲーションキットＡ液１００μｌ
とＢ液２０μｌを添加し、１６℃で一晩反応を行った。
このＤＮＡを再び精製後、ＸbaＩ数ユニットで３７℃１
時間反応させた。反応液全量３０μｌはＪＭ１０９コン
ピテントセル２００μｌにトランスフォーメーション
し、プレート上でプラークを形成させた。現れたプラー
クのうち任意の３２個を指示菌の入った２×ＹＴ培地に
植え継ぎ、３７℃で５時間振とう培養した。培養液の上
清と菌体を分離し、菌体からアルカリ法でプラスミドを
精製した。これをＥcoＲＩ−ＰstＩで切断し反応液の一
部をアガロース電気泳動することにより、挿入断片の長
さを確認した。この結果、本来の挿入断片約１．２kbの
３′末端から約１００bp〜１０００bpが欠失した、いろ
いろな長さの挿入断片を持つプラスミドが得られた。そ
こでこのうち適当なクローンを幾つか選んで、それら培
養液上清より一本鎖ＤＮＡを精製し、Ｍ１３シークエン
スキット（宝酒造社）を用いて塩基配列の解読を行っ
た。こうして、配列表の配列番号３６に示される図１の
１．２kbのＰstＩ切断フラグメント中の、約１kbの塩基
配列が決定できた。この配列をＤＮＡＳＩＳ（宝酒造
社）で解析した結果、ＨＰＶ１６ＤＮＡあるいはＨＰＶ
３１ＤＮＡのＥ６とＥ７領域の配列と非常にホモロジー
が高いことがわかり、確かにＥ６とＥ７領域をシークエ
ンシングしたことが確かめられた。また、従来報告され
ているＨＰＶのＥ６及びＥ７領域とは完全に一致するも
のはなく、この未同定ＨＰＶは新しい遺伝子型であっ
た。この新しい遺伝子型を有するＨＰＶをＨＰＶ−sapp
oro と命名した。この配列をアミノ酸に翻訳したとこ
ろ、可能性のある３通りのオープンリーディングフレー
ムに対して、開始コドン（ＡＴＧ）や停止コドン（ＴＡ
Ａ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）、あるいはＨＰＶ１６のＥ６やＥ
７タンパクのアミノ酸配列との相関より、配列表の配列
番号３６に示すアミノ酸配列を決定した。この中には、
ＤＮＡ結合タンパクと相関を持つＣｙｓ−Ｃｙｓモチー
フやレチノブラストーマタンパク結合モチーフが、従来
のＨＰＶ１６やＨＰＶ３１のものと同様保存されてい
た。(3-3) Cloned HPV DNA
Determination of nucleotide sequences of E6 and E7 regions In the restriction enzyme map shown in FIG. 1, 1.2 kb PstI
The fragment was expected to contain the E6 and E7 regions. Then, the plasmid pHPV-Sapporo obtained in (3-2)
Was digested with PstI and HindIII, and the resulting 1.2 kb fragment was treated with M13mp19R in the same manner as in (3-2).
It was subcloned into the PstI and HindIII sites of FDNA. From this plasmid, the method of Henikov [Henikoff, S, Gene, Volume 28,
Pp. 351 (1984)], using a deletion kit for kilosequencing (Takara Shuzo), mutants in which DNAs of various lengths were deleted from the 3'end of the insert were prepared. First, this plasmid was purified by the alkaline method in the same manner as in (3-2), and 10 μg thereof was simultaneously digested with KpnI and XbaI. This was purified by phenol / chloroform extraction, ethanol precipitation, 80% ethanol rinse and drying. This is ExoIII buffer 1 in the kit
It was dissolved in 00 μl, 1 μl of ExoIII nuclease was added, and the mixture was reacted at 25 ° C. Every 30 seconds after starting the reaction, 100 μ of mung bean buffer in the kit prepared in advance.
10 μl each was transferred to 1 liter, and after 5 minutes, the transfer of the total amount was completed, and the total amount of the reaction solution was 200 μl. This was heat-treated at 65 ° C. for 5 minutes to inactivate the ExoIII nuclease, 2 μl of mung bean nuclease was added, and the reaction was carried out at 37 ° C. for 60 minutes to blunt the ends of the DNA. The DNA of this solution was purified once again, dissolved in 50 μl of Klenow buffer in the kit, added with 1 μl of Klenow enzyme and reacted at 37 ° C. for 15 minutes to again purify the DNA. This DNA was dissolved in 20 μl of TE buffer and ligation kit A solution 100 μl
And 20 μl of solution B were added and reacted at 16 ° C. overnight.
After the DNA was purified again, it was mixed with several units of XbaI at 37 ° C for 1 hour.
Reacted for hours. A total volume of 30 μl of the reaction solution was transformed into 200 μl of JM109 competent cells to form plaques on the plate. Arbitrary 32 of the appearing plaques were subcultured in a 2 × YT medium containing the indicator bacterium and shake-cultured at 37 ° C. for 5 hours. The supernatant of the culture solution and the cells were separated, and the plasmid was purified from the cells by the alkaline method. This was cleaved with EcoRI-PstI and a part of the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis to confirm the length of the inserted fragment. As a result, plasmids having insert fragments of various lengths were obtained in which about 100 bp to 1000 bp were deleted from the 3'end of the original insert fragment of about 1.2 kb. Therefore, some suitable clones were selected from these, single-stranded DNA was purified from the culture supernatants, and the nucleotide sequence was decoded using M13 Sequence Kit (Takara Shuzo). In this way, the base sequence of about 1 kb in the 1.2 kb PstI digested fragment shown in SEQ ID NO: 36 of FIG. 1 could be determined. Analysis of this sequence by DNASIS (Takara Shuzo) showed that HPV16 DNA or HPV
It was found that the E6 and E7 regions of 31 DNA have very high homology, and it was confirmed that the E6 and E7 regions were sequenced. Further, there was no perfect match with the E6 and E7 regions of HPV reported so far, and this unidentified HPV had a new genotype. HPV with this new genotype is transformed into HPV-sapp
I named it oro. When this sequence was translated into amino acids, the start codon (ATG) and stop codon (TA) were identified for the three possible open reading frames.
A, TAG, TGA), or HPV16 E6 or E
The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 in the sequence listing was determined by correlation with the amino acid sequence of 7 protein. In this,
The Cys-Cys motif and the retinoblastoma protein binding motif having a correlation with the DNA binding protein were conserved as in the conventional HPV16 and HPV31.

【００４６】実施例４ ＨＰＶ−Sapporo のＰＣＲ法に
よる検出 （４−１） 共通プライマーを用いた２重ＰＣＲによる
増幅と制限酵素切断パターンによるタイピング （３−２）でクローニングしたプラスミドｐＨＰＶ−Sa
pporo １ngを（１−７）と同様にプライマーｐ１６−１
とｐＵ−２ＲあるいはｐＵ−ＯとｐＵ−２Ｒを用いて３
０サイクルの１次ＰＣＲを行った。次に１次ＰＣＲの反
応液０．５μｌをプライマーｐＵ−１ＭとｐＵ−２Ｒを
用いて１５サイクルの２次ＰＣＲを行い、２３２bpの増
幅断片を得た。この増幅断片を制限酵素ＡvaＩにより切
断した結果、１８６bpと４６bpの切断パターンが得られ
た。ＡvaＩによる切断は、ｐＨＰＶ１６、１８、３１、
３３、５２ｂ、及び５８の増幅断片には認められなかっ
た。したがって、ＡvaＩによる切断によりＨＰＶ−Sapp
oro を同定することができた。Example 4 Detection of HPV-Sapporo by PCR method (4-1) Amplification by double PCR using common primers and typing by restriction enzyme cleavage pattern (3-2) Plasmid pHPV-Sa cloned
1 ng of pporo was added to primer p16-1 as in (1-7)
And pU-2R or pU-O and pU-2R
0 cycles of primary PCR was performed. Next, 0.5 μl of the reaction solution of the primary PCR was subjected to 15 cycles of secondary PCR using the primers pU-1M and pU-2R to obtain an amplified fragment of 232 bp. As a result of digesting this amplified fragment with the restriction enzyme AvaI, digestion patterns of 186 bp and 46 bp were obtained. Cleavage with AvaI is pHPV16, 18, 31,
It was not found in the amplified fragments of 33, 52b, and 58. Therefore, HPV-Sapp can be digested with AvaI.
We were able to identify oro.

【００４７】（４−２） 型特異的オリゴヌクレオチド
プローブを用いたドットハイブリダイゼーションによる
タイピング プライマーｐＵ−１ＭとｐＵ−２Ｒによる増幅領域内
に、配列表の配列番号３７に示すＨＰＶ−Sapporo に特
異的なプローブｐＳＢ−Ｓを実施例（１−１）と同様の
方法で作製した。（４−１）で得た２次ＰＣＲの増幅断
片を（１−６）と同様の方法で、該ｐＳＢ−Ｓを用いて
ドットハイブリダイゼーションを行った。その結果、ｐ
ＨＰＶ−Sapporo のみにドットが現われ、ｐＨＰＶ１
６、１８、３１、３３、５２ｂ、５８からの増幅断片に
はドットが現れなかった。したがって、ｐＳＢ−Ｓプロ
ーブを用いたドットハイブリダイゼーションにより、Ｈ
ＰＶ−Sapporo を特異的に検出することができた。(4-2) Typing by dot hybridization using type-specific oligonucleotide probe Within the amplification region of primers pU-1M and pU-2R, specific to HPV-Sapporo shown in SEQ ID NO: 37 of the sequence listing. The different probe pSB-S was prepared in the same manner as in Example (1-1). The amplified fragment of the secondary PCR obtained in (4-1) was subjected to dot hybridization using the pSB-S in the same manner as in (1-6). As a result, p
Dots appear only in HPV-Sapporo, and pHPV1
No dots appeared in the amplified fragments from 6, 18, 31, 33, 52b, 58. Therefore, by dot hybridization using the pSB-S probe, H
It was possible to specifically detect PV-Sapporo.

【００４８】（４−３） ＨＰＶ１０１の特異的増幅と
検出 （３−３）で明らかにしたＨＰＶ−Sapporo のＥ６及び
Ｅ７領域の塩基配列からＨＰＶ−Sapporo に特異的な領
域を用いてオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマー
を設定すれば、ＨＰＶ−Sapporo をＰＣＲ法を用いて特
異的に増幅し、特異的なプローブにより高感度に検出す
ることができる。例えば、配列表の配列番号３８及び配
列番号３９に示したプライマー対ｐＳ−１及びｐＳ−２
Ｒを実施例（１−１）と同様に合成し、次にこれらを用
いて（１−２）と同様に増幅を行い、ＨＰＶ−Sapporo
の１４２bpの領域を増幅することができた。また、配列
表の配列番号４０に示すプローブｐＢＳ−１を同様に合
成し、これを用いて（１−６）と同様にドットハイブリ
ダイゼーションを行い、ＨＰＶ−Sapporo を特異的に検
出することができた。ｐＨＰＶ１６、１８、３１、３
３、５２ｂ、５８ではプライマー対ｐＳ−１及びｐＳ−
２Ｒを用いても増幅は認められず、プローブｐＢＳ−１
を用いたドットハイブリダイゼーションでもドットは認
められなかった。(4-3) Specific amplification and detection of HPV101 Oligonucleotide probe using a region specific to HPV-Sapporo from the nucleotide sequences of E6 and E7 regions of HPV-Sapporo revealed in (3-3) By setting the and primers, HPV-Sapporo can be specifically amplified using the PCR method, and can be detected with high sensitivity using a specific probe. For example, the primer pairs pS-1 and pS-2 shown in SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39 of the sequence listing.
R was synthesized in the same manner as in Example (1-1), and then these were used for amplification in the same manner as in (1-2) to give HPV-Sapporo.
The region of 142 bp was able to be amplified. Further, the probe pBS-1 shown in SEQ ID NO: 40 in the sequence listing can be synthesized in the same manner, and dot hybridization can be carried out in the same manner as in (1-6) to detect HPV-Sapporo specifically. It was pHPV16, 18, 31, 3
3, 52b and 58, primer pairs pS-1 and pS-
No amplification was observed using 2R, and the probe pBS-1
No dots were observed in the dot hybridization using the.

【００４９】実施例５ ＨＰＶ増幅・検出用キットの作
成 試料中のＨＰＶを増幅、検出するためのキットを作成し
た（表６及び表７）。１次ＰＣＲ増幅用プライマーとし
てｐＵ−Ｏ及びｐＵ−２Ｒが各２０μＭ溶液となるよう
にＴＥバッファーに溶解し、１次ＰＣＲプライマー液
（Ａ剤）とした。同様に、プライマーｐＵ−１Ｍ及びｐ
Ｕ−２Ｒを含む２次ＰＣＲ悪性型ＨＰＶプライマー液
（Ｂ剤）、プライマーｐＵ−３１Ｂ及びｐＵ−２Ｒを含
む２次ＰＣＲ良性型ＨＰＶプライマー液（Ｃ剤）を作成
した。ＤＮＡ検出用プローブとして、ｐＢＵ−１及びｐ
ＢＵ−２が各１０μＭ溶液となるようにＴＥバッファー
に溶解し、悪性型ＨＰＶ検出用プローブ液（Ｄ剤）とし
た。同様に、プローブｐＢＵ−３を含む良性型ＨＰＶ検
出用プローブ液（Ｅ剤）、ｐＳＢ−１６を含む悪性型Ｈ
ＰＶ１６型特異的プローブ液（Ｆ剤）、ｐＳＢ−１８を
含む悪性型ＨＰＶ１８型特異的プローブ液（Ｇ剤）、ｐ
ＳＢ−３１を含む悪性型ＨＰＶ３１型特異的プローブ液
（Ｈ剤）、ｐＳＢ−３３を含む悪性型ＨＰＶ３３型特異
的プローブ液（Ｉ剤）、ｐＳＢ−Ｓを含む悪性型ＨＰＶ
−Sapporo 型特異的プローブ液（Ｊ剤）を作成した。ま
た、増幅断片を制限酵素の切断パターンによりＨＰＶの
タイピングを行うために、タイピング用制限酵素ＡvaII
液（Ｋ剤）、ＲsaＩ液（Ｌ剤）、ＢglII液（Ｍ剤）、Ａ
ccＩ液（Ｎ剤）、ＡvaＩ液（Ｏ剤）を作成した。本キッ
トを用いて、実施例１、２及び４と同様にＨＰＶを増幅
・検出することができた。Example 5 Preparation of HPV amplification / detection kit A kit for amplifying and detecting HPV in a sample was prepared (Table 6 and Table 7). As primers for primary PCR amplification, pU-O and pU-2R were dissolved in a TE buffer so that each solution was a 20 μM solution to obtain a primary PCR primer solution (agent A). Similarly, primers pU-1M and p
A secondary PCR malignant HPV primer solution containing U-2R (agent B) and a secondary PCR benign HPV primer solution containing agent pU-31B and pU-2R (agent C) were prepared. As a probe for detecting DNA, pBU-1 and p
BU-2 was dissolved in TE buffer so that each solution was 10 μM to prepare a malignant HPV detection probe solution (D agent). Similarly, a benign HPV detection probe solution (E agent) containing the probe pBU-3, and a malignant H containing pSB-16
PV16 type specific probe solution (F agent), malignant HPV18 type specific probe solution containing pSB-18 (G agent), p
Malignant HPV31 type specific probe solution containing SB-31 (H agent), Malignant HPV33 type specific probe solution containing pSB-33 (I agent), Malignant HPV containing pSB-S
-A Sapporo type specific probe solution (agent J) was prepared. Further, in order to perform HPV typing on the amplified fragment according to the restriction enzyme cleavage pattern, the restriction enzyme AvaII for typing is used.
Solution (K agent), RsaI solution (L agent), BglII solution (M agent), A
A ccI solution (N agent) and an AvaI solution (O agent) were prepared. Using this kit, HPV could be amplified and detected in the same manner as in Examples 1, 2 and 4.

【００５０】[0050]

【表６】 表 ６ ＨＰＶ増幅・検出キット ───────────────────────────────── Ａ剤 １次ＰＣＲプライマー液 ２０μｌ ２０μＭ ｐＵ−Ｏ （１μｌ×２０回） ２０μＭ ｐＵ−２Ｒ Ｂ剤 ２次ＰＣＲ悪性型ＨＰＶプライマー液 ２０μＭ ｐＵ−１Ｍ ２０μｌ ２０μＭ ｐＵ−２Ｒ （１μｌ×２０回） Ｃ剤 ２次ＰＣＲ良性型ＨＰＶプライマー液 ２０μＭ ｐＵ−３１Ｂ ２０μｌ ２０μＭ ｐＵ−２Ｒ （１μｌ×２０回） Ｄ剤 悪性型ＨＰＶ検出用プローブ液 １０μＭ ｐＢＵ−１ ２０μｌ １０μＭ ｐＢＵ−２ （１μｌ×２０回） Ｅ剤 良性型ＨＰＶ検出用プローブ液 １０μＭ ｐＢＵ−３ ２０μｌ （１μｌ×２０回） Ｆ剤 悪性型ＨＰＶ１６型特異的プローブ液 １０μＭ ｐＳＢ−１６ ２０μｌ （１μｌ×２０回）[Table 6] Table 6 HPV Amplification / Detection Kit ────────────────────────────────── Agent A Primary PCR primer Liquid 20 μl 20 μM pU-O (1 μl × 20 times) 20 μM pU-2R B agent Second PCR malignant HPV primer liquid 20 μM pU-1M 20 μl 20 μM pU-2R (1 μl × 20 times) C agent Second PCR benign HPV primer Liquid 20 μM pU-31B 20 μl 20 μM pU-2R (1 μl × 20 times) D agent Malignant HPV detection probe liquid 10 μM pBU-1 20 μl 10 μM pBU-2 (1 μl × 20 times) E agent Benign HPV detection probe liquid 10 μM pBU-3 20 μl (1 μl × 20 times) F agent Malignant HPV16 type specific probe solution 10 μM pSB-16 20 μl (1 μl × 20 times)

【００５１】[0051]

【表７】 表 ７ ＨＰＶ増幅・検出キット ─────────────────────────────────── Ｇ剤 悪性型ＨＰＶ１８型特異的プローブ液 １０μＭ ｐＳＢ−１８ ２０μｌ （１μｌ×２０回） Ｈ剤 悪性型ＨＰＶ３１型特異的プローブ液 １０μＭ ｐＳＢ−３１ ２０μｌ （１μｌ×２０回） Ｉ剤 悪性型ＨＰＶ３３型特異的プローブ液 １０μＭ ｐＳＢ−３３ ２０μｌ （１μｌ×２０回） Ｊ剤 悪性型ＨＰＶ−Sapporo 型特異的プローブ液 １０μＭ ｐＳＢ−Ｓ ２０μｌ （１μｌ×２０回） Ｋ剤 タイピング用制限酵素ＡvaII液 １０ユニット／μｌ １０μｌ（０．５μｌ×２０回） Ｌ剤 タイピング用制限酵素ＲsaＩ液 １０ユニット／μｌ １０μｌ（０．５μｌ×２０回） Ｍ剤 タイピング用制限酵素ＢglII液 １０ユニット／μｌ １０μｌ（０．５μｌ×２０回） Ｎ剤 タイピング用制限酵素ＡccＩ液 １０ユニット／μｌ １０μｌ（０．５μｌ×２０回） Ｏ剤 タイピング用制限酵素ＡvaＩ液 １０ユニット／μｌ １０μｌ（０．５μｌ×２０回）[Table 7] Table 7 HPV amplification / detection kit ──────────────────────────────────── G agent Malignant type HPV18-type specific probe solution 10 μM pSB-18 20 μl (1 μl × 20 times) H agent Malignant HPV31 type-specific probe solution 10 μM pSB-31 20 μl (1 μl × 20 times) I-agent Malignant HPV33-type specific probe solution 10 μM pSB -33 20 μl (1 μl × 20 times) J agent Malignant HPV-Sapporo type specific probe solution 10 μM pSB-S 20 μl (1 μl × 20 times) K agent Typing restriction enzyme AvaII solution 10 units / μl 10 μl (0.5 μl ×) 20 times) L agent Typing restriction enzyme RsaI solution 10 units / μl 10 μl (0.5 μl × 20 times) M agent Typing restriction enzyme BglII solution 10 units / μl 10 μl 0.5 [mu] l × 20 times) N agents Typing for restriction enzyme AccI solution 10 units / μl 10μl (0.5μl × 20 times) for O agent typing restriction enzyme AvaI solution 10 units / μl 10μl (0.5μl × 20 times)

【００５２】[0052]

【発明の効果】以上詳細に説明した様に、本発明によ
り、良性型及び／又は悪性型ＨＰＶに共通な遺伝子領域
が見出され、この領域の遺伝子配列を検出することによ
り、試料中の良性型及び／又は悪性型ＨＰＶの簡便かつ
高感度な検出方法が提供された。また、各ＨＰＶ型に特
異的なプローブを用いるハイブリダイゼーションや制限
酵素処理によって、各ＨＰＶのタイピングを簡便に行う
ことが可能となった。INDUSTRIAL APPLICABILITY As described in detail above, according to the present invention, a gene region common to benign and / or malignant HPVs was found, and by detecting the gene sequence in this region, a benign specimen A simple and highly sensitive method for detecting type and / or malignant HPV has been provided. In addition, it became possible to easily type each HPV by hybridization using a probe specific to each HPV type or treatment with a restriction enzyme.

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ATAGGAGGGACCGAAAACGGT 21 配列番号：2 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：TGCTAATTCGGTGCTACCTG 20 配列番号：3 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：CCTACACTGCTGGACAACAT 20 配列番号：4 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：GAGCAATTAGTAGACAGCTC 20 配列番号：5 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：AGAGGAGGGACCGAAAACGGT 21 配列番号：6 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：TGTTAATTCGTTGTTACCTG 20 配列番号：7 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：CTTACACTGCTGGACAACAT 20 配列番号：8 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：GAGCAATTAGAAGACAGCTC 20 配列番号：9 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：AAGGGCGTAACCGAAATCGGT 21 配列番号：10 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：TGTCAAAAGCCACTGTGTCC 20 配列番号：11 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：TTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCT 29 配列番号：12 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：GAGCAATTAAATGACAGCTC 20 配列番号：13 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：AAGGGAGTAACCGAAAACGGT 21 配列番号：14 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：TGCCAGAAACCGTTGAATCC 20 配列番号：15 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：GAGCAATTAAGCGACTCAGA 20 配列番号：16 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：TAGGGAGTGACCGAAAGTGGT 21 配列番号：17 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：TGTCAAAGACCGTTGTGTCC 20 配列番号：18 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：TTAGATTTGCAACCTGAGGCAACTGACCT 29 配列番号：19 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：GAGCAATTACCCGACAGCTC 20 配列番号：20 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：TAGGGTGTAACCGAAAGCGGT 21 配列番号：21 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：TGTCAAAGACCTTTGTGTCC 20 配列番号：22 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：TTAGATTTATATCCTGAACCAACTGACCT 29 配列番号：23 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：GAGCAATTAAGTGACAGCTC 20 配列番号：24 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：AGGGAGTGACCGAAAACGGT 20 配列番号：25 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：AAGGGCGTAACCGAAATCGGT 21 配列番号：26 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：TGCTAATTCGGTGCTACCTG 20 配列番号：27 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：TGTCAAAAACCGTTGTGTCC 20 配列番号：28 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：GAGCTGTCGCTTAATTGCTC 20 配列番号：29 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：１９番目のＮはｉ（イノシン） 配列：TTAGATTTRCAWCCTGARNCAACTGACCT 29 配列番号：30 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：GAGCCCCAAAATGAAATTCCGGTTGACCT 29 配列番号：31 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：CCTACACTGCTGGACAACAT 20 配列番号：32 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：CAGATCATCAAGAACACGTA 20 配列番号：33 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：AACCGAGCACGACAGGAACG 20 配列番号：34 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：GAGAAGACCTCGTACTGAAA 20 配列番号：35 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：CTGCACTGTGACGTGTAAAA 20 配列番号：36 配列の長さ：1023 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴： 250-696 E CDS （Ｅ６領域） 702-998 E CDS （Ｅ７領域） 337-348 S Cys-Cys モチーフ 436-447 S Cys-Cys モチーフ 876-887 S Cys-Cys モチーフ 975-986 S Cys-Cys モチーフ 762-815 S レチノブラストーマ蛋白結合モチーフ 配列： TCCTGCCAAC TTTAAGTTGA AACATGCATG TAAAACATTA CTCACTGTAT TACACATTGT 60 TATATGCACA CAGGTGTGTC CAACCGATTT GGATTACAGT TTTATAAGCA TTTCTTTTTA 120 TTATAGTTAG TAACAATTAT CCCTATAAAA AAAACAGGGA GTGACCGAAA ACGGTCGTAC 180 CGAAAACGGT TGCCATAAAA GCAGAAGTGC ACAAAAAAGC AGAAGTGGAC AGACATTGTA 240 AGGTGCGGT 249 ATG TTT CAG GAC CCA GCC GAA AGA CCC TAC AAA CTG CAT GAT TTG 294 Met Phe Gln Asp Pro Ala Glu Arg Pro Tyr Lys Leu His Asp Leu 1 5 10 15 TGC AAC GAG GTA GAA GAA AGC ATC CAT GAA ATT TGT TTG AAT TGT 339 Cys Asn Glu Val Glu Glu Ser Ile His Glu Ile Cys Leu Asn Cys 20 25 30 GTA TAC TGC AAA CAA GAA TTA CAG CGG AGT GAG GTA TAT GAC TTT 384 Val Tyr Cys Lys Gln Glu Leu Gln Arg Ser Glu Val Tyr Asp Phe 35 40 45 GCA TGC TAT GAT TTG TGT ATA GTA TAT AGA GAA GGC CAG CCA TAT 429 Ala Cys Tyr Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Glu Gly Gln Pro Tyr 50 55 60 GGA GTT TGC ATG AAA TGT TTA AAA TTT TAT TCA AAA ATA AGT GAA 474 Gly Val Cys Met Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu 65 70 75 TAT AGA CGG TAT AGA TAT AGT GTG TAT GGA GAA ACG TTA GAA AAA 519 Tyr Arg Arg Tyr Arg Tyr Ser Val Tyr Gly Glu Thr Leu Glu Lys 80 85 90 CAA TGC AAC AAA CAG TTA TGT CAT TTA TTA ATT AGG TGT ATT ACA 564 Gln Cys Asn Lys Gln Leu Cys His Leu Leu Ile Arg Cys Ile Thr 95 100 105 TGT CAA AAA CCG CTG TGT CCA GTT GAA AAG CAA AGA CAT TTA GAA 609 Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Val Glu Lys Gln Arg His Leu Glu 110 115 120 GAA AAA AAA CGA TTC CAT AAC ATC GGT GGA CGG TGG ACA GGT CGG 654 Glu Lys Lys Arg Phe His Asn Ile Gly Gly Arg Trp Thr Gly Arg 125 130 135 TGT ATG TCC TGT TGG AAA CCA ACA CGT AGA GAA ACC GAG GTG TAATC 701 Cys Met Ser Cys Trp Lys Pro Thr Arg Arg Glu Thr Glu Val 140 145 ATG CAT GGA GAA ATA ACT ACA TTG CAA GAC TAT GTT TTA GAT TTG 746 Met His Gly Glu Ile Thr Thr Leu Gln Asp Tyr Val Leu Asp Leu 1 5 10 15 GAA CCC GAG GCA ACT GAC CTA TAC TGT TAT GAG CAA TTG TGT GAC 791 Glu Pro Glu Ala Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Cys Asp 20 25 30 AGC TCA GAG GAG GAG GAA GAT ACT ATT GAC GGT CCA GCT GGA CAA 836 Ser Ser Glu Glu Glu Glu Asp Thr Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln 35 40 45 GCA AAA CCA GAC ACC TCC AAT TAT AAT ATT GTA ACG TCC TGT TGT 881 Ala Lys Pro Asp Thr Ser Asn Tyr Asn Ile Val Thr Ser Cys Cys 50 55 60 AAA TGT GAG GCG ACA CTA CGT CTG TGT GTA CAG AGC ACA CAC ATT 926 Lys Cys Glu Ala Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Ile 65 70 75 GAC ATA CGT AAA TTG GAA GAT TTA TTA ATG GGC ACA TTT GGA ATA 971 Asp Ile Arg Lys Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Phe Gly Ile 80 85 90 GTG TGC CCC GGC TGT TCA CAG AGA GCA TAATCTACAA TGGCTGATCC TGCAG 1023 Val Cys Pro Gly Cys Ser Gln Arg Ala 95 配列番号：37 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：GTTGGAAACCAACACGTAG 19 配列番号：38 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：AACGGTCGTACCGAAAACGGT 21 配列番号：39 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：TCTTCTACCTCGTTGCACA 19 配列番号：40 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：AAGTGGACAGACATTGTAAGGTGCGGT 27[Sequence Listing] SEQ ID NO: 1 Sequence Length: 21 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Other Nucleic Acid (Synthetic DNA) Sequence: ATAGGAGGGACCGAAAACGGT 21 SEQ ID NO: 2 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: 1 Strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: TGCTAATTCGGTGCTACCTG 20 SEQ ID NO: 3 Sequence length: 20 Sequence Type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: CCTACACTGCTGGACAACAT 20 SEQ ID NO: 4 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: 1 Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: GAGCAATTAGTAGACAGCTC 20 SEQ ID NO: 5 Sequence length: 21 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear sequence Type: other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: AGAGGAGGGACCGAAAACGGT 21 sequence No .: 6 Sequence Length: 20 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Other Nucleic Acid (Synthetic DNA) Sequence: TGTTAATTCGTTGTTACCTG 20 SEQ ID NO: 7 Sequence Length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: CTTACACTGCTGGACAACAT 20 SEQ ID NO: 8 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number: 1 strand Topology: linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: GAGCAATTAGAAGACAGCTC 20 SEQ ID NO: 9 Sequence length: 21 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: 1 strand Topology: direct Chain type of sequence: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: AAGGGCGTAACCGAAATCGGT 21 SEQ ID NO: 10 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: 1 strand Topology: Linear Sequence type: Other Nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: TGTCAAAAGCCACTGTGTCC 20 SEQ ID NO: 11 Sequence length : 29 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: TTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCT 29 SEQ ID NO: 12 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid strand Number of: 1 strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: GAGCAATTAAATGACAGCTC 20 SEQ ID NO: 13 Sequence length: 21 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: 1 strand Topology: Linear sequence type: other nucleic acid (synthetic DNA) sequence: AAGGGAGTAACCGAAAACGGT 21 SEQ ID NO: 14 sequence length: 20 sequence type: nucleic acid number of strands: 1 strand topology: linear sequence type: other Nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: TGCCAGAAACCGTTGAATCC 20 SEQ ID NO: 15 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: 1 strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: GAGCAATTAAGCGACTCAGA 20 SEQ ID NO: 16 Sequence length: 21 Column type: Nucleic acid Number of strands: 1 Strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: TAGGGAGTGACCGAAAGTGGT 21 SEQ ID NO: 17 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands : Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: TGTCAAAGACCGTTGTGTCC 20 SEQ ID NO: 18 Sequence length: 29 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Type Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: TTAGATTTGCAACCTGAGGCAACTGACCT 29 SEQ ID NO: 19 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: 1 strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (Synthetic DNA) Sequence: GAGCAATTACCCGACAGCTC 20 Sequence number: 20 Sequence length: 21 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: 1 strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (Synthetic DNA) Sequence: TAGGGTGTAACCGAAAGCGGT 21 SEQ ID NO: 21 Sequence length: 20 Sequence : Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: TGTCAAAGACCTTTGTGTCC 20 SEQ ID NO: 22 Sequence length: 29 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: 1 Chain Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: TTAGATTTATATCCTGAACCAACTGACCT 29 SEQ ID NO: 23 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: 1 strand Topology: Linear sequence Type: Other Nucleic Acid (Synthetic DNA) Sequence: GAGCAATTAAGTGACAGCTC 20 SEQ ID NO: 24 Sequence Length: 20 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Other Nucleic Acid (Synthetic DNA ) Sequence: AGGGAGTGACCGAAAACGGT 20 SEQ ID NO: 25 Sequence length: 21 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: 1 strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: AAGGGCGTAACCGAAATCGGT 21 SEQ ID NO: 26 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: 1 strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: TGCTAATTCGGTGCTACCTG 20 SEQ ID NO: 27 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand topology : Linear sequence type: other nucleic acid (synthetic DNA) sequence: TGTCAAAAACCGTTGTGTCC 20 SEQ ID NO: 28 sequence length: 20 sequence type: nucleic acid number of strands: 1 strand topology: linear sequence type: Other nucleic acids (synthetic DNA) Sequence: GAGCTGTCGCTTAATTGCTC 20 SEQ ID NO: 29 Sequence length: 29 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) sequence Features: 19th N is i (inosine) Sequence: TTAGATTTRCAWCCTGARNCAACTGACCT 29 SEQ ID NO: 30 Sequence length: 29 Sequence type: Nucleic acid Strand number: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (Synthetic DNA) Sequence: GAGCCCCAAAATGAAATTCCGGTTGACCT 29 Column number: 31 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: 1 Strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: CCTACACTGCTGGACAACAT 20 SEQ ID NO: 32 Sequence length : 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: CAGATCATCAAGAACACGTA 20 SEQ ID NO: 33 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid strand Number of: 1 strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: AACCGAGCACGACAGGAACG 20 SEQ ID NO: 34 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: 1 strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: GAGAAGACCTCGTACTGAAA 20 SEQ ID NO: 35 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: 1 strand Topology: Linear Sequence type: Other Nucleic acid (synthetic DNA) sequence: CTGCACTGTGACGTGTAAAA 20 SEQ ID NO: 36 Sequence length: 1023 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double stranded Topology: Linear Sequence type: Genomic DNA Sequence features: 250-696 E CDS (E6 region) 702-998 E CDS (E7 region) ) 337-348 S Cys-Cys motif 436-447 S Cys-Cys motif 876-887 S Cys-Cys motif 975-986 S Cys-Cys motif 762-815 S Retinoblastoma protein binding motif Sequence: TCCTGCCAAC TTTAAGTTGA AACATGCATG TAAAACATTA CTCACTGTAT TACACATTGT 60 TATATGCACA CAGGTGTGTC CAACCGATTT GGATTACAGT TTTATAAGCA TTTCTTTTTA 120 TTATAGTTAG TAACAATTAT CCCTATAAAA AAAACAGGGA GTGACCGAAA ACGGTCGTAC 180 CGAAAACGGT TGCCATAAAA GCAGAAGTGC ACAAAAAAGC AGAAGTGGAC AGACATTGTA 240 AGGTGCGGT 249 ATG TTT CAG GAC CCA GCC GAA AGA CCC TAC AAA CTG CAT GAT TTG 294 Met Phe Gln Asp Pro Ala Glu Arg Pro Tyr Lys Leu His Asp Leu 1 5 10 15 TGC AAC GAG GTA GAA GAA AGC ATC CAT GAA ATT TGT TTG AAT TGT 339 Cys Asn Glu Val Glu Glu Ser Ile His Glu Ile Cys Leu Asn Cys 20 25 30 GTA TAC TGC AAA CAA GAA TTA CAG CGG A GT GAG GTA TAT GAC TTT 384 Val Tyr Cys Lys Gln Glu Leu Gln Arg Ser Glu Val Tyr Asp Phe 35 40 45 GCA TGC TAT GAT TTG TGT ATA GTA TAT AGA GAA GGC CAG CCA TAT 429 Ala Cys Tyr Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Glu Gly Gln Pro Tyr 50 55 60 GGA GTT TGC ATG AAA TGT TTA AAA TTT TAT TCA AAA ATA AGT GAA 474 Gly Val Cys Met Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu 65 70 75 TAT AGA CGG TAT AGA TAT AGT GTG TAT GGA GAA ACG TTA GAA AAA 519 Tyr Arg Arg Tyr Arg Tyr Ser Val Tyr Gly Glu Thr Leu Glu Lys 80 85 90 CAA TGC AAC AAA CAG TTA TGT CAT TTA TTA ATT AGG TGT ATT ACA 564 Gln Cys Asn Lys Gln Leu Cys His Leu Leu Ile Arg Cys Ile Thr 95 100 105 TGT CAA AAA CCG CTG TGT CCA GTT GAA AAG CAA AGA CAT TTA GAA 609 Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Val Glu Lys Gln Arg His Leu Glu 110 115 120 GAA AAA AAA CGA TTC CAT AAC ATC GGT GGA CGG TGG ACA GGT CGG 654 Glu Lys Lys Arg Phe His Asn Ile Gly Gly Arg Trp Thr Gly Arg 125 130 135 TGT ATG TCC TGT TGG AAA CCA ACA CGT AGA GAA ACC GAG GTG TAATC 701 Cys Met Ser Cys Trp Lys Pro Thr Arg Arg Glu Thr Glu Val 140 145 ATG CAT GGA GAA ATA ACT ACA TTG CAA GAC TAT GTT TTA GAT TTG 746 Met His Gly Glu Ile Thr Thr Leu Gln Asp Tyr Val Leu Asp Leu 1 5 10 15 GAA CCC GAG GCA ACT GAC CTA TAC TGT TAT GAG CAA TTG TGT GAC 791 Glu Pro Glu Ala Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Cys Asp 20 25 30 AGC TCA GAG GAG GAG GAA GAT ACT ATT GAC GGT CCA GCT GGA CAA 836 Ser Ser Glu Glu Glu Glu Asp Thr Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln 35 40 45 GCA AAA CCA GAC ACC TCC AAT TAT AAT ATT GTA ACG TCC TGT TGT 881 Ala Lys Pro Asp Thr Ser Asn Tyr Asn Ile Val Thr Ser Cys Cys 50 55 60 AAA TGT GAG GCG ACA CTA CGT CTG TGT GTA CAG AGC ACA CAC ATT 926 Lys Cys Glu Ala Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Ile 65 70 75 GAC ATA CGT AAA TTG GAA GAT TTA TTA ATG GGC ACA TTT GGA ATA 971 Asp Ile Arg Lys Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Phe Gly Ile 80 85 90 GTG TGC CCC GGC TGT TCA CAG AGA GCA TAATCTACAA TGGCTGATCC TGCAG 1023 Val Cys Pro Gly Cys Ser Gln Arg Ala 95 SEQ ID NO: 37 Sequence length: 19 Sequence type: 19 Nuclear Number of chains: 1 strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: GTTGGAAACCAACACGTAG 19 SEQ ID NO: 38 Sequence length: 21 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: 1 strand topology : Linear sequence type: other nucleic acid (synthetic DNA) sequence: AACGGTCGTACCGAAAACGGT 21 SEQ ID NO: 39 sequence length: 19 sequence type: nucleic acid number of strands: 1 strand topology: linear sequence type: Other Nucleic Acid (Synthetic DNA) Sequence: TCTTCTACCTCGTTGCACA 19 SEQ ID NO: 40 Sequence Length: 27 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Other Nucleic Acid (Synthetic DNA) Sequence : AAGTGGACAGACATTGTAAGGTGCGGT 27

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】クローニングした未同定ＨＰＶの制限酵素切断
地図を示す図である。FIG. 1 is a view showing a restriction enzyme cleavage map of cloned unidentified HPV.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 福島 道夫 北海道札幌市中央区円山西町１−１−１− 510 (72)発明者 藤永 ▲ケイ▲ 北海道札幌市中央区旭ケ丘５丁目６−25 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Michio Fukushima 1-1-1-1 Maruyamanishicho, Chuo-ku, Sapporo, Hokkaido (72) Inventor Fujinaga ▲ Kei ▲ 5-6-25 Asahigaoka, Chuo-ku, Sapporo-shi, Hokkaido

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 良性型及び／又は悪性型ヒトパピローマ
ウイルスの検出方法において、該ヒトパピローマウイル
スのＥ６及び／又はＥ７領域のＤＮＡ配列を検出するこ
とを特徴とするヒトパピローマウイルスの検出方法。1. A method for detecting a benign and / or malignant human papillomavirus, which comprises detecting a DNA sequence in the E6 and / or E7 region of the human papillomavirus. 【請求項２】 請求項１記載の方法を用いて検出を行う
ための検出キットであって、ヒトパピローマウイルスの
Ｅ６及び／又はＥ７領域を増幅させるための特定のプラ
イマー、及び増幅されたＤＮＡを検出するためのプロー
ブを含有していることを特徴とするヒトパピローマウイ
ルスの検出キット。2. A detection kit for performing detection using the method according to claim 1, wherein specific primers for amplifying E6 and / or E7 regions of human papilloma virus, and amplified DNA are detected. A human papillomavirus detection kit, which comprises a probe for