JPH05168472A - ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体 - Google Patents
ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体Info
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- JPH05168472A JPH05168472A JP3124648A JP12464891A JPH05168472A JP H05168472 A JPH05168472 A JP H05168472A JP 3124648 A JP3124648 A JP 3124648A JP 12464891 A JP12464891 A JP 12464891A JP H05168472 A JPH05168472 A JP H05168472A
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Abstract
(57)【要約】
【構 成】 ハイブリドーマセルラインHB8730及
びそれから産生分泌されるDNA・RNA二重鎖に対し
て特異的に結合するモノクローナル抗体。 【効 果】 特定のポリヌクレオチド配列の検出に用い
る核酸ハイブリッド形成分析法に利用される。
びそれから産生分泌されるDNA・RNA二重鎖に対し
て特異的に結合するモノクローナル抗体。 【効 果】 特定のポリヌクレオチド配列の検出に用い
る核酸ハイブリッド形成分析法に利用される。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】この発明は、特定のポリヌクレオ
チド配列の検出に用いる核酸ハイブリッド形成分析法の
ための、DNA・RNA二重鎖に対して特異的に結合す
るモノクローナル抗体及びそれを産生分泌するハイブリ
ドーマセルラインHB8730に関する。
チド配列の検出に用いる核酸ハイブリッド形成分析法の
ための、DNA・RNA二重鎖に対して特異的に結合す
るモノクローナル抗体及びそれを産生分泌するハイブリ
ドーマセルラインHB8730に関する。
【0002】核酸ハイブリッド形成分析法の原理は、目
的とする特定のポリヌクレオチド塩基配列を決定分離す
るための手段として、組換えDNAの分野の研究者達に
よって開発された。2本鎖体を変性させて得られるよう
なDNAやRNAの如き単一鎖の核酸は、適当な条件下
では、相補的な1本鎖の核酸とハイブリッド形成または
組換えを行うことが分かった。このような相補的検出用
プローブに、何か容易に検出できる化学基で標識をつけ
ることによって、単一鎖の形状をした試料核酸を含む試
験媒体中の目的とするポリヌクレオチドのいかなる配列
の存在をも検出することが可能となった。
的とする特定のポリヌクレオチド塩基配列を決定分離す
るための手段として、組換えDNAの分野の研究者達に
よって開発された。2本鎖体を変性させて得られるよう
なDNAやRNAの如き単一鎖の核酸は、適当な条件下
では、相補的な1本鎖の核酸とハイブリッド形成または
組換えを行うことが分かった。このような相補的検出用
プローブに、何か容易に検出できる化学基で標識をつけ
ることによって、単一鎖の形状をした試料核酸を含む試
験媒体中の目的とするポリヌクレオチドのいかなる配列
の存在をも検出することが可能となった。
【0003】組換えDNAの分野以外に、この分析用ハ
イブリッド形成技術は、就中、人間医学、獣医学、農業
および食物科学の分野における重要なポリヌクレオチド
の検出に応用することができる。特にこの技術は、バク
テリアやウイルスなどの病原体の検出や同定、抗生物質
耐性を目的としたバクテリアのスクリーニング、鎌状赤
血球貧血やサラセミアのような遺伝障害の診断およびガ
ン細胞の検出に用いることができる。この技術並びにそ
の現在および将来の重要性に関する一般的論評は、バイ
オテクノロジー(Biotechnology)(1983年10月
号)のp471〜478に記載されている。
イブリッド形成技術は、就中、人間医学、獣医学、農業
および食物科学の分野における重要なポリヌクレオチド
の検出に応用することができる。特にこの技術は、バク
テリアやウイルスなどの病原体の検出や同定、抗生物質
耐性を目的としたバクテリアのスクリーニング、鎌状赤
血球貧血やサラセミアのような遺伝障害の診断およびガ
ン細胞の検出に用いることができる。この技術並びにそ
の現在および将来の重要性に関する一般的論評は、バイ
オテクノロジー(Biotechnology)(1983年10月
号)のp471〜478に記載されている。
【0004】
【従来の技術】下記の情報は、本発明に関係あると出願
人の考える情報を開示する目的で示すものである。しか
しながら、下記の情報のいずれかが本発明に対し先行技
術を構成することを必ずしも認めるものではなく、また
そうであると考えるべきでもない。
人の考える情報を開示する目的で示すものである。しか
しながら、下記の情報のいずれかが本発明に対し先行技
術を構成することを必ずしも認めるものではなく、また
そうであると考えるべきでもない。
【0005】従来の核酸ハイブリッド形成分析技術にお
いては、一般に、試料となる核酸を固体の支持体に固定
化する。したがってすなわち、試料となる核酸の目的と
する特定の塩基配列間ないし遺伝子間のハイブリッド形
成は、非結合の標識プローブを含有する残りの反応混合
物から固体の支持体を分離し、次いで該固体の支持体上
の標識を検出することにより測定される。
いては、一般に、試料となる核酸を固体の支持体に固定
化する。したがってすなわち、試料となる核酸の目的と
する特定の塩基配列間ないし遺伝子間のハイブリッド形
成は、非結合の標識プローブを含有する残りの反応混合
物から固体の支持体を分離し、次いで該固体の支持体上
の標識を検出することにより測定される。
【0006】この従来技術によるハイブリッド形成分析
法を実施するために試料となる核酸を固定化しなければ
ならないが、これには重要な二つの問題が存する。第一
に固定化を達成するために要する操作に、一般的に時間
がかかり、そのため、臨床実験室でこの技術をルーチン
で用いるのに望ましくない工程が加わることになる。第
二に不均一な試料中の蛋白質その他の物質は、特に臨床
試料の場合に、核酸の固定化を妨害することがある。
法を実施するために試料となる核酸を固定化しなければ
ならないが、これには重要な二つの問題が存する。第一
に固定化を達成するために要する操作に、一般的に時間
がかかり、そのため、臨床実験室でこの技術をルーチン
で用いるのに望ましくない工程が加わることになる。第
二に不均一な試料中の蛋白質その他の物質は、特に臨床
試料の場合に、核酸の固定化を妨害することがある。
【0007】核酸試料を固定化し、標識プローブを加え
る代わりに、固定化されたプローブを使用し、核酸のサ
ンプルをそのまま標識すること、更には、2つのプロー
ブ(一方のプローブは固定化され、他方のプローブは標
識されている)を必要とする二重ハイブリッド形成技術
を用いることも可能である[メソッド・イン・エンザイ
モロジー(Methods in Enzymology)65:468(19
68)及びジーン(Gene)21:77〜86(198
3)]。しかし第1の変法は、核酸試料をそのまま標識
することに通常の臨床技術者の能力をこえる高度の技術
を必要とし、かつ標識の歩留りをモニターする簡単で高
信頼性の方法がないこととあいまって、最初に述べた方
法よりも更に望ましくない。標識の歩留りをモニターす
る便利な方法がないことは、標識媒体に様々な量の標識
反応に対する阻害剤(インヒビター)が含まれている場
合に、重大な問題を惹起することがある。二重ハイブリ
ッド形成技術には、余分の試薬を必要とすること、培養
工程およびハイブリッド形成反応の動力学が遅く効率が
悪いことなどの欠点があるうえに、試料配列順序との両
プローブの相補性が異なる場合、分析の正確さも同様に
変動することが多い。
る代わりに、固定化されたプローブを使用し、核酸のサ
ンプルをそのまま標識すること、更には、2つのプロー
ブ(一方のプローブは固定化され、他方のプローブは標
識されている)を必要とする二重ハイブリッド形成技術
を用いることも可能である[メソッド・イン・エンザイ
モロジー(Methods in Enzymology)65:468(19
68)及びジーン(Gene)21:77〜86(198
3)]。しかし第1の変法は、核酸試料をそのまま標識
することに通常の臨床技術者の能力をこえる高度の技術
を必要とし、かつ標識の歩留りをモニターする簡単で高
信頼性の方法がないこととあいまって、最初に述べた方
法よりも更に望ましくない。標識の歩留りをモニターす
る便利な方法がないことは、標識媒体に様々な量の標識
反応に対する阻害剤(インヒビター)が含まれている場
合に、重大な問題を惹起することがある。二重ハイブリ
ッド形成技術には、余分の試薬を必要とすること、培養
工程およびハイブリッド形成反応の動力学が遅く効率が
悪いことなどの欠点があるうえに、試料配列順序との両
プローブの相補性が異なる場合、分析の正確さも同様に
変動することが多い。
【0008】試料およびプローブのポリヌクレオチド間
のハイブリッド形成生成物として生じたポリヌクレオチ
ド二重鎖構造を直接検出し、これによって一方または他
方のポリヌクレオチドの化学標識を省こうという方法
は、一般に成功しなかった。また単一鎖のDNAに優先
して二重鎖のDNA/DNAハイブリッドと選択的に結
合するような抗体を作り出そうという試みは失敗に終っ
た[パーカーおよびハロラン(Parker and Halloran)、
“免疫学における核酸(Nucleic Acids in Immunolog
y)”、プレスシアおよびブラウン(Plescia and Brau
n)、スプリンガー−ベルラーク(Springer−Verlag)編
集、ニューヨーク(NY)(1969年)p18以下参
照]。一方、DNA・RNAの混合ハイブリッドまたは
RNA・RNAハイブリッドと結合し、単一鎖のポリヌ
クレオチドに対する親和性が小さい抗体を作るのに成功
した事例はいくつかある[例えば、ルトキンおよびスト
ーラー、ネイチャー265:472(1977)(Rudk
in and Stollar, Nature265: 472(1977))参照]。ルト
キン(Rudkin)およびストーラー(Stollar)は、顕微鏡
スライド上に全部の細胞を固定させ、細胞核中のDNA
を取り出した。このものは、RNAプローブとハイブリ
ッドを形成し、ハイブリッドはDNA・RNAに対する
螢光標識抗体を用いて螢光顕微鏡によって検出された。
しかしながら、これらの方法においては上述した標識プ
ローブを用いるハイブリッド形成技術の場合と同様に試
料となる核酸の固定化が必要であると記載されている。
細胞DNAをそのままハイブリッド形成のために固定化
することは、DNAが、ハイブリッド形成及び免疫化学
検出工程中、微妙な細胞残渣に固定されていなければな
らないので特に面白味のない方法である。また、螢光顕
微鏡による観察結果では形成されるハイブリッドについ
ての定量的なデータが得られない。
のハイブリッド形成生成物として生じたポリヌクレオチ
ド二重鎖構造を直接検出し、これによって一方または他
方のポリヌクレオチドの化学標識を省こうという方法
は、一般に成功しなかった。また単一鎖のDNAに優先
して二重鎖のDNA/DNAハイブリッドと選択的に結
合するような抗体を作り出そうという試みは失敗に終っ
た[パーカーおよびハロラン(Parker and Halloran)、
“免疫学における核酸(Nucleic Acids in Immunolog
y)”、プレスシアおよびブラウン(Plescia and Brau
n)、スプリンガー−ベルラーク(Springer−Verlag)編
集、ニューヨーク(NY)(1969年)p18以下参
照]。一方、DNA・RNAの混合ハイブリッドまたは
RNA・RNAハイブリッドと結合し、単一鎖のポリヌ
クレオチドに対する親和性が小さい抗体を作るのに成功
した事例はいくつかある[例えば、ルトキンおよびスト
ーラー、ネイチャー265:472(1977)(Rudk
in and Stollar, Nature265: 472(1977))参照]。ルト
キン(Rudkin)およびストーラー(Stollar)は、顕微鏡
スライド上に全部の細胞を固定させ、細胞核中のDNA
を取り出した。このものは、RNAプローブとハイブリ
ッドを形成し、ハイブリッドはDNA・RNAに対する
螢光標識抗体を用いて螢光顕微鏡によって検出された。
しかしながら、これらの方法においては上述した標識プ
ローブを用いるハイブリッド形成技術の場合と同様に試
料となる核酸の固定化が必要であると記載されている。
細胞DNAをそのままハイブリッド形成のために固定化
することは、DNAが、ハイブリッド形成及び免疫化学
検出工程中、微妙な細胞残渣に固定されていなければな
らないので特に面白味のない方法である。また、螢光顕
微鏡による観察結果では形成されるハイブリッドについ
ての定量的なデータが得られない。
【0009】従って、核酸試料を固定化する必要も、標
識する必要もなくかつ二重のプローブを必要としない核
酸のハイブリッド形成分析法に対する大きな期待があ
る。更に、このような技術は、各種の標識特に非放射性
同位元素型の標識の使用を可能にするはずである。
識する必要もなくかつ二重のプローブを必要としない核
酸のハイブリッド形成分析法に対する大きな期待があ
る。更に、このような技術は、各種の標識特に非放射性
同位元素型の標識の使用を可能にするはずである。
【0010】
【発明が解決しようとする課題】本発明の主な目的は、
これらの利点および他の利点を備えた核酸ハイブリッド
形成分析に用いられるモノクローナル抗体、及びそれを
産生分泌するハイブリドーマセルラインHB8730を
提供することである。
これらの利点および他の利点を備えた核酸ハイブリッド
形成分析に用いられるモノクローナル抗体、及びそれを
産生分泌するハイブリドーマセルラインHB8730を
提供することである。
【0011】本発明のモノクローナル抗体は、単一鎖の
核酸を含有する適当な試験媒体中の特定なポリヌクレオ
チド配列を決定するためのハイブリッド形成分析方法に
用いられる。この方法において、試験媒体は、分析すべ
き配列と相補的なプローブ配列との間のハイブリッド形
成に好適な条件の下、分析すべき配列と実質上相補的な
少なくとも一本の単一鎖の塩基配列からなる固定化され
るポリヌクレオチドプローブと合わされる。分析すべき
配列がRNAまたはDNAである場合には相補的なプロ
ーブの配列は実質上RNAからなるように選択される。
すなわち目的とする試料の配列がRNAであろうとDN
AであろうとこのようなプローブはRNAであるように
選択することができる。また、目的とする試料の配列が
RNAである場合には相補的なプローブの配列は実質上
DNAかRNAかのいずれかからなるように選択するこ
とができる。従ってプローブおよび試料配列間のハイブ
リッド形成によって生じるハイブリッドはDNA・RN
A二重鎖となる。そして生成するハイブリッドは、プロ
ーブを試験媒体と合わせて固定化後に、形成されたDN
A・RNA二重鎖と結合しうる抗体試薬を加え、かかる
二重鎖と結合した抗体試薬を分析することにより測定さ
れる。この方法の最も重要な特徴は、試料となる核酸を
プローブと接触する前に固定化または標識する必要がな
い点である。
核酸を含有する適当な試験媒体中の特定なポリヌクレオ
チド配列を決定するためのハイブリッド形成分析方法に
用いられる。この方法において、試験媒体は、分析すべ
き配列と相補的なプローブ配列との間のハイブリッド形
成に好適な条件の下、分析すべき配列と実質上相補的な
少なくとも一本の単一鎖の塩基配列からなる固定化され
るポリヌクレオチドプローブと合わされる。分析すべき
配列がRNAまたはDNAである場合には相補的なプロ
ーブの配列は実質上RNAからなるように選択される。
すなわち目的とする試料の配列がRNAであろうとDN
AであろうとこのようなプローブはRNAであるように
選択することができる。また、目的とする試料の配列が
RNAである場合には相補的なプローブの配列は実質上
DNAかRNAかのいずれかからなるように選択するこ
とができる。従ってプローブおよび試料配列間のハイブ
リッド形成によって生じるハイブリッドはDNA・RN
A二重鎖となる。そして生成するハイブリッドは、プロ
ーブを試験媒体と合わせて固定化後に、形成されたDN
A・RNA二重鎖と結合しうる抗体試薬を加え、かかる
二重鎖と結合した抗体試薬を分析することにより測定さ
れる。この方法の最も重要な特徴は、試料となる核酸を
プローブと接触する前に固定化または標識する必要がな
い点である。
【0012】プローブおよび試料となる核酸間のハイブ
リッド形成を特異的かつ鋭敏に検出するためには抗体試
薬が鍵となる。勿論、全抗体またはこれら抗体の適当な
断片および多官能体を、以下に詳述するように、使用す
ることができ、本開示および特許請求の範囲において用
いた抗体試薬という用語は、特に断りがない場合、全抗
体試薬並びにそれらの多官能体及び断片をも意味する。
リッド形成を特異的かつ鋭敏に検出するためには抗体試
薬が鍵となる。勿論、全抗体またはこれら抗体の適当な
断片および多官能体を、以下に詳述するように、使用す
ることができ、本開示および特許請求の範囲において用
いた抗体試薬という用語は、特に断りがない場合、全抗
体試薬並びにそれらの多官能体及び断片をも意味する。
【0013】抗体試薬のハイブリッド形成二重鎖に対す
る結合は好都合な方法ならばいかなる方法によっても測
定することができる。抗体試薬は、酵素学的に活性な原
子団、螢光体、発色団、発光体、特異的な結合が可能な
配位子または放射性同位元素のような検出可能な化学的
な原子団で標識するのが好ましく、特に非放射性同位元
素による標識が好ましい。生成する固定化されたハイブ
リッド二重鎖に結合される標識された抗体試薬は結合さ
れなかった抗体試薬から容易に分離することができる。
検出可能な化学的な原子団または標識は、分離された何
れの画分においても測定されるが、通常は結合された抗
体試薬が測定される。
る結合は好都合な方法ならばいかなる方法によっても測
定することができる。抗体試薬は、酵素学的に活性な原
子団、螢光体、発色団、発光体、特異的な結合が可能な
配位子または放射性同位元素のような検出可能な化学的
な原子団で標識するのが好ましく、特に非放射性同位元
素による標識が好ましい。生成する固定化されたハイブ
リッド二重鎖に結合される標識された抗体試薬は結合さ
れなかった抗体試薬から容易に分離することができる。
検出可能な化学的な原子団または標識は、分離された何
れの画分においても測定されるが、通常は結合された抗
体試薬が測定される。
【0014】この方法は、試料となる核酸の固定化また
は標識化を省くことによって、非常に有利なハイブリッ
ド形成分析技術を提供する。分析技術者は高度の分析技
術を必要としない。すなわち、固定化操作または標識化
操作に要する時間を省くことができる。更に、試料が固
定化操作を妨害するという可能性が完全になくなる。臨
床的な使用に供される試験キットは、例えば、固定化さ
れた結合相手と結合させることによって既に固定された
プローブもしくは容易に固定化し得る形のプローブから
なる。従来技術における系では、試料中の外来性蛋白質
およびその他の物質の妨害によって、固定化される試料
核酸がRNAであるかDNAであるかが重大な問題とな
り得る。
は標識化を省くことによって、非常に有利なハイブリッ
ド形成分析技術を提供する。分析技術者は高度の分析技
術を必要としない。すなわち、固定化操作または標識化
操作に要する時間を省くことができる。更に、試料が固
定化操作を妨害するという可能性が完全になくなる。臨
床的な使用に供される試験キットは、例えば、固定化さ
れた結合相手と結合させることによって既に固定された
プローブもしくは容易に固定化し得る形のプローブから
なる。従来技術における系では、試料中の外来性蛋白質
およびその他の物質の妨害によって、固定化される試料
核酸がRNAであるかDNAであるかが重大な問題とな
り得る。
【0015】この方法の好ましい実施態様において、既
に固定化された形態のプローブであるので、従来の固定
化操作技術に固有の欠陥が克服され、従って分析の検出
限界が下がることがない。更にこの方法においては、試
料RNAまたはDNAの固体の支持体に対する非特異的
な結合が工程試薬によって認識されないという利点があ
る。したがってノイズ信号が低下し、検出限界が改善さ
れる。標識されたプローブと固定化されたプローブとを
用いる二重のハイブリッド形成に対しては、標識された
ヌクレオチドは、固体の支持体に非特異的に結合し得る
し、ノイズの原因ともなり得る。この方法においては、
標識されたプローブを含まないのでこのような可能性は
ない。
に固定化された形態のプローブであるので、従来の固定
化操作技術に固有の欠陥が克服され、従って分析の検出
限界が下がることがない。更にこの方法においては、試
料RNAまたはDNAの固体の支持体に対する非特異的
な結合が工程試薬によって認識されないという利点があ
る。したがってノイズ信号が低下し、検出限界が改善さ
れる。標識されたプローブと固定化されたプローブとを
用いる二重のハイブリッド形成に対しては、標識された
ヌクレオチドは、固体の支持体に非特異的に結合し得る
し、ノイズの原因ともなり得る。この方法においては、
標識されたプローブを含まないのでこのような可能性は
ない。
【0016】図面は、この方法を実施するための好まし
い方法の概略を表わす。核酸のハイブリッド形成を分析
手段として用いるのは、基本的にはDNAの二重鎖構造
を基礎としている。二重鎖DNAのそれぞれの連鎖のプ
リンおよびピリミジン塩基間の水素結合は可逆的に切断
できる。このDNAの融解または変性によって生じる2
本のDNAの相補的単一鎖は融合(リアニーリングまた
はハイブリッド形成ともいう)して二重鎖構造を再生す
る。当業者には周知のように、充分に相補性のある塩基
配列からなるDNAまたはRNAの第1の単一鎖の核酸
を適当な溶液条件下、第2の単一鎖核酸と接触させる
と、DNA・RNAハイブリッドを形成する。
い方法の概略を表わす。核酸のハイブリッド形成を分析
手段として用いるのは、基本的にはDNAの二重鎖構造
を基礎としている。二重鎖DNAのそれぞれの連鎖のプ
リンおよびピリミジン塩基間の水素結合は可逆的に切断
できる。このDNAの融解または変性によって生じる2
本のDNAの相補的単一鎖は融合(リアニーリングまた
はハイブリッド形成ともいう)して二重鎖構造を再生す
る。当業者には周知のように、充分に相補性のある塩基
配列からなるDNAまたはRNAの第1の単一鎖の核酸
を適当な溶液条件下、第2の単一鎖核酸と接触させる
と、DNA・RNAハイブリッドを形成する。
【0017】図1に示す実施態様では、ハイブリッド形
成に好適な条件下、単一鎖の試料核酸(S)を固定化さ
れたプローブ(P)と接触させる。生成する固定化され
かつハイブリッド形成された二重鎖を残る反応物から分
離した後、随時、DNA・RNA二重鎖に対して特異な
標識抗体(Ab*)と接触させる。結合していない標識抗
体を洗浄した後、固体支持体上に存在する標識を測定す
る。
成に好適な条件下、単一鎖の試料核酸(S)を固定化さ
れたプローブ(P)と接触させる。生成する固定化され
かつハイブリッド形成された二重鎖を残る反応物から分
離した後、随時、DNA・RNA二重鎖に対して特異な
標識抗体(Ab*)と接触させる。結合していない標識抗
体を洗浄した後、固体支持体上に存在する標識を測定す
る。
【0018】図2に示す実施態様では、単一鎖の試料核
酸(S)を、結合性のビオチン部分からなるように適当
に化学修飾したプローブ(P)の可溶形と接触させる。
生じた可溶性ハイブリッドに、ビオチンに対する結合相
手であるアビジンの固定化された形を加え、固定化され
たハイブリッドを形成する。このようにして固定化され
た二重鎖を、所望ならば、残る反応混合物から分離した
後、標識された抗ハイブリッド抗体と接触させ、洗浄
後、固体の支持体上に存在する標識を前述のように測定
する。
酸(S)を、結合性のビオチン部分からなるように適当
に化学修飾したプローブ(P)の可溶形と接触させる。
生じた可溶性ハイブリッドに、ビオチンに対する結合相
手であるアビジンの固定化された形を加え、固定化され
たハイブリッドを形成する。このようにして固定化され
た二重鎖を、所望ならば、残る反応混合物から分離した
後、標識された抗ハイブリッド抗体と接触させ、洗浄
後、固体の支持体上に存在する標識を前述のように測定
する。
【0019】プローブ プローブは、検出さるべき配列と実質的に相補的に少な
くとも一の単一鎖塩基配列からなる。しかしながら、こ
のような塩基配列は単一の連続的なポリヌクレオチド断
片である必要なはく、非相補的な配列が介在する2つ以
上の個々の断片からなっていてもよい。これらのハイブ
リッドを形成しない配列は、線状であってもよく、ま
た、自己相補的でありかつヘアピンループを形成しても
よい。更に、プローブの相補的領域は、その中に相補的
配列が、増殖のために、挿入されていたベクターのRN
Aを含む配列のような、ハイブリッドを形成しない配列
によって3′−及び5′−末端ではさみつけられていて
もよい。何れにしても分析試薬として提供されるプロー
ブは、当該試料核酸と1個以上の点で検出可能なハイブ
リッド形成を示す。臨界相同断片が単一鎖の形で存在
し、試料のRNAとハイブリッドを形成するために利用
でき、しかもプローブとともに用いるために選ばれた抗
体試薬がプローブ中の二重鎖領域と著しく交差反応しな
い(例えば抗体試薬がDNA・RNAハイブリッドに特
異的であり、プローブがRNA・RNA二重鎖領域から
なる。)であるならば、線状または環状の単一鎖ポリヌ
クレオチドは、多少とも相補的なポリヌクレオチド鎖が
重複していてもプローブ要素として使用できる。相補的
なプローブ配列は十数個から10,000個程度の塩基
範囲の都合のよいまたは所望の長さの何れでもよく、塩
基が約50個以下のオリゴヌクレオチドを含む。
くとも一の単一鎖塩基配列からなる。しかしながら、こ
のような塩基配列は単一の連続的なポリヌクレオチド断
片である必要なはく、非相補的な配列が介在する2つ以
上の個々の断片からなっていてもよい。これらのハイブ
リッドを形成しない配列は、線状であってもよく、ま
た、自己相補的でありかつヘアピンループを形成しても
よい。更に、プローブの相補的領域は、その中に相補的
配列が、増殖のために、挿入されていたベクターのRN
Aを含む配列のような、ハイブリッドを形成しない配列
によって3′−及び5′−末端ではさみつけられていて
もよい。何れにしても分析試薬として提供されるプロー
ブは、当該試料核酸と1個以上の点で検出可能なハイブ
リッド形成を示す。臨界相同断片が単一鎖の形で存在
し、試料のRNAとハイブリッドを形成するために利用
でき、しかもプローブとともに用いるために選ばれた抗
体試薬がプローブ中の二重鎖領域と著しく交差反応しな
い(例えば抗体試薬がDNA・RNAハイブリッドに特
異的であり、プローブがRNA・RNA二重鎖領域から
なる。)であるならば、線状または環状の単一鎖ポリヌ
クレオチドは、多少とも相補的なポリヌクレオチド鎖が
重複していてもプローブ要素として使用できる。相補的
なプローブ配列は十数個から10,000個程度の塩基
範囲の都合のよいまたは所望の長さの何れでもよく、塩
基が約50個以下のオリゴヌクレオチドを含む。
【0020】DNAプローブは種々の源から従来法によ
り調製することができる。バクテリアのゲノム(genom
e)は全て、典型的に無菌状の試料中のバクテリアを検
出するように設計されたハイブリッド形成分析法のため
に固定化することができる。この分析法によれば、リボ
ソームRNA(ribosimal RNA)および転移RNA等
の豊富なバクテリア性RNAを検出することができる。
また細胞性RNA(cellularRNA)に対して相補的な
特異なDNA配列は、公知のプラスミドまたはウイルス
性のベクターにクローン化でき、ハイブリッド形成プロ
ーブとして用いることができる。
り調製することができる。バクテリアのゲノム(genom
e)は全て、典型的に無菌状の試料中のバクテリアを検
出するように設計されたハイブリッド形成分析法のため
に固定化することができる。この分析法によれば、リボ
ソームRNA(ribosimal RNA)および転移RNA等
の豊富なバクテリア性RNAを検出することができる。
また細胞性RNA(cellularRNA)に対して相補的な
特異なDNA配列は、公知のプラスミドまたはウイルス
性のベクターにクローン化でき、ハイブリッド形成プロ
ーブとして用いることができる。
【0021】ここで「DNAプローブ」という表現を用
いる場合、プローブ中に含まれる全てのヌクレオチドが
2′−デオキシリボヌクレオチドであることを意味する
ものではない。本発明の目的に対するDNAプローブの
基本的な特徴は、分析的に著しい程個々の単一鎖と交差
反応してハイブリッドのようなものを形成しない、DN
AプローブからなるDNA・RNAハイブリッドに対す
る抗体を刺激し得るような特性を有することである。し
たがって本分析を実施するために必要な抗体結合特性が
実質的に保たれるならば、プローブ中に含まれるヌクレ
オチドの2′−位置を化学的に修飾することができる。
同様に個々の単一鎖に比べ、二重鎖のハイブリッド形成
に対する抗体の特異性が妨害されなければ、2′−デオ
キシの化学修飾に限らず、プローブは、一般に、リボー
スホスフェイト骨格に沿ってどのようにも化学修飾する
ことができる。
いる場合、プローブ中に含まれる全てのヌクレオチドが
2′−デオキシリボヌクレオチドであることを意味する
ものではない。本発明の目的に対するDNAプローブの
基本的な特徴は、分析的に著しい程個々の単一鎖と交差
反応してハイブリッドのようなものを形成しない、DN
AプローブからなるDNA・RNAハイブリッドに対す
る抗体を刺激し得るような特性を有することである。し
たがって本分析を実施するために必要な抗体結合特性が
実質的に保たれるならば、プローブ中に含まれるヌクレ
オチドの2′−位置を化学的に修飾することができる。
同様に個々の単一鎖に比べ、二重鎖のハイブリッド形成
に対する抗体の特異性が妨害されなければ、2′−デオ
キシの化学修飾に限らず、プローブは、一般に、リボー
スホスフェイト骨格に沿ってどのようにも化学修飾する
ことができる。
【0022】ここで用いるDNAプローブの重要な性質
は、相補的なRNAまたはDNA鎖と二重鎖を形成した
プローブに対して惹起された抗体がプローブの二重鎖形
態と単一鎖の核酸との間の結合性で識別することであ
る。このような性質により、プローブのハイブリッドを
形成しない単一鎖の形態または非特異的に結合した試料
の核酸に対して著しくノイズとなる結合をすることな
く、分析混合物中のハイブリッドを形成したプローブを
検出することができる。
は、相補的なRNAまたはDNA鎖と二重鎖を形成した
プローブに対して惹起された抗体がプローブの二重鎖形
態と単一鎖の核酸との間の結合性で識別することであ
る。このような性質により、プローブのハイブリッドを
形成しない単一鎖の形態または非特異的に結合した試料
の核酸に対して著しくノイズとなる結合をすることな
く、分析混合物中のハイブリッドを形成したプローブを
検出することができる。
【0023】プローブの固定化 前述のように、プローブは、固定化されたまたは固定し
得る形で試料の核酸とハイブリッドを形成する。プロー
ブの固定し得る形とは、ハイブリッド形成反応に続き、
プローブがうまい具合に固定化され得る形のものをい
う。プローブを究極的に固定化する手段は、本発明にお
いては、特に制限されないが、プローブと目的とする配
列との間で形成されるハイブリッドがプローブの性質を
介して固定化される限りいかなる方法をも採用すること
ができる。従って試料核酸は直接固定化されることはな
い。
得る形で試料の核酸とハイブリッドを形成する。プロー
ブの固定し得る形とは、ハイブリッド形成反応に続き、
プローブがうまい具合に固定化され得る形のものをい
う。プローブを究極的に固定化する手段は、本発明にお
いては、特に制限されないが、プローブと目的とする配
列との間で形成されるハイブリッドがプローブの性質を
介して固定化される限りいかなる方法をも採用すること
ができる。従って試料核酸は直接固定化されることはな
い。
【0024】固定化された形でハイブリッド形成反応に
供される場合には、プローブは、該プローブおよび、ハ
イブリッド形成および/または抗ハイブリッド試薬との
結合によってプローブと結合する反応混合物の成分が残
る混合物から、遠心分離、濾過、クロマトグラフィーま
たはデカンテーション等によって単離または分離される
かぎり、いかなる形態をとってもよい。すなわち、固定
化されたプローブの種々の組成および形態は、当業者に
とっては明白でかつ利用可能なものである。本質的に
は、反応混合物に不溶なあらゆる形態のプローブを用い
ることができる。例えば、プローブは、凝集するか、さ
もなくば沈澱させるか、不溶性の物質、ポリマー、また
は支持体に付着させるかあるいはアガロース(agarose)
またはポリアクリルアミド等のゲル中に捕獲せしめる
[メソ・エンザイモル(Meth. Enzymol.)12B:63
5(1968)およびピーエヌエイエス(PNAS)6
7:807(1970)参照]。特に、プローブを共有
結合または非共有結合によって付着させるか固定化する
ための固体の支持体を用いるのが好ましく、非共有結合
による場合には、適度に安定で、かつ、強力な付着力を
与える吸着法がある。固体の支持体は種々の形状および
組成をとることができ、例えば、微粒子、ビーズ、多孔
質で不浸透性のストリップおよび膜、並びに試験管およ
びマイクロタイター・プレート(microtiter plate)等
の反応容器の内面が挙げられる。所望の反応相手を、選
択した固体の支持体に付着させる手段は当業者にとって
は日常的な仕事に属する。
供される場合には、プローブは、該プローブおよび、ハ
イブリッド形成および/または抗ハイブリッド試薬との
結合によってプローブと結合する反応混合物の成分が残
る混合物から、遠心分離、濾過、クロマトグラフィーま
たはデカンテーション等によって単離または分離される
かぎり、いかなる形態をとってもよい。すなわち、固定
化されたプローブの種々の組成および形態は、当業者に
とっては明白でかつ利用可能なものである。本質的に
は、反応混合物に不溶なあらゆる形態のプローブを用い
ることができる。例えば、プローブは、凝集するか、さ
もなくば沈澱させるか、不溶性の物質、ポリマー、また
は支持体に付着させるかあるいはアガロース(agarose)
またはポリアクリルアミド等のゲル中に捕獲せしめる
[メソ・エンザイモル(Meth. Enzymol.)12B:63
5(1968)およびピーエヌエイエス(PNAS)6
7:807(1970)参照]。特に、プローブを共有
結合または非共有結合によって付着させるか固定化する
ための固体の支持体を用いるのが好ましく、非共有結合
による場合には、適度に安定で、かつ、強力な付着力を
与える吸着法がある。固体の支持体は種々の形状および
組成をとることができ、例えば、微粒子、ビーズ、多孔
質で不浸透性のストリップおよび膜、並びに試験管およ
びマイクロタイター・プレート(microtiter plate)等
の反応容器の内面が挙げられる。所望の反応相手を、選
択した固体の支持体に付着させる手段は当業者にとって
は日常的な仕事に属する。
【0025】一般に、相補的な単一鎖配列を試料核酸に
対しハイブリッド形成するために用いることができれ
ば、どのような方法でもプローブを固定化するために用
いることができる。本発明は特定の方法および物質に限
定されるものではない。
対しハイブリッド形成するために用いることができれ
ば、どのような方法でもプローブを固定化するために用
いることができる。本発明は特定の方法および物質に限
定されるものではない。
【0026】直接固定化されたプローブを用いる方法に
代わる特に魅力ある別法は、反応速度が更に速い溶液中
でハイブリッド形成を進行させる固定化し得る形のプロ
ーブを用いる方法である。このような場合、通常、反応
相手と安定な共有結合または非共有結合を形成し得る反
応部位を有するプローブを用い、このような反応相手の
固定化された形にさらすことにより固定化することがで
きる。
代わる特に魅力ある別法は、反応速度が更に速い溶液中
でハイブリッド形成を進行させる固定化し得る形のプロ
ーブを用いる方法である。このような場合、通常、反応
相手と安定な共有結合または非共有結合を形成し得る反
応部位を有するプローブを用い、このような反応相手の
固定化された形にさらすことにより固定化することがで
きる。
【0027】プローブ中のこのような反応部位として
は、アビジンまたは反応相手となる抗体等の結合物質と
特異な非共有結合を形成し得るビオチンまたはハプテン
部分等の結合部位が好ましい。
は、アビジンまたは反応相手となる抗体等の結合物質と
特異な非共有結合を形成し得るビオチンまたはハプテン
部分等の結合部位が好ましい。
【0028】
【課題を解決するための手段】本発明のモノクローナル
抗体は、プローブと相補的な試料核酸との間に形成され
るDNA・RNAハイブリッドと結合し単一鎖のポリヌ
クレオチドを著しく排除する能力に特徴がある。そのよ
うなDNA・RNAハイブリッドに対して特異的に結合
するモノクローナル抗体は、それを産生分泌するハイブ
リドーマセルラインHB8730から得られる。ハイブ
リドーマセルラインHB8730は、ブタベスト条約に
従ってATCCに寄託され、その寄託番号はHB873
0である。
抗体は、プローブと相補的な試料核酸との間に形成され
るDNA・RNAハイブリッドと結合し単一鎖のポリヌ
クレオチドを著しく排除する能力に特徴がある。そのよ
うなDNA・RNAハイブリッドに対して特異的に結合
するモノクローナル抗体は、それを産生分泌するハイブ
リドーマセルラインHB8730から得られる。ハイブ
リドーマセルラインHB8730は、ブタベスト条約に
従ってATCCに寄託され、その寄託番号はHB873
0である。
【0029】ハイブリドーマセルラインHB8730の
調製は、Biochem. 19, 2835 (1980)に記載された方法
に従い、DNAをRNAポリメラーゼで転写することに
よって作られたDNA・RNAハイブリッドを免疫源と
してマウスに注射し、それに対する抗体産生に関わる脾
細胞を取り出し、これをSP2/O−Ag14骨髄種細
胞(ATCCより入手可能)と細胞融合させ、DNA・
RNAハイブリッドに対して特異的な抗体を分泌するハ
イブリドーマをスクリーニングして単離することができ
る。
調製は、Biochem. 19, 2835 (1980)に記載された方法
に従い、DNAをRNAポリメラーゼで転写することに
よって作られたDNA・RNAハイブリッドを免疫源と
してマウスに注射し、それに対する抗体産生に関わる脾
細胞を取り出し、これをSP2/O−Ag14骨髄種細
胞(ATCCより入手可能)と細胞融合させ、DNA・
RNAハイブリッドに対して特異的な抗体を分泌するハ
イブリドーマをスクリーニングして単離することができ
る。
【0030】このようにして得たハイブリドーマからモ
ノクローナル抗体を得るには、通常の抗体を調製する方
法に従って実施することができる。例えば、このモノク
ローナル抗体のスクリーニング法は、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 78, 3751 及びMeth. in Enzymol. 73, 1
に記載されている。
ノクローナル抗体を得るには、通常の抗体を調製する方
法に従って実施することができる。例えば、このモノク
ローナル抗体のスクリーニング法は、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 78, 3751 及びMeth. in Enzymol. 73, 1
に記載されている。
【0031】クローニングされたハイブリドーマをマウ
ス腹腔内で増殖させ、目的の一つの抗原決定基に対する
均一なモノクローナル抗体を多量に産生させることがで
きる。
ス腹腔内で増殖させ、目的の一つの抗原決定基に対する
均一なモノクローナル抗体を多量に産生させることがで
きる。
【0032】抗体試薬に対する免疫グロブリン源は、従
来の抗血清およびモノクローナル技術等のいかなる技術
を用いても得ることができる。抗血清は、適切な免疫原
を用いて、マウス、兎、モルモット、山羊等の動物を感
作させる、十分に確立された技術によって得ることがで
きる。免疫グロブリンもまた、適当な免疫原の利用を含
み、モノクローナル抗体といわれる物質を生じる体細胞
のハイブリッド形成技術によって得ることができる。
来の抗血清およびモノクローナル技術等のいかなる技術
を用いても得ることができる。抗血清は、適切な免疫原
を用いて、マウス、兎、モルモット、山羊等の動物を感
作させる、十分に確立された技術によって得ることがで
きる。免疫グロブリンもまた、適当な免疫原の利用を含
み、モノクローナル抗体といわれる物質を生じる体細胞
のハイブリッド形成技術によって得ることができる。
【0033】DNA・RNAハイブリッドに対して特異
的な抗体を刺激するための免疫源は、ホモ重合体または
ヘテロ重合体のポリヌクレオチド二重鎖から構成するこ
とができる。可能なホモ重合体の二重鎖のなかでは、特
にポリ(γA)・ポリ(dT)が好ましい[キタガワお
よびストーラー(Kitagawa and Stollar)(1982)モル
・インミュノル(Mol. Immunol.)19:413]。しか
しながら一般に、ヘテロ重合体の二重鎖を用いるのが好
ましく、φ×174ビリオンDNA(φ×174 Virio
n DNA)のRNAポリメラーゼによる複写を含む種々
の方法によって調製することができる[ナカザト(Naka
zato)(1980)バイオケム(Biochem.)19:283
5]。選んだRNA、DNA二重鎖は、メチル化した蛋
白質に吸着させるか、または仔牛血清アルブミン等の従
来の免疫源担体物質等に結合させ、所望の宿種動物に注
入する[ストーラー(Stollar)(1980)メソ・エンザイ
モル(Meth. Enzymol.)70:70参照]。
的な抗体を刺激するための免疫源は、ホモ重合体または
ヘテロ重合体のポリヌクレオチド二重鎖から構成するこ
とができる。可能なホモ重合体の二重鎖のなかでは、特
にポリ(γA)・ポリ(dT)が好ましい[キタガワお
よびストーラー(Kitagawa and Stollar)(1982)モル
・インミュノル(Mol. Immunol.)19:413]。しか
しながら一般に、ヘテロ重合体の二重鎖を用いるのが好
ましく、φ×174ビリオンDNA(φ×174 Virio
n DNA)のRNAポリメラーゼによる複写を含む種々
の方法によって調製することができる[ナカザト(Naka
zato)(1980)バイオケム(Biochem.)19:283
5]。選んだRNA、DNA二重鎖は、メチル化した蛋
白質に吸着させるか、または仔牛血清アルブミン等の従
来の免疫源担体物質等に結合させ、所望の宿種動物に注
入する[ストーラー(Stollar)(1980)メソ・エンザイ
モル(Meth. Enzymol.)70:70参照]。
【0034】RNA・RNA二重鎖に対する抗体は、と
りわけレオウイルス(reovirus)または蔗糖に感染する
フィージィー病ウイルス(Fiji disease virus)等のウ
イルスからの二重鎖RNAに対して産生する。また、と
りわけ、ポリ(γI)・ポリ(γC)またはポリ(γ
A)・ポリ(γU)等のホモ重合体も上述のような感作
(免疫化)に用いることができる。
りわけレオウイルス(reovirus)または蔗糖に感染する
フィージィー病ウイルス(Fiji disease virus)等のウ
イルスからの二重鎖RNAに対して産生する。また、と
りわけ、ポリ(γI)・ポリ(γC)またはポリ(γ
A)・ポリ(γU)等のホモ重合体も上述のような感作
(免疫化)に用いることができる。
【0035】本方法に従う抗体試薬のハイブリッド形成
したプローブに対する結合は、いかなる好都合な技術に
よっても検出することもできる。抗体試薬はそれ自体検
出可能な化学的な原子団によって標識されているのが有
利である。このような化学的な原子団は、検出可能な物
理的または化学的性質を有すれば、いかなる物質であっ
てもよい。このような物質は、免疫分析法の領域におい
ては充分に開発されており、このような方法に用いられ
る標識は、一般に、ほとんど全て本発明に応用すること
ができる。酵素[クリニ・ケム(Clin. Chem), (1976)
22:1243、ユー・エス・ライシュ・パット(U.S.
Reissue Pat.)No. 31,006およびユー・ケイ・パ
ット(UK Pat.)2,109,408参照]、酵素基質
[ユー・エス・パット(U.S. Pat.)No. 4,492,7
51参照]、コファクター[ユー・エス・パット(U.S.
Pat.)No. 4,230,799およびNo. 4,238,
565参照]および酵素阻害剤[ユー・エス・パット
(U.S. Pat.)No. 4,134,792参照]等の酵素学
的に活性な原子団、螢光体[クリニ・ケム(Clin. Che
m.)(1979)25:353参照]、発色団、化学発光体
および生物発光体等の発光体[ユー・エス・パット(U.
S. Pat.)No. 4,380,580参照]。ビオチン等の
特異な結合が可能な配位子[ユーロピアン・パット・セ
ク(European Pat.Sec.)63,879]またはハプテ
ン[ピー・シー・ティ・パブリ・(PCT Publ.)83−2
286]、並びに 3H、35S、32P、 125Iおよび14C
等の放射性同位元素が特に有用である。このような標識
および標識体は、それぞれ固有の物理的性質(例えば、
螢光体、発色団および放射性同位元素)または反応性あ
るいは結合性(例えば、酵素、基質、コファクターおよ
び阻害剤)に基づいて検出される。例えば、コファクタ
ーで標識した抗体は、標識がその酵素に対するコファク
ターおよび基質である酵素を添加することによって検出
することができる。ハプテンまたは配位子(例えばビオ
チン)で標識した抗体は、検出可能な分子(部分)を含
んだ、ハプテンに対する抗体、または配位子と結合する
蛋白質(例えばアビジン)を添加することによって検出
できる。このような検出可能な分子は、測定可能な物理
的性質(例えば螢光または光吸収)を有する分子である
か、あるいは、酵素反応に関与する何らかの分子である
(例えば、上記参照)。例えば、基質に作用して測定可
能な物理的性質を有する生成物を与える酵素を用いるこ
とができる。このような酵素として、例えば、β−ガラ
クトシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびペルオキ
シダーゼがあるが、これらに限定されるものではない。
その他の標識化の方式は当業者にとってよく知られてい
るものである。
したプローブに対する結合は、いかなる好都合な技術に
よっても検出することもできる。抗体試薬はそれ自体検
出可能な化学的な原子団によって標識されているのが有
利である。このような化学的な原子団は、検出可能な物
理的または化学的性質を有すれば、いかなる物質であっ
てもよい。このような物質は、免疫分析法の領域におい
ては充分に開発されており、このような方法に用いられ
る標識は、一般に、ほとんど全て本発明に応用すること
ができる。酵素[クリニ・ケム(Clin. Chem), (1976)
22:1243、ユー・エス・ライシュ・パット(U.S.
Reissue Pat.)No. 31,006およびユー・ケイ・パ
ット(UK Pat.)2,109,408参照]、酵素基質
[ユー・エス・パット(U.S. Pat.)No. 4,492,7
51参照]、コファクター[ユー・エス・パット(U.S.
Pat.)No. 4,230,799およびNo. 4,238,
565参照]および酵素阻害剤[ユー・エス・パット
(U.S. Pat.)No. 4,134,792参照]等の酵素学
的に活性な原子団、螢光体[クリニ・ケム(Clin. Che
m.)(1979)25:353参照]、発色団、化学発光体
および生物発光体等の発光体[ユー・エス・パット(U.
S. Pat.)No. 4,380,580参照]。ビオチン等の
特異な結合が可能な配位子[ユーロピアン・パット・セ
ク(European Pat.Sec.)63,879]またはハプテ
ン[ピー・シー・ティ・パブリ・(PCT Publ.)83−2
286]、並びに 3H、35S、32P、 125Iおよび14C
等の放射性同位元素が特に有用である。このような標識
および標識体は、それぞれ固有の物理的性質(例えば、
螢光体、発色団および放射性同位元素)または反応性あ
るいは結合性(例えば、酵素、基質、コファクターおよ
び阻害剤)に基づいて検出される。例えば、コファクタ
ーで標識した抗体は、標識がその酵素に対するコファク
ターおよび基質である酵素を添加することによって検出
することができる。ハプテンまたは配位子(例えばビオ
チン)で標識した抗体は、検出可能な分子(部分)を含
んだ、ハプテンに対する抗体、または配位子と結合する
蛋白質(例えばアビジン)を添加することによって検出
できる。このような検出可能な分子は、測定可能な物理
的性質(例えば螢光または光吸収)を有する分子である
か、あるいは、酵素反応に関与する何らかの分子である
(例えば、上記参照)。例えば、基質に作用して測定可
能な物理的性質を有する生成物を与える酵素を用いるこ
とができる。このような酵素として、例えば、β−ガラ
クトシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびペルオキ
シダーゼがあるが、これらに限定されるものではない。
その他の標識化の方式は当業者にとってよく知られてい
るものである。
【0036】更に、抗体試薬は、それに固有の抗原性等
の生来の性質を基にして検出することもできる。標識さ
れた抗抗体[anti−(antibody)antibody]は、二次抗
体に対する標識が上述のような従来の標識である場合に
一次抗体に結合する。また、抗体は、抗体検出法として
知られているその他の技術と同様に、補足的な固定化
(complement fixation)または標識したプロティンAを
用いて検出することもできる。
の生来の性質を基にして検出することもできる。標識さ
れた抗抗体[anti−(antibody)antibody]は、二次抗
体に対する標識が上述のような従来の標識である場合に
一次抗体に結合する。また、抗体は、抗体検出法として
知られているその他の技術と同様に、補足的な固定化
(complement fixation)または標識したプロティンAを
用いて検出することもできる。
【0037】好ましいことではあるが抗体試薬を標識す
る場合には、標識部分と抗体試薬とは、共有結合を含む
ような直接的な化学結合、あるいは、抗体と結合する小
胞体(microcapsule)あるいはリボソームに標識が包含
せしめるような間接的な結合によって、相互に会合せし
められるか結合される。標識化技術は当業者には充分知
られており、本発明においては、好都合な方法ならいか
なる方法をも用いることができる。
る場合には、標識部分と抗体試薬とは、共有結合を含む
ような直接的な化学結合、あるいは、抗体と結合する小
胞体(microcapsule)あるいはリボソームに標識が包含
せしめるような間接的な結合によって、相互に会合せし
められるか結合される。標識化技術は当業者には充分知
られており、本発明においては、好都合な方法ならいか
なる方法をも用いることができる。
【0038】反応混合物 分析される試験試料は、目的とするいかなる媒体であっ
てもよく、通常は、医学的、獣医学的、環境学的、栄養
学的あるいは工業的に重要な液体試料である。特に本発
明の方法によっては、ヒトおよび動物標本並びに体液を
分析することができ、例えば尿、血液(血清または血
漿)、乳液、髄液、唾液、糞便、肺吸引物、喉スワブ、
性器スワブおよび滲出液、直腸スワブおよび耳鼻喉吸引
物などを分析することができる。患者その他の源から得
られた試験すべき試験試料が主に、例えば、細胞中に含
まれる二重鎖核酸を含む場合には、試料を処理して核酸
を変性させ、必要に応じて、先ず核酸を細胞から放出さ
せる。核酸の変性は沸騰水中における加熱或いはアルカ
リ処理(例えば、0.1N水酸化ナトリウム)によって
達成するのが好ましく、望ましくはこれらを同時に使用
して細胞を溶解させるのがよい。また、核酸の放出は、
例えば、機械的破壊(凍結/融解、摩耗、超音波処
理)、物理的/化学的破壊(Triton、Tween 、ドデシル
硫酸ナトリウムなどの洗剤、アルカリ処理、浸透圧衝撃
或いは熱)、或いは酵素的溶解(リゾチーム、プロティ
ナーゼK、ペプシン)により得ることができる。得られ
た試験媒体は核酸を一重鎖の形態で含有し、これは次い
で本発明のハイブリッド形成方法により分析することが
できる。
てもよく、通常は、医学的、獣医学的、環境学的、栄養
学的あるいは工業的に重要な液体試料である。特に本発
明の方法によっては、ヒトおよび動物標本並びに体液を
分析することができ、例えば尿、血液(血清または血
漿)、乳液、髄液、唾液、糞便、肺吸引物、喉スワブ、
性器スワブおよび滲出液、直腸スワブおよび耳鼻喉吸引
物などを分析することができる。患者その他の源から得
られた試験すべき試験試料が主に、例えば、細胞中に含
まれる二重鎖核酸を含む場合には、試料を処理して核酸
を変性させ、必要に応じて、先ず核酸を細胞から放出さ
せる。核酸の変性は沸騰水中における加熱或いはアルカ
リ処理(例えば、0.1N水酸化ナトリウム)によって
達成するのが好ましく、望ましくはこれらを同時に使用
して細胞を溶解させるのがよい。また、核酸の放出は、
例えば、機械的破壊(凍結/融解、摩耗、超音波処
理)、物理的/化学的破壊(Triton、Tween 、ドデシル
硫酸ナトリウムなどの洗剤、アルカリ処理、浸透圧衝撃
或いは熱)、或いは酵素的溶解(リゾチーム、プロティ
ナーゼK、ペプシン)により得ることができる。得られ
た試験媒体は核酸を一重鎖の形態で含有し、これは次い
で本発明のハイブリッド形成方法により分析することが
できる。
【0039】公知の如く、各種のハイブリッド形成条件
を分析に使用することができる。典型的には、ハイブリ
ッド形成はやや高温の条件、例えば、約35〜75℃、
通常は65℃付近において、適当なイオン強度を有する
約pH6〜8の緩衝液(例えば、1×SSC=0.15M
塩化ナトリウムおよび0.015Mクエン酸ナトリウム
である場合に2×SSC、pH7.0)、仔牛血清アルブ
ミン等の蛋白質、ファイコル(Ficoll)[ファルマシア
ファイン、ケミカルズ、ピスカタウェイ ニューヨー
ク(Pharmacia Fine Chemicals, Ptscataway, NY)によ
って販売されているスクロースとエピクロルヒドリンと
の共重合体に対する商標]、ポリビニルピロリドンおよ
び仔牛の胸腺あるいは鮭の***等からの変性された異種
DNAからなる溶液中で進行する。生起するハイブリッ
ド形成に必要とする試料およびプローブの鎖間の相補性
の度合は、条件の厳密性に依存する。ハイブリッド形成
の度合および特異性は、以下の主要な条件によって影響
される。
を分析に使用することができる。典型的には、ハイブリ
ッド形成はやや高温の条件、例えば、約35〜75℃、
通常は65℃付近において、適当なイオン強度を有する
約pH6〜8の緩衝液(例えば、1×SSC=0.15M
塩化ナトリウムおよび0.015Mクエン酸ナトリウム
である場合に2×SSC、pH7.0)、仔牛血清アルブ
ミン等の蛋白質、ファイコル(Ficoll)[ファルマシア
ファイン、ケミカルズ、ピスカタウェイ ニューヨー
ク(Pharmacia Fine Chemicals, Ptscataway, NY)によ
って販売されているスクロースとエピクロルヒドリンと
の共重合体に対する商標]、ポリビニルピロリドンおよ
び仔牛の胸腺あるいは鮭の***等からの変性された異種
DNAからなる溶液中で進行する。生起するハイブリッ
ド形成に必要とする試料およびプローブの鎖間の相補性
の度合は、条件の厳密性に依存する。ハイブリッド形成
の度合および特異性は、以下の主要な条件によって影響
される。
【0040】1.核酸調製剤の純度
【0041】2.プローブの塩基組成−すなわち、GC
塩基対はA−TまたはA−U塩基対よりも熱安定性が大
きい。従って、G−C含量の高いハイブリッド形成は比
較的高温においても安定である。
塩基対はA−TまたはA−U塩基対よりも熱安定性が大
きい。従って、G−C含量の高いハイブリッド形成は比
較的高温においても安定である。
【0042】3.均一な塩基配列の長さ−いかなる短い
塩基の配列(例えば6塩基以下)であっても、多数の核
酸に存在する可能性の度合が高い。従ってこのような短
い塩基配列を含むハイブリッド形成においては特異性は
ほとんどあるいは全くない。本発明の均一なプローブの
配列は、少なくとも10塩基、通常は20塩基以上であ
って、100塩基以上であるのが好ましい。実用的な見
地からは、均一なプローブ配列は300〜1,000の
ヌクレオチドとなることもしばしばである。
塩基の配列(例えば6塩基以下)であっても、多数の核
酸に存在する可能性の度合が高い。従ってこのような短
い塩基配列を含むハイブリッド形成においては特異性は
ほとんどあるいは全くない。本発明の均一なプローブの
配列は、少なくとも10塩基、通常は20塩基以上であ
って、100塩基以上であるのが好ましい。実用的な見
地からは、均一なプローブ配列は300〜1,000の
ヌクレオチドとなることもしばしばである。
【0043】4.イオン強度−リアニーリングの速度は
インキュベーション溶液のイオン強度の増大とともに増
大する。ハイブリッドの熱安定性も増大する。
インキュベーション溶液のイオン強度の増大とともに増
大する。ハイブリッドの熱安定性も増大する。
【0044】5.インキュベーション温度−所定の二重
鎖に対する融解温度(Tm)よりも低い約25〜30℃の
温度で最適なリアニーリングが起こる。最適温度よりも
著しく低い温度におけるインキュベーションにおいて
は、関連する塩基配列のハイブリッド形成を起こしにく
い。
鎖に対する融解温度(Tm)よりも低い約25〜30℃の
温度で最適なリアニーリングが起こる。最適温度よりも
著しく低い温度におけるインキュベーションにおいて
は、関連する塩基配列のハイブリッド形成を起こしにく
い。
【0045】6.核酸濃度およびインキュベーション時
間−通常、ハイブリッド形成を推進するためには、ハイ
ブリッド形成可能な試料核酸またはプローブ核酸の一方
を過剰に、通常は100倍以上過剰に存在させる。
間−通常、ハイブリッド形成を推進するためには、ハイ
ブリッド形成可能な試料核酸またはプローブ核酸の一方
を過剰に、通常は100倍以上過剰に存在させる。
【0046】7.変性試薬−ホルムアルデヒドおよび尿
素のような水素結合切断試薬が存在するとハイブリッド
形成の厳密性が増大する。
素のような水素結合切断試薬が存在するとハイブリッド
形成の厳密性が増大する。
【0047】8.インキュベーション時間−インキュベ
ーション時間が長ければ長い程、ハイブリッド形成は更
に完壁になる。
ーション時間が長ければ長い程、ハイブリッド形成は更
に完壁になる。
【0048】9.体積排除剤−例えば、デキストランお
よび硫酸デキストランのような体積排除剤が存在する
と、これによってハイブリッド形成要素の有効濃度が増
大し、従ってハイブリッド形成速度が増大する。
よび硫酸デキストランのような体積排除剤が存在する
と、これによってハイブリッド形成要素の有効濃度が増
大し、従ってハイブリッド形成速度が増大する。
【0049】通常、ハイブリッド形成のために選ばれる
温度条件は、形成されたハイブリッドに対する抗体試薬
の結合と標識の応答の検出と相入れないものである。従
って抗体試薬の結合工程および標識の検出工程は、ハイ
ブリッド形成工程の終了後に進行する。反応混合物は、
通常、約3℃〜約40℃の範囲の温度とし、次いで結合
および検出工程を行う。塩および/またはホルムアミド
の濃度が高くて抗体結合反応を著しく阻害する時には、
抗体試薬を添加するに先立ってハイブリッド形成混合物
を希釈するのが望ましい。
温度条件は、形成されたハイブリッドに対する抗体試薬
の結合と標識の応答の検出と相入れないものである。従
って抗体試薬の結合工程および標識の検出工程は、ハイ
ブリッド形成工程の終了後に進行する。反応混合物は、
通常、約3℃〜約40℃の範囲の温度とし、次いで結合
および検出工程を行う。塩および/またはホルムアミド
の濃度が高くて抗体結合反応を著しく阻害する時には、
抗体試薬を添加するに先立ってハイブリッド形成混合物
を希釈するのが望ましい。
【0050】
【実施例】以下本発明を実施例に基づき詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
【0051】実施例1 固定化DNAプローブを用いるE. Cori 23sリボソー
ムRNAに対するハイブリッド形成分析法 A.23sRNAに対するDNAプローブ DNAプローブは、E. Cori 中の23sRNAをコード
するrrnDオペロンのEcoRI/BglII断片であ
った[ジンクス−ロバートソンら(Jinks−Robertson et
al)(1983)セル(Cell.)33:865]。本プローブ
は、3′−ヒドロキシルからの23sRNA配列の約2
/3を含み、M13ウイルスベクターでクローン化さ
れ、細胞リボソームRNAと相補性のある単一鎖ビリオ
ンDNAを生成した。M13ウイルスをE. Cori 系統J
M103(E. Cori strain JM 103)中で成長させ、ポリ
エチレングリコールで沈澱させることにより培養溶媒か
ら単離した。ビリオンDNAをフェノール抽出によりウ
イルス粒子から精製した[マニアティスら(Maniatis,
et al)、スプラ(supra)]。
ムRNAに対するハイブリッド形成分析法 A.23sRNAに対するDNAプローブ DNAプローブは、E. Cori 中の23sRNAをコード
するrrnDオペロンのEcoRI/BglII断片であ
った[ジンクス−ロバートソンら(Jinks−Robertson et
al)(1983)セル(Cell.)33:865]。本プローブ
は、3′−ヒドロキシルからの23sRNA配列の約2
/3を含み、M13ウイルスベクターでクローン化さ
れ、細胞リボソームRNAと相補性のある単一鎖ビリオ
ンDNAを生成した。M13ウイルスをE. Cori 系統J
M103(E. Cori strain JM 103)中で成長させ、ポリ
エチレングリコールで沈澱させることにより培養溶媒か
ら単離した。ビリオンDNAをフェノール抽出によりウ
イルス粒子から精製した[マニアティスら(Maniatis,
et al)、スプラ(supra)]。
【0052】精製したDNAをNaOH中0.3Mと
し、37℃で4時間インキュベートして爽雑するRNA
を減成した。混合物は、30%酢酸を加えて中和し、D
NAを冷エタノールで沈澱させた。
し、37℃で4時間インキュベートして爽雑するRNA
を減成した。混合物は、30%酢酸を加えて中和し、D
NAを冷エタノールで沈澱させた。
【0053】B.メチル化したチログロブリンの調製 仔牛のチログロブリン[シグマ ケミカル カンパニー
セントルイス ミズリー(Sigma chemical Co., St.
Louis MO)]100mgを無水メタノール10mlおよび
2.55M HClメタノール溶液400μl と合わせ
た。この混合物をロータリーミキサーにより室温で5日
間撹拌した。沈澱物を遠心分離により集め、メタノール
で二回、エタノ−ルで二回洗浄した。次いで減圧下で一
晩乾燥した。約82mgの乾燥粉末が得られた。
セントルイス ミズリー(Sigma chemical Co., St.
Louis MO)]100mgを無水メタノール10mlおよび
2.55M HClメタノール溶液400μl と合わせ
た。この混合物をロータリーミキサーにより室温で5日
間撹拌した。沈澱物を遠心分離により集め、メタノール
で二回、エタノ−ルで二回洗浄した。次いで減圧下で一
晩乾燥した。約82mgの乾燥粉末が得られた。
【0054】C.ハイブリドーマの調製 中里(Nakazato)[バイオケム(Biochem.)19:28
35(1980) ]により記載されているようにφ×174
ビリオンDNAをRNAポリメラーゼで複写することに
よりDNA・RNAハイブリッドを調製した。1mMのE
DTAを含むpH7.4の20mM Tris−塩酸塩緩衝
液250μl 中のハイブリッド150mgを水250μl
中のメチル化されたチログロブリン150μg と合わせ
た。沈澱物が生じるが、これをTris−緩衝液中に懸
濁させた。この混合物を等量のフロインド・アジュバン
トで乳化した。このDNA・RNAハイブリッド懸濁液
0.5mlで複数匹のマウスをそれぞれ免疫し、このマウ
スの脾細胞をSP2/0−Ag14骨髄種細胞[アメリ
カンタイプカルチャーコレクション、ロックビルメリー
ランド(American Type Culture Collection, Rockvil
l, MD)から入手できる]と融合させた。DNA・RN
Aハイブリッドに対して特異的な抗体を分泌するハイブ
リドーマが単離された。これは、ATCC HB873
0[アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロック
ビル メリーランド(American TypeCulture Collectio
n, Rockvill, MD]に寄託されたハイブリドーマであ
る。RNA・DNAハイブリッドに対して特異的なモノ
クローナル抗体をスクーリングした[スチュアートら
(Stuart et al)(1981)(Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA)78、3751;ガルフリおよびミルシュタイン
(Galfre and Milstein)(1981)(Meth. in Enzymol.)
73、1]。
35(1980) ]により記載されているようにφ×174
ビリオンDNAをRNAポリメラーゼで複写することに
よりDNA・RNAハイブリッドを調製した。1mMのE
DTAを含むpH7.4の20mM Tris−塩酸塩緩衝
液250μl 中のハイブリッド150mgを水250μl
中のメチル化されたチログロブリン150μg と合わせ
た。沈澱物が生じるが、これをTris−緩衝液中に懸
濁させた。この混合物を等量のフロインド・アジュバン
トで乳化した。このDNA・RNAハイブリッド懸濁液
0.5mlで複数匹のマウスをそれぞれ免疫し、このマウ
スの脾細胞をSP2/0−Ag14骨髄種細胞[アメリ
カンタイプカルチャーコレクション、ロックビルメリー
ランド(American Type Culture Collection, Rockvil
l, MD)から入手できる]と融合させた。DNA・RN
Aハイブリッドに対して特異的な抗体を分泌するハイブ
リドーマが単離された。これは、ATCC HB873
0[アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロック
ビル メリーランド(American TypeCulture Collectio
n, Rockvill, MD]に寄託されたハイブリドーマであ
る。RNA・DNAハイブリッドに対して特異的なモノ
クローナル抗体をスクーリングした[スチュアートら
(Stuart et al)(1981)(Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA)78、3751;ガルフリおよびミルシュタイン
(Galfre and Milstein)(1981)(Meth. in Enzymol.)
73、1]。
【0055】D.DNA・RNAハイブリッドに対する
抗体 クローニングされたハイブリドーマは、マウスの腹腔内
で増殖し、多量の抗体を産生した。
抗体 クローニングされたハイブリドーマは、マウスの腹腔内
で増殖し、多量の抗体を産生した。
【0056】CI〜10インテグレーターを備えたLD
C/Milton Roy液体クロマトグラフを用いた高速液体ク
ロマトグラフィー(HPLC)により腹水液から抗体を
精製した。腹水液をpH6.8のリン酸カリウム0.01
Mで透析し、遠心分離して微粒子物質を除去し、0.2
2μm のニトロセルロースフィルターで濾過した。処理
した腹水液の1〜2mlをpH6.84のリン酸カリウム
0.01Mと平衡化した10×250mmの陰イオン交換
カラムに通した。pH6.84の0.01Mリン酸カリウ
ム〜pH6.40の0.085Mリン酸カリウム緩衝液を
用い、流速1ml/min 60分間の直線勾配法でクロマト
グラフィーを行った。IgGを含むピークを濃縮し、pH
7.4のリン酸緩衝食塩水で透析し、遠心分離すること
により変性蛋白質を全て除去した後、E1mg/ml 1cm =
1.40を用いて280nmの吸収を基にIgG濃度を測
定した。
C/Milton Roy液体クロマトグラフを用いた高速液体ク
ロマトグラフィー(HPLC)により腹水液から抗体を
精製した。腹水液をpH6.8のリン酸カリウム0.01
Mで透析し、遠心分離して微粒子物質を除去し、0.2
2μm のニトロセルロースフィルターで濾過した。処理
した腹水液の1〜2mlをpH6.84のリン酸カリウム
0.01Mと平衡化した10×250mmの陰イオン交換
カラムに通した。pH6.84の0.01Mリン酸カリウ
ム〜pH6.40の0.085Mリン酸カリウム緩衝液を
用い、流速1ml/min 60分間の直線勾配法でクロマト
グラフィーを行った。IgGを含むピークを濃縮し、pH
7.4のリン酸緩衝食塩水で透析し、遠心分離すること
により変性蛋白質を全て除去した後、E1mg/ml 1cm =
1.40を用いて280nmの吸収を基にIgG濃度を測
定した。
【0057】E.DNAプローブの固定化 セルロース粉末にm−ニトロフェニル基を導入し、次い
でDNAを共有結合で固定化するためにジアゾニウム塩
に変換した。
でDNAを共有結合で固定化するためにジアゾニウム塩
に変換した。
【0058】1−[(m−ニトロベンジルオキシ)メチ
ル]ピリジニウム・クロリド[アルドリッチ ケミカル
カンパニー、ミルウォーキー ウィスコンシン(Aldr
ichChemical Co., Milwaukee, WI)]を水7.7ml中で
酢酸ナトリウム128mgと混合した。シグマセルタイプ
20セルロース(Sigmacelltype 20 cellulose)[シグ
マ・ケミカル・カンパニー(Sigma Chemical Co.) ]2
g を添加し、60℃の水浴に浸したビーカー中で約15
分間混合した。セルロースをほぼ乾燥させ、更に135
〜140℃のオーブン中に45分間入れた。この間、で
きる限り高温に保持する程、m−ニトロフェニル残基が
うまく包含せしめられた。温度が高すぎるとセルロース
がカルメル化した。
ル]ピリジニウム・クロリド[アルドリッチ ケミカル
カンパニー、ミルウォーキー ウィスコンシン(Aldr
ichChemical Co., Milwaukee, WI)]を水7.7ml中で
酢酸ナトリウム128mgと混合した。シグマセルタイプ
20セルロース(Sigmacelltype 20 cellulose)[シグ
マ・ケミカル・カンパニー(Sigma Chemical Co.) ]2
g を添加し、60℃の水浴に浸したビーカー中で約15
分間混合した。セルロースをほぼ乾燥させ、更に135
〜140℃のオーブン中に45分間入れた。この間、で
きる限り高温に保持する程、m−ニトロフェニル残基が
うまく包含せしめられた。温度が高すぎるとセルロース
がカルメル化した。
【0059】焼成工程後、セルロースを水に懸濁させ、
粒子が15μm の篩を通るまで水中のセルロースをこす
って塊を砕いた。セルロースを一回120mlの水で三
度、一回50mlのエタノールで二度洗浄した。次いで一
晩減圧下で乾燥した。
粒子が15μm の篩を通るまで水中のセルロースをこす
って塊を砕いた。セルロースを一回120mlの水で三
度、一回50mlのエタノールで二度洗浄した。次いで一
晩減圧下で乾燥した。
【0060】2.0g のナトリウムジチオナイトを含む
0.1MのNa2 CO3 10ml中65℃で1時間インキ
ュベートすることによりセルロースのニトロフェニル基
を還元した。次いでセルロースをガラス濾過器上水で数
回、30%酢酸で一回洗浄した。最終的にセルロースを
水で更に三回洗浄し、40〜50℃、減圧下で一晩乾燥
した。
0.1MのNa2 CO3 10ml中65℃で1時間インキ
ュベートすることによりセルロースのニトロフェニル基
を還元した。次いでセルロースをガラス濾過器上水で数
回、30%酢酸で一回洗浄した。最終的にセルロースを
水で更に三回洗浄し、40〜50℃、減圧下で一晩乾燥
した。
【0061】還元したセルロース250mgを0℃で1.
2M HCl5.0mlに添加し、100mg/mlのNaN
O2 13μl を添加した。この混合物を1.0時間放置
し、この間混合物につきNaNO2 の存在を澱粉−ヨー
ド試験紙で試験した。試験結果が弱いか陰性であれば、
NaNO2 20μl を添加した。
2M HCl5.0mlに添加し、100mg/mlのNaN
O2 13μl を添加した。この混合物を1.0時間放置
し、この間混合物につきNaNO2 の存在を澱粉−ヨー
ド試験紙で試験した。試験結果が弱いか陰性であれば、
NaNO2 20μl を添加した。
【0062】反応期間が終了した時点で、セルロースを
冷ガラス濾過器上まず冷水(0℃)30〜50mlで、次
に10mMの冷尿素10〜15mlで、更に冷水で、そして
最終的にpH4.0の0.2M冷酢酸ナトリウム約10ml
で連続的に洗浄した。DNAプローブ69μg を含有す
るpH4.0の0.2M酢酸ナトリウム緩衝液0.92ml
を含むフラスコにセルロースを迅速に移した。
冷ガラス濾過器上まず冷水(0℃)30〜50mlで、次
に10mMの冷尿素10〜15mlで、更に冷水で、そして
最終的にpH4.0の0.2M冷酢酸ナトリウム約10ml
で連続的に洗浄した。DNAプローブ69μg を含有す
るpH4.0の0.2M酢酸ナトリウム緩衝液0.92ml
を含むフラスコにセルロースを迅速に移した。
【0063】混合物を0〜4℃で15時間振盪し、次い
でガラス濾過器上1×SSPE(0.18MのNaC
l、1mMのEDTAを含むpH7.8のリン酸ナトリウム
緩衝液20mM)、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(S
DS)で洗浄した。ホルムアミド2.0ml、20×SS
PE1.5ml、10mg/mlの仔牛血清アルブミン、10
mg/mlのFicoll、10mg/mlのピロリドン0.3ml、1
0%(W/V)のSDS0.03ml、4.25mg/mlの
鮭の***0.140mlをそれぞれ含有するハイブリッド
形成溶液中でセルロースを55℃で4時間インキュベー
トした。使用に先立ち、鮭の***のDNAを0.3Mの
NaOH中37℃で17時間インキュベートし、30%
酢酸で中和し、冷エタノール(−15℃)で沈澱させる
ことにより集めた。
でガラス濾過器上1×SSPE(0.18MのNaC
l、1mMのEDTAを含むpH7.8のリン酸ナトリウム
緩衝液20mM)、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(S
DS)で洗浄した。ホルムアミド2.0ml、20×SS
PE1.5ml、10mg/mlの仔牛血清アルブミン、10
mg/mlのFicoll、10mg/mlのピロリドン0.3ml、1
0%(W/V)のSDS0.03ml、4.25mg/mlの
鮭の***0.140mlをそれぞれ含有するハイブリッド
形成溶液中でセルロースを55℃で4時間インキュベー
トした。使用に先立ち、鮭の***のDNAを0.3Mの
NaOH中37℃で17時間インキュベートし、30%
酢酸で中和し、冷エタノール(−15℃)で沈澱させる
ことにより集めた。
【0064】55℃でのインキュベーションに続き、
0.1%のSDSを含む1×SSPE約10mlずつで二
度セルロースを洗浄した。セルロースをハイブリッド形
成溶液5.0mlに再度懸濁させ、スラリー状の部分標本
0.2mlをハイブリッド形成用の反応管に投じた。
0.1%のSDSを含む1×SSPE約10mlずつで二
度セルロースを洗浄した。セルロースをハイブリッド形
成溶液5.0mlに再度懸濁させ、スラリー状の部分標本
0.2mlをハイブリッド形成用の反応管に投じた。
【0065】F.23sリボソームRNAの調製 リボソームRNAをE. Coli から調製し、スクロース密
度勾配遠心分離により23s成分を単離した[タカナミ
・エム(Takanami, M.)、(1967) メソ・エンザイモル
[Meth. Enzymol.]、12A:491;マッコンキー・
イー・エイチ(McConkey, E.H.)(1967)メソ・エンザ
イモル(Meth. Enzymol.)、12A:620]。
度勾配遠心分離により23s成分を単離した[タカナミ
・エム(Takanami, M.)、(1967) メソ・エンザイモル
[Meth. Enzymol.]、12A:491;マッコンキー・
イー・エイチ(McConkey, E.H.)(1967)メソ・エンザ
イモル(Meth. Enzymol.)、12A:620]。
【0066】G.23sRNAに対するハイブリッド形
成分析法 固定化されたDNAプローブを有するセルロースを含む
反応管からハイブリッド形成溶液を吸引した。次いで、
23sRNA10ng/mlを含むハイブリッド形成溶液1
00μl を個々の反応管に添加し、これらを指示された
期間55℃でインキュベートした。インキュベーション
が終了したら、ハイブリッド形成溶液を除去し、0.1
%のSDSを含む1×SSPE 0.5mlでセルロース
を洗浄し、0.1%のSDSを含む1×SSPE 0.
5ml中55℃で30分間インキュベートし、0.1%の
SDSを含む1×SSPE 0.5mlで一回洗浄した。
成分析法 固定化されたDNAプローブを有するセルロースを含む
反応管からハイブリッド形成溶液を吸引した。次いで、
23sRNA10ng/mlを含むハイブリッド形成溶液1
00μl を個々の反応管に添加し、これらを指示された
期間55℃でインキュベートした。インキュベーション
が終了したら、ハイブリッド形成溶液を除去し、0.1
%のSDSを含む1×SSPE 0.5mlでセルロース
を洗浄し、0.1%のSDSを含む1×SSPE 0.
5ml中55℃で30分間インキュベートし、0.1%の
SDSを含む1×SSPE 0.5mlで一回洗浄した。
【0067】形成されたDNA・RNAの量を免疫分析
(immunoassay)により測定した。0.15MのNaC
l、1mMのEDTA、0.5%(V/V)のTween
20及び5.0mg/mlのBSAを含むpH7.4の20mM
リン酸ナトリウム緩衝液50μl を個々の反応管のセル
ロースに加え、室温で30分間振盪した。ついで、DN
A・RNAハイブリッドに対する抗体1.0μg を含
む、この溶液100μl を個々の反応管に加え、30分
間振盪を続けた。吸引により液体を除去し、5mMのMg
Cl2 、0.5%のTween−20及び5.0mg/ml
の仔牛血清(Tris/MgCl2 /Tween/BS
A)を含むpH8.0の0.1M Tris−塩酸塩緩衝
液各0.5mlでセルロースを4回洗浄した。次いで、ア
ルカリホスファターゼで標識した抗マウスIgG[シグ
マ・ケミカル・カンパニー(Sigma Chemical Co.,)]1
50μl を(Tris/MgCl2 /Tween/BS
A)中で200倍に希釈して個々の反応管に加え、室温
で1.0時間振盪した。
(immunoassay)により測定した。0.15MのNaC
l、1mMのEDTA、0.5%(V/V)のTween
20及び5.0mg/mlのBSAを含むpH7.4の20mM
リン酸ナトリウム緩衝液50μl を個々の反応管のセル
ロースに加え、室温で30分間振盪した。ついで、DN
A・RNAハイブリッドに対する抗体1.0μg を含
む、この溶液100μl を個々の反応管に加え、30分
間振盪を続けた。吸引により液体を除去し、5mMのMg
Cl2 、0.5%のTween−20及び5.0mg/ml
の仔牛血清(Tris/MgCl2 /Tween/BS
A)を含むpH8.0の0.1M Tris−塩酸塩緩衝
液各0.5mlでセルロースを4回洗浄した。次いで、ア
ルカリホスファターゼで標識した抗マウスIgG[シグ
マ・ケミカル・カンパニー(Sigma Chemical Co.,)]1
50μl を(Tris/MgCl2 /Tween/BS
A)中で200倍に希釈して個々の反応管に加え、室温
で1.0時間振盪した。
【0068】0.5MのNaClを含むTris/Mg
Cl2 /Tween/BSA各0.5mlで個々の分析か
らのセルロースを2度洗浄し、次いでこの緩衝液1.5
〜2.0mlを用い、セルロースを正常な試験管に移し
た。緩衝液を除去し、セルロースに結合したアルカリホ
スファターゼ標識を測定した。
Cl2 /Tween/BSA各0.5mlで個々の分析か
らのセルロースを2度洗浄し、次いでこの緩衝液1.5
〜2.0mlを用い、セルロースを正常な試験管に移し
た。緩衝液を除去し、セルロースに結合したアルカリホ
スファターゼ標識を測定した。
【0069】この目的のために、1mMのMgCl2 およ
び1mg/mlのp−ニトロフェニルホスフェイトを含むpH
9.8の1.0Mジエタノ−ルアミン−ハイドロクロラ
イド緩衝液200μl を加え、25℃で30分間インキ
ュベートした。次いで、0.1MのNa3 PO4 1.5
mlを添加することにより酵素触媒反応を止め、405nm
の吸光度を記録した。
び1mg/mlのp−ニトロフェニルホスフェイトを含むpH
9.8の1.0Mジエタノ−ルアミン−ハイドロクロラ
イド緩衝液200μl を加え、25℃で30分間インキ
ュベートした。次いで、0.1MのNa3 PO4 1.5
mlを添加することにより酵素触媒反応を止め、405nm
の吸光度を記録した。
【0070】結果は以下のとおりであった。
【0071】
【0072】吸光度はハイブリッド形成時間とともに増
大し、このことは形成されるDNA・RNAハイブリッ
ドの量が増大することを示す。
大し、このことは形成されるDNA・RNAハイブリッ
ドの量が増大することを示す。
【0073】実施例2 固定化し得るDNAプローブを用いる23sリボソーム
RNAに対するハイブリッド形成分析法試料RNAを付
加したビオチン残基を有する可溶性のDNAプローブで
ハイブリッド形成した。次いで、固定化されたストレプ
トアビジンを有する固体の支持体に、ハイブリッド形成
したDNAプローブとハイブリッド形成しないDNAプ
ローブとを結合させた。酵素で標識した抗DNA・RN
A抗体を用いる免疫分析法により、支持体上のDNA・
RNAの量を測定した。
RNAに対するハイブリッド形成分析法試料RNAを付
加したビオチン残基を有する可溶性のDNAプローブで
ハイブリッド形成した。次いで、固定化されたストレプ
トアビジンを有する固体の支持体に、ハイブリッド形成
したDNAプローブとハイブリッド形成しないDNAプ
ローブとを結合させた。酵素で標識した抗DNA・RN
A抗体を用いる免疫分析法により、支持体上のDNA・
RNAの量を測定した。
【0074】A.ビオチン化したプローブDNA 23sRNAに対して挿入相補性を有する実施例2で上
述したM−13ウイルスをE. Cori 系統JM103(E.
Cori strain JM103)中で増殖せしめ、細菌細胞を採取
してウイルス性のDNAの複製形を単離した。塩化セシ
ウム−臭化エチジウム密度勾配遠心分離によりこの二重
鎖DNAを精製した[マニアティスら(Maniatis, et a
l.) スプラ(supra)]。
述したM−13ウイルスをE. Cori 系統JM103(E.
Cori strain JM103)中で増殖せしめ、細菌細胞を採取
してウイルス性のDNAの複製形を単離した。塩化セシ
ウム−臭化エチジウム密度勾配遠心分離によりこの二重
鎖DNAを精製した[マニアティスら(Maniatis, et a
l.) スプラ(supra)]。
【0075】エンゾ バイオケム インコーポレイテッ
ド、ニューヨーク(EnzoBiochem.Inc., NY)により入手
できるビオチン化したdUTPを用いニックトランスレ
ーション(nick translation)により、ビオチン残基を
この二重鎖DNAに導入した[ランガー・ピー・アール
ら(Langer, P.R. et al)(1981)プロス・ナツル・ア
カデ・サイ(Proc. Natl. Acad. Sci.)、78:663
3;リアリー・ジェイ・ジェイら(Leary, J.J. et al)
(1983)プロス・ナツル・アカデ・サイ(Proc. Natl.
Acad. Sci)、80:4045]。
ド、ニューヨーク(EnzoBiochem.Inc., NY)により入手
できるビオチン化したdUTPを用いニックトランスレ
ーション(nick translation)により、ビオチン残基を
この二重鎖DNAに導入した[ランガー・ピー・アール
ら(Langer, P.R. et al)(1981)プロス・ナツル・ア
カデ・サイ(Proc. Natl. Acad. Sci.)、78:663
3;リアリー・ジェイ・ジェイら(Leary, J.J. et al)
(1983)プロス・ナツル・アカデ・サイ(Proc. Natl.
Acad. Sci)、80:4045]。
【0076】実施例1に記載したようにアルカリ処理に
より爽雑するRNAを減成した。使用する直前に、溶液
を沸騰水浴に4分間置くことによりビオチン化したプロ
ーブを変性した。
より爽雑するRNAを減成した。使用する直前に、溶液
を沸騰水浴に4分間置くことによりビオチン化したプロ
ーブを変性した。
【0077】B.ストレプトアビジンの固定化 グルタルアルデヒドで活性化したアクリルアミド−アガ
ロース支持体であるアクトーウルトロゲルAcA22
(Act-Ultrogel R AcA 22)[エルケイビー インスツル
メント インコーポレイテッド ガイザーブルグ メリ
ーランド(LKB Instruments, Inc., Gaithersburg, MD)
から入手できる]上にストレプトアビジン[カルバイオ
ケム−ベーリング・コーポレーション ラ ジョラ カ
リフォルニア(Calbiochem-Behving Corp., La Jolla,
CA)]を固定化した。製造者の指示に従い、固定化した
ところ、充填されたアクト−ウルトロゲルAcA22
(Act-Ultrogel ACA 22)10μl 当たりほぼ0.5μg
のストレプトアビジンが得られた。
ロース支持体であるアクトーウルトロゲルAcA22
(Act-Ultrogel R AcA 22)[エルケイビー インスツル
メント インコーポレイテッド ガイザーブルグ メリ
ーランド(LKB Instruments, Inc., Gaithersburg, MD)
から入手できる]上にストレプトアビジン[カルバイオ
ケム−ベーリング・コーポレーション ラ ジョラ カ
リフォルニア(Calbiochem-Behving Corp., La Jolla,
CA)]を固定化した。製造者の指示に従い、固定化した
ところ、充填されたアクト−ウルトロゲルAcA22
(Act-Ultrogel ACA 22)10μl 当たりほぼ0.5μg
のストレプトアビジンが得られた。
【0078】C.ハイブリッド形成分析 細菌感染症の疑いのある尿の部分標本2mlを3,000
×g で遠心分離し、バクテリアを沈渣させ、上澄をデカ
ンテーションした。実施例1に記載した90μl のハイ
ブリッド形成溶液を菌糸塊(pellet)毎に加え、ビオチ
ン化したプローブ(0.5mMのEDTAを含むpH7.0
の20mMリン酸ナトリウム緩衝液中0.5μg /mlの濃
度で)を加えた。混合物を撹拌して菌糸塊が存在すれば
これを懸濁させ、これらを55℃で4.0時間インキュ
ベートした。
×g で遠心分離し、バクテリアを沈渣させ、上澄をデカ
ンテーションした。実施例1に記載した90μl のハイ
ブリッド形成溶液を菌糸塊(pellet)毎に加え、ビオチ
ン化したプローブ(0.5mMのEDTAを含むpH7.0
の20mMリン酸ナトリウム緩衝液中0.5μg /mlの濃
度で)を加えた。混合物を撹拌して菌糸塊が存在すれば
これを懸濁させ、これらを55℃で4.0時間インキュ
ベートした。
【0079】次いで、仔牛血清5.0mgと固定化された
ストレプトアビジンを有するウルトロゲル(Ultrogel)
50μl とを含むpH7.4の20mMリン酸ナトリウム緩
衝液700μl を各混合物に加えてハイブリッド形成溶
液を希釈し、ビオチン化したプローブを固定化した。混
合物を室温で2時間振盪し、支持体から液体を除いた。
ストレプトアビジンを有するウルトロゲル(Ultrogel)
50μl とを含むpH7.4の20mMリン酸ナトリウム緩
衝液700μl を各混合物に加えてハイブリッド形成溶
液を希釈し、ビオチン化したプローブを固定化した。混
合物を室温で2時間振盪し、支持体から液体を除いた。
【0080】セルロース支持体に対して実施例1で記載
したように、免疫分析法によりウルトロゲル(ultroge
l)支持体に会合したDNA・RNAハイブリッドの量
を測定した。
したように、免疫分析法によりウルトロゲル(ultroge
l)支持体に会合したDNA・RNAハイブリッドの量
を測定した。
【0081】比較するために、マッコンキーおよび血液
寒天培地(McConkey andagarplates)を用い、1μl の
ループ培養法(loop culture method)により未処理の尿
についてバクテリアを試験した。培地を37℃で36時
間培養し、コロニーを数えた。
寒天培地(McConkey andagarplates)を用い、1μl の
ループ培養法(loop culture method)により未処理の尿
についてバクテリアを試験した。培地を37℃で36時
間培養し、コロニーを数えた。
【0082】培養法によるバクテリアの量の多い尿はハ
イブリッド形成分析法により吸光度が大きかった。
イブリッド形成分析法により吸光度が大きかった。
【図1】本発明のモノクローナル抗体を用いる核酸ハイ
ブリッド形成分析法の実施態様を示す説明図である。
ブリッド形成分析法の実施態様を示す説明図である。
【図2】本発明のモノクローナル抗体を用いる核酸ハイ
ブリッド形成分析法の実施態様を示す説明図である。
ブリッド形成分析法の実施態様を示す説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 33/577 B 9015−2J //(C12P 21/08 C12R 1:91)
Claims (2)
- 【請求項1】 ハイブリドーマセルラインHB873
0。 - 【請求項2】 ハイブリドーマセルラインHB8730
から産生分泌される、DNA・RNA二重鎖に対して特
異的に結合するモノクローナル抗体。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US61613284A | 1984-06-01 | 1984-06-01 | |
US616132 | 1984-06-01 | ||
US70742085A | 1985-03-01 | 1985-03-01 | |
US707420 | 1985-03-01 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH05168472A true JPH05168472A (ja) | 1993-07-02 |
JPH0768280B2 JPH0768280B2 (ja) | 1995-07-26 |
Family
ID=27087673
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3124648A Expired - Lifetime JPH0768280B2 (ja) | 1984-06-01 | 1991-04-30 | モノクローナル抗体 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
EP (3) | EP0163220B1 (ja) |
JP (1) | JPH0768280B2 (ja) |
AT (3) | ATE80666T1 (ja) |
AU (1) | AU587188B2 (ja) |
CA (1) | CA1253777A (ja) |
DE (3) | DE3578349D1 (ja) |
DK (1) | DK163383C (ja) |
ES (1) | ES8703201A1 (ja) |
FI (1) | FI86311C (ja) |
IL (1) | IL75182A (ja) |
NO (1) | NO166301C (ja) |
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JP2015516814A (ja) * | 2012-04-30 | 2015-06-18 | キアゲン ゲーエムベーハー | 標的化されたdnaの濃縮および配列決定 |
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FR2606154B1 (fr) * | 1986-11-05 | 1990-05-11 | Pasteur Institut | Procede de detection et de dosage immunologique des acides nucleiques presents dans les milieux biologiques |
FR2606155B1 (fr) * | 1986-11-05 | 1990-07-20 | Pasteur Institut | Reactif immunologique pour la determination de la sequence d'un acide nucleique, son procede de preparation et methode immunologique de determination de la sequence d'un acide nucleique a l'aide de ce reactif |
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KR100289793B1 (ko) * | 1992-01-29 | 2001-12-01 | 테츠오 토미나가 | 폴리누클레오티드고정지지체 |
ES2044784B1 (es) * | 1992-06-12 | 1994-09-01 | Inia | Procedimiento para la deteccion e identificacion de patogenos virales y subvirales. |
PT1038022E (pt) | 1997-12-12 | 2005-11-30 | Digene Corp | Avaliacao de doencas relacionadas com o virus papiloma humano |
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-
1985
- 1985-05-10 CA CA000481294A patent/CA1253777A/en not_active Expired
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- 1985-05-30 FI FI852160A patent/FI86311C/fi not_active IP Right Cessation
-
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