JPH0458899A - Detection of nucleic acid and cell for detection of nucleic acid used therefor - Google Patents
Detection of nucleic acid and cell for detection of nucleic acid used thereforInfo
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の背景〕
産業上の利用分野
本発明は核酸の検出法に関する。さらに詳しくは本発明
は、例えば遺伝子診断分野において、遠心操作によって
核酸を膜に固定し、ハイブリダイゼーション法によって
その膜に固定された核酸を検出する方法ならびにその方
法に用いる容器に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION BACKGROUND OF THE INVENTION Field of Industrial Application The present invention relates to a method for detecting nucleic acids. More specifically, the present invention relates to a method for fixing nucleic acids to a membrane by centrifugation and detecting the nucleic acids fixed to the membrane by hybridization, for example in the field of genetic diagnosis, and a container used in the method.
従来の技術
核酸の特異的塩基配列を検出するためのハイブリダイゼ
ーション法としては、例えば担体に吸着された核酸と溶
液中の核酸とをハイブリダイズする固−液ハイブリダイ
ゼーション法や、溶液中の核酸同士をハイブリダイズす
る液−液ハイブリダイゼーション法が知られている（Ａ
ｎａｌ、Ｂｌｏｃｈｅｍ。Conventional techniques Hybridization methods for detecting specific base sequences of nucleic acids include, for example, solid-liquid hybridization methods in which nucleic acids adsorbed on a carrier are hybridized with nucleic acids in a solution, and nucleic acids in a solution are hybridized with each other. A liquid-liquid hybridization method is known that hybridizes (A
nal, Blochem.
１１３９、１−２５（１９８８） ）。1139, 1-25 (1988)).
前者の典型的な例としてはサザンハイプリダイゼーショ
ン法とドツトハイブリダイゼーション法とがある。Typical examples of the former include Southern hybridization and dot hybridization.
サザンハイプリダイゼーション法とは、目的の遺伝子を
制限酵素で消化し、電気泳動によりそれらの断片をその
大きさに従って分離した後、膜に転写して検出する方法
である。この方法によれば、目的の遺伝子の存在のみな
らず、そのまわりの制限酵素の切断部位の存否に関する
情報も得られる。The Southern hybridization method is a method in which a gene of interest is digested with restriction enzymes, the fragments are separated according to their size by electrophoresis, and then transferred to a membrane and detected. According to this method, information regarding not only the presence of the target gene but also the presence or absence of restriction enzyme cleavage sites around it can be obtained.
ただし、この方法は非常に煩雑である。However, this method is very complicated.
一方、ドツトハイブリダイゼーション法は、何らかの方
法によって核酸を精製あるいは粗精製し、これを直接膜
に固定してハイブリダイゼーションを行う方法である。On the other hand, the dot hybridization method is a method in which nucleic acids are purified or roughly purified by some method, and then hybridized by directly immobilizing the nucleic acids on a membrane.
サザンハイプリダイゼーション法と比較すると非常に簡
易である。ただし、得られる情報は目的の遺伝子の存否
のみである。これら膜を利用するハイブリダイゼーショ
ン法はナイロンバックあるいはそれにかわる容器中で核
酸プローブとハイブリダイズし、過剰の核酸プローブを
洗浄で除いた後に、標識がアイソトープの場合はフィル
ムに感光するか、あるいは放射活性を測定することによ
り目的の遺伝子を検出する。また標識が非放射性の場合
（即ち、アイソトープでない場合）は、それぞれの標識
方法に応じた方法に従って発色あるいは発光等の反応を
行い、目的の遺伝子を検出する。This method is very simple compared to the Southern hybridization method. However, the information obtained is only the presence or absence of the target gene. Hybridization methods using these membranes involve hybridizing with a nucleic acid probe in a nylon bag or other container, removing excess nucleic acid probe by washing, and then exposing the label to a film if the label is an isotope, or exposing it to radioactivity. The gene of interest is detected by measuring. If the label is non-radioactive (ie, not an isotope), a reaction such as coloring or luminescence is performed according to the method of each labeling method to detect the gene of interest.
上記方法のうちドツトハイブリダイゼーション法は比較
的操作が簡便であり、多数の検体を処理する場合には有
効な手段と言える。しかしながら、核酸の検出を行う場
合、検体数が少ないことも多々あり、そのような時にも
ドツトプロット機器を用意するのは不便である。また、
ドツトプロット機器は多数の検体用に作られていること
もあり、経済的でない。Among the above methods, the dot hybridization method is relatively easy to operate and can be said to be an effective means when processing a large number of specimens. However, when detecting nucleic acids, the number of specimens is often small, and even in such cases it is inconvenient to prepare a dot plot device. Also,
Dot plot instruments are not economical because they are made for large numbers of samples.
上記の課題は、本発明による遠心操作を利用した核酸の
検出法ならびにそれに用いる容器により解決される。The above-mentioned problems are solved by the nucleic acid detection method using centrifugation and the container used therefor according to the present invention.
すなわち本発明による核酸の検出法は、下記の工程（ａ
）〜（ｅ）からなるものである。That is, the nucleic acid detection method according to the present invention includes the following steps (a).
) to (e).
（ａ） 遠心操作用の容器であって、該容器の内部に
、目的核酸を固定化可能な膜が、該容器を膜の上側と下
側の二つの空間に区分するように着脱自在に配置されて
なる容器を用意する工程。(a) A container for centrifugation, in which a membrane capable of immobilizing a target nucleic acid is removably arranged so as to divide the container into two spaces, an upper side and a lower side of the membrane. The process of preparing a container to be used.
（ｂ） 前記容器の遠心方向内側の部屋に検体溶液を
置き、遠心操作を行うことによって検体中の核酸を該膜
上に固定化する工程。(b) A step of placing a sample solution in a chamber inside the container in the centrifugal direction and performing a centrifugal operation to immobilize the nucleic acid in the sample on the membrane.
（ｃ） 目的核酸とハイブリダイズ可能な標識化プロ
ーブを、固定化された膜上の核酸と、ハイブリダイゼー
ション反応させる工程。(c) A step of hybridizing a labeled probe capable of hybridizing with the target nucleic acid with the nucleic acid on the immobilized membrane.
（ｄ） 反応終了後、核酸の固定化された膜から未反
応の標識化プローブを除去する工程。(d) After the reaction is completed, a step of removing unreacted labeled probe from the membrane on which the nucleic acid is immobilized.
（ｅ） 機工化プローブの官能基を利用する検出操作
に付して、目的核酸の有無を検知する工程。(e) A step of detecting the presence or absence of the target nucleic acid by subjecting it to a detection operation that utilizes the functional group of the engineered probe.
また本発明による核酸検出容器とは、遠心操作用の容器
であって、該容器の内部に、目的核酸を固定化可能な膜
が、該容器を膜の上側と下側の二つの空間に区分するよ
うに着脱自在に配置されてなるものである。Further, the nucleic acid detection container according to the present invention is a container for centrifugation, and a membrane capable of immobilizing a target nucleic acid is provided inside the container, dividing the container into two spaces, an upper side and a lower side of the membrane. It is arranged so that it can be attached and detached at will.
効果
本発明による核酸の検出法ならびに容器は、遠心機を利
用することにより、高価な装置を必要としないこと、処
理操作が簡便であること、ならびに、少数の検体であっ
ても効率よく処理できること等より、例えば、遺伝子診
断分野において多大な貢献をなすものである。Effects The nucleic acid detection method and container according to the present invention do not require expensive equipment by using a centrifuge, the processing operation is simple, and even a small number of samples can be processed efficiently. For example, it will make a great contribution in the field of genetic diagnosis.
核酸
本発明でいう検出すべき核酸すなわち目的核酸とは、検
出しようとする塩基配列を含むものであって、ＤＮＡ、
ＲＮＡいずれであってもよい。本発明を適用しうろこの
ような核酸は、大腸菌、ビールスおよび高等動植物など
あらゆる生命体から調製することができる。また、上記
核酸は、本検比法に用いる場合、精製されていても、さ
れていなくてもよい。Nucleic acid The nucleic acid to be detected in the present invention, that is, the target nucleic acid, includes the base sequence to be detected, and includes DNA,
It may be either RNA. Applying the present invention, scale-like nucleic acids can be prepared from all living organisms such as E. coli, viruses, and higher plants and animals. Moreover, when the above-mentioned nucleic acid is used in this comparison method, it may or may not be purified.
核酸の検出法
本発明による核酸の検出法は、前記した工程（ａ）〜（
ｅ）から成るものである。Nucleic acid detection method The nucleic acid detection method according to the present invention comprises the steps (a) to (
e).
工程（ａ）
本工程で用意される核酸検出容器は、遠心操作用の容器
であって、該容器の内部に、目的核酸を固定化可能な膜
が、該容器を膜の上側と下側の二つの空間に区分するよ
うに着脱自在に配置されてなるものである。Step (a) The nucleic acid detection container prepared in this step is a container for centrifugation, and a membrane capable of immobilizing the target nucleic acid is inside the container, and the container is connected to the upper and lower sides of the membrane. It is detachably arranged so as to divide it into two spaces.
通常１個の容器で１検体の検出測定を行うことができる
。この容器の詳細および好ましい実施例については以下
に説明する。Usually, one container can detect and measure one sample. Details and preferred embodiments of this container are described below.
核酸検出容器
本発明による核酸検出容器において、容器を膜の上側と
下側の二つの空間に区分するとは、すなわち、容器が、
膜によって、開口部すなわち膜の上側と、底部側すなわ
ち膜の下側の二つの空間に分けられることを意味する。Nucleic Acid Detection Container In the nucleic acid detection container according to the present invention, dividing the container into two spaces above and below the membrane means that the container is
This means that the membrane is divided into two spaces: an opening, that is, the upper side of the membrane, and a bottom side, that is, the lower side of the membrane.
膜がこのように配置された結果、膜の上側の空間におか
れた溶液は、遠心操作を行うことによって膜を透過して
、膜の下側の空間に移動することになる。As a result of the membrane being arranged in this manner, a solution placed in the space above the membrane will permeate the membrane by centrifugation and move to the space below the membrane.
この膜は、着脱自在であることから、脱芒して護膜の表
裏を反転することも可能である。Since this membrane is removable, it is also possible to remove the awn and turn the protective membrane over.
膜の配置の方法は、したがって、膜の上側の空間に置か
れた溶液が、遠心操作によって膜を透過して、膜の下側
の空間に移動するような構成であれば限定されない。例
えば、遠心操作用の容器の内側に小孔が有する仕切り板
を設け、その板上に膜を乗せて容器を区分する方法、ま
たその様な仕切り板を容器とは別の膜支持体に設け、そ
の支持体を遠心容器に挿入して用いる方法などが挙げら
れる。Therefore, the method of arranging the membrane is not limited as long as the solution placed in the space above the membrane passes through the membrane by centrifugation and moves to the space below the membrane. For example, there is a method in which a partition plate with small holes is provided inside a container for centrifugation, and a membrane is placed on the plate to divide the container, or a method in which such a partition plate is provided on a membrane support separate from the container. , a method in which the support is inserted into a centrifuge container, and the like.
膜の素材としては、目的核酸を固定化でき、かつ、標識
化ＤＮＡプローブの検出に影響を与えないものであり、
また、使用する溶媒等により影響されないものであれば
特に限定はされない。例えば、ニトロセルロースフィル
ター、ナイロンメンブレンフィルター、その他類似の高
分子膜を用いることができる。The membrane material is one that can immobilize the target nucleic acid and does not affect the detection of the labeled DNA probe.
Further, there is no particular limitation as long as it is not affected by the solvent etc. used. For example, nitrocellulose filters, nylon membrane filters, and other similar polymer membranes can be used.
また、膜量外の部分については、標識化プローブの検出
に影響を与えないものであって、目的核酸が吸着されに
くく、かつ使用溶媒等により浸食されないものであれば
、その材質に制限はない。In addition, there are no restrictions on the material for the part outside the membrane, as long as it does not affect the detection of the labeled probe, does not easily adsorb the target nucleic acid, and is not eroded by the solvent used. .
好ましい素材としては、例えばガラス、ポリプロピレン
、ポリスチレン等がある。Preferred materials include, for example, glass, polypropylene, and polystyrene.
以上示した核酸検出用容器は、いわゆる遠心機に設置で
きるものであれば、任意の形状であってもよいことは、
いうまでもない。The nucleic acid detection container shown above may have any shape as long as it can be installed in a so-called centrifuge.
Needless to say.
工程（ｂ）
本工程は、前記工程（ａ）で用意した容器の股上に、検
体中の核酸を、遠心操作により固定化する工程である。Step (b) This step is a step in which the nucleic acid in the specimen is immobilized on the crotch of the container prepared in step (a) above by centrifugation.
まず検体溶液を容器内の上側の空間に置く。遠心操作を
行うことにより、当該検体溶液は護膜を通過する。その
際、検体中の核酸は護膜に固定化される。本発明におい
て、核酸の固定化とは、膜上に核酸が濃縮され、非特異
的あるいは特異的に吸着されており容品に脱離できない
状態をいうものとする。First, place the sample solution in the upper space of the container. By performing the centrifugation operation, the sample solution passes through the protective membrane. At that time, the nucleic acid in the specimen is immobilized on the protective membrane. In the present invention, immobilization of nucleic acids refers to a state in which nucleic acids are concentrated on a membrane, non-specifically or specifically adsorbed, and cannot be detached into a container.
なお、検体溶液の量は、遠心操作を行った後に、膜を通
過した炉液が、膜によって分割された容器の遠心方向下
側の空間に全て保持される程度であることが好ましい。Note that the amount of the sample solution is preferably such that after centrifugation, all of the furnace solution that has passed through the membrane is retained in the space below the container in the centrifugal direction divided by the membrane.
核酸の種類及び膜の材質の組み合せによっては、検体中
の核酸の変性操作が必要となる場合もあるが、かかる変
性操作は従来公知の方法によって行えばよい。Depending on the type of nucleic acid and the combination of membrane materials, it may be necessary to denature the nucleic acid in the sample, but such denaturation may be performed by a conventionally known method.
また、本工程で、検体中の核酸を遠心操作により膜上に
固定化する場合、検体をあらかじめアルカリ性にするこ
とにより、膜への吸着効率を高めることができる。場合
によっては核酸を膜部分に濃縮吸着させた後、光照射す
るか加熱真空乾燥することにより膜への固定をより確実
にすることができる。Furthermore, in this step, when nucleic acids in a sample are immobilized on a membrane by centrifugation, the efficiency of adsorption onto the membrane can be increased by making the sample alkaline in advance. In some cases, fixation to the membrane can be made more reliable by concentrating and adsorbing the nucleic acid onto the membrane and then irradiating it with light or heating and vacuum drying it.
工程（ｃ）
本工程は、目的核酸と、いわゆる標識化プローブとをハ
イブリダイゼーション反応させる工程である。Step (c) This step is a step in which a target nucleic acid and a so-called labeled probe are subjected to a hybridization reaction.
本工程で使用する目的核酸とハイブリダイズ可能な標識
化プローブとは、検出対象の塩基配列、すなわち標的配
列、と相補的な塩基配列を一部に有するポリヌクレオチ
ドであり、その構成塩基配列部分が、直接あるいは間接
的に少（とも１個の標識物質で修飾されたものである。The labeled probe that can hybridize with the target nucleic acid used in this step is a polynucleotide that partially has a base sequence that is complementary to the base sequence to be detected, that is, the target sequence, and its constituent base sequence portions are , directly or indirectly modified with at least one labeling substance.
このような標識化プローブには、標的配列と相補助な塩
基配列を部分的に含む一部プローブと、標的配列と相補
的な塩基配列以外の該一部プローブの部分とハイブリダ
イズする程度に相補的な塩基配列を含み、かつ構成塩基
配列部分が直接あるいは間接的に少くとも１個の標識物
質で修飾された二次プローブとからなる検出用プローブ
（特開平１−６３３９８号公報参照）も含まれる。ここ
で標識物質とは、ハイブリダイゼーション操作後にこの
物質を検出し得るものであるならば、放射性、非放射性
を問わない。取扱いの容易性、保存性、廃棄処理等から
、また本発明の効果を最もよく享有するものとして、非
放射性の標識物質か好ましい。Such labeled probes include a partial probe that partially includes a base sequence that is complementary to the target sequence, and a probe that is complementary to the extent that it hybridizes with a portion of the partial probe that is not a base sequence that is complementary to the target sequence. It also includes a detection probe (see JP-A-1-63398), which consists of a secondary probe that contains a base sequence and whose constituent base sequence portion is directly or indirectly modified with at least one labeling substance. It will be done. Here, the labeling substance may be radioactive or non-radioactive, as long as it can be detected after hybridization. Non-radioactive labeling substances are preferred from the standpoint of ease of handling, storage stability, disposal, etc., and because they best enjoy the effects of the present invention.
非放射性の標識物質としては、例えばビオチン、２．４
−ジニトロフェニル基、ジゴキシゲニン等のハプテン、
フルオレセインおよびその誘導体〔例えば、フルオレセ
インイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等〕、ローダミン
およびその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミンイ
ソチオシネート（ＴＲＩＴＣ） 、テキサスレッド等〕
、４−フルオロ−７−二トロペンゾフラン（ＮＢＤＦ）
およびダンシルなどの螢光物質あるいはアクリジン等の
化学発光物質があり、いずれも公知手段（特開昭５９−
９３０９８号、特開昭５９−９３０９９号各公報参照）
により、標識化を行うことができる。Examples of non-radioactive labeling substances include biotin, 2.4
- Dinitrophenyl group, hapten such as digoxigenin,
Fluorescein and its derivatives [e.g., fluorescein isothiocyanate (FITC), etc.], rhodamine and its derivatives [e.g., tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), Texas Red, etc.]
, 4-fluoro-7-nitropenzofuran (NBDF)
There are also fluorescent substances such as dansyl and chemiluminescent substances such as acridine, all of which are known by known means (Japanese Patent Laid-Open No.
(Refer to No. 93098 and Japanese Unexamined Patent Publication No. 59-93099)
Labeling can be performed by
また標識として酵素を用いる場合、例えば西洋ワサビパ
ーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ等を利用することもできる。Further, when using an enzyme as a label, for example, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, etc. can also be used.
本工程におけるハイブリダイゼーション反応は、好まし
くは、標識化プローブを含む溶液を、容器の遠心方向内
側の部屋に置（ことによって行なわれる。また、目的核
酸を固定化した膜を容器がら取り出して、積置化プロー
ブとハイブリダイゼーション反応させることも可能であ
る。ハイブリダイゼーション反応の条件は、目的核酸と
使用する標識化プローブの種類によって適宜選択されて
よい。反応促進剤を添加することも有利であろう。The hybridization reaction in this step is preferably carried out by placing a solution containing the labeled probe in a chamber inside the container in the centrifugal direction.Also, the membrane on which the target nucleic acid is immobilized is removed from the container and stacked. It is also possible to carry out a hybridization reaction with a labeled probe.The conditions for the hybridization reaction may be selected as appropriate depending on the target nucleic acid and the type of labeled probe used.It may also be advantageous to add a reaction accelerator. .
工程（ｃり
本工程は、工程（Ｃ）におけるハイブリダイゼーション
反応終了後、核酸の固定化された膜から未反応の標識化
プローブを除去する工程である。Step (c) This step is a step of removing unreacted labeled probes from the membrane on which nucleic acids are immobilized after the hybridization reaction in step (C) is completed.
その操作は例えば次のように行われる。洗浄液を、容器
の遠心方向内側の部屋に置き、振とうした後、洗浄液を
直接廃棄するか、スポイトあるいはアスピレータ−等で
吸引して除くことにより、未反応の標識化プローブを除
去することができる。更に洗浄液を除いた後、護膜を脱
むして、目的核酸の固定化された面が遠心方向外向きに
なるように反転して容器内に設置し、そして遠心操作を
行うことも、洗浄液を十分に除去する観点から好ましい
。For example, the operation is performed as follows. Unreacted labeled probe can be removed by placing the washing solution in a chamber inside the container in the centrifugal direction and shaking it, then either directly discarding the washing solution or removing it by suctioning with a dropper or aspirator. . Furthermore, after removing the washing solution, the protective film can be removed, the target nucleic acid immobilized side facing outward in the centrifugal direction, placed in the container, and then centrifuged. Alternatively, the washing solution can be removed. It is preferable from the viewpoint of sufficient removal.
これらの洗浄操作を１回〜数回行うことにより、未反応
の標識化プローブを除くことができる。By performing these washing operations once to several times, unreacted labeled probes can be removed.
また、目的核酸を固定化した膜を容器から取り出してハ
イブリダイゼーション反応させた場合も、前記したよう
な洗浄操作に付すことが有利である。Furthermore, even when the membrane on which the target nucleic acid is immobilized is taken out from the container and subjected to hybridization reaction, it is advantageous to subject it to the washing operation as described above.
なお、前記した工程（ｂ）、場合によって更に工程（ｄ
）において、遠心操作を行った結果、容器の遠心方向外
側の部屋には、炉液が保持されることとなる。これらの
炉液は、工程（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの
工程が終了した後、除去されるのが好ましい。すなわち
、工程（ｂ）、（Ｃ）または（ｄ）のいずれかの工程が
終了した後、膜を脱離して、容器内の炉液を廃棄し、再
び護膜を装着すればよい。好ましくは、この炉液の除去
は、工程（ｂ）が終了した後行われる。In addition, the above-mentioned step (b) may further include step (d) as the case may be.
), as a result of the centrifugal operation, the furnace liquid is retained in the chamber on the outside of the container in the centrifugal direction. These furnace liquids are preferably removed after any one of steps (b), (c), or (d) is completed. That is, after completing any one of steps (b), (C), or (d), the membrane may be removed, the reactor liquid in the container may be discarded, and the protective membrane may be reattached. Preferably, this removal of furnace fluid is carried out after step (b) has been completed.
工程（ｅ）
本工程は、標讃化プローブの官能基を利用して目的核酸
の有無を検知する工程である。Step (e) This step is a step of detecting the presence or absence of the target nucleic acid using the functional group of the labeled probe.
本工程で、積置化プローブの官能基を利用して目的核酸
の有無を検知するとは、標識物質がアイソトープである
場合にはシンチレータ−を用いて酵素、蛍光、あるいは
発光物質である場合にはそれぞれに応じた既知の測定法
で測定することをいう。また、−度に複数の目的核酸を
検出する場合には、それぞれの標識物質に対応する測定
を同一試料を用いて行うことができる（たとえばそれぞ
れの標識物質が蛍光特性の異なる蛍光物質で標識されて
いる場合、それぞれの螢光物質に合った励起波長と蛍光
波長を選べば良い）。In this step, detecting the presence or absence of the target nucleic acid using the functional group of the stacked probe means that if the labeling substance is an isotope, a scintillator is used, and if the labeling substance is an enzyme, fluorescence, or luminescent substance, the presence or absence of the target nucleic acid is detected. This refers to measurement using known measurement methods appropriate for each. In addition, when detecting multiple target nucleic acids at the same time, measurements corresponding to each labeling substance can be performed using the same sample (for example, if each labeling substance is labeled with a fluorescent substance with different fluorescent properties) (If so, choose the excitation and fluorescence wavelengths appropriate for each fluorophore).
なお、本検出工程は膜部分を取り比して行っても、また
、膜部分を取り出すことなく容器ごと検出操作に付すこ
ともできる。Note that this detection step can be performed by removing the membrane portion, or the whole container can be subjected to the detection operation without removing the membrane portion.
実施例１
核酸検出容器（その１）
本発明による核酸検出容器の実施例を、第１図を基に以
下説明する。Example 1 Nucleic acid detection container (part 1) An example of the nucleic acid detection container according to the present invention will be described below with reference to FIG.
内径］、ｃｒｎｓ外径１．２外径１金２３ＣＩＩ＋まで
は円柱状で、そこから底部にかけては円すい状を呈して
いる）のフタ付ポリプロピレン製の遠心用容器１を用意
した。A centrifugal container 1 made of polypropylene with a lid was prepared.
次に内径０４７９ｃｍ，外径０． ９９ｃｍ、全長２
、 ９ｃｍのポリプロピレン製の円柱状の筒であって
、中間部に膜部分を支えるため多数の小孔を有する境界
面３が設けてあり、更に両端に本体を掴むための突起部
分４が設けである膜固定部２を用意した。膜固定部２の
一方の境界面に直径０、７９ｃｍの円形状のニトロセル
ロース膜５を置き、核酸検出容器とした。膜固定部２は
、上下どちらの面からでも遠心用容器１に脱着可能な構
造になっている。Next, the inner diameter is 0479cm, and the outer diameter is 0. 99cm, total length 2
It is a 9 cm cylindrical tube made of polypropylene, and has a boundary surface 3 with a large number of small holes in the middle to support the membrane part, and protrusions 4 at both ends for gripping the main body. A certain membrane fixing part 2 was prepared. A circular nitrocellulose membrane 5 with a diameter of 0.79 cm was placed on one boundary surface of the membrane fixing part 2 to serve as a nucleic acid detection container. The membrane fixing part 2 has a structure that allows it to be attached to and detached from the centrifugation container 1 from either the upper or lower side.
実施例２
核酸検出容器（その２）
本発明による更なる核酸検出容器の別の実施例を、第２
図を基に以下説明する。Example 2 Nucleic acid detection container (Part 2) Another example of a further nucleic acid detection container according to the present invention is shown in Example 2.
This will be explained below based on the figures.
内径１ｃｍ，外径１．２ｃｍ，全長１．５ｃｍ（口部か
ら０． ５ｃｍまでは円柱状で、そこから底部にかけ
ては円すい状を呈している）のポリプロピレン製の遠心
用容器１′と内径１ｃｍ，外径１．、２ｃｍ。A polypropylene centrifuge container 1' with an inner diameter of 1 cm, an outer diameter of 1.2 cm, and a total length of 1.5 cm (cylindrical shape from the mouth to 0.5 cm, and a conical shape from there to the bottom) and an inner diameter of 1 cm. , outer diameter 1. , 2cm.
全長２． ５ｃ＋ｎのポリプロピレン製の筒であって
、膜部分を支えるために中間部に多数の小孔を有する境
界面３が設けである膜固定部２′をｒＴ］意した。Total length 2. A membrane fixing part 2' was designed which was a 5c+n polypropylene cylinder and had a boundary surface 3 having a large number of small holes in the middle part to support the membrane part.
遠心用容器１′の口部と膜固定部２′の両日部とは連結
できるように１′の口部には雄ネジ部分４ａが、膜固定
部２′の両日部には酸ネジ部分４ｂが設けられている。In order to connect the mouth of the centrifugal container 1' and both ends of the membrane fixing part 2', a male screw part 4a is provided at the mouth of the centrifugal container 1', and an acid thread part 4b is provided in both parts of the membrane fixing part 2'. is provided.
さらに直径１ｃｍのニトロセルロース膜５′を膜固定部
２′の片面に固定化して、核酸検出容器とした。以上示
した容器は膜固定部２′を上下どちらの而らでも遠心用
容器１′に脱着可能な構造になっている。Further, a nitrocellulose membrane 5' having a diameter of 1 cm was immobilized on one side of the membrane fixing part 2' to form a nucleic acid detection container. The container shown above has a structure in which the membrane fixing part 2' can be attached to and detached from the centrifugation container 1' either above or below.
実施例３
プラスミドｐＵｃ１８を制限酵素ＢａｍＨ１で切断して
直鎖状とし、〔α−３２Ｐ）ｄＣＴＰとＤＮＡポリメラ
ーゼ（フレナラフラグメント）を用いて標識した。この
標識ＤＮＡの一定量を０、３Ｍ ＮａＯＨ溶液とし、
ＤＮＡサンプルとした。Example 3 Plasmid pUc18 was cut with the restriction enzyme BamH1 to form a linear chain, which was then labeled using [α-32P)dCTP and DNA polymerase (Frenara fragment). A certain amount of this labeled DNA was made into a 0.3M NaOH solution,
It was used as a DNA sample.
第１図に示した容器に、先のＤＮＡ溶液を加え、卓上遠
心機（クボタＫＭ−１５２００）で５００Ｏｒｐｍの回
転数で５分間遠心した。遠心後、膜を装着した部分と３
液の放射活性を測定した。The above DNA solution was added to the container shown in FIG. 1, and centrifuged for 5 minutes at 500 rpm using a tabletop centrifuge (Kubota KM-15200). After centrifugation, the membrane-attached part and 3
The radioactivity of the liquid was measured.
従来法としてはミリボア社のろ過ユニットにアマジャム
社製のＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋（商標）を装着して吸引によ
りＤＮＡを膜に吸着させ、膜に残留した放射活性と、ろ
液の放射活性を測定した。As a conventional method, Hybond N+ (trademark) manufactured by Amajam was attached to a Millibore filtration unit, DNA was adsorbed onto the membrane by suction, and the radioactivity remaining on the membrane and the radioactivity of the filtrate were measured.
上記いづれの場合も核酸溶液は総放射活性３７００ｃｐ
ｍで、１００μｍの溶液を使用した。In any of the above cases, the nucleic acid solution has a total radioactivity of 3700 cp.
A 100 μm solution was used.
結果は表１に示す通りである。この結果より、遠心操作
によってＤＮＡが、容器中の膜にほぼ定量的に吸着され
ることが明らかとなった。The results are shown in Table 1. These results revealed that DNA was almost quantitatively adsorbed to the membrane in the container by centrifugation.
表１
２、膜表面の電荷とプロッティング効率第１図に示した
膜部分に関して、膜表面が電気的に中性のもの（Ｈｙｂ
ｏｎｄ Ｎ ）とプラスの電荷を帯びたもの（Ｈｙｂｏ
ｎｄ Ｎ ” ）の遠心によるＤＮＡ（７）吸着効率の
違いを検討した。核酸試料は前記１と同様のもので、総
放射活性４７００ｃｐｍで１００μｌの溶液を使用した
。結果は表２に示す通りである。Table 1 2. Charge and plotting efficiency of the membrane surface Regarding the membrane parts shown in Figure 1, the membrane surface is electrically neutral (Hyb
ond N ) and the positively charged one (Hybo
The difference in adsorption efficiency of DNA (7) by centrifugation was investigated. The nucleic acid sample was the same as in 1 above, and 100 μl of a solution with a total radioactivity of 4700 cpm was used. The results are shown in Table 2. be.
表２
この結果、遠心操作によるＤＮＡの膜への吸着は、正の
電荷を帯びた膜の方がより効率的であることが明らかと
なった。Table 2 The results revealed that positively charged membranes were more efficient at adsorbing DNA to membranes through centrifugation.
ヒトＢ型肝炎ウィルスの遺伝子断片（３２００塩基対：
１００ｐｇ、 ５０ｐｇ、１０ ｐｇ、 Ｏｐｇ）を
０．５Ｍ ＮａＯＨ（１００μ＋）に溶解し、第２図
に示す容器を用いて、卓上遠心機（クボタＫＭ−１５２
００）によって５０００ ｒｐｔｓで５分間遠心を行い
、核酸の膜への固定化を行った。遠心後、水（１００μ
ｍ）で２回遠心して洗浄した。Human hepatitis B virus gene fragment (3200 base pairs:
100 pg, 50 pg, 10 pg, Opg) in 0.5 M NaOH (100μ+), and using a container shown in Figure 2, centrifuge (Kubota KM-152)
The nucleic acid was immobilized on the membrane by centrifugation at 5000 rpts for 5 minutes. After centrifugation, water (100μ
Washed by centrifugation twice.
膜を装着した部分を遠心チューブからはずし、風乾した
。このようにして調製した膜に吸着されたヒ）Ｂ型肝炎
ウィルス遺伝子を、ユニバーサルプローブシステム（特
開平１−６３３９８号）を用いて検出した。The membrane-attached part was removed from the centrifuge tube and air-dried. The human hepatitis B virus gene adsorbed on the membrane thus prepared was detected using a universal probe system (Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-63398).
まず、上記膜を含む容器にプレハイブリダイゼーション
溶液（５ＸＳＳＰＥ、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０
、 ５％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌ変性サケＤＮＡ：５
００μｌ）を加え、４２℃で１時間放置した。次に、−
次ブローブ〔ヒトＢ型肝炎遺伝子を挿入したプラスミド
ＰＵＣｆｌ（ファルマシア製）から得られた一本鎖ＤＮ
Ａ：１０１００ｎを加え、４２℃で１４時間放置した。First, a prehybridization solution (5X SSPE, 5X Denhardt's solution, 0.0
, 5% SDS, 200 μg/ml denatured salmon DNA: 5
00 μl) was added and left at 42° C. for 1 hour. Next, −
Next probe [single-stranded DNA obtained from plasmid PUCfl (manufactured by Pharmacia) into which the human hepatitis B gene was inserted
A: 10100n was added and left at 42°C for 14 hours.
ハイブリダイゼーション溶液を除き、ビオチン標識した
二次プローブ（特開平１−６３３９８号）を含むハイブ
リダイゼーション溶液を加え（５００μｌに次プローブ
： １１００ｎ、５ｘＳＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ
’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍ１変性サケ
ＤＮＡ） 、４２℃で４時間保温した。Remove the hybridization solution and add a hybridization solution containing a biotin-labeled secondary probe (Japanese Unexamined Patent Publication No. 1-63398) (to 500 μl, add the following probes: 1100n, 5xSSPE, 5x Denhardt).
's solution, 0.5% SDS, 200 μg/ml denatured salmon DNA) and kept at 42° C. for 4 hours.
次に、ハイブリダイゼーション溶液を遠心操作で完全に
除き、洗浄液１ （２ＸＳＳＣ，０，１％５ＤＳ）を
用いて室温で５分間、５１２回洗浄した。Next, the hybridization solution was completely removed by centrifugation, and the cells were washed 512 times at room temperature for 5 minutes using washing solution 1 (2XSSC, 0.1% 5DS).
さらに洗浄液２ （０，２ＸＳＳＣ，０，１％５ＤＳ）
を用いて４２℃で５分間、計２回洗浄した。これらの洗
浄操作においても、膜を装着した容器を逆向きにして遠
心チューブにセットし、遠心操作により洗浄液をほぼ完
全に除いた。次に、ブロッキング試薬（５００μｌ：ベ
ーリンガー社製）を加え、３０分間室温で放置し液を除
いた。Furthermore, cleaning solution 2 (0,2XSSC, 0,1%5DS)
Washing was performed twice at 42° C. for 5 minutes in total. In these washing operations as well, the container equipped with the membrane was placed in a centrifuge tube in the opposite direction, and the washing solution was almost completely removed by centrifugation. Next, a blocking reagent (500 μl, manufactured by Boehringer) was added, and the mixture was left to stand at room temperature for 30 minutes, and the solution was removed.
その後ＢＲＬ社のＢＬｕＧｅｎｅ （商標）を用いてＢ
ＲＬ社のプロトコールに従い、上記容器中でのビオチン
標識プローブの検出を行った。その結果、ヒトＢ型肝炎
ウィルス遺伝子断片１１００ｐ、５０ｐｇ、１０ｐｇを
添加した場合は容器に装着した膜部分が青紫色に着色し
たが、遺伝子断片を添加しなかった場合は着色しながっ
た。以上により、遠心プロッティング操作にリヒトＢ型
肝炎ウィルス遺伝子が検出できることが明らかとなった
。Then BRL's BLuGene (trademark) was used to
The biotin-labeled probe in the above container was detected according to the protocol of RL. As a result, when 1100 p, 50 pg, and 10 pg of human hepatitis B virus gene fragments were added, the membrane part attached to the container was colored bluish-purple, but when no gene fragment was added, no coloration occurred. From the above, it has become clear that the human hepatitis B virus gene can be detected by centrifugal plotting.
第１図および第２図は、本発明の一実施例である核酸検
出用容器を示した図である。FIG. 1 and FIG. 2 are diagrams showing a container for nucleic acid detection which is an embodiment of the present invention.
Claims (1)
る、核酸の検出法。 （ａ）遠心操作用の容器であって、該容器の内部に、目
的核酸を固定化可能な膜が、該容器を膜の上側と下側の
二つの空間に区分するように着脱自在に配置されてなる
容器を用意する工程。 （ｂ）前記容器の遠心方向内側の部屋に検体溶液を置き
、遠心操作を行うことによって検体中の核酸を該膜上に
固定化する工程。 （ｃ）目的核酸とハイブリダイズ可能な標識化プローブ
を、固定化された膜上の核酸と、ハイブリダイゼーショ
ン反応させる工程。 （ｄ）反応終了後、核酸の固定化された膜から未反応の
標識化プローブを除去する工程。（ｅ）標識化プローブ
の官能基を利用する検出操作に付して、目的核酸の有無
を検知する工程。 ２、遠心操作用の容器であって、該容器の内部に、目的
核酸を固定化可能な膜が、該容器を膜の上側と下側の二
つの空間に区分するように着脱自在に配置されてなる容
器。[Scope of Claims] 1. A method for detecting nucleic acids, comprising the following steps (a) to (e). (a) A container for centrifugation, in which a membrane capable of immobilizing a target nucleic acid is removably arranged so as to divide the container into two spaces, an upper side and a lower side of the membrane. The process of preparing a container to be used. (b) A step of placing a sample solution in the inner chamber in the centrifugal direction of the container and performing a centrifugal operation to immobilize the nucleic acid in the sample on the membrane. (c) A step of causing a hybridization reaction between a labeled probe capable of hybridizing with the target nucleic acid and the nucleic acid on the immobilized membrane. (d) After the reaction is completed, a step of removing unreacted labeled probe from the membrane on which the nucleic acid is immobilized. (e) A step of detecting the presence or absence of the target nucleic acid by subjecting it to a detection operation that utilizes the functional group of the labeled probe. 2. A container for centrifugation, in which a membrane capable of immobilizing a target nucleic acid is removably arranged inside the container so as to divide the container into two spaces, an upper side and a lower side of the membrane. A container.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2168660A JP3036791B2 (en) | 1990-06-27 | 1990-06-27 | Nucleic acid detection method and nucleic acid detection container used therefor |
Applications Claiming Priority (1)
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| JPH0458899A true JPH0458899A (en) | 1992-02-25 |
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| JP2168660A Expired - Lifetime JP3036791B2 (en) | 1990-06-27 | 1990-06-27 | Nucleic acid detection method and nucleic acid detection container used therefor |
Country Status (1)
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| JP (1) | JP3036791B2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08281098A (en) * | 1995-04-01 | 1996-10-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Isolation device for nucleic acid |
| JP2003527953A (en) * | 2000-03-22 | 2003-09-24 | デワルチ テクノロジーズ、インコーポレイテッド | Method and apparatus for treating substances in a single container |
-
1990
- 1990-06-27 JP JP2168660A patent/JP3036791B2/en not_active Expired - Lifetime
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| JPH08281098A (en) * | 1995-04-01 | 1996-10-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Isolation device for nucleic acid |
| JP2003527953A (en) * | 2000-03-22 | 2003-09-24 | デワルチ テクノロジーズ、インコーポレイテッド | Method and apparatus for treating substances in a single container |
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