JPH05132428A - Periodontosis preventing vaccine for nasal application - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain the subject vaccine applicable to nasal cavity without causing pain and digestion and capable of easily and efficiently increase the antibody titer by using the surface layer substance of bacterial cell of Porphyromonas gingivalis, Actinomyces viscosous, etc., as an antigen. CONSTITUTION:A bacterial strain such as Porphyromonas gingivalis, Actinomyces viscosous, Prevotella intermedia, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Triponema denticola, Wolinella recta and Bacteroides forsythus is cultured in a medium, the cultured cells are collected by centrifugal separation and repeatedly passed through an injection needle to break and separate the surface layer substance such as cilium from the cell and the surface layer substance is depolymerized with protease and compounded with a surfactant, cholera toxin B, bile acid, etc., to obtain the objective periodontosis preventing vaccine for nasal application, applicable to nasal cavity without causing pain and digestion in contrast with injection and oral administration and capable of easily and efficiently increase the antibody titer.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、歯周病の予防ワクチン
に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a preventive vaccine for periodontal disease.

【０００２】[0002]

【従来の技術】歯周疾患の主原因は、歯周ポケットに蓄
積する歯垢中の細菌である。健康な歯周ポケットでは、
通常グラム陽性球菌が大部分を占めているが、歯周疾患
が進行すると、ポルフィロモナス・ジンジバリス、アク
チノマイセス・ビスコーサス、プレボテーラ・インター
メデア等の歯周病病原菌が増殖する。2. Description of the Related Art The main cause of periodontal disease is bacteria in plaque accumulated in periodontal pockets. In a healthy periodontal pocket,
Gram-positive cocci usually occupy the majority, but when periodontal disease progresses, periodontal pathogens such as Porphyromonas gingivalis, Actinomyces viscosus, and Prevotella intermedea grow.

【０００３】歯周病病原菌は、菌体表面に線毛のような
表層物質を有しており、これらによって歯周粘膜に付着
し、増殖して歯周組織に悪影響を及ぼすと言われてい
る。このような原因による歯周病を予防するためには、
これらの歯周病病原菌の口腔内への定着を阻止し、ある
いは増殖を抑えることが有効である。[0003] Pathogens of periodontal disease have surface layer substances such as pili on the surface of bacterial cells, which are said to adhere to the periodontal mucosa and proliferate to adversely affect periodontal tissues. .. In order to prevent periodontal disease due to such causes,
It is effective to prevent colonization of these periodontal disease-causing bacteria in the oral cavity or suppress proliferation.

【０００４】従来、このような歯周病の予防方法として
は、アクチノマイセス・ビスコーサス、ポルフィロモナ
ス・ジンジバリス等の歯周病病原菌の線毛またはその抽
出物をワクチンとし、これを注射投与することが知られ
ている（特開昭５９−１２８３３８号公報）。[0004] Conventionally, as a method for preventing such periodontal disease, fimbriae of periodontal disease pathogenic bacteria such as Actinomyces viscosus, Porphyromonas gingivalis or the like is used as a vaccine, and this is administered by injection. It is known (Japanese Patent Application Laid-Open No. 59-128338).

【０００５】また、上記と同様の歯周病病原菌の全菌体
またはその線毛あるいはその抽出物を抗原とし、経口的
に投与するワクチンが知られている（特開昭６１−１４
０５２７号公報）。しかしながら、これらはいずれも注
射あるいは経口免疫である。Further, there is known a vaccine which is orally administered with whole cells of periodontal pathogenic bacteria similar to the above or pili thereof or extracts thereof as an antigen (JP-A-61-114).
No. 0527 publication). However, all of these are injection or oral immunization.

【０００６】経皮、経肉、静脈等による注射免疫の場合
には、局所における炎症の可能性があり、機能障害を起
こす恐れもある。また、注射は、苦痛を伴い、投与箇
所、例えば耳下腺近傍などでは投与に対する抵抗感もあ
る。さらに、注射投与では、唾液中の抗体価が上昇し難
いという欠点もあった。[0006] In the case of injection immunization by percutaneous, carcass, vein, etc., there is a possibility of local inflammation and there is a possibility of causing functional disorder. Further, the injection is accompanied by pain and there is a feeling of resistance to the administration at the administration site, for example, near the parotid gland. Furthermore, injection administration has a drawback that the antibody titer in saliva is unlikely to increase.

【０００７】経口投与の場合には、胃で消化される可能
性があり、また、免疫寛容を起こして抗原に対する応答
性がなくなり易いという問題があった。さらに、経口免
疫では抗体価が上がり難いという欠点があった。[0007] In the case of oral administration, there is a problem that it may be digested in the stomach, and immunological tolerance is caused to easily lose the responsiveness to the antigen. In addition, oral immunity has a drawback that the antibody titer is difficult to increase.

【０００８】[0008]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ワクチン抗
原を鼻腔内投与することにより、抗体化を効率よく上昇
させることが可能な歯周病予防ワクチンを提供するもの
である。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention provides a periodontal disease-preventing vaccine capable of efficiently increasing antibodyization by intranasally administering a vaccine antigen.

【０００９】[0009]

【課題を解決するための手段】本発明の点鼻用歯周病予
防ワクチンは、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏ
ｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｒｉｓ；Ｐ.
ｇ.）、アクチノマイセス・ビスコーサス（Ａｃｔｉｎ
ｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ；Ａ.ｖ.）、プレボテ
ーラ・インターメデア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔ
ｅｒｍｅ−ｄｉａ；Ｐ.ｉ.）、アクチノバチラス・アク
チノミセタンコミタンス（Ａｃ−ｔｉｎｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ；
Ａ．ａ．）、トリポネーマ・デンチコーラ（Ｔｒｅｐｏ
ｎｅｍａ ｄｅｎｔｉ−ｃｏｌａ；Ｔ．ｄ．）、ウォリ
ネラ・レクタ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｒｅｃｔａ；Ｗ．
ｒ．）またはバクテロイデス・フォーサイサス（Ｂａｃ
ｔｅｒｏｉｄｅｓｆｏｒｓｙｔｈｕｓ；Ｂ．ｆ．）の菌
体表層物質を抗原とし、鼻腔内に投与されることを特徴
とする。The preventive vaccine for periodontal disease for nasal drop of the present invention comprises Porphyromonas gingivalis ( Po).
rphyromonas gingivaris ; P.
g.), Actinomyces viscosus ( Actin
omyces viscosus ; A.v.), Prevotella intermedea ( Prevotella int
erme - dia ; P.i.), Actinobacillus actinomycetan committance ( Ac - tinobacill)
us actinomycetemcomitans ;
A. a. ), Tryponema Denchicola ( Trepo
nema denti - cola ; d. ), Wolinella recta ;
r. ) Or Bacteroides forsythus ( Bac
B. teroidesforsysth ; f. ) Is used as an antigen and is administered into the nasal cavity.

【００１０】[0010]

【発明の実施態様】本発明で用いられる菌は、いずれも
歯周病病原菌であり、種々の抗原を含んでいるが、本発
明ではそのうちの菌体表層物質を利用する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The bacteria used in the present invention are all pathogens of periodontal disease and contain various antigens, and in the present invention, the cell surface substance of them is used.

【００１１】抗原 菌 菌体表層物質 P.g. 線毛、莢膜 A.v. 線毛 P.i. 線毛、莢膜 A.a. 線毛、莢膜 T.d. 軸鞭毛、莢膜 W.r. 鞭毛B.f. 線毛、莢膜 [0011] Antigen bacterial bacterial cell surface material Pg pili capsular Av pili Pi pili, capsular Aa pili, capsular Td Jikumuchike capsular Wr flagella Bf pili, capsule

【００１２】これら菌体からの菌体表層物質抗原の分離
は、例えば、菌体を適当な培地で培養したのち、遠心分
離などにより集菌し、注射針の中をくり返し通すなどし
て菌体より線毛などの表層物質を分断し、ついで遠心分
離等により菌体と表層物質とを分離し、表層物質を回収
することにより行なうことができる。The cell surface antigen is separated from these cells by, for example, culturing the cells in an appropriate medium, collecting the cells by centrifugation, etc., and repeatedly passing the cells through an injection needle. It can be carried out by dividing the surface layer substance such as pili and then separating the microbial cells and the surface layer substance by centrifugation or the like, and collecting the surface layer substance.

【００１３】本発明では、得られた菌体表層物質抗原を
生理的食塩水等に溶解して点鼻用ワクチンとすることが
できる。In the present invention, the obtained microbial cell surface substance antigen can be dissolved in physiological saline or the like to prepare a nasal vaccine.

【００１４】また、菌体表層物質抗原をプロテアーゼで
処理して低分子化することにより、ワクチン効果をより
十分に発揮させることができる。この処理のうち、トリ
プシン処理は、精製した抗原をｐＨ７．０の緩衝液中に
溶解し、トリプシンで３７℃、５時間の加水分解を行な
った後、ゲル濾過または限外濾過によりトリプシンと抗
原部分分解物を分離、採取する。なお、トリプシン以外
に使用できるプロテアーゼとしては、アスパラギニルエ
ンドペプチダーゼ、アルギニルエンドペプチダーゼ、エ
ンドプロテアーゼリジンＣ、エンドプロテアーゼアルギ
ニンＣ、ククミシン、パパイン、トリプシン、キモトリ
プシン等がある。Further, the vaccine effect can be more sufficiently exerted by treating the cell surface substance antigen with a protease to reduce the molecular weight thereof. Among these treatments, the trypsin treatment is performed by dissolving the purified antigen in a pH 7.0 buffer solution, hydrolyzing the mixture with trypsin at 37 ° C. for 5 hours, and then performing gel filtration or ultrafiltration on the trypsin and the antigen portion. Separate and collect the degradation products. As proteases that can be used other than trypsin, there are asparaginyl endopeptidase, arginyl endopeptidase, endoprotease lysine C, endoprotease arginine C, cucumisin, papain, trypsin, chymotrypsin and the like.

【００１５】さらに、界面活性剤、コレラトキシンＢ、
胆汁酸またはその塩の１種または２種以上を添加してワ
クチン製剤とすることにより、投与後に抗体価を効率よ
く上昇させることができる。Further, a surfactant, cholera toxin B,
By adding one or more of bile acids or salts thereof to prepare a vaccine preparation, the antibody titer can be efficiently increased after administration.

【００１６】界面活性剤としては、アニオン界面活性
剤、カチオン界面活性剤、ノニオン界面活性剤、両性界
面活性剤などが用いられ、カチオン界面活性剤およびア
ニオン界面活性剤、特にカチオン界面活性剤が好適であ
る。また、これら界面活性剤を併用することもできる。As the surface active agent, an anionic surface active agent, a cationic surface active agent, a nonionic surface active agent, an amphoteric surface active agent or the like is used, and a cationic surface active agent and an anionic surface active agent, particularly a cationic surface active agent is preferable. Is. Further, these surfactants can be used together.

【００１７】カチオン界面活性剤としては、塩化ベンゼ
トニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニ
ウム、クロルヘキシジン・グルコネイト、クロルヘキシ
ジン・塩酸塩等の第４級アンモニウム塩などが挙げられ
る。Examples of cationic surfactants include quaternary ammonium salts such as benzethonium chloride, benzalkonium chloride, cetylpyridinium chloride, chlorhexidine gluconate and chlorhexidine hydrochloride.

【００１８】アニオン界面活性剤としては、高級脂肪酸
塩（石けん）、ラウロイルザルコシネート等のＮ−アシ
ルアミノ酸塩などのカルボン酸塩；ラウリルサルフェー
ト塩等のアルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキル
エーテルサルフェート等のアルキルエーテル硫酸塩、脂
肪酸モノグリセリド硫酸塩などの硫酸エステル塩；アル
カンスルホン酸塩、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウ
ム等のスルホコハク酸塩、Ｎ−アシルスルホン酸塩、脂
肪酸モノグリセリドスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸エ
ステル塩などのスルホン酸塩；アルキルリン酸塩、アル
キルエーテルリン酸塩などが挙げられる。Examples of the anionic surfactant include carboxylates such as N-acyl amino acid salts such as higher fatty acid salts (soap) and lauroyl sarcosinate; alkyl sulfates such as lauryl sulfate salts and polyoxyethylene alkyl ether sulfates. Sulfate salts such as alkyl ether sulfates and fatty acid monoglyceride sulfates; alkane sulfonates, sulfosuccinates such as sodium dioctylsulfosuccinate, N-acyl sulfonates, fatty acid monoglyceride sulfonates, α-sulfo fatty acid ester salts Examples thereof include sulfonates; alkyl phosphates, alkyl ether phosphates and the like.

【００１９】ノニオン界面活性剤としては、ポリオキシ
エチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキ
ルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００等）、
ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレ
ンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ ２０，Ｔｗ
ｅｅｎ ８０等）、ポリオキシエチレン（硬化）ヒマシ
油、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポ
リオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体などの
ノニオン界面活性剤が挙げられる。As the nonionic surfactant, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkylphenyl ether (Triton X-100 etc.),
Polyoxyethylene fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (Tween 20, Tw
een 80), polyoxyethylene (hardened) castor oil, polyoxyethylene glycerin fatty acid ester, polyoxyethylene polyoxypropylene copolymer, and other nonionic surfactants.

【００２０】胆汁酸としてはエチオビリアン酸、エチオ
アロビリアン酸、エチアン酸、３−ハイドロキシーノル
−５α−コラン酸、ノル−５α−コラン酸、デヒドロコ
ール酸、シリアン酸、エチオビリアン酸、１２−ケトコ
ラン酸、リトコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキ
シコール酸、コール酸、コラン酸などが挙げられ、これ
らのナトリウム塩、カリウム塩やこれらの誘導体、また
は誘導体のナトリウム塩、カリウム塩等も使用できる。
胆汁酸誘導体の中でも、胆汁酸とアミノ酸とのアミド化
合物、または胆汁酸とアミノスルホン酸とのアミド化合
物もしくはそれらのナトリウム塩、カリウム塩は本発明
に好適である。ここで、アミノ酸、アミノスルホン酸の
例としてはグリシン、セリン、アスパラギン、アスパラ
ギン酸、タウリンなどが挙げられる。Examples of bile acids are ethiobilian acid, ethiarobilianic acid, ethianic acid, 3-hydroxy-nor-5α-cholanic acid, nor-5α-cholanic acid, dehydrocholic acid, syrianic acid, ethiobilianic acid and 12-ketocholan. Acids, lithocholic acid, deoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, cholic acid, colanic acid and the like can be mentioned, and their sodium salts, potassium salts and their derivatives, or the sodium salts and potassium salts of derivatives can also be used.
Among the bile acid derivatives, amide compounds of bile acids and amino acids, amide compounds of bile acids and aminosulfonic acids, or their sodium salts and potassium salts are suitable for the present invention. Here, examples of amino acids and aminosulfonic acids include glycine, serine, asparagine, aspartic acid, and taurine.

【００２１】１回に投与するワクチン中の菌体表層物質
の量は、０．００５〜２ｍｇが好適であり、好ましくは
０．０２〜０．５ｍｇである。界面活性剤のワクチン中
への配合量は０．００１〜１重量％が好適であり、好ま
しくは０．０１〜０．２重量％である。The amount of the cell surface substance in the vaccine to be administered once is preferably 0.005 to 2 mg, and preferably 0.02 to 0.5 mg. The content of the surfactant in the vaccine is preferably 0.001 to 1% by weight, preferably 0.01 to 0.2% by weight.

【００２２】胆汁酸またはその塩は、ワクチン中に０．
００５〜２重量％配合することが好適であり、好ましく
は０．０２〜０．５重量％である。コレラトキシンＢの
配合量は、ワクチン中に５μｇ〜２ｍｇ／０．２ｍｌが
好適であり、好ましくは、３０μｇ〜０．５ｍｇ／０．
２ｍｌである。Bile acid or its salts are added to the vaccine in the amount of 0.
It is suitable to add 005 to 2% by weight, preferably 0.02 to 0.5% by weight. The amount of cholera toxin B to be added is preferably 5 μg to 2 mg / 0.2 ml in the vaccine, and preferably 30 μg to 0.5 mg / 0.
2 ml.

【００２３】本発明のワクチンは、上記各成分に加え、
必要に応じて防腐剤、保湿剤、粘結剤、アジュバンド、
吸収促進剤等を添加して、製剤化することができる。The vaccine of the present invention comprises, in addition to the above components,
Preservatives, moisturizers, binders, adjuvants, if necessary
An absorption promoter or the like may be added to the composition to prepare a preparation.

【００２４】具体的には例えばミョウバン、水酸化アル
ミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、ム
ラミルジペプチド等のアジュバンド；オレイン酸、ステ
アリン酸、パルミチン酸等のアジュバンド脂溶成分（吸
収促進剤）；グリセリン、ソルビット、キシリット、マ
ンニット、ラクチット、マルチット、ポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ ４００， ＰＥＧ ４０００等）等の
保湿剤；ソルビン酸、クロロブタノール、安息香酸、パ
ラオキシ安息香酸エステル、ほう酸、デヒドロ酢酸、チ
モール等の防腐剤；ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビ
ニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメ
チルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロ
キシエチルセルロース、カラギーナン、アルギン酸ナト
リウム、アラビアゴム、キサンタンガム、モンモリロナ
イト、カオリン、水和シリカ、ケイ酸アルミニウムマグ
ネシウム、ヘクトライトなどの粘結剤を配合することが
できる。Specifically, for example, adjuvants such as alum, aluminum hydroxide, aluminum phosphate, aluminum sulfate, and muramyl dipeptide; adjuvant fat-soluble components (absorption accelerators) such as oleic acid, stearic acid and palmitic acid; Moisturizers such as glycerin, sorbit, xylit, mannitol, lactit, maltite, polyethylene glycol (PEG 400, PEG 4000, etc.); sorbic acid, chlorobutanol, benzoic acid, paraoxybenzoic acid ester, boric acid, dehydroacetic acid, thymol, etc. Antiseptic; sodium polyacrylate, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxyethylcellulose, carrageenan, sodium alginate, gum arabic Xanthan gum, montmorillonite, can be blended kaolin, hydrated silica, magnesium aluminum silicate, a caking agent such as hectorite.

【００２５】[0025]

【発明の効果】本発明によれば、Ｐ．ｇ．，Ａ．ｖ．，
Ｐ．ｉ．，Ａ．ａ．，Ｔ．ｄ．，Ｗ．ｒ．，Ｂ．ｆ．菌
の菌体表層物質抗原を鼻粘膜から投与することにより、
効率的に抗体価を上昇させることができ、しかも投与が
簡便であり、注射による苦痛や、経口投与による抗原の
消化劣化の問題を解消できる。また、ワクチン中に界面
活性剤、胆汁酸または塩、コレラトキシンＢを配合する
ことにより、抗原に対する抗体価増強作用が得られる。According to the present invention, P. g. , A. v. ，
P. i. , A. a. , T. d. , W. r. , B. f. By administering the bacterial cell surface substance antigen from the nasal mucosa,
The antibody titer can be efficiently increased, the administration is simple, and the problems of injection pain and digestive deterioration of the antigen by oral administration can be solved. Further, by adding a surfactant, bile acid or salt, and cholera toxin B to the vaccine, an antibody titer-enhancing action against the antigen can be obtained.

【００２６】[0026]

【実施例】【Example】

実施例１：プレボテラ・インターメデア（Ｐ．ｉ．）の
線毛抗原の調製 プレボテラ・インターメデア ＡＴＣＣ ２５６１１を
トリプティケースペプトン、ファイトンペプトンおよび
イーストエクストラクトの透析外液にＬ−アスパラギ
ン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、燐酸水素二
カリウム、塩化ナトリウム、グルコース、ヘミンおよび
メナジオンを加えた液体培地で２日間培養した。その
後、１２，０００ｇ、１５分間の遠心で集菌、洗浄後、
蒸留水中でガラスビーズと共に２日間ゆるやかに撹拌
し、Ｎｏ．２５の注射針（０．５×２５ｍｍ）に３回通
し、菌体より線毛を分断した。次いで、１２，０００
ｇ、１５分間の遠心で菌体と上清に有る線毛を分離し、
上清を蒸留水で透析後、凍結乾燥を行ない、Ｐ．ｉ．線
毛抗原とした。収量は、菌体湿重量に対して０．５％で
あった。Example 1 Preparation of Prevotella intermedea (Pi) Fimbria Antigen Prevotella intermedea ATCC 25611 was added to trypticase peptone, phyton peptone, and yeast extract as L-asparagine, L-dialysis external solution. It was cultured for 2 days in a liquid medium containing tryptophan, L-cysteine, dipotassium hydrogen phosphate, sodium chloride, glucose, hemin and menadione. Then, collect the cells by centrifugation at 12,000g for 15 minutes, wash,
Gently stir for 2 days with glass beads in distilled water, The fimbriae were separated from the bacterial cells by passing through a 25-injection needle (0.5 × 25 mm) three times. Then 12,000
g, centrifugation for 15 minutes to separate bacterial cells and pili in the supernatant,
The supernatant was dialyzed against distilled water, freeze-dried, and then P. i. It was used as a pili antigen. The yield was 0.5% based on the wet weight of the cells.

【００２７】実施例２：経鼻免疫実験 ２週令のＢＡＬＢ／ｃマウス各群６匹を、上記のように
調製したＰ．ｉ．線毛、あるいはさらに後記濃度の界面
活性剤、コレラトキシンＢ、胆汁酸（塩）を含む混合溶
液２０μｌで免疫し、さらに２週間ごとに２次、３次免
疫を行なった。その後１週間して血液、唾液を採取し、
血清および唾液中の抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定した。
また、トリプシン部分処理したＰ．ｉ．線毛抗原を用い
実験も行なった。トリプシン処理は、精製した抗原をｐ
Ｈ７．０の緩衝液中に溶解し、トリプシンで３７℃、５
時間加水分解を行なった後、ゲル濾過によりトリプシン
と抗原部分分解物を分離、採取した。Example 2 Nasal Immunization Experiment Two 6-week-old BALB / c mice, each group containing 6 mice, were prepared as described above. i. Immunization was carried out with pili or 20 μl of a mixed solution containing a surfactant, cholera toxin B, and bile acid (salt) at the concentrations described below, and secondary and tertiary immunizations were performed every two weeks. One week after that, blood and saliva were collected,
The antibody titer in serum and saliva was measured by the ELISA method.
In addition, P. i. Experiments were also performed using pili antigens. The trypsin treatment was performed by purifying the purified antigen with p
Dissolve in H7.0 buffer and trypsin at 37 ° C for 5
After hydrolyzing for a period of time, trypsin and a partially decomposed product of the antigen were separated and collected by gel filtration.

【００２８】ＥＬＩＳＡ法による測定は以下のようにし
て行なった。すなわち、３０μｇ／ｍｌのＰ．ｉ．菌線
毛抗原を添加しコートした９６穴プレートに希釈した血
清または唾液を添加し洗浄した。次いで、アルカリフォ
スファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ａ＋Ｍ）抗体
を添加洗浄後、ｐ−ニトロフェニルリン酸２ナトリウム
を加え、９０分後４０５ｎｍで吸光度を測定した。The measurement by the ELISA method was performed as follows. That is, 30 μg / ml of P. i. The diluted serum or saliva was added to the 96-well plate coated with the pilus antigen and washed. Then, after alkaline phosphatase-labeled goat anti-mouse Ig (G + A + M) antibody was added and washed, p-nitrophenyl phosphate disodium was added, and 90 minutes later, the absorbance was measured at 405 nm.

【００２９】各成分の濃度（投与量２０μｌ） Ｐ．ｉ．線毛：２０μｇ／ｍｌ トリプシン部分処理したＰ．ｉ．線毛：２０μｇ／ｍｌ コレラトキシンＢ：１０μｇ／ｍｌ グリココール酸ナトリウム（胆汁酸塩）：０．３％ 塩化ベンゼトニウム（カチオン界面活性剤）：０．２％Concentration of each component (dosage 20 μl) P. i. Pili: 20 μg / ml Trypsin partially treated P. i. Pili: 20 μg / ml Cholera toxin B: 10 μg / ml Sodium glycocholate (bile salt): 0.3% Benzethonium chloride (cationic surfactant): 0.2%

【００３０】 実験群 投 与 内 容 １ Ｐ．ｉ．線毛 ２ Ｐ．ｉ．線毛＋コレラトキシンＢ ３ Ｐ．ｉ．線毛＋塩化ベンゼトニウム ４ Ｐ．ｉ．線毛＋グリココール酸ナトリウム ５ Ｐ．ｉ．線毛＋コレラトキシンＢ＋グリココール酸ナトリウム ６ Ｐ．ｉ．線毛（トリプシン処理） ７ コントロール（生理食塩水） Experimental group administration contents 1 P. i. Pili 2 P. i. Pili + cholera toxin B 3 P. i. Pili + benzethonium chloride 4 P.I. i. Pili + sodium glycocholate 5 P.I. i. Pili + cholera toxin B + sodium glycocholate 6 P.I. i. Pili (trypsin treatment) 7 control (saline solution)

【００３１】[0031]

【表１】 表１：Ｐ．ｉ．線毛抗原の実験結果（抗体価；各希釈倍率によるＥＬＩＳＡ法 によるＯＤ値） 血清(1/100000希釈) 唾液(1/500希釈) 実験群 免 疫 前 免 疫 後 免 疫 前 免 疫 後 １群 0.05 0.45 0.14 0.51 ２群 0.06 1.23 0.18 1.28 ３群 0.05 0.97 0.20 1.05 ４群 0.07 1.10 0.17 1.22 ５群 0.06 1.52 0.18 1.83 ６群 0.06 0.60 0.18 0.76 ７群 0.08 0.09 0.16 0.21 Table 1: Table 1: P. i. Pili antigen experiments (antibody titer; OD value by ELISA method using the respective dilution) serum (1/100000 dilution) Saliva (1/500 dilution) experimental group immunity before immunity after immunity before immunity after one group 0.05 0.45 0.14 0.51 2 groups 0.06 1.23 0.18 1.28 3 groups 0.05 0.97 0.20 1.05 4 groups 0.07 1.10 0.17 1.22 5 groups 0.06 1.52 0.18 1.83 6 groups 0.06 0.60 0.18 0.76 7 groups 0.08 0.09 0.16 0.21

【００３２】本発明に従い、Ｐ．ｉ．線毛を鼻粘膜に投
与すると、血清、唾液中の抗体価を増強することができ
る。特に、カチオン界面活性剤、胆汁酸塩、コレラトキ
シンＢを点鼻用Ｐ．ｉ．線毛ワクチン製剤に配合する
と、鼻粘膜を通じてＰ．ｉ．線毛（抗原）は効率良く生
体内に吸収され、Ｐ．ｉ．線毛単独投与に比べて著しく
血清、唾液中の抗体価を増強することができた。In accordance with the present invention, P. i. Administration of fimbriae to the nasal mucosa can enhance the antibody titer in serum and saliva. In particular, cationic surfactants, bile salts, and cholera toxin B are used for nasal administration. i. When added to the pili vaccine formulation, P. i. Pili (antigen) are efficiently absorbed in the living body, and P. i. The antibody titer in serum and saliva could be markedly increased as compared to administration of pili alone.

【００３３】実施例２ Ｐ．ｉ．に代えて、ポルフィロモナス・ジンジバリス
（Ｐ．ｇ．）を用いた他は、実施例１と同様の実験を繰
り返した。各群の投与内容および実験結果は以下に示
す。なお、実験群６では、トリプシンに代えてククミシ
ンにより部分分解処理した。Example 2 P. i. Instead of, Porphyromonas gingivalis (P.g.) was used, and the same experiment as in Example 1 was repeated. The administration details and experimental results of each group are shown below. In addition, in the experimental group 6, partial decomposition treatment was performed using kumumicin instead of trypsin.

【００３４】 実験群 投 与 内 容 １ Ｐ．ｇ．線毛 ２ Ｐ．ｇ．線毛＋コレラトキシンＢ ３ Ｐ．ｇ．線毛＋塩化ベンザルコニウム ４ Ｐ．ｇ．線毛＋コール酸 ５ Ｐ．ｇ．線毛＋コレラトキシンＢ＋コール酸 ６ Ｐ．ｇ．線毛（ククミシン処理） ７ コントロール（生理食塩水） Experimental group administration contents 1 P. g. Pili 2 P. g. Pili + cholera toxin B 3 P. g. Pili + benzalkonium chloride 4 P.I. g. Pili + Cholic acid 5 P. g. Pili + cholera toxin B + cholic acid 6 P.I. g. Pili (cucumicin treatment) 7 control (saline)

【００３５】[0035]

【表２】 表２：Ｐ．ｇ．線毛抗原の実験結果（抗体価；各希釈倍率によるＥＬＩＳＡ法 によるＯＤ値） 血清(1/100000希釈) 唾液(1/500希釈) 実験群 免 疫 前 免 疫 後 免 疫 前 免 疫 後 １群 0.05 0.54 0.15 0.61 ２群 0.07 1.26 0.17 1.21 ３群 0.04 1.02 0.14 1.05 ４群 0.05 1.43 0.19 1.38 ５群 0.04 1.71 0.15 1.68 ６群 0.06 0.67 0.16 0.77 ７群 0.06 0.08 0.20 0.21 Table 2: Table 2: P. g. Pili antigen experiments (antibody titer; OD value by ELISA method using the respective dilution) serum (1/100000 dilution) Saliva (1/500 dilution) experimental group immunity before immunity after immunity before immunity after one group 0.05 0.54 0.15 0.61 2 groups 0.07 1.26 0.17 1.21 3 groups 0.04 1.02 0.14 1.05 4 groups 0.05 1.43 0.19 1.38 5 groups 0.04 1.71 0.15 1.68 6 groups 0.06 0.67 0.16 0.77 7 groups 0.06 0.08 0.20 0.21

【００３６】実施例３ Ｐ．ｉ．に代えて、アクチノマイセス・ビスコーサス
（Ａ．ｖ．）を用いた他は、実施例１と同様の実験を繰
り返した。各群の投与内容および実験結果は以下に示
す。Example 3 P. i. Instead of, Actinomyces viscosus (Av.) Was used, and the same experiment as in Example 1 was repeated. The administration details and experimental results of each group are shown below.

【００３７】 実験群 投 与 内 容 １ Ａ．ｖ．線毛 ２ Ａ．ｖ．線毛＋コレラトキシンＢ ３ Ａ．ｖ．線毛＋クロルヘキシジン塩酸塩 ４ Ａ．ｖ．線毛＋グリココール酸ナトリウム ５ Ａ．ｖ．線毛＋コレラトキシンＢ＋グリココール酸ナトリウム ６ Ａ．ｖ．線毛（トリプシン処理） ７ コントロール（生理食塩水） Experimental group administration contents 1 A. v. Pili 2 A. v. Pili + Cholera toxin B 3 A. v. Pili + chlorhexidine hydrochloride 4 A. v. Pili + sodium glycocholate 5 A. v. Pili + cholera toxin B + sodium glycocholate 6 A. v. Pili (trypsin treatment) 7 control (saline solution)

【００３８】[0038]

【表３】 表３：Ａ．ｖ．線毛抗原の実験結果（抗体価；各希釈倍率によるＥＬＩＳＡ法 によるＯＤ値） 血清(1/100000希釈) 唾液(1/500希釈) 実験群 免 疫 前 免 疫 後 免 疫 前 免 疫 後 １群 0.06 0.41 0.17 0.53 ２群 0.04 1.20 0.18 1.35 ３群 0.05 0.85 0.16 1.03 ４群 0.06 1.12 0.19 1.31 ５群 0.05 1.62 0.20 1.85 ６群 0.04 0.54 0.18 0.65 ７群 0.05 0.06 0.16 0.18 Table 3: Table 3: A. v. Pili antigen experiments (antibody titer; OD value by ELISA method using the respective dilution) serum (1/100000 dilution) Saliva (1/500 dilution) experimental group immunity before immunity after immunity before immunity after one group 0.06 0.41 0.17 0.53 2 groups 0.04 1.20 0.18 1.35 3 groups 0.05 0.85 0.16 1.03 4 groups 0.06 1.12 0.19 1.31 5 groups 0.05 1.62 0.20 1.85 6 groups 0.04 0.54 0.18 0.65 7 groups 0.05 0.06 0.16 0.18

【００３９】以下の処方の各ワクチン製剤を調製した。 実施例４ 塩化ベンゼトニウム 0.1 g グリセリン 0.8 g ヒドロキシエチルセルロース 0.8 g Ｐ．ｉ．線毛 0.01g 精製水 残量 100 gEach vaccine formulation having the following formulation was prepared. Example 4 Benzethonium chloride 0.1 g Glycerin 0.8 g Hydroxyethyl cellulose 0.8 g P.I. i. Pili 0.01g Purified water 100g remaining

【００４０】実施例５ グリセリン脂肪酸エステル 0.8 g ソルビット 0.6 g メチルセルロース 0.6 g Ａ．ｖ．菌表層抗原 0.02g 塩化ベンザルコニウム 0.05g 精製水 残量 100 gExample 5 Glycerin fatty acid ester 0.8 g sorbit 0.6 g methylcellulose 0.6 g A. v. Bacterial surface antigen 0.02 g Benzalkonium chloride 0.05 g Purified water Remaining amount 100 g

【００４１】実施例６ 塩化ベンゼトニウム 0.1 g ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 0.8 g キシリット 0.5 g ヒドロキシメチルセルロース 0.8 g Ａ．ａ．菌表層抗原 0.01g 安息香酸 0.1 g ミョウバン 0.02g 精製水 残量 100 gExample 6 Benzethonium chloride 0.1 g Polyoxyethylene hydrogenated castor oil 0.8 g Xylit 0.5 g Hydroxymethylcellulose 0.8 g A. a. Bacterial surface antigen 0.01 g Benzoic acid 0.1 g Alum 0.02 g Purified water Remaining amount 100 g

【００４２】実施例７ 塩化セチルピリジニウム 1.5 g ソルビット 0.7 g アラビアゴム 0.3 g Ｐ．ｇ．菌表層抗原 0.05g ムラミルジペプチド 0.05g 精製水 残量 100 gExample 7 Cetylpyridinium chloride 1.5 g Solbit 0.7 g Arabic gum 0.3 g P. g. Bacterial surface antigen 0.05 g Muramyl dipeptide 0.05 g Purified water Remaining amount 100 g

【００４３】実施例８ クロルヘキシジングルコネイト 0.1 g ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル 0.5 g グリセリン 0.8 g ヒドロキシエチルセルロース 0.5 g Ｗ．ｒ．菌表層抗原 0.08g コレラトキシンＢ 0.08g 水酸化アルミニウム 0.1 g 精製水 残量 100 gExample 8 Chlorhexidine gluconate 0.1 g Polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester 0.5 g Glycerin 0.8 g Hydroxyethyl cellulose 0.5 g W. r. Bacterial surface antigen 0.08g Cholera toxin B 0.08g Aluminum hydroxide 0.1 g Purified water Remaining amount 100 g

【００４４】実施例９ グリセリン 0.8 g Ｂ．ｆ．菌表層抗原 0.08g ブチルパラベンンＨＣｌ 0.1 g グリココール酸Ｎａ 0.1 g ステアリン酸 0.05g ミョウバン 0.1 g 精製水 残量 100 gExample 9 Glycerin 0.8 g B.I. f. Bacterial surface antigen 0.08 g Butylparaben HCl 0.1 g Glycocholate Na 0.1 g Stearic acid 0.05 g Alum 0.1 g Purified water Remaining amount 100 g

【００４５】実施例１０ ソルビット 2.0 g Ｔ．ｄ．菌表層抗原 0.05g ブチルパラベンンＨＣｌ 0.1 g コール酸 0.2 g ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エーテル 1.0 g 精製水 残量 100 gExample 10 Solbit 2.0 g T.I. d. Bacterial surface antigen 0.05 g Butylparaben HCl 0.1 g Cholic acid 0.2 g Polyoxyethylene sorbitan fatty acid ether 1.0 g Purified water Remaining amount 100 g

【００４６】実施例１１ グリセリン 2.0 g Ｐ．ｉ．菌表層抗原 0.08g グリココール酸Ｎａ 0.1 g コレラトキシンＢ 0.04g 精製水 残量 100 gExample 11 Glycerin 2.0 g P. i. Bacterial surface antigen 0.08 g Na glycocholate 0.1 g Cholera toxin B 0.04 g Purified water Remaining amount 100 g

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ポルフィロモナス・ジンジバリス、アク
チノマイセス・ビスコーサス、プレボテーラ・インター
メデア、アクチノバチラス・アクチノミセタンコミタン
ス、トリポネーマ・デンチコーラ、ウォリネラ・レクタ
またはバクテロイデス・フォーサイサスの菌体表層物質
を抗原として含み、鼻腔内に投与されることを特徴とす
る点鼻用歯周病予防ワクチン。1. A cell surface substance of Porphyromonas gingivalis, Actinomyces viscosus, Prevotella intermedea, Actinobacillus actinomycetan commititans, Tryponema denticola, Wallinella lecta or Bacteroides forsysus as an antigen. A preventive periodontal disease vaccine for nasal drop, which is characterized in that it is administered intranasally. 【請求項２】 さらに、界面活性剤、胆汁酸またはその
塩およびコレラトキシンＢの少なくとも１種を配合した
請求項１に記載の点鼻用歯周病予防ワクチン。2. The nasal periodontal disease preventive vaccine according to claim 1, further comprising at least one selected from a surfactant, a bile acid or a salt thereof, and cholera toxin B.