JPH0499500A

JPH0499500A - アビジンまたはアビジン標識体の定量法およびビオチンまたはビオチン標識体の定量法

Info

Publication number: JPH0499500A
Application number: JP21575890A
Authority: JP
Inventors: Hidetoshi Arakawa; 秀俊荒川; Masako Maeda; 前田　昌子; Akio Tsuji; 辻　章夫; Eiichi Nakano; 中野　衛一; Shigeru Honma; 茂本間
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1990-08-17
Filing date: 1990-08-17
Publication date: 1992-03-31

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明は、アビジンまたはアビジン標識体の定量法およ
びビオチンまたはビオチン標識体の定量法に関する。

〈従来の技術〉アビジンは、塩基性タンパク質の一種であり、卵白総タ
ンパク質量の約０．０５％を占めている。

ＣＭ−セルロースを用いて調製したアビジン標品は、Ｄ
ＮＡを含んでおらず、４個のサブユニットを有するが、
１分子当たり２分子のビオチンと結合するものである。

従来、アビジンの定量法としては、例えば、放射性同位
元素を用いる方法、すなわち、アビジンに［”Ｃ］　ビ
オチンを特異的に結合させ、生成した複合体をベントナ
イトに吸着させ、ニトロセルロースメンブランフィルタ
−で濾過して遊離のＭ’Ｃ］　ビオチンと分離して定量
する方法等が知られている。（Ｒ，Ｄ、Ｗｅｉ、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”　、Ｖｏｌ、Ｉ
８Ａ、ｅｄ、　ｐ、４２４（１９７０）、Ｓ、Ｇ、Ｋｏ
ｒｅｎｍａｎ、　Ｂ、Ｗ、０’Ｍａｌｌｅｙ、　＋Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　、Ｖｏｌ、
１８Ａ、ｅｄ、　ｐ、４２７（１９７０））また、ビオ
チンは、生体内の糖質・脂質代謝系等において炭酸固定
および炭転移反応に関与しているビタミンの一種である
。

そして、ビオチンの定量法としては、例えば、微生物定
量法（バイオアッセイ）　　〔Ｐ、Ｇｙ６ｒｇｙ“Ｔｈ
ｅ　Ｖｉｔａｍｉｎｓ　、ｅｄ、、Ｖｏｌ、７．　ｐ、
３０３（１９６７））等が知られている。

〈発明が解決しようとする課題〉しかしながら、上記アビジンの定量法は［”Ｃ］を用い
るため、その取り扱いには厳重な管理が必要であると共
に操作が極めて繁雑である等の問題点を有し、また上記
ビオチンの定量法は、操作が繁雑であり、更に、定量値
を出すまでに長時間必要である等の欠点があった。

〈課題を解決するための手段〉そこで本発明者等は、上記欠点を解消すべく種々検討し
た結果、ビオチン標識ルシフェラーゼは、その発光活性
がアビジンの共存により阻害され、その阻害程度が、ア
ビジン量に依存すること等の知見を得た。

そして、ビオチン標識ルシフェラーゼに、アビジンまた
はアビジン標識体含有試料を添加し、次いで、ルシフェ
ラーゼ活性を測定すれば、試料中のアビジンまたはアビ
ジン標識体量を、迅速、簡便かつ高感度に測定できるこ
とを見出し本発明を完成した。

更にまた、本発明者等は、上記欠点を解消すべく種々検
討した結果、アビジンによるビオチン標識ルシフェラー
ゼ発光活性阻害は、ビオチンまたはビオチン標識体の共
存により緩和されると共に、その緩和の程度が、ビオチ
ンまたはビオチン標識体量に依存すること等の知見を得
た。

そして、ビオチン標識ルシフェラーゼに、アビジンおよ
びビオチンまたはビオチン標識体含有試料を添加し、次
いで、ルシフェラーゼ活性を測定すれば、試料中のビオ
チンまたはビオチン標識体量を、迅速、簡便かつ高感度
に測定できることを見出し本発明を完成した。

すなわち本発明は、ビオチン標識ルシフェラーゼに、ア
ビジンまたはアビジン標識体含有試料を添加し、次いで
、ルシフェラーゼ活性を測定することを特徴とするアビ
ジンまたはアビジン標識体の定量法であり、また本発明
は、ビオチン標識ルシフェラーゼに、アビジンおよびビ
オチンまたはビオチン標識体含有試料を添加し、次いで
、ルシフェラーゼ活性を測定することを特徴とするビオ
チンまたはビオチン標識体の定量法である。

以下、本発明を更に詳細に説明する。

先ず、ビオチン標識ルシフェラーゼを調製するには、ビ
オチン活性エステルとルシフェラーゼとを標識反応させ
、ビオチン標識ルシフェラーゼを得る。

ビオチン活性エステルとしては、如何なるものでもよく
、例えば、Ｄ−ビオチニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ
−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（以下、ビオチン
−Ｘ−ＮＨ５と略称する）等が挙げられる。

ルシフェラーゼとしては、ルシフェリン−ルシフェラー
ゼ系によるＡＴＰ測定に用いられるルシフェラーゼであ
れば如何なるものでもよく、例えば、ゲンジボタル、ヘ
イケボタル、アメリカホタル由来のルシフェラーゼ、更
に、それらを遺伝子組み換え法により製造したもの、あ
るいは一部改変したもの等が挙げられる。

標識反応の条件としては、例えば、反応ｐＨは５〜９、
好ましくはｐＨ７，５前後であり、反応温度は４〜２５
℃、好ましくは４℃前後であり、又、反応時間は３〜６
時間、好ましくは４時間であり、更に、緩衝液としては
、グリセロール、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウムを含む、Ｈ
ＥＰＥＳ、　トリス緩衝液等が挙げられ、ルシフェラー
ゼの濃度としては、１ｍｇ／ｍＰ、反応液中のビオチン
活性エステルとルシフェラーゼのモル比は、０５〜５０
、好ましくは、５〜２０である。反応終了後、未反応の
ビオチン活性エステルを除去するには、如何なる方法で
もよく、例えば、透析により除去することができる。

上記のようにして、得られたビオチン標識ルシフェラー
ゼを用い、以下のようにして、アビジンまたはアビジン
標識体を定量することができる。

アビジンまたはアビジン標識体含有試料とビオチン標識
ルシフェラーゼとを反応させる。反応条件としては、例
えば、反応ｐＨは５〜９、好ましくはｐＨ７前後であり
、反応温度は４〜３６℃、好ましくは２５℃前後であり
、又、反応時間は　１０〜１２０分間、好ましくは６０
分間であり、更に、緩衝液としては、例えば、リン酸緩
衝液等が挙げられる。次いで、この反応液にＡＴＰおよ
びルシフェリンを添加し、生じてくる発光強度を測定し
、例えば、以下の、実施例１記載のような検量線を使用
して、試料中に含まれるアビジンまたはアビジン標識体
を定量する。反応条件としては、例えば、反応ｐＨは６
〜９、好ましくはｐＨ７，７５前後であり、反応温度は
４〜３６、好ましくは２５℃前後であり、また、反応時
間は１時間以内、好ましくは、３０分以内であり、更に
、緩衝液としては、例えば、　１ｍＭ以上のマグネシウ
ムイオンを含む、グリシルグリシン、ＨＥＰＥＳ、　　
トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）緩衝液等が挙げられる。

上記アビジン標識体としては、例えば、５ｕｌｌｉｖａ
ｎ、Ｍｊ　　等、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、第９５巻、第
３１１頁（１９７８年）記載の方法により、蛋白質等、
例えば、抗１ｇＧ抗体のアビジン標識体を調製すること
かでき、このａ！識体を２次抗体として用いることによ
り発光免疫測定することができる。

また、ビオチン標識ルシフェラーゼ、ＡＴＰおよびルシ
フェリンの添加量は、アビジンまたはアビジン標識体の
含有量により適宜選択すればよい。

更に、ビオチン標識ルシフェラーゼおよびアビジンを用
い、以下のようにして、ビオチンまたはビオチン標識体
を定量することができる。

ビオチンまたはビオチン標識体含有試料とアビジンおよ
びビオチン標識ルシフェラーゼとを反応させる。反応条
件としては、例えば、ｐＨは５〜９、好ましくはｐＨ７
，０前後であり、反応温度は４〜３６℃、好ましくは２
５℃前後であり、また、反応時間は１０〜１２０分間、
好ましくは３０分間前後であり、更に、緩衝液としては
、例えば、リン酸緩衝液等が挙げられる。次いで、この
反応液にＡＴＰおよびルシフェリンを添加し、生してく
る発光強度を測定し、例えば、以下の、実施例１記載の
ような検量線を使用して、試料中に含まれるビオチンま
たはビオチン標識体を定量する。反応条件としては、例
えば、反応ｐＨは６〜９、好ましくはｐ）Ｉ　７．７５
前後であり、反応温度は２０〜３０℃、好ましくは２５
℃前後であり、また、反応時間は１時間以内、好ましく
は、３０分以内であり、更に、緩衝液としては、１　ｍ
Ｍ以上のマグネシウムイオンを含む、グリシルグリシン
、ＨＥＰＥＳ。

トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）緩衝液等を用いる。また、
ビオチン標識ルシフェラーゼ、アビジン、ＡＴＰおよび
ルシフェリンの添加量は、ビオチンまたはビオチン標識
体の含有量により適宜選択すればよい。

ビオチンヒドラジド、ビオチン−アミノカプロイル−ヒ
ドラジド等を用イＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｍ１等、ＪＮｅ
ｕｒｏｃｈｅｍ、　、第４６巻、第６４１頁（１９８６
年）に記載の方法により、ペプチドおよび蛋白質、例え
ば、ＩｇＧ抗体のビオチン標識体を調製することができ
、この標識体を２次抗体として用いることにより発光免
疫Ｍｊ定することができる。

また、Ｓｐｉｅｇｅｌ、　Ｓ　＆　Ｗｉｌｃｈｅｋ、　
Ｍ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ第１２７巻、第５７２頁（
１９８１年）に記載の方法により、炭水化物のビオチン
標識体を調製することができる。

更に、ビオチン−１１−（ｌｔｌＴＰ等を用いＦｅｉｎ
ｂｅｒｇＡ、Ｐ、＆　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、　Ｂ、、
Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　第１３７巻、第２６６
頁（１９８４年）に記載の方法により、ＤＮＡのビオチ
ン標識体を調製することができ、この方法により放射性
同位体を用いることな（ＤＮＡ合成量を測定することが
でき、また、生成したビオチン標識体ＤＮＡをプローブ
として用いることによリサザンプロット法等、ＤＮＡ配
列検出等に応用することができる。

〈発明の効果〉以上の如く本発明によれば、試料中のアビジン、アビジ
ン標識体、ビオチンまたはビオチン標識体量を、迅速、
簡便かつ高感度に測定することができる。

尚、上記に於てビオチン標識体として、例えば、ビオチ
ン−アミノカプロイル−ヒドラジド、ビオチン−１１−
ｄＵＴＰ等に応用し、ＤＮＡ合成量の測定および、非放
射性ＤＮＡプローブを用いたＤＮＡ配列検出等が可能で
ある。

〈実施例〉以下に、本発明を実施例を挙げて更に詳細１こ説明する
。

実施例１１、ビオチン標識ルシフェラーゼの調製（１）試薬の調
製以下の試薬（イ）〜（ホ）を調製した。

試薬（イ）：ビオチンーＸ−ＮＨ５溶液Ｄ−ビオチニル
−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミ
ドエステル（カルビオケム社製）をジメチルホルムアミ
ドに１ｍＭ当たり　２■となるように溶解して、ビオチ
ン−Ｘ−ＮＨ５溶液を調製した。

試薬（ロ）：ルシフェラーゼ溶液特開平２−６５７８０号公報に記載の方法により得られ
たゲンジボタルルシフェラーゼを　１ｍｇ／＋ｎｊの濃
度になるように　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液［５０ｍ
ＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７，５）、５％グリセロ
ール、５００繭ＮａＣ１，５ｍＭ　ＥＤＴＡ］に溶解し
、ルシフェラーゼ溶液をＨ製した。

試薬（ハ）　：　ｌ０ｍＭ　ＡＴＰ溶液２５ｍＭ　ＨＥ
ＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，５）にＡＴＰを１０＋＋＋Ｍと
なるように溶解し、１０＋＋＋Ｍ　ＡＴＰ溶液を調製し
た。

試薬（ニ）ニルシフニリン溶液５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７，５）、１０
０ｍＭ硫酸マグネシウム水溶液および１ｍ）ＪＤ−ルシ
フェリン（シグマ社製）水溶液を８　：　０．５　：　
０．８の割合で混合し、ルシフェリン溶液を調製した。

試薬（ホ）：ＰＢＳ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に塩化ナトリウム
および子牛血清アルブミンを夫々　０９％、０１％とな
るように溶解し、ＰＢＳを調製した。

（２）標識反応試薬（ロ）１ｍＭと試薬（イ）　０．００２５〜０．１
１ＴＬ［！を混合し、水中で４時間反応させた。これら
反応液を５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液［５０ｍＭ　ＨＥ
ＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７５）、５％グリセロール、５
００ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＥＤＴＡ］に対して一晩
透析し、各反応モル比のビオチン標識ルシフェラーゼを
得た。

（３）測定上記各種ビオチン標識ルシフェラーゼを試薬（ホ）で２
０００倍に希釈したちの０１ｍ１に、試薬（ハ）　Ｏ，
’０８ｍ１！および、試薬（ニ）０４ｍＭを添加混合し
、生じる発光を発光検出器（アロカ社製アロカルミネッ
センスリーダ）により、１５秒間積算し、その結果を下
表に示した。

第　　　１　　　表２、ビオチン標識ルシフェラーゼによるアビジンの測定（１）試薬の調製以下の試薬（イ）〜（ホ）を調製した。

試薬（イ）　：　ＰＢＳ５００１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ，７，０）に塩化ナトリ
ウムおよび子牛血清アルブミンを夫々　０．９％、０１
％となるように溶解し、ＰＢＳを調製した。

試薬（ロ）：アビジン溶液アビジン（和光純薬社製）０５γＩＤＯｎｇを試薬（イ
）０１ｍＭに溶解し、アビジン溶液を調製した。

試薬（ハ）：ビオチン標識ルシフェラーゼ希釈液１、（
１）で調製しｔ：ビオチン標識ルシフェラーゼ（Ｂ／Ｌ
比＝１７の標品）を試薬（イ）を用いて５０００倍に希
釈してビオチン標識ルシフェラーゼ希釈液を調製した。

試薬（ニ）　：　２０ｍＭ　ＡＴＰ溶液２５ｍＭ　ＨＥ
ＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，５）にＡＴＰを２０ｍＭとなる
ように溶解し、２０ｍＭ　ＡＴＰ溶液を調製した。

試薬　（ホ）：ルンフェリン溶液５０＋ｅＭ　ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７，５）、１
００ｍＭ硫酸マグネシウム水溶液および１ｍＭＤ−ルシ
フェリン（シグマ社製）水溶液を８　：　０．５　：　
０．８の割合で混合し、ルシフェリン溶液を調製した。

（２）測定試薬（イ）　０．０５ｍ９、試薬（ロ）　０．１ｒａｆ
！および試薬（ハ）　０．１ｙａｆ！を混合し、室温に
て１時間反応させた後、試薬（：）　０．０８ｍ１！お
よび、試薬（ホ）０４ｍＭを添加し、生じる発光を発光
検出器（アロカ社製アロカルミネッセンスリーダ）によ
り、１５秒間積算した。結果を第１図に示す。第１図よ
り明らかな如くアビジン　１〜１０ｎｇ間で測定が可能
であった。

更に、上記検量域上のアビジンを含む試料（２および７
ｍｇ）を前記と同様の方法で測定したところ、検量線の
値とよく一致する発光強度が得られた。

３　ビオチンの定量（１）試薬の調製以下の試薬（イ）〜（へ）を調製した。

試薬（イ）　：　ＰＢＳ５０■Ｖリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に塩化ナトリウム
および子牛血清アルブミンを夫々　０．９％、０１％と
なるように溶解し、ＰＢＳを調製した。

試薬（ロ）：ビオチン溶液ビオチン　１５〜５００ｐｇを試薬（イ）　０．０５７
！に溶解し、ビオチン溶液を調製した。

試薬（ハ）：アビジン（和光純薬社製）　　１１００ｎ
を試薬（イ）０１１ＴＬｉ！　に溶解し、アビジン溶液
を調製した。

試薬（ニ）：ビオチン標識ルシフェラーゼ希釈液１、（
１）で調製したビオチン標識ルシフェラーゼ（ＢＺＬ比
＝１７の標品）を試薬（イ）を用いて５０００倍に希釈
してビオチン標識ルシフェラーゼ希釈液を調製した。

試薬（ホ）　：　ｌ０ｍＭ　ＡＴＰ溶液２５ｍＭ　ＨＥ
ＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，５）にＡＴＰを］ＯｍＭとなる
ように溶解し、１０ＩＩＩＭ　ＡＴＰ溶液を調製した。

試薬（へ）ニルシフニリン溶液５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７，５）、１０
０ｍＭ硫酸マグネシウム水溶液および１ｍＭ　Ｄ−ルシ
フェリン（シグマ社製）水溶液を８　：　０．５　：　
０．８の割合で混合し、ルシフェリン溶液を調製した。

（２）測定試薬（ロ）　０．０５ｍｆ！、試薬（ハ）０１ｍＭおよ
び、試薬（ニ）０．１−を混合し、室温で３０分間反応
させた後、試薬（ホ）　０．０８＋ｕＱおよび試薬（へ
）０４ｍＭを添加し、生じる発光を発光検出器（アロヵ
社製アロカルミネッセンスリーグ）により、１５秒間積
算し、その結果を第２図に示す。１５〜５００ｐｇのビ
オチンが測定可能であった。

更に、上記検量域上のアビジンを含む試料（５０，１０
０および２００　ｐｇ）を前記と同様の方法で測定した
ところ、検量線の値とよく一致する発光強度が得られた
。

４　本ビオチン定量法の特異性およびビオチン誘導体と
の反応性３、と同様にして、ビオチンの代わりに下表に掲げる物
質を反応させ測定した結果を下表に示す。

尿素、尿酸、クレアチンには反応せず、特異性の高いこ
とが判る。また、ビオチンの誘導体も測定可能であった
。

第　　　　２　　　　表

【図面の簡単な説明】

第１図は、アビンン量および発光量の相関を示すアビジ
ン測定用検量線を表わす図であり、また第２図は、ビオ
チン量および発光量の相関を示すビオチン測定用検量線
を表わす図である。特許出願人　　キッコーマン株式会社第１図第２図

Claims

【特許請求の範囲】１、ビオチン標識ルシフェラーゼに、アビジンまたはア
ビジン標識体含有試料を添加し、次いで、ルシフェラー
ゼ活性を測定することを特徴とするアビジンまたはアビ
ジン標識体の定量法。２、ビオチン標識ルシフェラーゼに、アビジンおよびビ
オチンまたはビオチン標識体含有試料を添加し、次いで
、ルシフェラーゼ活性を測定することを特徴とするビオ
チンまたはビオチン標識体の定量法。