JPH0518950A - Attraction carrier for affinity chromatography - Google Patents
Attraction carrier for affinity chromatographyInfo
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- JPH0518950A JPH0518950A JP3194734A JP19473491A JPH0518950A JP H0518950 A JPH0518950 A JP H0518950A JP 3194734 A JP3194734 A JP 3194734A JP 19473491 A JP19473491 A JP 19473491A JP H0518950 A JPH0518950 A JP H0518950A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、リガンドが高濃度にま
た効率的に固定化されたアフィニティクロマトグラフィ
ー用吸着担体に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to an adsorption carrier for affinity chromatography in which a ligand is immobilized at a high concentration and efficiently.
【０００２】[0002]
【従来の技術】クロマトグラフィー技術の一つであるア
フィニティクロマトグラフィーは、互いに特異的に相互
作用を及ぼし合う物質対の親和性を利用して分離精製を
行うものであり、例えば生体物質をその生物学的特性を
発揮する分子上のある特定の化学構造を識別して精製す
る場合などに有効である。アフィニティクロマトグラフ
ィー用吸着担体（アフィニティゲル）は、水に不溶性の
支持体に結合基（スペーサー）を結合させて活性支持体
とし、さらにスペーサーにリガンドを結合させたもので
あり、このリガンドと互いに相互作用を及ぼし合う物質
の組合せを選択して吸着操作を行う。前記アフィニティ
クロマトグラフィー用吸着担体の主構成成分である活性
支持体に望まれる性質としては、非特異的吸着が少ない
こと、リガンドの結合が容易であり固定化可能容量が大
きいこと、化学的に安定でpH域、塩濃度、温度の広範な
条件下で充分安定であり体積変化が少ないこと、充分な
機械的強度と安定性を有し流動特性が良いこと及び生物
学的汚染に耐えることなどが挙げられる。2. Description of the Related Art Affinity chromatography, which is one of the chromatographic techniques, carries out separation and purification by utilizing the affinity of pairs of substances that specifically interact with each other. It is effective when identifying and purifying a specific chemical structure on a molecule that exerts biological properties. An adsorption carrier for affinity chromatography (affinity gel) is one in which a water-insoluble support is bound with a binding group (spacer) to form an active support, and further a ligand is bound to the spacer. The adsorption operation is performed by selecting a combination of substances that exert an action. The properties desired for the active support, which is the main component of the adsorption carrier for affinity chromatography, are low non-specific adsorption, easy ligand binding and large immobilizable capacity, and chemically stable It is stable enough under a wide range of pH range, salt concentration, and temperature, has little volume change, has sufficient mechanical strength and stability, has good flow characteristics, and is resistant to biological contamination. Can be mentioned.
【０００３】上記性質を満たすべく、従来よりアフィニ
ティクロマトグラフィー用吸着担体は様々な支持体が工
夫されており、例えばセルロース、デキストラン、ポリ
アクリルアミド、アガロース等からなるソフトビーズ及
び、シリカゲル、合成高分子等のハードビーズなどが挙
げられる。In order to satisfy the above-mentioned properties, various supports have been devised for the adsorption carrier for affinity chromatography, for example, soft beads made of cellulose, dextran, polyacrylamide, agarose, silica gel, synthetic polymer and the like. Hard beads and the like.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】しかし、このように支
持体の多様化をはかることにより活性支持体の性能向上
が試みられてきたが、特に固定化可能容量の大きさに関
してはいずれのビーズに於いてもほぼ一定の水準にとど
まり、上記一連のビーズの充分な性能発揮を妨げる大き
な要因となっているのは否めない。したがって、さらな
る性能アップを図るためにはリガンドの固定化量を大幅
に増加させることが必要とされている。またリガンドの
固定化に伴う立体障害によって引き起こされる性能の低
下を避けることも必要である。このように支持体単位量
当りのリガンド固定化量の増加、固定化方法の改良を行
うことにより、分離能、吸着能の向上及びこれに伴った
吸着担体量減少による様々な経済的有利性等が期待され
ている。本発明の目的は、従来のアフィニティクロマト
グラフィー用吸着担体の欠点を克服して、リガンドの固
定化可能容量が大きく、また固定化に伴う立体障害によ
る性能低下が改善されたアフィニティクロマトグラフィ
ー用吸着担体を提供することである。However, although it has been attempted to improve the performance of the active support by diversifying the support in this way, particularly with respect to the size of the immobilizable volume, any beads should be used. Even in this case, it is undeniable that it remains at a substantially constant level, which is a major factor that prevents the above-mentioned series of beads from exhibiting sufficient performance. Therefore, in order to further improve the performance, it is necessary to significantly increase the amount of immobilized ligand. It is also necessary to avoid the loss of performance caused by steric hindrance associated with ligand immobilization. In this way, by increasing the amount of immobilized ligand per unit amount of support and improving the immobilization method, separation efficiency and adsorption capacity are improved, and various economic advantages due to the decrease in the amount of adsorbed carrier, etc. Is expected. An object of the present invention is to overcome the drawbacks of the conventional adsorption carrier for affinity chromatography, to have a large capacity for immobilizing a ligand, and to improve the performance deterioration due to steric hindrance due to immobilization. Is to provide.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】本発明者は、前記欠点を
克服する方法について種々研究した結果、反応性の高い
官能基を多数有する結合基を水に不溶性の支持体に結合
させることによって活性支持体とし、前記結合基を介し
てリガンドを固定化させることにより、リガンドの固定
化量を大幅に増加させ、なおかつアフィニティ吸着の際
立体障害により引き起こされるリガンドの性能の低下を
避けることを可能にし本発明をなすに至った。本発明
は、アミノ基、カルボキシル基、酸無水物から選ばれる
少なくとも１つの官能基を有する結合基を介して、水に
不溶性の支持体にリガンドが共有結合により効率的に固
定化されたアフィニティクロマトグラフィー用吸着担体
にある。As a result of various studies on a method for overcoming the above-mentioned drawbacks, the present inventor has found that a binding group having a large number of highly reactive functional groups is activated by binding to a water-insoluble support. By immobilizing the ligand through the above-mentioned binding group as a support, it is possible to significantly increase the amount of immobilization of the ligand and to avoid the deterioration of the ligand performance caused by steric hindrance during affinity adsorption. The present invention has been completed. The present invention provides an affinity chromatograph in which a ligand is efficiently immobilized by covalent bonding to a water-insoluble support through a bonding group having at least one functional group selected from an amino group, a carboxyl group and an acid anhydride. It is in the adsorption carrier for chromatography.
【０００６】本発明に用いられる支持体としては、水に
不溶性でありポーラスまたはノンポーラスのいずれであ
ってもよく、セルロース、アガロース、デキストラン等
の多糖体及びポリアクリルアミドのようないわゆるソフ
トビーズあるいはシリカゲル、スチレン系重合体、ビニ
ルアルコール系重合体またはメタクリレート系重合体な
どのような合成高分子ビーズ等があげられるが、高速液
体クロマトグラフィー（HPLC）として用いる際にはシリ
カゲルまたは合成高分子ビーズのようなハードビーズが
望ましい。粒径は特に制限はないが用途により3〜300
μm のものが多く用いられる。The support used in the present invention is insoluble in water and may be either porous or non-porous, and polysaccharides such as cellulose, agarose and dextran, and so-called soft beads such as polyacrylamide or silica gel. , Synthetic polymer beads such as styrene-based polymer, vinyl alcohol-based polymer or methacrylate-based polymer, etc. are used, but when used as high performance liquid chromatography (HPLC), silica gel or synthetic polymer beads are used. Hard beads are desirable. The particle size is not particularly limited, but 3 to 300 depending on the application
The one with μm is often used.
【０００７】本発明に用いられる結合基とは、反応性の
高い官能基を有する結合基であり（以下結合基（Ａ）と
する）、これを用いることによって支持体にリガンドを
高濃度にまた効率的に固定化させることが可能になっ
た。The linking group used in the present invention is a linking group having a highly reactive functional group (hereinafter referred to as linking group (A)). By using this, the ligand can be applied to the support at a high concentration. It became possible to immobilize efficiently.
【０００８】結合基（Ａ）としては、固定化を目的とす
るリガンドと結合し得る反応性の高い官能基を有するも
のであればよく、他に特に制限はない。結合基（Ａ）の
有する反応性の高い官能基としては、アミノ基、カルボ
キシル基、酸無水物が挙げられる。例えば多数のアミノ
基を有する結合基（Ａ）としてはポリアスパラギン酸、
ポリグルタミン酸、ポリリジンのような塩基性ポリアミ
ノ酸、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリエチ
レンイミンのようなポリアミン類などが挙げられる。カ
ルボキシル基を有する結合基（Ａ）としてはポリグルタ
ミン酸、ポリアスパラギン酸、などの酸性ポリアミノ酸
等が挙げられる。酸無水物を有する結合基（Ａ）として
は無水マレイン酸共重合体などが挙げられる。尚、ここ
で用いられる無水マレイン酸共重合体は無水マレイン酸
とそれと重合しうるビニルモノマー、たとえば、メチル
ビニルエーテル、エチルビニルエーテル、ブチルビニル
エーテル、イソブチルビニルエーテル、スチレン、など
との共重合体を例示することができる。本共重合体に、
エチレンジアミン、トリエチレンジアミン、フェニレン
ジアミン等のジアミン類を反応させて上記のアミノ基を
有する結合基を得ることもできる。また、適当な条件下
で加水分解することにより、カルボキシル基を有する結
合基を得ることもできる。結合基（Ａ）の長さとしては
特に制限はないが、結合させるリガンドの大きさに応じ
た立体障害を除去し、さらにリガンドを高濃度に担持さ
せるため、原子数200 〜3000が望ましい。結合基（Ａ）
に結合させる官能基の数は特に限定されないが、結合基
（Ａ）１分子あたり３個以上が望ましい。The binding group (A) is not particularly limited as long as it has a highly reactive functional group capable of binding to a ligand for immobilization. Examples of the highly reactive functional group contained in the bonding group (A) include an amino group, a carboxyl group, and an acid anhydride. For example, as the bonding group (A) having a large number of amino groups, polyaspartic acid,
Examples thereof include basic polyamino acids such as polyglutamic acid and polylysine, polyvinylamine, polyallylamine, and polyamines such as polyethyleneimine. Examples of the binding group (A) having a carboxyl group include acidic polyamino acids such as polyglutamic acid and polyaspartic acid. Examples of the bonding group (A) having an acid anhydride include a maleic anhydride copolymer. The maleic anhydride copolymer used here is exemplified by a copolymer of maleic anhydride and a vinyl monomer which can be polymerized therewith, for example, methyl vinyl ether, ethyl vinyl ether, butyl vinyl ether, isobutyl vinyl ether, styrene, etc. You can In this copolymer,
It is also possible to react a diamine such as ethylenediamine, triethylenediamine or phenylenediamine to obtain the above-mentioned bonding group having an amino group. Further, it is also possible to obtain a bonding group having a carboxyl group by hydrolyzing under a suitable condition. The length of the binding group (A) is not particularly limited, but the number of atoms is preferably 200 to 3000 in order to remove the steric hindrance depending on the size of the ligand to be bound and to carry the ligand at a high concentration. Linking group (A)
The number of functional groups to be bonded to is not particularly limited, but is preferably 3 or more per one molecule of the bonding group (A).
【０００９】結合基（Ａ）を支持体に結合させるに際し
ては、支持体が有する水酸基等の結合基導入基に直接反
応させる方法（合成法１）と、従来のアフィニティクロ
マトグラフィー用吸着担体に用いられてきた二官能性結
合基（以下結合基（Ｂ）とする）をまず支持体に結合さ
せた後結合基（Ｂ）に結合基（Ａ）を結合させる方法
（合成法２）がある。前記合成法１は本願出願人の出願
特許（特開昭６２−１５３７５０号、特開昭６２−１５
３７５４号参照）に記載された方法を用いて行なうこと
が出来る。When the binding group (A) is bound to the support, a method of directly reacting with a binding group-introducing group of the support such as a hydroxyl group (synthesis method 1) and a conventional adsorption carrier for affinity chromatography are used. There is a method (Synthesis Method 2) in which the obtained bifunctional linking group (hereinafter referred to as linking group (B)) is first bound to a support and then the linking group (A) is bound to the linking group (B). The above-mentioned synthesis method 1 is applied to the patents filed by the present applicant (Japanese Patent Laid-Open Nos. 62-153750 and 62-1515).
No. 3754)).
【００１０】前記合成法２について以下に説明する。ま
ず結合基（Ｂ）としては、支持体および結合基（Ａ）と
それぞれ結合可能な官能基を有するものであればよい。
たとえば、結合基（Ｂ）が有する官能基としてはエポキ
シ基、ハロゲン原子、アミノ基、ヒドラジノ基、カルボ
キシル基、ホルミル基等が例示される。これらの官能基
を有する結合基（Ｂ）の支持体への導入は、適当な溶媒
の存在下で本願出願人の出願特許に記載の方法（特開昭
６２−１５３７５０号、特開昭６２−１５３７５４号参
照）を用いて容易に行うことができる。例えばエポキシ
基あるいはハロゲン原子を有する結合基（Ｂ）として
は、エピクロルヒドリンのようなエピハロヒドリン類、
1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテルのようなジグ
リシジルエーテル類、1,7-オクタジエンジエポキシドの
ようなジエポキシド類等があげられるが、これらは支持
体上の水酸基とアルカリ条件下で速やかに反応しエポキ
シ変性支持体あるいはハロゲン変性支持体を与える。ま
た、得られたエポキシ変性支持体は、アンモニア、ヒド
ラジン、あるいはプロパンジアミンのようなジアミノア
ルカン類等と反応させることによりアミノ基あるいはヒ
ドラジノ基を有するアミノ変性支持体あるいはヒドラジ
ノ変性支持体を、またアミノ酪酸のようなアミノカルボ
ン酸類と反応させることでカルボキシル変性支持体を、
また、エポキシ基を加水分解し過ヨウ素酸酸化を行うこ
とでホルミル変性支持体を与える。また、アミノ変性支
持体は、無水コハク酸のような酸無水物と反応させるこ
とによりカルボキシル変性支持体とすることもできる。
なお、結合基（Ｂ）の長さとしては、特に制限はない
が、原子数3 〜30が望ましい。The synthesis method 2 will be described below. First, the binding group (B) may be any group having a functional group capable of binding to the support and the binding group (A).
Examples of the functional group contained in the bonding group (B) include an epoxy group, a halogen atom, an amino group, a hydrazino group, a carboxyl group and a formyl group. The introduction of the binding group (B) having these functional groups into the support is carried out in the presence of a suitable solvent according to the method described in the applicant's patent application (JP-A-62-153750, JP-A-62-153750). (See No. 153754)). For example, as the bonding group (B) having an epoxy group or a halogen atom, epihalohydrins such as epichlorohydrin,
Examples include diglycidyl ethers such as 1,4-butanediol diglycidyl ether and diepoxides such as 1,7-octadiene diepoxide. React to give an epoxy modified support or a halogen modified support. The obtained epoxy-modified support is reacted with ammonia, hydrazine, or a diaminoalkane such as propanediamine to give an amino-modified support having an amino group or a hydrazino group or a hydrazino-modified support, or an amino group. The carboxyl-modified support is reacted with an aminocarboxylic acid such as butyric acid,
Further, a formyl-modified support is obtained by hydrolyzing the epoxy group and performing periodate oxidation. The amino-modified support can also be converted to a carboxyl-modified support by reacting it with an acid anhydride such as succinic anhydride.
The length of the bonding group (B) is not particularly limited, but preferably has 3 to 30 atoms.
【００１１】これらの官能基を有する支持体に結合基
（Ａ）を結合させるに際しては、結合基（Ａ）及び
（Ｂ）が有する官能基に応じて、必要であれば、適宜触
媒や反応試薬等を用いて適当な溶媒下で行うことができ
る。例えば触媒としては、塩酸や炭酸ナトリウムまたは
炭酸水素ナトリウムなどの酸、アルカリが主としてエポ
キシ基を介した結合の場合に用いられ、また、例えば反
応試薬としては、N-ヒドロキシコハク酸イミド、ジシク
ロヘキシルカルボジイミド、1-エチル-3-(3-ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミドまたはカルボニルジイミ
ダゾールのような縮合剤がカルボキシル基またはアミノ
基を介した結合の場合に、また水素化シアノホウ素ナト
リウムのような還元剤がホルミル基を介した結合の場合
に用いられる等々を例示することができる。また、溶媒
としては、通常水が用いられるが必要に応じてリン酸や
酢酸緩衝液として用いることもでき、また塩化ナトリウ
ムなどの無機塩類を添加して用いることも可能である。
ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキ
シド、等の有機溶媒を用いても良い。When the bonding group (A) is bonded to the support having these functional groups, a catalyst or a reaction reagent may be appropriately used depending on the functional groups of the bonding groups (A) and (B), if necessary. And the like in a suitable solvent. For example, as a catalyst, an acid such as hydrochloric acid or sodium carbonate or sodium hydrogen carbonate, an alkali is mainly used in the case of a bond through an epoxy group, and for example, as a reaction reagent, N-hydroxysuccinimide, dicyclohexylcarbodiimide, When a condensing agent such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide or carbonyldiimidazole is linked via a carboxyl group or an amino group, and a reducing agent such as sodium cyanoborohydride is formyl. Examples include those used in the case of conjugation through groups. Water is usually used as the solvent, but phosphoric acid or acetic acid buffer may be used if necessary, and inorganic salts such as sodium chloride may be added and used.
An organic solvent such as dioxane, dimethylformamide, dimethylsulfoxide may be used.
【００１２】以上のようにして、支持体−結合基（Ａ）
あるいは支持体−結合基（Ｂ）−結合基（Ａ）から構成
される活性支持体が調整される。支持体と結合基（Ａ）
との間に結合基（Ｂ）を介在させるかどうかは、使用す
る支持体と結合基（Ａ）の有する官能基や反応性によっ
て適宜選択される。また結合基（Ａ）に結合させるリガ
ンドの立体障害を除去する目的で、支持体とリガンドの
間の長さを調節する必要のある場合に、結合基（Ｂ）を
用いて調節することも可能である。本発明に用いられる
リガンドについては特に制限はないが、アラニン、セリ
ン、ヒスチジン、アルギニンパラニトロアニリド、イソ
ロイシルプロピルアルギニルパラニトロアニリドなどの
アミノ酸、ペプチド及びその誘導体、ω−アミノカプリ
ル酸、ε−アミノカプロン酸等のアミノカルボン酸、グ
ルコサミン、ガラクトサミン等のアミノ糖及びヒスタミ
ンなどをはじめとする合成または天然のアミノ化合物、
ホルモン、レセプター、抗体、抗原、コンカナバリンＡ
などのレクチン、酵素、酵素阻害剤などのようなタンパ
ク質、ウシ血清アルブミンなどの血漿タンパク質、糖タ
ンパク質、糖脂質、あるいはオリゴアデニル酸、ポリウ
リジル酸などの核酸等を例示することが出来る。As described above, the support-bonding group (A)
Alternatively, an active support composed of support-bonding group (B) -bonding group (A) is prepared. Support and bonding group (A)
Whether or not to interpose the binding group (B) between and is appropriately selected depending on the support used and the functional group or reactivity of the binding group (A). In addition, when it is necessary to adjust the length between the support and the ligand in order to remove the steric hindrance of the ligand bound to the binding group (A), the binding group (B) can be used for adjustment. Is. The ligand used in the present invention is not particularly limited, but amino acids such as alanine, serine, histidine, arginine paranitroanilide, isoleucylpropylarginylparanitroanilide, peptides and derivatives thereof, ω-aminocaprylic acid, ε. -Synthetic or natural amino compounds, including aminocarboxylic acids such as aminocaproic acid, aminosugars such as glucosamine and galactosamine, and histamine;
Hormone, receptor, antibody, antigen, concanavalin A
Examples thereof include proteins such as lectins, enzymes, enzyme inhibitors, plasma proteins such as bovine serum albumin, glycoproteins, glycolipids, and nucleic acids such as oligoadenylic acid and polyuridylic acid.
【００１３】前記活性支持体の結合基（Ａ）にリガンド
を共有結合させるに際しては、必ずしも制限はないが、
結合基（Ｂ）に結合基（Ａ）を結合させると同様、結合
基が有する官能基に応じて必要であれば、適宜触媒や反
応試薬などを用いて適当な溶媒下で行うことが出来る。
リガンドとの反応条件については必ずしも制限はないが
一般に次のような範囲で行うことが適当である。結合基
（Ａ）を結合させた活性支持体とリガンドの反応温度は
0 ℃〜80℃の範囲で行ない好ましくは4 ℃〜60℃であ
る。反応時間は1 〜72時間で行ない好ましくは2 〜12時
間である。反応後の後処理についても特別な条件はな
く、ろ別、洗浄等通常行われている方法にて適宜実施さ
れる。When the ligand is covalently bound to the binding group (A) of the active support, there is no limitation.
Similar to the case where the bonding group (A) is bonded to the bonding group (B), if necessary depending on the functional group of the bonding group, it can be carried out in an appropriate solvent using an appropriate catalyst or reaction reagent.
The reaction conditions with the ligand are not necessarily limited, but it is generally appropriate to carry out the reaction in the following range. The reaction temperature between the active support to which the binding group (A) is bound and the ligand is
The temperature is 0 ° C to 80 ° C, preferably 4 ° C to 60 ° C. The reaction time is 1 to 72 hours, preferably 2 to 12 hours. There is no special condition for the post-treatment after the reaction, and it is appropriately carried out by a commonly used method such as filtration and washing.
【００１４】本発明のアフィニティクロマトグラフィー
用吸着担体を用いてアフィニティクロマトグラフィーを
行うに際しては通常、吸着担体を中空管に充填して行わ
れるが、このとき充填する中空管の材質は、一般的には
ガラス製、ステンレス製、テフロン製、またはポリエー
テルエーテルケトンなどの合成高分子製、ステンレスの
内壁をテフロンで被覆したもの等が用いられる。中空管
のサイズは、目的に応じて適宜決めればよく特に制限は
ない。本吸着担体の中空管への充填方法は、常法に従っ
て行われ特に制限はない。また、充填率も適宜選択する
ことができる。When carrying out affinity chromatography using the adsorption carrier for affinity chromatography of the present invention, usually, the adsorption carrier is filled in a hollow tube, and the material of the hollow tube filled at this time is generally Specifically, glass, stainless steel, Teflon, synthetic polymer such as polyetheretherketone, stainless steel whose inner wall is coated with Teflon, or the like is used. The size of the hollow tube may be appropriately determined according to the purpose and is not particularly limited. The method of filling the present adsorption carrier into the hollow tube is carried out according to a conventional method and is not particularly limited. Also, the filling rate can be appropriately selected.
【００１５】[0015]
【実施例】以下、本発明について代表的な例を示しさら
に具体的に説明する。なお、これらは説明のための単な
る例示であって本発明はこれらに何ら制限されるもので
ないことはいうまでもない。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically by showing typical examples. Needless to say, these are merely examples for explanation and the present invention is not limited to these.
【００１６】実施例１ グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタ
クリレート共重合体のグリシジル基を加水分解して得ら
れた水酸基変性ビーズに、1,4-ブタンジオールジグリシ
ジルエーテルでエポキシ基を導入した後、さらにγ−ア
ミノ酪酸でカルボキシル基を導入した。次いで、N-ヒド
ロキシコハク酸イミド（以下HOSuと称する）及びジシク
ロヘキシルカルボジイミド（以下DCC と称する）を用い
て、HOSu化ビーズを得た。得られたHOSu化ビーズ 1 gに
ポリグルタミン酸（以下poly-D-Gluと称する）100mg の
0.01N炭酸水素ナトリウム水溶液 4 ml を加え、室温で
3時間振とうした。次いでビーズをろ取し、1M塩化ナト
リウム水溶液及び水で洗浄した。こうして得られたpoly
-D-Glu固定化ビーズを乾燥させ、HOSu0.8g及びDCC1.8g
の無水ジオキサン溶液4ml を加え、室温で1.5 時間振と
うした後ビーズをろ取し、無水ジオキサン、メタノール
で素早く洗浄した。このビーズ1gにアルギニンパラニト
ロアニリド150mg （以下Arg-pNA と称する）の0.01N 炭
酸水素ナトリウム水溶液5 mlを加え、室温で4 時間振と
うした。次いでビーズをろ取し、1M塩化ナトリウム水溶
液及び水で洗浄した。本ビーズをトリプシン処理し、分
解生成したパラニトロアニリン（以下pNA と称する）を
定量することにより、本ビーズに固定化されたArg-pNA
は乾燥ビーズ1g当り約30μmol であることが確かめられ
た。Example 1 After introducing an epoxy group with 1,4-butanediol diglycidyl ether into hydroxyl group-modified beads obtained by hydrolyzing the glycidyl group of a glycidyl methacrylate / ethylene glycol dimethacrylate copolymer, The carboxyl group was introduced with γ-aminobutyric acid. Then, N-hydroxysuccinimide (hereinafter referred to as HOSu) and dicyclohexylcarbodiimide (hereinafter referred to as DCC) were used to obtain HOSu-modified beads. 100 g of polyglutamic acid (hereinafter referred to as poly-D-Glu) was added to 1 g of the obtained HOSu beads.
Add 4 ml of 0.01N sodium hydrogen carbonate solution at room temperature.
Shake for 3 hours. Then, the beads were collected by filtration and washed with a 1M sodium chloride aqueous solution and water. Thus obtained poly
-D-Glu-immobilized beads are dried and HOSu 0.8g and DCC 1.8g
4 ml of an anhydrous dioxane solution of was added, and the mixture was shaken at room temperature for 1.5 hours, the beads were collected by filtration, and washed rapidly with anhydrous dioxane and methanol. To 1 g of these beads was added arginine paranitroanilide 150 mg (hereinafter referred to as Arg-pNA) 5 ml of 0.01N sodium hydrogen carbonate solution, and the mixture was shaken at room temperature for 4 hours. Then, the beads were collected by filtration and washed with a 1M sodium chloride aqueous solution and water. Arg-pNA immobilized on the beads was obtained by treating the beads with trypsin and quantifying the decomposition product of para-nitroaniline (hereinafter referred to as pNA).
Was found to be about 30 μmol / g dry beads.
【００１７】比較例１ 実施例１と同様の方法で調製したHOSu化ビーズにpoly-D
-Gluを介さずにArg-pNA を固定化したところ乾燥ビーズ
1g当り約10μmol のArg-pNA が固定化されていることが
確かめられた。Comparative Example 1 HOSu beads prepared by the same method as in Example 1 were added to poly-D.
-Immobilized Arg-pNA without Glu and dried beads
It was confirmed that about 10 μmol of Arg-pNA was immobilized per 1 g.
【００１８】実施例２ 実施例１に於けるγ−アミノ酪酸の替わりにプロパンジ
アミンを用いてアミノ基を導入したビーズ1gに、無水マ
レイン酸メチルビニルエーテル共重合体（以下MAMEC と
称する）の３％アセトン溶液6ml を加え25℃で２時間振
とうさせ、次いでビーズをろ取しアセトンで洗浄後、MA
MEC 固定化ビーズを得た。このビーズにイソロイシルプ
ロリルアルギニルパラニトロアニリド（以下Ile-Pro-Ar
g-pNA と称する）100mg のジメチルスルホキシド溶液を
加え25℃で10時間振とうさせた。反応後のビーズをアセ
トンメタノール及び水で洗浄した後20mlの1Mトリス塩酸
緩衝液（pH8.5 ）を加え１時間振とうし、Ile-Pro-Arg-
pNA 固定化ビーズを得た。得られたビーズをトリプシン
処理することにより、固定化されたIle-Pro-Arg-pNA 量
は乾燥ビーズ1g当り100 μmol であることが確かめられ
た。Example 2 To 1 g of beads in which an amino group was introduced by using propanediamine instead of γ-aminobutyric acid in Example 1, 3% of a maleic anhydride methyl vinyl ether copolymer (hereinafter referred to as MAMEC) was used. Add 6 ml of acetone solution and shake at 25 ° C for 2 hours, then collect the beads by filtration and wash with acetone.
MEC-immobilized beads were obtained. Isoleucyl prolyl arginyl paranitroanilide (hereinafter referred to as Ile-Pro-Ar
100 mg of dimethylsulfoxide solution (referred to as g-pNA) was added and shaken at 25 ° C for 10 hours. After the reaction, the beads were washed with acetone-methanol and water, 20 ml of 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.5) was added, and the mixture was shaken for 1 hour, and Ile-Pro-Arg-
The pNA-immobilized beads were obtained. By treating the obtained beads with trypsin, it was confirmed that the amount of immobilized Ile-Pro-Arg-pNA was 100 μmol per 1 g of the dried beads.
【００１９】比較例２ 実施例１と同様の方法で調製したHOSu化ビーズにMAMEC
を介さずにIle-Pro-Arg-pNA を直接固定化したところ、
乾燥ビーズ１ｇ当り約10μmol のIle-Pro-Arg-pNA が固
定化できたことが判った。Comparative Example 2 HOSu beads prepared in the same manner as in Example 1 were mixed with MAMEC.
Immobilization of Ile-Pro-Arg-pNA directly without going through
It was found that about 10 μmol of Ile-Pro-Arg-pNA could be immobilized per 1 g of dried beads.
【００２０】実施例３ 実施例２に於けるMAMEC 固定化ビーズ１g に、ウシ血清
アルブミン（以下BSAと称する）200mg を含む0.1M酢酸
緩衝液（pH3.5 ）5ml を加え、25℃で3 時間振とうさせ
た。反応前後に於けるBSA 反応混合溶液中のBSA の減少
量を高速液体クロマトグラフィーで定量することによ
り、固定化されたBSA 量は、乾燥ビーズ1g当り100mg で
あることが確かめられた。Example 3 To 1 g of MAMEC-immobilized beads used in Example 2, 5 ml of 0.1 M acetate buffer (pH 3.5) containing 200 mg of bovine serum albumin (hereinafter referred to as BSA) was added, and the mixture was kept at 25 ° C. for 3 hours. I was shaken. The amount of BSA immobilized in the BSA reaction mixture solution before and after the reaction was quantified by high performance liquid chromatography, and it was confirmed that the amount of immobilized BSA was 100 mg per 1 g of the dried beads.
【００２１】比較例３ 実施例１に於けるHOSu化ビーズにMAMEC を介さずに直接
BSA を固定化したところ、乾燥ビーズ１ｇ当り約10mgの
BSA が固定化できたことが判った。Comparative Example 3 The HOSu-modified beads in Example 1 were directly subjected to no MAMEC.
Immobilization of BSA resulted in about 10 mg / g dry beads.
It was found that the BSA could be immobilized.
【００２２】実施例４ 実施例２に於けるMAMEC 固定化ビーズ1gに、プロティン
Ａ（以下ProAと称する）250mg を含む0.1M酢酸緩衝液
（pH4.5 ）7ml を加え、25℃で３時間振とうさせた。反
応前後に於ける反応混合溶液中のProAの減少量から、固
定化されたProA量は、乾燥ビーズ１ｇ当り100mg である
ことが確かめられた。Example 4 To 1 g of MAMEC-immobilized beads used in Example 2, 7 ml of 0.1 M acetate buffer (pH 4.5) containing 250 mg of protein A (hereinafter referred to as ProA) was added and shaken at 25 ° C. for 3 hours. I was allowed to. The amount of ProA immobilized in the reaction mixture solution before and after the reaction was confirmed to be 100 mg per 1 g of dried beads.
【００２３】比較例４ 実施例１に於けるHOSu化ビーズにMAMEC を介さずに直接
ProAを固定化したところ、乾燥ビーズ１ｇ当り30mgのPr
oAが固定化できたことが判った。Comparative Example 4 The HOSu-modified beads in Example 1 were directly subjected to no MAMEC.
Immobilization of ProA resulted in 30 mg of Pr per 1 g of dry beads.
It was found that oA could be fixed.
【００２４】実施例５ 実施例２に於けるMAMEC 化ビーズ1gに、0.1Nの水酸化ナ
トリウム水溶液20mlを加え、室温で４時間放置し、ビー
ズをろ取し、水及びメタノールで洗浄しカルボキシル変
性ビーズを得た。得られたビーズ１g を無水ジオキサン
で充分洗浄した後、HOSu0.8g及びDCC1.8g の無水ジオキ
サン溶液4ml を加えて30℃で2 時間振とうした。ビーズ
をろ取し無水ジオキサン20ml、メタノール6ml 、冷水3m
l で素早く洗浄し、HOSu化ビーズを得た。このビーズを
コンカナバリンＡ（以下ConAと称する）100mg 及びα−
メチル−マンノピラノシド60mgを含む1mM 塩化カルシウ
ム、1mM 塩化マンガン及び10mM炭酸緩衝液（pH8 ）20ml
に加え室温で4 時間振とう後4 ℃で一夜放置した。ビー
ズをろ取し50mMトリス−塩酸緩衝液（pH8 ）で洗浄した
後、1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.5 ）5ml に加え室温で
1時間振とうした後ビーズをろ取した。更にこのビーズ
にα−メチル−マンノピラノシド30mgを含む0.1M燐酸緩
衝液（pH7.4 ）10mlを加え、1 ℃で10分間振とうした
後、上記燐酸緩衝液の0.05% グルタルアルデヒド溶液20
mlを加え、1 ℃で10分間振とうした。次いで10mgの水素
化シアノホウ素ナトリウムを加え、1 ℃で30分間振とう
した。同様にして更に2 回にわたって水素化シアノホウ
素ナトリウムを加え振とうした後、50mMトリス−塩酸緩
衝液50ml、水50mlで洗浄し、1Mトリス−塩酸緩衝液（pH
8）50mlを加え、15分間振とうした。ビーズを水洗しCon
A固定化ビーズとした。反応前後に於ける反応混合溶液
中のConAの減少量から、固定化されたConAの量は、乾燥
ビーズ1gあたり45mgであることが確かめられた。Example 5 To 1 g of the MAMEC-modified beads used in Example 2, 20 ml of 0.1N sodium hydroxide aqueous solution was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 4 hours. The beads were collected by filtration, washed with water and methanol and subjected to carboxyl modification. Obtained beads. After thoroughly washing 1 g of the obtained beads with anhydrous dioxane, 4 g of an anhydrous dioxane solution containing 0.8 g of HOSu and 1.8 g of DCC was added and shaken at 30 ° C. for 2 hours. The beads were collected by filtration, and anhydrous dioxane 20 ml, methanol 6 ml, cold water 3 m
It was quickly washed with l to obtain HOSu beads. These beads were used as concanavalin A (hereinafter referred to as ConA) 100 mg and α-
20 ml of 1 mM calcium chloride, 1 mM manganese chloride and 10 mM carbonate buffer (pH 8) containing 60 mg of methyl-mannopyranoside
In addition to the above, the mixture was shaken at room temperature for 4 hours and then left overnight at 4 ° C. The beads were collected by filtration, washed with 50 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH8), added to 5 ml of 1M Tris-hydrochloric acid buffer (pH8.5), and allowed to stand at room temperature.
After shaking for 1 hour, the beads were collected by filtration. Further, 10 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) containing 30 mg of α-methyl-mannopyranoside was added to the beads, and the mixture was shaken at 1 ° C for 10 minutes, and then 0.05% glutaraldehyde solution of the above phosphate buffer was added.
ml was added, and the mixture was shaken at 1 ° C for 10 minutes. Then, 10 mg of sodium cyanoborohydride was added, and the mixture was shaken at 1 ° C for 30 minutes. After adding sodium cyanoborohydride twice more in the same manner and shaking, wash with 50 ml of 50 mM Tris-HCl buffer and 50 ml of water, and wash with 1 M Tris-HCl buffer (pH
8) 50 ml was added and shaken for 15 minutes. Wash beads with Con
A beads were immobilized. The amount of ConA immobilized in the reaction mixture solution before and after the reaction was confirmed to be 45 mg per 1 g of the dried beads.
【００２５】比較例５ 実施例１に於けるHOSu化ビーズにMAMEC を介さずに直接
ConAを固定化したところ、乾燥ビーズ１ｇ当り50mgのCo
nAが固定化されたことが判った。Comparative Example 5 The HOSu-adapted beads of Example 1 were directly subjected to no MAMEC.
When ConA was immobilized, 50 mg of Co was added per 1 g of dried beads.
It was found that nA was immobilized.
【００２６】実施例６ 実施例４で得られたProA固定化ビーズを内径4.6mm 、長
さ1cm のステンレス製カラムに充填し、高速液体クロマ
トグラフを用いてヒト免疫グロブリンＧ（IgG、sigma
社製）のアフィニティクロマトグラフィーを行ったとこ
ろ、図１に示すような結果が得られた。即ち溶離液Ａを
用いて150 μg のIgG を含む水溶液を本装置に注入した
ところIgG は溶出されなかったが、次いで、溶離液Ａを
溶離液Ｂに切り替えたところ（図１の矢印の箇所）、精
製されたIgG が溶出された。したがって本ProA固定化ビ
ーズはIgG のアフィニティ吸着担体として用い得ること
が確かめられた。 分析条件 試料 ：IgG （ヒト血清、sigma 社製） 溶離液 ：0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4 ）（溶離液A ） 0.1Mクエン酸水溶液（pH2.5 ）（溶離液B ） 溶離速度：1ml/min 検出器 ：紫外分光光度計（280nm ） 温度 ：室温Example 6 The ProA-immobilized beads obtained in Example 4 were packed in a stainless steel column having an inner diameter of 4.6 mm and a length of 1 cm, and human immunoglobulin G (IgG, sigma) was analyzed by high performance liquid chromatography.
Affinity chromatography (manufactured by K.K.) was performed and the results shown in FIG. 1 were obtained. That is, when an aqueous solution containing 150 μg of IgG was injected into the device using the eluent A, IgG was not eluted, but when the eluent A was switched to the eluent B (the arrow in FIG. 1). The purified IgG was eluted. Therefore, it was confirmed that the present ProA-immobilized beads can be used as an affinity adsorption carrier for IgG. Analytical conditions Sample: IgG (human serum, sigma) Eluent: 0.1M phosphate buffer (pH7.4) (eluent A) 0.1M citric acid aqueous solution (pH2.5) (eluent B) Elution rate: 1ml / min Detector: UV spectrophotometer (280nm) Temperature: Room temperature
【００２７】実施例７ 実施例５で得られたConA固定化ビーズ（以下ConA固定化
ビーズ（Ａ）とする）を内径8.0mm 、長さ5cm のステン
レス製カラムに充填し、高速液体クロマトグラフを用い
て、p-ニトロフェニル β-D- ガラクトピラノシド（以
下pNP-β-Galと称する）及び、p-ニトロフェニル β-D
- グルコピラノシド（以下pNP-β-Glcと称する）のアフ
ィニティクロマトグラフィーを行ったところ図２の
（Ａ）に示すような結果が得られた。なお図中はpNP-
β-GalをはpNP-β-Glcのピークを示す。 分析条件 試料 ：pNP-β-Gal（sigma 社製） pNP-β-Glc（sigma 社製） 溶離液：50mM トリスー塩酸緩衝液（pH7.4 ）、0.15M
NaCl、1mM MnCl2 、1mM CaCl2 、 溶離速度：1ml/min 検出器：紫外分光光度計（300nm ） 温度 ：室温Example 7 The ConA-immobilized beads (hereinafter referred to as ConA-immobilized beads (A)) obtained in Example 5 were packed in a stainless steel column having an inner diameter of 8.0 mm and a length of 5 cm, and a high performance liquid chromatograph was used. And p-nitrophenyl β-D-galactopyranoside (hereinafter referred to as pNP-β-Gal) and p-nitrophenyl β-D
-Affinity chromatography of glucopyranoside (hereinafter referred to as pNP-β-Glc) gave the results shown in FIG. 2 (A). In the figure, pNP-
β-Gal indicates the peak of pNP-β-Glc. Analysis conditions Sample: pNP-β-Gal (manufactured by sigma) pNP-β-Glc (manufactured by sigma) Eluent: 50 mM Tris-HCl buffer (pH7.4), 0.15M
NaCl, 1 mM MnCl 2 , 1 mM CaCl 2 , Elution rate: 1 ml / min Detector: UV spectrophotometer (300 nm) Temperature: Room temperature
【００２８】比較例６ 比較例５で得られたMAMEC を介さずにConAを固定化した
ConA固定化ビーズ（以下ConA固定化ビーズ（Ｂ）とす
る）を用いて実施例７と同様の条件でアフィニティクロ
マトグラフィーを行った結果を図２の（Ｂ）に示した。
得られた結果と実施例７のpNP 糖誘導体の分離能を比較
したところ、ConA固定化ビーズ（Ａ）は（Ｂ）よりも優
れていることが判った。Comparative Example 6 ConA was immobilized without going through MAMEC obtained in Comparative Example 5.
The results of affinity chromatography using ConA-immobilized beads (hereinafter referred to as ConA-immobilized beads (B)) under the same conditions as in Example 7 are shown in FIG. 2 (B).
When the obtained results were compared with the separation ability of the pNP sugar derivative of Example 7, it was found that ConA-immobilized beads (A) were superior to (B).
【００２９】実施例８ 実施例７で用いたConA固定化ビーズ（Ａ）を充填したカ
ラムを用いて、ウリジン-5'-ジホスホガラクトース（以
下UDP-Gal と称する）及び、ウリジン-5'-ジホスホマン
ノース（以下UDP-Man と称する）のアフィニティクロマ
トグラフィーを行った結果を図３の（Ａ）に示した。な
お、図中はUDP-β-Gal、はUDP-β-Manのピーク示
す。 分析条件 試料 ：UDP-β-Gal（sigma 社製） UDP-β-Man（sigma 社製） 溶離液 ：50mMトリスー塩酸緩衝液（pH7.4 ）0.25M N
aCl、1mM MnCl2 、1mM CaCl2 溶離速度：0.5ml/min 検出器 ：紫外分光光度計（261nm ） 温度 ：室温Example 8 Using the column packed with ConA-immobilized beads (A) used in Example 7, uridine-5'-diphosphogalactose (hereinafter referred to as UDP-Gal) and uridine-5'- were used. The results of affinity chromatography of diphosphomannose (hereinafter referred to as UDP-Man) are shown in FIG. In the figure, UDP-β-Gal indicates the peak of UDP-β-Man. Analysis conditions Sample: UDP-β-Gal (manufactured by sigma) UDP-β-Man (manufactured by sigma) Eluent: 50 mM Tris-HCl buffer (pH7.4) 0.25MN
aCl, 1 mM MnCl 2 , 1 mM CaCl 2 Elution rate: 0.5 ml / min Detector: Ultraviolet spectrophotometer (261 nm) Temperature: Room temperature
【００３０】比較例７ 比較例６で用いたConA固定化ビーズ（Ｂ）を充填したカ
ラムを用いて実施例７と同様の条件でのアフィニティク
ロマトグラフィーを行った結果を図３の（Ｂ）に示し
た。得られた結果と実施例８のUDP 糖誘導体の分離能を
比較したところ、ConA固定化ビーズ（Ａ）を充填したカ
ラムにより、ConA固定化ビーズ（Ｂ）を充填したカラム
では分離が不可能であったUDP 糖誘導体の分離が可能で
あることが判った。Comparative Example 7 The result of affinity chromatography under the same conditions as in Example 7 using the column packed with the ConA-immobilized beads (B) used in Comparative Example 6 is shown in FIG. 3 (B). Indicated. Comparing the obtained results with the separability of the UDP sugar derivative of Example 8, it was found that the column packed with ConA-immobilized beads (A) could not separate the column packed with ConA-immobilized beads (B). It was found that the existing UDP sugar derivative could be separated.
【００３１】[0031]
【発明の効果】本発明によるアフィニティクロマトグラ
フィー用吸着担体は、支持体とリガンドを、反応性の高
い官能基を有する結合基を介して結合させたことによ
り、従来の吸着担体が有するリガンドの数倍から数十倍
量を固定化することが可能になり、また、リガンドの立
体障害が減少されたことにより、等量のリガンドを有す
る吸着担体においても従来と比較して高い分離能を発現
させることが可能になった。本発明は支持体単位量当り
の吸着能及び分離能に優れた、アフィニティクロマトグ
ラフィー用吸着担体であり、生体物質の分離精製に関わ
る様々なクロマトグラフィーの応用分野において有用な
手段を提供するものである。INDUSTRIAL APPLICABILITY In the adsorption carrier for affinity chromatography according to the present invention, the number of the ligands possessed by the conventional adsorption carrier is obtained by binding the support and the ligand through the bonding group having the highly reactive functional group. It becomes possible to immobilize a double to several tens of times amount, and the steric hindrance of the ligand is reduced, so that even an adsorption carrier having an equivalent amount of the ligand can exhibit higher resolution than the conventional one. It has become possible. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is an adsorption carrier for affinity chromatography, which is excellent in adsorption ability and separation ability per unit amount of support, and provides a useful means in various application fields of chromatography relating to separation and purification of biological substances. is there.
【図１】図１はProA固定化ビーズを充填したカラムに対
するIgG の溶出挙動を示すクロマトグラムである。FIG. 1 is a chromatogram showing the elution behavior of IgG with respect to a column packed with ProA-immobilized beads.
【図２】図２はConA固定化ビーズを充填したカラムに対
するpNP-β-GalおよびpNP-β-Glcの溶出挙動を示すクロ
マトグラムである。（Ａ）はMAMEC を介してConAを固定
化したビーズを、（Ｂ）はMAMEC を介さずにConAを固定
化したビーズを充填したカラムに対するクロマトグラム
を示す。FIG. 2 is a chromatogram showing the elution behavior of pNP-β-Gal and pNP-β-Glc with respect to a column packed with ConA-immobilized beads. (A) shows a chromatogram for a column packed with beads in which ConA was immobilized via MAMEC, and (B) was a column packed with beads in which ConA was immobilized without MAMEC.
【図３】図３はConA固定化ビーズを充填したカラムに対
するUDP-β-GalおよびUDP-β-Manの溶出挙動を示すクロ
マトグラムである。（Ａ）はMAMEC を介してConAを固定
化したビーズを、（Ｂ）はMAMEC を介さずにConAを固定
化したビーズを充填したカラムに対するクロマトグラム
を示す。FIG. 3 is a chromatogram showing the elution behavior of UDP-β-Gal and UDP-β-Man with respect to a column packed with ConA-immobilized beads. (A) shows a chromatogram for a column packed with beads in which ConA was immobilized via MAMEC, and (B) was a column packed with beads in which ConA was immobilized without MAMEC.
Claims (1)
ボキシル基または酸無水物から選ばれる少なくとも１つ
の官能基を有する結合基を介して共有結合によりリガン
ドが固定化されていることを特徴とするアフィニティク
ロマトグラフィー用吸着担体。Claim: What is claimed is: 1. A ligand is covalently immobilized on a water-insoluble support through a bonding group having at least one functional group selected from an amino group, a carboxyl group or an acid anhydride. An adsorption carrier for affinity chromatography, which is characterized in that
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3194734A JPH0518950A (en) | 1991-07-09 | 1991-07-09 | Attraction carrier for affinity chromatography |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3194734A JPH0518950A (en) | 1991-07-09 | 1991-07-09 | Attraction carrier for affinity chromatography |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0518950A true JPH0518950A (en) | 1993-01-26 |
Family
ID=16329348
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3194734A Pending JPH0518950A (en) | 1991-07-09 | 1991-07-09 | Attraction carrier for affinity chromatography |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0518950A (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPWO2008146906A1 (en) * | 2007-05-30 | 2010-08-19 | 株式会社カネカ | Formyl group-containing porous carrier, adsorbent using the same, and production method thereof |
| KR101506389B1 (en) * | 2013-06-21 | 2015-03-30 | (주) 영진바이오크롬 | Separating agent for affinity chromatography using carboxyl group binding carrier and manufacturing method same |
-
1991
- 1991-07-09 JP JP3194734A patent/JPH0518950A/en active Pending
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