JPH05130877A - Transformation of plant - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To produce a transformant plant not containing a heteroorganism- derived DNA. CONSTITUTION:Transformation of a plant is carried out by abundantly purifying only a plant-derived promoter, a structural gene and a terminator fragment and using the direct introduction method not requiring a vector, e.g. electroporation method or microprojection method. Since only amplified plant- derived genes are introduced in the resultant transformant plant, there is no danger of N production of a heteroorganism-derived unknown gene product. By this method, relaxation of the regulation as a recombinant is possible and image down as a gene-recombinant food can be remarkably prevented.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は植物を形質転換する方法
に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a method for transforming plants.

【０００２】[0002]

【従来の技術】従来、植物を形質転換する方法として
は、目的遺伝子を大腸菌内で複製可能なプラスミドにク
ローニングし、これを土壌細菌アグロバクテリウムの感
染機構を利用して植物細胞に導入する方法、電気刺激や
ポリエチレングリコール等の化学薬品を利用してプロト
プラストへ導入する方法、マイクロインジェクション法
などにより植物に導入する方法等がある。これまでの方
法ではたとえ植物由来の遺伝子を導入する場合でも目的
とする遺伝子の他にベクター上に存在する微生物由来の
遺伝子の一部または全部も導入される。大腸菌や酵母で
は同種生物由来の遺伝子だけを導入するセルフクローニ
ングが可能であるが、植物は固有のベクターを持たない
ため植物以外の生物の遺伝子を含まない形質転換体を作
出した例はなく、また、従来の技術では困難であった。
これまでの研究でこれらのベクター上の微生物の遺伝子
が植物体中で発現したり、植物の生育を阻害したり、な
んらかの形で有害物質を作り出したりした例は報告され
ておらず、その危険性はほとんどないと考えられる。2. Description of the Related Art Conventionally, as a method for transforming a plant, a gene of interest is cloned into a plasmid which can be replicated in Escherichia coli and introduced into a plant cell by utilizing the infection mechanism of the soil bacterium Agrobacterium. , A method of introducing into protoplasts using chemical agents such as electrical stimulation and polyethylene glycol, a method of introducing into plants by a microinjection method, and the like. In the conventional methods, even when a plant-derived gene is introduced, a part or all of the microorganism-derived gene present on the vector is introduced in addition to the target gene. In Escherichia coli and yeast, self-cloning that introduces only genes derived from the same species is possible, but since plants do not have a unique vector, there are no examples of transformants that do not contain genes of organisms other than plants. , It was difficult with the conventional technology.
Previous studies have not reported any cases where the microbial genes on these vectors were expressed in plants, inhibited the growth of plants, or produced harmful substances in some way. Is thought to be rare.

【０００３】しかしながら、ベクター上に存在する本来
ならば植物では働かない微生物の遺伝子、例えば抗生物
質耐性遺伝子がそれが導入された位置に存在する植物の
プロモーターにより転写され、異種タンパクが生産され
る可能性もわずかではあるが存在する。その場合これら
のタンパク質が毒性を有する可能性や収穫物の品質を低
下させる可能性がある。また、従来の方法で作出された
形質転換植物は組換え体として規制を受けている。将来
に於て規制が撤廃された場合でも植物以外の生物の遺伝
子を含む植物は商品としては消費者にマイナスイメージ
を与えかねない。However, it is possible to produce a heterologous protein by transcribing a microbial gene existing on the vector, which normally does not work in plants, such as an antibiotic resistance gene, by the plant promoter existing at the position where it is introduced. There is a slight sex, but it exists. In that case, these proteins may be toxic or reduce the quality of the crop. In addition, transformed plants produced by conventional methods are regulated as recombinants. Even if regulations are removed in the future, plants containing genes of organisms other than plants may give consumers a negative image as a product.

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は植物に
由来する遺伝子のみを導入した安全で消費者に受け入れ
られ易い形質転換植物を作出する方法の提供である。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a method for producing a safe and consumer-accepted transformed plant into which only a plant-derived gene has been introduced.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】本発明者はエレクトロポ
レーション法やポリエチレングリコール等によるプロト
プラストへの直接的な遺伝子導入法では遺伝子を植物細
胞に運ぶためのベクターが必要ないことに着目し、増幅
した植物由来の遺伝子のみを植物に導入する事を試み
た。その結果、植物以外の生物の遺伝子を含まない形質
転換植物を作出できることを見いだし本発明を完成し
た。Means for Solving the Problems The present inventor focused on the fact that a vector for carrying a gene to a plant cell is not required in the electroporation method or the direct gene transfer method into a protoplast by polyethylene glycol or the like, and amplification is performed. Attempts were made to introduce only genes derived from the above plants into the plants. As a result, they have found that it is possible to produce a transformed plant that does not contain the genes of organisms other than plants, and completed the present invention.

【０００６】すなわち、本発明は植物由来のプロモータ
ー、構造遺伝子およびターミネーターで構成され、かつ
植物以外の生物由来の塩基配列を含まない遺伝子を用い
た植物の形質転換方法である。That is, the present invention is a method for transforming a plant using a gene which is composed of a plant-derived promoter, a structural gene and a terminator and does not contain a nucleotide sequence derived from an organism other than the plant.

【０００７】本発明で用いる植物由来のプロモーターと
しては、例えばイネのワキシー遺伝子、グルテリン遺伝
子やクロロフィル結合性タンパク質遺伝子のプロモータ
ー等がある。また、ターミネーターとしてはそれらの遺
伝子のターミネーター等がある。構造遺伝子としては単
離されている植物の遺伝子はすべて本発明に使用でき、
例えばイネのワキシー遺伝子、グルテリン遺伝子、リポ
キシゲナーゼ遺伝子等がある。Examples of plant-derived promoters used in the present invention include promoters of rice waxy gene, glutelin gene and chlorophyll-binding protein gene. The terminator includes terminators of those genes. All plant genes that have been isolated as structural genes can be used in the present invention,
Examples include the rice waxy gene, glutelin gene, and lipoxygenase gene.

【０００８】本発明で導入する遺伝子の調製方法は特に
制限はないが、例えば次のような方法がある。 （１）常法によりプラスミド、λファージまたはコスミ
ド等に目的とする遺伝子をクローニングする。これらを
常法により大量に精製し、適当な制限酵素により目的の
遺伝子部分を切り出し、カラムクロマトグラフィーや密
度勾配遠心法を用いて目的とする遺伝子断片をのみを精
製する。 （２）（１）でクローニングした遺伝子の上流と下流の
配列をプライマーとしてＰＣＲ法により植物由来の目的
遺伝子部分のみを増殖する。 （３）ある植物の塩基配列が既知の遺伝子をそのまま別
の植物に導入したい場合は目的遺伝子を持つ植物から抽
出したＤＮＡを鋳型とし、その遺伝子の上流と下流の配
列をプライマーとしたＰＣＲにより大腸菌等での組換え
操作を経ずに直接増殖することができる。The method for preparing the gene to be introduced in the present invention is not particularly limited, but for example, there are the following methods. (1) The desired gene is cloned into a plasmid, λ phage, cosmid or the like by a conventional method. These are purified in a large amount by a conventional method, the desired gene portion is cut out with an appropriate restriction enzyme, and only the desired gene fragment is purified by using column chromatography or density gradient centrifugation. (2) Using the upstream and downstream sequences of the gene cloned in (1) as primers, only the plant-derived target gene portion is propagated by the PCR method. (3) When it is desired to introduce a gene whose base sequence is already known to another plant as it is, Escherichia coli is obtained by PCR using the DNA extracted from the plant having the target gene as a template and the upstream and downstream sequences of the gene as primers. It can be directly propagated without a recombination operation such as.

【０００９】こうして得られた植物由来遺伝子のみをキ
ャリアーＤＮＡや選抜マーカー遺伝子を使わずに植物細
胞に導入する。形質転換された細胞のスクリーニングは
細胞から抽出したＤＮＡを鋳型とし、導入遺伝子の両端
の配列をプライマーとしたＰＣＲ法により予想される大
きさの断片が増幅されるかどうかを調べることにより行
なう。次に目的遺伝子を持つ細胞から植物体を再分化さ
せ、目的の形質の発現を調べる本発明で利用する形質転
換方法は通常利用されているエレクトロポレーション
法、ポリエチレングリコール法、マイクロインジェクシ
ョン法、マイクロプロジェクタイル法の他、ベクターを
必要としない公知のどの方法でもよい。Only the plant-derived gene thus obtained is introduced into plant cells without using carrier DNA or a selectable marker gene. Screening of transformed cells is carried out by examining whether or not a fragment of the expected size is amplified by the PCR method using the DNA extracted from the cells as a template and the sequences at both ends of the transgene as primers. Next, the transformation method used in the present invention for redifferentiating the plant body from the cells having the target gene and examining the expression of the target trait is the commonly used electroporation method, polyethylene glycol method, microinjection method, microinjection method. In addition to the projectile method, any known method that does not require a vector may be used.

【００１０】[0010]

【実施例】以下、実施例で本発明を詳細に説明する。 実施例１ イネのワキシー遺伝子（Wangら, Nucleic Acids Reseac
h, 18:5898 (1990))制限酵素ScaI,BglIIで切断しターミ
ネーター部位を含む約0.67kbの断片を取り出した。これ
をDNA Blunting Kit（宝酒造）で処理し、プラスミドｐ
ＵＣ１９のHincII site に常法によりサブクローニング
した。次にこのプラスミドのKpnI siteにＰＣＲ法で増
幅したイネのグルテリン遺伝子（Takaiwaら、FEBS Lett
ers 221:43 (1987)）のプロモーター（転写開始点から
数えて-872から+61 までの約0.93kb）を常法によりサブ
クローニングした。また、同様にしてグルテリン遺伝子
のプロモーターの代わりにＰＣＲ法で増幅したイネワキ
シー遺伝子（Wangら、Nucleic Acids Research 18:5898
(1990)）のプロモーター（ＡＴＧから上流の1211bp）
を結合した。これら２種のプラスミドのそれぞれのSmaI
site にＰＣＲ法で増幅したイネワキシー遺伝子の一部
である約1.1kb のR12(Shimada とTada, Gene98:243(199
1) ）をアンチセンスの方向でサブクローニングした
（それぞれ図１のpGWA1 と図２のpWWA1 ）。これらのプ
ラスミドを導入したイネではグルテリン遺伝子またはワ
キシー遺伝子のプロモーターによりワキシー遺伝子のア
ンチセンスＲＮＡが転写され、ワキシー遺伝子の発現が
抑制されアミロース含量が抑えられることが期待され
る。これらのプラスミドにサブクローニングされたプロ
モーター、構造遺伝子、ターミネーターはすべて植物由
来である。EXAMPLES The present invention will be described in detail below with reference to examples. Example 1 Rice waxy gene (Wang et al., Nucleic Acids Reseac
h, 18: 5898 (1990)) It was cleaved with restriction enzymes ScaI and BglII, and a fragment of about 0.67 kb containing a terminator site was extracted. This was treated with DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) and the plasmid p
It was subcloned into HincII site of UC19 by a conventional method. Next, the rice glutelin gene (Takaiwa et al., FEBS Lett) amplified by PCR was added to the KpnI site of this plasmid.
ers 221: 43 (1987)) promoter (about 0.93 kb from −872 to +61 counting from the transcription start point) was subcloned by a conventional method. Similarly, instead of the promoter of the glutelin gene, the rice waxy gene amplified by the PCR method (Wang et al., Nucleic Acids Research 18: 5898
(1990)) promoter (1211 bp upstream from ATG)
Combined. SmaI of each of these two plasmids
About 1.1 kb of R12 (Shimada and Tada, Gene98: 243 (199) which is a part of rice waxy gene amplified by PCR method at the site.
1)) was subcloned in the antisense direction (pGWA1 in FIG. 1 and pWWA1 in FIG. 2, respectively). In rice into which these plasmids have been introduced, it is expected that the antisense RNA of the waxy gene is transcribed by the promoter of the glutelin gene or the waxy gene, the expression of the waxy gene is suppressed, and the amylose content is suppressed. The promoters, structural genes, and terminators subcloned into these plasmids are all plant-derived.

【００１１】また、これらの植物由来の遺伝子のみを増
幅するためのプライマーとしてワキシー遺伝子のATG か
ら3820番目と3841番目の間の22塩基に相補的な塩基配列
（プライマー１）、-1196 番目と-1208 番目の間の12塩
基（プライマー３）、グルテリン遺伝子のATG から-848
番目と-872番目の間の25塩基（プライマー２）を合成し
た。Further, as a primer for amplifying only these plant-derived genes, a nucleotide sequence (primer 1) complementary to 22 nucleotides between the 3820th position and the 3841st position from ATG of the waxy gene (primer 1), -1196th position and- 12 bases between the 1208th position (primer 3), from the ATG of the glutelin gene to -848
25 bases (primer 2) between the 8th position and the -872nd position were synthesized.

【００１２】PGWA1 の植物由来のプロモーター、構造遺
伝子の一部およびターミネーターで構成された塩基配列
（約2.7kb ）をプライマー１およびプライマー２を用い
てＰＣＲ法で増幅した。増幅した遺伝子をエレクトロポ
レーション法（Tadaら、Theor. Appl.Genet. 80:475 (1
990)）でイネプロトプラストに導入した。その後、増殖
してきたカルス200 個から常法によりＤＮＡを抽出し、
プライマー１およびプライマー２を用いてＰＣＲを行な
ったところ３つのカルスで予想される約2.7kbのＤＮＡ
が増幅したためこれらのカルスは導入した遺伝子を持つ
と判断された。これらのカルスから植物体を再生させ
た。これら３種の植物からＤＮＡを抽出し制限酵素EcoR
I で切断した後、ワキシー遺伝子の一部または、プラス
ミドpUC19をプローブとしてサザン解析を行なった。そ
の結果、ワキシー遺伝子をプローブとした場合は約6kb
の内生のワキシー遺伝子に対応するバンドと導入された
遺伝子と考えられるいくつかのサイズの異なるバンドが
認められた。それに対し、pUC19 をプローブとした場合
はハイブリダイズするバンドは検出されなかった。A nucleotide sequence (about 2.7 kb) composed of a PGWA1 plant-derived promoter, a part of a structural gene and a terminator was amplified by PCR using Primer 1 and Primer 2. The amplified gene was electroporated (Tada et al., Theor. Appl. Genet. 80: 475 (1
990)) and introduced into rice protoplasts. Then, DNA was extracted from 200 proliferated callus by a conventional method,
When PCR was performed using Primer 1 and Primer 2, a DNA of about 2.7 kb expected in 3 callus was obtained.
It was judged that these callus had the introduced gene because of the amplification of P. Plants were regenerated from these calli. DNA was extracted from these three plants and the restriction enzyme EcoR
After cutting with I, Southern analysis was performed using a part of the waxy gene or the plasmid pUC19 as a probe. As a result, when the waxy gene was used as a probe, it was approximately 6 kb.
A band corresponding to the endogenous waxy gene of Escherichia coli and several bands of different sizes considered to be the introduced gene were observed. On the other hand, when pUC19 was used as a probe, no hybridizing band was detected.

【００１３】同様にしてPWWA2 の植物由来塩基配列（約
3.0kb）をプライマー１とプライマー３を用いてＰＣＲ
法で増幅しイネプロトプラストに導入した。増殖してき
たカルス300 個から常法によりＤＮＡを抽出し、プライ
マー１およびプライマー３を用いてＰＣＲを行なったと
ころ１０のカルスで予想される約3.0kb のＤＮＡが増幅
したためこれらのカルスは導入した遺伝子を持つと判断
された。これらのカルスのうち６カルスから植物体が再
生した。これら６種の植物からＤＮＡを抽出し制限酵素
EcoRI で切断した後、ワキシー遺伝子の一部または、プ
ラスミドpUC19をプローブとしてサザン解析を行なっ
た。その結果、ワキシー遺伝子をプローブとした場合は
約6kb の内生のワキシー遺伝子に対応するバンドと導入
された遺伝子と考えられるいくつかのサイズの異なるバ
ンドが認められた。それに対し、pUC19 をプローブとし
た場合はハイブリダイズするバンドは検出されなかっ
た。Similarly, a plant-derived base sequence of PWWA2 (about
PCR using Primer 1 and Primer 3
It was amplified by the method and introduced into rice protoplasts. DNA was extracted from 300 proliferated callus by a conventional method, and PCR was performed using Primer 1 and Primer 3. As a result, about 3.0 kb of DNA expected in 10 callus was amplified. Was determined to have. Plants were regenerated from 6 of these calli. Extraction of DNA from these 6 plants
After cutting with EcoRI, Southern analysis was performed using a part of the waxy gene or the plasmid pUC19 as a probe. As a result, when the waxy gene was used as a probe, a band corresponding to the endogenous waxy gene of about 6 kb and several bands different in size considered to be the introduced gene were observed. On the other hand, when pUC19 was used as a probe, no hybridizing band was detected.

【００１４】これらのイネに結実した米のアミロース含
量は５〜１０％であった。元の品種である日本晴では通
常約２０％であることから導入した遺伝子が機能してい
ることが確認された。これらの結果から本方法により植
物由来の遺伝子だけで形質転換され、バクテリア等の遺
伝子を含まない植物を得ることが出来ることが確認され
た。The amylose content of these rice-bearing rice was 5 to 10%. It was confirmed that the introduced gene is functional since the original variety, Nihonbare, is usually about 20%. From these results, it was confirmed that by this method, it is possible to obtain a plant which is transformed with only a plant-derived gene and does not contain a gene such as bacteria.

【００１５】実施例２ イネグルテリン遺伝子をイネゲノムＤＮＡからＰＣＲ法
で直接増幅させるためのプライマーとしてグルテリン遺
伝子の転写開始点から-872番目と-857番目の間の16塩基
の５’側にさらに塩基としてAACCTTGGA を付加した25塩
基（プライマー４）を合成した。また、このプライマー
の５’側の15塩基を別に合成した（プライマー５）。ま
た、グルテリン遺伝子の2050番目から2069番目までの20
塩基の相補鎖を合成した（プライマー６）。Example 2 As a primer for directly amplifying the rice glutelin gene from rice genomic DNA by the PCR method, as a further base on the 5 ′ side of 16 bases between −872 and −857 from the transcription initiation point of the glutelin gene. 25 bases (primer 4) to which AACCTTGGA was added were synthesized. In addition, 15 bases on the 5'side of this primer were separately synthesized (primer 5). In addition, 20 from the 2050th to 2069th of the glutelin gene
A complementary strand of bases was synthesized (primer 6).

【００１６】イネの品種日本晴の葉から抽出した全ＤＮ
Ａを鋳型としてプライマー４とプライマー６を用いてＰ
ＣＲを行なったところ予想される約2.9kbpの断片が増幅
された。増幅した遺伝子をエレクトロポレーション法で
イネのプロトプラストに導入した。その後、増殖してき
たカルス300 個から常法によりＤＮＡを抽出し、プライ
マー５およびプライマー６を用いてＰＣＲを行なったと
ころ５つのカルスで予想される約2.9kb のＤＮＡが増幅
したためこれらのカルスは導入した遺伝子を持つと判断
された。これらのカルスのうち３カルスから植物体が再
生した。これら３種の植物からＤＮＡを抽出し制限酵素
EcoRIで切断した後、グルテリン遺伝子の一部をプロー
ブとしてサザン解析を行なった。その結果、約6.8, 4.
2, 2.8kbの内生のグルテリン遺伝子に対応するバンドと
導入された遺伝子と考えられるいくつかのサイズの異な
るバンドが認められた。この結果から本方法により植物
由来の遺伝子を微生物中での遺伝子操作を経ずに別の植
物に導入して形質転換された植物を得ることが出来るこ
とが確認された。Rice varieties All DN extracted from Nipponbare leaf
P using A and A as templates
When CR was performed, the expected fragment of about 2.9 kbp was amplified. The amplified gene was introduced into rice protoplasts by electroporation. After that, DNA was extracted from 300 proliferated callus by a conventional method, and PCR was performed using Primer 5 and Primer 6. As a result, about 2.9 kb of DNA expected in 5 callus was amplified, and thus these callus were introduced. Was determined to have the gene. Plants were regenerated from 3 of these calli. Extraction of DNA from these three plants
After cutting with EcoRI, Southern analysis was performed using a part of the glutelin gene as a probe. As a result, about 6.8, 4.
A band corresponding to the endogenous glutelin gene of 2,2.8 kb and several bands of different sizes considered to be the introduced gene were observed. From this result, it was confirmed that this method can obtain a transformed plant by introducing a plant-derived gene into another plant without genetic manipulation in a microorganism.

【００１７】[0017]

【発明の効果】従来は選抜マーカーを利用せずに形質転
換された細胞、植物を選抜することは困難であったが、
本発明によればポリメラーゼチェインリアクション（Ｐ
ＣＲ）法を使うことにより比較的容易に選抜が可能とな
った。また、ＰＣＲ法を利用してある植物のＤＮＡから
直接に目的遺伝子を大量に増殖し、別の植物に導入する
場合は組換え操作を必要としないため組換え体に対する
規制を受けない可能性が高い。植物の遺伝子のみを導入
する場合は前例がないため特別なガイドライン等が示さ
れていないが、本方法によって作出された形質転換体は
細胞融合等によって遺伝子を導入した場合と同様に植物
以外の生物の遺伝子を含まないため規制がゆるめられる
可能性がある。Although it has been difficult to select transformed cells and plants without using a selection marker,
According to the present invention, the polymerase chain reaction (P
Using the (CR) method, selection became relatively easy. Further, when a large amount of a target gene is directly propagated from DNA of a plant using the PCR method and introduced into another plant, there is a possibility that the recombinant is not regulated because no recombination operation is required. high. Since there is no precedent when introducing only plant genes, no special guidelines are given, but the transformants created by this method are similar to those when introducing genes by cell fusion etc. The regulation may be relaxed because it does not contain the gene.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】プラスミドｐＧＷＡ１の構造を表した図であ
る。FIG. 1 is a diagram showing the structure of plasmid pGWA1.

【図２】プラスミドｐＷＷＡ１の構造を表した図であ
る。FIG. 2 is a diagram showing the structure of plasmid pWWA1.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 植物由来のプロモーター、構造遺伝子お
よびターミネーターで構成され、かつ植物以外の生物由
来の塩基配列を含まない遺伝子を用いた植物の形質転換
方法。1. A method for transforming a plant using a gene that is composed of a plant-derived promoter, a structural gene and a terminator and does not contain a base sequence derived from an organism other than the plant.