JPH05103658A - カプセルの選別装置 - Google Patents
カプセルの選別装置Info
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- JPH05103658A JPH05103658A JP3280505A JP28050591A JPH05103658A JP H05103658 A JPH05103658 A JP H05103658A JP 3280505 A JP3280505 A JP 3280505A JP 28050591 A JP28050591 A JP 28050591A JP H05103658 A JPH05103658 A JP H05103658A
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- JP
- Japan
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- capsule
- capsules
- pipette
- cells
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- Pending
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/04—Cell isolation or sorting
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
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- Biomedical Technology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】本発明は、染色剤により染色された目的のカプ
セルを選別する装置であって、カプセルを通過させ得る
網目を有するカプセル保持容器と、該保持容器上のカプ
セルの吸光度あるいは蛍光強度を検出する検出手段と、
該検出手段により得られる結果に基づき特定のカプセル
を網目を通過させるか吸引して分離する手段、およびそ
れらを制御する制御部よりなるカプセルの選別装置に関
する。 【効果】顕微鏡観察に比べ正確にかつ定量的に蛍光量を
測定し、分別が自動的に行える。また、処理速度も大幅
に改善され、同時に数百のカプセルを認識できる。全カ
プセル中の分別するべきカプセルの割合は通常１％以下
であり、分別に数十秒要していたものが、１〜１０カプ
セル／秒の速度で処理できるようになった。
セルを選別する装置であって、カプセルを通過させ得る
網目を有するカプセル保持容器と、該保持容器上のカプ
セルの吸光度あるいは蛍光強度を検出する検出手段と、
該検出手段により得られる結果に基づき特定のカプセル
を網目を通過させるか吸引して分離する手段、およびそ
れらを制御する制御部よりなるカプセルの選別装置に関
する。 【効果】顕微鏡観察に比べ正確にかつ定量的に蛍光量を
測定し、分別が自動的に行える。また、処理速度も大幅
に改善され、同時に数百のカプセルを認識できる。全カ
プセル中の分別するべきカプセルの割合は通常１％以下
であり、分別に数十秒要していたものが、１〜１０カプ
セル／秒の速度で処理できるようになった。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はモノクローナル抗体等を
産生する細胞を含むカプセルを選別する装置に関する。
産生する細胞を含むカプセルを選別する装置に関する。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】従来、自
然界からのあるいは変異処理をした微生物群から目的の
菌株を選択（スクリーニング）する操作は、顕微鏡下に
カプセルを観察し着色したものあるいは蛍光強度の高い
ものをピペット等で無菌的に吸引し分離するような手作
業に限られていた。これに対してサンプルを無菌水で希
釈することによって適当な濃度に調整した細胞懸濁液を
シャーレ中の寒天培地上に塗抹し、培養後現れる純粋集
落（コロニー）を釣菌分離する方法があるが、この場合
得られた細胞を再度培養することとなり、時間を要す
る。また、コロニー形成が満足されるものとは限らな
い。従って、目的とする細胞を含むカプセルを選別でき
る装置の開発が期待されている。
然界からのあるいは変異処理をした微生物群から目的の
菌株を選択（スクリーニング）する操作は、顕微鏡下に
カプセルを観察し着色したものあるいは蛍光強度の高い
ものをピペット等で無菌的に吸引し分離するような手作
業に限られていた。これに対してサンプルを無菌水で希
釈することによって適当な濃度に調整した細胞懸濁液を
シャーレ中の寒天培地上に塗抹し、培養後現れる純粋集
落（コロニー）を釣菌分離する方法があるが、この場合
得られた細胞を再度培養することとなり、時間を要す
る。また、コロニー形成が満足されるものとは限らな
い。従って、目的とする細胞を含むカプセルを選別でき
る装置の開発が期待されている。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明は、染色剤により
染色された目的のカプセルを選別する装置において、カ
プセルを通過させ得る網目を有するカプセル保持容器
と、該保持容器上のカプセルの吸光度あるいは蛍光強度
を検出する検出手段と、該検出手段により得られる結果
に基づき特定のカプセルを網目を通過させて分離する手
段、およびそれらを制御する制御部よりなるカプセルの
選別装置、あるいはカプセルを保持するカプセル保持容
器と、該保持容器上のカプセルの吸光度あるいは蛍光強
度を検出する検出手段と、該検出手段により得られる結
果に基づき特定のカプセルを吸引して分離する手段、お
よびそれらを制御する制御部よりなるカプセルの選別装
置により構成される。
染色された目的のカプセルを選別する装置において、カ
プセルを通過させ得る網目を有するカプセル保持容器
と、該保持容器上のカプセルの吸光度あるいは蛍光強度
を検出する検出手段と、該検出手段により得られる結果
に基づき特定のカプセルを網目を通過させて分離する手
段、およびそれらを制御する制御部よりなるカプセルの
選別装置、あるいはカプセルを保持するカプセル保持容
器と、該保持容器上のカプセルの吸光度あるいは蛍光強
度を検出する検出手段と、該検出手段により得られる結
果に基づき特定のカプセルを吸引して分離する手段、お
よびそれらを制御する制御部よりなるカプセルの選別装
置により構成される。
【０００４】即ち、本発明の装置には、シャーレにカプ
セルが保持されかつ通過しうる網目を有する網を担持し
たカプセル保持容器を用いて、ピペットから噴出する水
流または気流によってカプセルを網目を通過させて選別
する態様の装置と、シャーレ内の目的のカプセルをピペ
ットで吸引して選別する態様の装置が含まれる。
セルが保持されかつ通過しうる網目を有する網を担持し
たカプセル保持容器を用いて、ピペットから噴出する水
流または気流によってカプセルを網目を通過させて選別
する態様の装置と、シャーレ内の目的のカプセルをピペ
ットで吸引して選別する態様の装置が含まれる。
【０００５】本発明におけるカプセル内で培養される細
胞は、生理学的に有用な細胞、融合細胞、形質転換細胞
等の微生物工学的な細胞等であり、培養により産生され
る検出対象となる物質としてはこれらの細胞から放出さ
れる生理的に活性な物質、例えば、サイトカイン、ペプ
チド、抗体、ホルモンなどが例示される。なかでも、標
識を有する物質と結合しうるもの、例えば表面抗原、レ
セプター結合性、特異性反応基を有するものなどが挙げ
られる。
胞は、生理学的に有用な細胞、融合細胞、形質転換細胞
等の微生物工学的な細胞等であり、培養により産生され
る検出対象となる物質としてはこれらの細胞から放出さ
れる生理的に活性な物質、例えば、サイトカイン、ペプ
チド、抗体、ホルモンなどが例示される。なかでも、標
識を有する物質と結合しうるもの、例えば表面抗原、レ
セプター結合性、特異性反応基を有するものなどが挙げ
られる。
【０００６】本発明で用いられるカプセルは、細胞の成
長に必要な物質を透過し、検出目的の細胞あるいは細胞
より産生する物質は保持するものであり、分子量６万程
度の培養栄養分、老廃物等が透過でき、分子量１５万程
度の高分子タンパク質、抗体等を保持できるカプセル膜
を有する。カプセル内では細胞がその培地に適応すれば
増殖可能であり、その細胞の目的の生理活性物質も保持
される。しかも十分量の培養液で培養すれば４週間以上
の長期にわたって高密度で細胞が維持される。一方、カ
プセル内の細胞がその培地に不適応ならば、細胞数が増
えないかまたは死滅する。
長に必要な物質を透過し、検出目的の細胞あるいは細胞
より産生する物質は保持するものであり、分子量６万程
度の培養栄養分、老廃物等が透過でき、分子量１５万程
度の高分子タンパク質、抗体等を保持できるカプセル膜
を有する。カプセル内では細胞がその培地に適応すれば
増殖可能であり、その細胞の目的の生理活性物質も保持
される。しかも十分量の培養液で培養すれば４週間以上
の長期にわたって高密度で細胞が維持される。一方、カ
プセル内の細胞がその培地に不適応ならば、細胞数が増
えないかまたは死滅する。
【０００７】マイクロカプセルを形成する材料として
は、例えば、アルギン酸ナトリウム、カラゲニン、ペク
チン等の水に可能な酸性多糖類ゴムが例示される。マイ
クロカプセルへの細胞の封入は、例えば多価カチオンの
水溶液中に細胞を混和した酸性多糖類ゴム溶液を滴下し
て行なわれる。多価カチオンの水溶液は、例えば塩化カ
ルシウム溶液を使用することができ、その濃度は特に限
定されず、カルシウムイオンが前記多糖類分子を架橋す
るのに十分な量を含むものならば、いずれでもよい。滴
下手段は、例えばシリンジ型注射器、分液ロートなどを
用いることができるが、これらには限定されない。カプ
セル径を制御するためには、例えば、滴下手段の液滴落
下の箇所に気流をつくることが考えられる。
は、例えば、アルギン酸ナトリウム、カラゲニン、ペク
チン等の水に可能な酸性多糖類ゴムが例示される。マイ
クロカプセルへの細胞の封入は、例えば多価カチオンの
水溶液中に細胞を混和した酸性多糖類ゴム溶液を滴下し
て行なわれる。多価カチオンの水溶液は、例えば塩化カ
ルシウム溶液を使用することができ、その濃度は特に限
定されず、カルシウムイオンが前記多糖類分子を架橋す
るのに十分な量を含むものならば、いずれでもよい。滴
下手段は、例えばシリンジ型注射器、分液ロートなどを
用いることができるが、これらには限定されない。カプ
セル径を制御するためには、例えば、滴下手段の液滴落
下の箇所に気流をつくることが考えられる。
【０００８】カプセル膜の透過性は適当な架橋用重合体
により表面層が架橋されることにより制御されており、
そのような架橋用重合体としては、例えば、ポリリジ
ン、ポリペプチド、ポリエチレンアミンなどが例示され
るが、特にポリ−Ｌ−リジンが好ましい。透過分子量の
制御は、架橋用重合体の濃度と反応時間によって行なわ
れ、例えば、分子量１．５万〜３０万のポリ−Ｌ−リジ
ンを用いる場合には、ポリ−Ｌ−リジン含量０．０５％
の生理的水溶液中に３分間マイクロカプセルを入れるこ
とにより、前記の透過度を持つ膜が得られる。
により表面層が架橋されることにより制御されており、
そのような架橋用重合体としては、例えば、ポリリジ
ン、ポリペプチド、ポリエチレンアミンなどが例示され
るが、特にポリ−Ｌ−リジンが好ましい。透過分子量の
制御は、架橋用重合体の濃度と反応時間によって行なわ
れ、例えば、分子量１．５万〜３０万のポリ−Ｌ−リジ
ンを用いる場合には、ポリ−Ｌ−リジン含量０．０５％
の生理的水溶液中に３分間マイクロカプセルを入れるこ
とにより、前記の透過度を持つ膜が得られる。
【０００９】本発明において染色剤により標識される標
識物質としては、カプセル膜を透過することが可能な分
子量１０万以下でなければならない。目的物質が抗体の
場合、例えばプロテインＡ、プロテインＧ等のタンパク
質、低分子化した抗体、抗原等が挙げられるが、特にプ
ロテインＡが好ましい。また、ここで用いられる染色剤
としては、例えばフルオロセイン イソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）、ローダミンＢ、ダンシルクロリド等の蛍
光物質が例示され、目的物質あるいは結合物質に応じて
選択でき、また標識に応じた検出方法が採用される。
識物質としては、カプセル膜を透過することが可能な分
子量１０万以下でなければならない。目的物質が抗体の
場合、例えばプロテインＡ、プロテインＧ等のタンパク
質、低分子化した抗体、抗原等が挙げられるが、特にプ
ロテインＡが好ましい。また、ここで用いられる染色剤
としては、例えばフルオロセイン イソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）、ローダミンＢ、ダンシルクロリド等の蛍
光物質が例示され、目的物質あるいは結合物質に応じて
選択でき、また標識に応じた検出方法が採用される。
【００１０】本発明において染色剤により染色されたカ
プセルの染色の強度を検出する検出手段としては、特に
限定されるものではないが、例えば励起光として４９０
ｎｍのバンドパスフィルターを透過した光をカメラと同
方向より照射し、カメラに５２０ｎｍのバンドパスフィ
ルターを装着して観察する方法が挙げられる。
プセルの染色の強度を検出する検出手段としては、特に
限定されるものではないが、例えば励起光として４９０
ｎｍのバンドパスフィルターを透過した光をカメラと同
方向より照射し、カメラに５２０ｎｍのバンドパスフィ
ルターを装着して観察する方法が挙げられる。
【００１１】マイクロカプセルの径は、多価カチオンの
水溶液中への多糖類ゴム溶液の滴下速度により制御でき
る。例えば、滴下手段のノズルの直径が０．５ｍｍで、
ノズル回りの気流が６リットル／分のときに、滴下速度
が０．１〜０．５ｍｌ／分の範囲にあるとき、１カプセ
ル中に１個以下の細胞を封入するのに最適な径となる。
径の大きさは通常０．５〜０．８ｍｍであり、このカプ
セルの大きさに応じてカプセル保持容器内の網の目の大
きさが決定される。選別用の網目の大きさは０．４〜
０．８ｍｍ位で、水流あるいは気流によって通過できる
大きさである。このような網目としては例えばナイロン
メッシュを用いることができる。
水溶液中への多糖類ゴム溶液の滴下速度により制御でき
る。例えば、滴下手段のノズルの直径が０．５ｍｍで、
ノズル回りの気流が６リットル／分のときに、滴下速度
が０．１〜０．５ｍｌ／分の範囲にあるとき、１カプセ
ル中に１個以下の細胞を封入するのに最適な径となる。
径の大きさは通常０．５〜０．８ｍｍであり、このカプ
セルの大きさに応じてカプセル保持容器内の網の目の大
きさが決定される。選別用の網目の大きさは０．４〜
０．８ｍｍ位で、水流あるいは気流によって通過できる
大きさである。このような網目としては例えばナイロン
メッシュを用いることができる。
【００１２】検出する際に、カプセルが塊となっていた
のでは検出強度が高く、しかも径が大きくなるので、正
確に選別するため、まずカプセルの大きさを判定する。
平均０．６ｍｍのカプセルを製造した場合、光点の大き
さを判定し、直径０．５ｍｍ以下の物は除く。直径０．
７ｍｍを大きく超えるものや形状が円形より大きく異な
るものは２つ以上のカプセルが隣接していると考え、円
形に分離する。
のでは検出強度が高く、しかも径が大きくなるので、正
確に選別するため、まずカプセルの大きさを判定する。
平均０．６ｍｍのカプセルを製造した場合、光点の大き
さを判定し、直径０．５ｍｍ以下の物は除く。直径０．
７ｍｍを大きく超えるものや形状が円形より大きく異な
るものは２つ以上のカプセルが隣接していると考え、円
形に分離する。
【００１３】次に、蛍光強度を測定し、その強度によっ
て選別する。蛍光強度が強いカプセル内には目的の細胞
が増殖していることを示す。カプセルの上にピペットを
先に装着したマニュピレータを移動させ、カプセルに狙
いをつける。カプセルを分離する手段としては、図１の
態様では、目的の細胞を含むカプセルをピペット先端よ
りポンプにより気流あるいは水流を勢いよく噴出させ、
該カプセルを網目を通過させ、下に落とす。選別された
目的の細胞を含むカプセルを回収する。この場合、２〜
１０リットル／分程度の気流あるいは１０〜１００ｍｌ
／分程度の水流でよい。また図２の態様では目的の細胞
を含むカプセルをピペット先端より吸引し、分離する。
この場合の吸引力は０．１〜２ｍｌ／秒程度のものでよ
い。次いで、カメラを動かし別の視野にあるカプセルを
観察し、同様に目的の細胞を含むカプセルを選別する。
これをシャーレの全カプセルについて行ない目的のカプ
セルを回収する。
て選別する。蛍光強度が強いカプセル内には目的の細胞
が増殖していることを示す。カプセルの上にピペットを
先に装着したマニュピレータを移動させ、カプセルに狙
いをつける。カプセルを分離する手段としては、図１の
態様では、目的の細胞を含むカプセルをピペット先端よ
りポンプにより気流あるいは水流を勢いよく噴出させ、
該カプセルを網目を通過させ、下に落とす。選別された
目的の細胞を含むカプセルを回収する。この場合、２〜
１０リットル／分程度の気流あるいは１０〜１００ｍｌ
／分程度の水流でよい。また図２の態様では目的の細胞
を含むカプセルをピペット先端より吸引し、分離する。
この場合の吸引力は０．１〜２ｍｌ／秒程度のものでよ
い。次いで、カメラを動かし別の視野にあるカプセルを
観察し、同様に目的の細胞を含むカプセルを選別する。
これをシャーレの全カプセルについて行ない目的のカプ
セルを回収する。
【００１４】図１の装置の場合、別の態様として目的の
細胞を含まないカプセルを網目を通過させて、網上に残
された目的のカプセルを回収することもできる。また図
２の装置の場合、別の態様として目的の細胞を含まない
カプセルを吸引し、シャーレ中に残された目的のカプセ
ルを回収することもできる。
細胞を含まないカプセルを網目を通過させて、網上に残
された目的のカプセルを回収することもできる。また図
２の装置の場合、別の態様として目的の細胞を含まない
カプセルを吸引し、シャーレ中に残された目的のカプセ
ルを回収することもできる。
【００１５】標識カプセルを選別できれば、カプセル膜
を破壊し、細胞を回収する。カプセル膜の破壊に際して
は、まずカプセルを培養ボトルから取り出し、十分に洗
浄して、カプセル外部に存在する汚染物を全て除去して
おく必要がある。膜の破壊は、公知の手法、例えば、マ
イクロカプセルを塩化カルシウムとヘパリンを含む溶液
に分散させインキュベートした後、クエン酸ナトリウム
溶液に入れることにより容易に行うことができる。塩化
カルシウム、ヘパリン、クエン酸ナトリウムの濃度はカ
プセル内の細胞に悪影響を与えない範囲で、適宜決めら
れる。なお、膜破壊の方法は、これに限定されない。
を破壊し、細胞を回収する。カプセル膜の破壊に際して
は、まずカプセルを培養ボトルから取り出し、十分に洗
浄して、カプセル外部に存在する汚染物を全て除去して
おく必要がある。膜の破壊は、公知の手法、例えば、マ
イクロカプセルを塩化カルシウムとヘパリンを含む溶液
に分散させインキュベートした後、クエン酸ナトリウム
溶液に入れることにより容易に行うことができる。塩化
カルシウム、ヘパリン、クエン酸ナトリウムの濃度はカ
プセル内の細胞に悪影響を与えない範囲で、適宜決めら
れる。なお、膜破壊の方法は、これに限定されない。
【００１６】
【作 用】平面に配置されたカプセルの吸光度あるいは
蛍光強度を測定し、ある一定値以上の値を持つものを探
す。ｘｙｚ方向に移動できるマニュピレータの先端にピ
ペットを装着し、ピペットの先端を、目的のカプセルの
位置へ動かす。ピペットよりカプセルに水流あるいは気
流をあて、カプセル保持容器内の網目を通過させ分離す
るか、ピペットでカプセルを吸引し分離する。これによ
り一定蛍光強度以上のカプセルのみを集めることができ
る。
蛍光強度を測定し、ある一定値以上の値を持つものを探
す。ｘｙｚ方向に移動できるマニュピレータの先端にピ
ペットを装着し、ピペットの先端を、目的のカプセルの
位置へ動かす。ピペットよりカプセルに水流あるいは気
流をあて、カプセル保持容器内の網目を通過させ分離す
るか、ピペットでカプセルを吸引し分離する。これによ
り一定蛍光強度以上のカプセルのみを集めることができ
る。
【００１７】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。 免疫および細胞融合 ダルベコ・リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解したヒトのト
ランスフェリン溶液（２００μｇ／ｍｌ）と完全フロイ
ンドアジュバントを等量混合して作成したエマルジョン
（２００μｌ）を、４週令のＢａｂｌｂ／ｃマウスの腹
腔内に、２週間おきに３回注射した。さらに２週間後、
５０μｌのトランスフェリン溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を尾
部静脈から注入し、３日目に脾臓を摘出した。脾臓をほ
ぐして得られた細胞を、５ｍｌの０．１７Ｍ塩化アンモ
ニウム溶液に１０分間懸濁して赤血球を破壊し、脾細胞
を調製した。
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。 免疫および細胞融合 ダルベコ・リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解したヒトのト
ランスフェリン溶液（２００μｇ／ｍｌ）と完全フロイ
ンドアジュバントを等量混合して作成したエマルジョン
（２００μｌ）を、４週令のＢａｂｌｂ／ｃマウスの腹
腔内に、２週間おきに３回注射した。さらに２週間後、
５０μｌのトランスフェリン溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を尾
部静脈から注入し、３日目に脾臓を摘出した。脾臓をほ
ぐして得られた細胞を、５ｍｌの０．１７Ｍ塩化アンモ
ニウム溶液に１０分間懸濁して赤血球を破壊し、脾細胞
を調製した。
【００１８】１．５×１０8 個の脾臓細胞と３×１０7
のマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１を、５０％
ポリエチレングリコール溶液（平均分子量１５００、ベ
ーリンガーマンハイム社）を用いて、Ｇａｌｆｒｅらの
方法（ネーチャー、266,550(1977)) に準じて融合し、
融合後の細胞を５０ｍｌのＨＡＴ培地に懸濁し、３７
℃、５％ＣＯ2 環境下で６日間培養した。
のマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１を、５０％
ポリエチレングリコール溶液（平均分子量１５００、ベ
ーリンガーマンハイム社）を用いて、Ｇａｌｆｒｅらの
方法（ネーチャー、266,550(1977)) に準じて融合し、
融合後の細胞を５０ｍｌのＨＡＴ培地に懸濁し、３７
℃、５％ＣＯ2 環境下で６日間培養した。
【００１９】カプセルへの封入および培養 培養した細胞を遠心して集めた後、０．５ｍｌのＨＡＴ
培地に再懸濁し、０．８５％の塩化ナトリウムを含む２
％アルギン酸ナトリウム溶液１．５ｍｌを加えた。この
細胞懸濁液を直径０．５ｍｍのノズルから毎分０．１ｍ
ｌの速さで押し出し、１．５％塩化カルシウム溶液中に
滴下した。この際、ノズル周辺部に６リットル／分の速
さで空気を流して、カプセル径を制御した。１．５％塩
化カルシウム中で１５分間攪拌し、ゲル化させた後、５
％グルコース溶液で２回洗浄した。このようにして作成
したマイクロカプセル（直径約６００μｍ）を０．０５
％ポリ−Ｌ−リジンを含む５％グルコース溶液（２０ｍ
ｌ）中に１０分間入れて、カプセル表面を高分子で被覆
した後、２０ｍｌの５％グルコース溶液で２回洗浄し
た。さらに０．０３％アルギン酸ナトリウムを含む５％
グルコース溶液（２０ｍｌ）で４分間処理した後、５％
グルコースで２回洗浄した。
培地に再懸濁し、０．８５％の塩化ナトリウムを含む２
％アルギン酸ナトリウム溶液１．５ｍｌを加えた。この
細胞懸濁液を直径０．５ｍｍのノズルから毎分０．１ｍ
ｌの速さで押し出し、１．５％塩化カルシウム溶液中に
滴下した。この際、ノズル周辺部に６リットル／分の速
さで空気を流して、カプセル径を制御した。１．５％塩
化カルシウム中で１５分間攪拌し、ゲル化させた後、５
％グルコース溶液で２回洗浄した。このようにして作成
したマイクロカプセル（直径約６００μｍ）を０．０５
％ポリ−Ｌ−リジンを含む５％グルコース溶液（２０ｍ
ｌ）中に１０分間入れて、カプセル表面を高分子で被覆
した後、２０ｍｌの５％グルコース溶液で２回洗浄し
た。さらに０．０３％アルギン酸ナトリウムを含む５％
グルコース溶液（２０ｍｌ）で４分間処理した後、５％
グルコースで２回洗浄した。
【００２０】カプセルを０．０５Ｍクエン酸ナトリウム
を含むＨＡＴ培地（２０ｍｌ）で１．５分間処理した
後、２０ｍｌのＨＡＴ培地で２回洗浄した。カプセルを
５０ｍｌのＨＡＴ培地に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ2 環
境下で培養した。封入後７日目から１週間ごとにＨＴ培
地を用いて培養液の交換を行なった。
を含むＨＡＴ培地（２０ｍｌ）で１．５分間処理した
後、２０ｍｌのＨＡＴ培地で２回洗浄した。カプセルを
５０ｍｌのＨＡＴ培地に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ2 環
境下で培養した。封入後７日目から１週間ごとにＨＴ培
地を用いて培養液の交換を行なった。
【００２１】実施例１ 前記のようにして得られたカプセルをリン酸緩衝生理食
塩水でよく洗浄し、培地を十分に除去したのち、染色剤
を加え、３０分間よく攪拌した（攪拌の方法はwave-rot
ationが望ましい）。例えば２．５ｍｇ／ｍｌになるよ
うにリン酸緩衝生理食塩水に溶解したＦＩＴＣ標識プロ
テインＡを染色剤として用いた。その後、静置し、デカ
ンテーションかアスピレーターによる吸引で上清を除去
し、リン酸緩衝生理食塩水を加え、１０分間よく攪拌
し、洗浄した。通常、この洗浄操作を再度繰り返し余分
な標識を除去した。このカプセル中に抗体産生能のある
ハイブリドーマが含まれていればカプセル中に抗体が高
濃度に蓄積されている。
塩水でよく洗浄し、培地を十分に除去したのち、染色剤
を加え、３０分間よく攪拌した（攪拌の方法はwave-rot
ationが望ましい）。例えば２．５ｍｇ／ｍｌになるよ
うにリン酸緩衝生理食塩水に溶解したＦＩＴＣ標識プロ
テインＡを染色剤として用いた。その後、静置し、デカ
ンテーションかアスピレーターによる吸引で上清を除去
し、リン酸緩衝生理食塩水を加え、１０分間よく攪拌
し、洗浄した。通常、この洗浄操作を再度繰り返し余分
な標識を除去した。このカプセル中に抗体産生能のある
ハイブリドーマが含まれていればカプセル中に抗体が高
濃度に蓄積されている。
【００２２】このように染色剤により染色されたカプセ
ルを互いに重ならないようにシャーレに広げた。励起光
として４９０ｎｍのバンドパスフィルターを透過した光
をカメラと同方向より照射し、カメラに５２０ｎｍのバ
ンドパスフィルターを装着して観察した（図１参照）。
情報は制御部へ伝達され制御部において処理される。そ
の処理の主なものは次のとおりである。
ルを互いに重ならないようにシャーレに広げた。励起光
として４９０ｎｍのバンドパスフィルターを透過した光
をカメラと同方向より照射し、カメラに５２０ｎｍのバ
ンドパスフィルターを装着して観察した（図１参照）。
情報は制御部へ伝達され制御部において処理される。そ
の処理の主なものは次のとおりである。
【００２３】（１）予め設定した値により二値化を行
う。次に光点の大きさを判定し、直径０．５ｍｍ以下の
物は除く。直径０．７ｍｍを大きく超えるものや形状が
円形より大きく異なるものは２つ以上のカプセルが隣接
していると考え、円形に分離する。 （２）蛍光強度を測定し、その強度によって選別する。
カプセルの位置に従って、ピペットを先に装着したマニ
ュピレータを移動させ、カプセルに狙いをつける。 （３）目的の細胞を含むカプセルをピペット先端よりポ
ンプにより気流あるいは水流を勢いよく吹き出し、カプ
セルを網目を通過させ、下に落とす。選別されたカプセ
ルを回収する。 （４）カメラを動かし別の視野にあるカプセルを観察
し、同様にカプセルを選別する。これをシャーレの全カ
プセルについて行ない目的のカプセルを回収する。
う。次に光点の大きさを判定し、直径０．５ｍｍ以下の
物は除く。直径０．７ｍｍを大きく超えるものや形状が
円形より大きく異なるものは２つ以上のカプセルが隣接
していると考え、円形に分離する。 （２）蛍光強度を測定し、その強度によって選別する。
カプセルの位置に従って、ピペットを先に装着したマニ
ュピレータを移動させ、カプセルに狙いをつける。 （３）目的の細胞を含むカプセルをピペット先端よりポ
ンプにより気流あるいは水流を勢いよく吹き出し、カプ
セルを網目を通過させ、下に落とす。選別されたカプセ
ルを回収する。 （４）カメラを動かし別の視野にあるカプセルを観察
し、同様にカプセルを選別する。これをシャーレの全カ
プセルについて行ない目的のカプセルを回収する。
【００２４】この装置の場合、別の態様として目的の細
胞を含まないカプセルを網目を通過させて、網上の目的
のカプセルを回収することもできる。
胞を含まないカプセルを網目を通過させて、網上の目的
のカプセルを回収することもできる。
【００２５】実施例２ 実施例１と同様にして得たカプセルを互いに重ならない
ようにシャーレに広げた。励起光として４９０ｎｍのバ
ンドパスフィルターを透過した光をカメラと同方向より
照射し、カメラに５１５ｎｍ以上のハイパスフィルター
を装着して観察した（図２参照）。情報は制御部へ伝達
され制御部において処理される。その処理の主なものは
次のとおりである。
ようにシャーレに広げた。励起光として４９０ｎｍのバ
ンドパスフィルターを透過した光をカメラと同方向より
照射し、カメラに５１５ｎｍ以上のハイパスフィルター
を装着して観察した（図２参照）。情報は制御部へ伝達
され制御部において処理される。その処理の主なものは
次のとおりである。
【００２６】（１）予め設定した値により二値化を行
う。次に光点の大きさを判定し、直径０．５ｍｍ以下の
物は除く。直径０．７ｍｍを大きく超えるものや形状が
円形より大きく異なるものは２つ以上のカプセルが隣接
していると考え、円形に分離する。 （２）蛍光強度を測定し、その強度によって選別する。
カプセルの位置に従って、ピペットを先に装着したマニ
ュピレータを移動させ、カプセルに狙いをつける。 （３）目的の細胞を含むカプセルをピペット先端より吸
引する。吸引されたカプセルは回収ビン（図示せず）に
移される。 （４）カメラを動かし別の視野にあるカプセルを観察
し、同様にカプセルを選別する。これをシャーレの全カ
プセルについて行ない目的のカプセルを回収する。
う。次に光点の大きさを判定し、直径０．５ｍｍ以下の
物は除く。直径０．７ｍｍを大きく超えるものや形状が
円形より大きく異なるものは２つ以上のカプセルが隣接
していると考え、円形に分離する。 （２）蛍光強度を測定し、その強度によって選別する。
カプセルの位置に従って、ピペットを先に装着したマニ
ュピレータを移動させ、カプセルに狙いをつける。 （３）目的の細胞を含むカプセルをピペット先端より吸
引する。吸引されたカプセルは回収ビン（図示せず）に
移される。 （４）カメラを動かし別の視野にあるカプセルを観察
し、同様にカプセルを選別する。これをシャーレの全カ
プセルについて行ない目的のカプセルを回収する。
【００２７】この場合、別の態様として目的の細胞を含
まないカプセルを吸引し、シャーレ中に目的のカプセル
を回収することもできる。
まないカプセルを吸引し、シャーレ中に目的のカプセル
を回収することもできる。
【００２８】
【発明の効果】顕微鏡観察に比べ正確にかつ定量的に蛍
光量を測定し、分別が自動的に行える。また、処理速度
も大幅に改善され、同時に数百のカプセルを認識でき
る。全カプセル中の分別するべきカプセルの割合は通常
１％以下であり、分別に数十秒要していたものが、１〜
１０カプセル／秒の速度で処理できるようになった。
光量を測定し、分別が自動的に行える。また、処理速度
も大幅に改善され、同時に数百のカプセルを認識でき
る。全カプセル中の分別するべきカプセルの割合は通常
１％以下であり、分別に数十秒要していたものが、１〜
１０カプセル／秒の速度で処理できるようになった。
【図１】図１は蛍光強度の高いカプセルを水流あるいは
気流にて網目を通過させ選別する装置の概略図である。
気流にて網目を通過させ選別する装置の概略図である。
【図２】図２は蛍光強度の高いカプセルをピペットで吸
引し選別する装置の概略図である。
引し選別する装置の概略図である。
フロントページの続き (72)発明者 青山 佳弘 京都市中京区西ノ京桑原町１番地 株式会 社島津製作所三条工場内 (72)発明者 岡田 まなみ 京都市中京区西ノ京桑原町１番地 株式会 社島津製作所三条工場内
Claims (2)
- 【請求項１】 染色剤により染色された目的のカプセル
を選別する装置において、カプセルを通過させ得る網目
を有するカプセル保持容器と、該保持容器上のカプセル
の吸光度あるいは蛍光強度を検出する検出手段と、該検
出手段により得られる結果に基づき特定のカプセルを網
目を通過させて分離する手段、およびそれらを制御する
制御部よりなるカプセルの選別装置。 - 【請求項２】 染色剤により染色された目的のカプセル
を選別する装置において、カプセルを保持するカプセル
保持容器と、該保持容器上のカプセルの吸光度あるいは
蛍光強度を検出する検出手段と、該検出手段により得ら
れる結果に基づき特定のカプセルを吸引して分離する手
段、およびそれらを制御する制御部よりなるカプセルの
選別装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3280505A JPH05103658A (ja) | 1991-09-30 | 1991-09-30 | カプセルの選別装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3280505A JPH05103658A (ja) | 1991-09-30 | 1991-09-30 | カプセルの選別装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05103658A true JPH05103658A (ja) | 1993-04-27 |
Family
ID=17626031
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3280505A Pending JPH05103658A (ja) | 1991-09-30 | 1991-09-30 | カプセルの選別装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05103658A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006121998A (ja) * | 2004-10-29 | 2006-05-18 | Kri Inc | 微生物単離装置、微生物の単離方法および該方法で得られた微生物含有微粒子 |
| JP2010029178A (ja) * | 2008-07-01 | 2010-02-12 | Osaka Univ | 細胞ピッキングシステム、スクリーニング方法および哺乳類細胞を取得する方法 |
| WO2013093954A1 (ja) | 2011-12-19 | 2013-06-27 | ヤマハ発動機株式会社 | 対象物選別装置および対象物選別方法 |
| WO2013093961A1 (ja) | 2011-12-20 | 2013-06-27 | ヤマハ発動機株式会社 | 対象物選別装置および対象物選別方法 |
| WO2013108296A1 (ja) * | 2012-01-20 | 2013-07-25 | ヤマハ発動機株式会社 | 対象物選別装置および対象物選別方法 |
-
1991
- 1991-09-30 JP JP3280505A patent/JPH05103658A/ja active Pending
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006121998A (ja) * | 2004-10-29 | 2006-05-18 | Kri Inc | 微生物単離装置、微生物の単離方法および該方法で得られた微生物含有微粒子 |
| JP2010029178A (ja) * | 2008-07-01 | 2010-02-12 | Osaka Univ | 細胞ピッキングシステム、スクリーニング方法および哺乳類細胞を取得する方法 |
| WO2013093954A1 (ja) | 2011-12-19 | 2013-06-27 | ヤマハ発動機株式会社 | 対象物選別装置および対象物選別方法 |
| KR20140102251A (ko) | 2011-12-19 | 2014-08-21 | 야마하하쓰도키 가부시키가이샤 | 대상물 선별 장치 및 대상물 선별 방법 |
| US9194865B2 (en) | 2011-12-19 | 2015-11-24 | Yamaha Hatsudoki Kabushiki Kaisha | Object selecting device and object selecting method |
| KR20160114730A (ko) | 2011-12-19 | 2016-10-05 | 야마하하쓰도키 가부시키가이샤 | 대상물 선별 장치 및 대상물 선별 방법 |
| WO2013093961A1 (ja) | 2011-12-20 | 2013-06-27 | ヤマハ発動機株式会社 | 対象物選別装置および対象物選別方法 |
| KR20140105803A (ko) | 2011-12-20 | 2014-09-02 | 야마하하쓰도키 가부시키가이샤 | 대상물 선별 장치 및 대상물 선별 방법 |
| WO2013108296A1 (ja) * | 2012-01-20 | 2013-07-25 | ヤマハ発動機株式会社 | 対象物選別装置および対象物選別方法 |
| JPWO2013108296A1 (ja) * | 2012-01-20 | 2015-05-11 | ヤマハ発動機株式会社 | 対象物選別装置および対象物選別方法 |
| US9687842B2 (en) | 2012-01-20 | 2017-06-27 | Yamaha Hatsudoki Kabushiki Kaisha | Subject selection device and subject selection method |
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