JPH0458890A - Compound plasmid vector - Google Patents
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野コ
本発明は、；グラム陰性細菌の大腸菌やグラム陽性細菌
例えば乳酸桿菌・枯草菌等の異種の細菌細胞中でも自律
増殖可能であり、クローニングベクターとして有用な新
規な複合プラスミドベクターに関するものである。[Detailed Description of the Invention] [Industrial Field of Application] The present invention is capable of autonomously propagating even in different bacterial cells such as Gram-negative bacteria Escherichia coli and Gram-positive bacteria such as Lactobacillus and Bacillus subtilis, and can be used as a cloning vector. This invention relates to a useful new complex plasmid vector.
更に詳細には乳酸菌において優れた安定性を示す複合プ
ラスミドベクターに関するものである。More specifically, the present invention relates to a complex plasmid vector that exhibits excellent stability in lactic acid bacteria.
［従来の技術］
現在量も研究開発の進んだＤＮＡクローニングシステム
は、；グラム陰性細菌の大腸菌とそのベクター系（ＥＫ
系）であって、このシステムでは、；グラム陰性細菌に
由来する遺伝子等を形質発現させることができる。[Prior art] DNA cloning systems, which are currently available and have been extensively researched and developed, are based on the Gram-negative bacterium Escherichia coli and its vector system (EK
This system is capable of expressing genes derived from Gram-negative bacteria.
一方、グラム陽性細菌の系に関しては、解決すべき問題
点がより多く残されており、今日多大の関心が払われて
いる。On the other hand, with regard to Gram-positive bacterial systems, many more problems remain to be solved, and a great deal of attention is currently being paid to them.
特にグラム陽性細菌のうち、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｆｓ）や乳酸菌（例えばラクトバチルス・
カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）
）に関しては、実用上程々の利点を持つ有用な微生物で
ある反面、その生物学的性状が大腸菌のそれとは全く異
なっており、大腸菌におけるベクター系がそのまま使用
できない。そのため、これらグラム陽性細菌における遺
伝子のクローニングシステムの開発・確立が強く望まれ
ているところである。Especially among Gram-positive bacteria, Bacillus subtilis
subtilfs) and lactic acid bacteria (e.g. Lactobacillus
Lactobacillus casei
) is a useful microorganism with moderate practical advantages, but its biological properties are completely different from those of E. coli, and the vector system in E. coli cannot be used as is. Therefore, there is a strong desire to develop and establish a gene cloning system for these Gram-positive bacteria.
一般に、インビトロ（ｉｎ ｖｆｔｒｏ）遺伝子操作で
は、所望の外来遺伝子を宿主細胞内に移入させて、その
遺伝情報を発現させるためには、宿主細胞に適合したベ
クター（ｖｅｃｔｏｒ）を使用することが要言青される
。Generally, in in vitro genetic manipulation, it is important to use a vector that is compatible with the host cell in order to transfer a desired foreign gene into the host cell and express the genetic information. Blued.
ところで、ベクターとしての必須条件が、■自己複製に
必要な遺伝子配列と、■外来遺伝子を挿入するための制
限酵素の認識切断部位の存在であることが知られてはい
るが、更に実用化のためには、例えば遺伝子操作を可能
にし且つ容易にするために、■形質転換体の検出等に必
要なマーカー遺伝子の存在、■利用可能な制限酵素の種
類とその認識切断部位の多様性、■形質発現の高効率性
、■宿主細胞との適合性と宿主域、■宿主細胞内での安
定性、更には、■仮想される生物封じ込めに対する適応
性など、種々の条件を全て満たすことが要請される。By the way, it is known that the essential conditions for a vector are: 1) a gene sequence necessary for self-replication, and 2) the presence of a restriction enzyme recognition cleavage site for inserting a foreign gene. For example, in order to enable and facilitate genetic manipulation, there are two things that need to be considered: (1) the presence of marker genes necessary for detecting transformants, (2) the diversity of available restriction enzyme types and their recognized cleavage sites, (2) It is required to satisfy all of various conditions such as high efficiency of trait expression, ■ compatibility with host cells and host range, ■ stability within host cells, and furthermore, ■ adaptability to hypothetical biological containment. be done.
上記のような特性を有する遺伝子操作におけるベクター
に関しては、前述のように研究例の多い大腸菌の宿主−
ベクター系にて最もよく開発されているが、最近では大
腸菌以外の微生物、例えば工業的に有用な微生物である
枯草菌、抗生物質の生産菌である放線菌、醸造分野で広
く利用されている酵母などに関しても、宿主−ベクター
系の開発研究が活発に行われているところである。Regarding vectors for genetic manipulation with the above-mentioned characteristics, the E. coli host, which has been extensively studied, is used as mentioned above.
Although vector systems are most commonly developed, recently microorganisms other than E. coli, such as Bacillus subtilis, an industrially useful microorganism, actinomycetes, an antibiotic-producing bacterium, and yeast, which is widely used in the brewing field, have been developed. In this regard, research and development of host-vector systems is currently being actively conducted.
酪農製品製造に用いられる乳酸菌においての宿主−ベク
ター系の開発研究は、他の微生物に比較して遅れていた
が、チーズ用乳酸球菌ラクトコッカス・ラクテイス（Ｌ
ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ １ａｃｅｓ）を宿主とした場合
を中心に近頃発展をみせはしめた（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、４６：２８１−２９５．１９８７）
。Research on the development of host-vector systems in lactic acid bacteria used in dairy product production has been delayed compared to other microorganisms, but
In recent years, there has been progress mainly in the use of FEMS microorganisms (actococcus 1aces) as hosts (FEMS Micro
biol, Rev, 46:281-295.1987)
.
また乳製品・乳酸菌飲料等の製造に用いられている乳酸
桿菌ラクトバチルス・カゼイを宿主とした場合は、１９
８７年に電気穿孔法による形質転換法が開発され（ＦＥ
ＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔ、４４：１７３−
１７７−１９８７） たことで、ベクター構築作業がや
っと可能になってきた。In addition, when the host is Lactobacillus casei, which is used in the production of dairy products and lactic acid bacteria drinks, 19
In 1987, a transformation method using electroporation was developed (FE
MS Microbiol, Lett, 44:173-
177-1987), vector construction work has finally become possible.
また、大腸菌と枯草菌との２種の細菌細胞中で自律増殖
可能なプラスミドベクターに関して、エンテロコッカス
・フェカリスのプラスミドｐＡＭα１由来の複製開始領
域（Ｒｅｐ−α１）と、前記ベクターｐＡＣＹＣ１７７
由来の複製開始領域（Ｏｒｉ−１７７）と、前記プラス
ミドｐＡＭａ１由来のテトラサイクリン（Ｔｃ）耐性遺
伝子領域と、大腸菌のヘクターρＡＣ￥Ｃ１７７由来の
アンピシリン（Ａｐ）耐性遺伝子領域と、更に両端がそ
れぞれ制限酵素Ｅ ｃ ｏ ４７ ＩＩＩとＨｉ ｎ
ｄ ＩＩＩの認識切断配列である多重制限酵素認識配列
とを有するシャトルベクターりＨＹ３２０ＰＬＫは、大
腸菌と枯草菌のクローニングベクターとして有用なシャ
トルベクターであり、前述したベクターとしての必須特
性を満たしていることが既に報告されている（特願昭６
３−１６３１１号）。Furthermore, regarding plasmid vectors that can autonomously reproduce in two types of bacterial cells, E. coli and Bacillus subtilis, the replication initiation region (Rep-α1) derived from Enterococcus faecalis plasmid pAMα1 and the vector pACYC177
origin (Ori-177), the tetracycline (Tc) resistance gene region derived from the plasmid pAMa1, the ampicillin (Ap) resistance gene region derived from Escherichia coli Hector ρAC\C177, and the restriction enzyme E at both ends. c o 47 III and Hi n
The shuttle vector HY320PLK, which has a multiple restriction enzyme recognition sequence that is a recognition cleavage sequence for dIII, is a shuttle vector useful as a cloning vector for E. coli and Bacillus subtilis, and has been shown to satisfy the essential characteristics as a vector as described above. It has already been reported (Special application 1986)
3-16311).
更に、本発明者らによって、；グラム陰性細菌である大
腸菌と、グラム陽性細菌である乳酸桿菌のラクトバチル
ス・カゼイや、枯草菌等との遺伝子操作におけるシャト
ルベクターとして好適な諸特性を保有している複合シャ
トルベクターｐＨ３２０１０及びｐＨ５１０１０とその
派生体が既に提案されている（特願昭６３−２８１４７
８号、特願平２−５４９２１号）。Furthermore, the present inventors have discovered that the present invention possesses various properties suitable as a shuttle vector for genetic manipulation between Escherichia coli, a Gram-negative bacterium, and Lactobacillus casei, a Gram-positive bacterium, and Bacillus subtilis. Composite shuttle vectors pH32010 and pH51010 and their derivatives have already been proposed (Japanese Patent Application No. 63-28147).
No. 8, Japanese Patent Application No. 2-54921).
これら複合シャトルベクターｐＨ３２０１０ｐＨ３１０
１０は、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）のプラスミドｐＡＭ
β１由来のマクロイド（Ｍａｃｒｏｌｉｄｅ）−リンコ
サミド（Ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅ） −ストレプトグ
ラミン・ビー（Ｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｇ＋ｉｎ Ｂ）耐
性遺伝子領域（以下、ＭＬＳ耐性遺伝子領域と記す）の
ＤＮＡ断片と、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔ
ｅｒｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）のプラスミドｐ
ＡＭ０１由来のテトラサイクリン耐性遺伝子領域（以下
、Ｔｃ耐性遺伝子領域と記す）と、大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のベクターｐＡＣＹＣ１７７
由来のアンピシリン耐性遺伝子領域（以下、Ａｐ耐性遺
伝子領域と記す）と、前記プラスミドｐＡＭα１由来の
複製開始領域（以下、Ｒｅｐ−ａｌと記す）と、ベクタ
ーｐＡＣＹ０１７７由来の複製開始領域（以下、０ｒｉ
−１７７と記す）と、枯草菌ｒｅｃＥ−株でプラスミド
を安定に保持する５ｏｐ−α１領域（以下、ＢＡ３領域
とする）を備えたものである。These composite shuttle vectors pH32010pH310
10 is Enterococcus faecalis (Enterococcus faecalis)
coccus faecalis) plasmid pAM
A DNA fragment of the β1-derived Macrolide-Lincosamide-Streptogram+in B resistance gene region (hereinafter referred to as the MLS resistance gene region) and Enterococcus faecalis (Ent.
ercoccus faecalis) plasmid p
The tetracycline resistance gene region derived from AM01 (hereinafter referred to as Tc resistance gene region) and Escherichia coli (Esche.
richia coli) vector pACYC177
ampicillin resistance gene region (hereinafter referred to as Ap resistance gene region) derived from the plasmid pAMα1 (hereinafter referred to as Rep-al), and replication initiation region derived from vector pACY0177 (hereinafter referred to as Ori
-177) and a 5op-α1 region (hereinafter referred to as BA3 region) that stably maintains the plasmid in the Bacillus subtilis recE- strain.
また、その派生体はＴｃ耐性遺伝子領域、Ａｐ耐性遺伝
子領域ＢＡ３領域を各々欠失させた変異体で、プラスミ
ドのサイズを小型化することにより、宿主菌内での保持
の安定性向上を図ったものである。In addition, the derivative is a mutant in which the Tc resistance gene region and the Ap resistance gene region BA3 region are deleted, and by reducing the size of the plasmid, it is possible to improve the stability of retention within the host bacteria. It is something.
これらベクターにより、グラム陽性細菌である乳酸桿菌
・枯草菌等で、今迄広く用いられてぎた大腸菌の有用遺
伝子が初めて利用可能となった。These vectors have made it possible for the first time to utilize useful genes from Escherichia coli, which have been widely used in Gram-positive bacteria such as Lactobacillus and Bacillus subtilis.
［発明が解決しようとする課題］
しかしながら、前記複合シャトルベクターｐＨ５２０１
０及びｐ）Ｉｓ １０１０とその派生体は、宿主、特に
乳酸菌細胞中での保持安定性に問題があり、本発明者ら
は宿主細胞中でのプラスミドの保持の安定性の向上を意
図し、鋭意努力の結果、保持安定性を更に向上させた本
発明の複合プラスミドベクターを得るに至った。[Problems to be Solved by the Invention] However, the composite shuttle vector pH5201
0 and p) Is 1010 and its derivatives have problems with retention stability in hosts, especially lactic acid bacteria cells, and the present inventors intend to improve the stability of plasmid retention in host cells, As a result of intensive efforts, we have now obtained the composite plasmid vector of the present invention, which has further improved retention stability.
［課題を解決するための手段］
本発明に係る複合プラスミドベクターは、乳酸桿菌に対
してマイナスオリジン活性を持つパリンドロームと、乳
酸桿菌に対してプラスオリジン活性を持つ複製開始領域
とを備えたものである。[Means for Solving the Problems] A complex plasmid vector according to the present invention includes a palindrome that has negative origin activity against Lactobacillus bacteria and a replication initiation region that has positive origin activity against Lactobacillus bacteria. It is.
さらに、前記マイナスオリジン活性を持つパリンドロー
ムとして、ラギング鎖複製開始領域のｐａ１ＡまたはＩ
Ｇを備えたものである。Furthermore, as a palindrome with negative origin activity, pa1A or I of the lagging strand replication initiation region
It is equipped with G.
また、好ましくはｐａ１Ａが黄色ぶどう球菌のプラスミ
ドｐｃ１９４又はｐＥ１９４由来の遺伝子領域であるも
のである。Preferably, pa1A is a gene region derived from Staphylococcus aureus plasmid pc194 or pE194.
また、好ましくは前記ＩＧが環状−本ｉ［Ｄ Ｎ Ａフ
ァージＭ１３由来の遺伝子領域であるものである。Preferably, the IG is a circular DNA phage M13-derived gene region.
具体的な複合プラスミドベクターｐＨ５２３１１、ｐＨ
３２３１２では、エンテロコッカス・フェカリスのプラ
スミドｐＡＭα１由来の複製開始領域（Ｒｅｐ−α１）
又は黄色ぶどう球菌のプラスミドｐＵＢ１１０白来の複
製開始領域（ＯＲＦα）と−大腸菌のプラスミドｐＡＣ
ＹＣ１７７由来の複製開始領域（Ｏｒｉ−１７７）と・
；グラム陽性細菌に機能するエンテロコッカス・フェカ
リスのプラスミドｐＡＭβ１由来のＭＬＳ耐性遺伝子領
域と；エンテロコッカス・フェカリスのプラスミドｐＡ
Ｍα１由来のテトラサイクリン耐性遺伝子領域と；グラ
ム陰性細菌である大腸菌に機能する大腸菌のベクターｐ
ＡＣＹＣ １７７由来のＡｐ耐性遺伝子領域と；枯草菌
ｒｅｃＥ−株でプラスミドを安定に保持するＢＡ３領域
と；乳酸桿菌でプラミスドを安定に保持し、マイナスオ
リジン活性を有するｐａ１Ａ遺伝子と；所定の制限酵素
認識切断部位を備えた複製に関与しない遺伝子領域であ
る多重制限酵素Ｕ識配列と；約６．８にｂｐの大きさと
；第１図に示した制限酵素Ｕ識切断部位の配列とを備え
たものである。Specific composite plasmid vector pH52311, pH
32312, the replication initiation region (Rep-α1) derived from Enterococcus faecalis plasmid pAMα1
or Staphylococcus aureus plasmid pUB110 white origin replication origin region (ORFα) and Escherichia coli plasmid pAC
YC177-derived replication initiation region (Ori-177) and
; MLS resistance gene region derived from Enterococcus faecalis plasmid pAMβ1 that functions in Gram-positive bacteria; and Enterococcus faecalis plasmid pA
Tetracycline resistance gene region derived from Mα1; Escherichia coli vector p that functions in Escherichia coli, a Gram-negative bacterium
Ap resistance gene region derived from ACYC 177; BA3 region that stably retains plasmid in Bacillus subtilis recE- strain; pa1A gene that stably retains plasmid in Lactobacillus and has negative origin activity; A multiple restriction enzyme U recognition sequence which is a gene region not involved in replication and has a cleavage site; a size of approximately 6.8 bp; and a restriction enzyme U recognition cleavage site sequence shown in Figure 1. It is.
また複合プラスミドベクターＰＨ５２５１１゜ＰＨ３２
５１２では、エンテロコッカス・フェカリスのプラスミ
ドｐＡＭα１由来の複製開始領域（Ｒｅｐ−α１）又は
黄色ぶどう球菌のプラスミドｐＬＩＢ１１０由来の複製
開始領域（ＯＲＦα）と；大腸菌のプラスミドｐＡＣＹ
Ｃ１７７由来の複製開始領域（Ｏｒｉ−１７７） とニ
ゲラム陽性細菌に機能するエンテロコッカス・フェカリ
スのプラスミドｐＡＭβ１由来のＭＬＳ耐性遺伝子領域
とニゲラム陽性細菌である枯草菌やグラム陰性細菌であ
る大腸菌に機能するエンテロコッカス・フェカリスのプ
ラスミドρＡＭα１由来のＴｃ耐性遺伝子領域と；グラ
ム陰性細菌である大腸菌に機能する大腸菌のベクターρ
ＡＣＹＣ１７７由来のＡｐ耐性遺伝子領域と乳酸桿菌で
プラスミドを安定に保持し、マイナスオリジン活性を有
するＩＧ遺伝子と；枯草菌ｒｅｃＥ−株でプラスミドを
安定に保持するＢＡ３領域と：所定の制限酵素認識切断
部位を備えた複製に関与しない遺伝子領域である多重制
限酵素認識配列と；約７．Ｏｋｂｐの大きさと；第２図
に示した制限酵素認識切断部位の配列とを備えたもので
ある。Also, composite plasmid vector PH52511゜PH32
512, the replication initiation region (Rep-α1) derived from plasmid pAMα1 of Enterococcus faecalis or the replication initiation region (ORFα) derived from plasmid pLIB110 of Staphylococcus aureus; plasmid pACY of E. coli
The replication origin region (Ori-177) derived from C177, the MLS resistance gene region derived from the Enterococcus faecalis plasmid pAMβ1 that functions in nigerum-positive bacteria, and the Enterococcus faecalis that functions in Bacillus subtilis, a nigeram-positive bacterium, and Escherichia coli, a Gram-negative bacterium. Tc resistance gene region derived from plasmid ρAMα1 of E. faecalis; E. coli vector ρ that functions in E. coli, a Gram-negative bacterium.
Ap resistance gene region derived from ACYC177, IG gene that stably maintains the plasmid in Lactobacillus and has negative origin activity; BA3 region that stably maintains the plasmid in Bacillus subtilis recE- strain: Predetermined restriction enzyme recognition cleavage site multiple restriction enzyme recognition sequences, which are gene regions not involved in replication; and about 7. It has the size of Okbp and the sequence of the restriction enzyme recognition cleavage site shown in FIG.
また複合プラスミドベクターＰＨ５４２１，１゜ＰＨ３
４２１２では、エンテロコッカス・フェカリスのプラス
ミドｐＡＭα１由来の複製開始領域（Ｒｅｐ−α１）又
は黄色ぶどう球菌のプラスミドρＵＢＩＩＯ由来の複製
開始領域（ＯＲＦα）と：大腸菌のプラスミドｐＢＲ３
２２由来の複製開始領域とニゲラム陽性細菌に機能する
エンテロコッカス・フェカリスのプラスミドｐＡＭβｌ
由来のＭＬＳ耐性遺伝子領域と；エンテロコッカス・フ
ェカリスのプラスミドｐＡＭα１白来のテトラサイクリ
ン耐性遺伝子領域と；：枯草菌ｒｅｃＥ−株でプラスミ
ドを安定に保持するＢＡ３領域と；乳酸桿菌でプラスミ
ドを安定に保持し、マイナスオリジン活性を有するＩＧ
遺伝子と；所定の制限酵素認識切断部位を備えた複製に
関与しない遺伝子領域である多重制限酵素認識配列と、
約５．８ ｋｂｐの大きさと；第３図に示した制限酵素
認識切断部位の配列とを備えたものである。Also, composite plasmid vector PH5421, 1゜PH3
4212, the replication initiation region (Rep-α1) derived from plasmid pAMα1 of Enterococcus faecalis or the replication initiation region (ORFα) derived from plasmid ρUBIIO of Staphylococcus aureus: plasmid pBR3 of E. coli.
Plasmid pAMβl of Enterococcus faecalis that functions in the replication origin region derived from 22 and nigerum-positive bacteria.
The derived MLS resistance gene region; The tetracycline resistance gene region of Enterococcus faecalis plasmid pAMα1 white; The BA3 region that stably maintains the plasmid in Bacillus subtilis recE- strain; The plasmid stably maintains in Lactobacillus, IG with negative origin activity
a gene; a multiple restriction enzyme recognition sequence that is a gene region not involved in replication that has a predetermined restriction enzyme recognition cleavage site;
It has a size of approximately 5.8 kbp; and a restriction enzyme recognition cleavage site sequence shown in FIG.
また、複合プラスミドベクターＰＨ２３１１゜ＰＨ２３
１２では、エンテロコッカス・フェカリスのプラスミド
ｐＡＭα１由来の複製開始領域（Ｒｅｐ−α１）又は黄
色ぶどう球菌のプラスミドｐＵＢＩＩＯ由来の複製開始
領域（ＯＲＦα）と；大腸菌のプラスミドｐＡＣＹＣ１
７７由来の複製開始領域（Ｏｒｉ−１７７） と；グラ
ム陽性細菌に機能するエンテロコッカス・フェカリスの
プラスミドｐＡＭβ１由来のＭＬＳ耐性遺伝子領域と、
グラム陰性細菌である枯草菌やグラム陰性細菌である大
腸菌に機能するエンテロコッカス・フェカリスのプラス
ミドｐＡＭα１由来のＴｃ耐性遺伝子領域と；グラム陰
性細菌である大腸菌に機能する大腸菌のベクターｐＡＣ
ＹＣ１７７由来のＡｐ耐性遺伝子領域と；乳酸桿菌でプ
ラスミドを安定に保持し、マイナスオリジン活性を有す
るｐａ ＩＡ遺伝子と所定の制限酵素認識切断部位を備
えた複製に関与しない遺伝子領域である多重制限酵素認
識配列と；約１ｉ、２ ｋｂｐの大ぎさと；第５図に示
した制限案認識切断部位の配列とを備えたものである。In addition, composite plasmid vector PH2311゜PH23
12, with the replication initiation region (Rep-α1) derived from the plasmid pAMα1 of Enterococcus faecalis or the replication initiation region (ORFα) derived from the plasmid pUBIIO of Staphylococcus aureus; and the plasmid pACYC1 of E. coli.
77-derived replication initiation region (Ori-177); and an MLS resistance gene region derived from Enterococcus faecalis plasmid pAMβ1 that functions in Gram-positive bacteria;
Tc resistance gene region derived from Enterococcus faecalis plasmid pAMα1 that functions in Bacillus subtilis, a Gram-negative bacterium, and Escherichia coli, a Gram-negative bacterium; and vector pAC of E. coli, which functions in Escherichia coli, a Gram-negative bacterium.
The Ap resistance gene region derived from YC177; The pa IA gene that stably maintains the plasmid in Lactobacillus and has negative origin activity, and the multiple restriction enzyme recognition gene region that is not involved in replication and has a predetermined restriction enzyme recognition cleavage site. It has a size of approximately 1 i, 2 kbp and a restriction proposal recognition cleavage site sequence shown in FIG.
更に複合プラスミドベクターＰＨ２５１１，ＰＨ２５１
２では、エンテロコッカス・フェカリスのプラスミドｐ
ＡＭα１由来の複製開始領域（Ｒｅｐ−α１）又は黄色
ぶどう球菌のプラスミドρＵＢ１１０由来の複製開始領
域（ＯＲＦα）と、大腸菌のプラスミドｐＡＣＹＣ１７
７由来の複製開始領域（Ｏｒｉ−１７７） と；グラム
陽性細菌に機能するエンテロコッカス・フェカリスのプ
ラスミドｐＡＭβ１由来のＭＬＳ耐性耐性遺伝子上域グ
ラム陰性細菌である枯草菌やグラム陰性細菌である大腸
菌に機能するエンテロコッカス・フェカリスのプラスミ
ドｐＡＭα１由来のＴｃ耐性遺伝子領域と、グラム陰性
細菌である大腸菌に機能する大腸菌のヘクターρＡＣＹ
Ｃ１７７由来のＡＰ耐性遺伝子領域と；乳酸桿菌でプラ
スミドを安定に保持し、マイナスオリジン活性を有する
ＩＧ遺伝子と二所定の制限酵素認識切断部位を備えた複
製に関与しない遺伝子領域である多重制限酵素認識配列
と；約６．５ ｋｂｐの大きさと；第４図に示した制限
酵素認識切断部位の配列とを備えたものである。Furthermore, composite plasmid vectors PH2511, PH251
2, the Enterococcus faecalis plasmid p
Replication initiation region derived from AMα1 (Rep-α1) or replication initiation region derived from Staphylococcus aureus plasmid ρUB110 (ORFα) and Escherichia coli plasmid pACYC17
Replication origin region (Ori-177) derived from 7; Upper region of MLS resistance gene derived from Enterococcus faecalis plasmid pAMβ1 that functions in Gram-positive bacteria Functions in Bacillus subtilis, a Gram-negative bacterium, and Escherichia coli, a Gram-negative bacterium Tc resistance gene region derived from plasmid pAMα1 of Enterococcus faecalis and Hector ρACY of E. coli that functions in E. coli, a Gram-negative bacterium.
AP resistance gene region derived from C177; IG gene that stably maintains the plasmid in Lactobacillus and has minus origin activity; and multiple restriction enzyme recognition, which is a gene region that is not involved in replication and has two predetermined restriction enzyme recognition cleavage sites. It has a size of approximately 6.5 kbp and a restriction enzyme recognition cleavage site sequence shown in FIG.
最後に複合プラスミドベクターＰＨ４２１１Ｐ）１４２
１２では、エンテロコッカス・フェカリスのプラスミド
ｐＡＭα１由来の複製開始領域（Ｒｅｐ−α１）又は黄
色ぶどう球菌のプラスミドｐＵＢＩＩＯ由来の複製開始
領域（ＯＲＦα）と；大腸菌のプラスミドＰＢＲ３２２
由来の複製開始領域と；グラム陽性細菌に機能するエン
テロコッカス・フェカリスのプラスミドｐＡＭβ１由来
のＭＬＳ耐性遺伝子領域と；グラム陽性細菌である枯草
菌やグラム陰性細菌である大腸菌に機能するエンテロコ
ッカス・フェカリスのプラスミドｐＡＭα１由来のＴｃ
耐性遺伝子領域と；乳酸桿菌でプラスミドを安定に保持
し、マイナスオリジン活性を有するＩＧ遺伝子と：所定
の制限酵素認識切断部位を備えた複製に関与しない遺伝
子領域である多重制限酵素認識配列と；約５．７ ｋ
ｂｐの大きさと；第６図に示した制限酵素認識切断部位
の配列とを備えたものである。Finally, the composite plasmid vector PH4211P) 142
12, with the replication initiation region (Rep-α1) derived from plasmid pAMα1 of Enterococcus faecalis or the replication initiation region (ORFα) derived from plasmid pUBIIO of Staphylococcus aureus; plasmid PBR322 of E. coli.
replication initiation region derived from; MLS resistance gene region derived from Enterococcus faecalis plasmid pAMβ1 that functions in Gram-positive bacteria; and Enterococcus faecalis plasmid pAMα1 that functions in Gram-positive bacteria Bacillus subtilis and Gram-negative bacteria Escherichia coli. Origin of Tc
A resistance gene region; An IG gene that stably maintains a plasmid in Lactobacillus and has negative origin activity; A multiple restriction enzyme recognition sequence, which is a gene region that is not involved in replication and is equipped with a predetermined restriction enzyme recognition cleavage site; 5.7k
bp size and the sequence of the restriction enzyme recognition cleavage site shown in FIG.
［作 用］
安定でしかも多コピー保持するためのベクターの条件に
はプラスミドが小型であることなど種々のものがあるが
、あるプラスミドに安定化に働く遺伝子領域を挿入する
ことにより、プラスミドの安定性を向上させることがで
きる。[Effect] There are various conditions for a vector to be stable and maintain multiple copies, such as the plasmid being small. can improve sex.
本発明者らによフて既に提案された複合シャトルベクタ
ーｐＨ３２０１０，ｐＨ３１０１０はグラム陽性細菌で
ある枯草菌・乳酸菌で機能するＭＬＳ耐性遺伝子領域と
グラム陰性細菌である枯草菌やグラム陰性細菌である大
腸菌で機能するＡｐ耐性遺伝子領域と、グラム陰性細菌
である枯草菌、乳酸菌での複製開始領域（Ｒｅｐ−α１
）とグラム陰性細菌である大腸菌での複製開始領域（ｏ
ｒｉ−１７７）と枯草菌ｒｅｃＥ−株でプラスミドを安
定に保持するＢＡ３領域とを備えたものである。The composite shuttle vectors pH32010 and pH31010, which were already proposed by the present inventors, contain an MLS resistance gene region that functions in Gram-positive bacteria Bacillus subtilis and lactic acid bacteria, and Gram-negative bacteria Bacillus subtilis and Gram-negative bacteria Escherichia coli. The Ap resistance gene region that functions in Bacillus subtilis and the replication initiation region (Rep-α1
) and the replication initiation region (o
ri-177) and a BA3 region that stably maintains the plasmid in the Bacillus subtilis recE- strain.
すなわち、枯草菌ｒｅｃＥ−株でプラスミドを安定に保
持するＢＡ３領域は、枯草菌においてマイナスオリジン
活性を有し、ラギング釦を効率的に複製することで、枯
草菌でのプラスミドの安定化に寄与している。ＢＡ３領
域がプラスミドの複製においてどのような作用をするの
か、その詳細な機構は未だ明らかとはなっていないが、
枯草菌において、ＢＡ３領域を持たないプラスミドの場
合には一本鎖ＤＮＡが蓄積し、安定に保持されないこと
が知られている（Ｊ、 Ｆ、 Ｖｉｒｅｔ ＆ Ｊ、
Ｃ，Ａｌｏｎｓ。That is, the BA3 region that stably maintains the plasmid in B. subtilis recE-strain has negative origin activity in B. subtilis, and contributes to the stabilization of the plasmid in B. subtilis by efficiently replicating the lagging button. ing. Although the detailed mechanism of how the BA3 region functions in plasmid replication is still unclear,
In Bacillus subtilis, it is known that single-stranded DNA accumulates and is not stably retained in the case of plasmids that do not have the BA3 region (J, F, Viret & J,
C. Alons.
： Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ １ｉｎｅａｒ
ｍｕｌｔｉｇｅｎｏｍｅ−１ｅｎｇｔｈｐｌａｓｍ
ｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
５ｕｂｔｉｌｊｓＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、
１５：６３４９−［１３６７（＋９８７））しかしな
がら、ＢＡ３領域は同じグラム陰性である乳酸菌に対し
てはマイナスオリジン活性を持たず、プラスミドの安定
保持に寄与しないことが判明した（特願平２−５４９２
１）。そこで、乳酸菌を宿主菌とするプラスミドとして
、より高い安定性を得ようとする場合には、乳酸菌内に
おいてプラスミドの安定化に働く遺伝子領域を導入する
必要がある。: Generation of 1inear
multigenome-1engthplasm
id molecules in Bacillus
5ubtiljs Nucleic Ac1d Res,
15:6349-[1367 (+987)) However, it was found that the BA3 region does not have negative origin activity against the same Gram-negative lactic acid bacteria and does not contribute to stable maintenance of the plasmid (Japanese Patent Application No. 2-5492
1). Therefore, in order to obtain higher stability as a plasmid that uses lactic acid bacteria as a host, it is necessary to introduce a gene region that works to stabilize the plasmid into lactic acid bacteria.
そこで、本発明は、乳酸菌を宿主菌とした場合に安定保
持されるプラスミドとして、乳酸桿菌に対してマイナス
オリジン活性を持つパリンドロームと、乳酸桿菌に対し
てプラスオリジン活性を持つ複製開始領域とを備えた複
合ブラスミトヘクターを得たものである。Therefore, the present invention has developed a palindrome that has a negative origin activity against lactobacilli and a replication initiation region that has a positive origin activity against lactobacilli as a plasmid that is stably maintained when lactic acid bacteria are used as a host bacterium. A composite blasmite hector with the following properties was obtained.
前記マイナスオリジン活性を持つパリンドロームはラギ
ング鎖複製開始領域のｐａ ＩＡまたはＩＧであるもの
か好ましい。Preferably, the palindrome having negative origin activity is pa IA or IG of the lagging strand replication initiation region.
ｐａ１Ａについては、黄色ぶどう球菌（Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）や、肺炎双球菌（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）でマイ
ナスオリジン活性を有していることが知られ（文献１）
、枯草菌においては弱いマイナスオリジン活性を有する
ことが報告され（文献２）、さらにＩＧについてはｐａ
１Ａとホモロジーを有することか報告されていた（文献
１）遺伝子領域である。これら遺伝子領域は、乳酸菌を
宿主としたベクターの安定化因子として機能することが
、本発明で初めて確認されたものである。For pa1A, Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus)
ococcus aureus) and diplococcus pneumoniae (St
reptococcalpneumoniae) and is known to have negative origin activity (Reference 1).
It has been reported that Bacillus subtilis has weak negative origin activity (Reference 2), and IG has been reported to have weak negative origin activity in Bacillus subtilis.
This is a gene region that has been reported to have homology with 1A (Reference 1). It was confirmed for the first time in the present invention that these gene regions function as stabilizing factors for vectors using lactic acid bacteria as hosts.
＊文献１ ： Ｉｎ１ｔｉａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｒｓ＋ｏｎ ｏｆ ｓｉ
ｎｇｌｅ ５ｔｒａｎｄ ｔｏ ｄｏｕｂｌｅ ５ｔｒ
ａｎｄｅｄ ＤＮＡｆｏｒｍｓ ｉｎ ｔｈｅ
５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｐｌａｓｍｉｄ Ｐ
ＬＳＩ。*Reference 1: Invention signals
for the convers+on of si
ngle 5trand to double 5tr
anded DNAforms in the
5treptococcal plasmid P
LSI.
Ｇｌｏｒｉａ ）１．ｄｅｌ ５ｏｌａｒ、Ａｎｔ
ｏｎｉｏ Ｐｕｙｅｔ ａｎｄ ＭａｎｕｅｌＥ
ｓｐｉｎｏｓａ
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
ｖｏｌｕｍｅ １５ ｎｕｍｂｅｒ １４１９
８７、 ５５６１−５５８０
＊文献２ ： Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＤＮＡ
ｔｒａｎｓｆａｒ ｉｎ ｆａｃｔｏｃｏｃｃｉ、Ｃｈ
ａｐｔｅｒ Ｖｌ、５１ｍ１ｌａｒｉｔｙ ｏｆ
ｍ１ｎｕｓ ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ ｒｅｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｏ
ｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｓ ｏｆ ｐ
ｌａｓｍｉｄｓ ｐＵＢｌｌｏ、ｐＴＢ９１３ ａ
ｎｄ ｐＭＶＩ５８Ｓｕｂａ＋１ｔｔｅｄ ｔｏ
Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 Ｄａｎｉ
ｅｌ ｖａｎ ｄｅｒｅｌｉｅ
また、好ましくは更に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）で機能する複製開始領域と、グラム陰性細菌
に機能する薬剤耐性遺伝子領域と、グラム陰性細菌であ
る大腸菌に機能する薬剤耐性遺伝子領域と、所定の制限
酵素認識部位を備えた複製に関与しない遺伝子領域であ
る多重制限酵素認識配列とを備えたものでは、グラム陰
性細菌である大腸菌とグラム陰性細菌である乳酸菌や枯
草菌等とを利用した遺伝子操作における好適なシャトル
ベクターとして利用することかできる。Gloria) 1. del 5olar, Ant
Onio Puyet and ManuelE
spinosa Nucleic Ac1ds Re5earch
volume 15 number 1419
87, 5561-5580 *Reference 2: Mechanisms of DNA
transfer in factococci, Ch.
apter Vl, 51m1rarity of
m1nus origins of repl
cation and franking o
pen reading frames of p
lasmids pUBllo, pTB913a
nd pMVI58Suba+1tted to
Nucl, Ac1ds Res, Dani
Preferably, Escherichia coli (E. coli) is also used.
A replication initiation region that functions in E. coli), a drug resistance gene region that functions in Gram-negative bacteria, a drug resistance gene region that functions in Escherichia coli, a Gram-negative bacterium, and a designated restriction enzyme recognition site that is not involved in replication. Those equipped with multiple restriction enzyme recognition sequences, which are gene regions, can be used as suitable shuttle vectors in genetic manipulation using Gram-negative bacteria such as Escherichia coli and Gram-negative bacteria such as lactic acid bacteria and Bacillus subtilis. .
更に、好ましくは枯草菌ｒｅｃＥ−株でプラスミドを安
定に保持するＢＡ３領域を挿入することにより、乳酸菌
と枯草菌とを宿主とする、さらに優れたシャトルベクタ
ーとして利用することができる。Furthermore, by inserting the BA3 region that stably maintains the plasmid, preferably in the Bacillus subtilis recE- strain, it can be used as an even better shuttle vector that uses lactic acid bacteria and Bacillus subtilis as hosts.
更に、乳酸菌などのグラム陰性細菌を宿主菌とした場合
には、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）のプラスミドｐＡＭβ
１由来のマクラロライド（Ｍａｃｒｏｌｉｄｅ） −リ
ンコサミド（Ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄａ） −ストレプ
トグラミン・ビー（Ｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｍｉｎ Ｂ）
（Ｍ Ｌ Ｓ ）耐性遺伝子か形質転換体の検出に
有効なマーカーとして利用できる。Furthermore, when Gram-negative bacteria such as lactic acid bacteria are used as host bacteria, Enterococcus faecalis (Enterococcus faecalis)
occus faecalis) plasmid pAMβ
Macrolide from 1 - Lincosamida - Streptogramin B
(MLS) Can be used as a marker effective for detecting resistance genes or transformants.
また、枯草菌などのグラム陰性細菌や犬１１！菌などの
グラム陰性細菌を宿主菌とした場合には、エンテロコッ
カス・フェカリスのプラスミドｐＡＭα１由来のテトラ
サイクリン（Ｔｃ）耐性遺伝子領域が形質転換体の検出
に有効なマーカーとして利用できる。In addition, Gram-negative bacteria such as Bacillus subtilis and dog 11! When a Gram-negative bacterium such as a fungus is used as a host, the tetracycline (Tc) resistance gene region derived from plasmid pAMα1 of Enterococcus faecalis can be used as an effective marker for detecting transformants.
また、大腸菌なとの；グラム陰性１菌を宿主菌とした場
合には、大腸菌のプラスミドρＡＣＹＣ１７７由来のｏ
ｒｉ−１７７が、宿主菌内でのヘクターの複製・増殖に
利用できる。In addition, when the host bacterium is a gram-negative bacterium such as Escherichia coli, o
ri-177 can be used for the replication and proliferation of Hector within the host bacteria.
本発明の具体的な実施例として、第１図に示したｐＨ５
２３１１、ｐＨ３２３１２、第２図に示したｐＨ３２５
１１、ｐＨ３２５１２は、乳酸菌において安定な複合プ
ラスミドベクターであるとともに、乳酸菌、大腸菌、枯
草菌間でのシャトルベクターとしても利用でき、かつＢ
Ａ３領域を備えていることにより枯草菌内で安定に保持
されうる。As a specific example of the present invention, the pH5 shown in FIG.
2311, pH 32312, pH 325 shown in Figure 2
11. pH32512 is a complex plasmid vector that is stable in lactic acid bacteria, and can also be used as a shuttle vector between lactic acid bacteria, Escherichia coli, and Bacillus subtilis.
By having the A3 region, it can be stably retained in Bacillus subtilis.
本発明の具体的な実施例として、第３図に示したｐＨ５
４２１１、ｐＨ３４２１２は上記と同様の利点を備えて
いるとともに、後述するように、ＤＮＡの塩基配列決定
においても有用である。As a specific example of the present invention, pH 5 as shown in FIG.
4211, pH 34212 has the same advantages as above, and is also useful in DNA base sequencing, as described below.
本発明の具体的な実施例として、第５図に示したｐＨ２
３１１、ｐＨ２３１２、第４図に示したｐＨ２５１１、
ｐＨ２５１２は、乳酸菌において安定な複合プラスミド
ベクターであるとともに、乳酸菌、大腸菌、枯草菌間で
のシャトルベクターとして利用できるものである。As a specific example of the present invention, the pH 2 shown in FIG.
311, pH 2312, pH 2511 shown in Figure 4,
pH2512 is a complex plasmid vector that is stable in lactic acid bacteria, and can also be used as a shuttle vector between lactic acid bacteria, Escherichia coli, and Bacillus subtilis.
さらに、本発明の具体的な実施例として、第６図に示し
たｐＨ４２１１，、ｐＨ４２１２は、乳酸菌において安
定な複合プラスミドベクターであるとともに、乳酸菌、
大腸菌、枯草菌間でのシャトルベクターとしても利用で
き、後述するように、ＤＮＡの塩基配列決定においても
有用なものである。Furthermore, as a specific example of the present invention, pH4211 and pH4212 shown in FIG. 6 are composite plasmid vectors that are stable in lactic acid bacteria, and
It can also be used as a shuttle vector between E. coli and Bacillus subtilis, and is also useful in DNA base sequencing, as described below.
ところで、ＩＧについては、ｐａｃｋａｇｅ活性をもち
、ジデオキシ法での塩基配列決定において有用であるこ
とが、かつてから知られ、広く利用されている。すなわ
ち、ｐＵｃ１１９などＩＧをもつ二本８ＲＤ Ｎ Ａプ
ラスミドが存在する菌体に、ヘルパーファージＭ１３Ｋ
Ｏ７を感染させることで、プラスミドは一本鎖ＤＮＡと
なり、ファージ粒子に包みこまれ（ｐａｃｋａｇｉｎｇ
） 菌体外に放出される。これにより、二本鎖Ｄ Ｎ
Ａを一木６１ Ｄ Ｎ Ａとして回収することができ
るので、ジデオキシ法による塩基配列決定にただちに使
用でざる。さらに、Ｍ１３ＫＯ７のようなｐ１５Ａの複
製開始領域（ｏｒｉ−１７７など）をもりたファージを
ヘルパーファージとして使用することが一般的であるが
、このような場合には、Ｐ１５Ａ由来の複製開始領域を
もたないプラスミドの方が優先的にｐａｃｋａｇｉｎｇ
されることが知られていた。したがって、本発明の具体
的な実施例として後述するｐＨ３４２１１、ｐＨ３４２
１２、ｐＨ４２１１、ｐＨ４２１２では、；グラム陰性
細菌である大腸菌において機能する複製開始領域を、大
腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２系統のプラスミド由来の
ものとすることによフて、塩基配列決定に特に有用な複
合プラスミドベクターを得た。Incidentally, IG has been known for a long time to have package activity and to be useful in determining base sequences using the dideoxy method, and is widely used. In other words, helper phage M13K is added to a bacterial cell containing two 8RD DNA plasmids with IG such as pUc119.
By infecting O7, the plasmid becomes single-stranded DNA and is packaged into phage particles.
) Released outside the bacterial body. This results in double-stranded D N
Since A can be recovered as Ichiki 61 DNA, it can be used immediately for base sequence determination by the dideoxy method. Furthermore, it is common to use a phage such as M13KO7 that has a p15A replication initiation region (ori-177, etc.) as a helper phage; Packaging is preferential for plasmids without
It was known that it would happen. Therefore, as specific examples of the present invention, pH 34211, pH 342
12, pH4211, and pH4212; The replication initiation region that functions in Escherichia coli, a Gram-negative bacterium, is derived from a plasmid of the Escherichia coli plasmid pBR322 strain, making it a complex plasmid vector particularly useful for base sequencing. I got it.
尚、本発明で得られた複合シャトルベクターのうち、プ
ラスミドｐＨ３２３１２，ｐＨ５２５１１、ｐＨ５４２
１１を保持した大腸菌は各々徴工研究菌寄第１１５１７
号、第１１５１６号、第１１５１８号として工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されており、他のプラスミ
ドについては、後述する実施例に沿って容易に合成可能
であるため、寄託の必要がないと判断した。Of the composite shuttle vectors obtained in the present invention, plasmids pH32312, pH52511, pH542
The E. coli bacteria carrying 11 were classified as Recruit Research Bacteria Collection No. 11517.
No. 1, No. 11516, and No. 11518 have been deposited with the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology. Other plasmids do not need to be deposited as they can be easily synthesized according to the examples described below. I decided that.
［実旅例コ
■ 複合プラスミドベクター
１、複合プラスミドベクターｆ）Ｈ３２３１１，ｐＨ３
２３１２の合成
第７図に基づいて概要を説明すれば次の通りである。[Example ■ Composite plasmid vector 1, Composite plasmid vector f) H32311, pH3
The outline of the synthesis of 2312 will be explained based on FIG. 7 as follows.
合成のための出発材料としてはプラスミドｐＨ３２０１
０（微工研菌寄第１０３３６号）及びｐＣ１９４（三菱
化成生命研、田中暉夫博士より分与）を使用した。本実
施例で得られたｐＨ３２３１１及びｐＨ３２３１２はｐ
Ｈ３２０１０にρＣ１９４より得られたｐａ１Ａ遺伝子
を挿入した構成となっている。ｐａ１Ａはいわゆるパリ
ンドロームと呼ばれる２回回転対照構造をもつ遺伝子領
域であることが知られている。Plasmid pH3201 as starting material for synthesis
pC194 (distributed from Mitsubishi Kasei Life Research Institute, Dr. Akio Tanaka) was used. pH32311 and pH32312 obtained in this example are p
It has a configuration in which the pa1A gene obtained from ρC194 is inserted into H32010. pa1A is known to be a gene region with a double rotation contrast structure called a palindrome.
詳細にはｐｃ１９４ＤＮＡを制限酵素５ａｕ３ＡＩとＢ
ａ ｎ ＩＩ＋で切断して種々の長さの切断片を得た
。ざらにＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理を行って両端を平
滑化した。それらの中から０．７＊低融点アガロースゲ
ル電気泳動と、フェノール抽出法及びエタン−ル沈殿法
を行い、２７７ｂｐのＤＮＡフラグメントを取り出した
。次にｐＨ５２０１０ＤＮＡを全領域中、唯一の認識切
断部位である制限酵素Ａａｔ１１で開裂した後、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ処理を行って両端を平滑化した後、ア
ルカリフォスファターゼ処理を施し、同様にフェノール
抽出法、エタノール沈殿法とを行って約６．５ ｋｂｐ
のＤＮＡフラグメントを得た。得られた２つのフラグメ
ントを混合し、Ｔ４リガーゼにより反応させた。反応さ
せたプラスミドＤＮＡに大腸菌コンピテント細胞を加え
、０℃で１５分間放置した後、４２℃９０秒間の熱ショ
ックを与え、氷中１分間冷却した後、ＬＢ−グロス（バ
タトトリプトン １％。In detail, pc194 DNA was digested with restriction enzymes 5au3AI and B.
Cutting pieces with various lengths were obtained by cutting with a n II+. It was then treated with T4 DNA polymerase to make both ends blunt. A 277 bp DNA fragment was extracted from them by 0.7* low melting point agarose gel electrophoresis, phenol extraction method and ethane precipitation method. Next, after cleaving the pH52010 DNA with the restriction enzyme Aat11, which is the only recognition cleavage site in the entire region, T4D
After smoothing both ends by NA polymerase treatment, alkaline phosphatase treatment was performed, and the same phenol extraction method and ethanol precipitation method were performed to obtain approximately 6.5 kbp.
A DNA fragment was obtained. The two obtained fragments were mixed and reacted with T4 ligase. E. coli competent cells were added to the reacted plasmid DNA, left at 0°C for 15 minutes, heat-shocked at 42°C for 90 seconds, cooled on ice for 1 minute, and then treated with LB-gross (Batato tryptone 1%).
酵母エキス０．５％、 ＮａＣ１０，５％、グルコース
０．１零をｌＮ−ＮａＯＨでｐＨ７，０に調整）を加え
て、３７℃にて１時間培養した。次いで、この培養液を
テトラサイクリンを添加したＬＢ寒天培地の表面に塗布
して、−夜培養して形質転換体を得た。得られたプラス
ミドのｐａ１Ａ遺伝子領域の方向性を常法により決定し
た。Yeast extract 0.5%, NaC 10.5%, glucose 0.1 zero (adjusted to pH 7.0 with IN-NaOH) were added and cultured at 37°C for 1 hour. Next, this culture solution was applied to the surface of an LB agar medium supplemented with tetracycline, and cultured overnight to obtain a transformant. The orientation of the pa1A gene region of the obtained plasmid was determined by a conventional method.
第１ （ａ） （ｂ）図は得られたｐＨ３２３１１とｐ
Ｈ５２３１２の制限酵素地図である。図に示す通り、ｐ
ａ１Ａ遺伝子がｐＨ５２０１０のＲｅｐ−Ｃ１と逆方向
に挿入されたものをｐＨ５２３１１、同一方向に挿入さ
れたものをｐＨ５２３１２とした。Figures 1 (a) and (b) show the obtained pH 32311 and p
This is a restriction enzyme map of H52312. As shown in the figure, p
The one in which the a1A gene was inserted in the opposite direction to Rep-C1 at pH 52010 was designated as pH 52311, and the one in which the a1A gene was inserted in the same direction was designated as pH 52312.
２、複合プラスミドベクターｐＨ３２５１１，ｐＨ３２
５１２の合成
第８図は複合プラスミドベクターｐＨ５２５１１及びｐ
Ｈ３２５１２の合成経路を示す説明図である。2. Composite plasmid vector pH32511, pH32
Synthesis of 512 Figure 8 shows the composite plasmid vector pH52511 and p
FIG. 2 is an explanatory diagram showing the synthesis route of H32512.
第８図に基づいて概要を説明すれは次の通りである。The outline will be explained based on FIG. 8 as follows.
合成のための出発材料としてはプラスミドｐＨ３２０１
０（徹工研菌寄第１０３３６号）及びＰＵＣ１１９（宝
酒造社製）を使用した。木実施例で得られたｐＨ５２５
１１及びｐＨ３２５１２はｐＨ３２０１０にｐＵｃｌ
１９ （３１６２ｂｐ）より得られたＩＧ遺伝子を挿入
した構成となっている。ＩＧはいわゆるパリンドローム
と呼ばれる２回回転対照構造をもつ遺伝子領域であるこ
とが知られている。Plasmid pH3201 as starting material for synthesis
0 (Tetsukoken Bokuyori No. 10336) and PUC119 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) were used. pH 525 obtained in wood example
11 and pH 32512 were added with pUcl to pH 32010.
It has a structure in which the IG gene obtained from No. 19 (3162 bp) is inserted. IG is known to be a gene region with a double rotation contrast structure called a palindrome.
詳細にはｐＵｃｌ １９ＤＮＡを制限酵素ＡｐａＬＩと
Ｄｒａｌで切断して種々の長さの切断片を得た。その切
断片の中から０．７＊低融点アガロースケル電気泳動と
フェノール抽出法及びエタノール沈殿法を行い、更にＴ
４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ ）処理を行って両端を平滑化した約１．４ ｋ
ｂｐのＤＮＡフラグメントを取り出した。Specifically, pUcl 19 DNA was digested with restriction enzymes ApaLI and Dral to obtain fragments of various lengths. The cut pieces were subjected to 0.7* low melting point agarose gel electrophoresis, phenol extraction method, and ethanol precipitation method, and then T
4DNA polymerase (T4DNA polymerase)
Approximately 1.4 k with both ends smoothed by processing
A bp DNA fragment was extracted.
これをＢｂｅＩリンカ−（ＢｂｅＩ １ｉｎｋｅｒ）
と混合し、Ｔ４リガーゼ（Ｔ４ ｌｉｇａｓｅ）
により反応させた後、６０℃１５分間の熱処理を行いＴ
４リガーゼを失活させた。Use this as BbeI linker (BbeI 1inker)
Mix with T4 ligase (T4 ligase)
After the reaction, heat treatment was performed at 60°C for 15 minutes and
4 ligase was inactivated.
この両端にＢｂｅＩ １ｉｎｋｅｒを付着させた断片を
制限酵素Ｂｂｅｌで切断し、二種類の長さの切断片を得
た。その切断片の中から０．７に低融点アガロースゲル
Ｎ、 気泳動、フェノール抽出法及びエタノール沈殿法
を行い、５３４ｂｐのＤＮＡフラグメントを取り出した
。次にＰＨ３２０１０ＤＮＡを全領域中、唯一の認識切
断部位である制限酵素Ｂｂｅｌて開裂した後、アルカリ
フォスファターゼ処理を施し、同様にフェノール抽出法
、エタノール沈殿法とを行って約６．５ ｋｂｐのＤＮ
Ａフラグメントを得た。得られた２つのフラグメントを
混合し、Ｔ４リガーゼにより反応させた。反応させたプ
ラスミドＤＮＡに大腸菌コンピテント細胞を加え、０℃
で１５分間放置した後、４２℃９０秒間の熱ショックを
与え、氷中１分間冷却した後ＬＢ−グロス（バタトトリ
プトン １％、酵母エキス０．５％ＮａＣ１Ｏ，５％、
グルコース ０１％をＩ Ｎ −Ｎａ０１＋でｐＨ７０
に調整）を加えて、３７℃にて１時間培養した。次いで
、この培養ン夜をテトラサイクリンを添加したＬＢ寒天
培地の表面に塗布して、−夜培養して形質転換体を得た
。得られたプラスミドの工Ｇ遺伝子領域の方向性を常法
により決定した。This fragment with Bbel 1 inker attached to both ends was cut with the restriction enzyme Bbel to obtain cut fragments of two different lengths. A DNA fragment of 534 bp was extracted from the cut fragment by performing low melting point agarose gel N, pneumophoresis, phenol extraction, and ethanol precipitation. Next, the PH32010 DNA was cleaved using the restriction enzyme Bbel, which is the only recognition cleavage site in the entire region, and then treated with alkaline phosphatase, followed by the same phenol extraction method and ethanol precipitation method to obtain approximately 6.5 kbp DNA.
A fragment was obtained. The two obtained fragments were mixed and reacted with T4 ligase. Add E. coli competent cells to the reacted plasmid DNA and heat at 0°C.
After leaving for 15 minutes at 42°C, heat shock was applied for 90 seconds at 42°C, and after cooling in ice for 1 minute, LB-gloss (Batato tryptone 1%, yeast extract 0.5% NaClO, 5%,
Glucose 01% with IN-Na01+ pH70
(adjusted to ) and cultured at 37°C for 1 hour. Next, this culture was spread on the surface of an LB agar medium supplemented with tetracycline, and cultured overnight to obtain transformants. The orientation of the engineered G gene region of the obtained plasmid was determined by a conventional method.
第２ （ａ） （ｂ）図は得られたｐＨ３２５１１と
ｐＨ５２５１２の制限酵素地図である。図に示す通り、
ＩＧ遺伝子がｐＨ３２０１０のＲｅｐ−ａｌと逆方向に
挿入されたものをｐＨ３２５１１，同一方向に１Φ人さ
れたものをｐ １１５２５１２とした。Figures 2 (a) and (b) are restriction enzyme maps of pH32511 and pH52512 obtained. As shown in the figure,
The one in which the IG gene was inserted in the opposite direction to Rep-al at pH 32010 was designated as pH 32511, and the one in which the IG gene was inserted in the same direction by 1Φ was designated as p1152512.
３ 複合プラスミドベクターｐＨ５４２１１，ＰＨＳ
４２１２の合成
第９図は複合プラスミドヘクターｐ ｌ（Ｓ ４２１１
及びｐ Ｈ３４２１２の合成経路を示す説明ｌである。3 Complex plasmid vector pH54211, PHS
Synthesis of 4212 Figure 9 shows the composite plasmid Hector p l (S 4211
and explanation l showing the synthetic route of pH34212.
第９図に基づいて概要を説明すれば次の通りである。The outline will be explained based on FIG. 9 as follows.
合成のための出発材Ｉ４としてはプラスミドｐ ｌｌ５
２０１０（徴工研菌寄第、１０３３６号）及びｐＵＣＩ
＋８（宝酒造社製）を使用した。未実施例テ得られたｐ
ＨＳ ４２１１及びｐＨ３４２１２はｐ ＨＳ ２０
１０のＭＬＳ、ＢＡ３．Ｔｃ” 、Ｒｅｐ−α１を含む
断片と、ｐＵｃＩ１８のＩＧ、１ａｃＺ’、複製開始領
域を含む断片を組合せた構成となっている。Plasmid pll5 as starting material I4 for the synthesis
2010 (Collaborative Research Institute No. 10336) and pUCI
+8 (manufactured by Takara Shuzo) was used. Unexamined p obtained
HS 4211 and pH 34212 are pH HS 20
10 MLS, BA3. It has a combination of a fragment containing pUcI18 IG, 1acZ', and the replication initiation region.
菖Ｙ細にはｐＵｃＩ １８ＤＮ八を湘ノ「艮酵累Ｅｃｏ
ｌＯ！］ＩとＤｒａｒで切断して種々の長さの切断片を
マクだ。In the irises, pUcI 18DN8 is added to the
lO! ] Cut with I and Drar to make cut pieces of various lengths.
その切断片の中から０．７に低融点アガロースゲル電気
泳動とフェノール抽出法及びエタノール沈殿法を行い、
約２ ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを取り出した。これ
を更に４ＤＮＡボソメラーゼ（Ｔ４ＤＮ Ａ ｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ）処理を行って両端を平滑化し、フェル
ル抽出法及びエタノール沈殿法を行っｔコ後、アルカリ
フオスファターセ処理を施し、同様にフェノール抽出法
、エタノール沈殿法を行いＤＮＡフラグメントを得た。Among the cut pieces, 0.7 was subjected to low melting point agarose gel electrophoresis, phenol extraction method, and ethanol precipitation method.
A DNA fragment of about 2 kbp was extracted. This was further treated with 4DNA bosomerase (T4DNA pol
ymerase) treatment to make both ends smooth, ferrule extraction method and ethanol precipitation method were performed, followed by alkaline phosphatase treatment, and phenol extraction method and ethanol precipitation method were similarly performed to obtain DNA fragments.
次にｐＨ３２０１０ＤＮＡを全領域中、唯一の認識切断
部位である制限酵素ＥｃｏＲＩ と Ａａ口１で開裂し
、２つの断片を得た。その切断片の中から０７を低融点
アガロースケル泳動とフェノール抽出法及びエタノール
沈殿法を行い、約４．７ ｋｂｐのＤＮＡフラグメント
を取り出した。これを更にＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理
を行って両端を平滑化し、フェノール抽出法、エタノー
ル沈殿法を行いフラグメントを得た。Next, the pH32010 DNA was cleaved with restriction enzymes EcoRI and Aa1, which are the only recognition cleavage sites in the entire region, to obtain two fragments. From among the cut fragments, 07 was subjected to low melting point agarose gel electrophoresis, phenol extraction, and ethanol precipitation, and a DNA fragment of about 4.7 kbp was extracted. This was further treated with T4 DNA polymerase to blunt both ends, and subjected to phenol extraction and ethanol precipitation to obtain a fragment.
マリらねた２つのフラグメントを混合し、丁４ソガーゼ
により反応させた。反応させたプラスミドＤＮＡに大腸
菌コンピテント細胞を加え、０℃で１５分間放置した後
、４２℃９０秒間の熱ショックを与え、氷中１分間玲却
した後ＬＢ−ブロス（バクトドリブトン １％、酵母エ
キス ０５％。The two marinated fragments were mixed and reacted with D4 sogase. E. coli competent cells were added to the reacted plasmid DNA, left at 0°C for 15 minutes, heat-shocked at 42°C for 90 seconds, incubated on ice for 1 minute, and then washed with LB-broth (Bactodributon 1%, yeast extract). 05%.
ＮａＣｌ ０．５ｋ 、グルコース ０．１！をＩ Ｎ
−Ｎａ０１１’ＣｐＨ７，０１，：調整）を加えて、
３７℃にて１１侍間ｊ８養した０次いで、このｊＢ養液
をテトラサイタリンを添加したＬＢ寒天培地の表面に塗
イロして、−夜培養しで形１１転換体を＋５た。ｊすら
れたプラスミドの■Ｇ遺伝子領域の方向性を常法により
決定した。NaCl 0.5k, glucose 0.1! I N
-Na011'CpH7,01,: adjustment) was added,
The cells were incubated at 37 DEG C. for 11 hours.Then, this JB nutrient solution was spread on the surface of an LB agar medium supplemented with tetracytalline, and the cells were cultured overnight to obtain a Form 11 transformant. The orientation of the G gene region of the plasmid was determined by a conventional method.
第３ （ａ＞ （ｂ）図は得られたｐＨ５４２１１と
ｐＨ３４２１２の制限酵素地図である。図に示す通り、
ＩＧ遺伝子がＰＨ３ＩＱＩＯのＲｅｐ−ａ＋と）ヂ方向
に挿入されたものをｐ Ｈ３４２１１、同方向に挿入さ
れたものをｐ Ｈ３４２１２とした。Figure 3 (a> (b) is the restriction enzyme map of pH 54211 and pH 34212 obtained. As shown in the figure,
The one in which the IG gene was inserted in the ) direction of Rep-a+ of PH3IQIO was designated as pH34211, and the one in which the IG gene was inserted in the same direction was designated as pH34212.
４、複合プラスミドヘクターｐＨ２５１１，ｐＨ２５１
２の合成
第１１間（ま複合ブラスミ）へベクターｐ）ｌ ２５１
１及びｐＨ２５１２の合成経路を示す説明Ｕ；！１であ
る。4. Complex plasmid Hector pH2511, pH251
2 synthesis 11th interval (composite blasmi) vector p)l 251
Explanation U showing the synthetic route of 1 and pH2512;! It is 1.
′ｆｊ１１図に基づいて概要を説明すれば次の通りであ
る。The outline will be explained based on FIG. 11 as follows.
合成のための出発材料としてはプラスミドｐＭＳＫ７２
１及びｐＨ３２５１１，ｐＨ５２５１２を使用した。木
実層側で得られたｐ Ｈ２５１１及びｐＨ２５１２はｐ
＋（Ｓ ２５１１、ｐ ）（Ｓ ２５ ＋２よりＢΔ
３領域を除いて／ＩＪられた構成とｒ、ｚっている。ｐ
ＭｓＫ７２１は、ｐＬＹ２０１ （徴土回菌寄第９５
５５号、１１．１ｋｂｌ から、Ｍ Ｌ Ｓ耐イ′を遺
伝子領域を含むＩｆ ｉ ｎ Ｐ １部位で挟まれた領
域（１、１ｋｂ）をＩＩ ｉ ｎ Ｐ Ｉで切り出し、
これを複合プラスミドｐＨＹ １６３ Ｐ Ｌ Ｋ （
ＦＥＭＳ Ｊｐｎ、 Ｊ、 Ｇｅｎｅｌ ６０：４８５
４９Ｂ、 ＋９８５）のＤＮＡをＳｍａ１部位にクロー
ニングして合成したものである。Plasmid pMSK72 as starting material for synthesis
1, pH 32511, and pH 52512. pH2511 and pH2512 obtained on the nut layer side are p
+ (S 2511, p ) (BΔ from S 25 +2
Except for 3 regions, the structure is similar to the IJ configuration. p
MsK721 is pLY201
From No. 55, 11.1 kbl, a region (1, 1 kb) sandwiched between If in P 1 sites including the MLS resistance A' gene region was excised with II in P I,
This was combined into a complex plasmid pHY 163 PLK (
FEMS Jpn, J, Genel 60:485
49B, +985) was cloned into the Sma1 site.
詳細にはｐＭＳＫ７２１ ＤＮＡを制限酵ｉＢａｍｌｌ
■で切断して、Ｇ塩基のみ加えたＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼ処理を行い両端を平滑化した。更に制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで開裂し、２つの異なる大きさの切断片を得た。For details, transfer pMSK721 DNA to restriction enzyme iBamll.
It was cut with (2) and treated with T4 DNA polymerase containing only the G base to make both ends blunt. Furthermore, the restriction enzyme EcoR
Cleavage was performed with I to obtain two different sized fragments.
その切断片の中から０．７％低融点アガロースゲル電気
泳動とフェノール抽出法及びエタノール沈殿法を行い、
約１．１ ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを取り出した。The cut pieces were subjected to 0.7% low melting point agarose gel electrophoresis, phenol extraction method, and ethanol precipitation method.
A DNA fragment of approximately 1.1 kbp was extracted.
次にｐＨ３２５１１，ｐ［（Ｓ２５１２ＤＮＡを制限酵
素ＮａｒＩで不完全に開裂した後、Ｔ４ポリメラーゼ処
理を施し、末端を平滑化し、フェノール抽出法、エタノ
ール沈殿法とを行って、更にＥｃｏＲＩによる開裂を行
い数種の異なる長さの切断片を得た。その切断片の中か
ら０．７％低融点アガロースゲル泳動とフェノール抽出
法及びエタノール沈殿法を行い、約５．４ ｋｂｐの切
断片を得た。このフラグメントにアルカリフォスファタ
ーゼ処理を施し同様にフェノール抽出法、エタノール沈
殿法とを行いフラグメントを得た。得られた２つのフラ
グメントを混合し、Ｔ４リガーゼにより反応させた。反
応させたプラスミドＤＮＡに大腸菌コンピテント細胞を
加え、０℃で１５分間放置した後、４２℃９０秒間の熱
ショックを与え、氷中１分間冷却した後ＬＢ−ブロス（
ハタトドリブトン １％、酵母エキス ０５％、 Ｎａ
Ｃｌ Ｏ，繋、グルコース０１七をｌＮ−ＮａＯＨで１
））１７．０に調整）を加えて、３７℃にて１時間培養
した。次いで、この培養液をテトラサイクリンを添加し
たＬＢ寒天培地の表面に塗布して、−夜培養して形質転
換体を得た。得られたプラスミドのＩＧ遺伝子領域の方
向性を常法により決定した。Next, pH 32511, p[(S2512 DNA was incompletely cleaved with the restriction enzyme NarI, treated with T4 polymerase, the ends were blunted, phenol extraction method and ethanol precipitation method were performed, and further cleaved with EcoRI. Cut fragments of different lengths of the species were obtained. The cut fragments were subjected to 0.7% low melting point agarose gel electrophoresis, phenol extraction, and ethanol precipitation to obtain a cut fragment of about 5.4 kbp. This fragment was treated with alkaline phosphatase and similarly subjected to phenol extraction and ethanol precipitation to obtain a fragment. The two obtained fragments were mixed and reacted with T4 ligase. Tent cells were added and left at 0°C for 15 minutes, then heat shocked at 42°C for 90 seconds, cooled on ice for 1 minute, and then added to LB-broth (
Hatatodributon 1%, yeast extract 05%, Na
ClO, connective, glucose 017 with lN-NaOH 1
)) was added and cultured at 37°C for 1 hour. Next, this culture solution was applied to the surface of an LB agar medium supplemented with tetracycline, and cultured overnight to obtain a transformant. The orientation of the IG gene region of the obtained plasmid was determined by a conventional method.
第４ （ａ） （ｂ）図は得られたｐ、Ｈ２５１１とｐ
Ｈ２５１２の制限酵素地図である。図に示す通り、ＩＧ
遺伝子がＲｅｐ−Ｃ１と逆方向に挿入されたものをｐＨ
２５１１，同一方向に挿入されたものをｐＨ２５１２と
した。Figures 4 (a) and (b) show the obtained p, H2511 and p
This is a restriction enzyme map of H2512. As shown in the figure, IG
The gene inserted in the opposite direction to Rep-C1 is pH
2511, and the one inserted in the same direction was set to pH 2512.
５、複合プラスミドベクターｐＨ２３１１，ｐＨ２３１
２の合成
第１０図は複合プラスミドベクターｐＨ２３１１及びｐ
Ｈ２３１２の合成経路を示す説明図である。5. Composite plasmid vector pH2311, pH231
Figure 10 shows the composite plasmid vector pH2311 and p
FIG. 2 is an explanatory diagram showing the synthesis route of H2312.
第１０図に基づいて概要を説明すれは次の通りである。The outline will be explained based on FIG. 10 as follows.
合成のための出発材料としてはプラスミドｐ）（２５１
１及びｐＨ３２３１１，ｐＨ５２３１２を使用した。本
実施例で得られたｐＨ２３１１及びｐＨ２３１２はｐＨ
２０１２のＡｐａＬＩ−Ｎｓｉ＋ ｌａｒｇｅｆｒａｇ
ｍｅｎｔとｐＨ３２３１１，ｐＨ３２３１２の＾ｐａＬ
Ｉ−ＮｓｊＩ ｓｍａ１］ｆｒａｇｍｅｎｔを連結させ
たものである。Plasmid p) (251
1, pH 32311, and pH 52312 were used. pH2311 and pH2312 obtained in this example are pH
2012 ApaLI-Nsi+ largefrag
ment and pH32311, pH32312 ^paL
I-NsjI sma1] fragments are concatenated.
詳細にはｐＨ２５１１ＤＮＡを制限酵素ＮａｒｌとＮａ
ｅｌで切断して種々の長さの切断片を得た。モしてＴ４
リガーゼにより反応させた。反応させたプラスミドＤＮ
Ａに大腸菌コンピテント細胞を加え、０℃で１５分間放
置した後、４２℃９０秒間の熱ショックを与え、氷中１
分間冷却した後ＬＢ−グロス（ハタトドリブトン １％
、酵母エキス０．５％、 ＮａＣ１０，５零、グルコー
ス０．１！ｋをｌＮ−Ｎａ０）１でｐＨ７，０に調整）
を加えて、３７℃にて１時間培養した。次いで、この培
養液をテトラサイクリンを添加したＬＢ寒天培地の表面
に塗布して、−夜培養して約５．９ｋｂｐの形質転換体
を得た。ここで得られた形質転換体をｐＨ２０１２とし
、出発材料とした。ざらにこのｐＨ２０１２ＤＮＡを制
限酵素ＡｐａＬＩ とＮ５ｉＩで切断して、異なる長さ
の２木の切断片を得た。その切断片の中から０．７％低
融点アガロースゲル電気泳動とフェノール抽出法及びエ
タノール沈殿法を行い、約４．９ ｋｂｐのＤＮＡフラ
グメントを取り田した。In detail, pH2511 DNA is digested with restriction enzymes Narl and Na
Cut pieces of various lengths were obtained by cutting with el. Moshite T4
Reaction was performed using ligase. Reacted plasmid DN
Add E. coli competent cells to A, leave at 0°C for 15 minutes, heat shock at 42°C for 90 seconds, and incubate in ice for 15 minutes.
After cooling for a minute, LB-Gloss (Hatatodributon 1%)
, yeast extract 0.5%, NaC 10.5 zero, glucose 0.1! Adjust k to pH 7.0 with lN-Na0)1)
was added and cultured at 37°C for 1 hour. Next, this culture solution was spread on the surface of an LB agar medium supplemented with tetracycline, and cultured overnight to obtain a transformant of about 5.9 kbp. The transformant obtained here was adjusted to pH 2012 and used as a starting material. This pH2012 DNA was roughly cut with restriction enzymes ApaLI and N5iI to obtain two cut pieces of different lengths. The cut fragment was subjected to 0.7% low melting point agarose gel electrophoresis, phenol extraction, and ethanol precipitation, and a DNA fragment of approximately 4.9 kbp was obtained.
これをアルカリフォスファターゼ処理を施し、同様にフ
ェノール抽出法、エタノール沈ＷｊＬ法とを行って約４
．９ ｋｂｐ Ｄ Ｎ Ａフラグメントを得た。This was treated with alkaline phosphatase, and similarly subjected to phenol extraction method and ethanol precipitation WjL method to obtain approximately 4.
．． A 9 kbp DNA fragment was obtained.
次にｐＨ５２３１１，ｐＨ５２３１２ＤＮＡを全領域中
、唯一の肥識切断部位である制限酵素ＡｐａＬＩ とＮ
５ｉｌで開裂し、二種類の長さの切断片を得た。その切
断片の中から０７％低融点アガロースゲル泳動とフェノ
ール抽出法及びエタノール沈殿法とを行って、約１．３
ｋｂｐ Ｄ Ｎ Ａフラグメントを得た。Next, the pH52311 and pH52312 DNAs were extracted with the restriction enzymes ApaLI and N
Cleavage was performed with 5il to obtain two different lengths of fragments. The cut pieces were subjected to 0.7% low melting point agarose gel electrophoresis, phenol extraction method, and ethanol precipitation method, and approximately 1.3
A kbp DNA fragment was obtained.
得られた２つのフラグメントを混合し、Ｔ４リガーゼに
より反応させた。反応させたプラスミドＤＮＡに大腸菌
コンピテント細胞を加え、ｏｔで１５分間放置した後、
４２℃９０秒間の熱ショックを与え、氷中１分間冷却し
た後しＢ・−ブロス（バタトトリブトン １％、酵母エ
キス ０５％ＮａＣ１Ｏ，５堀 グルコース Ｏ，ｌ
ＸをｌＮ−ＮａＯＨでｐＨ７，０に調整）を加えて、３
７℃にて１時間培養した。次いで、この培養液をテトラ
サイクリンを添ｉ二
加したＬＢ寒天培地の表面に塗布して、−夜培養して形
質転換体を得た。得られたプラスミドのＰａ１Ａ遺伝子
領域の方向性を常法により決定した。The two obtained fragments were mixed and reacted with T4 ligase. E. coli competent cells were added to the reacted plasmid DNA and left in the oven for 15 minutes.
Heat shock at 42°C for 90 seconds, cool in ice for 1 minute, and then add B-broth (1% batatotributone, 05% yeast extract, 05% NaCl, 100 glucose, 0,1
(adjusted to pH 7.0 with 1N-NaOH)
The cells were cultured at 7°C for 1 hour. Next, this culture solution was applied to the surface of an LB agar medium supplemented with tetracycline and cultured overnight to obtain transformants. The orientation of the Pa1A gene region of the obtained plasmid was determined by a conventional method.
第５ （ａ） （ｂ）図は得られたｐＨ２３１１とｐ
Ｈ２３１２の制限酵素地図である。図に示す通り、Ｐａ
１Ａ遺伝子がＲｅｐ−α１と逆方向に挿入されたものを
ｐＨ２３１１、同一方向に挿入されたものをＰＨ２３１
２とした。Figures 5 (a) and (b) show the obtained pH 2311 and p
This is a restriction enzyme map of H2312. As shown in the figure, Pa
The one in which the 1A gene was inserted in the opposite direction to Rep-α1 is called pH2311, and the one in which the 1A gene is inserted in the same direction is called PH231.
It was set as 2.
６、複合プラスミドベクターｐＨ４２１，１，ｐＨ４２
１２の合成
第１２図は複合ブラスミトヘクターｐＨ４２１１及びｐ
Ｈ４２１２の合成経路を示す説明図である。6. Composite plasmid vector pH421, 1, pH42
Synthesis of 12 Figure 12 shows the composite plasmid hector pH 4211 and p
FIG. 2 is an explanatory diagram showing the synthesis route of H4212.
第１２図に基づいて概要を説明すれば次の通りである。The outline will be explained based on FIG. 12 as follows.
合成のための出発材料としてはベクターｐＢＲ３２２（
宝酒造社製）及びｐＨ２５１１，ｐＨ２５１２を使用し
た。本実施例で得られたｐＨ４２１１及びｐＨ４２１２
はｐＨ２５１１，ｐＨ２５１２よりｏｒｉ−１７７とＡ
ｐ Ｒを除き、ｐＢＲ３２２の複製開始領域を挿入し
て得られた構成となっている。Starting material for the synthesis was the vector pBR322 (
(manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and pH 2511 and pH 2512 were used. pH4211 and pH4212 obtained in this example
is ori-177 and A from pH 2511 and pH 2512.
It has a configuration obtained by inserting the replication initiation region of pBR322 except for pR.
詳細には、ｐＢＲ３２２ＤＮＡを制限酵素ＮｄｅｌとＤ
ｒａｌで切断して、Ｔ４ポリメラーゼ処理を行い両端を
平滑化し、異なる大きさのＤＮＡ断片を得た。その断片
の中から０．７９６低融点アガロースゲル電気沫動とフ
ェノール抽出法及びエタノール沈殿法を行い９３５ｂｐ
のＤＮＡフラグメントを取り比した。In detail, pBR322 DNA was digested with restriction enzymes Ndel and D.
It was cut with ral and treated with T4 polymerase to make both ends blunt to obtain DNA fragments of different sizes. From among the fragments, 0.796 low melting point agarose gel electrophoresis, phenol extraction method, and ethanol precipitation method were performed to obtain 935 bp.
DNA fragments were compared.
次にｐＨ２５１１，ｐＨ２５１２ＤＮＡを制限酵素Ｈｉ
ｎ ｄ ＩＩＩと Ａａｔｌ［で開裂し、種々の大き
ざの断片を得た後、Ｔ４ポリメラーゼ処理を行い、末端
を平滑化し、フェノール抽出法、エタノール沈殿法とを
行って更にアルカリフオスファターセ処理を施し、同様
にフェノール抽出法、エタノール沈殿法とを行った。こ
れらの断片の中から０．７％低融点アガロースゲル電気
泳動とフェノール抽出法及びエタノール沈殿法を行い約
４．８ｋｂｐの切断片を得た。得られた２つのタラグメ
ントを混合しＴ４リガーゼにより反応させた。反応させ
たプラスミドＤＮＡに大腸菌コンピテント細胞を加え、
０℃で１５分間放置した後、４２℃９０秒間の熱ショッ
クを与え、氷中１分間冷却した後、ＬＢグロス（バタト
トリブトン １％、酵母エキス０．５％ＮａＣ：Ｉ Ｏ
，５零 グルコース ０．１零をＩ Ｎ −ＮａＯＨ
でｐ）Ｉ７．０に調整）を加えて３７℃にて１時間培養
した。次いで、この培養液をテトラサイクリンを添加し
たＬＢ寒天培地の表面に塗布して一夜培養して形質転換
体を得た。形質転換体のうち、Ｈｉ ｎ ｄｌ１１部位
のあるものを選択し、ＰＨ４２１１，ｐＨ４２１２とし
た。得られたプラスミドのｒＧ遺伝子領域の方向性を常
法により決定した。Next, pH2511, pH2512 DNA was treated with restriction enzyme Hi.
After cleavage with ndIII and Aatl to obtain fragments of various sizes, the fragments were treated with T4 polymerase to blunt the ends, followed by phenol extraction, ethanol precipitation, and further treatment with alkaline phosphatase. The phenol extraction method and ethanol precipitation method were performed in the same manner. These fragments were subjected to 0.7% low melting point agarose gel electrophoresis, phenol extraction, and ethanol precipitation to obtain a cleaved fragment of about 4.8 kbp. The two obtained tagragments were mixed and reacted with T4 ligase. Add E. coli competent cells to the reacted plasmid DNA,
After being left at 0°C for 15 minutes, heat shock was applied at 42°C for 90 seconds, and after cooling in ice for 1 minute, LB gloss (1% batatotributone, 0.5% yeast extract NaC:I O
, 5 zero glucose 0.1 zero I N -NaOH
p) (adjusted to I7.0) was added and cultured at 37°C for 1 hour. Next, this culture solution was applied to the surface of an LB agar medium supplemented with tetracycline and cultured overnight to obtain a transformant. Among the transformants, those with the Hin dl11 site were selected and set to pH4211 and pH4212. The orientation of the rG gene region of the obtained plasmid was determined by a conventional method.
第６図（ａ） （ｂ）は得られたＰ Ｈ４２１，１とＰ
Ｈ４２１２の制限酵素地図である。図に示す通り、ＩＧ
遺伝子がＲｅｐ−α１と逆方向に挿入されたものをｐＨ
４２１１，同一方向に挿入されたものをｐＨ４２１２と
した。Figure 6 (a) and (b) show the obtained P H421,1 and P
This is a restriction enzyme map of H4212. As shown in the figure, IG
The gene was inserted in the opposite direction to Rep-α1 at pH
4211, and the one inserted in the same direction was set to pH 4212.
以上のように新規なシャトルベクターｐＨ３２３１１、
ｐＨ３２３１２，ｐＨ３２５１２，ρ Ｈ３２５１２，
ｐＨ３４２１１，ｐＨ３４２１２ｐＨ２３１１，ＰＨ２
３１２，ｐＨ２５１１，ｐＨ２５１２，ｐＨ４２１１，
ｐＨ４２１２が得られた。各ベクターの複製開始領域と
薬剤耐性遺伝子との関係を次の第１表に示す。As mentioned above, the new shuttle vector pH32311,
pH32312, pH32512, ρ H32512,
pH34211, pH34212pH2311, PH2
312, pH2511, pH2512, pH4211,
A pH of 4212 was obtained. The relationship between the replication initiation region of each vector and the drug resistance gene is shown in Table 1 below.
ＩＩ 、複合シャトルベクターの安定性１．安定性試験
シャトルベクターｐＨ３２０１０，ｐＨ３２５１１、ｐ
Ｈ３２５１２，ｐＨ５２３１１，ｐＨ３２３１２、ＰＨ
５４２１１，ＰＨ３４２１２，ＰＨ２５１１，ｐＨ２５
１２，ｐＨ２３１１，ｐＨ２３１２、ｐＨ２０１０を使
用し、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｃａｓｅｉ）の形質転換を電気穿孔法（エレク
トロポーション法）により行った。形質転換体の選択に
はエリスロマイシン耐性（２０ｇｇ／ｍりの表現型を用
いた。得られた形質転換体をエリスロマイシン２０μｇ
／ ｍｌを含むロゴサ培地（Ｒｏｇｏｓａ ｍｅｄｉ
ｕｍ； １℃中、グルコース２０ｇ、ｌ−リブチケー
スベプトン ｔｏｇ、酵［エキス ５ｇ、トリプトース
３ ｇ、 ＩｈＨＰＯ４３ｇ、クエン酸アンモニウム
２ｇ１酢酸ナトリウム Ｉｇ、 ツイーン８０ １
ｇ 、ＭｇＳＯ４・Ｉ（２００，５７５ｇ、 Ｌ−シ
スティン塩酸塩０．５ｇ、 Ｍｎ５ＯＪ２００．１２ｇ
、 ＦｅＳＯ４’７Ｈ２０８４ｍｇを含む： ｐ）１６
．８ ） ５ ｍｌ中で３７℃、１晩静置培養を行い
、得られた細胞から薬剤を除くため洗浄を行りた後、再
び薬剤を含まないロゴサ培地５ｍｌに懸濁した。この懸
濁液を薬剤を含まないロゴサ培地１０ｍ１に１０４希釈
となるように接種し、３７℃で初期定常期（ｅａｒｌｙ
５ｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ；約１５***）ま
で１晩（１９時間）静置培養した。同様の方法で、１晩
静置培養したこの培養液を、薬剤を含まないロゴサ培地
へ継代し、約１５***ごとにサンプリングを行った。各
々の継代直前の培養液を希釈し、それを薬剤なしのロゴ
サ寒天プレート上とエリスロマイシン２０μｇ／ｍ Ｉ
を含むロゴサ寒天プレート上とで３７℃２日間培養を行
った。得られた全コロニー中の薬剤耐性コロニーの割合
を安定度として求めた。II. Stability of composite shuttle vectors 1. Stability test shuttle vector pH32010, pH32511, p
H32512, pH52311, pH32312, PH
54211, PH34212, PH2511, pH25
12, pH 2311, pH 2312, and pH 2010.
lus casei) was transformed by electroporation method. Erythromycin resistance (20 mg/m2) was used for selection of transformants.
Rogosa medium containing /ml
um; At 1°C, 20 g of glucose, 1-ributicase beptone tog, 5 g of fermentation extract, 3 g of tryptose, 43 g of IhHPO, ammonium citrate
2g1 Sodium Acetate Ig, Tween 80 1
g, MgSO4・I (200,575g, L-cystine hydrochloride 0.5g, Mn5OJ200.12g
, containing 2084 mg of FeSO4'7H: p) 16
．． 8) Static culture was performed overnight at 37°C in 5 ml, and the resulting cells were washed to remove the drug, and then suspended again in 5 ml of Rogosa medium containing no drug. This suspension was inoculated into 10 ml of drug-free Rogosa medium at a dilution of 104, and was incubated at 37°C in the early stationary phase.
The cells were statically cultured overnight (19 hours) until 5tationary phase (approximately 15 divisions). In the same manner, this culture solution, which had been left to stand overnight, was subcultured to Rogosa medium containing no drug, and sampling was performed approximately every 15 divisions. Dilute the culture just before each passage and place it on Rogosa agar plates without drugs and 20 μg/m I of erythromycin.
Culture was carried out at 37°C for 2 days on Rogosa agar plates containing . The percentage of drug-resistant colonies among all the colonies obtained was determined as stability.
第１３図は各プラスミドの継代培養での安定性の代表的
な結果を示す線図である。FIG. 13 is a diagram showing typical results of the stability of each plasmid during subculture.
第１３図に示す通り、ラクトバチルス・カゼイ中におけ
るプラスミドベクターの安定性はコントロールのｐＨ３
２０１０及びｐＨ２０１０と比較して、ＩＧやｐａ Ｉ
Ａを持つものの方か分子量（プラスミドベクターのサイ
ズ）に関係なく安定であった。即ち、黄色ブドウ球菌や
肺炎双球菌でマイナスオリジン活性を持ち、枯草菌で弱
いマイナスオリジン活性を持つｐａ ＩＡや、ｐａ１Ａ
と類似性のあるＩＧはラクトバチルス・カゼイの中でも
マイナスオリジン活性を有することが示唆された。As shown in Figure 13, the stability of the plasmid vector in Lactobacillus casei was lower than that of the control pH 3.
Compared with 2010 and pH2010, IG and pa I
Those with A were more stable regardless of molecular weight (size of plasmid vector). That is, pa IA and pa1A have negative origin activity in Staphylococcus aureus and Diptococcus pneumoniae and weak negative origin activity in Bacillus subtilis.
It was suggested that IG with similarities to Lactobacillus casei has negative origin activity.
λ、−木鎖プラスミドＤＮＡの検出
複合シャトルベクターｐＨ３２５１１，ｐＨ３２５１２
、ｐＨ２５１１，ｐＨ２５１２，ｐＨ５２３１１、ｐＨ
５２３１２，ｐＨ２３１１，ｐＨ２３１２は、何れもエ
ンテロコッカス・フェカリスのプラスミドｐＡＭα１由
来の複製開始領域Ｒｅｐ−ａ１を持ち、さらにｐＨ３２
３１１，ｐＨ５２３１２，ｐＨ２３１１； ｐＨ２３
１２ては黄色ブドウ球菌、肺炎双球菌、枯草菌なとてマ
イナスオリジン活性を持つｐａ１Ａを持つ。またｐＨ３
２５１１，ｐＨ５２５１２，ｐＨ２５１１，ｐＨ２５１
２は、ｐａ ＩＡと類似性があるＩＧを持つ。λ, - detection of wood chain plasmid DNA composite shuttle vector pH32511, pH32512
, pH2511, pH2512, pH52311, pH
52312, pH2311, and pH2312 all have the replication initiation region Rep-a1 derived from the plasmid pAMα1 of Enterococcus faecalis, and furthermore, pH32
311, pH52312, pH2311; pH23
12 Staphylococcus aureus, Dilococcus pneumoniae, and Bacillus subtilis have pa1A with negative origin activity. Also pH 3
2511, pH52512, pH2511, pH251
2 has an IG similar to pa IA.
黄色ぶどう球菌由来のプラスミドｐｃ１９４由来のｐａ
１Ａ遺伝子については、黄色ぶどう球菌や肺炎双球菌で
はマイナスオリジン活性を有し、枯草菌においては、弱
いマイナスオリジン活性を有することが報告されている
。さらにＭ１３由来のＩＧ遺伝子については先に示した
ｐａ１Ａとホモロジーを有することが報告されている。pa from Staphylococcus aureus-derived plasmid pc194
It has been reported that the 1A gene has negative origin activity in Staphylococcus aureus and Diptococcus pneumoniae, and weak negative origin activity in Bacillus subtilis. Furthermore, it has been reported that the IG gene derived from M13 has homology with pa1A shown above.
一方、前記安定性試験でラクトバチルス・カゼイではｐ
Ｈ３２５１１，ｐＨ５２５１２，ｐＨ２５１１、ｐＨ２
５１２，ｐＨ３２３１１，ｐＨ３２３１２、ｐＨ２３１
１，ｐＨ２３１２でｐａ１Ａ又はＩＧが安定性向上に貢
献していることか示唆され、ベクタープラスミドＤＮＡ
複製の際、ラギング釦の効率的複製がなされた可能性が
考えられた。このため、これら８ｆ重のプラスミドＤＮ
Ａを各々保持するラクトバチルス・カゼイ細胞ではｐａ
１ＡやＩＧの存在により一本鎖プラスミドＤＮＡの蓄積
がなくなるかを調べた。On the other hand, in the stability test, Lactobacillus casei
H32511, pH52512, pH2511, pH2
512, pH32311, pH32312, pH231
1. At pH 2312, it was suggested that pa1A or IG contributed to improving the stability, and vector plasmid DNA
It is thought that the lagging button may have been efficiently replicated during replication. Therefore, these 8f heavy plasmid DNAs
In Lactobacillus casei cells that each carry A, pa
We investigated whether the presence of 1A or IG eliminates the accumulation of single-stranded plasmid DNA.
詳細には二本＆ＪＩ Ｄ Ｎ Ａはニトロセルロースフ
ィルターに吸着しないことを利用し、サザン・フィルタ
・パイプリダイゼーションをアガロースゲルのアルカリ
変性なしに行フた。使用したＤＮＡはｐＨ３２５１１，
ｐＨ３２５１２，ｐＨ２５１１ｐＨ２５１２，ｐＨ３２
，３１１，ｐＨ５２３１２、ｐＨ２３１１，ｐＨ２３１
２を用いた。二本鎖プローブとして図１４に示したｐＨ
Ｙ３００ＰＬＫ（特願昭５９−１０５４１１）、−末鎖
の５ｔｒａｎｄ ５ｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｖｅとして
図１５に示したＭ１３ｍｐｌＢ Ｎｏ、５．Ｍ１３ｍ
ｐ１Ｂ Ｎｏ、１７を用い、３２ｐの標識はマルチプ
ライム・ＤＮＡ・ラベリング・システム・キット（アマ
ジャム社製）を使用した。なお、Ｍ １３ｍｐ １８
Ｎｏ、５は、取得した組換えファージＤＮＡにユニバ
ーサルブライマーをつけて、そこからＤＮＡを合成させ
たとき、Ｒｅｐ−α１より複製された（＋）鎮とハイブ
リダイズするものてあり、Ｍ１３ｍｐ１８Ｎｏ、１７は
、（−）釦とハイブリダイズするものである。Specifically, taking advantage of the fact that Nihon & JI DNA does not adsorb to nitrocellulose filters, Southern filter piperidization was performed without alkaline denaturation of the agarose gel. The DNA used had a pH of 32511,
pH32512, pH2511pH2512, pH32
, 311, pH52312, pH2311, pH231
2 was used. The pH shown in Figure 14 as a double-stranded probe
Y300PLK (Japanese Patent Application No. 59-105411), M13mplB No. shown in FIG. M13m
p1B No. 17 was used, and 32p was labeled using Multiprime DNA Labeling System Kit (manufactured by Amajam). In addition, M 13mp 18
No. 5 is the one that hybridizes with the (+) tail replicated from Rep-α1 when a universal primer is attached to the obtained recombinant phage DNA and DNA is synthesized from it, and M13mp18 No. 17 is , (-) button.
また−末鎖ＤＮＡか蓄積するプラスミドとしてｐＨ５２
０１０，ｐＨ２０ゴＯを用いた。−木！］ ＤＮＡであ
ることを確認するため、−末鎖の核酸のみ特異的に消化
するＳ−１ヌクレアーゼ（宝酒造社製）を用いた。Also, as a plasmid that accumulates end-strand DNA, pH 52
010, pH 20 GoO was used. - Tree! ] In order to confirm that it was DNA, S-1 nuclease (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), which specifically digests only the -terminal strand of nucleic acid, was used.
第１６図は未変性ゲルのサザン・フィルタ・パイプリダ
イゼーションの結果を示す説明図である。（ａ） はプ
ローブにＭ １３ｍｐ １８ Ｎｏ、５゜（ｂ）はＭ
１３ｍｐｆ８ Ｎｏ、１７、（ｃ）はＰｉ−［Ｙ３０
０ＰＬＫを用いた。各レーンは、（ａ） （ｂ）
（ｃ）ともに以下の材料を用いたものである。FIG. 16 is an explanatory diagram showing the results of Southern filter piperidization of native gel. (a) is M 13mp 18 No. on the probe, 5° (b) is M
13mpf8 No, 17, (c) is Pi-[Y30
0PLK was used. Each lane is (a) (b)
(c) Both use the following materials.
レーン 材料
ｐＨ３２０１０を持つラクトバチルス・カゼイの溶菌液
ｐＨ５２５１１
ｐＨ３２５１を十ｓ−を処理
ｐＨ３２５１２
ｐＨ５２５１２＋Ｓ −１処理
ｐＨ２５１１
ｐＨ２５１１＋ｓ−１処理
ｐＨ２５１２
ｐＨ２５１２＋ｓ−１処理
ｐＨ５２３１１
ｐＨ３２３１１＋Ｓ−１処理里
１２ ｐＨ３２３１２
１３ｐＨ３２３１２＋Ｓ−１処理
１４ ｐＨ２３１１
１５ｐＨ２３１１＋Ｓ−１処理
１６ ｐＨ２３１２
１７ｐＨ２３１２＋Ｓ−１処理
１８ ９Ｈ２０１０
図に示す通り、ゲル（ａ） （ｃ）の対照のｐ）Ｉｓ
２０１０、ｐＨ，２０１０（レーン１．１８）は−木
ｉｆｆ Ｄ Ｎ Ａが確認されたが、ＩＧ＋ｐａ１Ａを
持つ、その他のプラスミドベクターではＳ−１ｆｉ理を
したものもしないものも一本６１ Ｄ Ｎ Ａは検出さ
れなかった。またゲル（ｂ）のＭ１３ｍｐ１８Ｎｏ。Lane Material Lysis solution of Lactobacillus casei with pH 32010 pH 52511 pH 3251 treated with 10 s- pH 32512 pH 52512 + S-1 treatment pH 2511 pH 2511 + s-1 treatment pH 2512 pH 2512 + s-1 treatment pH 52311 pH 32311 + S-1 treatment 12 pH32312 13pH32312+S-1 treatment 14 pH2311 15pH2311+S -1 treatment 16 pH2312 17pH2312+S-1 treatment 18 9H2010 As shown in the figure, gel (a) (c) control p) Is
2010, pH, 2010 (lane 1.18) was confirmed to have -tree iff DNA, but other plasmid vectors with IG+pa1A, with and without S-1fi processing, had 61 DNA. was not detected. Also, M13mp18No in gel (b).
１７をプローブとしたものについては対照のｐＨ５２０
１０、ｐＨ２０１０（レーン１．１８）についても−木
＆ｉ Ｄ Ｎ Ａがほとんど検出されなかった。For those using 17 as a probe, the control pH 520
10, pH 2010 (lane 1.18) - almost no wood & i DNA was detected.
従って、予想通り、−木鎮ブラスミＦＤＮＡの蓄積はＩ
Ｇやｐａ１Ａを持つプラスミドでは見られなくなり、ま
た５ｔｒａｎｄ ５ｐｅｃｉｆｉｃに見られることが示
され、ＩＧ、ｐａ１Ａはラクトバチルス・カゼイにおい
てラギング釦の複製開始領域として機能していることが
確認された。Therefore, as expected, the accumulation of I
It was shown that IG and pa1A are no longer observed in plasmids containing G and pa1A, and are observed in 5tran 5specific, confirming that IG and pa1A function as the replication initiation region of the lagging button in Lactobacillus casei.
［発明の効果］
以上説明した通り、本発明により；グラム陰性細菌であ
る大腸菌と、グラム陽性細菌である乳酸桿菌・枯草菌等
の異種の細胞中でも自律増殖可能であり、しかも宿主細
胞中に安定保持されるクローニングベクターとして有用
な新規な複合プラスミドベクターが得られた。[Effects of the Invention] As explained above, the present invention enables autonomous proliferation in cells of different species such as Escherichia coli, a Gram-negative bacterium, and Lactobacillus and Bacillus subtilis, which are Gram-positive bacteria, and is stable in host cells. A novel complex plasmid vector useful as a retained cloning vector has been obtained.
特にラクトバチルス・カゼイの宿主−ヘクター系を確立
することは産業上の要請となっていることから、；グラ
ム陰性菌の代表菌種である大腸菌と；グラム陽性菌の代
表菌種である乳酸桿菌、枯草菌の間を往復できるシャト
ルベクターとして利用できる新規なプラスミドヘクター
を開発し得たことは、ラクトバチルス・カゼイ等の；グ
ラム陽性菌のＤＮＡクローニングシステムの確立への一
つの段階を克服するものとして意義深く、さらに、今迄
広く用いられてきた大腸菌の有用遺伝子をグラム腸性細
菌である乳酸桿菌・枯草菌等へ導入・利用することが可
能となるという産業上の利用分野も広がる等の効果かあ
る。In particular, it is an industrial requirement to establish a host-Hecter system for Lactobacillus casei; Escherichia coli, a representative species of Gram-negative bacteria; and Lactobacillus, a representative species of Gram-positive bacteria. The development of a novel plasmid hector that can be used as a shuttle vector to shuttle between B. subtilis and Bacillus subtilis overcomes one step toward establishing a DNA cloning system for Gram-positive bacteria such as Lactobacillus casei. Furthermore, the field of industrial application will expand as it will become possible to introduce and utilize useful genes from Escherichia coli, which have been widely used until now, into Gram enteric bacteria such as Lactobacillus and Bacillus subtilis. It's effective.
第１ （ａ） （ｂ）図は複合ブラスミトヘクターｐ
Ｈ３２３１１及びｐＨ３２３１２の制限酵素地図、第２
（ａ） （ｂ）図は複合プラスミドへフタ−ｐＨ３
２５１１及びｐＨ３２５１２の制限酵素地図、第３ （
ａ） （ｂ）図は複合プラスミドベクターｐＨ５４２
１１及びｐ）１５４２１２の制限酵素地図、第４図（ａ
） （ｂ）は複合プラスミドベクターｐＨ２５１１及
びｐＨ２５１２の制限酵素地図、第５図（ａ） （ｂ
）は複合プラスミドベクターｐＨ２３１１及びｐＨ２３
１２の制限酵素地図、第６図（ａ） （ｂ） は複合
プラスミドベクターｐＨ４２１１及びｐＨ４２１２の制
限酵素地図、第７図は複合ブラスミトヘクターｐＨ５２
３１１及びｐＨ５２３１２の合成経路を示す説明図、第
８図は複合プラスミドベクターｐＨ５２５１１及びｐＨ
５２５１２の合成経路を示す説明図、第９図は複合プラ
スミドベクターｐＨ５４２１１及びｐＨ５４２１２の合
成経路を示す説明図、第１０図は複合プラスミドベクタ
ーｐＨ２３１１及びｐＨ２３１２の合成経路を示す説明
図、第１１図は複合プラスミドベクターｐＨ２５１１及
びｐＨ２５１２の合成経路を示す説明図、第１２図は複
合プラスミドベクターｐＨ４２１１及びｐＨ４２１２の
合成経路を示す説明図、第１３図は各プラスミドの継代
培養ての安定性を示す線図、
第１４図はサザンハイプリダイゼーションに使用したり
、Ｓ、ｐｒｏｖｅ ＤＮＡの制限酵素地図、
第１５図はサザンハイプリダイゼーションに使用した５
ｔｒａｎｄ ５ｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｖｅの合成経路
を示す説明図、
第１６図は未変性ゲルのサザン・フィルタ・ハイブリダ
イゼーションの結果を示す説明図である。
図中、ＭＬＳＲはＭＬＳ耐性遺伝子領域、ＴｃＲはテト
ラサイクリン耐性遺伝子領域、Ａ Ｐ Ｒはアンピシリ
ン耐性遺伝子領域、０ｒｉ１７７はｐＡＣＹＣ１７７由
来の複製開始領域、ＢＡ３は枯草菌ｒｅｃＥ−細胞中で
プラスミドを安定に保持し、マイナスオリジン活性を有
する領域、ｏｒｉはＰＢＲ３２２由来の複製開始領域、
ＩＧ、ｐａ１Ａはラクトバチルス・カゼイ細胞でプラス
ミＦを安定に保持し、マイナスオリジン活性を有する領
域である。
代理人 弁理士 佐 藤 正 年
Ｕ）
α〕
手続補正書（自発）
平成３年５月１６日
５、補正の対象Figures 1 (a) and (b) show the composite plasmid hector p.
Restriction enzyme map of H32311 and pH32312, 2nd
(a) (b) The figure shows the lid to the complex plasmid - pH3
Restriction enzyme map of 2511 and pH32512, No. 3 (
a) (b) The figure shows composite plasmid vector pH542
11 and p) Restriction enzyme map of 154212, Figure 4 (a
) (b) Restriction enzyme map of composite plasmid vectors pH2511 and pH2512, Figure 5(a) (b)
) are composite plasmid vectors pH2311 and pH23
12 restriction enzyme maps, Figure 6 (a) and (b) are restriction enzyme maps of the composite plasmid vector pH4211 and pH4212, Figure 7 is the restriction enzyme map of the composite plasmid vector pH52.
An explanatory diagram showing the synthetic route of 311 and pH52312, Figure 8 shows the composite plasmid vector pH52511 and pH52312.
9 is an explanatory diagram showing the synthetic route of composite plasmid vectors pH54211 and pH54212. Figure 10 is an explanatory diagram showing the synthetic route of composite plasmid vectors pH2311 and pH2312. An explanatory diagram showing the synthetic route of plasmid vectors pH2511 and pH2512, Fig. 12 is an explanatory diagram showing the synthetic route of composite plasmid vectors pH4211 and pH4212, and Fig. 13 is a diagram showing the stability of each plasmid after subculture. Figure 14 shows the restriction enzyme map of S,prove DNA used in Southern hybridization.
FIG. 16 is an explanatory diagram showing the synthetic route of trand 5 specific probe. FIG. 16 is an explanatory diagram showing the results of Southern filter hybridization of native gel. In the figure, MLSR is the MLS resistance gene region, TcR is the tetracycline resistance gene region, APR is the ampicillin resistance gene region, 0ri177 is the replication initiation region derived from pACYC177, and BA3 is the region that stably maintains the plasmid in Bacillus subtilis recE- cells. , a region with minus origin activity, ori is a replication initiation region derived from PBR322,
IG and pa1A are regions that stably retain plasmid F in Lactobacillus casei cells and have negative origin activity. Agent: Patent Attorney Masaru Sato, 2010) α〕 Procedural Amendment (Voluntary) May 16, 1991 5, Subject of Amendment
Claims (17)
リンドロームと、乳酸桿菌に対してプラスオリジン活性
を持つ複製開始領域とを備えたことを特徴とする複合プ
ラスミドベクター。(1) A composite plasmid vector comprising a palindrome having negative origin activity against lactobacilli and a replication initiation region having positive origin activity against lactobacilli.
おいて、 前記マイナスオリジン活性を持つパリンドロームがラギ
ング鎖複製開始領域のｐａ１ＡまたはＩＧであることを
特徴とする複合プラスミドベクター。(2) The composite plasmid vector according to claim 1, wherein the palindrome having negative origin activity is pa1A or IG of the lagging strand replication initiation region.
おいて、 ｐａ１Ａが黄色ぶどう球菌（￥Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ￥）のプラスミドｐＣ１９４又は
ｐＥ１９４由来の遺伝子領域である複合プラスミドベク
ター。(3) In the composite plasmid vector according to claim 2, pa1A is Staphylococcus aureus.
A composite plasmid vector that is a gene region derived from plasmid pC194 or pE194 of P. cus aureus ¥).
おいて、 前記ＩＧが環状一本鎖ＤＮＡファージＭ１３由来の遺伝
子領域である複合プラスミドベクター。(4) The composite plasmid vector according to claim 2, wherein the IG is a gene region derived from circular single-stranded DNA phage M13.
おいて、 前記プラスオリジン活性を持つ複製開始領域がエンテロ
コッカス・フェカリス（￥Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｆａｅｃａｌｉｓ￥）のプラスミドｐＡＭα１由来の複
製開始領域（Ｒｅｐ−α１）又は黄色ブドウ球菌（￥Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ￥）のプラ
スミドｐＵＢ１１０由来の複製開始領域（ＯＲＦα）で
あることを特徴とする複合プラスミドベクター。(5) In the composite plasmid vector according to claim 1, the replication initiation region having positive origin activity is derived from Enterococcus faecalis.
faecalis￥) or the replication initiation region (Rep-α1) derived from plasmid pAMα1 of Staphylococcus aureus (￥S
A composite plasmid vector characterized in that it is a replication initiation region (ORFa) derived from plasmid pUB110 of Taphylococcus aureus ¥).
ミドベクターにおいて、 大腸菌（￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ￥）で機
能する複製開始領域と； グラム陽性細菌に機能する薬剤耐性遺伝子領域と； グラム陰性細菌である大腸菌に機能する薬剤耐性遺伝子
領域と； 所定の制限酵素認識部位を備えた複製に関与しない遺伝
子領域である多重制限酵素認識配列とを更に備えたこと
を特徴とする複合プラスミドベクター。(6) In the composite plasmid vector according to any one of claims 1 to 5, a replication initiation region that functions in Escherichia coli; a drug resistance gene region that functions in Gram-positive bacteria; and Gram-negative bacteria. A complex plasmid vector further comprising: a drug resistance gene region that functions in Escherichia coli; and a multiple restriction enzyme recognition sequence that is a gene region that is not involved in replication and has a predetermined restriction enzyme recognition site.
ミドベクターにおいて、 枯草菌ｒｅｃＥ＾−株でプラスミドを安定に保持する領
域を更に備えたことを特徴とする複合プラスミドベクタ
ー。(7) The composite plasmid vector according to any one of claims 1 to 6, further comprising a region for stably retaining the plasmid in Bacillus subtilis recE^- strain.
おいて、 前記グラム陽性細菌に機能する薬剤耐性遺伝子領域が、
エンテロコッカス・フェカリス（￥Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ￥）のプラスミドｐＡＭβ１
由来のマクラロライド（Ｍａｃｒｏｌｉｄｅ）−リンコ
サミド（Ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅ）−ストレプトグラミ
ン・ビー（Ｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｍｉｎ Ｂ）（ＭＬＳ
）耐性遺伝子である複合プラスミドベクター。(8) In the composite plasmid vector according to claim 6, the drug resistance gene region that functions in Gram-positive bacteria is
Enterococcus faecalis
plasmid pAMβ1 of S. cus faecalis￥
Macrolide-Lincosamide-Streptogramin B (MLS)
) Composite plasmid vector that is a resistance gene.
おいて、 前記グラム陽性細菌に機能する薬剤耐性遺伝子又は／及
びグラム陰性細菌である大腸菌に機能する薬剤耐性遺伝
子としてエンテロコッカス・フェカリスのプラスミドｐ
ＡＭα１由来のテトラサイクリン（Ｔｃ）耐性遺伝子領
域を備えたことを特徴とする複合プラスミドベクター。(9) In the composite plasmid vector according to claim 6, the plasmid p of Enterococcus faecalis is used as the drug resistance gene that functions in Gram-positive bacteria and/or the drug resistance gene that functions in Escherichia coli, which is a Gram-negative bacterium.
A composite plasmid vector comprising a tetracycline (Tc) resistance gene region derived from AMα1.
いて、 グラム陰性細菌である大腸菌で機能する複製開始領域が
大腸菌のプラスミドｐＡＣＹＣ１７７由来のｏｒｉ−１
７７である複合プラスミドベクター。(10) In the plasmid vector according to claim 6, the replication initiation region that functions in Escherichia coli, which is a Gram-negative bacterium, is ori-1 derived from Escherichia coli plasmid pACYC177.
77, a composite plasmid vector.
いて、 前記グラム陰性細菌である大腸菌で機能する複製開始領
域が大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２系統のプラスミド
由来である複合プラスミドベクター。(11) The plasmid vector according to claim 6, wherein the replication initiation region that functions in Escherichia coli, which is the Gram-negative bacterium, is derived from a plasmid of the plasmid pBR322 strain of Escherichia coli.
ＡＭα１由来の複製開始領域（Ｒｅｐ−α１）又は黄色
ぶどう球菌のプラスミドｐＵＢ１１０由来の複製開始領
域（ＯＲＦα）と、 大腸菌のプラスミドｐＡＣＹＣ１７７由来の複製開始領
域（Ｏｒｉ−１７７）と、 グラム陽性細菌に機能するエンテロコッカス・フェカリ
スのプラスミドｐＡＭβ１由来のＭＬＳ耐性遺伝子領域
と、 グラム陽性細菌である枯草菌やグラム陰性細菌である大
腸菌に機能するエンテロコッカス・フェカリスのプラス
ミドｐＡＭα１由来のテトラサイクリン（Ｔｃ）耐性遺
伝子領域と、 グラム陰性細菌である大腸菌に機能する大腸菌のベクタ
ーｐＡＣＹＣ１７７由来のアンピシリン（Ａｐ）耐性遺
伝子領域と、 枯草菌ｒｅｃＥ＾−株でプラスミドを安定に保持するＢ
Ａ３領域と、 乳酸桿菌でプラミスドを安定に保持し、マイナスオリジ
ン活性を有するｐａ１Ａ遺伝子と、所定の制限酵素認識
切断部位を備えた複製に関与しない遺伝子領域である多
重制限酵素認識配列と、 約６．８Ｋｂｐの大きさと、 下記の制限酵素認識切断部位の配列とを備えたことを特
徴とする複合プラスミドベクターｐＨＳ２３１１、ｐＨ
Ｓ２３１２。 【遺伝子配列があります。】(12) Enterococcus faecalis plasmid p
The replication initiation region (Rep-α1) derived from AMα1 or the replication initiation region (ORFα) derived from Staphylococcus aureus plasmid pUB110, and the replication initiation region (Ori-177) derived from Escherichia coli plasmid pACYC177, which function in Gram-positive bacteria. An MLS resistance gene region derived from Enterococcus faecalis plasmid pAMβ1, a tetracycline (Tc) resistance gene region derived from Enterococcus faecalis plasmid pAMα1 that functions in Bacillus subtilis, a Gram-positive bacterium, and Escherichia coli, a Gram-negative bacterium, and a Gram-negative Ampicillin (Ap) resistance gene region derived from the E. coli vector pACYC177 that functions in the bacterium E. coli, and B that stably maintains the plasmid in the Bacillus subtilis recE^- strain.
A3 region, the pa1A gene that stably maintains pramisid in Lactobacillus and has negative origin activity, and a multiple restriction enzyme recognition sequence that is a gene region that is not involved in replication and has a predetermined restriction enzyme recognition cleavage site, about 6 A complex plasmid vector pHS2311, pH, which is characterized by having a size of .8 Kbp and the following restriction enzyme recognition and cleavage site sequence.
S2312. [There is a gene sequence. ]
ＡＭα１由来の複製開始領域（Ｒｅｐ−α１）又は黄色
ぶどう球菌のプラスミドｐＵＢ１１０由来の複製開始領
域（ＯＲＦα）と、 大腸菌のプラスミドｐＡＣＹＣ１７７由来の複製開始領
域（Ｏｒｉ−１７７）と、 グラム陽性細菌に機能するエンテロコッカス・フェカリ
スのプラスミドｐＡＭβ１由来のＭＬＳ耐性遺伝子領域
と、 グラム陽性細菌である枯草菌やグラム陰性細菌である大
腸菌に機能するエンテロコッカス・フェカリスのプラス
ミドｐＡＭα１由来のテトラサイクリン（Ｔｃ）耐性遺
伝子領域と、 グラム陰性細菌である大腸菌に機能する大腸菌のベクタ
ーｐＡＣＹＣ１７７由来のアンピシリン（Ａｐ）耐性遺
伝子領域と、 乳酸桿菌でプラスミドを安定に保持し、マイナスオリジ
ン活性を有するＩＧ遺伝子と、 枯草菌ｒｅｃＥ＾−株でプラスミドを安定に保持するＢ
Ａ３領域と、 所定の制限酵素認識切断部位を備えた複製に関与しない
遺伝子領域である多重制限酵素認識配列と、 約７．０ｋｂｐの大きさと、 下記の制限酵素認識切断部位の配列とを備えたことを特
徴とする複合プラスミドベクターｐＨＳ２５１１、ｐＨ
Ｓ２５１２。 【遺伝子配列があります。】(13) Enterococcus faecalis plasmid p
The replication initiation region (Rep-α1) derived from AMα1 or the replication initiation region (ORFα) derived from Staphylococcus aureus plasmid pUB110, and the replication initiation region (Ori-177) derived from Escherichia coli plasmid pACYC177, which function in Gram-positive bacteria. An MLS resistance gene region derived from Enterococcus faecalis plasmid pAMβ1, a tetracycline (Tc) resistance gene region derived from Enterococcus faecalis plasmid pAMα1 that functions in Bacillus subtilis, a Gram-positive bacterium, and Escherichia coli, a Gram-negative bacterium, and a Gram-negative The ampicillin (Ap) resistance gene region derived from the Escherichia coli vector pACYC177 that functions in the bacterium Escherichia coli, the IG gene that stably maintains the plasmid in Lactobacillus and has negative origin activity, and the plasmid in the Bacillus subtilis recE^- strain. Hold stable B
A3 region, a multiple restriction enzyme recognition sequence which is a gene region not involved in replication with a predetermined restriction enzyme recognition and cleavage site, a size of approximately 7.0 kbp, and the following restriction enzyme recognition and cleavage site sequence. A complex plasmid vector pHS2511, pH
S2512. [There is a gene sequence. ]
ＡＭα１由来の複製開始領域（Ｒｅｐ−α１）又は黄色
ぶどう球菌のプラスミドｐＵＢ１１０由来の複製開始領
域（ＯＲＦα）と、 大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開始領域と
、 グラム陽性細菌に機能するエンテロコッカス・フェカリ
スのプラスミドｐＡＭβ１由来のＭＬＳ耐性遺伝子領域
と、 エンテロコッカス・フェカリスのプラスミドｐＡＭα１
由来のテトラサイクリン（Ｔｃ）耐性遺伝子領域と、 枯草菌ｒｅｃＥ＾−株でプラスミドを安定に保持するＢ
Ａ３領域と、 乳酸桿菌でプラスミドを安定に保持し、マイナスオリジ
ン活性を有するＩＧ遺伝子と、 所定の制限酵素認識切断部位を備えた複製に関与しない
遺伝子領域である多重制限酵素認識配列と、 約６．８ｋｂｐの大きさと、 下記の制限酵素認識切断部位の配列とを備えたことを特
徴とする複合プラスミドベクターｐＨＳ４２１１、ｐＨ
Ｓ４２１２。 【遺伝子配列があります。】(14) Enterococcus faecalis plasmid p
A replication initiation region (Rep-α1) derived from AMα1 or a replication initiation region (ORFα) derived from Staphylococcus aureus plasmid pUB110, a replication initiation region derived from Escherichia coli plasmid pBR322, and an Enterococcus faecalis plasmid that functions in Gram-positive bacteria. MLS resistance gene region derived from pAMβ1 and Enterococcus faecalis plasmid pAMα1
The derived tetracycline (Tc) resistance gene region and B that stably maintains the plasmid in Bacillus subtilis recE^- strain.
A3 region, an IG gene that stably maintains a plasmid in Lactobacillus and has negative origin activity, a multiple restriction enzyme recognition sequence that is a gene region that is not involved in replication and has a predetermined restriction enzyme recognition cleavage site, and approximately 6 A complex plasmid vector pHS4211, pH, which is characterized by having a size of .8 kbp and the following restriction enzyme recognition and cleavage site sequence.
S4212. [There is a gene sequence. ]
ＡＭα１由来の複製開始領域（Ｒｅｐ−α１）又は黄色
ぶどう球菌のプラスミドｐＵＢ１１０由来の複製開始領
域（ＯＲＦα）と、 大腸菌のプラスミドｐＡＣＹＣ１７７由来の複製開始領
域（Ｏｒｉ−１７７）と、 グラム陽性細菌に機能するエンテロコッカス・フェカリ
スのプラスミドｐＡＭβ１由来のＭＬＳ耐性遺伝子領域
と、 グラム陽性細菌である枯草菌やグラム陰性細菌である大
腸菌に機能するエンテロコッカス・フェカリスのプラス
ミドｐＡＭα１由来のテトラサイクリンン（Ｔｃ）耐性
遺伝子領域と、 グラム陰性細菌である大腸菌に機能する大腸菌のベクタ
ーｐＡＣＹＣ１７７由来のアンピシリン（Ａｐ）耐性遺
伝子領域と、 乳酸桿菌でプラスミドを安定に保持し、マイナスオリジ
ン活性を有するＩＧ遺伝子と、 所定の制限酵素認識切断部位を備えた複製に関与しない
遺伝子領域である多重制限酵素認識配列と、 約６．５ｋｂｐの大きさと、 下記の制限酵素認識切断部位の配列とを備えたことを特
徴とする複合プラスミドベクターｐＨ２５１１、ｐＨ２
５１２。 【遺伝子配列があります。】(15) Enterococcus faecalis plasmid p
The replication initiation region (Rep-α1) derived from AMα1 or the replication initiation region (ORFα) derived from Staphylococcus aureus plasmid pUB110, and the replication initiation region (Ori-177) derived from Escherichia coli plasmid pACYC177, which function in Gram-positive bacteria. an MLS resistance gene region derived from plasmid pAMβ1 of Enterococcus faecalis; a tetracycline (Tc) resistance gene region derived from plasmid pAMα1 of Enterococcus faecalis that functions in Bacillus subtilis, a Gram-positive bacterium, and Escherichia coli, a Gram-negative bacterium; An ampicillin (Ap) resistance gene region derived from the Escherichia coli vector pACYC177 that functions in Escherichia coli, a negative bacterium, an IG gene that stably maintains the plasmid in Lactobacillus and has negative origin activity, and a predetermined restriction enzyme recognition cleavage site. A complex plasmid vector pH2511, pH2 characterized by comprising a multiple restriction enzyme recognition sequence which is a gene region not involved in replication, a size of about 6.5 kbp, and the following restriction enzyme recognition cleavage site sequence.
512. [There is a gene sequence. ]
ＡＭα１由来の複製開始領域（Ｒｅｐ−α１）又は黄色
ぶどう球菌のプラスミドｐＵＢ１１０由来の複製開始領
域（ＯＲＦα）と、 大腸菌のプラスミドｐＡＣＹＣ１７７由来の複製開始領
域（Ｏｒｉ−１７７）と、 グラム陽性細菌に機能するエンテロコッカス・フェカリ
スのプラスミドｐＡＭβ１由来のＭＬＳ耐性遺伝子領域
と、 グラム陽性細菌である枯草菌やグラム陰性細菌である大
腸菌に機能するエンテロコッカス・フェカリスのプラス
ミドｐＡＭα１由来のテトラサイクリン（Ｔｃ）耐性遺
伝子領域と、 グラム陰性細菌である大腸菌に機能する大腸菌のベクタ
ーｐＡＣＹＣ１７７由来のアンピシリンン（Ａｐ）耐性
遺伝子領域と、 乳酸桿菌でプラスミドを安定に保持し、マイナスオリジ
ン活性を有するｐａ１Ａ遺伝子と、所定の制限酵素認識
切断部位を備えた複製に関与しない遺伝子領域である多
重制限酵素認識配列と、 約６．２ｋｂｐの大きさと、 下記の制限酵素認識切断部位の配列とを備えたことを特
徴とする複合プラスミドベクターｐＨ２３１１、ｐＨ２
３１２。 【遺伝子配列があります。】(16) Enterococcus faecalis plasmid p
The replication initiation region (Rep-α1) derived from AMα1 or the replication initiation region (ORFα) derived from Staphylococcus aureus plasmid pUB110, and the replication initiation region (Ori-177) derived from Escherichia coli plasmid pACYC177, which function in Gram-positive bacteria. An MLS resistance gene region derived from Enterococcus faecalis plasmid pAMβ1, a tetracycline (Tc) resistance gene region derived from Enterococcus faecalis plasmid pAMα1 that functions in Bacillus subtilis, a Gram-positive bacterium, and Escherichia coli, a Gram-negative bacterium, and a Gram-negative The ampicillin (Ap) resistance gene region derived from the Escherichia coli vector pACYC177 that functions in the bacterium Escherichia coli, the pa1A gene that stably maintains the plasmid in Lactobacillus and has negative origin activity, and a specific restriction enzyme recognition cleavage site. A complex plasmid vector pH2311, pH2 characterized by comprising a multiple restriction enzyme recognition sequence which is a gene region not involved in replication, a size of about 6.2 kbp, and the following restriction enzyme recognition cleavage site sequence.
312. [There is a gene sequence. ]
ＡＭα１由来の複製開始領域（Ｒｅｐ−α１）又は黄色
ぶどう球菌のプラスミドｐＵＢ１１０由来の複製開始領
域（ＯＲＦα）と、 大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開始領域と
、 グラム陽性細菌に機能するエンテロコッカス・フェカリ
スのプラスミドｐＡＭβ１由来のＭＬＳ耐性遺伝子領域
と、 グラム陽性細菌である枯草菌やグラム陰性細菌である大
腸菌に機能するエンテロコッカス・フェカリスのプラス
ミドｐＡＭα１由来のテトラサイクリン（Ｔｃ）耐性遺
伝子領域と、 乳酸桿菌でプラスミドを安定に保持しマイナスオリジン
活性を有するＩＧ遺伝子と、 所定の制限酵素認識切断部位を備えた複製に関与しない
遺伝子領域である多重制限酵素認識配列と、 約５．７ｋｂｐの大きさと、 下記の制限酵素認識切断部位の配列とを備えたことを特
徴とする複合プラスミドベクターｐｎ４２１１、ｐＨ４
２１２。 【遺伝子配列があります。】(17) Enterococcus faecalis plasmid p
A replication initiation region (Rep-α1) derived from AMα1 or a replication initiation region (ORFα) derived from Staphylococcus aureus plasmid pUB110, a replication initiation region derived from Escherichia coli plasmid pBR322, and an Enterococcus faecalis plasmid that functions in Gram-positive bacteria. The MLS resistance gene region derived from pAMβ1, the tetracycline (Tc) resistance gene region derived from the Enterococcus faecalis plasmid pAMα1, which functions in Bacillus subtilis, a Gram-positive bacterium, and Escherichia coli, a Gram-negative bacterium, and the plasmid stabilized with Lactobacillus. An IG gene that retains and has negative origin activity, a multiple restriction enzyme recognition sequence that is a gene region not involved in replication that is equipped with a predetermined restriction enzyme recognition cleavage site, a size of approximately 5.7 kbp, and the following restriction enzyme recognition cleavage sites. A composite plasmid vector pn4211, pH4, characterized in that it is provided with a site sequence.
212. [There is a gene sequence. ]
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16855090A JPH0458890A (en) | 1990-06-28 | 1990-06-28 | Compound plasmid vector |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16855090A JPH0458890A (en) | 1990-06-28 | 1990-06-28 | Compound plasmid vector |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0458890A true JPH0458890A (en) | 1992-02-25 |
Family
ID=15870103
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP16855090A Pending JPH0458890A (en) | 1990-06-28 | 1990-06-28 | Compound plasmid vector |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0458890A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997049820A1 (en) * | 1996-06-26 | 1997-12-31 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Methods for transferring gene into chromosome |
| CN101899469A (en) * | 2010-05-14 | 2010-12-01 | 上海艾魁英生物科技有限公司 | Shuttle plasmid and method for efficiently expressing cecropin and lysozyme genes |
| CN101948865A (en) * | 2010-08-17 | 2011-01-19 | 复旦大学 | Dual-promoter inducible secretable shuttle plasmid and construction method thereof |
-
1990
- 1990-06-28 JP JP16855090A patent/JPH0458890A/en active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997049820A1 (en) * | 1996-06-26 | 1997-12-31 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Methods for transferring gene into chromosome |
| US6319692B1 (en) | 1996-06-26 | 2001-11-20 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Methods for transferring gene into chromosome |
| CN101899469A (en) * | 2010-05-14 | 2010-12-01 | 上海艾魁英生物科技有限公司 | Shuttle plasmid and method for efficiently expressing cecropin and lysozyme genes |
| CN101948865A (en) * | 2010-08-17 | 2011-01-19 | 复旦大学 | Dual-promoter inducible secretable shuttle plasmid and construction method thereof |
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