JPH05125099A - Peptide in main allergen der-f ii of acarid - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain the subject compound for prevention, treatment and diagnosis of various allergic diseases having a specific amino acid sequence and having a property capable of binding to human anti-Der-fII IgE antibody against main allergen of Dermatophagoides, and capable of mass-producing by gene engineering. CONSTITUTION:A plasmid retaining cDNA of Der-fII as main allergen of Dermatophagoides is completely digested with a restriction enzyme KpnI in a synthetic nucleotide adaptor and subjected to 0.7% agarose electrophoresis to separate the digested DNA fragment. The DNA fragment completely containing Der-fIIc DNA is extracted and purified from agarose gel after the electrophoresis the projected terminal of cut site is smoothed and then bound to a manifestation vector to prepare the recombinant plasmid and the plasmid is inserted into Escherichia coli to transform the plasmid. The transformant is cultured in a culture medium to provide the objective peptide containing an amino acid sequence expressed by the formula, necessary to bind human anti-Der-f IgE against Dermatophagoides main allergen (Der-fII).

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、ダニの主要アレルゲン
Der f IIのヒト抗Der f II IgE抗体が結合するのに必須
なアミノ酸配列を含むペプチド、このペプチドをコード
するＤＮＡ並びにそのＤＮＡに関連した複製ベクター、
プラスミド、宿主細胞、およびその用途に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention is a major allergen of mites.
Peptide containing the essential amino acid sequence for human anti Der f II IgE antibodies in the Der f II are attached, DNA and replicating vector associated with the DNA encoding the peptide,
It relates to plasmids, host cells and their uses.

【０００２】[0002]

【従来の技術】アレルギー疾患の多くは、その疾患の原
因抗原に感作されることにより、血清および組織でアレ
ルゲンに特異的なIgE 抗体（レアギン抗体）が産生さ
れ、再びその抗原に暴露されることにより、各組織上で
抗原とIgE 抗体が抗原抗体反応を起こし、その際、生じ
る種々の症状によるものと考えられている。2. Description of the Related Art Many allergic diseases are sensitized to the causative antigens of the diseases, so that IgE antibody (reagin antibody) specific to the allergen is produced in serum and tissues, and is exposed again to the antigen. Therefore, it is considered that the antigen and the IgE antibody cause an antigen-antibody reaction on each tissue, and that various symptoms occur at that time.

【０００３】このアレルギー疾患を根本的に治療する方
法として、減感作療法がある。この方法は、その原因抗
原を少量ずつ、また、症状に応じて投与量を徐々に増量
しながら、反復投与する方法である。この療法により遮
断抗体産生、IgE 抗体産生抑制、マスト細胞から遊離す
るヒスタミン量の低下が起こり、治療効果が得られると
考えられている。As a method for fundamentally treating this allergic disease, there is hyposensitization therapy. This method is a method of repeatedly administering the causative antigen little by little and gradually increasing the dose according to the symptoms. It is believed that this therapy produces a blocking antibody, suppresses IgE antibody production, and reduces the amount of histamine released from mast cells, resulting in a therapeutic effect.

【０００４】一方、気管支喘息、小児喘息、アトピー性
皮膚炎などのアレルギー性疾患は、室内塵中に生息して
いるダニに対するアレルギーが主な原因であることが明
らかになっており、既にいくつかのダニ主要アレルゲン
蛋白質が同定されている (プラッツミルズ（Platts-Mil
ls) ら、ザ・ジャーナル・オブ・アレルギー・アンド・
クリニカル・イムノロジー（J. Allergy Clin. Immuno
l.)、80巻、755頁1987年) 。従って、この主要アレルゲ
ン、特にそのIgEが結合するのに必須な部位を用いた上
記アレルギー疾患の減感作療法は、きわめて有効である
が、精製アレルゲンおよびアレルゲン中の結合必須部位
の多量調製が必要である。精製ダニ主要アレルゲンを多
量に調製する方法は、結城らにより既に開示されている
（アレルギー（Japanese J. Allergology)、39巻、557
頁、1990年）。しかしダニ主要アレルゲンの抗Der f II
IgE抗体結合必須領域部位はこれまで特定されておら
ず、従ってその多量調製は不可能であった。On the other hand, allergic diseases such as bronchial asthma, childhood asthma and atopic dermatitis have been clarified to be mainly caused by allergies to mites inhabiting indoor dust, and some of them have already been revealed. A major allergen protein of mite has been identified (Platts-Mil
ls) et al, The Journal of Allergies and
Clinical Immunology (J. Allergy Clin. Immuno
l.), 80, 755, 1987). Therefore, the hyposensitization therapy of the above-mentioned allergic disease using this major allergen, in particular the site essential for its IgE binding, is extremely effective, but it requires large-scale preparation of the purified allergen and the essential binding site in the allergen. Is. A method for preparing a large amount of purified mite major allergen has already been disclosed by Yuki et al. (Allergy (Japanese J. Allergology), Vol. 39, 557).
Page, 1990). However, anti- Der f II, a major mite allergen
The IgE antibody-binding essential region site has not been identified so far, and thus its large-scale preparation was impossible.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、既に開
示されているダニ主要アレルゲンDer f IIに対応する遺
伝子を遺伝子操作によって種々改変して発現させた後、
アレルギー患者血清との反応性を検討することにより、
抗Der f II IgE抗体結合必須部位の特定、並びにその多
量調製が可能となることを見出した。DISCLOSURE OF INVENTION Problems to be Solved by the Invention The present inventors, after expressing variously modified genes corresponding to the tick major allergen Der f II already disclosed by genetic engineering,
By examining the reactivity with serum of allergic patients,
It was found that it is possible to identify the essential site for anti- Der f II IgE antibody binding and to prepare it in large quantities.

【０００６】それゆえ、本発明の目的は遺伝子工学を使
ってダニ主要アレルゲン蛋白質中のIgE 結合必須部位を
コードするＤＮＡ配列を得ることであり、かつそのＤＮ
Ａがコードしているダニ主要アレルゲンのIgE 結合必須
領域を発現して、目的とするアレルゲンにIgE 抗体が結
合する必須領域を大量に製造する方法を提供することで
ある。It is therefore an object of the present invention to use genetic engineering to obtain a DNA sequence encoding the essential IgE binding site in the major tick allergen protein, and its DN.
(EN) It is intended to provide a method for producing an essential region in which IgE antibody binds to a target allergen in a large amount by expressing an IgE-binding essential region of a tick major allergen encoded by A.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】本発明は、ヒョウヒダニ
主要アレルゲン（Der f II）のアレルギー患者IgE 抗体
が結合する必須な部位をコードするＤＮＡおよび結合部
位を含むペプチドである。ダニ主要アレルゲンDer f II
をコードする遺伝子、およびその調製法は、既に結城ら
により開示されている（アレルギー（Japanese J. Alle
rgology)、39巻、557 頁、1990年）。アレルゲン蛋白質
中のエピトープ部位の特定には種々の方法を用いること
ができるが、当該蛋白質をコードする遺伝子を用いるこ
とができる本発明の場合は、その遺伝子を改変し適当な
ベクターを用いて適当な宿主中で発現させ、発現蛋白質
と患者血清との反応で検索する方法が有利である。この
一連の操作には従来用いられている種々の方法を使うこ
とが可能である（マニアティス（Maniatis）ら、モレキ
ュラー・クローニング（Molecular Cloning)、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー (Cold Spring
Harbor Laboratory)、1982年) 。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention is a peptide containing a binding site and a DNA encoding an essential site to which IgE antibody of allergic patients of Derf II major allergen ( Der f II) binds. Major tick allergen Der f II
The gene coding for and its preparation method have already been disclosed by Yuki et al. (Allergy (Japanese J. Alle
rgology), 39, 557, 1990). Although various methods can be used to identify the epitope site in the allergen protein, in the case of the present invention in which a gene encoding the protein can be used, the gene is modified to a suitable vector. A method of expressing in a host and searching by reaction between the expressed protein and patient serum is advantageous. Various methods conventionally used can be used for this series of operations (Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring).
Harbor Laboratory), 1982).

【０００８】Der f II遺伝子は単独あるいは適当なベク
ターへ挿入した後に種々の改変を加えることができる
が、特に発現ベクター、例えばpMAL-cのクローニングサ
イトへ挿入した状態で改変する方法が有利である。本ベ
クターを用いる場合、当該遺伝子はマルトース結合蛋白
質との融合蛋白質として発現し、その発現量が多いこと
から検出は容易である。[0008] The Der f II gene can be subjected to various modifications after it has been inserted alone or into an appropriate vector. In particular, a method of modifying the Der f II gene while it is inserted into the cloning site of an expression vector such as pMAL-c is advantageous. .. When this vector is used, the gene is expressed as a fusion protein with the maltose-binding protein, and its expression level is large, so that detection is easy.

【０００９】Der f II遺伝子は結城らが開示した方法
（アレルギー（Japanese J. Allergology)、39巻、557
頁、1990年）に従って調製した。得られたDer f II遺伝
子を含むプラスミドは、種々の制限酵素で改変を行っ
た。まず、制限酵素ＫpnI で切断し、３’突出末端をT4
ポリメラーゼで削除した。しかして得られたDer f II遺
伝子を含む直鎖状のプラスミドをエクソヌクレアーゼII
I で５’末端より欠失させた。反応時間を加減すること
により、順次欠失の程度の異なるDer f II遺伝子を含む
直鎖状のプラスミドが得られた。得られたプラスミドを
HindIIIで完全消化した後、アガロースゲル電気泳動を
行い欠失Der f II遺伝子を含む断片を得た。一方、プラ
スミドpMAL-c (ニューイングランドバイオラブ社製) を
StuI 及びHindIIIで完全消化した。先に調製しておいた
欠失Der f II遺伝子をT4リガーゼを用いてライゲーショ
ンして環状プラスミドとした。得られた欠失程度の異な
るDer f II遺伝子を含むプラスミドで大腸菌を形質転換
した。方法は全てニューイングランドバイオラブ社のプ
ロトコールに従った。形質転換の後に、抗Der f IIポリ
クローナル抗体を用いたコロニーイムノアッセイでDer
f II蛋白を産生しているクローンを選択した。The Der f II gene is a method disclosed by Yuki et al. (Allergy (Japanese J. Allergology), 39, 557.
Page, 1990). The obtained plasmid containing the Der f II gene was modified with various restriction enzymes. First, cut with the restriction enzyme Kpn I and attach the 3'overhanging end to T4.
Deleted with polymerase. The linear plasmid containing the Der f II gene thus obtained was transformed with exonuclease II.
I was deleted from the 5'end. By adjusting the reaction time, linear plasmids containing the Der f II gene with different degrees of deletion were obtained. The obtained plasmid
After complete digestion with Hin dIII, agarose gel electrophoresis was performed to obtain a fragment containing the deleted Der f II gene. On the other hand, plasmid pMAL-c (manufactured by New England Biolab) was
It was completely digested with Stu I and Hin d III. The deleted Der f II gene prepared previously was ligated with T4 ligase to give a circular plasmid. Escherichia coli was transformed with the obtained plasmids containing the Der f II gene having different deletion levels. All methods followed the New England Biolabs protocol. After transformation, Der was detected by colony immunoassay using anti- Der f II polyclonal antibody.
A clone producing the f II protein was selected.

【００１０】形質転換した大腸菌をＬブロス寒天培地
（１％バクトトリプトン、 0.5％イーストエキストラク
ト、0.5 ％塩化ナトリウム、 1.5％バクトアガー、50μ
ｇ／mlアンピシリン、pH7.4)上に生育させた後、生じた
コロニーを適宜Ｌブロス液体培地（Ｌブロス寒天培地か
ら寒天を除いたもの）へ接種した。37℃で約３時間培養
した後、IPTG（イソプロピル−β−チオガラクトピラノ
シド）を0.1mMになるように加え、さらに２時間培養を
継続した。集菌後、全菌体蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動後のゲルをウ
エスタンブロッティング法（トゥビン(Towbin,H.) ら、
プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.
A.)、76巻、4350頁、1979年) で産生された蛋白質をセ
ルロースフィルターに転写した。蛋白質が転写されたフ
ィルターを0.1 ％ツイーン20(Tween 20)でブロッキング
し、アレルギー患者血清を反応させた。その後、緩衝液
（トリス塩酸緩衝液、10mM、pH7.4 、塩化ナトリウム、
150mM 、ツイーン20、0.05％）で洗浄した。洗浄したフ
ィルターを、パーオキシダーゼで標識した抗ヒトIgE 抗
体（ICN 社製）と反応させた。しかる後に、反応しない
で残存しているパーオキシダーゼ標識抗体を除去した。
さらに、このフィルターを過酸化水素および色素４−ク
ロロ−１−ナフトールを用いて反応させた。Transformed E. coli was transformed into L broth agar medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 1.5% bacto agar, 50 μm).
After growing on g / ml ampicillin (pH 7.4), the resulting colonies were inoculated into L broth liquid medium (L broth agar medium minus agar) as appropriate. After culturing at 37 ° C. for about 3 hours, IPTG (isopropyl-β-thiogalactopyranoside) was added to 0.1 mM, and the culturing was continued for another 2 hours. After collecting the cells, the whole cell protein was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The gel after electrophoresis was subjected to Western blotting (Towbin, H., et al.
Proceeding of the National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci. US
A.), 76, 4350, 1979) was transferred to a cellulose filter. The protein-transferred filter was blocked with 0.1% Tween 20 and reacted with the serum of allergic patients. Then, a buffer solution (Tris-HCl buffer, 10 mM, pH 7.4, sodium chloride,
150 mM, Tween 20, 0.05%). The washed filter was reacted with an anti-human IgE antibody (ICN) labeled with peroxidase. Thereafter, the peroxidase-labeled antibody remaining without reaction was removed.
Furthermore, the filter was reacted with hydrogen peroxide and the dye 4-chloro-1-naphthol.

【００１１】その結果、Der f II遺伝子の欠失がある程
度進むと、Der f II蛋白質はアレルギー患者IgE と反応
しなくなった。Der f II遺伝子は制限酵素Bam HIによる
完全分解で切り出すことができる。切り出されたＤＮＡ
断片はダイデオキシ法（サンガー（Sanger) ら、ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol.Bio
l.) 162巻、729 頁、1982年) などを用いてその塩基配
列を決定することができる。しかして、アレルギー患者
IgE と結合するDer f II蛋白質をコードする遺伝子のう
ち最も欠失程度が大きなものと、アレルギー患者IgE と
結合しないDerf II蛋白質をコードする遺伝子のうち最
も欠失程度が小さいものの塩基配列を決定した。決定さ
れた２株の塩基配列の重複しない部分の配列、すなわち
IgE との結合能を失う前後で欠失した塩基配列を次式Ｉ
に示す。また、式Ｉには対応するアミノ酸も示してあ
る。As a result, when the Der f II gene was deleted to some extent, the Der f II protein stopped reacting with IgE in allergic patients. The Der f II gene can be excised by complete digestion with the restriction enzyme Bam HI. Excised DNA
Fragments were prepared by the dideoxy method (Sanger et al., Journal of Molecular Biology (J. Mol. Bio
l.) 162, p. 729, 1982) and the like can be used to determine the nucleotide sequence. And allergic patients
The most about deletions larger of the genes encoding the Der f II proteins that bind with IgE, to determine the nucleotide sequence of most things about deletion smaller of the gene encoding the DERF II protein that does not bind to allergic patients IgE .. Sequences of non-overlapping parts of the determined two base sequences, that is,
The nucleotide sequence deleted before and after losing the binding ability to IgE is represented by the following formula I
Shown in. The corresponding amino acids are also shown in Formula I.

【００１２】式Ｉ： GAT-CCA-TGC-ATC-ATC Asp-Pro-Cys-Ile-Ile 本ＤＮＡ断片および本ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片は、
Der f II遺伝子から適当な制限酵素やエクソヌクレアー
ゼ処理によって得ることができるが、ＤＮＡ合成機を用
いて合成することもできる。しかる後に適当なベクター
および適当な宿主を用いて発現させ、目的とするペプチ
ドを製造することができる。あるいは化学合成によって
目的とするペプチドを製造することができる。Formula I: GAT-CCA-TGC-ATC-ATC Asp-Pro-Cys-Ile-Ile This DNA fragment and a DNA fragment containing this DNA sequence are
It can be obtained from the Der f II gene by treatment with an appropriate restriction enzyme or exonuclease, but it can also be synthesized using a DNA synthesizer. Thereafter, the desired peptide can be produced by expressing it using an appropriate vector and an appropriate host. Alternatively, the desired peptide can be produced by chemical synthesis.

【００１３】化学合成あるいは遺伝子工学により調製し
た、本発明に従うダニアレルゲン蛋白質Der f IIのエピ
トープ部位、その一部およびそれらが他のペプチド、蛋
白質などと融合した形のもので、生化学的、免疫学的に
ダニ主要アレルゲンDer f IIエピトープの性質を有する
ペプチドは、ダニに起因する各種のアレルギー疾患の予
防、治療あるいは診断に使用できる。An epitope site of the mite allergen protein Der f II according to the present invention prepared by chemical synthesis or genetic engineering, a part thereof and a form in which they are fused with other peptides, proteins, etc. A peptide having a characteristic of Der f II epitope, which is a major allergen of mite, can be used for prevention, treatment or diagnosis of various allergic diseases caused by mite.

【００１４】[0014]

【発明の効果】本発明によれば、遺伝子工学を使ってヒ
ョウヒダニ主要アレルゲン蛋白質Derf IIのIgE 結合必
須部位を決定したことにより、結合必須部位ペプチドを
コードするＤＮＡ断片を得ることができた。それ故、こ
のＤＮＡがコードしているダニ主要アレルゲン蛋白質の
IgE結合必須部位を発現し、あるいは化学合成し、大量
に製造する方法を提供することができ、このIgE 結合必
須部位を用いて各種アレルギー疾患の予防、治療あるい
は診断に使用することができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a DNA fragment encoding a peptide essential for binding can be obtained by determining the essential IgE binding site of the major allergen protein Derf II, Derf II, using genetic engineering. Therefore, the major tick allergen protein encoded by this DNA is
It is possible to provide a method for producing a large amount by expressing or chemically synthesizing an IgE-binding essential site, and using this IgE-binding essential site can be used for prevention, treatment or diagnosis of various allergic diseases.

【００１５】[0015]

【実施例】次に、実施例に基づき本発明をさらに具体的
に説明する。これらの実施例は単に本発明を説明するた
めのものであり、本発明の範囲を限定するものではな
い。 実施例１Der f II発現プラスミドpFL11 の改変 既に結城らにより開示されているところの、ダニ主要ア
レルゲンDerf IIのｃＤＮＡを保持しているプラスミドp
FL11(アレルギー（Japanese J. Allergology,39 巻、55
7 頁、1990年）からDer f IIをコードする遺伝子だけを
調製した。その概略を図１に示す。EXAMPLES Next, the present invention will be described more specifically based on examples. These examples are merely illustrative of the invention and are not intended to limit the scope of the invention. Example 1 Modification of the Der f II expression plasmid pFL11 A plasmid p carrying the cDNA of the major mite allergen Der f II as previously disclosed by Yuki et al.
FL11 (Allergy (Japanese J. Allergology, Volume 39, 55
From page 7, 1990), only the gene encoding Der f II was prepared. The outline is shown in FIG.

【００１６】pFL11 は発現用プラスミドpUEX１（アマシ
ャム社）を基にして構築されたものであって、その制限
酵素BamHI部位にDer f IIのｃＤＮＡ遺伝子が合成ヌク
レオチドのアダプター（アマシャム社）を介して挿入さ
れている。このpFL11 を合成ヌクレオチドアダプター中
の制限酵素KpnI で完全消化し、0.7 ％アガロース電気
泳動に供し消化ＤＮＡ断片を分離した。Der f IIｃＤＮ
Ａを完全に含んでいる約500 塩基対のKpnI 断片を泳動
後のアガロースゲルから抽出精製した。虫体由来成熟体
Der f IIのＮ末端アミノ酸アスパラギン酸に対応するコ
ドンＧＡＴの位置に丁度切断部位が存在する制限酵素Sa
u3AI で精製したKpnI 断片を、完全切断し、ＤＮＡポリ
メレースＩ クレノウ(Klenow)フラグメントを用い、切
断部位の突出末端を平滑化した。その後、制限酵素NcoI
で完全切断し、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
に供し、63塩基対のSau3AI(filled)-NcoI 断片を分離精
製した。同じように、KpnI 断片をポリＡ配列の直前に
切断部位が存在する制限酵素HinfIで完全切断した後、
末端を平滑化した。その後、やはりNcoI で切断後、５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離精製し、389
塩基対のNcoI-HinfI(filled)断片を得た。[0016] pFL11 can be those the expression plasmid PUEX1 (Amersham) was constructed based on, cDNA gene Der f II to the restriction enzyme Bam HI site via an adapter synthetic nucleotide (Amersham) Has been inserted. The pFL11 was completely digested with restriction enzymes Kpn I in the synthetic nucleotide adapters were separated digested DNA fragments were subjected to 0.7% agarose electrophoresis. Der f IIc DN
A Kpn I fragment of about 500 base pairs which completely contained A was extracted and purified from the agarose gel after electrophoresis. Insect-derived mature body
Restriction enzyme Sa, which has a cleavage site at the position of codon GAT corresponding to N-terminal amino acid aspartic acid of Der f II
The Kpn I fragment was purified by u 3AI, was completely cut, using a DNA polymerase I Klenow (Klenow) fragment was blunted protruding ends of the cleavage site. After that, the restriction enzyme Nco I
Completely cleaved with 5% polyacrylamide gel electrophoresis, and the 63 base pair Sau 3 AI (filled) -Nco I fragment was separated and purified. Similarly , after completely digesting the Kpn I fragment with the restriction enzyme Hin fI having a cleavage site immediately before the poly A sequence,
The ends were blunted. After that, after cutting with Nco I, 5
Separated and purified by% polyacrylamide gel electrophoresis, 389
Base pair Nco I- obtain a Hin fI (filled) fragment.

【００１７】大腸菌での発現ベクターにはpMAL-c( ニュ
ーイングランドバイオラブ社製) を用いた。同発現プラ
スミドにコードされたマルトース結合蛋白質遺伝子の
３’末端に異種蛋白質を融合する事によりlac プロモー
タの制御下マルトース結合蛋白質と異種蛋白質の融合蛋
白質を誘導発現する事が可能である（メイナ（Maina)
等、ジーン(Gene)、74巻、365 頁、1988年) 。このpMAL
-cを制限酵素StuI で完全消化しアルカリフォスファタ
ーゼ処理した。得られたベクターＤＮＡ断片と、先の63
塩基対のSau3AI(filled)-NcoI 断片と389 塩基対のNcoI
-HinfI(filled)断片を混合し、ＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造株式会社製）を用いてライゲーション反応
を行い、大腸菌TBl(ニューイングランドバイオラブ社、
遺伝子型 ara, △（lac - proAB), rpsL, (φ80lacZ
△M15), hsdR) を形質転換した。ここで用いた遺伝子操
作の基本実験法 (制限酵素処理、修飾酵素処理等) はマ
ニアテス(Maniatis)らの方法 (モレキュラー クローニ
ング(Molecular Cloning) 、コールド スプリング ハ
ーバー プレス、1982年) に準拠した。また大腸菌の形
質転換には電気パルス法（バイオ ラッド社、ジーン
パルサー）を用いた。アンピシリン耐性のコロニーよ
り、プラスミドをアルカリ法（バーンボイム（Birnboi
m) 等、ヌクレイック アシッド リサーチ(Nucl. Acid
s Res.)、７巻、1513頁、1979年) にて分離した。得ら
れたプラスミドを制限酵素BamHIにより完全消化し、Der
f II遺伝子が挿入されていることを確認した。このよ
うにして得られた菌株を、pMFL11-c/TB1とした。PMAL-c (New England Biolab) was used as an expression vector in E. coli. By fusing a heterologous protein to the 3'end of the maltose-binding protein gene encoded by the expression plasmid, it is possible to induce and express a fusion protein of the maltose-binding protein and the heterologous protein under the control of the lac promoter (Maina (Maina )
Et al., Gene, 74, 365, 1988). This pMAL
-c was completely digested with the restriction enzyme Stu I and treated with alkaline phosphatase. The obtained vector DNA fragment and the above 63
Base pair Sau 3 AI (filled) -Nco I fragment and 389 base pair Nco I
-Hin fI (filled) fragments were mixed, and a ligation reaction was carried out using a DNA ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.), and E. coli TBl (New England Biolab,
Genotype ara , △ ( lac - proAB) , rpsL , (φ80 lacZ
ΔM15 ), hsdR ) were transformed. The basic experimental method of gene manipulation (restriction enzyme treatment, modification enzyme treatment, etc.) used here was based on the method of Maniatis et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, 1982). For transformation of E. coli, the electric pulse method (Bio-Rad, Gene
Pulsar) was used. From the ampicillin-resistant colonies, the plasmid was transferred to the alkaline method (Birnboi
m) etc., Nucleic Acid Research (Nucl. Acid
S. Res.), 7: 1513, 1979). The resulting plasmid was completely digested with the restriction enzyme Bam HI and Der
It was confirmed that the f II gene had been inserted. The strain thus obtained was designated as pMFL11-c / TB1.

【００１８】実施例２Der f II遺伝子の５’末端領域欠失遺伝子の作製 前記のpMFL11-cを用いて、Der f II遺伝子の５’末端が
段階的に欠失しているプラスミドシリーズを作製した
（図２）。この段階的欠失は、エキソヌクレアーゼIII
(ExonucleaseIII)とムング ビーン ヌクレアーゼ (Mu
ng Bean Nuclease) を併用するヘニコフ(Henikoff)の方
法（ジーン（Gene) 、28巻、351 頁、1984年) で行っ
た。[0018] 'with pMFL11-c Preparation said terminal region deleted gene, 5 of Der f II gene 5' of Example 2 Der f II gene produce plasmid series terminally deleted stepwise deleted (Fig. 2). This stepwise deletion results in exonuclease III
(Exonuclease III) and Mung Bean Nuclease (Mu
ng Bean Nuclease) together with the method of Henikoff (Gene, 28, 351 pages, 1984).

【００１９】pMFL11-cを制限酵素StuI で消化し直鎖状
にした後、ＤＮＡブランティングキット（宝酒造株式会
社）を用いてKpnI 切断部位の突出末端を平滑化した。
この直鎖状ＤＮＡ５μg を 105μl のExoIII緩衝液 (50
mM Tris-HCl, pH8.0、100mM 塩化ナトリウム、５mM塩化
マグネシウム、10mM 2−メルカプトエタノール) に溶解
し、180unit のエキソヌクレアーゼIII を１μl 加え23
℃で反応を開始した。20秒毎に7.5 μl ずつサンプリン
グして、反応を止めるために 100μl のムング ビーン
ヌクレアーゼ緩衝液(40mM 酢酸ナトリウム pH4.5、10
0mM 塩化ナトリウム、２mM塩化亜鉛、10％(v/v) グリセ
リン) の中へ順次加えていった。ムング ビーン ヌク
レアーゼ処理を行った後、ＤＮＡポリメレースＩ クレ
ノウ（Klenow) フラグメントによる末端修復を行った。
この一連の操作は、キロ シークエンス用デリーション
キット (宝酒造株式会社) を用いた。得られた直鎖状
ＤＮＡを、制限酵素HindIIIで完全切断し、10％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行い、５’末端より順次欠
失の導入されたDer f II遺伝子を含む断片を分離精製し
た。After pMFL11-c was digested with the restriction enzyme Stu I to make it linear, the protruding end of the Kpn I cleavage site was blunted using a DNA blunting kit (Takara Shuzo Co., Ltd.).
5 μg of this linear DNA was added to 105 μl of ExoIII buffer (50
mM Tris-HCl, pH8.0, 100 mM sodium chloride, 5 mM magnesium chloride, 10 mM 2-mercaptoethanol), and 180 units of exonuclease III (1 μl) was added.
The reaction started at ° C. Samples of 7.5 μl every 20 seconds and 100 μl of Mung Bean nuclease buffer (40 mM sodium acetate pH 4.5, 10 to stop the reaction).
It was sequentially added into 0 mM sodium chloride, 2 mM zinc chloride, and 10% (v / v) glycerin). After the Mung Bean nuclease treatment, the end was repaired with DNA Polymerase I Klenow fragment.
This series of operations used a deletion kit for kilo sequences (Takara Shuzo Co., Ltd.). The obtained linear DNA was completely cleaved with restriction enzyme Hin dIII and subjected to 10% polyacrylamide gel electrophoresis to separate and purify a fragment containing the Der f II gene in which deletions were sequentially introduced from the 5'end. ..

【００２０】一方、プラスミドpMAL-cをStuI 及びHindI
IIで完全消化した。このＤＮＡ断片と先に調製した欠失
Der f II遺伝子を、ＤＮＡライゲーションキットを用い
てライゲーションして環状ＤＮＡとした。この反応液を
用い大腸菌TB1 を形質転換した。形質転換株が保持する
プラスミドにコードされたマルトース結合蛋白質遺伝子
と欠失Der f II遺伝子のコドンの読み枠が一致していれ
ば、Der f II蛋白質のＮ末端が欠失した融合蛋白質を発
現すると考えられる。そこで、得られたアンピシリン耐
性株よりコロニーイムノアッセイ法（アグリカルチュア
ル アンド バイオロジカル ケミストリー（Agric. B
iol. Chem.) 55巻、1233頁、1991年) によりマウス由来
抗Der f II抗体と反応する、すなわちDer f II融合蛋白
質を産生する株を選択した。陽性株を、Ｌ液体培地（１
％バクトトリプトン (Tryptone、ディフコ社製) 、0.5
％イースト・イクストラクト(Yeast Extract、ディフコ
社製) 、0.5 ％塩化ナトリウム）に接種し、培養した
後、プラスミドを抽出し、制限酵素BamHI及びClaI で完
全消化しポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、Der
f II遺伝子の欠失程度を調べた。このようにして、Der
f II遺伝子の５’末端が０〜 200bp、順次欠失している
プラスミド及びそれぞれのプラスミドを保持しＮ末端欠
失Der f II融合蛋白質を発現する大腸菌TB1 を100 種
類、得た。On the other hand, the plasmid pMAL-c was cloned into Stu I and Hin dI.
Completely digested with II. This DNA fragment and the previously prepared deletion
The Der f II gene was ligated into a circular DNA by using a DNA ligation kit. Escherichia coli TB1 was transformed with this reaction solution. If the maltose binding protein gene encoded by the plasmid carried by the transformant and the codons of the deleted Der f II gene have the same reading frame, it is possible to express a fusion protein in which the N-terminal of the Der f II protein has been deleted. Conceivable. Therefore, the obtained ampicillin-resistant strain was subjected to colony immunoassay (Agricultural and Biological Chemistry (Agric.
iol. Chem.) 55, 1233, 1991), a strain that reacts with a mouse-derived anti- Der f II antibody, that is, a strain that produces a Der f II fusion protein was selected. The positive strain was designated as L liquid medium (1
% Bactrypton (Tryptone, Difco), 0.5
% Yeast extract (Yeast Extract, manufactured by Difco), 0.5% sodium chloride), and after culturing, the plasmid is extracted, completely digested with restriction enzymes Bam HI and Cla I, and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis. , Der
The degree of deletion of the f II gene was examined. In this way, Der
5 'end of the f II gene 0 to 200 bp, sequentially deleted in which holds a plasmid and each plasmid N-terminal deletion Der f II fusion protein 100 different E. coli TB1 expressing, was obtained.

【００２１】実施例３ Ｎ末端欠失Der f II融合蛋白質のIgE 抗体結合能の検出 実施例２で得られた100 種の形質転換株が発現するＮ末
端欠失Der f II融合蛋白質のIgE 抗体との結合能を、ウ
エスタン ブロット法 (タウビン(Towbin)等、プロシー
ディング イン ナショナル アカデミー オブ サイ
エンス (Proc.Natl. Acad. Sci. USA)、69巻、1409
頁、1972年) を用いて調べた。[0021] Example 3 N-terminal deletion Der f II fused N-terminal deletion Der f II fusion protein IgE antibodies protein 100 kinds of transformants obtained in detecting a second embodiment of the IgE antibody binding capacity of expressing Western blot method (Towbin, etc., Proceeding National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69, 1409)
Page, 1972).

【００２２】得られた形質転換株を100 μg/mlアンピシ
リンを含むＬ液体培地に接種し、37℃で振盪培養し、OD
₆₆₀nm が0.4 になったところで、ＩＰＴＧ（イソプロピ
ル−β−チオガラクトピラノシド）を0.1mM になるよう
に添加し、さらに２時間培養した。培養後の菌体を遠心
分離で回収した後、サンプル バッファー(10％(v/v)グ
リセリン、５％(v/v) ２−メルカプトエタノール、３％
(w/v) ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、62mM Tris-
Cl pH6.8) に懸濁し、100 ℃で５分間、加熱処理するこ
とで全菌体蛋白質を抽出した。得られた蛋白サンプル
を、ＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動（テフコ株式
会社製電気泳動装置、ゲル濃度８％) で分離した。泳動
後のゲルから、ニトロセルロース (バイオラッド社)も
しくは合成ポリマー（ミリポア社、商品名イモビロン)
のメンブランフィルター上に蛋白質を電気的に転写し
た。この転写は、セミドライ型蛋白質転写装置（アトー
社、ホライズ ブロット）を用いて行った。転写後のメ
ンブランを、抗体の非特異的吸着を防ぐためのブロッキ
ング操作として、0.1 ％ツイーン20(Tween20) を含むPB
S 緩衝液 (ダルベッコ(Dulbecco)等、ジャーナル オブ
イクスペリメンタルメディシン(J. Exp. Med.)、99
巻、167 頁、1954年) で１時間、振盪した。一次抗体と
しては、ヒョウヒダニに対してアレルギーを持つ患者の
血清（RAST試験でIgE 量の多い一人の患者の血清もしく
は数人のアレルギー患者の血清を混ぜたプール血清) を
用いた。血清をPBS 緩衝液で４倍に希釈した溶液にメン
ブランを浸し一晩振盪した。その後、0.05％ツイーン20
を含むPBS 緩衝液で３回清浄して、吸着しなかった一次
抗体を洗い流した。二次抗体はパーオキシダーゼ標識し
た抗ヒトIgE 抗体（ＩＣＮ社製）を用い、一次抗体の時
と同様にPBS で希釈(400倍)し、吸着（４時間）、洗浄
操作を行った。発色試薬のクロロナフトール（4-chloro
-1-naphthol)を0.5mg/mlの濃度でPBS 緩衝液に溶解し、
過酸化水素水を最終濃度0.05％になるように添加した
後、メンブランを浸し発色を行った。The obtained transformant was inoculated into L liquid medium containing 100 μg / ml ampicillin, shake-cultured at 37 ° C., and OD
_{When 660} nm reached 0.4, IPTG (isopropyl-β-thiogalactopyranoside) was added to 0.1 mM and the cells were further cultured for 2 hours. After harvesting the cultured cells by centrifugation, sample buffer (10% (v / v) glycerin, 5% (v / v) 2-mercaptoethanol, 3%
(w / v) SDS (sodium dodecyl sulfate), 62 mM Tris-
The whole bacterial cell protein was extracted by suspending it in Cl pH 6.8) and heating it at 100 ° C. for 5 minutes. The obtained protein sample was separated by SDS-acrylamide gel electrophoresis (electrophoresis device manufactured by Tefco Ltd., gel concentration 8%). Nitrocellulose (Bio-Rad) or synthetic polymer (Millipore, trade name Immobilon) from the gel after electrophoresis
The proteins were electrotransferred onto the membrane filter of the above. This transfer was carried out using a semi-dry type protein transfer device (Ato Co., Horize Blot). The membrane after transcription was treated with PB containing 0.1% Tween 20 as a blocking operation to prevent nonspecific adsorption of antibodies.
S buffer (Dulbecco et al., Journal of Experimental Medicine (J. Exp. Med.), 99
Vol. 167, 1954) for 1 hour. As the primary antibody, sera from patients allergic to Dermatophagoides faridae (sera from one patient with a high IgE amount in the RAST test or pooled sera from several allergic patients) was used. The membrane was immersed in a solution prepared by diluting the serum 4-fold with PBS buffer and shaken overnight. After that, 0.05% Tween 20
It was washed three times with a PBS buffer containing the above to wash away the non-adsorbed primary antibody. As a secondary antibody, a peroxidase-labeled anti-human IgE antibody (manufactured by ICN) was used. Like the primary antibody, it was diluted (400 times) with PBS, adsorbed (4 hours), and washed. The coloring reagent chloronaphthol (4-chloro)
-1-naphthol) at a concentration of 0.5 mg / ml in PBS buffer,
After adding hydrogen peroxide solution to a final concentration of 0.05%, the membrane was dipped for color development.

【００２３】この方法で欠失操作前のpMFL11-c/TB1の発
現する融合蛋白質は明らかに患者血清中のIgE 抗体と反
応した。それに対して、Ｎ末端欠失Der f II融合蛋白質
は欠失程度が少ないうちはIgE 抗体と反応するが、ある
程度以上欠失するとその反応性を失った。ここで、IgE
抗体と反応しない融合蛋白質をコードするプラスミドの
うち欠失が最も少ない株、及びIgE 抗体と反応する融合
蛋白質をコードするプラスミドのうち欠失が最も多い株
を選択し、その塩基配列の決定を試みた。By this method, the fusion protein expressed by pMFL11-c / TB1 before the deletion operation obviously reacted with the IgE antibody in the serum of the patient. On the other hand, the N-terminal deleted Der f II fusion protein reacts with the IgE antibody while the degree of deletion is small, but loses its reactivity when it is deleted over a certain amount. Where IgE
Attempt to determine the nucleotide sequence by selecting the strain with the least deletion among the plasmids encoding the fusion protein that does not react with the antibody and the strain with the most deletion among the plasmids encoding the fusion protein that reacts with the IgE antibody. It was

【００２４】実施例４ 欠失プラスミドの塩基配列の決定 前述した、IgE 抗体と反応しない融合蛋白質をコードす
るプラスミドのうち欠失が最も少ないもの、およびIgE
抗体と反応する融合蛋白質をコードするプラスミドのう
ち欠失が最も多いものの塩基配列を決定した。Example 4 Determination of Nucleotide Sequence of Deletion Plasmid Among the above-mentioned plasmids encoding a fusion protein that does not react with the IgE antibody, the one with the least deletion, and IgE.
Among the plasmids encoding the fusion protein that reacts with the antibody, the nucleotide sequence with the most deletions was determined.

【００２５】得られたプラスミドをBamHIで完全消化
し、1.5 ％アガロースゲル電気泳動を行い、Der f II遺
伝子を含むＤＮＡ切断を分離精製した。得られたＤＮＡ
切断をBam HIで完全消化し、サンガー(Sanger)の塩基配
列決定法（サイエンス（Science) 214巻、1205−1210
頁、1981年) に適したベクター pUC118(メッシング(Mes
sing) 等、メソッズ イン エンザイモロジー(Methods
in Enzymology) 101巻、20〜78頁、1987年) に挿入し
た後に、大腸菌宿主MV1184 (宝酒造社、遺伝子型 ara,
thi, strA, △（lac −proAB ),（φ80 lacZ △M15),
△(srl−recA)306::Tn10(tet^r )F' (proAB ⁺ , lacI ^qZ
△DM15, traD36))を形質転換した。この組換えプラスミ
ドの一本鎖ＤＮＡを単離精製し、サンガー(Sanger)の方
法に従い、塩基配列を決定した。配列決定には、蛍光式
自動ＤＮＡシークエンサー (アプライド バイオ シス
テム社製、Model 373A) を用いた。その結果、欠失プラ
スミドがDer f II遺伝子中の上記式Ｉで示される塩基配
列を欠失すると、IgE 結合能が失われることが判明し
た。このことは翻訳蛋白質がIgE 結合能を失う前後で、
式Ｉで示されたアミノ酸のみが欠失していることを示唆
している。The obtained plasmid was completely digested with Bam HI and subjected to 1.5% agarose gel electrophoresis to separate and purify the DNA fragment containing the Der f II gene. The obtained DNA
The digestion was completely digested with Bam HI, and the nucleotide sequence determination method of Sanger (Science 214, 1205-1210)
PUC118 (Messing (Mes.
sings etc., Methods in Enzymology (Methods
in Enzymology) 101, 20-78, 1987), E. coli host MV1184 (Takara Shuzo, genotype ara ,
thi , strA , △ ( lac − proAB ), (φ80 lacZ △ M15),
△ (srl − recA ) 306 :: Tn10 (tet ^r ) F ' (proAB ⁺ , lacI ^q Z
ΔDM15, traD 36)) was transformed. The single-stranded DNA of this recombinant plasmid was isolated and purified, and the nucleotide sequence was determined according to the method of Sanger. A fluorescent automatic DNA sequencer (Model 373A, manufactured by Applied Biosystems) was used for sequence determination. As a result, it was revealed that when the deletion plasmid lacks the base sequence represented by the above formula I in the Der f II gene, the IgE binding ability is lost. This means before and after the translated protein loses its IgE binding ability.
It is suggested that only the amino acid shown in formula I is deleted.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】実施例１においてダニ主要アレルゲンDer f II
の cＤＮＡを保持しているプラスミドpFL11 を改変して
エピトープ部位を探索するためのプラスミドpMFL11-cを
構築するまでの工程を示す図。FIG. 1 Der f II major allergen in Example 1
FIG. 6 is a diagram showing steps up to construction of a plasmid pMFL11-c for searching an epitope site by modifying the plasmid pFL11 carrying the cDNA of the above.

【図２】実施例２においてpMFL11-cを用いてDer fII遺
伝子の５’末端が段階的に欠失しているプラスミドシリ
ーズを作製する工程を示す図。FIG. 2 is a diagram showing a process of preparing a plasmid series in which the 5 ′ end of the Der f II gene is deleted stepwise by using pMFL11-c in Example 2.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ // Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｚ 8318−4Ｈ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 奥村 康 東京都大田区大森北２−13−１ アサヒビ ール株式会社応用技術研究所内 (72)発明者 杉山 哲資 千葉県市川市南八幡３丁目14番３号 鳥居 薬品株式会社研究所内 (72)発明者 山川 洋志 千葉県市川市南八幡３丁目14番３号 鳥居 薬品株式会社研究所内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁵ Identification code Internal reference number FI Technical display location C12N 15/12 C12P 21/02 C 8214-4B G01N 33/53 D 8310-2J // C07K 7 / 06 Z 8318-4H (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) C07K 99:00 (72) Inventor Yasushi Okumura 2-13-1, Omorikita, Ota-ku, Tokyo Asahi Biru Applied Technology Research Institute Co., Ltd. (72) Inventor Tetsuji Sugiyama 3-14-3 Minamihachiman, Ichikawa-shi, Chiba Torii Pharmaceutical Co., Ltd. Research Institute (72) Hiroshi Yamakawa 3-14-3 Minamihachiman, Ichikawa-shi, Chiba No. Torii Pharmaceutical Co., Ltd.

Claims (15)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ヒョウヒダニ主要アレルゲン（Der f I
I) 中のヒト抗Der fII IgE抗体が結合するのに必須な次
の式Ｉ： Asp-Pro-Cys-Ile-Ile で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。1. A major allergen of Der f I
A peptide containing an amino acid sequence represented by the following formula I: Asp-Pro-Cys-Ile-Ile, which is essential for binding to the human anti- Der f II IgE antibody in I). 【請求項２】 次の式II：GAT-CCA-TGC-ATC-ATC に示さ
れる塩基配列を含むＤＮＡであって請求項１記載のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡ。2. A DNA comprising the base sequence represented by the following formula II: GAT-CCA-TGC-ATC-ATC, which is the DNA encoding the amino acid sequence of claim 1. 【請求項３】 合成、半合成あるいは天然の起源を持
ち、請求項１記載のペブチドおよびその誘導体と関連
し、かつヒト抗Der f II IgE抗体と結合する能力を有す
るペプチド。3. A peptide of synthetic, semi-synthetic or natural origin, related to the peptide and its derivatives according to claim 1 and having the ability to bind to human anti- Der f II IgE antibodies. 【請求項４】 合成、半合成、および天然の起源を持
ち、請求項２記載のＤＮＡおよびその突然変異体と関連
し、かつ請求項１記載のペプチドをコードするＤＮＡ。4. A DNA of synthetic, semi-synthetic and natural origin, which is associated with the DNA of claim 2 and mutants thereof and which encodes the peptide of claim 1. 【請求項５】 請求項２または請求項４に記載のＤＮＡ
とハイブリダイズするＤＮＡ。5. The DNA according to claim 2 or 4.
DNA that hybridizes with. 【請求項６】 請求項２に記載したＤＮＡ配列を含むこ
とを特徴とする、少なくとも一つの選択マーカー、およ
び複製開始点の外で且つ他の基本的遺伝子領域の外に少
なくとも一つの制限酵素の認識部位を有する複製ベクタ
ー。6. At least one selectable marker, characterized in that it comprises the DNA sequence according to claim 2, and at least one restriction enzyme outside the origin of replication and outside the other basic gene regions. A replication vector having a recognition site. 【請求項７】 ウイルス起源であることを特徴とする請
求項６記載の複製ベクター。7. The replication vector according to claim 6, which is of viral origin. 【請求項８】 プラスミド起源であることを特徴とする
請求項６記載の複製ベクター。8. The replication vector according to claim 6, which is derived from a plasmid. 【請求項９】 請求項２、請求項４、または請求項５に
記載したＤＮＡ配列を含む発現カセットを持ち、安定し
た形で原核性または真核性宿主を形質転換でき、該宿主
細胞中で複製可能で、且つ、その中に含まれる当該ＤＮ
Ａに基づく遺伝情報が正しく転写されるプラスミド。9. A prokaryotic or eukaryotic host can be transformed in a stable manner with an expression cassette containing the DNA sequence according to claim 2, 4, or 5, and in said host cell. The DN that can be duplicated and is included in it
A plasmid in which genetic information based on A is correctly transcribed. 【請求項１０】 請求項１記載のヒト抗Der f II IgE抗
体が結合するのに必須な部位をコードする遺伝情報を含
む、形質転換した宿主細胞。10. A transformed host cell comprising genetic information encoding an essential site for binding to the human anti- Der f II IgE antibody of claim 1. 【請求項１１】 請求項２または請求項４記載のＤＮＡ
を用いて請求項１記載のペプチドを含む蛋白質を製造す
る方法。11. The DNA according to claim 2 or 4.
A method for producing a protein containing the peptide according to claim 1 using. 【請求項１２】 請求項１１記載の方法で得られた蛋白
質。12. A protein obtained by the method according to claim 11. 【請求項１３】 請求項１または請求項３記載のペプチ
ドを用いてアレルギー疾患を予防する方法。13. A method for preventing an allergic disease using the peptide according to claim 1 or 3. 【請求項１４】 請求項１または請求項３記載のペプチ
ドを用いて製造されたアレルギー疾患治療薬。14. A remedy for allergic diseases produced using the peptide according to claim 1 or 3. 【請求項１５】 請求項１または請求項３記載のペプチ
ドを用いたアレルギー疾患臨床検査薬。15. A drug for clinical examination of allergic diseases, which comprises the peptide according to claim 1 or 3.