JPH05176994A - Low specific gravity lipoprotein adsorbent - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide the low sp. gr. lipoprotein adsorbent which has the blood adaptability to prevent the troubles, such as clotting of blood and destruction and decrease of blood cell components by the direct circulation of the blood and the adsorbability and adsoption characteristics capable of selectively, easily and effectively adsorbing the low sp. gr. lipoprotein and (or) extremely low sp. gr. lipoprotein in the blood. CONSTITUTION:This low sp. gr. lipoprotein adsorbent is formed by fixing N- sulfochitosan to a water-insoluble solid surface in such a manner that the content of sulfonic acid attains 50mueq/g to 2.0meq/g (wet state).

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は動脈硬化、高脂血症の病
因物質である低比重リポ蛋白（以下ＬＤＬと略記する）
および（または）極低比重リポ蛋白（以下ＶＬＤＬと略
記する）を吸着除去することを目的とし、血液もしくは
血液成分を接触させることによって血中のＬＤＬおよび
（または）ＶＬＤＬを吸着する低比重リポ蛋白吸着材に
関するものである。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to low-density lipoprotein (hereinafter abbreviated as LDL) which is a causative agent of arteriosclerosis and hyperlipidemia.
And / or low specific gravity lipoprotein that adsorbs LDL and / or VLDL in blood by contacting blood or blood components for the purpose of adsorbing and removing extremely low specific gravity lipoprotein (hereinafter abbreviated as VLDL) It concerns an adsorbent.

【０００２】[0002]

【従来の技術】動脈硬化の原因となる高脂血症の治療に
は各種薬剤の使用が行われているが、一般に副作用の危
険性があり、使用量、使用機関などに細心の注意を払う
必要がある。また、正常値の数倍のＬＤＬおよび（また
は）ＶＬＤＬ値を示し、最も重篤な症状を招く危険性の
ある家族性高脂血症（ＦＨ）では薬剤の効果が充分に期
待できない場合も多い。2. Description of the Related Art Although various drugs are used for the treatment of hyperlipidemia that causes arteriosclerosis, there is a risk of side effects in general, and careful attention should be paid to the amount used and the institutions used. There is a need. In addition, in many cases familial hyperlipidemia (FH), which shows LDL and / or VLDL levels that are several times higher than the normal values and is at risk of inducing the most serious symptoms, the effect of the drug cannot be expected sufficiently. ..

【０００３】他の治療方法としては血漿交換法が有効と
され、広く行われている。しかしながら、この療法では
血漿をすべて交換するため、（１）不要成分のみなら
ず、必要な成分までも除去されてしまうこと、（２）除
去した血漿に替えて体内に補充される血漿、あるいは血
漿製剤が不足しているため、大量かつ持続的な入手が困
難であること、（３）血清肝炎やアレルギー、さらには
ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）感染の危険性がある
こと、など血漿交換法が内含する問題は多い。As another treatment method, the plasmapheresis method is effective and widely used. However, since all plasma is exchanged in this therapy, (1) not only unnecessary components but also necessary components are removed, (2) plasma that is replaced by the removed plasma, or plasma that is supplemented in the body, or plasma. Inadequate preparations make it difficult to obtain large quantities and continuously. (3) Serum hepatitis, allergies, and the risk of AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) infection. There are many problems involved.

【０００４】このような問題を解決できる治療法として
は、自己の血液を浄化した後に再輸注する方法、すなわ
ち、体外循環血液浄化法が望ましいとされる。この方法
を採るにあたり、副作用がなく、自己の血液から病因物
質を充分且つ選択的に除去することのできる浄化材及び
血液浄化療法が望まれていた。As a therapeutic method capable of solving such a problem, a method of purifying own blood and then reinfusion, that is, an extracorporeal circulation blood purification method is desirable. In adopting this method, a purification material and a blood purification therapy capable of sufficiently and selectively removing a pathogenic substance from own blood without side effects have been desired.

【０００５】こういった状況を背景として、近年、ＬＤ
Ｌおよび（または）ＶＬＤＬの吸着除去による療法が一
般的になってきた。このような方法は例えば、アガロー
スゲルにヘパリンを固定した吸着材（Ｓ．Ｍｏｏｒｊａ
ｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔ
ａ．，７７（１９７７）２１−３０）などが知られてい
るが、この材料は吸着能力が充分でなく、機械的強度に
ついても充分とは言い難い。また、抗体等を固定した免
疫吸着体を利用してＬＤＬおよび（または）ＶＬＤＬの
吸着除去を行う試みがなされているが、吸着選択性、吸
着能力の面では満足できるものの、抗体の入手が困難で
高価であるという欠点がある。Against this background, LD
Therapy by adsorptive removal of L and / or VLDL has become popular. Such a method is, for example, an adsorbent (S. Moorja) in which heparin is immobilized on agarose gel.
ni et al. , Clin. Chim. Act
a. , 77 (1977) 21-30) and the like are known, but this material does not have sufficient adsorption ability and is not sufficient in terms of mechanical strength. In addition, attempts have been made to adsorb and remove LDL and / or VLDL using an immunoadsorbent on which an antibody or the like is immobilized, but it is satisfactory in terms of adsorption selectivity and adsorption capacity, but it is difficult to obtain the antibody. It has the disadvantage of being expensive.

【０００６】このような問題点を改善する目的で供せら
れた吸着材には、有害成分と親和性をもつ素材（シリカ
など）を多孔化したもの（特開昭５９−１３９９３５、
特開昭６３−１６０６６９など）、有害成分と親和性を
有する化合物（リガンド：スルホン酸基、カルボキシル
基など）を固定したものがある。後者はいわゆるアフィ
ニティー吸着材と呼ばれるもので、さらに次のふたつに
大別できる。 （１）不溶性担体にリガンドとしてポリアニオンを固定
したもの（特公昭６２−５９９７５、特開平１−１４５
０７１、リガンドをデキストラン硫酸に限定：特公平３
−５８２２、リガンドをヘパリンに限定：特開昭５９−
１３９９３７など） （２）不溶性担体にリガンドとしてスルホン酸基および
（または）カルボキシル基をもつ単量体を固定したもの
（特公平２−５１３４６、特開昭５８−２７５５９な
ど）The adsorbent provided for the purpose of ameliorating such problems has a porous material (silica or the like) having an affinity for harmful components (Japanese Patent Laid-Open No. 59-139935).
JP-A-63-160669, etc.) and compounds having an affinity for harmful components (ligand: sulfonic acid group, carboxyl group, etc.) immobilized. The latter is a so-called affinity adsorbent and can be roughly classified into the following two. (1) A polyanion fixed as a ligand on an insoluble carrier (Japanese Patent Publication No. 62-59975, JP-A-1-145).
071, Limiting the ligand to dextran sulfate: Tokuhei 3
-5822, limiting ligand to heparin: JP-A-59-59
139937) (2) Insoluble carrier to which a monomer having a sulfonic acid group and / or a carboxyl group is immobilized as a ligand (Japanese Patent Publication No. 2-51346, JP-A-58-27559, etc.)

【０００７】アフィニティー吸着材に用いられるリガン
ドは比較的安価で、選択性、吸着能力も比較的満足でき
るレベルにあるが、これらの吸着材は血液適合性に乏し
いため、多量のヘパリンの添加が必要となり、出血傾向
等の副作用が生じる可能性を残している。このような点
から、さらに高い効率及び特異性で病因物質を除去する
ことができ、また体液に対する悪影響の少ない浄化材が
望まれている。Ligands used for affinity adsorbents are relatively inexpensive and have relatively satisfactory levels of selectivity and adsorption capacity, but since these adsorbents have poor blood compatibility, it is necessary to add a large amount of heparin. Therefore, there is a possibility that side effects such as bleeding tendency may occur. From such a point, there is a demand for a purifying material that can remove a pathogenic substance with higher efficiency and specificity and that has less adverse effects on body fluids.

【０００８】ＬＤＬおよび（または）ＶＬＤＬ以外の物
質を吸着する吸着材に目を向けてみると、例えば、特開
平１−１５８９７０という特許にはこのような概念に基
づいて開発された血液浄化材について開示されている。
この特許によって開示されている血液浄化材は、重合度
１〜９０のエチレンオキサイド骨格を有する親水性スペ
ーサーを介して、リガンドとなる低分子有機化合物を水
不溶性多孔質固体表面に固定し、これに直接血液を灌流
して免疫グロブリンを吸着することを特徴としている。Turning to an adsorbent that adsorbs substances other than LDL and / or VLDL, for example, Japanese Patent Laid-Open No. 1-158970 discloses a blood purification material developed based on such a concept. It is disclosed.
The blood purification material disclosed by this patent fixes a low molecular weight organic compound as a ligand to a water-insoluble porous solid surface through a hydrophilic spacer having an ethylene oxide skeleton having a polymerization degree of 1 to 90, and It is characterized by perfusing blood directly to adsorb immunoglobulin.

【０００９】親水性スペーサーの持つ意義は大きく二つ
に分けることができる。第一に、血液中の血球成分や、
被吸着物質でない蛋白の付着を防止することである。親
水性スペーサーはその周辺に水を吸着している。このた
め吸着材表面は水の層に覆われ、この水の層が血球成分
の付着を防いでいる（排除体積効果）。また、水の層を
形成するスペーサーが運動することにより、さらに血球
成分の付着は困難になり、付着した血球成分は脱離しや
すくなる。また、凝固因子や補体の活性化が抑制される
といった利点を有する。The significance of the hydrophilic spacer can be broadly divided into two. First, the blood cell components in blood,
This is to prevent the attachment of proteins that are not adsorbed substances. The hydrophilic spacer adsorbs water around the hydrophilic spacer. Therefore, the surface of the adsorbent is covered with a layer of water, and this layer of water prevents adhesion of blood cell components (excluded volume effect). Further, the movement of the spacer forming the water layer makes it more difficult to attach the blood cell component, and the attached blood cell component is likely to be detached. It also has the advantage that the activation of coagulation factors and complement is suppressed.

【００１０】第二に、リガンドの運動性を上昇させるこ
とによって吸着能の向上が期待できるということであ
る。特に被吸着物質が巨大分子である場合、リガンドを
担体表面に直接固定しただけでは被吸着物質がリガンド
の接近が困難であり、また一部で結合したとしても結合
サイトの数が充分ではなく、容易に脱着してしまう可能
性が大きい。親水性スペーサーを介在させることによっ
て被吸着物質とリガンドとの接近が促進され、またリガ
ンドの動きに融通性があるため周囲のリガンドが被吸着
物質との結合に参与しやすく、このため結合サイトの多
い強固な結合を生成することができる。Secondly, it is expected that the adsorptivity can be improved by increasing the mobility of the ligand. Particularly when the substance to be adsorbed is a macromolecule, it is difficult for the substance to be adsorbed to approach the ligand by directly fixing the ligand to the surface of the carrier, and the number of binding sites is not sufficient even if it is partially bound, There is a high possibility that they will be easily removed. By interposing a hydrophilic spacer, the approach between the substance to be adsorbed and the ligand is promoted, and the flexibility of the movement of the ligand makes it easy for surrounding ligands to participate in the binding with the substance to be adsorbed. Many tight bonds can be generated.

【００１１】特開平１−１５８９７０では、重合度１〜
９０のエチレンオキサイド骨格を有する親水性スペーサ
ーを介在させているが、このスペーサーの持つ効果は本
質的にエチレンオキサイド骨格を有する物質に限られた
ものではない。スペーサーが長鎖の親水性化合物であれ
ば、排除体積効果等による血液適合性の向上は期待でき
る。In JP-A-1-158970, the degree of polymerization is 1
Although 90 hydrophilic spacers having an ethylene oxide skeleton are interposed, the effect of this spacer is not essentially limited to a substance having an ethylene oxide skeleton. If the spacer is a long-chain hydrophilic compound, improvement in blood compatibility due to the excluded volume effect can be expected.

【００１２】さらに、重合度が９０までのエチレンオキ
サイド骨格を有する親水性スペーサーを導入しただけで
は、充分な血液適合性を実現するのは困難であり、特開
平１−１５８９７０においても血液適合性向上のためア
クリル酸誘導体のコーティングを行っている。このよう
な操作は煩雑であるばかりでなく、毒性をもった物質の
溶出を招く可能性も存在する。Further, it is difficult to realize sufficient blood compatibility only by introducing a hydrophilic spacer having an ethylene oxide skeleton having a degree of polymerization of up to 90. In JP-A-1-158970, improvement of blood compatibility is also achieved. Therefore, acrylic acid derivative is coated. Such an operation is not only complicated, but may cause the elution of a toxic substance.

【００１３】[0013]

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記従来技術
の欠点を解決し、リガンドの効果を充分に引き出して、
良好な吸着能、吸着特性を有し、コーティング等の煩雑
な操作を省略してなお充分な血液適合性を持った血液浄
化吸着材を提供することにより、副作用がなく、自己の
血液からＬＤＬおよび（または）ＶＬＤＬを充分且つ選
択的に除去することのできる効果的な吸着材を提供しよ
うとしたものである。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention solves the above-mentioned drawbacks of the prior art and brings out the effect of the ligand sufficiently,
By providing a blood purification adsorbent having good adsorbability and adsorption properties and omitting complicated operations such as coating, and having sufficient blood compatibility, there are no side effects and LDL and (Or) It is intended to provide an effective adsorbent capable of sufficiently and selectively removing VLDL.

【００１４】[0014]

【課題を解決するための手段】本発明の低比重リポ蛋白
吸着材は、水不溶性固体表面にＮ−スルホキトサンをス
ルホン酸含量５０μｅｑ／ｍｌ（湿潤状態）〜２．０ｍ
ｅｑ／ｍｌ（湿潤状態）となるよう固定したことを特徴
とするものである。本発明の低比重リポ蛋白吸着材は水
不溶性固体がポリスチレン、架橋ポリビニルアルコー
ル、ポリメタクリル酸およびその誘導体或いはこれらの
共重合体などの合成有機高分子化合物、セルロース、キ
チン、キトサン等の天然有機高分子化合物、またはアシ
ルセルロース、アシルキチン等の改質天然有機高分子化
合物であることが好ましい。これらの高分子化合物のう
ち、機械的強度、リガンド導入の容易さを考慮すると、
適度に架橋したポリスチレン、ポリメタクリル酸および
その誘導体或いはこれらの共重合体、セルロースが望ま
しく、さらに好ましくはセルロースが望ましい。The low-density lipoprotein adsorbent of the present invention comprises N-sulfochitosan on the surface of a water-insoluble solid having a sulfonic acid content of 50 μeq / ml (wet state) to 2.0 m.
It is characterized in that it is fixed at eq / ml (wet state). The low-density lipoprotein adsorbent of the present invention comprises a water-insoluble solid such as polystyrene, cross-linked polyvinyl alcohol, polymethacrylic acid and its derivatives or synthetic organic polymer compounds such as copolymers thereof, natural organic compounds such as cellulose, chitin and chitosan. It is preferably a molecular compound or a modified natural organic polymer compound such as acyl cellulose or acyl chitin. Considering the mechanical strength and ease of ligand introduction among these polymer compounds,
Properly cross-linked polystyrene, polymethacrylic acid and derivatives thereof or copolymers thereof, and cellulose are desirable, and cellulose is more desirable.

【００１５】本発明に用いられるＮ−スルホキトサンは
ゲルパーミエイションクロマトグラフィー（以下ＧＰＣ
と略記する）によるポリエチレングリコール（以下ＰＥ
Ｇと略記する）換算で分子量１０００〜２００００が望
ましく、好ましくは２０００〜１００００が望ましい。
これよりも分子量が小さいと血液適合性、吸着性能とも
充分に得られず、これよりも大きいと導入率が低下する
傾向にあり、性能の向上は望めない。The N-sulfochitosan used in the present invention is gel permeation chromatography (hereinafter referred to as GPC).
Polyethylene glycol (hereinafter PE)
The molecular weight is preferably 1,000 to 20,000, and more preferably 2,000 to 10,000 in terms of G).
If the molecular weight is smaller than this, blood compatibility and adsorption performance cannot be sufficiently obtained, and if it is larger than this, the introduction rate tends to decrease, and improvement in performance cannot be expected.

【００１６】本発明でのＮ−スルホキトサン導入は、キ
トサンを水不溶性固体に導入した後アミノ基をスルホン
化する方法、あらかじめアミノ基をスルホン化したキト
サンを水不溶性固体に導入する方法、いずれも用いられ
得る。前者を採用する場合、Ｎ−スルホキトサンのスル
ホン化率は３０％以上、好ましくは５０％以上、さらに
好ましくは７０％以上が望ましい。後者を採用する場
合、Ｎ−スルホキトサンのスルホン化率は３０％以上、
好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上が
望ましいが、キトサンのアミノ基が全てスルホン化され
てしまうと（スルホン化率１００％）、残存のアミノ基
を利用して水不溶性固体表面上に化学結合により導入す
ることが不可能になるので好ましくない。本発明でのキ
トサンのＮ−スルホン化にはクロロスルホン酸、濃硫
酸、発煙硫酸、三酸化硫黄／ジメチルホルムアミド錯
体、三酸化硫黄／ピリジン錯体などが用いられ得るが、
アミノ基のみを選択的にスルホン化できるということ
で、三酸化硫黄／ピリジン錯体が好ましい。他の試薬を
用いた場合、水酸基までもスルホン化されてしまう。な
お、上記スルホン化率は、スルホン化前後のキトサンに
含まれるアミノ基を滴定する方法、もしくは元素分析で
窒素と硫黄の含量を定量することによって測定すること
ができる。The introduction of N-sulfochitosan in the present invention includes a method of introducing chitosan into a water-insoluble solid and then sulfonation of an amino group, and a method of introducing chitosan preliminarily sulfonated with an amino group into a water-insoluble solid. Can be used. When the former is adopted, the sulfonation rate of N-sulfochitosan is 30% or more, preferably 50% or more, more preferably 70% or more. When the latter is adopted, the sulfonation rate of N-sulfochitosan is 30% or more,
It is preferably 50% or more, more preferably 70% or more, but when all amino groups of chitosan are sulfonated (sulfonation rate 100%), residual amino groups are utilized to form a solid on the water-insoluble solid surface. It is not preferable because it cannot be introduced by a chemical bond. For the N-sulfonation of chitosan in the present invention, chlorosulfonic acid, concentrated sulfuric acid, fuming sulfuric acid, sulfur trioxide / dimethylformamide complex, sulfur trioxide / pyridine complex, etc. may be used.
A sulfur trioxide / pyridine complex is preferable because it can selectively sulfonate only amino groups. When other reagents are used, even hydroxyl groups are sulfonated. The sulfonation ratio can be measured by a method of titrating amino groups contained in chitosan before and after sulfonation, or by quantifying nitrogen and sulfur contents by elemental analysis.

【００１７】本発明のＮ−スルホキトサンはＬＤＬおよ
び（または）ＶＬＤＬとの親和性によってこれを吸着除
去するリガンドとしてだけではなく、上記の特開平１−
１５８９７０で開示されている親水性スペーサーとして
の働きをも有している。水不溶性固体表面との結合点近
傍のＮ−スルホキトサン鎖は主に親水性スペーサーとし
て血液適合性の向上およびリガンドの運動性向上に貢献
し、水不溶性固体表面から比較的遠距離にあるＮ−スル
ホキトサンはリガンドとしてＬＤＬおよび（または）Ｖ
ＬＤＬの吸着除去の役割を有する。The N-sulfochitosan of the present invention is not only used as a ligand for adsorbing and removing L-and / or VLDL due to its affinity with LDL and / or VLDL, but also in the above-mentioned JP-A-1-.
It also has a function as a hydrophilic spacer disclosed in 158970. The N-sulfochitosan chain in the vicinity of the binding point with the water-insoluble solid surface mainly contributes to the improvement of blood compatibility and the mobility of the ligand as a hydrophilic spacer, and the N-sulfochitosan chain at a relatively long distance from the water-insoluble solid surface is used. Sulfochitosan is a ligand for LDL and / or V
It has a role of adsorbing and removing LDL.

【００１８】さらに、Ｎ−スルホキトサンは抗凝血剤と
してよく知られているヘパリンの機能を示す類似物（ヘ
パリノイド）としての働きも有する。ヘパリンの基本骨
格はＤ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸であり、この
アミノ基と一部の水酸基がスルホン化された構造を持っ
ている。ヘパリノイドとしては現在までにセルロース、
アミロース、デキストランなどの基本骨格にスルホン酸
基を導入したものが報告されているが、キトサンはこれ
らの多糖類とは異なり、Ｄ−グルコサミンを基本骨格と
しているので、そのＮ−スルホン化物はヘパリノイドと
してより大きな効果が期待できる。したがって、特開平
１−１５８９７０ではいまだ不十分であった血液適合性
の実現が可能となる。Furthermore, N-sulfochitosan also functions as an analogue (heparinoid) showing the function of heparin, which is well known as an anticoagulant. The basic skeleton of heparin is D-glucosamine and D-glucuronic acid, which has a structure in which this amino group and some hydroxyl groups are sulfonated. To date, heparinoid is cellulose,
It has been reported that a sulfonic acid group is introduced into the basic skeleton of amylose, dextran, etc. However, unlike these polysaccharides, chitosan has D-glucosamine as the basic skeleton, and therefore its N-sulfonated compound is a heparinoid. Greater effect can be expected. Therefore, it is possible to realize blood compatibility which was not yet sufficient in JP-A-1-158970.

【００１９】このようなヘパリノイドの抗凝血性を議論
する際に忘れてならないのが、毒性であるが、本発明に
おいてはＮ−スルホキトサンを水不溶性固体表面に固定
しているため、抗凝血剤として直接投与する場合に比べ
てその危険性は極端に減少する。また、毒性はＮ−スル
ホキトサンの鎖長、分子量にも大きく影響を受ける。前
に記載したような範囲の分子量のＮ−スルホキトサンを
水不溶性固体表面上に固定した場合、万一Ｎ−スルホキ
トサンが脱離して血中に遊離しても、重篤な副作用を招
く恐れは小さい。It is toxic to be noted when discussing the anticoagulant property of such a heparinoid, but in the present invention, since N-sulfochitosan is immobilized on the surface of a water-insoluble solid, the anticoagulant property is observed. The risk is extremely reduced compared to when it is directly administered as a drug. The toxicity is also greatly affected by the chain length and molecular weight of N-sulfochitosan. If N-sulfochitosan having a molecular weight in the range described above is immobilized on a water-insoluble solid surface, even if N-sulfochitosan is released and released into blood, serious side effects may be caused. Is small.

【００２０】本発明に使用される水不溶性固体の形状
は、粒子状、繊維状、膜状等いずれの公知の形状も用い
られ得るが、通液性、表面積確保、吸着材調製時の取扱
いの容易さなどの点から、粒子状もしくは繊維状が望ま
しい。粒子状担体の平均粒径は１０μｍから５ｍｍの範
囲にあることが望ましいが、粒径が小さくなると血球の
流通抵抗が大きくなり、粒径が大きくなると担体充填量
の減少、ひいては有効表面積の減少を招くので、平均粒
径３０μｍから１ｍｍの範囲にあることが望ましい。さ
らに好ましくは平均粒径５０μｍから５００μｍが望ま
しい。粒子形状については、細胞に損傷を与えにくいこ
とや、物理的外力に対する強度、さらに調製の容易さか
ら、球状であることが望ましい。同じ理由から、繊維状
担体の繊維直径は０．１μｍから５０μｍ、好ましくは
０．３μｍから２５μｍが望ましく、さらに好ましくは
０．５μｍから１５μｍが望ましい。The shape of the water-insoluble solid used in the present invention may be any known shape such as particle shape, fibrous shape, and film shape. From the viewpoint of easiness and the like, a particulate or fibrous form is desirable. The average particle size of the particulate carrier is preferably in the range of 10 μm to 5 mm, but the smaller the particle size, the greater the flow resistance of blood cells, and the larger the particle size, the smaller the carrier loading amount and, consequently, the effective surface area. Therefore, it is desirable that the average particle size is in the range of 30 μm to 1 mm. More preferably, the average particle size is 50 μm to 500 μm. Regarding the particle shape, a spherical shape is desirable because it is less likely to damage cells, has strength against physical external force, and is easy to prepare. For the same reason, the fiber diameter of the fibrous carrier is preferably 0.1 μm to 50 μm, preferably 0.3 μm to 25 μm, and more preferably 0.5 μm to 15 μm.

【００２１】担体表面には有効表面積を拡大するため微
小孔が存在することが好ましい。その平均孔径は粒子状
担体の場合、２０Åから１００００Å、好ましくは１０
０Åから８０００Å、更に好ましくは１０００Åから７
０００Å、繊維状担体の場合２０Åから３０００Å、好
ましくは１００Åから２０００Åである。これより平均
孔径が小さいと被吸着物質が微小孔内部まで到達でき
ず、これより大きいと有効表面積を拡大する効果が不十
分であり、また担体の強度低下を招く恐れがある。Micropores are preferably present on the surface of the carrier in order to expand the effective surface area. The average pore size of the particulate carrier is 20Å to 10000Å, preferably 10Å
0Å to 8000Å, more preferably 1000Å to 7
000Å, in the case of a fibrous carrier, 20Å to 3000Å, preferably 100Å to 2000Å. If the average pore diameter is smaller than this, the substance to be adsorbed cannot reach the inside of the fine pores, and if it is larger than this, the effect of expanding the effective surface area is insufficient and the strength of the carrier may be reduced.

【００２２】本発明に使用される水不溶性固体へのＮ−
スルホキトサンの導入の方法は共有結合、電子線照射に
よるグラフト化など、特に制限されないが、〔セルロー
ス〕−〔Ｎ−スルホキトサン〕を得る場合、以下のよう
な方法が好ましい。 セルロースにキトサンを導入した後、このキトサンの
アミノ基をスルホン化する方法 （１）セルロースの改質 過沃素酸ナトリウムを０．１規定から５．０規定好まし
くは０．５規定から１．５規定の硫酸に溶解した溶液
に、平均粒径２０μｍから２００μｍ、好ましくは３０
μｍから７０μｍ、平均孔径５００Åから１００００
Å、好ましくは１０００Åから８０００Åの粒状多孔質
セルロースを添加し、１０℃から５０℃、好ましくは２
０℃から３０℃で、５時間から３０時間、好ましくは１
０時間から２４時間反応させる。上記過沃素酸ナトリウ
ム−硫酸溶液の過沃素酸ナトリウム濃度は２重量％から
１５重量％、好ましくは４重量％から１０重量％であ
る。また、上記粒径状多孔質セルロースの過沃素酸ナト
リウム溶液への浴比は１０容量％から３０容量％、好ま
しくは１５容量％から２５容量％である。この反応混合
物を濾過して生成物を回収し、充分に水洗して、膨潤状
態でアルデヒド含量０．１０ｍｅｑ／ｇから２．００ｍ
ｅｑ／ｍｌ、好ましくは０．２０ｍｅｑ／ｇから１．５
０ｍｅｑ／ｍｌのアルデヒドセルロースを得る。このア
ルデヒドセルロースは下記化１にその要部構造を示すよ
うに、一部のグルコースユニットが開環した構造をして
いる。N- to water-insoluble solid used in the present invention
The method of introducing sulfochitosan is not particularly limited, such as covalent bonding and grafting by electron beam irradiation, but when [cellulose]-[N-sulfochitosan] is obtained, the following method is preferable. After introducing chitosan into cellulose, a method of sulfonation of amino groups of this chitosan (1) Modification of cellulose Sodium periodate 0.1 to 5.0 normal, preferably 0.5 to 1.5 normal In a solution dissolved in sulfuric acid, the average particle size is 20 to 200 μm, preferably 30
μm to 70 μm, average pore size 500Å to 10000
Å, preferably 1000 Å to 8000 Å granular porous cellulose is added, and 10 ℃ to 50 ℃, preferably 2
0 ° C to 30 ° C, 5 hours to 30 hours, preferably 1
React for 0 to 24 hours. The sodium periodate concentration of the sodium periodate-sulfuric acid solution is 2% by weight to 15% by weight, preferably 4% by weight to 10% by weight. The bath ratio of the above-mentioned porous cellulose having a particle size to a sodium periodate solution is 10% by volume to 30% by volume, preferably 15% by volume to 25% by volume. The reaction mixture was filtered to collect the product, washed thoroughly with water, and swollen to give an aldehyde content of 0.10 meq / g to 2.00 m.
eq / ml, preferably 0.20 meq / g to 1.5
0 meq / ml aldehyde cellulose is obtained. This aldehyde cellulose has a structure in which some glucose units are ring-opened, as shown in the chemical formula 1 below.

【００２３】[0023]

【化１】 [Chemical 1]

【００２４】（２）キトサンの導入 ＧＰＣによるＰＥＧ換算で分子量１０００〜２０００
０、好ましくは２０００〜１００００のキトサンをｐＨ
９．５の緩衝液に溶解させておき、これに上記（１）で
得たアルデヒドセルロースを添加して攪拌しながら１０
℃から５０℃好ましくは２０℃から３０℃で、５時間か
ら３０時間、好ましくは１０時間から２４時間反応させ
る。上記キトサン−緩衝液の濃度は０．２重量％から
５．０重量％、好ましくは０．４重量％から３．０重量
％、この溶液へのアルデヒドセルロースの浴比は３容量
％から２０容量％、好ましくは５容量％から１５容量％
である。この反応混合物を濾過して生成物を回収、水洗
し、これをｐＨ９．０の緩衝液に分散させ、水素化ホウ
素ナトリウムを添加して１０℃から５０℃好ましくは２
０℃から３０℃で、５時間から３０時間、好ましくは１
０時間から２４時間反応させてシッフ塩基の水素添加を
行う。含シッフ塩基〔セルロース〕−〔キトサン〕の緩
衝液への浴比は３容量％から２０容量％、好ましくは５
容量％から１５容量％、含シッフ塩基〔セルロース〕−
〔キトサン〕と水素化ホウ素ナトリウムの仕込比は２０
／１から３／２、好ましくは１５／１から３／１（いず
れも容量／重量比）である。こうしてアミノ基含量０．
０５０から１．５０ｍｅｑ／ｍｌ、好ましくは０．２０
から１．５０ｍｅｑ／ｍｌの〔セルロース〕−〔キトサ
ン〕を得る。(2) Introduction of chitosan Molecular weight of 1000 to 2000 in terms of PEG by GPC
PH of 0, preferably 2000 to 10000 chitosan
It is dissolved in the buffer solution of 9.5, and the aldehyde cellulose obtained in the above (1) is added thereto and stirred for 10
The reaction is carried out at 50 ° C to 50 ° C, preferably 20 ° C to 30 ° C for 5 hours to 30 hours, preferably 10 hours to 24 hours. The concentration of the above chitosan-buffer is 0.2% to 5.0% by weight, preferably 0.4% to 3.0% by weight, and the bath ratio of aldehyde cellulose to this solution is 3% to 20% by volume. %, Preferably 5% to 15% by volume
Is. The reaction mixture is filtered to recover the product, which is washed with water, dispersed in a buffer having a pH of 9.0, and sodium borohydride is added to the reaction mixture at 10 ° C to 50 ° C, preferably 2 ° C.
0 ° C to 30 ° C, 5 hours to 30 hours, preferably 1
The Schiff base is hydrogenated by reacting for 0 to 24 hours. The bath ratio of the Schiff-containing base [cellulose]-[chitosan] to the buffer is 3% to 20% by volume, preferably 5%.
% To 15% by volume, containing Schiff base [cellulose]-
The charge ratio of [chitosan] and sodium borohydride is 20.
/ 1 to 3/2, preferably 15/1 to 3/1 (both in volume / weight ratio). Thus, the amino group content is 0.
050 to 1.50 meq / ml, preferably 0.20
To obtain 1.50 meq / ml of [cellulose]-[chitosan].

【００２５】（３）キトサンのＮ−スルホン化 上記（２）で得た〔セルロース〕−〔キトサン〕に水を
１／３から１／１２好ましくは１／５から１／１０の容
量比となるよう加えて分散させ、これに濃度が１０重量
％から５０重量％、好ましくは２０重量％から４０重量
％の水酸化ナトリウム水溶液を加えて反応溶液のｐＨを
９〜１０に調製し、さらに三酸化硫黄／ピリジン錯体を
少量ずつ加えてゆき、前記の水酸化ナトリウム水溶液を
少しずつ添加してｐＨを９〜１０に保ち、１０℃から５
０℃好ましくは２０℃から３０℃で、０．５時間から１
２時間、好ましくは１時間から８時間反応させる。反応
混合物から生成物を回収、洗浄水がｐＨ７．０になるま
で充分に洗浄して〔セルロース〕−〔Ｎ−スルホキトサ
ン〕を得る。〔セルロース〕−〔キトサン〕／水懸濁液
と、これに加えると水酸化ナトリウム水溶液との容量比
は３／１から２０／１、好ましくは７／１から１５／
１、〔セルロース〕−〔キトサン〕／水懸濁液と三酸化
硫黄／ピリジン錯体の仕込比は５／１から３０／１、好
ましくは１０／１から２５／１（いずれも容量／重量
比）である。(3) N-sulfonation of chitosan [Cellulose]-[chitosan] obtained in (2) above is mixed with water at a volume ratio of 1/3 to 1/12, preferably 1/5 to 1/10. And dispersed therein, an aqueous solution of sodium hydroxide having a concentration of 10% by weight to 50% by weight, preferably 20% by weight to 40% by weight is added to adjust the pH of the reaction solution to 9 to 10 and further trioxide is added. Sulfur / pyridine complex was added little by little, and the above sodium hydroxide aqueous solution was added little by little to keep the pH at 9-10 and from 10 ° C to 5
0 ° C, preferably 20 ° C to 30 ° C, 0.5 hour to 1
The reaction is carried out for 2 hours, preferably 1 to 8 hours. The product is recovered from the reaction mixture and sufficiently washed until the washing water has a pH of 7.0 to obtain [cellulose]-[N-sulfochitosan]. The volume ratio of [cellulose]-[chitosan] / water suspension and the aqueous sodium hydroxide solution added thereto is from 3/1 to 20/1, preferably from 7/1 to 15 /.
1, [Cellulose]-[Chitosan] / water suspension and sulfur trioxide / pyridine complex charge ratio 5/1 to 30/1, preferably 10/1 to 25/1 (both volume / weight ratio) Is.

【００２６】あらかじめアミノ基をスルホン化したキ
トサンを水不溶性固体表面に導入する方法 （１）キトサンのＮ−スルホン化 ＧＰＣによるＰＥＧ換算で分子量１０００〜２０００
０、好ましくは２０００〜１００００のキトサンに水を
１／３から１／１２好ましくは１／５から１／１０の重
量比となるよう加えて溶解させ、これに濃度が１０重量
％から５０重量％、好ましくは２０重量％から４０重量
％の水酸化ナトリウム水溶液を加えて反応溶液のｐＨを
９〜１０に調整し、さらに三酸化硫黄／ピリジン錯体を
少量ずつ加えてゆき、前記の水酸化ナトリウム水溶液を
少しずつ添加してｐＨを９〜１０に保ち、１０℃から５
０℃好ましくは２０℃から３０℃で、０．５時間から１
２時間、好ましくは１時間から８時間反応させる。反応
混合物を回収、洗浄水がｐＨ７．０になるまで充分に洗
浄してスルホン化率３０％から９９％、好ましくは５０
％から９５％、さらに好ましくは７０％から９５％のＮ
−スルホキトサンを得る。キトサン水溶液と、これに加
える水酸化ナトリウム水溶液との重量比は３／１から２
０／１、好ましくは７／１から１５／１、キトサンと三
酸化硫黄／ピリジン錯体の仕込比は１／３から１０／
１、好ましくは２／３から５／１（いずれも重量比）で
ある。Method for Introducing Chitosan Sulfonated with Amino Group to Surface of Water-Insoluble Solid (1) N-Sulfonation of Chitosan Molecular weight 1000-2000 in terms of PEG by GPC
Water is added to 0, preferably 2000 to 10000 chitosan at a weight ratio of 1/3 to 1/12, preferably 1/5 to 1/10, and dissolved, and the concentration is 10% to 50% by weight. The pH of the reaction solution is adjusted to 9 to 10 by adding a sodium hydroxide aqueous solution of preferably 20% by weight to 40% by weight, and a sulfur trioxide / pyridine complex is added little by little to obtain the above sodium hydroxide aqueous solution. Is added little by little to maintain the pH at 9-10 and from 10 ° C to 5
0 ° C, preferably 20 ° C to 30 ° C, 0.5 hour to 1
The reaction is carried out for 2 hours, preferably 1 to 8 hours. The reaction mixture is recovered, and the washing water is thoroughly washed until the pH reaches 7.0, and the sulfonation rate is 30% to 99%, preferably 50%.
% To 95%, more preferably 70% to 95% N
-Sulfochitosan is obtained. The weight ratio of the chitosan aqueous solution to the sodium hydroxide aqueous solution added is 3/1 to 2
0/1, preferably 7/1 to 15/1, the charge ratio of chitosan and sulfur trioxide / pyridine complex is 1/3 to 10 /
1, preferably 2/3 to 5/1 (both by weight).

【００２７】（２）セルロースへのＮ−スルホキトサン
の導入 上記（１）で得たＮ−スルホキトサンをｐＨ９．５の
緩衝液に溶解させておき、これに上記（１）の方法で
得たアルデヒドセルロースを添加して攪拌しながら１０
℃から５０℃好ましくは２０℃から３０℃で、５時間か
ら３０時間、好ましくは１０時間から２４時間反応させ
る。上記Ｎ−スルホキトサン−緩衝液の濃度は０．２重
量％から５．０重量％、好ましくは０．４重量％から
３．０重量％、この溶液へのアルデヒドセルロースの浴
比は３容量％から２０容量％、好ましくは５容量％から
１５容量％である。この反応混合物を濾過して生成物を
回収、水洗し、これをｐＨ９．０の緩衝液に分散させ、
水素化ホウ素ナトリウムを添加して１０℃から５０℃好
ましくは２０℃から３０℃で、５時間から３０時間、好
ましくは１０時間から２４時間反応させてシッフ塩基の
水素添加を行う。含シッフ塩基〔セルロース〕−〔Ｎ−
スルホキトサン〕の緩衝液への浴比は３から２０容量
％、好ましくは５から１５容量％、含シッフ塩基〔セル
ロース〕−〔キトサン〕と水素化ホウ素ナトリウムの仕
込比は１０／１から３／２、好ましくは７／１から３／
１（いぜれも容量／重量比）である。この反応混合物か
ら生成物を回収し、水で充分洗浄して〔セルロース〕−
〔Ｎ−スルホキトサン〕を得る。(2) Introduction of N-sulfochitosan into cellulose The N-sulfochitosan obtained in (1) above was dissolved in a pH 9.5 buffer solution, and the solution was obtained by the above method (1). Add aldehyde cellulose and stir 10
The reaction is carried out at 50 ° C to 50 ° C, preferably 20 ° C to 30 ° C for 5 hours to 30 hours, preferably 10 hours to 24 hours. The concentration of the N-sulfochitosan-buffer is 0.2% to 5.0% by weight, preferably 0.4% to 3.0% by weight, and the bath ratio of aldehyde cellulose to this solution is 3% by volume. To 20% by volume, preferably 5% to 15% by volume. The reaction mixture was filtered to collect the product, washed with water, dispersed in a buffer solution of pH 9.0,
Hydrogenation of the Schiff base is carried out by adding sodium borohydride and reacting at 10 ° C. to 50 ° C., preferably 20 ° C. to 30 ° C. for 5 hours to 30 hours, preferably 10 hours to 24 hours. Schiff-containing base [cellulose]-[N-
The bath ratio of [sulfochitosan] to the buffer is 3 to 20% by volume, preferably 5 to 15% by volume, and the charge ratio of the Schiff base containing [cellulose]-[chitosan] and sodium borohydride is 10/1 to 3 /. 2, preferably 7/1 to 3 /
1 (both volume / weight ratio). The product was recovered from this reaction mixture and washed thoroughly with water [cellulose]-
[N-sulfochitosan] is obtained.

【００２８】例えば上記の様な方法で、粒子状もしくは
繊維状の〔水不溶性固体〕−〔Ｎ−スルホキトサン〕を
得た後、これを適当な容器に充填することによって本発
明の血液浄化吸着材が得られる。容器の材質はガラス、
ステンレス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカー
ボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート
等、特に制限されないが、滅菌等の取扱いを考慮する
と、ポリプロピレンやポリカーボネイトが好ましい。容
器の形態についても特に制限されないが、粒子状担体の
場合は両端を血液流入部、血液流出部とした円筒のカラ
ム型、繊維状担体の場合は粒子状担体の場合と同様のカ
ラム型、或いはシート状に形成した後、これを挟み込む
ような形態にしたものが適当であろう。For example, after the particulate or fibrous [water-insoluble solid]-[N-sulfochitosan] is obtained by the above-mentioned method, it is filled in a suitable container to adsorb the blood for purification of the present invention. The material is obtained. The material of the container is glass,
Stainless steel, polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polystyrene, polymethylmethacrylate, etc. are not particularly limited, but polypropylene and polycarbonate are preferable in consideration of handling such as sterilization. The form of the container is also not particularly limited, but in the case of a particulate carrier, a cylindrical column type with both ends of blood inflow part and blood outflow part, in the case of a fibrous carrier, a column type similar to the case of the particulate carrier, or It is suitable that the sheet is formed into a sheet shape and then sandwiched.

【００２９】[0029]

【実施例】以下、実施例を用いて本発明を説明する。実
施例中の部は、特に注釈を加えない場合は重量部を意味
する。 〈実施例１〉粒状多孔質セルロース（平均粒径５０μ
ｍ、平均孔径１５００Å）１０００部（容量）を、過沃
素酸ナトリウム３２５部を１規定−硫酸５０００部に溶
解した溶液に添加し、２５℃で１８時間反応させた後、
濾別、水洗し、アルデヒド含量１．３０ｍｅｑ／ｍｌの
アルデヒドセルロース（ＣＡ−１）を得た。アルデヒド
の定量はオキシム法によって行った。すなわち、ＣＡ−
１約１．０ｍｌを正確に秤量し（この量をＶ₁ ｍｌとす
る）、これに０．５規定塩酸ヒドロキシルアミン溶液
（塩酸ヒドロキシルアミン３５ｇを水１６０ｍｌに溶か
し、９５％エタノールで希釈して１１としたもの）１０
ｍｌ、ピリジンブロムフェノールブルー溶液（４％ブロ
ムフェノールブルー０．２５ｍｌとピリジン２０ｍｌの
混合液を９５％エタノールに希釈して１１としたもの）
３５ｍｌを加えた。この懸濁液（以下サンプルと呼ぶ）
をＣＡ−１を入れずに０．５規定塩酸ヒドロキシルアミ
ン溶液１０ｍｌとピリジンブロムフェノールブルー溶液
３５ｍｌを加えたもの（以下ブランクと呼ぶ）と併せて
超音波洗浄器内に１５分間放置した。サンプルとブラン
クを取り出し、サンプルの呈する色がブランクと同じに
なるまで０．１規定水酸化ナトリウム−メタノール溶液
を滴下した。この際滴下した水酸化ナトリウム量をＷ₁
ｍｌ、力価をＦ₁ とすると、アルデヒド含量ｘ₁ ｍｅｑ
／ｇは次式によって得られる。 ｘ₁ ＝（０．１×Ｆ₁ ×Ｗ₁ ）／Ｖ₁ EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples. Parts in the examples mean parts by weight unless otherwise noted. Example 1 Granular porous cellulose (average particle size 50 μm
m, average pore diameter 1500Å) 1000 parts (volume) was added to a solution of 325 parts of sodium periodate dissolved in 5000 parts of 1N-sulfuric acid and reacted at 25 ° C. for 18 hours.
The crystals were separated by filtration and washed with water to obtain aldehyde cellulose (CA-1) having an aldehyde content of 1.30 meq / ml. The aldehyde was quantitatively determined by the oxime method. That is, CA-
1 About 1.0 ml was accurately weighed (this amount is referred to as V ₁ ml), and 0.5 N hydroxylamine hydrochloride solution (35 g of hydroxylamine hydrochloride was dissolved in 160 ml of water and diluted with 95% ethanol to give 11 And what) 10
ml, pyridine bromophenol blue solution (11% by diluting a mixed solution of 0.25 ml of 4% bromophenol blue and 20 ml of pyridine in 95% ethanol)
35 ml was added. This suspension (hereinafter referred to as sample)
Was added to a mixture of 10 ml of 0.5 N hydroxylamine hydrochloride solution and 35 ml of pyridine bromophenol blue solution (hereinafter referred to as blank) without CA-1 and left in an ultrasonic cleaner for 15 minutes. The sample and the blank were taken out, and a 0.1N sodium hydroxide-methanol solution was added dropwise until the color exhibited by the sample became the same as the blank. At this time, the amount of sodium hydroxide dropped was W ₁
ml, titer is F ₁ , aldehyde content x ₁ meq
/ G is obtained by the following equation. x ₁ = (0.1 × F ₁ × W ₁ ) / V ₁

【００３０】ＧＰＣ（島津製作所製Ｃ−Ｒ４Ａ）による
ＰＥＧ換算で分子量約５０００のキトサン３０部をｐＨ
９．５の炭酸緩衝液５０００部（容量）に溶解させてお
き、これに上記で得たＣＡ−１を２５０部（容量）添加
して攪拌しながら２５℃で、１８時間反応させた。この
反応混合物を濾過して生成物を回収、水洗し、これをｐ
Ｈ９．０の炭酸緩衝液５０００部（容量）に分散させ、
水酸化ホウ素ナトリウム７０部を添加して２５℃で、１
８時間反応させてシッフ塩基の水素添加を行った。こう
してキトサン由来のアミノ基含量０．９６ｍｅｑ／ｍｌ
の〔セルロース〕−〔キトサン〕（ＣＣ−１）を得た。
アミノ基の定量は以下の方法によって行った。ＣＣ−１
約０．１ｍｌを正確に秤量し（この量をＶ₂ ｇとす
る）、０．１規定塩酸水溶液１０ｍｌ（力価をＦ₂ とす
る）を加え、この懸濁液をジオキサンで希釈して全量で
４０ｍｌにする（この懸濁液を以下サンプルと呼ぶ）。
サンプルを約３０分攪拌した後、自動滴定装置（平沼産
業製ＣＯＭＴＩＴＥ１０１）を用いて０．１規定水酸化
ナトリウム水溶液（力価をＦ₂'とする）で滴定を行う。
サンプルを中和するまでに要した０．１規定水酸化ナト
リウム水溶液の量をＷ₂ ｍｌとすると、ＣＣ−１のアミ
ノ基含量ｘ₂ ｍｅｑ／ｇは次式によって得られる。 Ｖ₂ ×ｘ₂ ＋０．１×Ｆ₂'×Ｗ₂ ＝０．１×Ｆ₂ ×１０PH of 30 parts of chitosan having a molecular weight of about 5,000 in terms of PEG converted by GPC (C-R4A manufactured by Shimadzu Corporation) is used.
The carbonate buffer solution of 9.5 was dissolved in 5000 parts (volume), 250 parts (volume) of CA-1 obtained above was added thereto, and the mixture was reacted at 25 ° C. for 18 hours while stirring. The reaction mixture was filtered to collect the product, washed with water,
Disperse in 5000 parts of H9.0 carbonate buffer (volume),
Add 70 parts of sodium borohydride at 25 ° C and add 1
The Schiff base was hydrogenated by reacting for 8 hours. Thus, the amino group content derived from chitosan is 0.96 meq / ml.
[Cellulose]-[Chitosan] (CC-1) was obtained.
The amino group was quantified by the following method. CC-1
About 0.1 ml was accurately weighed (this amount was V ₂ g), 10 ml of 0.1 N hydrochloric acid aqueous solution (titer was F ₂ ) was added, and this suspension was diluted with dioxane to obtain the total amount. To 40 ml (this suspension will be referred to as a sample hereinafter).
After stirring the sample for about 30 minutes, it is titrated with an aqueous 0.1 N sodium hydroxide solution (titer is F ₂ ') using an automatic titrator (COMITITE 101 manufactured by Hiranuma Sangyo).
Assuming that the amount of the 0.1 N sodium hydroxide aqueous solution required to neutralize the sample is W ₂ ml, the amino group content x ₂ meq / g of CC-1 can be obtained by the following formula. V ₂ × x ₂ + 0.1 × F ₂ '× W ₂ = 0.1 × F ₂ × 10

【００３１】上記で得たＣＣ−１を１００部（容量）取
ってイオン交換水８５０部（容量）に分散させ、３０重
量％水酸化ナトリウム水溶液を少量ずつ添加し、ｐＨを
９〜１０に調整しながら三酸化硫黄／ピリジン錯体５０
部を２５℃で、少量ずつ４時間かけて加えてゆき、２５
℃でさらに１時間攪拌した。ここで要した水酸化ナトリ
ウム水溶液は８４部（容量）であった。反応混合物を回
収、洗浄水がｐＨ７．０になるまで充分にイオン交換水
で洗浄して〔セルロース〕−〔Ｎ−スルホキトサン〕
（ＣＳＣ−１）を得た。元素分析（イオンクロマト法）
によってＣＳＣ−１の硫黄含量を定量し、その値からア
ミノ基のスルホン化率を算出したところ、９５％であっ
た。〔セルロース〕−〔キトサン〕（ＣＣ−１）のアミ
ノ基含量が０．９６ｍｅｑ／ｍｌであるから、スルホン
酸の含量は０．９１ｍｅｑ／ｍｌと考えられる。100 parts (volume) of CC-1 obtained above was dispersed in 850 parts (volume) of ion-exchanged water, and a 30 wt% sodium hydroxide aqueous solution was added little by little to adjust the pH to 9-10. While sulfur trioxide / pyridine complex 50
Parts at 25 ° C in small portions over 4 hours, adding 25
Stirred for an additional hour at ° C. The aqueous solution of sodium hydroxide required here was 84 parts (volume). The reaction mixture was recovered and washed thoroughly with ion-exchanged water until the washing water had a pH of 7.0 [cellulose]-[N-sulfochitosan].
(CSC-1) was obtained. Elemental analysis (ion chromatography method)
The sulfur content of CSC-1 was quantified by the method, and the sulfonation rate of the amino group was calculated from the value, which was 95%. Since the amino group content of [cellulose]-[chitosan] (CC-1) is 0.96 meq / ml, the sulfonic acid content is considered to be 0.91 meq / ml.

【００３２】上記で得たＣＳＣ−１を１００ｍｌのカラ
ムに充填し、１００Ｕ／ｍｌのヘパリンを含む生理食塩
液１００ｍｌ、続いて１Ｕ／ｍｌのヘパリンを含む生理
食塩液１００ｍｌでカラム内、および血液回路内を洗浄
した。一方、クエン酸加豚血１ｌをビーカーにとり、カ
ラムを通して再びこのビーカーに戻すよう血液回路を組
んだ。この装置を用いて血液流量５０ｍｌ／ｍｉｎで灌
流実験を３時間連続して行い、カラム前後の血中ＬＤＬ
の量を測定した。また、灌流開始前後の全血液中のアル
ブミン量、総蛋白量、血小板量を測定した。ＬＤＬの定
量は和光純薬製β−リポ蛋白Ｃ−テストワコーを用いて
ヘパリン沈澱・比色法によって行った。アルブミン量は
ブロムクレゾールグリーン法、総蛋白量はビウレット
法、血小板量は自動血球算定装置を用いて定量した。結
果は表１、表２に示した。なお、ＬＤＬの量は実際の測
定値、アルブミン、総蛋白、血小板については残存率で
表示した。The CSC-1 obtained above was packed in a 100 ml column, 100 ml of a physiological saline solution containing 100 U / ml heparin, and subsequently 100 ml of a physiological saline solution containing 1 U / ml heparin were used in the column and in the blood circuit. The inside was washed. On the other hand, a blood circuit was set up so that 1 l of citrated pig blood was placed in a beaker and returned to this beaker through a column. Using this device, a perfusion experiment was continuously performed for 3 hours at a blood flow rate of 50 ml / min, and blood LDL before and after the column was analyzed.
Was measured. In addition, albumin amount, total protein amount, and platelet amount in whole blood before and after the start of perfusion were measured. LDL was quantified by heparin precipitation / colorimetric method using β-lipoprotein C-Test Wako manufactured by Wako Pure Chemical Industries. The amount of albumin was determined by the bromcresol green method, the amount of total protein was determined by the Biuret method, and the amount of platelets was determined by an automatic hemocytometer. The results are shown in Tables 1 and 2. The amount of LDL was shown as the actual measurement value, and albumin, total protein, and platelets were expressed as the residual rate.

【００３３】[0033]

【表１】 なお表１中で、ＬＤＬ量（前）とはカラム流入直前の血
液中ＬＤＬ量（mg/dl)、ＬＤＬ量（後）とはカラム流出
直後の血液中ＬＤＬ量（mg/dl)を示す。[Table 1] In Table 1, the LDL amount (before) indicates the LDL amount in blood (mg / dl) immediately before flowing into the column, and the LDL amount (after) indicates the LDL amount in blood (mg / dl) immediately after flowing out from the column.

【００３４】[0034]

【表２】 表２中、数値は残存率を示し、３時間灌流後の濃度値を
灌流前の濃度値で除して１００倍したものである。ただ
し血小板については、いずれも個数から算出した。[Table 2] In Table 2, the numerical values show the survival rate, which is the concentration value after 3 hours of perfusion divided by the concentration value before perfusion and multiplied by 100. However, for platelets, all were calculated from the number.

【００３５】〈実施例２〉ＧＰＣ（島津製作所製Ｃ−Ｒ
４Ａ）によるＰＥＧ換算で分子量約５０００のキトサン
１００部をイオン交換水９００部（容量）に溶解させて
おき、これに３０重量％の水酸化ナトリウム水溶液を少
量ずつ添加してｐＨを９〜１０に調製しながら、三酸化
硫黄／ピリジン錯体９０部を２５℃で少量ずつ５時間か
けて加えてゆき、２５℃でさらに１時間攪拌した。ここ
で要した水酸化ナトリウム水溶液は８４部（容量）であ
った。反応溶液に炭酸ナトリウムを加えてｐＨを９．５
に調整し、Ｎ−スルホキトサン（ＳＣ−２）溶液を得
た。<Embodiment 2> GPC (C-R manufactured by Shimadzu Corporation)
4A) 100 parts of chitosan having a molecular weight of about 5000 by PEG conversion was dissolved in 900 parts (volume) of ion-exchanged water, and 30 wt% sodium hydroxide aqueous solution was added little by little to adjust the pH to 9-10. While preparing, 90 parts of sulfur trioxide / pyridine complex was added little by little over 5 hours at 25 ° C., and the mixture was further stirred at 25 ° C. for 1 hour. The aqueous solution of sodium hydroxide required here was 84 parts (volume). Sodium carbonate was added to the reaction solution to adjust the pH to 9.5.
The N-sulfochitosan (SC-2) solution was obtained.

【００３６】上記で得たＳＣ−２溶液を４００部取って
ｐＨ９．５の炭酸緩衝液４６００部（容量）を加え、こ
れに実施例１で得たＣＡ−１を２５０部（容量）添加し
て攪拌し、２５℃で１８時間反応させた。この反応混合
物を濾過して生成物を回収、水洗し、これをｐＨ９．０
の炭酸緩衝液５０００部（容量）に分散させ、水素化ホ
ウ素ナトリウム７０部を添加して２５℃で、１８時間反
応させてシッフ塩基の水素添加を行った。こうしてＮ−
スルホキトサン由来のスルホン酸含量０．９０ｍｅｑ／
ｍｌの〔セルロース〕−〔Ｎ−スルホキトサン〕（ＣＳ
Ｃ−２）を得た。なお、スルホン酸含量はＣＳＣ−２を
３％過塩素酸水溶液、続いてイオン交換水で充分洗浄し
た後、実施例１で〔セルロース〕−〔キトサン〕のアミ
ノ基を定量したのと同様の方法で、０．１規定塩酸水溶
液を０．１規定過塩素酸−ジオキサン溶液にそれぞれ替
えて測定することによって定量した。400 parts of the SC-2 solution obtained above was added to 4600 parts (volume) of carbonate buffer having a pH of 9.5, and 250 parts (volume) of CA-1 obtained in Example 1 was added thereto. The mixture was stirred and stirred at 25 ° C. for 18 hours. The reaction mixture was filtered to collect the product, which was washed with water to give a pH of 9.0.
Was dispersed in 5000 parts (volume) of the carbonate buffer solution, and 70 parts of sodium borohydride was added, and the Schiff base was hydrogenated by reacting at 25 ° C. for 18 hours. Thus N-
Sulfonic acid content derived from sulfochitosan 0.90 meq /
ml of [cellulose]-[N-sulfochitosan] (CS
C-2) was obtained. The sulfonic acid content was determined by the same method as in Example 1 after quantifying the amino groups of [cellulose]-[chitosan] after thoroughly washing CSC-2 with a 3% aqueous solution of perchloric acid and then ion-exchanged water. Then, the 0.1 N hydrochloric acid aqueous solution was replaced with the 0.1 N perchloric acid-dioxane solution, and the measurement was performed.

【００３７】上記〔セルロース〕−〔Ｎ−スルホキトサ
ン〕（ＣＳＣ−２）を用いて実施例１と同様に血液灌流
実験を行い、カラム前後の血中ＬＤＬ量、灌流開始前後
の全血液中のアルブミン量、総蛋白量、血小板量を測定
した。結果は表１、表２に示す。Using the above [cellulose]-[N-sulfochitosan] (CSC-2), a blood perfusion experiment was conducted in the same manner as in Example 1, and the amount of LDL in blood before and after the column and the total blood before and after the start of perfusion were measured. Albumin amount, total protein amount, and platelet amount were measured. The results are shown in Tables 1 and 2.

【００３８】エチレンジアミン３３部をｐＨ９．５の炭
酸緩衝液５０００部に溶解させておき、これに実施例１
で得たＣＡ−２５０部（容量）添加して攪拌し、２５℃
で１８時間反応させた。この反応混合物を濾過して生成
物を回収、水洗し、これをｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０
００部に分散させ、水素化ホウ素ナトリウム７０部を添
加して２５℃で、１８時間反応させてシッフ塩基の水素
添加を行った。こうしてアミノ基を導入したセルロース
（ＡＣ−３）を得た。実施例１で〔セルロース〕−〔キ
トサン〕のアミノ基を定量したのと同様の方法により、
ＡＣ−３のアミノ基含量を定量したところ、０．９８ｍ
ｅｑ／ｍｌであった。33 parts of ethylenediamine was dissolved in 5000 parts of a carbonate buffer solution having a pH of 9.5, and Example 1 was added thereto.
CA-250 parts (volume) obtained in 1. was added and stirred at 25 ° C.
And reacted for 18 hours. The reaction mixture was filtered to collect the product, which was washed with water and washed with a carbonate buffer solution of pH 9.0.
It was dispersed in 00 parts, and 70 parts of sodium borohydride was added and reacted at 25 ° C. for 18 hours to hydrogenate the Schiff base. Thus, cellulose (AC-3) having an amino group introduced was obtained. By the same method as in Example 1 for determining the amino group of [cellulose]-[chitosan],
When the amino group content of AC-3 was quantified, it was 0.98 m.
It was eq / ml.

【００３９】分子量２５００００のポリアクリル酸５０
０部を取ってこれにクロロホルム２５００部（容量）を
加え、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（以
下ＤＣＣと略記する）６２部を添加して０℃で３０分攪
拌した後、これに実施例１で得たＣＡ−１を２００部
（容量）添加して０℃で３時間、続いて２５℃で１８時
間攪拌して反応させた。この反応混合物から生成物を回
収し、メタノール、３％水酸化ナトリウム水溶液、続い
てイオン交換水で充分洗浄して、〔セルロース〕−〔ポ
リアクリル酸〕（ＣＰＡＡ−３）を得た。ＣＰＡＡ−３
のポリアクリル酸由来スルホン酸の含量は、実施例２で
〔セルロース〕−〔Ｎ−スルホキトサン〕（ＣＳＣ−
２）のスルホン酸含量を求めたのと同じ方法により、
１．８６ｍｅｑ／ｍｌと得られた。Polyacrylic acid 50 having a molecular weight of 250,000
After taking 0 part, 2,500 parts of chloroform (by volume) was added, 62 parts of N, N′-dicyclohexylcarbodiimide (hereinafter abbreviated as DCC) was added, and the mixture was stirred at 0 ° C. for 30 minutes and then added to Example 1. 200 parts (volume) of CA-1 obtained in 1. was added and reacted at 0 ° C. for 3 hours and then at 25 ° C. for 18 hours with stirring. The product was recovered from this reaction mixture and thoroughly washed with methanol, a 3% sodium hydroxide aqueous solution, and then ion-exchanged water to obtain [cellulose]-[polyacrylic acid] (CPAA-3). CPAA-3
The content of sulfonic acid derived from polyacrylic acid in Example 2 was [cellulose]-[N-sulfochitosan] (CSC-
By the same method as that for obtaining the sulfonic acid content in 2),
It was 1.86 meq / ml.

【００４０】上記〔セルロース〕−〔ポリアクリル酸〕
（ＣＰＡＡ−３）を用いて実施例１と同様に血液灌流実
験を行い、カラム前後の血中ＬＤＬ量、灌流開始前後の
全血液中のアルブミン量、総蛋白量、血小板量を測定し
た。結果は表１、表２に示す。[Cellulose]-[Polyacrylic acid]
A blood perfusion experiment was performed using (CPAA-3) in the same manner as in Example 1, and the blood LDL amount before and after the column, the albumin amount in the whole blood before and after the start of perfusion, the total protein amount, and the platelet amount were measured. The results are shown in Tables 1 and 2.

【００４１】〈比較例２〉タウリン５２部をｐＨ９．５
の炭酸緩衝液５０００部（容量）に溶解させておき、こ
れに実施例１で得たＣＡ−１を２５０部（容量）添加し
て攪拌し、２５℃で１８時間反応させた。この反応混合
物を濾過して生成物を回収、水洗し、これをｐＨ９．０
の炭酸緩衝液５０００部（容量）に分散させ、水素化ホ
ウ素ナトリウム７０部を添加して２５℃で、１８時間反
応させてシッフ塩基の水素添加を行った。こうして〔セ
ルロース〕−〔タウリン〕（ＴＣ−４）を得た。ＴＣ−
４のタウリン由来スルホン酸の含量は、実施例２で〔セ
ルロース〕−〔Ｎ−スルホキトサン〕（ＣＳＣ−２）の
スルホン酸含量を求めたのと同じ方法により、０．９２
ｍｅｑ／ｍｌと得られた。Comparative Example 2 52 parts of taurine was added to pH 9.5.
Was dissolved in 5000 parts (volume) of the above carbonate buffer solution, 250 parts (volume) of CA-1 obtained in Example 1 was added thereto, and the mixture was stirred and reacted at 25 ° C. for 18 hours. The reaction mixture was filtered to collect the product, which was washed with water to give a pH of 9.0.
Was dispersed in 5000 parts (volume) of the carbonate buffer solution, and 70 parts of sodium borohydride was added, and the Schiff base was hydrogenated by reacting at 25 ° C. for 18 hours. Thus, [cellulose]-[taurine] (TC-4) was obtained. TC-
The content of the sulfonic acid derived from taurine of No. 4 was 0.92 by the same method as in Example 2 for determining the sulfonic acid content of [cellulose]-[N-sulfochitosan] (CSC-2).
Obtained as meq / ml.

【００４２】上記〔セルロース〕−〔タウリン〕（ＴＣ
−４）を用いて実施例１と同様に血液灌流実験を行い、
カラム前後の血中ＬＤＬ量、液灌開始前後の全血液中の
アルブミン量、総蛋白量、血小板量を測定した。結果は
表１、表２に示す。[Cellulose]-[Taurine] (TC
-4) was used to conduct a blood perfusion experiment in the same manner as in Example 1,
The amount of LDL in blood before and after the column, the amount of albumin in the whole blood before and after the start of liquid perfusion, the amount of total protein, and the amount of platelets were measured. The results are shown in Tables 1 and 2.

【００４３】〈比較例３〉粒状多孔質セルロース（平均
粒径５０μｍ、平均孔径１５００Å）１００部（容
量）、２０重量％水酸化ナトリウム水溶液４０部（容
量）、ヘプタン１２０部（容量）、ゼラチン８部の混合
懸濁液を４０℃で２時間攪拌した後、エピクロルヒドリ
ン５０部を加えて４０℃でさらに２時間攪拌した。この
反応混合物から生成物を回収し、充分に洗浄してエポキ
シ化セルロース（ＣＥ−５）を得た。極限粘度０．０８
３ｄｌ／ｇ、平均重合度１４０、硫黄含量１９．２％重
量のデキストラン硫酸ナトリウム５部を水２０部（容
量）に溶解させておき、これに上記ＣＥ−５を２０部
（容量）を加えてｐＨを１２に調製して４０℃で１８時
間反応させた。未反応のエポキシ基をモノエタノールア
ミンでクエンチした後、生成物を回収し充分洗浄してス
ルホン酸含量０．３０ｍｅｑ／ｍｌ〔セルロース〕−
〔デキストラン硫酸ナトリウム〕（ＣＤＳ−５）を得
た。Comparative Example 3 100 parts by volume of granular porous cellulose (average particle size 50 μm, average pore size 1500 Å), 40 parts by volume of 20 wt% sodium hydroxide aqueous solution (volume), 120 parts by volume heptane, gelatin 8 After stirring 2 parts of the mixed suspension at 40 ° C. for 2 hours, 50 parts of epichlorohydrin was added and further stirred at 40 ° C. for 2 hours. The product was recovered from this reaction mixture and thoroughly washed to obtain epoxidized cellulose (CE-5). Intrinsic viscosity 0.08
5 parts of sodium dextran sulfate having 3 dl / g, an average degree of polymerization of 140, and a sulfur content of 19.2% by weight was dissolved in 20 parts of water (volume), and 20 parts (volume) of the above CE-5 was added thereto. The pH was adjusted to 12 and reacted at 40 ° C. for 18 hours. After quenching the unreacted epoxy groups with monoethanolamine, the product was recovered and washed thoroughly to give a sulfonic acid content of 0.30 meq / ml [cellulose]-
[Dextran sodium sulfate] (CDS-5) was obtained.

【００４４】上記〔セルロース〕−〔デキストラン硫酸
ナトリウム〕（ＣＤＳ−５）を用いて実施例１と同様に
血液灌流実験を行い、カラム前後の血中ＬＤＬ量、灌流
開始前後の全血液中のアルブミン量、総蛋白量、血小板
量を測定した。結果は表１、表２に示す。A blood perfusion experiment was carried out in the same manner as in Example 1 using the above-mentioned [cellulose]-[dextran sodium sulfate] (CDS-5), and the amount of LDL in blood before and after the column and albumin in whole blood before and after the start of perfusion. The amount, total protein amount, and platelet amount were measured. The results are shown in Tables 1 and 2.

【００４５】上記の例から明らかなように、本発明の定
比重リポ蛋白吸着材は血中のＬＤＬを選択的かつ簡便に
除去できた。吸着能だけに注目した場合はデキストラン
硫酸を固定した吸着材も本発明の吸着材と同レベルであ
ったが、アルブミン、血小板といった他の血中成分に及
ぼす影響を考えた場合、本発明の吸着材は極めて優れて
いることがわかった。この理由は以下の通りである。水
不溶性固体表面上に固定したＮ−スルホキトサンが、固
体表面近傍では親水性スペーサーとして働くため排除体
積効果によって良好な血液適合性が実現される。また、
Ｎ−スルホキトサンはヘパリノイドとしての効果も現
れ、これも血液適合性の向上に貢献しているものと考え
られる。リガンドとして働く固体表面から比較的離れた
スルホン酸基は、親水性スペーサーとして働く固体表面
近傍のＮ−スルホキトサン鎖の流動性によってそのモー
ビリティーを増し、吸着能の向上が図られている。As is clear from the above examples, the constant gravity lipoprotein adsorbent of the present invention was able to selectively and simply remove LDL in blood. When focusing only on the adsorption capacity, the adsorbent having dextran sulfate immobilized was at the same level as the adsorbent of the present invention, but when considering the effect on other blood components such as albumin and platelets, the adsorption of the present invention was considered. The wood was found to be extremely good. The reason for this is as follows. Since N-sulfochitosan immobilized on the water-insoluble solid surface acts as a hydrophilic spacer near the solid surface, good blood compatibility is realized by the excluded volume effect. Also,
N-sulfochitosan also exhibits an effect as a heparinoid, and it is considered that this also contributes to the improvement of blood compatibility. Sulfonic acid groups that are relatively distant from the surface of the solid that functions as a ligand have increased mobility due to the fluidity of the N-sulfochitosan chain near the surface of the solid that functions as a hydrophilic spacer, and the adsorption capacity has been improved.

【００４６】[0046]

【発明の効果】本発明の低比重リポ蛋白吸着材は、リガ
ンドとして導入したＮ−スルホキトサンの一部が、親水
性スペーサーとして働くとともにヘパリノイドとしての
効果も発揮するために、良好な吸着能と血液適合性を両
立することができ、あらかじめ血液から血漿成分を分離
して灌流するという煩雑な方法をとらず直接血液を灌流
することによって充分な効果を期待することができる。
このため、簡便な操作で低比重リポ蛋白の除去に利用さ
れ得る。INDUSTRIAL APPLICABILITY In the low-density lipoprotein adsorbent of the present invention, a part of N-sulfochitosan introduced as a ligand acts as a hydrophilic spacer and also exerts an effect as a heparinoid. Both blood compatibility can be achieved, and a sufficient effect can be expected by directly perfusing blood without the complicated method of separating the plasma component from blood and perfusing in advance.
Therefore, it can be used for removal of low-density lipoprotein by a simple operation.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 昌和 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Masakazu Tanaka 2-1-1 Katata, Otsu City, Shiga Prefecture Toyobo Co., Ltd.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 水不溶性固体表面にＮ−スルホキトサン
をスルホン酸含量５０μｅｑ／ｍｌ（湿潤状態）〜２．
０ｍｅｑ／ｍｌ（湿潤状態）となるよう固定したことを
特徴とする低比重リポ蛋白吸着材。1. N-Sulfochitosan on the surface of a water-insoluble solid having a sulfonic acid content of 50 μeq / ml (wet state) to 2.
A low-density lipoprotein adsorbent, which is fixed so as to be 0 meq / ml (wet state).