JPH0499500A - アビジンまたはアビジン標識体の定量法およびビオチンまたはビオチン標識体の定量法 - Google Patents
アビジンまたはアビジン標識体の定量法およびビオチンまたはビオチン標識体の定量法Info
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は、アビジンまたはアビジン標識体の定量法およ
びビオチンまたはビオチン標識体の定量法に関する。
びビオチンまたはビオチン標識体の定量法に関する。
〈従来の技術〉
アビジンは、塩基性タンパク質の一種であり、卵白総タ
ンパク質量の約0.05%を占めている。
ンパク質量の約0.05%を占めている。
CM−セルロースを用いて調製したアビジン標品は、D
NAを含んでおらず、4個のサブユニットを有するが、
1分子当たり2分子のビオチンと結合するものである。
NAを含んでおらず、4個のサブユニットを有するが、
1分子当たり2分子のビオチンと結合するものである。
従来、アビジンの定量法としては、例えば、放射性同位
元素を用いる方法、すなわち、アビジンに[”C] ビ
オチンを特異的に結合させ、生成した複合体をベントナ
イトに吸着させ、ニトロセルロースメンブランフィルタ
−で濾過して遊離のM’C] ビオチンと分離して定量
する方法等が知られている。(R,D、Wei、Met
hodsin Enzymology” 、Vol、I
8A、ed、 p、424(1970)、S、G、Ko
renman、 B、W、0’Malley、 +Me
thods inEnzymology 、Vol、
18A、ed、 p、427(1970))また、ビオ
チンは、生体内の糖質・脂質代謝系等において炭酸固定
および炭転移反応に関与しているビタミンの一種である
。
元素を用いる方法、すなわち、アビジンに[”C] ビ
オチンを特異的に結合させ、生成した複合体をベントナ
イトに吸着させ、ニトロセルロースメンブランフィルタ
−で濾過して遊離のM’C] ビオチンと分離して定量
する方法等が知られている。(R,D、Wei、Met
hodsin Enzymology” 、Vol、I
8A、ed、 p、424(1970)、S、G、Ko
renman、 B、W、0’Malley、 +Me
thods inEnzymology 、Vol、
18A、ed、 p、427(1970))また、ビオ
チンは、生体内の糖質・脂質代謝系等において炭酸固定
および炭転移反応に関与しているビタミンの一種である
。
そして、ビオチンの定量法としては、例えば、微生物定
量法(バイオアッセイ) 〔P、Gy6rgy“Th
e Vitamins 、ed、、Vol、7. p、
303(1967))等が知られている。
量法(バイオアッセイ) 〔P、Gy6rgy“Th
e Vitamins 、ed、、Vol、7. p、
303(1967))等が知られている。
〈発明が解決しようとする課題〉
しかしながら、上記アビジンの定量法は[”C]を用い
るため、その取り扱いには厳重な管理が必要であると共
に操作が極めて繁雑である等の問題点を有し、また上記
ビオチンの定量法は、操作が繁雑であり、更に、定量値
を出すまでに長時間必要である等の欠点があった。
るため、その取り扱いには厳重な管理が必要であると共
に操作が極めて繁雑である等の問題点を有し、また上記
ビオチンの定量法は、操作が繁雑であり、更に、定量値
を出すまでに長時間必要である等の欠点があった。
〈課題を解決するための手段〉
そこで本発明者等は、上記欠点を解消すべく種々検討し
た結果、ビオチン標識ルシフェラーゼは、その発光活性
がアビジンの共存により阻害され、その阻害程度が、ア
ビジン量に依存すること等の知見を得た。
た結果、ビオチン標識ルシフェラーゼは、その発光活性
がアビジンの共存により阻害され、その阻害程度が、ア
ビジン量に依存すること等の知見を得た。
そして、ビオチン標識ルシフェラーゼに、アビジンまた
はアビジン標識体含有試料を添加し、次いで、ルシフェ
ラーゼ活性を測定すれば、試料中のアビジンまたはアビ
ジン標識体量を、迅速、簡便かつ高感度に測定できるこ
とを見出し本発明を完成した。
はアビジン標識体含有試料を添加し、次いで、ルシフェ
ラーゼ活性を測定すれば、試料中のアビジンまたはアビ
ジン標識体量を、迅速、簡便かつ高感度に測定できるこ
とを見出し本発明を完成した。
更にまた、本発明者等は、上記欠点を解消すべく種々検
討した結果、アビジンによるビオチン標識ルシフェラー
ゼ発光活性阻害は、ビオチンまたはビオチン標識体の共
存により緩和されると共に、その緩和の程度が、ビオチ
ンまたはビオチン標識体量に依存すること等の知見を得
た。
討した結果、アビジンによるビオチン標識ルシフェラー
ゼ発光活性阻害は、ビオチンまたはビオチン標識体の共
存により緩和されると共に、その緩和の程度が、ビオチ
ンまたはビオチン標識体量に依存すること等の知見を得
た。
そして、ビオチン標識ルシフェラーゼに、アビジンおよ
びビオチンまたはビオチン標識体含有試料を添加し、次
いで、ルシフェラーゼ活性を測定すれば、試料中のビオ
チンまたはビオチン標識体量を、迅速、簡便かつ高感度
に測定できることを見出し本発明を完成した。
びビオチンまたはビオチン標識体含有試料を添加し、次
いで、ルシフェラーゼ活性を測定すれば、試料中のビオ
チンまたはビオチン標識体量を、迅速、簡便かつ高感度
に測定できることを見出し本発明を完成した。
すなわち本発明は、ビオチン標識ルシフェラーゼに、ア
ビジンまたはアビジン標識体含有試料を添加し、次いで
、ルシフェラーゼ活性を測定することを特徴とするアビ
ジンまたはアビジン標識体の定量法であり、また本発明
は、ビオチン標識ルシフェラーゼに、アビジンおよびビ
オチンまたはビオチン標識体含有試料を添加し、次いで
、ルシフェラーゼ活性を測定することを特徴とするビオ
チンまたはビオチン標識体の定量法である。
ビジンまたはアビジン標識体含有試料を添加し、次いで
、ルシフェラーゼ活性を測定することを特徴とするアビ
ジンまたはアビジン標識体の定量法であり、また本発明
は、ビオチン標識ルシフェラーゼに、アビジンおよびビ
オチンまたはビオチン標識体含有試料を添加し、次いで
、ルシフェラーゼ活性を測定することを特徴とするビオ
チンまたはビオチン標識体の定量法である。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
先ず、ビオチン標識ルシフェラーゼを調製するには、ビ
オチン活性エステルとルシフェラーゼとを標識反応させ
、ビオチン標識ルシフェラーゼを得る。
オチン活性エステルとルシフェラーゼとを標識反応させ
、ビオチン標識ルシフェラーゼを得る。
ビオチン活性エステルとしては、如何なるものでもよく
、例えば、D−ビオチニル−ε−アミノカプロン酸−N
−ヒドロキシコハク酸イミドエステル(以下、ビオチン
−X−NH5と略称する)等が挙げられる。
、例えば、D−ビオチニル−ε−アミノカプロン酸−N
−ヒドロキシコハク酸イミドエステル(以下、ビオチン
−X−NH5と略称する)等が挙げられる。
ルシフェラーゼとしては、ルシフェリン−ルシフェラー
ゼ系によるATP測定に用いられるルシフェラーゼであ
れば如何なるものでもよく、例えば、ゲンジボタル、ヘ
イケボタル、アメリカホタル由来のルシフェラーゼ、更
に、それらを遺伝子組み換え法により製造したもの、あ
るいは一部改変したもの等が挙げられる。
ゼ系によるATP測定に用いられるルシフェラーゼであ
れば如何なるものでもよく、例えば、ゲンジボタル、ヘ
イケボタル、アメリカホタル由来のルシフェラーゼ、更
に、それらを遺伝子組み換え法により製造したもの、あ
るいは一部改変したもの等が挙げられる。
標識反応の条件としては、例えば、反応pHは5〜9、
好ましくはpH7,5前後であり、反応温度は4〜25
℃、好ましくは4℃前後であり、又、反応時間は3〜6
時間、好ましくは4時間であり、更に、緩衝液としては
、グリセロール、EDTA、塩化ナトリウムを含む、H
EPES、 トリス緩衝液等が挙げられ、ルシフェラー
ゼの濃度としては、1mg/mP、反応液中のビオチン
活性エステルとルシフェラーゼのモル比は、05〜50
、好ましくは、5〜20である。反応終了後、未反応の
ビオチン活性エステルを除去するには、如何なる方法で
もよく、例えば、透析により除去することができる。
好ましくはpH7,5前後であり、反応温度は4〜25
℃、好ましくは4℃前後であり、又、反応時間は3〜6
時間、好ましくは4時間であり、更に、緩衝液としては
、グリセロール、EDTA、塩化ナトリウムを含む、H
EPES、 トリス緩衝液等が挙げられ、ルシフェラー
ゼの濃度としては、1mg/mP、反応液中のビオチン
活性エステルとルシフェラーゼのモル比は、05〜50
、好ましくは、5〜20である。反応終了後、未反応の
ビオチン活性エステルを除去するには、如何なる方法で
もよく、例えば、透析により除去することができる。
上記のようにして、得られたビオチン標識ルシフェラー
ゼを用い、以下のようにして、アビジンまたはアビジン
標識体を定量することができる。
ゼを用い、以下のようにして、アビジンまたはアビジン
標識体を定量することができる。
アビジンまたはアビジン標識体含有試料とビオチン標識
ルシフェラーゼとを反応させる。反応条件としては、例
えば、反応pHは5〜9、好ましくはpH7前後であり
、反応温度は4〜36℃、好ましくは25℃前後であり
、又、反応時間は 10〜120分間、好ましくは60
分間であり、更に、緩衝液としては、例えば、リン酸緩
衝液等が挙げられる。次いで、この反応液にATPおよ
びルシフェリンを添加し、生じてくる発光強度を測定し
、例えば、以下の、実施例1記載のような検量線を使用
して、試料中に含まれるアビジンまたはアビジン標識体
を定量する。反応条件としては、例えば、反応pHは6
〜9、好ましくはpH7,75前後であり、反応温度は
4〜36、好ましくは25℃前後であり、また、反応時
間は1時間以内、好ましくは、30分以内であり、更に
、緩衝液としては、例えば、 1mM以上のマグネシウ
ムイオンを含む、グリシルグリシン、HEPES、
トリシン(Tricine)緩衝液等が挙げられる。
ルシフェラーゼとを反応させる。反応条件としては、例
えば、反応pHは5〜9、好ましくはpH7前後であり
、反応温度は4〜36℃、好ましくは25℃前後であり
、又、反応時間は 10〜120分間、好ましくは60
分間であり、更に、緩衝液としては、例えば、リン酸緩
衝液等が挙げられる。次いで、この反応液にATPおよ
びルシフェリンを添加し、生じてくる発光強度を測定し
、例えば、以下の、実施例1記載のような検量線を使用
して、試料中に含まれるアビジンまたはアビジン標識体
を定量する。反応条件としては、例えば、反応pHは6
〜9、好ましくはpH7,75前後であり、反応温度は
4〜36、好ましくは25℃前後であり、また、反応時
間は1時間以内、好ましくは、30分以内であり、更に
、緩衝液としては、例えば、 1mM以上のマグネシウ
ムイオンを含む、グリシルグリシン、HEPES、
トリシン(Tricine)緩衝液等が挙げられる。
上記アビジン標識体としては、例えば、5ulliva
n、Mj 等、FEBS Lett、、第95巻、第
311頁(1978年)記載の方法により、蛋白質等、
例えば、抗1gG抗体のアビジン標識体を調製すること
かでき、このa!識体を2次抗体として用いることによ
り発光免疫測定することができる。
n、Mj 等、FEBS Lett、、第95巻、第
311頁(1978年)記載の方法により、蛋白質等、
例えば、抗1gG抗体のアビジン標識体を調製すること
かでき、このa!識体を2次抗体として用いることによ
り発光免疫測定することができる。
また、ビオチン標識ルシフェラーゼ、ATPおよびルシ
フェリンの添加量は、アビジンまたはアビジン標識体の
含有量により適宜選択すればよい。
フェリンの添加量は、アビジンまたはアビジン標識体の
含有量により適宜選択すればよい。
更に、ビオチン標識ルシフェラーゼおよびアビジンを用
い、以下のようにして、ビオチンまたはビオチン標識体
を定量することができる。
い、以下のようにして、ビオチンまたはビオチン標識体
を定量することができる。
ビオチンまたはビオチン標識体含有試料とアビジンおよ
びビオチン標識ルシフェラーゼとを反応させる。反応条
件としては、例えば、pHは5〜9、好ましくはpH7
,0前後であり、反応温度は4〜36℃、好ましくは2
5℃前後であり、また、反応時間は10〜120分間、
好ましくは30分間前後であり、更に、緩衝液としては
、例えば、リン酸緩衝液等が挙げられる。次いで、この
反応液にATPおよびルシフェリンを添加し、生してく
る発光強度を測定し、例えば、以下の、実施例1記載の
ような検量線を使用して、試料中に含まれるビオチンま
たはビオチン標識体を定量する。反応条件としては、例
えば、反応pHは6〜9、好ましくはp)I 7.75
前後であり、反応温度は20〜30℃、好ましくは25
℃前後であり、また、反応時間は1時間以内、好ましく
は、30分以内であり、更に、緩衝液としては、1 m
M以上のマグネシウムイオンを含む、グリシルグリシン
、HEPES。
びビオチン標識ルシフェラーゼとを反応させる。反応条
件としては、例えば、pHは5〜9、好ましくはpH7
,0前後であり、反応温度は4〜36℃、好ましくは2
5℃前後であり、また、反応時間は10〜120分間、
好ましくは30分間前後であり、更に、緩衝液としては
、例えば、リン酸緩衝液等が挙げられる。次いで、この
反応液にATPおよびルシフェリンを添加し、生してく
る発光強度を測定し、例えば、以下の、実施例1記載の
ような検量線を使用して、試料中に含まれるビオチンま
たはビオチン標識体を定量する。反応条件としては、例
えば、反応pHは6〜9、好ましくはp)I 7.75
前後であり、反応温度は20〜30℃、好ましくは25
℃前後であり、また、反応時間は1時間以内、好ましく
は、30分以内であり、更に、緩衝液としては、1 m
M以上のマグネシウムイオンを含む、グリシルグリシン
、HEPES。
トリシン(Tricine)緩衝液等を用いる。また、
ビオチン標識ルシフェラーゼ、アビジン、ATPおよび
ルシフェリンの添加量は、ビオチンまたはビオチン標識
体の含有量により適宜選択すればよい。
ビオチン標識ルシフェラーゼ、アビジン、ATPおよび
ルシフェリンの添加量は、ビオチンまたはビオチン標識
体の含有量により適宜選択すればよい。
ビオチンヒドラジド、ビオチン−アミノカプロイル−ヒ
ドラジド等を用イRosenberg、M1等、JNe
urochem、 、第46巻、第641頁(1986
年)に記載の方法により、ペプチドおよび蛋白質、例え
ば、IgG抗体のビオチン標識体を調製することができ
、この標識体を2次抗体として用いることにより発光免
疫Mj定することができる。
ドラジド等を用イRosenberg、M1等、JNe
urochem、 、第46巻、第641頁(1986
年)に記載の方法により、ペプチドおよび蛋白質、例え
ば、IgG抗体のビオチン標識体を調製することができ
、この標識体を2次抗体として用いることにより発光免
疫Mj定することができる。
また、Spiegel、 S & Wilchek、
M、、 J、Immunol第127巻、第572頁(
1981年)に記載の方法により、炭水化物のビオチン
標識体を調製することができる。
M、、 J、Immunol第127巻、第572頁(
1981年)に記載の方法により、炭水化物のビオチン
標識体を調製することができる。
更に、ビオチン−11−(ltlTP等を用いFein
bergA、P、& Vogelstein、 B、、
Anal、Biochem、、 第137巻、第266
頁(1984年)に記載の方法により、DNAのビオチ
ン標識体を調製することができ、この方法により放射性
同位体を用いることな(DNA合成量を測定することが
でき、また、生成したビオチン標識体DNAをプローブ
として用いることによリサザンプロット法等、DNA配
列検出等に応用することができる。
bergA、P、& Vogelstein、 B、、
Anal、Biochem、、 第137巻、第266
頁(1984年)に記載の方法により、DNAのビオチ
ン標識体を調製することができ、この方法により放射性
同位体を用いることな(DNA合成量を測定することが
でき、また、生成したビオチン標識体DNAをプローブ
として用いることによリサザンプロット法等、DNA配
列検出等に応用することができる。
〈発明の効果〉
以上の如く本発明によれば、試料中のアビジン、アビジ
ン標識体、ビオチンまたはビオチン標識体量を、迅速、
簡便かつ高感度に測定することができる。
ン標識体、ビオチンまたはビオチン標識体量を、迅速、
簡便かつ高感度に測定することができる。
尚、上記に於てビオチン標識体として、例えば、ビオチ
ン−アミノカプロイル−ヒドラジド、ビオチン−11−
dUTP等に応用し、DNA合成量の測定および、非放
射性DNAプローブを用いたDNA配列検出等が可能で
ある。
ン−アミノカプロイル−ヒドラジド、ビオチン−11−
dUTP等に応用し、DNA合成量の測定および、非放
射性DNAプローブを用いたDNA配列検出等が可能で
ある。
〈実施例〉
以下に、本発明を実施例を挙げて更に詳細1こ説明する
。
。
実施例1
1、ビオチン標識ルシフェラーゼの調製(1)試薬の調
製 以下の試薬(イ)〜(ホ)を調製した。
製 以下の試薬(イ)〜(ホ)を調製した。
試薬(イ):ビオチンーX−NH5溶液D−ビオチニル
−ε−アミノカプロン酸−N−ヒドロキシコハク酸イミ
ドエステル(カルビオケム社製)をジメチルホルムアミ
ドに1mM当たり 2■となるように溶解して、ビオチ
ン−X−NH5溶液を調製した。
−ε−アミノカプロン酸−N−ヒドロキシコハク酸イミ
ドエステル(カルビオケム社製)をジメチルホルムアミ
ドに1mM当たり 2■となるように溶解して、ビオチ
ン−X−NH5溶液を調製した。
試薬(ロ):ルシフェラーゼ溶液
特開平2−65780号公報に記載の方法により得られ
たゲンジボタルルシフェラーゼを 1mg/+njの濃
度になるように 50mM HEPES緩衝液[50m
MHEPES−NaOH(pH7,5)、5%グリセロ
ール、500繭NaC1,5mM EDTA]に溶解し
、ルシフェラーゼ溶液をH製した。
たゲンジボタルルシフェラーゼを 1mg/+njの濃
度になるように 50mM HEPES緩衝液[50m
MHEPES−NaOH(pH7,5)、5%グリセロ
ール、500繭NaC1,5mM EDTA]に溶解し
、ルシフェラーゼ溶液をH製した。
試薬(ハ) : l0mM ATP溶液25mM HE
PES緩衝液(pH7,5)にATPを10+++Mと
なるように溶解し、10+++M ATP溶液を調製し
た。
PES緩衝液(pH7,5)にATPを10+++Mと
なるように溶解し、10+++M ATP溶液を調製し
た。
試薬(ニ)ニルシフニリン溶液
50mM HEPES−NaOH(pH7,5)、10
0mM硫酸マグネシウム水溶液および1m)JD−ルシ
フェリン(シグマ社製)水溶液を8 : 0.5 :
0.8の割合で混合し、ルシフェリン溶液を調製した。
0mM硫酸マグネシウム水溶液および1m)JD−ルシ
フェリン(シグマ社製)水溶液を8 : 0.5 :
0.8の割合で混合し、ルシフェリン溶液を調製した。
試薬(ホ):PBS
50mMリン酸緩衝液(pH7,0)に塩化ナトリウム
および子牛血清アルブミンを夫々 09%、01%とな
るように溶解し、PBSを調製した。
および子牛血清アルブミンを夫々 09%、01%とな
るように溶解し、PBSを調製した。
(2)標識反応
試薬(ロ)1mMと試薬(イ) 0.0025〜0.1
1TL[!を混合し、水中で4時間反応させた。これら
反応液を50mM HEPES緩衝液[50mM HE
PES−NaOH(pH75)、5%グリセロール、5
00mM NaC1,5mM EDTA]に対して一晩
透析し、各反応モル比のビオチン標識ルシフェラーゼを
得た。
1TL[!を混合し、水中で4時間反応させた。これら
反応液を50mM HEPES緩衝液[50mM HE
PES−NaOH(pH75)、5%グリセロール、5
00mM NaC1,5mM EDTA]に対して一晩
透析し、各反応モル比のビオチン標識ルシフェラーゼを
得た。
(3)測定
上記各種ビオチン標識ルシフェラーゼを試薬(ホ)で2
000倍に希釈したちの01m1に、試薬(ハ) O,
’08m1!および、試薬(ニ)04mMを添加混合し
、生じる発光を発光検出器(アロカ社製アロカルミネッ
センスリーダ)により、15秒間積算し、その結果を下
表に示した。
000倍に希釈したちの01m1に、試薬(ハ) O,
’08m1!および、試薬(ニ)04mMを添加混合し
、生じる発光を発光検出器(アロカ社製アロカルミネッ
センスリーダ)により、15秒間積算し、その結果を下
表に示した。
第 1 表
2、ビオチン標識ルシフェラーゼによるアビジンの測定
(1)試薬の調製
以下の試薬(イ)〜(ホ)を調製した。
試薬(イ) : PBS
5001Mリン酸緩衝液(pH,7,0)に塩化ナトリ
ウムおよび子牛血清アルブミンを夫々 0.9%、01
%となるように溶解し、PBSを調製した。
ウムおよび子牛血清アルブミンを夫々 0.9%、01
%となるように溶解し、PBSを調製した。
試薬(ロ):アビジン溶液
アビジン(和光純薬社製)05γIDOngを試薬(イ
)01mMに溶解し、アビジン溶液を調製した。
)01mMに溶解し、アビジン溶液を調製した。
試薬(ハ):ビオチン標識ルシフェラーゼ希釈液1、(
1)で調製しt:ビオチン標識ルシフェラーゼ(B/L
比=17の標品)を試薬(イ)を用いて5000倍に希
釈してビオチン標識ルシフェラーゼ希釈液を調製した。
1)で調製しt:ビオチン標識ルシフェラーゼ(B/L
比=17の標品)を試薬(イ)を用いて5000倍に希
釈してビオチン標識ルシフェラーゼ希釈液を調製した。
試薬(ニ) : 20mM ATP溶液25mM HE
PES緩衝液(pH7,5)にATPを20mMとなる
ように溶解し、20mM ATP溶液を調製した。
PES緩衝液(pH7,5)にATPを20mMとなる
ように溶解し、20mM ATP溶液を調製した。
試薬 (ホ):ルンフェリン溶液
50+eM HEPES−NaOH(pH7,5)、1
00mM硫酸マグネシウム水溶液および1mMD−ルシ
フェリン(シグマ社製)水溶液を8 : 0.5 :
0.8の割合で混合し、ルシフェリン溶液を調製した。
00mM硫酸マグネシウム水溶液および1mMD−ルシ
フェリン(シグマ社製)水溶液を8 : 0.5 :
0.8の割合で混合し、ルシフェリン溶液を調製した。
(2)測定
試薬(イ) 0.05m9、試薬(ロ) 0.1raf
!および試薬(ハ) 0.1yaf!を混合し、室温に
て1時間反応させた後、試薬(:) 0.08m1!お
よび、試薬(ホ)04mMを添加し、生じる発光を発光
検出器(アロカ社製アロカルミネッセンスリーダ)によ
り、15秒間積算した。結果を第1図に示す。第1図よ
り明らかな如くアビジン 1〜10ng間で測定が可能
であった。
!および試薬(ハ) 0.1yaf!を混合し、室温に
て1時間反応させた後、試薬(:) 0.08m1!お
よび、試薬(ホ)04mMを添加し、生じる発光を発光
検出器(アロカ社製アロカルミネッセンスリーダ)によ
り、15秒間積算した。結果を第1図に示す。第1図よ
り明らかな如くアビジン 1〜10ng間で測定が可能
であった。
更に、上記検量域上のアビジンを含む試料(2および7
mg)を前記と同様の方法で測定したところ、検量線の
値とよく一致する発光強度が得られた。
mg)を前記と同様の方法で測定したところ、検量線の
値とよく一致する発光強度が得られた。
3 ビオチンの定量
(1)試薬の調製
以下の試薬(イ)〜(へ)を調製した。
試薬(イ) : PBS
50■Vリン酸緩衝液(pH7,0)に塩化ナトリウム
および子牛血清アルブミンを夫々 0.9%、01%と
なるように溶解し、PBSを調製した。
および子牛血清アルブミンを夫々 0.9%、01%と
なるように溶解し、PBSを調製した。
試薬(ロ):ビオチン溶液
ビオチン 15〜500pgを試薬(イ) 0.057
!に溶解し、ビオチン溶液を調製した。
!に溶解し、ビオチン溶液を調製した。
試薬(ハ):アビジン(和光純薬社製) 1100n
を試薬(イ)011TLi! に溶解し、アビジン溶液
を調製した。
を試薬(イ)011TLi! に溶解し、アビジン溶液
を調製した。
試薬(ニ):ビオチン標識ルシフェラーゼ希釈液1、(
1)で調製したビオチン標識ルシフェラーゼ(BZL比
=17の標品)を試薬(イ)を用いて5000倍に希釈
してビオチン標識ルシフェラーゼ希釈液を調製した。
1)で調製したビオチン標識ルシフェラーゼ(BZL比
=17の標品)を試薬(イ)を用いて5000倍に希釈
してビオチン標識ルシフェラーゼ希釈液を調製した。
試薬(ホ) : l0mM ATP溶液25mM HE
PES緩衝液(pH7,5)にATPを]OmMとなる
ように溶解し、10IIIM ATP溶液を調製した。
PES緩衝液(pH7,5)にATPを]OmMとなる
ように溶解し、10IIIM ATP溶液を調製した。
試薬(へ)ニルシフニリン溶液
50mM HEPES−NaOH(pH7,5)、10
0mM硫酸マグネシウム水溶液および1mM D−ルシ
フェリン(シグマ社製)水溶液を8 : 0.5 :
0.8の割合で混合し、ルシフェリン溶液を調製した。
0mM硫酸マグネシウム水溶液および1mM D−ルシ
フェリン(シグマ社製)水溶液を8 : 0.5 :
0.8の割合で混合し、ルシフェリン溶液を調製した。
(2)測定
試薬(ロ) 0.05mf!、試薬(ハ)01mMおよ
び、試薬(ニ)0.1−を混合し、室温で30分間反応
させた後、試薬(ホ) 0.08+uQおよび試薬(へ
)04mMを添加し、生じる発光を発光検出器(アロヵ
社製アロカルミネッセンスリーグ)により、15秒間積
算し、その結果を第2図に示す。15〜500pgのビ
オチンが測定可能であった。
び、試薬(ニ)0.1−を混合し、室温で30分間反応
させた後、試薬(ホ) 0.08+uQおよび試薬(へ
)04mMを添加し、生じる発光を発光検出器(アロヵ
社製アロカルミネッセンスリーグ)により、15秒間積
算し、その結果を第2図に示す。15〜500pgのビ
オチンが測定可能であった。
更に、上記検量域上のアビジンを含む試料(50,10
0および200 pg)を前記と同様の方法で測定した
ところ、検量線の値とよく一致する発光強度が得られた
。
0および200 pg)を前記と同様の方法で測定した
ところ、検量線の値とよく一致する発光強度が得られた
。
4 本ビオチン定量法の特異性およびビオチン誘導体と
の反応性 3、と同様にして、ビオチンの代わりに下表に掲げる物
質を反応させ測定した結果を下表に示す。
の反応性 3、と同様にして、ビオチンの代わりに下表に掲げる物
質を反応させ測定した結果を下表に示す。
尿素、尿酸、クレアチンには反応せず、特異性の高いこ
とが判る。また、ビオチンの誘導体も測定可能であった
。
とが判る。また、ビオチンの誘導体も測定可能であった
。
第 2 表
第1図は、アビンン量および発光量の相関を示すアビジ
ン測定用検量線を表わす図であり、また第2図は、ビオ
チン量および発光量の相関を示すビオチン測定用検量線
を表わす図である。 特許出願人 キッコーマン株式会社 第1図 第2図
ン測定用検量線を表わす図であり、また第2図は、ビオ
チン量および発光量の相関を示すビオチン測定用検量線
を表わす図である。 特許出願人 キッコーマン株式会社 第1図 第2図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、ビオチン標識ルシフェラーゼに、アビジンまたはア
ビジン標識体含有試料を添加し、次いで、ルシフェラー
ゼ活性を測定することを特徴とするアビジンまたはアビ
ジン標識体の定量法。 2、ビオチン標識ルシフェラーゼに、アビジンおよびビ
オチンまたはビオチン標識体含有試料を添加し、次いで
、ルシフェラーゼ活性を測定することを特徴とするビオ
チンまたはビオチン標識体の定量法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP21575890A JPH0499500A (ja) | 1990-08-17 | 1990-08-17 | アビジンまたはアビジン標識体の定量法およびビオチンまたはビオチン標識体の定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP21575890A JPH0499500A (ja) | 1990-08-17 | 1990-08-17 | アビジンまたはアビジン標識体の定量法およびビオチンまたはビオチン標識体の定量法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0499500A true JPH0499500A (ja) | 1992-03-31 |
Family
ID=16677743
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP21575890A Pending JPH0499500A (ja) | 1990-08-17 | 1990-08-17 | アビジンまたはアビジン標識体の定量法およびビオチンまたはビオチン標識体の定量法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0499500A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007232384A (ja) * | 2006-02-27 | 2007-09-13 | Sysmex Corp | クロマトグラフィー用試験具及びその製造方法 |
JP2008022849A (ja) * | 2006-07-24 | 2008-02-07 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | ビオチン標識ウミホタルルシフェラーゼ・ストレプトアビジン複合体製造法及びその安定法 |
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JPS60138463A (ja) * | 1983-10-21 | 1985-07-23 | ヘモジエネテイツクス,インコ−ポレイテイド | ルシフエラ−ゼを使用する不均質免疫測定法 |
JPS62124446A (ja) * | 1985-07-10 | 1987-06-05 | バイエル・コーポレーシヨン | 光学発光法 |
JPH03206898A (ja) * | 1989-09-29 | 1991-09-10 | F Hoffmann La Roche Ag | クラミジア・トラコーマチスの検出方法およびそのためのキット |
JPH04504059A (ja) * | 1989-03-10 | 1992-07-23 | ミリポア・コーポレーシヨン | 化学発光検出を用いた核酸の配列決定 |
-
1990
- 1990-08-17 JP JP21575890A patent/JPH0499500A/ja active Pending
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JPS60138463A (ja) * | 1983-10-21 | 1985-07-23 | ヘモジエネテイツクス,インコ−ポレイテイド | ルシフエラ−ゼを使用する不均質免疫測定法 |
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JPH04504059A (ja) * | 1989-03-10 | 1992-07-23 | ミリポア・コーポレーシヨン | 化学発光検出を用いた核酸の配列決定 |
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