JPH05178826A - Bifunctional chelating agent, its complex with protein and its use - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide a bifunctional chelating agent causing little nonspecific adsorption in diagnostic imaging and having high tumor accumulating tendency. CONSTITUTION:The bifunctional chelating agent of formula I [L is bivalent linking group selected from amide, carbonyl, sulfamoyl, sulfonyl, ether and ester; R<1> and R<2> are (CH2)n (n is 1-8), 1,4-hexylene, group of formula II or group of formula III; (X) is 0 or 1]. The polyaminopolycarboxylic acid of the compound contains an introduced maleimide group capable of specifically bonding with sulfhydryl group of protein without damaging the metal-bonding property of the structure and the compound can bond with a protein, preferably antibody, especially its Fab' fragment to form a complex. The antibody-chelating compound complex is used in diagnostic imaging in living body by combining with radioactive metallic ion. When the radioactivc metallic ion has cytotoxicity, it can be combined with a tumorspecific antibody and used for the treatment of diseases such as cancer.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、生物学的活性分子に金
属イオンを結合するための二官能性キレート化剤とその
製法、及び二官能性キレート化剤と蛋白質との複合体並
びにその用途に関する。さらに詳しくは、マレイミド基
にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）もしくはジエチ
レントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を結合した新規な二
官能性キレート化剤とその製法、及びこれらと蛋白質と
の複合体並びにその用途に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a bifunctional chelating agent for binding a metal ion to a biologically active molecule, a process for producing the same, a complex of the bifunctional chelating agent and a protein, and uses thereof. Regarding More specifically, the present invention relates to a novel bifunctional chelating agent having ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) bound to a maleimide group, a method for producing the same, a complex of these with a protein, and use thereof.

【０００２】[0002]

【従来の技術】本発明に関連する、診断および治療上の
目的のための蛋白質／金属イオン結合体の使用を記録し
た文献が多数みられる。ガンソウ（Gansow) ら（米国特
許第４，４５４，１０６号）は、インビトロおよびイン
ビボ放射線画像形成診断法のためのモノクローナル抗体
／金属イオン結合体の使用法を開示している。ゴールデ
ンバーグ（Goldanbark) ら（N. Eng. J. Med. 第２９８
巻、１３８４〜８８頁（１９７８年））は、既知の腫瘍
関連抗原胎児性癌抗原（ＣＥＡ）に対する抗体をヨウ素
¹³¹ で標識し、癌患者に注射する診断的画像形成実験を
開示している。４８時間後、この患者をガンマ線シンチ
レーションカメラで走査し、ガンマ線放射図形により腫
瘍の位置がわかる。BACKGROUND OF THE INVENTION There is a large body of literature recording the use of protein / metal ion conjugates for diagnostic and therapeutic purposes in connection with the present invention. Gansow et al. (US Pat. No. 4,454,106) disclose the use of monoclonal antibody / metal ion conjugates for in vitro and in vivo radioimaging diagnostics. Goldanbark et al. (N. Eng. J. Med. 298)
Vol. 1384-88 (1978)) describes the use of iodine as an antibody against the known tumor-associated antigen embryonal carcinoma antigen (CEA).
Disclosed are diagnostic imaging experiments labeled with ¹³¹ and injected into cancer patients. After 48 hours, the patient was scanned with a gamma-ray scintillation camera and the gamma-radiogram revealed the location of the tumor.

【０００３】但しヨウ素の同位元素で標識した抗体は、
生体内で酵素的、非酵素的にヨウ素の脱離を起し、これ
は放射線画像診断法の問題点の１つとなっている。他の
研究者らは、細胞毒性ラジオアイソトープを生体内腫瘍
沈着物に分配するための抗体／金属イオン結合体の治療
的使用法を開示している。オーダー（Order)ら（Int.
J. Radiation Oncology Biol. Phys.第１２巻、２７７
〜８１頁（１９８６年）は、イットリウム⁹⁰でキレート
化した抗フエリチンポリクローナル抗体による肝細胞癌
の治療を開示している。ダックスバウム（Duchsbaum)ら
(Int.J. Radiation Oncology Biol. Phys. 第１２巻、
７９〜８２頁（１９８５年））は、ＣＥＡに対するモノ
クローナル抗体イットリウム⁹⁰で放射線標識する処理を
開示し、これによる結腸直腸癌の位置決定および治療の
可能性を示唆している。ニコロッテイ（Nicolotti)（欧
州特許出願第１７４，８５３号、公開日１９８６年３月
１９日）は、金属イオンと抗体フラグメントから成る結
合体を開示している。この開示によれば、サブクラスＩ
ｇＧのモノクローナル抗体は酵素的に処理されてＦｃフ
ラグメントが離脱し、抗体の主要分枝鎖を結合している
ジスルフイド結合を還元的に開裂させる。Ｆａｂ′フラ
グメントを、生体内診断的または治療的用途のために放
射性核種金属イオンに結合したキレート化剤に連結させ
る。However, an antibody labeled with an isotope of iodine is
In the living body, desorption of iodine is caused enzymatically or non-enzymatically, which is one of the problems of the radiographic imaging method. Other investigators have disclosed the therapeutic use of antibodies / metal ion conjugates to deliver cytotoxic radioisotopes to tumor deposits in vivo. Order et al. (Int.
J. Radiation Oncology Biol. Phys. Volume 12, 277
Pp. 81 (1986) discloses the treatment of hepatocellular carcinoma with an anti-ferritin polyclonal antibody chelated with yttrium ⁹⁰ . Duchsbaum et al.
(Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. Volume 12,
79-82 (1985)) discloses radiolabeling treatment with the yttrium ⁹⁰ monoclonal antibody against CEA, suggesting the potential for localization and treatment of colorectal cancer. Nicolotti (European Patent Application No. 174,853, published Mar. 19, 1986) discloses conjugates consisting of metal ions and antibody fragments. According to this disclosure, subclass I
The gG monoclonal antibody is enzymatically treated to release the Fc fragment and reductively cleave the disulphide bond linking the major branch chains of the antibody. Fab 'fragments are linked to chelating agents linked to radionuclide metal ions for in vivo diagnostic or therapeutic applications.

【０００４】抗体／金属イオン結合体は、金属結合基な
らびに蛋白質基質に共有結合することができる部分の配
列から成る二官能性キレート化剤を使用することにより
形成させることができる。二官能性キレート化剤に関す
る従来の研究では、ジエチレントリアミンペンタ酢酸
（ＤＴＰＡ）化合物およびその誘導体が例示されてい
る。この化合物は２個のエチレン鎖により連結する３個
の窒素原子を基本骨格とするものである。該基本骨格上
の窒素原子からの拡がりは５個のカルボキシメチル部分
である。このカルボキシメチル基のうちの１個と、抗体
または他の蛋白質分子上に存在するアミノ酸残基とを反
応させてアミド結合を形成させることができることが開
示されている。他の４個のカルボキシメチル部分は、３
個の窒素原子と共に金属結合のために使用されるために
保留される。不幸にして反応性基質とＤＴＰＡ中のキレ
ート官能性の間に固有の差異がないので、上記方法は架
橋結合、および標的抗原との結合性能の付随的低下を伴
う抗体の変性を起すことが大きな問題となっている。Antibody / metal ion conjugates can be formed by using a bifunctional chelating agent consisting of a metal binding group as well as a sequence of moieties capable of covalently binding to a protein substrate. Previous work on bifunctional chelating agents has exemplified diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) compounds and their derivatives. This compound has a basic skeleton of three nitrogen atoms linked by two ethylene chains. The extension from the nitrogen atom on the basic skeleton is 5 carboxymethyl moieties. It is disclosed that one of the carboxymethyl groups can be reacted with amino acid residues present on the antibody or other protein molecule to form an amide bond. The other four carboxymethyl moieties are 3
Reserved for use for metal binding with nitrogen atoms. Unfortunately, since there is no inherent difference between the chelating functionality in the reactive substrate and the DTPA, the method is largely subject to cross-linking and denaturation of the antibody with concomitant reduction in binding performance with the target antigen. It's a problem.

【０００５】このような好ましくない架橋結合の可能性
を避けるため、特異な蛋白質基質反応性サイトを組入れ
た二官能性キレート化剤が開発された。かかる化合物の
最初のものはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）化合
物の誘導体である。この化合物はエチレン鎖を連結した
２個の窒素原子の基本骨格を有する。該基本骨格上の窒
素原子からの拡がりは４個のカルボキシメチル部分であ
って、金属の結合のため該構造中の窒素原子が適当であ
る。このＥＤＴＡの二官能性キレート誘導体は、特異な
蛋白質基質反応性官能基がポリアミン骨格のエチレン炭
素において結合することが特色である。In order to avoid such potential undesired cross-linking, bifunctional chelating agents have been developed which incorporate unique protein substrate reactive sites. The first of these compounds is a derivative of the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) compound. This compound has a basic skeleton of two nitrogen atoms connecting ethylene chains. The divergence from the nitrogen atom on the basic skeleton is four carboxymethyl moieties, the nitrogen atom in the structure being suitable for metal binding. This bifunctional chelate derivative of EDTA is characterized by a unique protein substrate reactive functional group attached at the ethylene carbon of the polyamine backbone.

【０００６】サンドバーグ（Sundberg) ら(J. Med. Che
m.第１７巻、１３０４頁（１９７４年））は、パラアミ
ノフェニル蛋白質反応性置換基を有するＥＤＴＡ誘導体
の合成法を開示している。次いで該アミンと化学的に修
飾した蛋白質部分を反応させるか、または第一アミン体
を温和な条件で処理して蛋白質基質に結合することがで
きる他の置換基を形成させることにより、上記誘導体
を、温和な条件で蛋白質基質に結合することができる二
官能性キレート化剤に変換することができる。Sandberg et al. (J. Med. Che
m. 17: 1304 (1974)) discloses a method for synthesizing EDTA derivatives having para-aminophenyl protein reactive substituents. The above derivative is then prepared by reacting the chemically modified protein moiety with the amine, or by treating the primary amine form under mild conditions to form another substituent capable of binding to the protein substrate. It can be converted into a bifunctional chelating agent that can bind to protein substrates under mild conditions.

【０００７】ミーアス（Meares) ら(J. Protein Chem．
第３巻、２１５〜２２８頁（１９８４年））は、そのパ
ラアミノフェニル誘導体を原料として、亜硝酸処理によ
りジアゾニウム誘導体に変換したり、チオホスゲン処理
で誘導されるイソチオシアネートに変換したり、臭化ブ
ロモアセチルで処理して誘導されるブロモアセトアミド
誘導体に変換したり、さらに塩化パルミトイルで処理す
ることによりパルミタアミドベンジル誘導体に変換した
りする方法を開示している。アルトマン（Altman) ら
(J. Chem. Soc. Perkis Trans. I. 第３６５巻、５９〜
６２頁（１９８３年））は、上記ＥＤＴＡ化合物の多く
のフエネチル類似体を開示している。Meares et al. (J. Protein Chem.
Vol. 3, pp. 215-228 (1984)), using the paraaminophenyl derivative as a raw material, it is converted to a diazonium derivative by nitrite treatment, isothiocyanate derived by thiophosgene treatment, or bromobromide. It discloses a method of converting to a bromoacetamide derivative derived by treatment with acetyl and further converting to a palmitamide benzyl derivative by treatment with palmitoyl chloride. Altman et al.
(J. Chem. Soc. Perkis Trans. I. Volume 365, 59-
62 (1983)) discloses many phenethyl analogs of the EDTA compounds.

【０００８】特開昭６３−２９０８５４号に開示されて
いるジョンソンらによる二官能性キレート化剤も上記と
同様の考え方に基づいている。しかしながらこれらのキ
レート化剤は架橋による蛋白質の変性の問題については
これを軽減するものであるかも知れないが、依然として
蛋白質に対する不特定な結合とそれに基づく不都合につ
いては改良されていないし、連結基の部分にフェニル基
のような芳香族環を用いているために生体内での非特異
的な吸着が大きく、抗体自身の特異性が低下する点で十
分なものとはいえない。The bifunctional chelating agent by Johnson et al. Disclosed in JP-A-63-290854 is also based on the same concept as above. However, although these chelating agents may alleviate the problem of protein denaturation due to cross-linking, they still do not improve the unspecific binding to proteins and the inconveniences associated therewith, and the linking moiety Since it uses an aromatic ring such as a phenyl group, non-specific adsorption in vivo is large, and the specificity of the antibody itself is lowered, which is not sufficient.

【０００９】[0009]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、金属
イオンを含む安定な錯体を形成することができるＥＤＴ
ＡもしくはＤＴＰＡのメチレン骨格に、蛋白質の部位特
異的に共有結合可能な置換基を導入した、芳香族基を有
しない二官能性キレート化剤、及び該二官能性キレート
化剤と蛋白質との複合体並びにその用途を提供すること
である。The object of the present invention is to provide an EDT capable of forming a stable complex containing a metal ion.
Aromatic group-free bifunctional chelating agent in which a substituent capable of site-specific covalent bonding to a protein is introduced into the methylene skeleton of A or DTPA, and a complex of the bifunctional chelating agent and the protein It is to provide a body and its use.

【００１０】本発明の他の目的は、最小モル比（１：
１）の蛋白質を用いながら免疫複合体を製造するための
効率的な方法を提供することである。Another object of the present invention is the minimum molar ratio (1:
It is to provide an efficient method for producing an immune complex while using the protein of 1).

【００１１】[0011]

【課題を解決するための手段】本発明は下記一般式
（１）で示される二官能性キレート化剤及び該キレート
化剤と蛋白質との複合体に関する。The present invention relates to a bifunctional chelating agent represented by the following general formula (1) and a complex of the chelating agent and a protein.

【００１２】[0012]

【化２】 本発明の二官能性キレート化剤は、構造中の金属結合性
を損傷することなくポリアミノポリカルボン酸中に蛋白
質中のスルフヒドリル基と特異的に結合し得るマレイミ
ド基を導入することができる点で有益である。本発明は
また、上記二官能性キレート化剤と蛋白質との複合体を
提供するものである。[Chemical 2] The bifunctional chelating agent of the present invention is capable of introducing a maleimide group capable of specifically binding to a sulfhydryl group in a protein into a polyaminopolycarboxylic acid without damaging the metal binding property in the structure. Be beneficial. The present invention also provides a complex of the above bifunctional chelating agent and a protein.

【００１３】本発明の一つの態様によれば該キレート化
剤と結合するタンパク質は抗体であり、特に好ましくは
抗体のＦａｂ′断片である。本発明の上記抗体−キレー
ト化剤複合体と放射性金属イオンとの組み合わせを用い
て、生体内画像診断を行うことができる。また、放射性
金属イオンが細胞毒性をもつものであれば腫瘍特異抗体
と組み合わせることにより、癌等の疾病の治療を行うこ
とも可能である。別の利用法としては、Ｅｕ³⁺のような
ランタニド系の金属イオンと結合させて時間分解蛍光イ
ムノアッセイ法に応用することもできる。According to one aspect of the invention, the protein which binds to the chelating agent is an antibody, particularly preferably a Fab 'fragment of an antibody. In vivo image diagnosis can be performed using the combination of the above-described antibody-chelating agent complex of the present invention and a radioactive metal ion. If the radioactive metal ion has cytotoxicity, it can be treated with a tumor-specific antibody to treat a disease such as cancer. As another utilization method, it can be applied to a time-resolved fluorescence immunoassay method by binding with a lanthanide-based metal ion such as Eu ³⁺ .

【００１４】さらに、本発明の方法により製造される複
合体は、効率的な複合をもたらすチオエーテル結合によ
り連結され、高い収率及び複合時間の短縮が得られる。
連結反応は好ましくは、それぞれ抗体及び蛋白質上に最
少１個のスルフヒドリル基（本来のジスルフィド基に由
来する）及び１個のマレイミド基を生じさせるように最
適pH及び還元剤濃度を用いて行われる。Furthermore, the conjugates produced by the method of the present invention are linked by thioether bonds which lead to efficient conjugation, resulting in high yields and reduced conjugation times.
The ligation reaction is preferably carried out using an optimum pH and reducing agent concentration to generate a minimum of one sulfhydryl group (from the native disulfide group) and one maleimide group on the antibody and protein, respectively.

【００１５】本発明の二官能性キレート化剤は通常の有
機化学的な方法で合成することができる。一般的な合成
法の一例を以下の合成スキームに示す。The bifunctional chelating agent of the present invention can be synthesized by a conventional organic chemistry method. An example of a general synthesis method is shown in the following synthesis scheme.

【００１６】[0016]

【化３】 [Chemical 3]

【００１７】[0017]

【化４】 この合成ルートの特徴は、ＥＤＴＡ部のアミノ基とマレ
イミド連結部のアミノ基を区別するために Bamberger
開裂というイミダゾール開環反応を鍵反応として利用し
た点にある。[Chemical 4] The feature of this synthetic route is that Bamberger is used to distinguish the amino group of the EDTA part from the amino group of the maleimide linkage part.
The point is that the imidazole ring-opening reaction called cleavage is used as a key reaction.

【００１８】次に本発明の二官能性キレート化剤と蛋白
質との結合法について説明する。蛋白質がスルフヒドリ
ル基を有する場合はそのまま本発明の二官能性キレート
化剤との反応が可能であり、蛋白質がスルフヒドリル基
を有しない場合、蛋白質をイミノチオランのようなスル
フヒドリル基を導入できる反応剤と反応させてスルフヒ
ドリル基を導入した後、本発明の二官能性キレート化剤
と反応させることにより蛋白質と結合させることができ
る。Next, the method for binding the bifunctional chelating agent of the present invention to a protein will be described. When the protein has a sulfhydryl group, it can be directly reacted with the bifunctional chelating agent of the present invention.When the protein does not have a sulfhydryl group, the protein is reacted with a reagent capable of introducing a sulfhydryl group such as iminothiolane. After introducing the sulfhydryl group, the protein can be bound to the protein by reacting with the bifunctional chelating agent of the present invention.

【００１９】蛋白質が抗体である場合、抗体のＦｃ部を
ペプシンのような消化酵素で消化した後、ジチオスレイ
トールのような還元剤で還元してＦａｂ′断片とし、生
じたスルフヒドリル基を、本発明の二官能性キレート化
剤と反応させることが望ましい。本発明によりキレート
化することができる金属イオンは、診断的シンチグラフ
ィーに有用なガンマ線放出アイソトープを包含する。半
減期２．８日のインジウム¹¹¹ は特に有用であるが、ガ
リウム⁶⁷、ガリウム⁶⁹およびテクネチウム^99m を包含す
る他の適当なガンマ線放出体も有用である。When the protein is an antibody, the Fc portion of the antibody is digested with a digestive enzyme such as pepsin and then reduced with a reducing agent such as dithiothreitol to give Fab 'fragments, and the resulting sulfhydryl group is converted into It is desirable to react with the inventive bifunctional chelating agent. Metal ions that can be chelated according to the present invention include gamma-emitting isotopes useful for diagnostic scintigraphy. Indium ^{111, which} has a half-life of 2.8 days, is particularly useful, but other suitable gamma emitters including gallium ⁶⁷ , gallium ⁶⁹ and technetium ^99m are also useful.

【００２０】本発明による物質は、放射線療法のための
細胞毒性剤として有用なベータ放射線放出体にキレート
化することができる。かかる放出体は、スカンジウ
ム⁴⁶、スカンジウム⁴⁷、スカンジウム⁴⁸、銅⁶⁷、ガリウ
ム⁷²、ガリウム⁷³、イットリウム ⁹⁰、ルテニウム⁹⁷、パ
ラジウム¹⁰⁰ 、ロジウム^101m、パラジウム¹⁸⁶ 、サマリ
ウム¹⁵³ 、レニウム¹⁸⁶ 、レニウム¹⁸⁹ 、ラジウム²¹²
および鉛²¹² のようなアイソトープを包含する。The substances according to the invention are suitable for radiation therapy.
Chelating beta-emitters useful as cytotoxic agents
Can be converted. Such an emitter is
Mu⁴⁶,scandium⁴⁷,scandium⁴⁸,copper⁶⁷, Gariu
Mu⁷²,gallium⁷³,yttrium ⁹⁰,ruthenium⁹⁷, Pa
radium¹⁰⁰,rhodium^101m,palladium¹⁸⁶, Summary
Umm¹⁵³,rhenium¹⁸⁶,rhenium¹⁸⁹,radium²¹²
And lead²¹²Such isotopes are included.

【００２１】本発明のキレート化剤は、ビスマス²¹² の
ようなアルファ放射線放出物、銅⁶²のような陽電子放出
体、テルビウムおよびユーロピウムのようなランタニド
系およびルテニウムのような遷移元素系の蛍光元素およ
びガドリニウムと鉄のようなパラ磁性元素を結合させて
使用することができる。また本発明のキレート化剤は、
金属イオンの触媒性が有効であるような場合を含む種々
の目的のために有用なこともある他の多くの金属イオン
と結合させるのに適当である。The chelating agents of the present invention include alpha radiation emitters such as bismuth ²¹² , positron emitters such as copper ⁶² , lanthanide-based fluorescent elements such as terbium and europium and transition element-based fluorescent elements such as ruthenium and A gadolinium and a paramagnetic element such as iron can be combined and used. Further, the chelating agent of the present invention is
It is suitable for binding with many other metal ions which may be useful for a variety of purposes, including when the catalytic properties of the metal ion are effective.

【００２２】キレート化剤／金属イオン結合体の製造法
は、この技術分野でよく知られている。キレート化剤と
金属イオンの錯体は、一般にキレート化剤／基質の結合
体（Conjugate)を、金属イオンと共に該結合体が生理学
的に安定に保持される緩衝溶液中で熟成させることによ
り製造することができる。適当な緩衝剤はクエン酸塩、
酢酸またはグリシンのような弱い金属−結合特性を有す
る緩衝剤を包含する。適当な濃度、温度およびpHは、基
質上の弱い金属結合サイトよりむしろキレート化官能基
への金属イオンの結合を確実にするようにこの分野の技
術者により選択することができる。溶液はすべて金属不
純物が含まれないように保持することが特に望ましい。
適当時間熟成後、必要に応じて未結合金属を、ゲル濾過
のような操作により基質／キレート化剤／金属イオン結
合体から分離してもよい。Methods for making chelating agent / metal ion conjugates are well known in the art. Chelating agent-metal ion complexes are generally prepared by aging a chelating agent / substrate conjugate (Conjugate) with a metal ion in a buffer solution in which the conjugate is physiologically stable. You can A suitable buffer is citrate,
Includes buffers with weak metal-binding properties such as acetic acid or glycine. Appropriate concentrations, temperatures and pHs can be selected by those skilled in the art to ensure the binding of metal ions to chelating functional groups rather than weak metal binding sites on the substrate. It is especially desirable to keep the solution completely free of metallic impurities.
After aging for a suitable time, unbound metal may be separated from the substrate / chelating agent / metal ion binder by an operation such as gel filtration if necessary.

【００２３】以下に本発明で用いられる二官能性キレー
ト化剤の化合物例を挙げる。但、本発明で用いられる二
官能性キレート化剤はこれらに限定されるものではな
い。The compound examples of the bifunctional chelating agent used in the present invention are listed below. However, the bifunctional chelating agent used in the present invention is not limited to these.

【００２４】[0024]

【化５】 [Chemical 5]

【００２５】[0025]

【化６】 [Chemical 6]

【００２６】〔実施例１〕 化合物Ａ−５の合成 Ａ−４の合成は E. Fujitaらの論文（Chem. Pharm. Bul
l.３２巻、２６８７頁１９８４年）記載の方法に従っ
た。Ａ−４ ２７ｇをアセトニトリル４００ml、１０％
酢酸カリウム１８０mlに溶解させジ−ｔ−ブチルジカー
ボネート１００ｇを加えて室温で４日間攪拌した。溶媒
を減圧で留去したのちメタノール５００mlを加えて２時
間還流し、メタノールを留去した。残査を酢酸エチルで
抽出し酢酸エチル層を乾燥後留去し、カラムクロマトグ
ラフィー（ヘキサン：酢酸エチル７：３）にて精製し、
Ａ−５を得た。収量３１ｇ（６６％） Ａ−４ ＮＭＲ (CDCl₃) 2.65 (2H, t), 3.20 (2H, m), 4.95 (2H, s), 6.70
(1H, s), 7.20 (5H,s), 7.45 (1H, s) ＭＳ：２４５（Ｍ⁺ ） Ａ−５ ＮＭＲ (CDCl₃) 1.45 (18H, s), 2.30 (2H, t), 3.25 (2H, q), 5.10
(2H, s), 6.25 (1H,s), 7.40 (5H, s) ＭＳ：４３５（Ｍ⁺ ）Example 1 Synthesis of Compound A-5 Synthesis of A-4 was performed by E. Fujita et al. (Chem. Pharm. Bul.
l.32, 2687, 1984). A-4 27 g, acetonitrile 400 ml, 10%
It was dissolved in 180 ml of potassium acetate, 100 g of di-t-butyl dicarbonate was added, and the mixture was stirred at room temperature for 4 days. After the solvent was distilled off under reduced pressure, 500 ml of methanol was added and the mixture was refluxed for 2 hours to distill off methanol. The residue was extracted with ethyl acetate, the ethyl acetate layer was dried and evaporated, and purified by column chromatography (hexane: ethyl acetate 7: 3).
A-5 was obtained. Yield 31g (66%) A-4 NMR (CDCl 3) 2.65 (2H, t), 3.20 (2H, m), 4.95 (2H, s), 6.70
(1H, s), 7.20 (5H, s), 7.45 (1H, s) MS: 245 (M ⁺ ) A-5 NMR (CDCl ₃ ) 1.45 (18H, s), 2.30 (2H, t), 3.25 ( 2H, q), 5.10
(2H, s), 6.25 (1H, s), 7.40 (5H, s) MS: 435 (M ⁺ ).

【００２７】Ａ−６の合成 １１ｇのＡ−５をメタノール３００mlに溶解し１０％Ｐ
ｄ−Ｃを触媒としてオートクレーブ中５０℃５０気圧で
２４時間水素添加した。反応終了後、溶媒を留去しアセ
トニトリルにて再結晶し、Ａ−６を得た。収量６ｇ（７
６％） Ａ−６ ＮＭＲ (CDCl₃) 1.40 (18H, s), 2.6 〜3.7 (7H, m) ＭＳ：３０３（Ｍ⁺ ）Synthesis of A-6 11 g of A-5 was dissolved in 300 ml of methanol to obtain 10% P
Hydrogenation was carried out in an autoclave at 50 ° C. and 50 atm for 24 hours using dC as a catalyst. After completion of the reaction, the solvent was distilled off and the residue was recrystallized from acetonitrile to obtain A-6. Yield 6g (7
6%) A-6 NMR (CDCl ₃ ) 1.40 (18H, s), 2.6 to 3.7 (7H, m) MS: 303 (M ⁺ ).

【００２８】Ａ−７の合成 Ａ−６ ３ｇをジクロルメタンに溶解させトリエチルア
ミン２ml、カルボベンゾキシクロリド２ｇと１時間反応
させた。反応終了後希塩酸で処理し、有機層を濃縮し、
カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル３：
２）で精製し、ヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒で再結
晶し、Ａ−７を得た。収量２．８ｇ（６５％） Ａ−７ ＮＭＲ (CDCl₃) 1.45 (18H, s), 2.7 〜3.6 (7H, m), 5.10 (2H, s),
7.30 (5H, s) ＭＳ：４３８（Ｍ⁺ ＋Ｈ） Ａ−９の合成 Ａ−７ ２．３ｇをジクロルメタン１５mlに溶解し、ト
リフルオロ酢酸１０mlを添加し、そのまま室温にて７時
間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧で留去し、Ａ−８
（ＭＳ：２３８（Ｍ⁺ ＋Ｈ））を得た。さらなる精製を
加えずに次の反応を行った。Synthesis of A-7 3 g of A-6 was dissolved in dichloromethane and reacted with 2 ml of triethylamine and 2 g of carbobenzoxylcolide for 1 hour. After the reaction was completed, the mixture was treated with dilute hydrochloric acid and the organic layer was concentrated,
Column chromatography (hexane: ethyl acetate 3:
Purified in 2) and recrystallized with a mixed solvent of hexane and ethyl acetate to obtain A-7. Yield 2.8g (65%) A-7 NMR (CDCl 3) 1.45 (18H, s), 2.7 ~3.6 (7H, m), 5.10 (2H, s),
7.30 (5H, s) MS: Synthesis of 438 (M ⁺ + H) A-9 2.3 g of A-7 was dissolved in 15 ml of dichloromethane, 10 ml of trifluoroacetic acid was added, and the mixture was stirred at room temperature for 7 hours. After completion of the reaction, the solvent was distilled off under reduced pressure to give A-8.
^{(MS: 238 (M + +} H)) was obtained. The next reaction was carried out without further purification.

【００２９】すなわち、上で得られた残渣にアセトニト
リル１５mlを加え、プロトンスポンジ（１，８−ジメチ
ルアミノナフタレン）６ｇとヨウ化ナトリウム０．３ｇ
を加え、さらに６ｇのブロム酢酸ｔ−ブチルエステルを
加え２０時間還流した。溶媒を留去後、酢酸エチルを加
えて不溶物を濾去し、濾液をカラムクロマトグラフィー
（ヘキサン：酢酸エチル＝７：３）にて精製し、Ａ−９
を得た。収量１．２ｇ（３３％） Ａ−９ ＮＭＲ (CDCl₃) 1.45 (36H, s), 2.5 〜3.2 (7H, m), 3.2 〜3.6 (8H,
m), 5.25 (2H, s),7.40 (5H, s) ＭＳ：７１６（Ｍ⁺ ＋Ｎａ） Ａ−１０（ｎ＝３）の合成 Ａ−９ ０．２ｇをエタノール中１０％Ｐｄ−Ｃを触媒
として常圧で水素添加した。反応終了後、触媒を除去
し、溶媒を減圧にて留去した。That is, 15 ml of acetonitrile was added to the residue obtained above, 6 g of proton sponge (1,8-dimethylaminonaphthalene) and 0.3 g of sodium iodide.
Was added, 6 g of bromoacetic acid t-butyl ester was further added, and the mixture was refluxed for 20 hours. After distilling off the solvent, ethyl acetate was added to remove insoluble matter by filtration, and the filtrate was purified by column chromatography (hexane: ethyl acetate = 7: 3) to give A-9.
Got Yield 1.2g (33%) A-9 NMR (CDCl 3) 1.45 (36H, s), 2.5 ~3.2 (7H, m), 3.2 ~3.6 (8H,
m), 5.25 (2H, s), 7.40 (5H, s) MS: 716 (M ⁺ + Na) Synthesis of A-10 (n = 3) 0.2g of A-9 was catalyzed by 10% Pd-C in ethanol. Was hydrogenated at atmospheric pressure. After completion of the reaction, the catalyst was removed and the solvent was distilled off under reduced pressure.

【００３０】残査にジクロルメタン２ml、トリエチルア
ミン０．５ml、ＧＭＢＳ（N-succinimidyl-4-maleimido
butyrate、同仁化学）８０mgを加え、１時間室温で反応
させた。希塩酸で中和後クロロホルムで抽出し、カラム
クロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝３：２）
で精製し、Ａ−１０を得た。収量８０mg（収率４０％） Ａ−１０ ＮＭＲ (CDCl₃) 1.45 (36H, s), 1.85 (2H, t), 2.25 (2H, t), 2.40
〜3.30 (7H, m), 3.40 〜3.70 (8H, m), 6.70 (2H,
s) ＭＳ：７５７（Ｍ⁺ ＋Ｎａ） Ａ−１１（ｎ＝３）の合成 Ａ−１０ ８０mgをクロロホルム２mlに溶解させ１mlの
トリフルオロ酢酸を加え、室温で３時間反応させた後、
溶媒を減圧で留去し、残渣をそのまま蛋白質との結合反
応に用いた。また、上記反応終了後、凍結乾燥し、ＭＳ
用のサンプルとした。 Ａ−１１ ＭＳ：５２３（Ｍ⁺ ＋Ｎａ）The residue was 2 ml of dichloromethane, 0.5 ml of triethylamine, GMBS (N-succinimidyl-4-maleimido).
butyrate, Dojindo Chemical Co., Ltd.) (80 mg) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. After neutralizing with dilute hydrochloric acid and extracting with chloroform, column chromatography (ethyl acetate: hexane = 3: 2)
Purification was carried out at to obtain A-10. Yield 80 mg (40% _{yield) A-10 NMR (CDCl 3} ) 1.45 (36H, s), 1.85 (2H, t), 2.25 (2H, t), 2.40
~ 3.30 (7H, m), 3.40 ~ 3.70 (8H, m), 6.70 (2H,
s) MS: Synthesis of 757 (M ⁺ + Na) A-11 (n = 3) 80 mg of A-10 was dissolved in 2 ml of chloroform, 1 ml of trifluoroacetic acid was added, and the mixture was reacted at room temperature for 3 hours.
The solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was directly used for the binding reaction with the protein. After completion of the above reaction, lyophilize and MS
Was used as a sample. A-11 MS: 523 (M + + Na)

【００３１】〔実施例２〕 抗体の修飾 抗体の消化は、ファームらの文献〔Pharm et al., J. I
mmunology,１３１巻，２８９５頁（１９８３）〕に記載
の一般的方法に従って行った。すなわち、リン酸バッフ
ァー食塩水（pH７．２）中の濃度２mg／mlの抗ＣＥＡ抗
体１０mgを１．０Ｍクエン酸（pH３．５）１．６６mlに
加えた。ついでこの溶液にリン酸バッファー食塩水：ク
エン酸（９：１、ｖ／ｖ、pH３．７）中のペプシン０．
２５mg／mlの溶液０．８３mlを加え、さらにリン酸バッ
ファー食塩水（pH７．２）を１．６６ml加えた。得られ
た混合物を３７℃で１６時間インキュベートし、ついで
１．０Ｍ Tris １．６６mlを加えてペプシンを不活性
化した。その溶液をプロティンＡ−セファロースカラム
（ファルマシア、ニュージャージー）に通して完全な免
疫グロブリンおよびＦｃ断片を除き、ついで溶出液をバ
イオ・ゲルＰ−１００カラム（バイオ・ラド）上のクロ
マトグラフィーにかけて免疫グロブリンをペプシンから
分離した。所望のＦ（ａｂ′)₂断片をこのカラムからボ
イド容積中に溶出させた。[Example 2] Modification of antibody Digestion of an antibody is carried out according to the method of Pharm et al [Pharm et al., J. I.
mmunology, 131, 2895 (1983)]. That is, 10 mg of anti-CEA antibody having a concentration of 2 mg / ml in phosphate buffer saline (pH 7.2) was added to 1.66 ml of 1.0 M citric acid (pH 3.5). This solution was then added to pepsin 0. 0 in phosphate buffered saline: citric acid (9: 1, v / v, pH 3.7).
0.83 ml of a 25 mg / ml solution was added, and 1.66 ml of phosphate buffer saline (pH 7.2) was further added. The resulting mixture was incubated at 37 ° C for 16 hours and then 1.66 ml of 1.0 M Tris was added to inactivate pepsin. The solution is passed through a Protein A-Sepharose column (Pharmacia, NJ) to remove intact immunoglobulins and Fc fragments, then the eluate is chromatographed on a Bio-Gel P-100 column (Bio-Rad) to remove immunoglobulins. Separated from pepsin. The desired F (ab ') ₂ fragment was eluted from this column into the void volume.

【００３２】つぎの工程では抗ＣＥＡモノクロナール抗
体からのＦ（ａｂ′)₂断片を０．１Ｍ KH₂PO₄／０．１
Ｍ NaHCO₃（pH８．５）に対して約３〜約８℃で一夜透
析し、断片の濃度を１．３３mg／mlに調節した。 Ｆａｂ′化と二官能性キレート化剤の反応 上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ′)₂断片を２
５ mM ジチオスレイトールでpH７．５で還元し、還元さ
れたＦａｂ′断片を単離したのち化合物Ｂ−１と１５分
間インキュベートし、生じた免疫複合体をＨＰＬＣゲル
濾過で単離した。In the next step, the F (ab ') ₂ fragment from the anti-CEA monoclonal antibody was added to 0.1M KH ₂ PO ₄ /0.1.
It was dialyzed against M NaHCO ₃ (pH 8.5) at about 3 to about 8 ° C. overnight, and the fragment concentration was adjusted to 1.33 mg / ml. Fab ′ formation and reaction of bifunctional chelating agent The above anti-CEA monoclonal antibody F (ab ′) ₂ fragment
After reduction with 5 mM dithiothreitol at pH 7.5 and isolation of the reduced Fab 'fragment, it was incubated with compound B-1 for 15 minutes and the resulting immune complex was isolated by HPLC gel filtration.

【００３３】本発明の抗体−キレート化剤複合体の効果
を比較するために、従来用いられていた抗体とＤＴＰＡ
との結合体を作製した（比較化合物）。従来技術のもの
は、ナトウィッチらの文献〔Hnatovich et al., J. Imm
unol.Meth.,６５、１４７（１９８３）〕に記載されて
いるように、タンパク質をＤＴＰＡの２環無水物と反応
させることによってそのタンパク質分子にジエチレント
リアミンテトラアセテート（ＤＴＴＡ）残基を組み込ん
である。上記抗体はＩｇＧ₁ サブタイプの免疫グロブリ
ンであり、１０⁹ Ｌ．／モルよりも多いときに一定の親
和性でＣＥＡに結合し、非特異的交差反応性抗原１（Ｎ
ＣＡ１）とは反応しない。抗体はＢＡＬＢ／ｃマウスで
産生させ、プロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂ（シグ
マ・ケミカル、セント・ルイス、ＭＯ）上のアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより腹水から単離した。０．
１Ｍ KH₂PO₄／０．１５Ｍ NaCl／０．０５Ｍ ＨＰＥ
Ｓ（pH７．２）に対し徹底的に透析した後、抗体濃度を
１．０mg／mlに調節し、その溶液を必要なときまで２〜
８℃で保存した。抗体濃度はブラッドフォード色素結合
アッセイ（バイオ・ラド・ラボラトリーズ、リッチモン
ド、ＣＡ）により測定した。これを製造業者の説明書に
従って行った。 インジウム¹¹¹ の標識 上記本発明及び比較例の抗体−キレート化剤結合体をイ
ンジウム¹¹¹ で標識した。この場合、０．０５Ｍクエン
酸ナトリウム（pH６．０）に１．０mg／mlの濃度の抗体
・キレート化剤結合体のアリコート０．１mlをプラスチ
ック製のミクロ試験管に移し、６NHClを加えてpHを４．
５〜５．０に調節した。その結合体溶液に０．０４Ｍ H
Cl中のキャリヤーなし ¹¹¹InCl₃ （約５０〜４００ mCi
／ml、一般的には約８０ mCi／ml）６μl を加え、６N
NaOHを加えてそのpHを再び７．０に調節した。その溶液
を室温で約３０分間インキュベートした後、未結合イン
ジウム¹¹¹ をミアーズらの文献〔Meares et al., Anal.
Biochem. 、１４２、６８、（１９８４）〕に記載の遠
心分離ゲル濾過カラム法により放射活性の結合した抗体
から分離した。１００×ｇで２分間遠心分離したセファ
デックスＧ−５０ミクロカラムから溶出した放射標識結
合を規定食塩水中に希釈して最終濃度を１０μｇ／mlに
して、ＥＬＩＳＡアッセイを行ったところ、インジウム
¹¹¹ 標識手順の間中に免疫反応性の損失は認められなか
った。また、蛋白質濃度と放射活性の関係から本発明の
免疫複合体は１：１で結合しているのに対し比較例の抗
体−ＤＴＰＡ結合体は１：５で結合していることがわか
った。In order to compare the effects of the antibody-chelating agent complex of the present invention, the conventionally used antibody and DTPA
A conjugate with was prepared (comparative compound). The prior art is based on the article by Natwich et al. [Hnatovich et al., J. Imm.
unol. Meth., 65 , 147 (1983)] by incorporating a diethylenetriaminetetraacetate (DTTA) residue into the protein molecule by reacting the protein with the dianhydride of DTPA. The above-mentioned antibody is an IgG ₁ subtype immunoglobulin and is 10 ⁹ L. Non-specific cross-reactive antigen 1 (N
It does not react with CA1). Antibodies were raised in BALB / c mice and isolated from ascites by affinity chromatography on Protein A Sepharose CL-4B (Sigma Chemical, St. Louis, MO). 0.
1M KH ₂ PO ₄ /0.15M NaCl / 0.05M HPE
After thorough dialysis against S (pH 7.2), the antibody concentration was adjusted to 1.0 mg / ml, and the solution was adjusted to 2-mg until needed.
Stored at 8 ° C. Antibody concentration was measured by the Bradford dye binding assay (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). This was done according to the manufacturer's instructions. Labeling of Indium ¹¹¹ The antibody-chelating agent conjugates of the present invention and comparative examples were labeled with Indium ¹¹¹ . In this case, a 0.1 ml aliquot of the antibody / chelating agent conjugate at a concentration of 1.0 mg / ml in 0.05 M sodium citrate (pH 6.0) was transferred to a plastic micro test tube, and 6N HCl was added to adjust the pH. 4.
Adjusted to 5-5.0. 0.04MH in the conjugate solution
No carrier in Cl ¹¹¹ InCl ₃ (Approx. 50-400 mCi
/ Ml, generally about 80 mCi / ml) 6 μl
The pH was readjusted to 7.0 by adding NaOH. After incubating the solution at room temperature for about 30 minutes, unbound indium ¹¹¹ was treated with unbound Indium ¹¹¹ [Meares et al., Anal.
Biochem., 142 , 68, (1984)], and separated from the radioactively bound antibody by the centrifugal gel filtration column method. Radiolabeled binding eluted from Sephadex G-50 microcolumns centrifuged at 100 × g for 2 minutes was diluted in normal saline to a final concentration of 10 μg / ml and an ELISA assay was performed.
^No loss of immunoreactivity was observed during the ¹¹¹ labeling procedure. From the relationship between protein concentration and radioactivity, it was found that the immune complex of the present invention was bound at 1: 1 whereas the antibody-DTPA conjugate of Comparative Example was bound at 1: 5.

【００３４】〔実施例３〕 生体内分布テスト （実施例２）で示した本発明のインジウム¹¹¹ 標識免疫
複合体（ＣＥＡ（Ｂ−１）Ｉｎ−１１１）と従来技術で
作製した複合体（ＣＥＡ−ＤＴＰＡ−Ｉｎ−１１１）の
生体内分布比較を高いＣＥＡレベルを示すヒト直腸癌細
胞株ＬＳ１７４Ｔの異種移植を有するヌードマウスで調
べた。[Example 3] Biodistribution test [Example 2] The indium ^111- labeled immunocomplex of the present invention (CEA (B-1) In-111) shown in Example 2 and a complex (CEA) prepared by a conventional technique were used. -DTPA-In-111) biodistribution comparison was investigated in nude mice with xenografts of the human rectal cancer cell line LS174T showing high CEA levels.

【００３５】メス無胸腺ヌードマウス（nu／nu，ＢＡＬ
Ｂ／Ｃ）を用意し、ＬＳ−１７４Ｔヒト結腸直腸癌細胞
（規定食塩水０．１ml中に１．２５×１０⁹ 〜２．５×
１０ ⁶ 細胞）を右後部脇腹に皮下注射して生体内分布を
調べた。１〜２週間以内に腫瘍が発生し、大きさは０．
４〜０．８ｇに達した。ついで処理前の動物を無作為に
グループ分けし（通常一群５匹）規定食塩水０．１ml中
の３種の標識抗体結合体の一つ１．０μｇを尾静脈から
静脈内注射した。注射後の種々の時間に頸部脱臼により
屠殺し、すべての内臓を取り、重さを測り、ついでガン
マカウンター（ＡＵＴＯ−ＬＯＧＩＣガンマカウンタ
ー、アボット・ラボラトリーズ）中でカウントした。血
液、筋肉および皮膚のアリコート（重量測定）もカウン
トした。またその動物死体の残部も同様にカウントし
た。尾は注射部位での溢血をチェックするために別にカ
ウントし、コントロールに放射ヨード処理した抗体を用
いたときには甲状腺の取り込みを評価するために頭部を
別にカウントした。注入物質のアリコート０．１mlを組
織と同時にカウントし、ついで各組織で測定した放射活
性を組織１ｇ当たりのこの注入投与量のパーセントで表
した。Female athymic nude mouse (nu / nu, BAL
B / C) and prepare LS-174T human colorectal cancer cells
(1.25 x 10 in 0.1 ml of normal saline⁹~ 2.5x
10 ⁶Cells) to the right rear flank for subcutaneous distribution
Examined. Tumors developed within 1-2 weeks and had a size of 0.
Reached 4-0.8g. Then randomly treat the untreated animals
Divided into groups (usually 5 per group) in 0.1 ml of normal saline
1.0 μg of one of the three labeled antibody conjugates of
It was injected intravenously. By cervical dislocation at various times after injection
Slaughter, remove all internal organs, weigh and then cancer
Ma counter (AUTO-LOGIC gamma counter
ー, Abbott Laboratories). blood
Liquid, muscle and skin aliquots (weighing) are also counted
I got it. Also, count the rest of the animal carcass as well.
It was The tail should be covered separately to check for bleeding at the injection site.
And use radioactive iodine-treated antibody as a control
Head to assess thyroid uptake
Counted separately. Assemble 0.1 ml aliquots of injected material
Radioactivity measured at each tissue and then measured at each tissue
Sex is expressed as a percentage of this injected dose per gram of tissue.
did.

【００３６】コントロールとして、抗アルファフェトプ
ロテインＩｇＧをヨウ素¹²⁵ で標識したモノクローナル
抗体を用いて実験した。標識は５〜１０ mCi／mlの特異
活性に対してクロラミン−Ｔ法を用いて行った。これら
の実験によって、ＣＥＡ非特異的抗体の取り込みは抗Ｃ
ＥＡ抗体の取り込みよりも小さいことがわかった。これ
らの実験におけるタンパク質の注射量および解剖やカウ
ントの手順は、インジウム標識試薬について上述したも
のと同じである。抗ＣＥＡ抗体のＬＳ１７４腫瘍中への
取り込みの経時的測定によって腫瘍／血液比が２日後に
最大に達することがわかったので、これをキレート化剤
結合体の実験のための期間として選んだ。As a control, an experiment was carried out using a monoclonal antibody labeled with anti-alpha fetoprotein IgG with ^125I . Labeling was performed using the chloramine-T method for specific activities of 5-10 mCi / ml. These experiments show that CEA non-specific antibody uptake is anti-C.
It was found to be smaller than the uptake of EA antibody. The protein injection volume and dissection and counting procedures in these experiments are the same as described above for the indium labeling reagent. This was chosen as the time period for the chelator conjugate experiments as the time course measurement of uptake of anti-CEA antibody into LS174 tumors revealed that the tumor / blood ratio reached a maximum after 2 days.

【００３７】生体内分布の実験の結果を下記に示す。The results of the biodistribution experiment are shown below.

【００３８】[0038]

【表１】 これは本発明のＣＥＡ−（Ｂ−１）−Ｉｎ−１１１複合
体と従来技術のＣＥＡ−ＤＴＰＡ−Ｉｎ−１１１複合体
との比較である。すべての値はｎ＝５の平均（±ＳＤ）
で表わしてある。比較例のＣＥＡ−ＤＴＰＡ−Ｉｎ−１
１１複合体における腫瘍へのとり込みの小さいことと他
の臓器との比が小さいこと（とくに肝臓）は、低い免疫
活性と架橋反応が原因と考えられる。一方本発明のＣＥ
Ａ−（Ｂ−１）−Ｉｎ−１１１複合体は、抗体断片を用
いていることから予想されるようにクリアランスが速く
従って全体の放射活性が低いにもかかわらず腫瘍集積度
は高くかつ腫瘍／血液比が９．１、腫瘍／肝臓比が実に
７．３という結果が得られた。[Table 1] This is a comparison between the CEA- (B-1) -In-111 composite of the present invention and the prior art CEA-DTPA-In-111 composite. All values are mean (± SD) of n = 5
It is represented by. CEA-DTPA-In-1 of Comparative Example
The low tumor uptake and low ratio to other organs in the 11 complex (particularly in the liver) may be due to low immunoreactivity and cross-linking reaction. On the other hand, the CE of the present invention
The A- (B-1) -In-111 complex has high tumor accumulation and high tumor accumulation in spite of low clearance and thus low overall radioactivity as expected from the use of antibody fragments. A blood ratio of 9.1 and a tumor / liver ratio of 7.3 were obtained.

【００３９】この結果は、本発明の複合体が血液のバッ
クグラウンドに比較して非常に高い腫瘍レベルの対比を
得ることができ、癌の画像診断の有力な方法を与えるこ
とができることを示すものである。前記の例は本発明の
具体例を示したにすぎないのであって本発明の範囲がそ
れらに限定されるものではない。This result shows that the complex of the present invention can obtain a very high tumor level contrast compared to the blood background, and can provide a powerful method for diagnostic imaging of cancer. Is. The above examples merely show specific examples of the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.

【００４０】[0040]

【発明の効果】本発明の二官能性キレート化剤は蛋白質
のスルフヒドリル基とのみ特異的に結合する特徴を有す
る。本発明の一つの実施態様によれば上記二官能性キレ
ート化剤と抗体もしくは抗体断片との複合体は、放射線
放出金属イオンを用いたインビボ画像診断に、及び細胞
障害性核種を用いた部位特異的治療に利用可能であり、
また蛍光性金属イオンを用いることにより高感度イムノ
アッセイへの応用も可能である。INDUSTRIAL APPLICABILITY The bifunctional chelating agent of the present invention is characterized in that it specifically binds only to sulfhydryl groups of proteins. According to one embodiment of the invention, the complex of the bifunctional chelating agent with an antibody or antibody fragment is used for in vivo imaging with radiation-emitting metal ions and for site-specific use with cytotoxic nuclides. Available for specific treatment,
Further, by using a fluorescent metal ion, it can be applied to a highly sensitive immunoassay.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/534 8310−2Ｊ ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁵ Identification code Internal reference number FI technical display location G01N 33/534 8310-2J

Claims (7)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 下記一般式（１）で表わされる二官能性
キレート化剤。 【化１】 1. A bifunctional chelating agent represented by the following general formula (1). [Chemical 1] 【請求項２】 請求項１記載の二官能性キレート化剤と
蛋白質との複合体。2. A complex of the bifunctional chelating agent according to claim 1 and a protein. 【請求項３】 前記蛋白質が抗体である請求項２記載の
複合体。3. The complex according to claim 2, wherein the protein is an antibody. 【請求項４】 前記抗体がＦ（ａｂ′)₂、Ｆａｂ′断片
である請求項３記載の複合体。4. The complex according to claim 3, wherein the antibody is an F (ab ′) ₂ , Fab ′ fragment. 【請求項５】 前記蛋白質が該二官能性キレート化剤と
反応可能なスルフヒドリル基を有する蛋白質である請求
項２記載の複合体。5. The complex according to claim 2, wherein the protein is a protein having a sulfhydryl group capable of reacting with the bifunctional chelating agent. 【請求項６】 前記蛋白質が該二官能性キレート化剤と
反応可能なスルフヒドリル基を有する抗体もしくは抗体
断片である請求項３記載の複合体。6. The complex according to claim 3, wherein the protein is an antibody or antibody fragment having a sulfhydryl group capable of reacting with the bifunctional chelating agent. 【請求項７】 インビボ画像診断用の、一般式（１）で
表される二官能性キレート化剤と蛋白質との複合体組成
物。7. A complex composition of a bifunctional chelating agent represented by the general formula (1) and a protein for in vivo diagnostic imaging.