JPH05130872A - Hybrid upperstream-activating sequence - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To constitute the subject sequence with synergistically enhanced activity in comparison with the original two sequences by complexing the upperstream activation sequence originating from Escherichia coli chromosome DNA and the upperstream activation sequence of yeast glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene. CONSTITUTION:The upperstream activation sequence(UAS) originating from Escherichia coli chromosome DNA and the UAS of yeast glycer-aldehyde 3-phosphate gene (TDH3) or UAS of yeast alcohol dehydrogenase gene (ADH2) are treated with a restriction enzyme, then combined with DNA polymerase, and they are kept at 37 deg.C for 1 hour. After completion of the reaction, the electrophoresis is carried out on 10% polyacrylamide gel 12 to cleave fragments, which are finely sliced and the supernatant is recovered after addition of buffer solutions, then ethanol is added thereto to form precipitation. The product is dried under reduced pressure to give the objective sequence of synergistically enhanced activity compared with the two original UASs.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【従来の技術】哺乳類をはじめとする高等真核生物にお
いて、ＲＮＡポリメラーゼIIにより転写される遺伝子の
プロモーターは、多くの異なる機能部位から成り立って
いる。それら機能配列を役割別に分類すると、大きく２
つに分けることが出来る。その一つは、効率良く、且つ
正確に転写が起こるために必要な領域で、ＴＡＴＡ配列
と転写開始点によって構成される。2. Description of the Related Art In higher eukaryotes such as mammals, the promoter of a gene transcribed by RNA polymerase II is composed of many different functional sites. The functional sequences are roughly classified into 2 according to their roles.
It can be divided into two. One of them is a region required for efficient and accurate transcription, and is composed of a TATA sequence and a transcription initiation point.

【０００２】もう一つの機能配列は、この転写開始領域
の近傍、ある場合には数kb離れた位置に存在し、転写開
始領域からの転写を制御する機能を持つ配列であり、一
般にはエンハンサーと呼ばれる転写を活性化する機能を
持つ領域に代表される。これらの機能配列の存在は、こ
れらの領域を欠失させた場合に、転写が正常に起らない
とによって示すことが出来る。[0002] Another functional sequence exists near this transcription initiation region, in some cases, at a position several kb away, and has a function of controlling transcription from the transcription initiation region. It is typified by a region called a transcription-activating function. The presence of these functional sequences can be indicated by the fact that transcription does not occur normally when these regions are deleted.

【０００３】出芽酵母サッカロマイセス・セレビシエ
の、ＲＮＡポリメラーゼIIにより転写される遺伝子のプ
ロモーターも、酵母以外の真核生物のプロモーター構造
と同様の構造を持っているが、細部において異なった特
徴を持つ。酵母以外のほとんどのプロモーターにおいて
は、ＴＡＴＡ配列と転写開始点との距離が25bpから30bp
と狭い範囲に収まっているのに対し、多くの酵母のプロ
モーターでは、ＴＡＴＡ配列は転写開始点の上流40bpか
ら120bpの間の広い範囲にわたって位置している。The promoter of the gene transcribed by RNA polymerase II of Saccharomyces cerevisiae in Saccharomyces cerevisiae has the same structure as the promoter structure of eukaryotes other than yeast, but has different characteristics in details. In most promoters except yeast, the distance between the TATA sequence and the transcription start point is 25 to 30 bp.
In many yeast promoters, the TATA sequence is located broadly between 40 bp and 120 bp upstream of the transcription start site.

【０００４】また酵母においてはエンハンサーに似た機
能を持つ配列として上流活性化配列（Upstream activat
ing sequences、以下UAS と略す）が存在することが、
多くの遺伝子で明らかになっている。ＵＡＳとＴＡＴＡ
配列との距離が遺伝子によってさまざまである（20bpか
ら1500bp）点は、他の生物の場合と同様であるが、エン
ハンサーの多くがその構造遺伝子の上流に位置しても、
下流に位置してもその機能を発揮するのに対し、ＵＡＳ
は転写開始点の下流に位置した場合には転写を活性化す
ることはないことが大きく異なる点である。In yeast, an upstream activating sequence (Upstream activat) is used as a sequence having a function similar to that of an enhancer.
ing sequences, hereinafter abbreviated as UAS)
It is revealed in many genes. UAS and TATA
Similar to other organisms, the distance from the sequence varies from gene to gene (20 bp to 1500 bp), but even if many enhancers are located upstream of the structural gene,
Even if it is located downstream, it will exert its function, whereas UAS
Is greatly different in that it does not activate transcription when it is located downstream of the transcription start point.

【０００５】これらの機能配列はそれぞれ独立した存在
であり、例えば異なる遺伝子のＵＡＳと転写開始領域を
組み合わせても機能する。そのため、異なる複数の遺伝
子のＵＡＳを組み合わせる、もしくは異なる遺伝子のＵ
ＡＳと転写開始領域とを組み合わせることにより、天然
のプロモーター以上の転写活性を持つプロモーターの開
発が期待できる。このような戦略でBitterとEganはＧＡ
Ｌ１遺伝子のＵＡＳをＴＤＨ３プロモーターと組み合わ
せることにより、ガラクトースで制御可能で且つＧＡＬ
１プロモーターよりも強力な転写活性を持つハイブリッ
ドプロモーターを作成した（Bitter＆Egan, Gene 69, p
193-207, 1988)。[0005] These functional sequences are independent of each other and, for example, function even if the UAS and transcription initiation region of different genes are combined. Therefore, combine UAS of different genes, or use UAS of different genes.
By combining AS and a transcription initiation region, it is expected to develop a promoter having a transcription activity higher than that of a natural promoter. With such a strategy, Bitter and Egan will be GA
By combining UAS of L1 gene with TDH3 promoter, galactose-regulatable and GAL
A hybrid promoter having a transcription activity stronger than that of one promoter was constructed (Bitter & Egan, Gene 69, p.
193-207, 1988).

【０００６】また同じような試みとして、アルコールデ
ヒドロゲナーゼIIの遺伝子（ADH2）のＵＡＳとＴＤＨ３
プロモーターの転写開始領域を組み合わせることにより
培地中の炭素源で制御可能でＡＤＨ２プロモーターより
も強力な転写活性を持つハイブリッドプロモーター、ま
たＰＨＯ５プロモーターのＵＡＳをＴＤＨ３プロモータ
ーの転写開始領域と組み合わせることにより培養液中の
リン酸の濃度によって制御可能でＰＨＯ５プロモーター
よりも強力な転写活性を持つハイブリッドプロモーター
の開発などが報告されている（Shuster,in Yeast Genet
ic Engineering, ed by Bar et al., Butterworths Pub
lishers, 1989)。In a similar attempt, UAS and TDH3 of the alcohol dehydrogenase II gene (ADH2) were also tested.
A hybrid promoter that can be controlled by the carbon source in the medium by combining the transcription initiation region of the promoter and has a stronger transcription activity than the ADH2 promoter, and by combining UAS of the PHO5 promoter with the transcription initiation region of the TDH3 promoter Has been reported to develop a hybrid promoter that can be regulated by the phosphate concentration in Escherichia coli and has a stronger transcriptional activity than the PHO5 promoter (Shuster, in Yeast Genet
ic Engineering, ed by Bar et al., Butterworths Pub
lishers, 1989).

【０００７】酵母における最も強い活性を持つ解糖系酵
素遺伝子のプロモーターについては、解糖系のＵＡＳに
存在するＤＮＡ結合因子であるＡＢＦ１やＧＲＦ２の結
合配列が、ＤＥＤ１遺伝子のＵＡＳに存在するPoly A-T
stretchと組み合わせた場合に相乗的な効果を示すこと
が知られており（Chasman et al,Genes ＆Dev.4,p503-5
14,1990,Buchman et al,Mol.Cell.Biol.10,p887-897,19
90) 、またＡＤＨ２遺伝子のＵＡＳの場合には２種類存
在するＵＡＳを組み合わせると活性が相乗的に上昇する
ことが知られている（Yu,J.et al,Mol.Cell.Biol.9,p34
-42,1989）。Regarding the promoter of the glycolytic enzyme gene having the strongest activity in yeast, Poly AT in which the binding sequences of ABF1 and GRF2, which are DNA binding factors present in glycolytic UAS, are present in UAS of DED1 gene
It is known to show a synergistic effect when combined with stretch (Chasman et al, Genes & Dev.4, p503-5
14, 1990, Buchman et al, Mol. Cell. Biol. 10, p887-897,19.
90), and in the case of UAS of ADH2 gene, it is known that the activity is synergistically increased when two types of UAS are combined (Yu, J. et al, Mol. Cell. Biol. 9, p34).
-42,1989).

【０００８】ところで、解糖系の酵素の遺伝子の転写は
ほとんどがＤＮＡ結合因子、ＲＡＰ１依存性であるが、
ＲＡＰ１に関してはGCTTCCA(またはGCATCCA)配列と組み
合わせた場合には転写促進活性が著しく上昇するという
ことが知られているのみで、ＲＡＰ１結合配列を含むＵ
ＡＳ、例えばＥＮＯ１あるいはＰＧＫ遺伝子のＵＡＳを
それぞれ直列に配置しても、相加的もしくは相乗的な活
性上昇はみられず(Uemura et al.,Gene 45,p67-75,198
6,Odgen et al.,Mol.Cell.Biol.6,p4335-4343,1986)、
上記のように上流制御配列を組み合わせることによっ
て、天然のプロモーター活性を凌駕するものが得られた
という報告はまだない。By the way, most of the transcription of genes of glycolytic enzymes is dependent on the DNA binding factor, RAP1,
Regarding RAP1, it is only known that the transcription promoting activity is remarkably increased when combined with the GCTTCCA (or GCATCCA) sequence, and a U containing the RAP1 binding sequence is included.
Even when AS, for example, ENO1 or UAS of PGK gene was arranged in tandem, no additive or synergistic increase in activity was observed (Uemura et al., Gene 45, p67-75, 198).
6, Odgen et al., Mol. Cell. Biol. 6, p4335-4343, 1986),
There has been no report yet that a combination of upstream regulatory sequences as described above resulted in a gene that surpasses the natural promoter activity.

【０００９】[0009]

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は複数の
異なるＵＡＳを組合わせることにより一層強力なＵＡＳ
配列を提供しようとするものである。SUMMARY OF THE INVENTION Therefore, the present invention provides a more powerful UAS by combining a plurality of different UASs.
It is intended to provide an array.

【００１０】[0010]

【課題を解決するための手段】上記のような結果は、組
み合せる配列を工夫することにより転写促進活性の上昇
を図ることが期待できることを示唆している。本発明者
達は、既に明らかになっているＵＡＳとは全く異なる制
御機構により機能するＵＡＳの作成を試み、ランダムに
切断した大腸菌染色体ＤＮＡ断片からＵＡＳ機能を持つ
断片を単離した。単離した配列はそれ自体が解糖系酵素
遺伝子のＵＡＳ機能に匹敵する活性を持ち、さらにホス
ホグリセレートキナーゼ(PGK）のＵＡＳと組み合わせた
場合に、相加的に機能を上昇させることが出来ることを
示した（特願平２−226566）。The above results suggest that it is expected that the transcription promoting activity can be increased by devising the sequences to be combined. The present inventors have attempted to create a UAS that functions by a completely different control mechanism from the UAS that has already been clarified, and isolated a fragment having a UAS function from a randomly cut Escherichia coli chromosomal DNA fragment. The isolated sequence itself has an activity comparable to the UAS function of the glycolytic enzyme gene, and when combined with UAS of phosphoglycerate kinase (PGK), the function can be additively increased. (Japanese Patent Application No. 2-226566).

【００１１】本発明は、ＵＡＳ機能を持つ大腸菌染色体
ＤＮＡ断片と解糖系遺伝子のＵＡＳの構成配列の一部、
または抑制、誘発型の酵素であるアルコールデヒドロゲ
ナーゼII遺伝子（ADH2）のＵＡＳとを組み合わせたハイ
ブリッドＵＡＳが、単独の機能を大きく上回る機能を持
つという知見に基き、高い機能を示すハイブリッドＵＡ
Ｓ、これらを用いたプロモーター、加えてこれらを用い
た酵母を宿主とする蛋白質発現ベクタープラスミドを提
供する。The present invention relates to an Escherichia coli chromosomal DNA fragment having a UAS function and a part of the UAS constituent sequence of a glycolytic gene,
Alternatively, a hybrid UA showing a high function based on the finding that a hybrid UAS in combination with UAS of alcohol dehydrogenase II gene (ADH2), which is an inhibitory or inducible enzyme, has a function far exceeding that of a single function.
S, a promoter using these, and a protein expression vector plasmid using these using yeast as a host.

【００１２】[0012]

【具体的な記載】解糖系酵素であるグリセロアルデヒド
−３−燐酸デヒドロゲナーゼ（以下GAPDH と略す）は酵
母菌体内で最も良く発現している酵素の一つであり、Ｔ
ＤＨ１，ＴＤＨ２，ＴＤＨ３の３ヶ所の遺伝子座にコー
ドされている。そのうち最も良く発現している遺伝子、
ＴＤＨ３のＵＡＳにはＲＡＰ１の結合配列があり、その
配列の有無がＵＡＳの機能発現に著しく影響を与えるこ
とが判った（特願平３−106600）。[Detailed description] Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (hereinafter abbreviated as GAPDH), which is a glycolytic enzyme, is one of the most highly expressed enzymes in yeast cells.
It is encoded by 3 loci of DH1, TDH2 and TDH3. The most highly expressed genes,
It was found that the UAS of TDH3 has a RAP1 binding sequence, and the presence or absence of that sequence significantly affects the functional expression of UAS (Japanese Patent Application No. 3-106600).

【００１３】特に注目すべき事は、ＴＤＨ３プロモータ
ーのＵＡＳ領域のうちでほとんどＲＡＰ１結合配列しか
含まないセグメントでもＴＡＴＡボックスを含むＴＤＨ
３プロモーターの下流側のセグメントと融合させた場
合、完全なＵＡＳ領域と同等の転写促進活性を示すこと
である。このＴＤＨ３プロモーターのＲＡＰ１結合配列
しか含まないセグメントは、少し活性は低いが、ＴＡＴ
Ａボックスを含むＡＤＨ１プロモーターの下流側の配列
と融合させた場合でも有意に高い転写活性を示すことも
証明されている。セントロメアプラスミドにこの融合配
列を組み込んで大腸菌のβ−ガラクトシダーゼの発現を
調べると、完全なＵＡＳ領域を含むＴＤＨ３プロモータ
ー配列により達成される発現レベルの約３分の１に達す
る発現を引き起こす。It should be noted that TDH containing a TATA box in a segment of the UAS region of the TDH3 promoter which contains almost only the RAP1 binding sequence.
When fused with a segment on the downstream side of the 3 promoter, it shows a transcription promoting activity equivalent to that of the complete UAS region. The segment containing only the RAP1 binding sequence of the TDH3 promoter has a slightly lower activity, but the TAT
It has also been proved that when it is fused with a sequence on the downstream side of the ADH1 promoter containing an A box, it shows a significantly high transcription activity. Incorporation of this fusion sequence into the centromere plasmid and examination of E. coli β-galactosidase expression results in approximately one-third the level of expression achieved by the TDH3 promoter sequence containing the complete UAS region.

【００１４】ところでＲＡＰ１の結合配列が強いＵＡＳ
活性を示すためには、一般にＲＡＰ１結合配列近傍にGC
TTCCA またはGCATCCA 配列が存在することが必要である
ことが示されている。つまりこれらの配列はＲＡＰ１の
転写促進機能を著しく増大させる配列であり、同様の機
能を持つ配列を含む断片を見いだすことが出来るなら
ば、ＲＡＰ１結合配列を基本としたあらたなＵＡＳを作
成することが期待できる。また組み合わせる断片にＵＡ
Ｓ活性が存在しているならば、互いに他の活性を相補、
増強することも期待できる。By the way, UAS having a strong binding sequence of RAP1
In order to show activity, GC is generally present near the RAP1 binding sequence.
It has been shown that the TTCCA or GCATCCA sequence is required to be present. In other words, these sequences are sequences that significantly enhance the transcription promoting function of RAP1, and if a fragment containing a sequence having a similar function can be found, a new UAS based on the RAP1 binding sequence can be created. Can be expected. In addition, UA
If S activity is present, complement each other with other activities,
It can be expected to increase.

【００１５】本発明者等はこのＲＡＰ１結合配列だけを
含む断片を持ったＵＡＳカセットプラスミドベクターpU
AS４−11（特願平３−106600）の断片と大腸菌由来のＵ
ＡＳ機能を持つ断片とを組み合わせることにより、上記
のような可能性を検討した。用いた大腸菌由来の上流制
御配列はpSN1−10（特願平２−226566）から得ることの
出来る164bp のSau3AI断片を用いた。ここでは以下この
断片をSN164 断片（図１）と呼ぶ。The present inventors have developed a UAS cassette plasmid vector pU having a fragment containing only this RAP1 binding sequence.
Fragment of AS4-11 (Japanese Patent Application No. 3-106600) and E. coli-derived U
By combining with a fragment having AS function, the above possibility was examined. The E. coli-derived upstream control sequence used was a 164 bp Sau3AI fragment obtainable from pSN1-10 (Japanese Patent Application No. 2-226566). Hereafter, this fragment is referred to as the SN164 fragment (Fig. 1).

【００１６】組み合わせて得たハイブリッドＵＡＳを持
つ発現ベクター、pSN4-11AX-LacZCの構築方法を実施例
１に記載する。構築したベクターはセントロメア型のベ
クターで、酵母での選択遺伝子としてＬＥＵ２遺伝子を
持つものである。また転写開始領域は酵母ＡＤＨ１遺伝
子のものを用いる。対照にはそれぞれの断片を単独で持
つpRG-UAS4-11-AX-LacZC（特願平３−106600）とpRG-SN
-AX-LacZC を用いた。A method for constructing an expression vector, pSN4-11AX-LacZC, having a hybrid UAS obtained in combination is described in Example 1. The constructed vector is a centromere type vector and has the LEU2 gene as a selection gene in yeast. The transcription initiation region used is that of the yeast ADH1 gene. As controls, pRG-UAS4-11-AX-LacZC (Japanese Patent Application No. 3-106600) and pRG-SN each having each fragment alone were used.
-AX-LacZC was used.

【００１７】また比較のために酵母ＴＤＨ３のＵＡＳ断
片を持つpRG-UAS1-AX-LacZC(特願平３−106600）を使用
した。これらのベクターを用いて実施例２に記載したご
とく酵母ＤＣ５株を形質転換し、得た形質転換体を栄養
選択培地であるＳＤ(-Leu)培地で培養した。ＵＡＳの機
能は、改変した大腸菌βガラクトシダーゼ遺伝子である
LacZC遺伝子（特願平３−106600）によって産生された
酵母菌体内のβガラクトシダーゼ活性を実施例３に示し
た方法で測定し、転写能力を測定する方法を採った。For comparison, pRG-UAS1-AX-LacZC (Japanese Patent Application No. 3-106600) having a UAS fragment of yeast TDH3 was used. These vectors were used to transform yeast DC5 strain as described in Example 2, and the resulting transformants were cultured in SD (-Leu) medium which is a nutrient selection medium. The function of UAS is a modified E. coli β-galactosidase gene
The β-galactosidase activity in the yeast cells produced by the LacZC gene (Japanese Patent Application No. 3-106600) was measured by the method shown in Example 3 to measure the transcription ability.

【００１８】測定の結果を表１に示す。初期グルコース
濃度が２％においても0.２％においても、ハイブリッド
ＵＡＳ（pSN4-11AX-LacZC)をもった形質転換体の産生す
るβガラクトシダーゼ活性は、各々断片を単独に持つベ
クターpRG-SN-AX-LacZC 及びpRG-UAS4-11-AX-LacZCによ
る形質転換体の産生する活性のほぼ総和に等しい活性を
示した。またこの活性値は酵母ＴＤＨ３プロモーターの
ＵＡＳ領域を完全な形で含むＵＡＳ１を持つ形質転換体
よりも高い活性を示した。これらのことから、大腸菌由
来のＵＡＳであるSN164 はＲＡＰ１結合配列のＵＡＳ活
性を相加的に上昇させる能力を持ち、またハイブリッド
ＵＡＳ、SN4-11はＲＡＰ１の結合配列が重要な役割を果
たしている天然のＵＡＳであるＵＡＳ_TDH よりも強い転
写促進活性を持つことは明らかである。The results of the measurement are shown in Table 1. The β-galactosidase activity produced by the transformant having the hybrid UAS (pSN4-11AX-LacZC) at both the initial glucose concentration of 2% and 0.2% is the vector pRG-SN-AX having each fragment alone. -LacZC and pRG-UAS4-11-AX-LacZC showed an activity almost equal to the sum of the activities produced by the transformants. Further, this activity value was higher than that of the transformant having UAS1 containing the UAS region of the yeast TDH3 promoter in its complete form. From these facts, SN164, which is a UAS derived from Escherichia coli, has the ability to additively increase the UAS activity of the RAP1 binding sequence, and hybrid UAS and SN4-11 are naturally occurring in which the RAP1 binding sequence plays an important role. It has a stronger transcription promoting activity than UAS _TDH, which is UAS of

【００１９】[0019]

【表１】 [Table 1]

【００２０】一方、酵母アルコールデヒドロゲナーゼII
は培地中のグルコースが消費されたときに発現する酵素
であり、その遺伝子（ADH2）の転写によって発現が制御
されている。ＡＤＨ２遺伝子の転写は、ＵＡＳ１とＵＡ
Ｓ２の働きによって制御されている。ＵＡＳ１は転写制
御因子であるＡＤＲ１の結合配列であり、ＵＡＳ２が存
在するとこのＵＡＳ１の機能が相乗的に高められる（Y
u,J.et al.,Mol.Cell.Biol.,９,p34-42,1989）。On the other hand, yeast alcohol dehydrogenase II
Is an enzyme expressed when glucose in the medium is consumed, and its expression is regulated by transcription of the gene (ADH2). Transcription of the ADH2 gene is associated with UAS1 and UA
It is controlled by the action of S2. UAS1 is a binding sequence of ADR1, which is a transcriptional regulatory factor, and the presence of UAS2 synergistically enhances the function of UAS1 (Y
u, J. et al., Mol. Cell. Biol., 9 , p34-42, 1989).

【００２１】このことはさらに組み合わせる配列を工夫
することによりＵＡＳの機能を高めることができること
を期待させる。そこで本発明者等は大腸菌由来ＵＡＳ断
片であるDN2-18または SN164断片を、このＡＤＨ２のＵ
ＡＳと組み合わせることにより、活性を相乗的に高める
ことが出来るのではないかと考え、検討した。実施例４
に記載する方法により、大腸菌由来ＵＡＳ断片であるSN
164 またはDN2-18断片とＡＤＨ２のＵＡＳと組み合わせ
たハイブリッドＵＡＳを持つ発現検定ベクター、pSNAD1
-AX-LacZC ，pSNAD2-AX-LacZC ，pSNAD3-AX-LacZC ，pD
NAD-AX-LacZC，及びpDNAD3-AX-LacZC を作成した（図
３）。また対照としてＡＤＨ２のＵＡＳだけを持つベク
ター、pADAX-LacZC,pAD2AX-LacZC，及びpAD3AX-LacZC
(図４）並びに大腸菌上流制御配列のみを持つベクターp
RG-DN-AX-LacZC を作成した。This makes us expect that the function of UAS can be enhanced by further devising a combination of sequences. Therefore, the present inventors have used the U2 fragment of Escherichia coli, DN2-18 or SN164 fragment, as the U of ADH2.
It was considered that the activity could be synergistically enhanced by combining with AS, and it was studied. Example 4
SN, which is a UAS fragment derived from E. coli, according to the method described in 1.
PSNAD1, an expression assay vector having a hybrid UAS in which a 164 or DN2-18 fragment and a UAS of ADH2 are combined.
-AX-LacZC, pSNAD2-AX-LacZC, pSNAD3-AX-LacZC, pD
NAD-AX-LacZC and pDNAD3-AX-LacZC were prepared (Fig. 3). As a control, vectors containing only ADH2 UAS, pADAX-LacZC, pAD2AX-LacZC, and pAD3AX-LacZC
(Fig. 4) and vector p containing only E. coli upstream regulatory sequences
Created RG-DN-AX-LacZC.

【００２２】構築したベクターはセントロメア型のベク
ターで、酵母での選択遺伝子としてＬＥＵ２遺伝子を持
つものである。また転写開始領域は酵母ＡＤＨ１遺伝子
のものを用いた。これらのハイブリッドＵＡＳの構築を
模式的に図３及び図４に示す。これらのベクターを用い
て酵母ＤＣ５を実施例２に示した方法で形質転換し、得
られた形質転換体の産生するβガラクトシダーゼ活性を
実施例３に記載した方法により測定することによりＵＡ
Ｓ機能を推定した。The constructed vector is a centromere type vector and has the LEU2 gene as a selection gene in yeast. The transcription initiation region used was that of the yeast ADH1 gene. The construction of these hybrid UASs is shown schematically in Figures 3 and 4. Using these vectors, yeast DC5 was transformed by the method described in Example 2, and the β-galactosidase activity produced by the resulting transformant was measured by the method described in Example 3 to obtain UA.
S function was estimated.

【００２３】測定した活性値を表２に記載する。培地の
グルコースが消費されきらない条件（初期グルコース濃
度２％）、つまりＡＤＨ２の発現が制御される条件にお
いては、ハイブリッドＵＡＳを持つ形質転換体は、大腸
菌由来のＵＡＳ断片を単独で持つ形質転換体（pRG-SN-A
X-LacZC 及びpRG-DN-AX-LacZC)と同等又はそれより低い
活性値の酵素しか生産しなかった。The measured activity values are shown in Table 2. Under the condition that glucose in the medium is not consumed (initial glucose concentration 2%), that is, the condition in which the expression of ADH2 is controlled, the transformant having the hybrid UAS is the transformant having the EAS-derived UAS fragment alone. (PRG-SN-A
X-LacZC and pRG-DN-AX-LacZC) produced only an enzyme having an activity value equal to or lower than that.

【００２４】しかし培地のグルコースが消費されきって
しまう条件（初期グルコース濃度0.２％）、つまりＡＤ
Ｈ２の発現が誘導される条件においてはハイブリッドＵ
ＡＳを持つ形質転換体は、単独の大腸菌染色体ＤＮＡ由
来ＵＡＳを持つ形質転換体の産生する酵素活性を上回る
活性値の酵素を産生した。その活性値は単独のものを総
和したものを遙かに上回ることから、互いに相乗的な作
用をしていることは明らかである。However, the condition that glucose in the medium is completely consumed (initial glucose concentration is 0.2%), that is, AD
Hybrid U under the condition that H2 expression is induced
The transformant having AS produced an enzyme having an activity value higher than that produced by the transformant having UAS derived from a single Escherichia coli chromosomal DNA. Since the activity values are far higher than the sum of the single substances, it is clear that they act synergistically.

【００２５】[0025]

【表２】 [Table 2]

【００２６】以上記載したごとく、大腸菌由来ＤＮＡ断
片とその他のＵＡＳを組み合わせたいくつかのハイブリ
ッドＵＡＳは天然の酵母遺伝子のＵＡＳよりも高い機能
を持つことが判明した。これらのＵＡＳをＡＤＨ１より
転写効率の高い転写開始配列、例えば解糖系酵素遺伝子
のものなどと組み合わせるならば、さらに転写効率の良
いプロモーターを構築することが可能である。As described above, it was found that some hybrid UAS in which E. coli-derived DNA fragment and other UAS are combined have a higher function than that of the natural yeast gene. If these UASs are combined with a transcription initiation sequence having a higher transcription efficiency than that of ADH1, such as that of a glycolytic enzyme gene, it is possible to construct a promoter having a higher transcription efficiency.

【００２７】また構築したプロモーターの下流に有用な
蛋白質遺伝子を組み合わせることにより、高い発現を可
能にする蛋白質発現遺伝子を構築できる。本発明の実施
例においては、構築した発現遺伝子をＬＥＵ２を選択マ
ーカーに持つセントロメア型のベクターに導入した例の
み示したが、他の種々の酵母用ベクターに挿入すること
により、例えば組み込み型(YIP型）のベクターに導入す
ればより安定に発現することが可能となるなどの実用性
の高い蛋白質発現系を構築することが可能である。A protein expression gene that enables high expression can be constructed by combining a useful protein gene downstream of the constructed promoter. In the Examples of the present invention, only the example in which the constructed expression gene was introduced into a centromere type vector having LEU2 as a selection marker was shown, but by inserting it into various other yeast vectors, for example, an integrated type (YIP It is possible to construct a highly-practical protein expression system in which it can be expressed more stably when it is introduced into a (type) vector.

【００２８】[0028]

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。実施例１ ．大腸菌由来上流制御配列と酵母ＴＤＨ３遺伝
子の上流制御配列とのハイブリッドＵＡＳを持つ発現検
定ベクターの作成 pUSA4-11（特願平３−106600）のＤＮＡを14μｌの反応
液中で（バッファーはメーカーの推奨する条件の物を用
いた）各々５〜10ユニットのHindIII,BamHI の制限酵素
を加え、37℃に１時間保温し切断した。68℃10分間加熱
処理した後、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノー断片）を４
ユニット、２mM dXTP 混液（２mM dATP,２mM dTTP,２mM
dCTP,２mMdGTP)を１μｌ加えて、37℃１時間保温し
た。反応終了後、１／10容量のＢＰＢ溶液（50％グリセ
リン、0.01％ブロモフェノールブルー、50mM EDTA)を加
えた後、10％ポリアクリルアミドゲルにのせ、電気泳動
を行なった。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. Example 1 . Escherichia coli-derived upstream regulatory sequence and yeast TDH3 inheritance
Expression test with hybrid UAS with upstream control sequence of offspring
Preparation of constant vector DNA of pUSA4-11 (Japanese Patent Application No. 3-106600) was added to 14 μl of reaction solution (buffer used conditions recommended by the manufacturer) and 5 to 10 units of HindIII and BamHI restriction enzymes, respectively. Was added, and the mixture was kept at 37 ° C. for 1 hour and cut. After heat treatment at 68 ° C for 10 minutes, add DNA polymerase (Klenow fragment) 4
Unit, 2mM dXTP mixture (2mM dATP, 2mM dTTP, 2mM
1 μl of dCTP, 2 mM dGTP) was added and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After completion of the reaction, 1/10 volume of BPB solution (50% glycerin, 0.01% bromophenol blue, 50 mM EDTA) was added, and then loaded on a 10% polyacrylamide gel and electrophoresed.

【００２９】電気泳動はＴＡＥ緩衝液（40mMトリス塩酸
〔pH7.５〕、20mM酢酸ナトリウム、10mM EDTA を用いて
pH8.０に調製したもの）を用いて行なった。電気泳動終
了後小断片を切り出し、細かく刻み、ＴＥ（10mMトリス
塩酸〔pH7.５〕、１mM EDTA)250μｌを加え、37℃で10
時間放置した。上清 250μｌを回収後、50μｌのＴＥで
ゲルを洗い、その上清を加えた合計 300μｌの溶液に30
μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（pH5.２）、 750μｌのエタ
ノールを加え−80℃で30分間放置後、16Krpmで10分間の
遠心でＤＮＡ断片を集め、沈澱を70％エタノールで洗
浄、減圧乾燥後、７μｌのＴＥに溶かした。For electrophoresis, TAE buffer (40 mM Tris-HCl [pH 7.5], 20 mM sodium acetate, 10 mM EDTA) was used.
(prepared to pH 8.0). After electrophoresis, cut out small fragments, finely chop, add 250 μl of TE (10 mM Tris-HCl [pH 7.5], 1 mM EDTA), and incubate at 37 ° C for 10
Left for hours. After collecting 250 μl of the supernatant, wash the gel with 50 μl of TE, and add the supernatant to a total of 300 μl of solution.
After adding μl of 3M sodium acetate (pH5.2) and 750 μl of ethanol and leaving it at −80 ° C. for 30 minutes, the DNA fragments were collected by centrifugation at 16 Krpm for 10 minutes, the precipitate was washed with 70% ethanol, dried under reduced pressure, and then 7 μl. Melted in TE.

【００３０】pSN1-10(164)（特願平３−106600）のHind
III,XhoIによって切断することにより得られる約0.５Kb
の断片を、クローニングベクターpT3T7-18X のHindIII,
XhoIサイトに挿入することによって得ることの出来るプ
ラスミドベクターpSN1-10(164)・AXを14μｌ反応液中で
５ユニットのSphIを加え、37℃に１時間保温し切断し
た。反応終了後ＴＥを40μｌ、フェノール：クロロホル
ム（１：１）を25μｌ加えて水層を抽出し、そこに５μ
ｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、 125μｌのエタノールを加え
て−80℃に30分間放置し、16Krpm，10分間の遠心を行な
った。Hind of pSN1-10 (164) (Japanese Patent Application No. 3-106600)
About 0.5 Kb obtained by cutting with III, XhoI
Fragment of the cloning vector pT3T7-18X with HindIII,
The plasmid vector pSN1-10 (164) .AX, which can be obtained by inserting it into the XhoI site, was added with 5 units of SphI in a 14 μl reaction solution, and the mixture was kept at 37 ° C. for 1 hour for cleavage. After the reaction was completed, 40 μl of TE and 25 μl of phenol: chloroform (1: 1) were added to extract the aqueous layer, and 5 μl was added thereto.
l 3M sodium acetate and 125 μl ethanol were added, the mixture was allowed to stand at −80 ° C. for 30 minutes and then centrifuged at 16 Krpm for 10 minutes.

【００３１】得た沈澱を70％エタノールで洗浄後、減圧
乾燥し、８μｌの滅菌水に溶かし、１μｌのDNA Blunti
ng Kit( 宝酒造）の添付バッファーを加え、70℃で５分
間加熱処理し、37℃に保温後、キットのT4 DNA polymer
ase １μｌを加えて37℃に５分間置いた。40μｌのＴＥ
を加えて激しく攪拌し、フェノール：クロロホルム
（１：１）25μｌを加えて水層を抽出し、そこに５μｌ
の１Ｍ酢酸ナトリウム（pH5.２）、 125μｌのエタノー
ルを加えて−80℃、30分間放置し16Krpm，10分間の遠心
を行ない、沈澱を70％エタノールで洗浄、減圧乾燥し、
10μｌのＴＥに溶解した。The obtained precipitate was washed with 70% ethanol, dried under reduced pressure, dissolved in 8 μl of sterilized water, and 1 μl of DNA Blunti.
Add the attached buffer of ng Kit (Takara Shuzo), heat it at 70 ℃ for 5 minutes, keep it at 37 ℃, and then use T4 DNA polymer of the kit.
1 μl of ase was added and the mixture was placed at 37 ° C. for 5 minutes. 40 μl TE
And vigorously stir, add 25 μl of phenol: chloroform (1: 1) to extract the aqueous layer, and add 5 μl to it.
1M sodium acetate (pH5.2) and 125 μl of ethanol were added, and the mixture was left at −80 ° C. for 30 minutes and centrifuged at 16 Krpm for 10 minutes. The precipitate was washed with 70% ethanol and dried under reduced pressure.
Dissolved in 10 μl TE.

【００３２】先のUA4-11断片の溶液７μｌとpSN1-10(16
4)・AXのSphI断片ＤＮＡ溶液10μｌのうちの１μｌ、さ
らにT4 DNAリガーゼ350 ユニットと T4 DNA リガーゼバ
ッファー（50mMトリス塩酸〔pH7.５〕、10mMMgCl₂、10m
Mジチオスレイトール、１mMATP）10μｌ中で16℃，１時
間インキュベートした。68℃10分間加熱処理し、1.５μ
ｌの１Ｍ NaCl を加え、SphIを加えて37℃で１時間保温
後、68℃、10分間加熱処理したものを形質転換に用い
た。7 μl of the above solution of UA4-11 fragment and pSN1-10 (16
4) ・ 1 μl of 10 μl of SphI fragment DNA solution of AX, 350 units of T4 DNA ligase and T4 DNA ligase buffer (50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 10 mM MgCl ₂ , 10 mM)
Incubated in 10 μl of M dithiothreitol, 1 mM ATP) at 16 ° C. for 1 hour. Heated at 68 ℃ for 10 minutes, 1.5μ
1 M NaCl was added thereto, SphI was added thereto, the mixture was kept at 37 ° C. for 1 hour, then heat-treated at 68 ° C. for 10 minutes, and used for transformation.

【００３３】大腸菌XL1-BlueをHanahan らの方法で形質
転換し、形質転換体をLamp寒天培地（50μｇ／ｍｌアン
ピシリン、1.５％寒天を含むＬ培地）によって選択し
た。大腸菌の形質転換体のプラスミドＤＮＡをミニプレ
パレーション法で調整し、回収したＤＮＡを制限酵素Hi
ndIII,PstIによって切断し、そのパターンをアクリルア
ミドゲル電気泳動で確認して、目的とするプラスミドpS
N4-11AX を持つ形質転換体を選択した。E. coli XL1-Blue was transformed by the method of Hanahan et al., And transformants were selected by Lamp agar medium (L medium containing 50 μg / ml ampicillin and 1.5% agar). The plasmid DNA of the E. coli transformant was prepared by the minipreparation method, and the recovered DNA was digested with the restriction enzyme Hi.
Digest with ndIII and PstI and confirm the pattern by acrylamide gel electrophoresis.
Transformants with N4-11AX were selected.

【００３４】得られた形質転換体から一本鎖ＤＮＡを調
製し、ＤＮＡの塩基配列を調べ、目的の配列を持ってい
ることを確認した。pRG-UAS1-AX-LacZC(特願平３−1066
00），pSN1-10(164)・AXまたはpSN4-11AX のＤＮＡを、
それぞれ反応液14μｌ中で５〜10ユニットのHindIII,Xh
oIにより切断した。反応終了後、それぞれに１／10容量
のＢＰＢ液を加えた後、0.７％アガロースゲルにのせ、
ＴＡＥ緩衝液中で電気泳動を行なった。電気泳動終了
後、pRG-UAS1-AX-LacZC からは約10kbの断片を、pSN1-1
0(164)・AX, pSN4-11AX からは約0.５kbのバンドをそれ
ぞれ切り出し、GENE CLEAN Kit（Bio101社) を用いてア
ガロースゲルからＤＮＡを回収した。Single-stranded DNA was prepared from the obtained transformant, and the nucleotide sequence of the DNA was examined to confirm that it had the desired sequence. pRG-UAS1-AX-LacZC (Japanese Patent Application No. 3-1066
00), pSN1-10 (164) AX or pSN4-11AX DNA,
5 to 10 units of HindIII and Xh in 14 μl of each reaction mixture
Cut with oI. After completion of the reaction, add 1/10 volume of BPB solution to each, and load on a 0.7% agarose gel,
Electrophoresis was performed in TAE buffer. After completion of electrophoresis, a fragment of about 10 kb from pRG-UAS1-AX-LacZC was added to pSN1-1.
A band of about 0.5 kb was cut out from each of 0 (164) · AX and pSN4-11AX, and DNA was recovered from an agarose gel using GENE CLEAN Kit (Bio101).

【００３５】回収したpRG-UAS1-AX-LacZC 由来断片10ng
とpSN1-10(164)・AX, またはpSH4-11AX 由来断片 100ng
とを10μｌの反応液中でT4 DNAリガーゼを用いて16℃，
１時間反応することにより連結させた。これを用いて、
前述と同様の方法で大腸菌XL1-Blue株の形質転換を行な
い、ミニプレパレーション法で目的とするプラスミドpR
G-SN-AX-LacZC とpSH4-11AX-LacZC が得られたことを確
認した。実施例２ ．酵母の形質転換 酵母ＤＣ５株をＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプ
トン、２％グルコース）で１夜培養し、そのうちの0.１
mlを５mlのＹＰＤ培地に接種した。OD600 が1.０に達す
るまで培養した後、遠心により菌体を集め、集めた菌体
を0.５mlの0.１Ｍ酢酸リチウム液（0.１Ｍ酢酸リチウ
ム、10mMトリス塩酸〔pH7.５〕、１mMEDTA)にて１回洗
った。再度遠心により菌体を集め、70μｌの0.１Ｍ酢酸
リチウム液に再懸濁し、30℃，１時間保温した。10 ng of the recovered pRG-UAS1-AX-LacZC-derived fragment
And pSN1-10 (164) AX, or pSH4-11AX-derived fragment 100 ng
And 10 μl in a reaction solution using T4 DNA ligase at 16 ℃,
It was connected by reacting for 1 hour. With this,
The Escherichia coli XL1-Blue strain was transformed by the same method as described above, and the target plasmid pR was selected by the minipreparation method.
It was confirmed that G-SN-AX-LacZC and pSH4-11AX-LacZC were obtained. Example 2 . Yeast transformed yeast DC5 strain was cultivated overnight in YPD medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose).
ml was inoculated into 5 ml YPD medium. After culturing until the OD600 reached 1.0, the cells were collected by centrifugation, and the collected cells were collected in 0.5 ml of 0.1 M lithium acetate solution (0.1 M lithium acetate, 10 mM Tris-HCl [pH 7.5], It was washed once with 1 mM EDTA). The cells were collected again by centrifugation, resuspended in 70 μl of 0.1 M lithium acetate solution, and incubated at 30 ° C. for 1 hour.

【００３６】発現検定ベクターのＤＮＡを10μｇ加えた
後、30℃，30分保温した。 500μｌのＰＥＧ溶液（40％
ポリエチレングリコール〔平均分子量4,000 〕を含む0.
１Ｍ酢酸リチウム液）を加え、ピペットマンを用いてよ
く混合した後、45分、30℃で保温した。この細胞懸濁液
を42℃，５分熱処理し、 500μｌの滅菌水を加えた後、
遠心により菌体を集め、 100μｌの滅菌蒸留水に再懸濁
した後、SD(-Leu)寒天培地（20μｇ／ｍｌアデニン硫酸
塩、20μｇ／ｍｌアルギニン塩酸塩、20μｇ／ｍｌメチ
オニン、20μｇ／ｍｌヒスチジン硫酸塩、20μｇ／ｍｌ
トリプトファン、20μｇ／ｍｌウラシル、30μｇ／ｍｌ
イソロイシン、30μｇ／ｍｌリジン塩酸塩、30μｇ／ｍ
ｌチロシン、50μｇ／ｍｌフェニルアラニン、 150μｇ
／ｍｌバリン、0.67％アミノ酸不含イーストニトロゲン
ベース、２％デキストロース、２％寒天）にひろげ、30
℃におき３日間培養することによりコロニーを形成させ
た。実施例３ ．菌体内に産生されたβガラクトシダーゼ活性
の測定 得られた形質転換体を５mlのSD(-Leu)培地で１日間30℃
において培養した。培養液50μｌをグルコース濃度２
％、または0.２％の５mlのSD(-Leu)培地に接種し、２％
グルコースの場合には24または30時間、0.２％グルコー
スの場合には24時間30℃において培養した。培養後細胞
を遠心により集め、 100μｌのＺバッファー（リン酸二
ナトリウム・７水塩8.55ｇ、リン酸一ナトリウム・１水
塩2.75ｇ、塩化カリウム 0.375ｇ硫酸マグネシウム・７
水塩 0.123ｇ、２−メルカプトエタノール1.35mlを水に
溶かし全量を11にする）に再懸濁した。そこに 100μｌ
のガラス・ビーズ（直径0.４mm）を加え、ボルテックス
ミキシングを２分間行なった。そこに 100μｌのＺバッ
ファーを加え軽く混合した後、遠心をした。遠心後、上
清を取ることにより、細胞抽出液を得た。After adding 10 μg of the DNA of the expression assay vector, the mixture was incubated at 30 ° C. for 30 minutes. 500 μl PEG solution (40%
Contains polyethylene glycol (average molecular weight 4,000)
1M lithium acetate solution) was added and mixed well with Pipetman, and then the mixture was kept at 30 ° C. for 45 minutes. This cell suspension was heat treated at 42 ° C for 5 minutes, and after adding 500 µl of sterilized water,
After collecting the cells by centrifugation and resuspending them in 100 μl of sterile distilled water, SD (-Leu) agar medium (20 μg / ml adenine sulfate, 20 μg / ml arginine hydrochloride, 20 μg / ml methionine, 20 μg / ml histidine) Sulfate, 20 μg / ml
Tryptophan, 20 μg / ml Uracil, 30 μg / ml
Isoleucine, 30 μg / ml lysine hydrochloride, 30 μg / m
l-tyrosine, 50 μg / ml phenylalanine, 150 μg
/ Ml valine, 0.67% amino acid-free yeast nitrogen base, 2% dextrose, 2% agar), 30
Colonies were formed by culturing at 3 ° C for 3 days. Example 3 . Β-galactosidase activity produced in cells
Measurement of the obtained transformant in 5 ml of SD (-Leu) medium for 1 day at 30 ° C
Were cultured in. Glucose concentration 2
% Or 0.2% in 5 ml SD (-Leu) medium and inoculate 2%
Incubation was carried out at 30 ° C. for 24 or 30 hours in the case of glucose and 24 hours in the case of 0.2% glucose. After culturing, the cells were collected by centrifugation and 100 μl of Z buffer (disodium phosphate heptahydrate 8.55 g, monosodium phosphate monohydrate 2.75 g, potassium chloride 0.375 g magnesium sulfate -7
0.123 g of water salt and 1.35 ml of 2-mercaptoethanol were dissolved in water to adjust the total amount to 11). 100 μl there
Glass beads (diameter 0.4 mm) were added and vortex mixing was performed for 2 minutes. 100 μl of Z buffer was added thereto, mixed gently, and then centrifuged. After centrifugation, the supernatant was taken to obtain a cell extract.

【００３７】１mlのＺバッファーに細胞抽出液を加え、
そこに 100μｌの４mg／mlのｏ−ニトロフェニル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド溶液を加え、混合した後、28℃
で反応を行なわせた。適当な時間に250μｌの１Ｍ炭酸
ナトリウム溶液を加えることによって、反応を停止さ
せ、反応液のOD420 を測定した。また細胞抽出液の蛋白
濃度を、Bio-Rad 社のミクロプロテインアッセイ液を用
いて測定した。ベーターガラクトシダーゼの活性値は以
下の計算式で算出した。Cell extract was added to 1 ml of Z buffer,
100 μl of 4 mg / ml o-nitrophenyl-β-
Add D-galactopyranoside solution, mix, and then 28 ℃
Let the reaction take place. The reaction was stopped by adding 250 μl of 1 M sodium carbonate solution at the appropriate time, and the OD420 of the reaction solution was measured. In addition, the protein concentration of the cell extract was measured using a microprotein assay solution manufactured by Bio-Rad. The activity value of beta-galactosidase was calculated by the following formula.

【００３８】[0038]

【数１】 [Equation 1]

【００３９】実施例４．大腸菌由来上流制御配列と酵母
ＡＤＨ２遺伝子の上流制御配列とのハイブリッドＵＡＳ
を持つ発現検定ベクターの作成 pSN1-10(164)とpDN2-18S（特願平３−106600）をそれぞ
れHindIII,XhoIによって切断することにより得られる約
0.５Kbの断片を、クローニングベクターpT3T7-18X のHi
ndIII-XhoIサイトに挿入することによって得ることの出
来るプラスミドベクターpDN2-18S・AXとpSN1-10(164)・
AXのＤＮＡを、それぞれ14μｌの反応液中、５ユニット
のSphIを加え、37℃に１時間保温し切断した。 Example 4 Upstream regulatory sequences from E. coli and yeast
Hybrid UAS with upstream regulatory sequence of ADH2 gene
Preparation of an expression assay vector having pSN1-10 (164) and pDN2-18S (Japanese Patent Application No. 3-106600) obtained by digestion with HindIII and XhoI, respectively.
The 0.5 Kb fragment was cloned into Hi of cloning vector pT3T7-18X.
Plasmid vectors pDN2-18S / AX and pSN1-10 (164) / that can be obtained by inserting into the ndIII-XhoI site
AX DNA was cleaved by adding 5 units of SphI in 14 μl of each reaction solution, keeping the temperature at 37 ° C. for 1 hour.

【００４０】その反応液に35μｌのＴＥを加え、25μｌ
のフェノール：クロロホルム（１：１）を加えて水層を
抽出し、それぞれに５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと 125
μｌのエタノールを加え、−80℃に30分間放置した。 1
6Krpm ４℃で５分間遠心し、得られた沈澱を 100μｌの
70％エタノールで洗浄した後、減圧乾燥し８μｌの滅菌
水と１μｌのDNA Blunting Kit（TAKARA社）の添付バッ
ファーに溶かした。35 μl of TE was added to the reaction solution to give 25 μl.
Phenol: chloroform (1: 1) was added to extract the aqueous layer, and 5 μl of 3M sodium acetate and 125
μl of ethanol was added, and the mixture was left at −80 ° C. for 30 minutes. 1
Centrifuge at 6K rpm at 4 ° C for 5 minutes, and precipitate the resulting precipitate with 100 μl.
After washing with 70% ethanol, it was dried under reduced pressure and dissolved in 8 μl of sterilized water and 1 μl of the attached buffer of DNA Blunting Kit (TAKARA).

【００４１】反応液を70℃で５分間加温した後37℃に保
温し、キットのT4 DNAポリメラーゼを１μｌ加えて５分
間37℃で保温した。そこに40μｌのＴＥを加え激しく攪
拌し、25μｌフェノール：クロロホルム（１：１）を加
えて水層を抽出し、５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと 125
μｌエタノールを加えて−80℃30分間放置した後、16Kr
pm４℃で５分間遠心して沈澱を得た。これを 100μｌエ
タノールで洗浄後、減圧乾燥し、それぞれ16μｌのＴＥ
に溶かした。The reaction solution was heated at 70 ° C. for 5 minutes and then kept at 37 ° C., 1 μl of T4 DNA polymerase from the kit was added, and the mixture was kept at 37 ° C. for 5 minutes. 40 μl of TE was added thereto, and the mixture was vigorously stirred, 25 μl of phenol: chloroform (1: 1) was added to extract the aqueous layer, and 5 μl of 3M sodium acetate and 125
After adding μl ethanol and leaving it at -80 ℃ for 30 minutes, 16Kr
A precipitate was obtained by centrifugation at pm 4 ° C. for 5 minutes. This was washed with 100 μl ethanol and dried under reduced pressure.
Melted into

【００４２】一方、報告（Yu, J. et al.,Mol. Cell.Bi
l.９,p34−42，1989）に従い下記の配列を持つＡＤＨ２
のＵＡＳ１，ＵＡＳ２を持つ断片を化学合成した。 合成したＡＤＨ２のＵＡＳ断片の塩基配列 AGCTGATCCTCTGCCGGAACACCGGGCATCTCCAACTTATAAGTTGGA CTAGGAGACGGCCTTGTGGCCCGTAGAGGTTGAATATTCAACCTCTAG この断片をpBluescriptII KS(BgIII）のHindIII-BglIII
サイトにクローニングしpAD-Blueを作成した。なおpBlu
escriptII KS(BgIII）は以下のように作成した。pBlues
criptII KS（＋)(ストラタジーン社）をXbaIで切断した
後、65℃，５分処理し、１／10容の１mMのヌクレオチド
混液（１mM dATP,１mM dTTP,１mM dCTP,１mM dGTP)と２
ＵのＤＮＡポリメラーゼ（クレノー断片）を加え37℃15
分処理することにより平滑末端化した。On the other hand, a report (Yu, J. et al., Mol. Cell. Bi
l.9, p34-42, 1989), ADH2 having the following sequence
A fragment having UAS1 and UAS2 of was chemically synthesized. Nucleotide sequence of the synthesized ADH2 UAS fragment AGCTGATCCTCTGCCGGAACACCGGGCATCTCCAACTTATAAGTTGGA CTAGGAGACGGCCTTGTGGCCCGTAGAGGTTGAATATTCAACCTCTAG This fragment was designated as HindIII-BglIII of pBluescriptII KS (BgIII).
It was cloned into the site and pAD-Blue was created. PBlu
escriptII KS (BgIII) was created as follows. pBlues
CriptII KS (+) (Stratagene) was digested with XbaI, treated at 65 ° C. for 5 minutes, and 1/10 volume of 1 mM nucleotide mixture (1 mM dATP, 1 mM dTTP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP) and 2
Add U DNA polymerase (Klenow fragment) at 37 ℃ 15
It was blunt-ended by treating for minutes.

【００４３】フェノール−クロロホルム抽出、エタノー
ル沈澱法によりＤＮＡを回収し、得られた断片とpBgIII
リンカー（５′−pCAGATCTG)とともにT4 DNAリカーゼを
用いて環状化させることにより得たものである。次にpA
D-BlueをClaIで切断し、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノー
断片）を用いて平滑末端化した後、HindIII リンカー
（５′−pCCAAGCTTGG)、またはBglII リンカー（５′−
pCAGATCTG)と共にT4 DNAリガーゼを用いて環状化させ
た。その結果ＡＤＨ２の合成ＵＡＳ断片をHindIII-BglI
I 断片として切り出すことのできるpAD2-Hind, BglIII
断片として切り出すことのできるpAD2-Bglを得た。DNA was recovered by phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation, and the resulting fragment and pBgIII
It was obtained by circularizing using T4 DNA lyase together with a linker (5'-pCAGATCTG). Then pA
D-Blue was cleaved with ClaI and blunt-ended with DNA polymerase (Klenow fragment), followed by HindIII linker (5'-pCCAAGCTTGG) or BglII linker (5'-
It was circularized using T4 DNA ligase with pCAGATCTG). As a result, the synthetic UAS fragment of ADH2 was converted to HindIII-BglI.
PAD2-Hind, BglIII that can be excised as an I fragment
We obtained pAD2-Bgl that can be excised as a fragment.

【００４４】pAD2-Bglを14μｌの反応液中、５ユニット
のBglII を加え、37℃で１時間保温し切断した。反応終
了後68℃で10分間加温し１μｌのＤＮＡポリメラーゼ
（クレノー断片）と１μｌの２mM dXTP 混液を加え、30
分間37℃で保温後、１／10容量のＢＰＢ溶液を加え、８
％ポリアクリルアミドゲルにのせＴＡＥ緩衝液で電気泳
動を行なった。PAD2-Bgl was added to 5 μl of BglII in 14 μl of the reaction solution, and the mixture was kept at 37 ° C. for 1 hour for cleavage. After completion of the reaction, heat at 68 ° C for 10 minutes, add 1 µl of DNA polymerase (Klenow fragment) and 1 µl of 2 mM dXTP mixture,
After incubating at 37 ℃ for 1 minute, add 1/10 volume of BPB solution,
Electrophoresis was performed with TAE buffer on a polyacrylamide gel.

【００４５】電気泳動終了後、ＡＤＨ２の合成ＵＡＳ断
片を切り出し、細かく刻んでＴＥ 250μｌを加え、37℃
で10時間保温した。上清 250μｌをゲル懸濁液から回収
後、ゲルを洗浄したＴＥ50μｌと合わせ、30μｌの３Ｍ
酢酸ナトリウム、 750μｌエタノールを加え−80℃で30
分間放置後16Krpm10分間の遠心でＤＮＡ断片を集め沈澱
を70％エタノールで洗浄、減圧乾燥後、７μｌのＴＥに
溶かした。After completion of the electrophoresis, the synthetic UAS fragment of ADH2 was cut out, finely chopped and added with 250 μl of TE, and then at 37 ° C.
It was kept warm for 10 hours. After recovering 250 μl of the supernatant from the gel suspension, combine with 50 μl of gel-washed TE and add 30 μl of 3M
Add sodium acetate and 750 μl ethanol to 30 at -80 ℃.
After standing for 15 minutes, the DNA fragments were collected by centrifugation at 16 K rpm for 10 minutes, the precipitate was washed with 70% ethanol, dried under reduced pressure, and dissolved in 7 μl of TE.

【００４６】このＡＤＨ２の合成ＵＡＳ断片溶液７μｌ
と先のpDN2-18S・AXまたはpSN1-10(164S）・AXベクター
断片の16μｌ溶液中１μｌをもちいて、前述と同様の方
法でT4 DNAリガーゼを使って連結反応を行ない大腸菌XL
1-Blue株の形質転換を行ないミニプレパレーション法で
調製したＤＮＡの制限酵素パターンを調べることでＡＤ
Ｈ２の合成ＵＡＳ断片の挿入されたプラスミドが得られ
たことを確認した。7 μl of this synthetic UAS fragment solution of ADH2
And 1 μl of a 16 μl solution of the above pDN2-18S / AX or pSN1-10 (164S) / AX vector fragment in a ligation reaction using T4 DNA ligase in the same manner as above.
By transforming the 1-Blue strain and examining the restriction enzyme pattern of DNA prepared by the mini-preparation method, AD
It was confirmed that a plasmid having the synthetic UAS fragment of H2 inserted therein was obtained.

【００４７】得られた形質転換体の一本鎖ファージＤＮ
Ａを調製しＤＮＡ配列を調べ、大腸菌由来上流制御配列
とＡＸプロモーター断片の間にＡＤＨ２の合成ＵＡＳ断
片が挿入されているプラスミド，pDNADAX, pDNAD3AX, p
SNADAX, pSNAD2AX, 及びpSNAD3AXが得られていることを
確認した。これらのプラスミドのＤＮＡとpDN2-18 ・AX
から前述と同様にHindIII,XhoI処理で得られた小断片を
単離し、これらの断片をそれぞれpRG-UAS1-AX-LacZC か
ら得られたHidIII,XhoI 、約10Kbの断片と結合、環状化
させることにより検定ベクター、pSNADAX-LacZC, pSNAD
2AX-LacZC, pSNAD3AX-LacZC, pDNADAX-LacZC, pDNAD3AX
-LacZC, 及びpRG-DN-AX-LacZC を構築した。Single-chain phage DN of the obtained transformant
A was prepared, the DNA sequence was examined, and a plasmid in which a synthetic UAS fragment of ADH2 was inserted between the upstream regulatory sequence derived from Escherichia coli and the AX promoter fragment, pDNADAX, pDNAD3AX, p
It was confirmed that SNADAX, pSNAD2AX, and pSNAD3AX were obtained. DNA of these plasmids and pDN2-18.AX
Isolate small fragments obtained by treatment with HindIII and XhoI as described above, and ligate these fragments with the HidIII, XhoI and about 10 Kb fragments obtained from pRG-UAS1-AX-LacZC, respectively, and circularize. By assay vector, pSNADAX-LacZC, pSNAD
2AX-LacZC, pSNAD3AX-LacZC, pDNADAX-LacZC, pDNAD3AX
-LacZC and pRG-DN-AX-LacZC were constructed.

【００４８】pAD2-Hind を14μｌの反応液中、５ユニッ
トのBglII とHindIII を加え、37℃に１時間保温した。
１／10容量のＢＰＢ液を加え、10％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動をＴＡＥ緩衝液で行ない、泳動終了後ＡＤ
Ｈ２の合成ＵＡＳのHindIII-BglII 断片を切り出し、ゲ
ルを細かく刻んでＴＥ 250μｌを加え、37℃で10時間放
置した。5 units of BglII and HindIII were added to 14 μl of the reaction solution of pAD2-Hind, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour.
Add 1/10 volume of BPB solution and perform 10% polyacrylamide gel electrophoresis with TAE buffer.
The HindIII-BglII fragment of the synthetic UAS of H2 was cut out, the gel was finely chopped, 250 μl of TE was added, and the mixture was left at 37 ° C. for 10 hours.

【００４９】上清 250μｌを回収後、ゲルを50μｌのＴ
Ｅで洗浄後回収された50μｌとあわせた溶液に、30μｌ
の３Ｍ酢酸ナトリウムと 750μｌのエタノールを加え、
−80℃で30分間放置後、16Krpm10分間の遠心でＤＮＡ断
片を集め沈澱を70％エタノールで洗浄減圧乾燥後、７μ
ｌのＴＥに溶かした。この断片をpRG-UAS1-AX-LacZCをB
glII とHindIII で切断して、アガロースゲル電気泳動
により単離した約10Kbの断片とT4 DNAリガーゼを用いて
環状化させることにより、pADAX-LacZC を構築した。After collecting 250 μl of the supernatant, the gel was washed with 50 μl of T
30 μl to the combined solution with 50 μl collected after washing with E
3M sodium acetate and 750 μl of ethanol were added,
After leaving it at -80 ℃ for 30 minutes, centrifuge at 16K rpm for 10 minutes to collect the DNA fragments, wash the precipitate with 70% ethanol and dry under reduced pressure.
It was dissolved in 1 of TE. This fragment is called pRG-UAS1-AX-LacZC
pADAX-LacZC was constructed by cleaving with glII and HindIII and circularizing with a fragment of about 10 Kb isolated by agarose gel electrophoresis and T4 DNA ligase.

【００５０】pADAX-LacZC を14μｌの反応液中、５ユニ
ットのBglII を加え、37℃に１時間保温した。68℃で10
分間加熱処理後、90μｌのＴＥ１μｌの１Ｍトリス塩酸
（pH8.０）、１μｌのアルカリフォスファターゼを加え
て65℃１時間保温した。反応後、フェノールＴＥ飽和溶
液を50μｌ加え、激しく攪拌して水層を抽出後、再びフ
ェノールＴＥ飽和溶液での抽出を繰り返し、さらにフェ
ノール：クロロホルム（１：１）で一回水層を抽出、５
μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと 125μｌのエタノールを加
え、−80℃で30分間放置後、16Krpm10分間の遠心でＤＮ
Ａ断片をあつめ、沈澱を70％エタノールで洗浄、減圧乾
燥後、10μｌのＴＥに溶解した。5 units of BglII was added to 14 μl of a reaction solution of pADAX-LacZC, and the mixture was kept at 37 ° C. for 1 hour. 10 at 68 ° C
After heating for 1 minute, 90 μl of TE, 1 μl of 1M tris-hydrochloric acid (pH 8.0) and 1 μl of alkaline phosphatase were added, and the mixture was kept at 65 ° C. for 1 hour. After the reaction, 50 μl of a saturated phenol TE solution was added, and the mixture was vigorously stirred to extract an aqueous layer. Then, extraction with a saturated phenol TE solution was repeated, and the aqueous layer was extracted once with phenol: chloroform (1: 1).
Add 3 μl of 3M sodium acetate and 125 μl of ethanol, leave at -80 ° C for 30 minutes, and centrifuge at 16K rpm for 10 minutes to DN.
Fragments A were collected, the precipitate was washed with 70% ethanol, dried under reduced pressure, and then dissolved in 10 μl of TE.

【００５１】pAD2-Bglを14μｌの反応液中、５ユニット
のBglII を加え、37℃に１時間保温し切断した。１／10
容量のＢＰＢ溶液を加え、８％ポリアクリルアミドゲル
にのせＴＡＥ緩衝液中で電気泳動を行なった。電気泳動
終了後、ＡＤＨ２の合成ＵＡＳ断片を切り出し、細かく
刻んでＴＥ 250μｌを加え、37℃で10時間保温した。上
清 250μｌをゲル懸濁液から回収後、ゲルを洗浄したＴ
Ｅ50μｌと合わせ、30μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、 750
μｌエタノールを加え−80℃で30分間放置後、16Krpm10
分間の遠心でＤＮＡ断片を集め沈澱を70％エタノールで
洗浄、減圧乾燥後、７μｌのＴＥに溶かした。このＡＤ
Ｈ２の合成ＵＡＳ断片を含む溶液７μｌと前述のpADAX-
LacZC 由来ＤＮＡ溶液10μｌのうちの１μｌを用いて、
同様の方法で連結反応を行ない、大腸菌の形質転換を行
ない、ミニプレパレーション法でＡＤＨ２のＵＡＳ断片
が挿入されているプラスミド、pAD2AX-LacZCとpAD3AX-L
acZCが得られていることを確認した。5 units of BglII was added to 14 μl of a reaction solution of pAD2-Bgl, and the mixture was kept at 37 ° C. for 1 hour for cleavage. 1/10
A volume of BPB solution was added, and the mixture was loaded on an 8% polyacrylamide gel and subjected to electrophoresis in TAE buffer. After completion of the electrophoresis, the synthetic UAS fragment of ADH2 was cut out, finely chopped and added with 250 μl of TE, and incubated at 37 ° C. for 10 hours. After collecting 250 μl of the supernatant from the gel suspension, the gel was washed
Combine with 50 μl E, 30 μl 3M sodium acetate, 750
Add μl ethanol and leave at -80 ℃ for 30 minutes, then 16Krpm10
The DNA fragments were collected by centrifugation for 1 minute, the precipitate was washed with 70% ethanol, dried under reduced pressure, and dissolved in 7 μl of TE. This AD
7 µl of solution containing synthetic UAS fragment of H2 and pADAX-
Using 1 μl of 10 μl of LacZC-derived DNA solution,
The plasmids pAD2AX-LacZC and pAD3AX-L in which the UAS fragment of ADH2 was inserted by the mini-preparation method by carrying out the ligation reaction and transformation of Escherichia coli by the same method.
It was confirmed that acZC was obtained.

【００５２】得られた形質転換体のプラスミドＤＮＡを
14μｌの反応液（５ユニットずつのHindIII,PstIの制限
酵素を含む）で、37℃１時間保温し切断した。１／10容
量のＢＰＢ液を加え、0.７％アガロースゲルにのせＴＡ
Ｅ緩衝液で電気泳動を行なった。電気泳動終了後ＡＤＨ
２のＵＡＳとＡＸプロモーターから構成される約0.３Kb
のバンドをそれぞれ切り出し、GENE CLEAN Kitを用いて
ゲルからＤＮＡを回収した。pT7T3U19（ファルマシア
社）のＤＮＡ、500ngを50μｌの反応液中５ユニットのH
indIII とPstIを加え、37℃，１時間保温した後、68℃
で10分間の加熱処理をした。The plasmid DNA of the obtained transformant was
14 μl of reaction solution (containing 5 units each of HindIII and PstI restriction enzymes) was incubated at 37 ° C. for 1 hour and cleaved. Add 1/10 volume of BPB solution and load on 0.7% agarose gel TA
Electrophoresis was performed with E buffer. ADH after completion of electrophoresis
Approximately 0.3 Kb composed of 2 UAS and AX promoter
The respective bands were excised, and DNA was recovered from the gel using GENE CLEAN Kit. DNA of pT7T3U19 (Pharmacia), 500 ng of 5 units of H in 50 μl of reaction solution
After adding indIII and PstI and incubating at 37 ℃ for 1 hour, 68 ℃
Was heat-treated for 10 minutes.

【００５３】回収したＡＤＨ２のＵＡＳとＡＸプロモー
ターから構成される約0.３Kbの断片100ngと、熱処理し
た後の、pT7T3U19のＤＮＡ溶液１μｌを10μｌの反応液
中でT4 DNAリガーゼを用いて、16℃，１時間反応した。
これを用いて前述と同様の方法で、大腸菌XL1-Blue株の
形質転換を行ない、ミニプレパレーション法で調製した
ＤＮＡの制限酵素パターンを調べ、断片が挿入されてい
るプラスミドを得た。100 ng of the approximately 0.3 Kb fragment composed of the recovered ADH2 UAS and AX promoter and 1 μl of the pT7T3U19 DNA solution after heat treatment were used in a 10 μl reaction solution with T4 DNA ligase at 16 ° C. , Reacted for 1 hour.
Using this, E. coli XL1-Blue strain was transformed by the same method as described above, the restriction enzyme pattern of the DNA prepared by the mini-preparation method was examined, and a plasmid having the fragment inserted was obtained.

【００５４】得られた形質転換体の一本鎖ＤＮＡを調製
し、ＤＮＡ配列を調べ、ＡＤＨ２のＵＡＳ断片の挿入さ
れている方向を確認した。Single-stranded DNA of the obtained transformant was prepared, the DNA sequence was examined, and the direction in which the UAS fragment of ADH2 was inserted was confirmed.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】図１は大腸菌由来ＵＡＳと酵母ＴＤＨ３遺伝子
のＵＡＳとから成るハイブリッドＵＡＳ及びその下流に
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する発現プラスミド
pSN4-11AX-LacZC 、及び酵母ＴＤＨ３遺伝子のＵＡＳ
（大腸菌由来ＵＡＳは含まない）及びその下流にβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドpRG-SN-AX-LacZ
C の作製過程を示す。FIG. 1 is a hybrid UAS consisting of EAS derived from Escherichia coli and the yeast TDH3 gene UAS and an expression plasmid containing a β-galactosidase gene downstream thereof.
pSN4-11AX-LacZC, and UAS of yeast TDH3 gene
(Not containing UAS derived from E. coli) and a plasmid pRG-SN-AX-LacZ containing β-galactosidase gene downstream thereof
The manufacturing process of C is shown.

【図２】図２は、大腸菌由来ＵＡＳと酵母ＡＤＨ２遺伝
子のＵＡＳとのハイブリッドＵＡＳを含むプラスミドpS
NADAX, pSNAD2AX, pSNAD3AX, pDNADAX, 及びpDNAD3AXの
作製過程を示す。FIG. 2 is a plasmid pS containing a hybrid UAS of E. coli-derived UAS and yeast ADH2 gene UAS.
The production process of NADAX, pSNAD2AX, pSNAD3AX, pDNADAX, and pDNAD3AX is shown.

【図３】図３は、大腸菌由来のＵＡＳと酵母ＡＤＨ２遺
伝子のＵＡＳとのハイブリッドＵＡＳの下流にβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子を含む発現プラスミドpSNADAX-LacZ
C ，pSNAD2AX-LacZC，pSNAD3AX-LacZC, pDNADAX-LacZC
pDNAD3AX-LacZC,及び pRG-DN-AX-LacZCの作製過程を示
す。FIG. 3 is an expression plasmid pSNADAX-LacZ containing a β-galactosidase gene downstream of a hybrid UAS of UAS derived from Escherichia coli and UAS of yeast ADH2 gene.
C, pSNAD2AX-LacZC, pSNAD3AX-LacZC, pDNADAX-LacZC
The production process of pDNAD3AX-LacZC and pRG-DN-AX-LacZC is shown.

【図４】図４は、酵母ＡＤＨ２のＵＡＳ（大腸菌由来Ｕ
ＡＳを含まない）の下流にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
を含む発現プラスミドpAD2AX-LacZC及びpAD3AX-LacZCの
作製過程を示す。FIG. 4 shows UAS of yeast ADH2 (U.
The production process of expression plasmids pAD2AX-LacZC and pAD3AX-LacZC containing the β-galactosidase gene downstream of (without AS) is shown.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 鈴木 正則 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁵ Identification number Reference number within the agency FI technical display location C12R 1: 645) (72) Inventor Masanori Suzuki 1-3-3 Nishitsurugaoka, Oi-cho, Iruma-gun, Saitama Prefecture No. Tonen Co., Ltd.

Claims (9)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 異種の上流活性化配列(UAS）の組合せか
らなるハイブリッドＵＡＳ。1. A hybrid UAS consisting of a combination of heterologous upstream activating sequences (UAS). 【請求項２】 前記異種のＵＡＳが大腸菌染色体ＤＮＡ
由来のＤＮＡ配列と酵母菌染色体ＤＮＡ由来のＵＡＳで
あることを特徴とする請求項１に記載のハイブリッドＵ
ＡＳ。2. The heterologous UAS is Escherichia coli chromosomal DNA
Hybrid U according to claim 1, characterized in that it is a DNA sequence derived from UAS and a UAS derived from yeast chromosomal DNA.
AS. 【請求項３】 前記酵母菌染色体ＤＮＡ由来のＵＡＳが
グリセルアルデヒド３−燐酸デヒドログナーゼ遺伝子Ｔ
ＤＨ３の上流にあるＵＡＳであることを特徴とする請求
項２に記載のハイブリッドＵＡＳ。3. The yeast chromosomal DNA-derived UAS is glyceraldehyde 3-phosphate dehydrognase gene T.
Hybrid UAS according to claim 2, characterized in that it is a UAS upstream of DH3. 【請求項４】 前記グリセルアルデヒド３−燐酸デヒド
ログナーゼ遺伝子ＴＤＨ３の上流にあるＵＡＳが転写制
御因子ＲＡＰ１の結合サイトであることを特徴とする請
求項３に記載のハイブリッドＵＡＳ。4. The hybrid UAS according to claim 3, wherein the UAS upstream of the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrognase gene TDH3 is a binding site of the transcription factor RAP1. 【請求項５】 前記酵母菌染色体ＤＮＡ由来のＵＡＳが
アルコールデヒドロゲナーゼII（ADH2）遺伝子の上流に
あるＵＡＳ配列であることを特徴とする請求項２に記載
のハイブリッドＵＡＳ。5. The hybrid UAS according to claim 2, wherein the UAS derived from the yeast chromosomal DNA is a UAS sequence located upstream of the alcohol dehydrogenase II (ADH2) gene. 【請求項６】 前記アルコールデヒドロゲナーゼII（AD
H2）遺伝子の上流にあるＵＡＳ配列がＵＡＳ１とＵＡＳ
２の両方を含むことを特徴とする請求項２に記載のハイ
ブリッドＵＡＳ。6. The alcohol dehydrogenase II (AD
H2) UAS sequence upstream of the gene is UAS1 and UAS
The hybrid UAS of claim 2 including both. 【請求項７】 前記ハイブリッドＵＡＳとプロモーター
とから構成される転写制御配列。7. A transcription control sequence composed of the hybrid UAS and a promoter. 【請求項８】 前記プロモーターがアルコールデヒドロ
ゲナーゼＩ（ADH1）遺伝子のプロモーターであることを
特徴とする請求項７に記載の転写制御配列。8. The transcription control sequence according to claim 7, wherein the promoter is a promoter of alcohol dehydrogenase I (ADH1) gene. 【請求項９】 ハイブリッドＵＡＳとプロモーターとか
ら構成される転写制御配列を利用した酵母発現ベクタ
ー。9. A yeast expression vector utilizing a transcriptional control sequence composed of a hybrid UAS and a promoter.