JPH0466508A - 抗菌剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な抗菌剤に関し、より詳しくはアンヒド
ロフルピン酸（Ａｎｈｙｄｒｏｆｕｌｖｉｃ　Ａｃ１ｄ
）を含んでなる安全性の高い抗菌剤に関する。

〔発明の背景〕

本発明のアンヒドロフルピン酸と共通の母核を有するフ
ルビン酸は、ペニシリウム・グリゼオフルバム（Ｐｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｕｍ　Ｕ圓匹ハ旦叩）やセリコスポーラ・
ベチコーラ（並匹匹把胆ｂｅｔｉｃｏｌａ）などにより
生産されていることが知られている（例えば、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、Ｊ、２９．１１０２．１９３５およびＡｇｒｉ
、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅａ＋、、　４５．１２７５．１９８１）　、しか
し、この化合物が示す特徴としては、テンサイの葉を黄
変させるとか、培養液中の黄色針状性、酸性代謝物とし
てとらえられ、抗菌性化合物としての評価は不明である
。

また、アンヒドロフルピン酸は、フルビン酸の構造を解
析するうえでの確認サンプルとして合成されているが（
Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓ、Ｉ
、　３８９１９８７）　、その生理活性は何ら調べられ
ていない。

ところで、従来より各種の抗生物質等が抗菌剤として開
発され、そして現実に使用されてきたが、各種病原菌の
多様性ならび使用薬剤の病原菌に対する活性の特異性お
よび生体に対する毒性を・考慮すると、さらに新な抗菌
剤の開発が必要である。

そこで、本発明は毒性の少ない抗菌剤、特に抗真菌剤を
提供することを目的とする。

本発明者らは、かかる目的を達成すべく、新な抗真菌剤
の事前評価系として近年注目されてきたサクシネートオ
キシダーゼ系を用いることに着目した。即ち、サクシネ
ートオキシダーゼに対する阻害活性に関して、例えばフ
ルトラニールのごとく哺乳類と真菌類のそれに対する効
能が異る化合物が注目され出しており（八ｇｒｉ、Ｂｉ
ｏ１．ｃｈｅｍ、、　５２１４４５　１９８１）　、こ
れらの系が毒性の少ない抗真菌剤の事前評価系として使
用できると考えられるからである。そこで本発明者らは
、抗真菌活性を有する菌体培養液につき、細胞レベルで
の呼吸機能阻害活性を検討し、さらにその陽性部につき
、キャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉ
ｌｉｓ）より調製したミトコンドリアを用い、サクシネ
ートオキシダーゼ系活性を測定した。こうして数多くの
細胞レヘル呼吸機能阻害物の中から、サクシネートオキ
シダーゼ系活性を阻害するものとして、ペニシリウム・
ファシダム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｆａｃｉｄｕｍ
）（新種）の培養液を選出し、さらにその培養液中より
抗真菌阻害活性、呼吸阻害活性及びサクシネートオキシ
ダーゼ系阻害活性を有する区分を精製し、その結果、真
菌類に対して特異的に極めて低い濃度で増殖阻害活性を
有するアンヒドロフルピン酸を見い出し、この発明を完
成した。

〔発明の構成〕

本発明によれば、次式 で示されるアンヒドロフルピン酸を含んでなる新規な抗
菌剤が提供される。

本発明で用いるアンヒドロフルピン酸は、前述のごとく
フルビン酸の構造解析をするうえで合成されておりそれ
自体公知であるが、これらが何等かの生理活性を有する
かは知られていないばかりでなく、ハタテリアや動物細
胞について増殖活性阻害を示さず、皮膚真菌類や植物病
原糸状菌に極めて優位に増殖阻害効果を起こすことは、
本発明によって初めて、開示されるものである。当該化
合物は、詳細については後述するごとくペニシリウム属
に属する微生物によって生産できるが、それが本発明の
効果を奏する限り、前記のような既知の合成方法を包含
する化学的合成方法によって製造されるものも使用する
ことができる。

この化合物を有効成分として含有する抗菌剤は、本化合
物により細胞レベルの呼吸が阻害される微生物、特に真
菌および酵母に起因する動物および植物の疾病または病
気あるいは環境汚染（例えば、壁塗装面のカビ発生）を
予防または治療するのに有効である。このような微生物
の例としては、す・ッカロミセス（ガμ神叩ｙｅｓ）　
、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、シゾサツカロミセ
ス（Ｓｈ　１ｚｏｓａｃｃｈａｒ。

町ｓ−卯）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）　、リ
ゾプス（助力個用）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）　、ペニ
シリウム（Ｐｅｎｉｃｉ　ｌｌｉｕｍ）およびアスベリ
ギ／Ｌ／　’；ｌ　（ハ匹４ＬＪ−１−時）属に属する
ものが挙げられる。

また、本発明の剤形は適用微生物、適用方法に応じてそ
れぞれ適当に選ぶことができるが、具体的なものとして
は、ヒト皮膚用剤または注射用剤、植物病原糸状菌カビ
粉剤、乳剤または水和剤および塗料等への添加組成物が
挙げられる。なお、これらの剤形は適用対象によって限
定されるものではないが、各種適用対象に応じる代表的
な製剤について以下に説明する。

抗真菌剤として用いる場合には、本化合物が皮膚用抗真
菌剤中に任意の割合で配合されるが、通常は抗真菌剤全
量に対し、０．０５〜５０重量％好ましくは、０．１〜
３０％の範囲で用いられる。さらに、本発明の抗真菌剤
は性能向上のために種々の公知成分を含有させることが
できる。これらの成分としては、当該技術分野で既知の
、例えば界面活性剤、賦形剤、結合剤、懸濁化剖、乳化
剤、分散剤、増粘剤、安定剤、湿潤剤のような添加側な
どがあげられる。この界面活性剤としては、アルキル硫
酸エステル塩などのようなアニオン１面活性剤、アルキ
ルトリメチルアンモニウムハライドのようなカチオン界
面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート
のような非イオン界面活性剤、アルキルスルホベタイン
のような両面界面活性剤などがあげられる。

次に、植物病原糸状菌を対象にする農園芸用殺菌剤とし
て本化合物を用いる場合には、製剤系として、例えば、
溶液、エマルジョン、懸濁液、微粉末、粉末、ペースト
、顆粒に加工することができ、対象とする病原菌により
剤形を変えることができる。

製剤は、公知の方法で、例えば有効物質を溶剤及び／又
は賦形剤で、場合により乳化剤及び分散補助剤を使用し
て増量することにより製造することができる。この際、
溶剤としては、水、アルコール類（例えば、メチルアル
コール、エチレングリコール等）、芳香族化合物（例え
ば、ベンゼン、トルエン等）、ケトン類（例えば、アセ
トン、メチルエチルケトン）、アミン（例えば、ニチノ
ールアミン等）などが適当であり、これらの１種又は２
種以上を使用することもできる。

賦形剤としては、カチオン、ベントナイト、等の粘度類
、タルク、葉ろう石などのタルク類、珪藻土、ホワイト
カーボンなどの酸化物やダイズ粉、ＣＭＣなどの植物性
粉末などが適当であり、これらの１種又は２種以上を使
用してもよい。

乳化剤としては、非イオン性及び陰イオン性乳化剤（例
えば、アルキルスルホネート及び了り−ルスルホネート
）及び分散剤（例えば、リグニン、メチルセルロース）
が挙げられる。

本化合物を農園芸用抗真菌剤として施用する際に、乳剤
の形で使用する場合には、本化合物を１０〜５０％、溶
剤を１０〜８０％、界面活性剤を３〜２０％の適当な割
合で混合したものを原液とし、使用時に水で所定濃度に
希釈し、これを散布などの方法によって用いる。また水
和剤の形で使用する場合は、本化合物を２〜８０％なら
びに賦形剤ｌＯ〜９０％および界面活性剤１〜２０％を
適当な割合に混合し乳剤の場合と同じように水などで希
釈して使用する。

また、本化合物に加えそれ自体公知の抗菌剤を前記製剤
に添加することもできる。

本発明の有効成分として用いるアンヒドロフルピン酸は
、前述のごとく化学合成的に製造することができるが、
本発明者により見い出された本化合物を生産することの
できる微生物を栄養培地で培養する下記の方法によって
製造することもできる。

このような生産能を有する微生物は、土壌などの微生物
分離源から常法に従って、例えばペニシリウム属に属す
る菌を分離し、次にこれらの培養液を用いてキャンディ
ダ・ユティリスに対する抗菌性について試験して選択す
ることにより得られる。

本発明化合物の製造に際し、前期ペニシリウム属の培養
に使用される培地は、液状でも固状でもよいが、通常は
液体培地による振盪培養又は通気攪拌培養が便利である
。培地はアンヒドロフルピン酸の生産菌を生育して、培
地中に本発明の有効物質を蓄積するものであればどのよ
うなものでもよい。即ち、炭素源としては、例えば、グ
ルコース、ラクトース、グリセリン、デンプン、シュー
クロース、デキストリン、糖蜜、有機類などが、また窒
素源としては、例えばペプチド、カザミノ酸などの蛋白
質加水分解物、肉エキス、酵母エキス、大豆粕、コーン
ステイープリカー、アミノ酸類、アンモニア塩、硝酸塩
その他の各種を機あるいは無機窒素化合物が用いられる
。無機塩としては各種燐酸塩、硫酸マグネシウム、塩化
ナトリウムを添加してもよく、また菌の生育を促進する
目的でビタミン類、核酸関連化合物などを添加してもよ
い。なお、シリコン、ポリプロピレングリコール誘導体
、大豆油などの消泡剤を培地に添加することが本発明物
質の蓄積量を増大させるのに有効である場合もある。培
養にあたっては、いきなり本培養をするよりはあらかじ
め小規模な前培養を行なって得られる培養物を培地に接
触するのが望ましい。培養温度、培養期間、培養の液性
などの条件は、本発明の蓄積量が最大となるように適当
に選択、調節されるが、多くの場合、好気的条件下に２
５°Ｃ〜３５°Ｃ１２〜３日の培養でよく、また培地の
液性はｐＨ５，５〜７．２に保つのがよい。

こうして、培養中にアンヒドロフルピン酸が生成蓄積さ
れる。液体培地を用いて培養した場合には、主としてそ
の液状部分に目的物が蓄積されるので、培養物を一旦濾
過あるいは遠心分離して菌体を除去した後の濾液あるい
は上清液からこれを分離するのが好ましいが、必要に応
じて菌体を除去することなく培養液から直接目的物を分
離することもできる。アンヒドロフルピン酸を採取する
ためにはキャンディダ・アルビカンスを被検菌とするペ
ーパーディスク法による生物検定により定量される。

培養液からのアンヒドロフルピン酸の精製に際しては、
例えば培養液をダイアイオンＨＰ−２０（−菱化成製）
カラムにかけ、水洗後、メタノール溶出し、それを乾固
した後、クロロホルムに溶かして、ｐＨ９，０の水で抽
出する。さらにこの水層をｐＨ３，０にしてクロロホル
ムで抽出、さらにこれを濃縮しシリカゲルにかけ、クロ
ロホルム−メタノールで分画する。９９％クロロホルム
画分を乾固し、ＤＭＦに溶解、水を加えて沈殿させる。

この沈殿を、メタノールで洗浄、不溶物をＤＭＦ−水で
再結晶させることにより、強力な抗菌活性を有するアン
ヒドロフルピン酸を黄色針状結晶として得ることができ
る。これは、標準合成品とＮＭＲ的に一致する。

［作　用］ こうして得られるアンヒドロフルピン酸は、その生理活
性、例えばキャンディダ・ユティリス細胞に対する呼吸
阻害活性を測定することによって本発明の効果の一端を
確認することができる。この阻害活性について、１２ｍ
Ｍのグルコース存在下、Ｃ１ａｒｋ−ｔｙｐｅ酸素電極
モデル１００による酸素消費量で測定した場合、アンヒ
ドロフルピン酸は、６．２５■／　ｔｔｒ１以下の濃度
で呼吸阻害を呈することが判明した。キャンディダ・ユ
ティリス菌体を使い常法により調整したミトコンドリア
を用いて、サクシネートオキシゲナーゼ系及びＮＡＤＨ
オキシダーゼ系の活性を測定したところ、サクシネート
オキシダーゼ系はアンヒドロフルピン酸１．５６■／　
ｄ　（０，３４禮）の濃度以上で完全に阻害された。一
方、ＮＡＤＩ（オキシダーゼ系は、６．２５ｇ／−以上
のアンヒドロフルピン酸によってもほとんど阻害されず
、本化合物がサクシネート系のサクシネートから、Ｃｏ
Ｑまでの系、即ち、サクシネートデヒドロゲナーゼを含
むＣｏｍｐｌｅｘ　ＩＩが作用点であることを明らかに
した。動物と真菌とのＣｏｍｐｌｅｘ　Ｈばタイプが異
なるとの情報があり、これが動物に対する低毒性の原因
であろうと推定される。

ＭＪ！Ｌ！ｆｉ潰− また、本化合物は、常法のＹＭ液体培地希釈法により次
の第１表の示すような各種微生物乙こ対する最小阻止濃
度（ＭＩＣ）を示す。比較として示す共通の母核を有す
るフルビン酸のそれとの対比により、本化合物の抗菌剤
としての有用性が理解できるであろう。

ｌ　−、、、、！−−−表 アンヒドロフルビン　とフルビン　の坑且菌−活性以下
余白 なお、前述の細胞に対する呼吸阻害活性は、具体的には
下記のように測定することができる。

の−Ｓ キャンディダ・ｊ−ティリス（Ｃ，ｕｔｉｌｉｓ）ＡＴ
ＣＣ４２４０２を指標菌として用い、生菌に対する呼吸
阻害を見た。あらかじめＹＭ液体培地を用い、対数増殖
中期まで培養させた菌体を５０１１Ｉｌ酒石酸・ＮａＯ
Ｈ緩衝液（ｐＨ３，０）で洗浄し懸濁させた菌液を作成
した。

その一部は飢餓細胞化させるために、さらに２２時間、
２５℃にて浸透した。これら２つの菌液に所定の濃度の
アンヒドロフルピン酸を添加し、飢餓処理したものには
さらに最終濃度ＩＩＩＭとなるようにグルコースを加え
、６０分後の呼吸活性を酵素電極を用いて測定した。そ
の結果、どちらの場合にも同様に呼吸活性が阻害された
ことから、基質の取り込みや解糖系が阻害されるのでな
く、アンヒドロフルピン酸はミトコンドリアに直接作用
するものと思われる。結果を表２に示す。

１ユじし一表 ６．２５ ５＝２２　　　　　　　　４．０９ 前記と同様にしてえられたＣ、ｕｔｉｌｉｓ菌体を５０
％スクロース、５０ｍＭ　）リス・ＨＣｌ２　　ｉ　ｎ
＋Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，５）に懸濁させグラスビーズ
法により菌体破壊を行ない、スクロース密度勾配遠心に
よりミトコンドリア画分を得た。このミトコンドリア調
製物を用い所定濃度のアンヒドロフルピン酸（０，３９
〜２５〜／ｄ）を添加した条件におけるＮＡＤＨ及びコ
ハク酸塩に由来する酸素消費量を見た。結果を表３に示
す。

この表では、アンヒドロフルピン酸無添加（対照）にお
ける酸素消費量を１００として相対値で値を示しである
０表３の結果からアンヒドロフルピン酸によりＮＡＤＨ
オキシダーゼの阻害はほとんど認められず、これに対し
、コハク酸オキシダーゼは０．３９Ｊｉｇ　／　Ｉｄ　
、　２２ｍＭという極めて低濃度においても活性阻害が
認められたことから、本発明のアンヒドロフルピン酸の
阻害作用点はコハク酸からＣｏ口に至る経路、即ちコハ
ク酸デヒドロゲナーゼを含むＣｏｍｐｌｅｘ　ＩＩであ
ることが推定される。

１２．５ ６．２５ ３．１３ １．５６ ０．７８ ０．３９ ５．４ １．３ ０．３４ ０．０８６ ０．０２２ ８１．６０ Ｂ５．２０ ９０．４８ 皇−性 アンヒドロフルピン酸は、動物、植物にはほとんど毒性
を示さない（例えば、マウスに対して腹腔内投与した場
合のＬＤＳ。は２００■以上である）。

以上のごとく、本発明の有効成分であるアンヒドロフル
ピン酸は、それ単独で極めて特異的な作用機序を示し、
かつ強い抗菌活性を有することから、これらの活性に悪
影響を及ぼさない限りどのような組成物または剤形であ
っても所期の効果を奏することは明らかである。特に、
前述した各種剤形で対象動物または植物に適用または施
用することができる。

本発明の有効成分であるアンヒドロフルピン酸の適量は
、適用対象（例えば、ヒトまたは植物）における処置微
生物、ヒトにおいてはその年齢および個々の症状ならび
に適用様式によって大きく左右されるので限定的でない
。約６５ｋｇの体重を有するヒトの療法に使用される１
日量（経口または非経口的）は、約５０■〜５００■で
ある。なお、当業者であれば各効能に対する簡単な予備
試験を行うことによって容易に最適用量を決定すること
ができるであろう。

〔実施例］ 以下の各側は、本発明をより具体的に説明する目的で提
供する。

Ｍ１■ニー陪秀 グルコース１．８％、ポリペプトン０．５％、酵母エキ
ス０．３％、ＫＨ２ＰＯ４０，１７％、ＫＨ２ＰＯ４０
，］、４％、Ｍｇ５０・７ＦＩ２００．００５％からな
る液体培地を５００〆フラスコの１００ＲｉＶ、づつ分
注し滅菌したもの３個に、本発明のＳＡＭ　２５７０株
を植菌し２５°Ｃにて１週間浸透培養を行なった。この
培養物の全量を、上記培地組成にさらに０．７５％の酒
石酸を添加し、ｐＨ２，０に調整した培地１０Ｌを２Ｏ
Ｌファーメンタ−にいれ滅菌処理した後添加し、２５゛
Ｃにおいて１週間通気撹拌培養を行なった。培養後、菌
体を濾過法により除去することにより、培養濾液９．２
Ｌを得た。

ＪＬ、　−一製 前記培養で得られた培養濾液９．２ＬをダイヤイオンＨ
Ｐ−２０（三菱化成製）カラム（１０Ｘ３８ｃｍ）にか
け、水洗後、メタノールで溶出し、それの減圧乾固物を
５００ｊ＋１のアルカリ水（ｐＨ９，０）で溶出した。

この抽出水層をｐＨ３に低下させ、５００〆のクロロホ
ルムで抽出し、減圧濃縮させた。この濃縮物をシリカゲ
ルカラム（４Ｘ３０）にかけクロロホルム：メタノール
（９９：１）混液を用い溶出させ減圧乾固した。乾固物
をジメチルホルムアミドに溶解させた後、水を加え沈殿
物を得た。沈殿物はメタノールで洗浄し、さらに純度を
高めるために再度、ジメチルホルムアミド処理を行なっ
た結果、２５０■の黄色針状結晶物を得た。本化合物の
ＮＭＲスペクトルは合成アンヒドロフルピン酸と一致し
た。

製剤例１ 下記の処方にしたがって常法により軟膏剤を調製した。

白色ワセリン　　　　　　　　　　　　　２５．０％ス
テアリンアルコール　　　　　　　　　２２．０プロピ
レングリコール　　　　　　　　　１２．０ラウリル硫
酸ナトリウム　　　　　　　　２．０バラオキシ安息香
酸エチル　　　　　　　０．３パラオキシ安息香酸プロ
ピル　　　　　　０．２アンヒドロフルピン酸　　　　
　　　　　５．０サリチル酸　　　　　　　　　　　　
　　　０．１精製水　　　　　　　　　　　　　　　　
残余全ｉｔ　　　　　　　　１００．０％ 製剤例２ 下記の処方にしたがって常法により外用液剤を調製した
。

以下余日 塩酸ジフェンヒドラミン グリチリル酸ジカリウム アンヒドロフルピン酸 ラウロマクロゴール クエン酸 水 １．０％ ０．５ ５．０ ０．５ ０．１ 残余 １００．０％ り水和剤を調製 ２ｏ　　農剰嗟月胱漬−菌創 製剤例１ 下記の処方にしたがって常法ｔ、二よ した。

珪藻土 アルキルヘンゼンスルホン酸 アンヒドロフルピン酸 ７５．０％ ５．０ ２０．０ １００．０％ ※使用する場合には、本則をリン酸でｐＨ＝３．０〜４
．０になるように希釈する。

製剤例２ 下記の処方にしたがって常法により水和剤を調製した。

ホワイトカーボン　　　　　　　　　　　１０００％珪
藻±　　　　　　　　　　　　　　　　４７．０ツルポ
ール５０３９　（＊　）　　　　　　　　　　　３．０
アンヒドロフルピン酸　　　　　　　　　４０．０１０
０．０％ 本東邦化学工業社商標、ポリオキシエチレンアルキルア
リールエーテルスルホネートを主成分とする界面活性剤 ※使用する場合には、末剤をリン酸でＰＨ＝３．０〜４
．０になるように希釈する。

製剤例３ 下記の処方にしたがって常法により乳剤を調製した。

キシレン　　　　　　　　　　　　　　　２５．０％ジ
メチルホルムアミド　　　　　　　　　３０．０ツルポ
ール３００５Ｘ（＊　）　　　　　　　　　　　１５．
０アンヒドロフルピン酸　　　　　　　　　３０．０１
００．０％ 本東邦化学工業社商標、非イオン系界面活性剤と陰イオ
ン性界面活性剤との混合物 〔発明の効果〕 本発明によれば、微生物、特に真菌類には強い毒性（生
育阻害活性）を示すが、動物および植物に殆ど毒性を示
さず、選択的かつ安全性の高い抗菌剤が徒供される。か
かる抗菌剤は、その有効成分としてアンヒドロフルピン
酸を用いることによって所期の効果を奏することができ
る。

以下余白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるアンヒドロフルビン酸（Ａｎｈｙｄｒｏｆｕ
   ｌｖｉｃＡｃｉｄ）を含んでなる抗菌剤。