JPH0455171B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

本発明は脈管形成の抑制に関し、さらに詳しく
は、哺乳類動物をヘパリンまたはヘパリン断片と
コーチゾン、ハイドロコーチゾンまたはハイドロ
コーチゾンの11−ａ異性体で治療して脈管形成を
抑制し、担腫瘍動物の腫瘍塊の退行および腫瘍の
転移の防止を達成することに関する。 新しい毛細血管の生長である脈管形成の胚の発
育、黄体形成、創傷の治癒等、正常過程にきわめ
て重要である。しかし、慢性炎症、ある種の免疫
応答、腫瘍新生等の病的過程にも関与する。しか
も脈管形成は大部分の充実性腫瘍の特性であり、
それが生長を続けるのに必須である。 ヘパリンがin vivoにおいて、腫瘍が誘発する
脈管形成を強めること、しかし腫瘍細胞または腫
瘍抽出物が存在しなければ、ヘパリンも、またヘ
パリンを放出する肥満細胞も脈管形成を誘発しな
いことは、知られている（Taylor＆Folkman、
Nature、297：307−312、1982）。また6α−メチ
ルプレドニソロンがある種の条件下にハムスター
の頬嚢の腫瘍脈管形成を部分的に抑制するが、腫
瘍の生育は停止しないことを、Shubikら（J.
Natl.Cancer Inst.，57：769−774、1976）が報
告している。大量のコーチゾンの存在下にも腫瘍
の生育が続くことに関しては他に多くの報告があ
る。Grossら（Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，
78：1176−1180、1981）はメドロキシプロゲステ
ロン、デキサメサゾンおよび作用は弱いがコーチ
ゾンに、ウサギ角膜の腫瘍脈管形成阻止作用があ
り、一方、エストラジオールおよびテストステロ
ンにはその作用はないことを報告している。 ヘパリン、すなわちα、βグリコシド結合し
た、高度に硫酸化されたウロン酸とグルコサミン
の共重合体は、半世紀前から坑凝固剤として臨床
的に用いられてきた。その重要性や広範囲での使
用にもかかわらず、ヘパリンの正確な構造も、ま
た血液坑凝固剤として作用する機序も明らかにさ
れていない。ヘパリンの構造決定の難しさの多く
はそれが均一物質でないことによる。ヘパリンは
分子量5000から40000の多分散性物質である。そ
の鎖のなかにも、硫酸化、Ｎ−アシル化、またウ
ロン酸残基のＣ−５エピメル化などの程度に変動
があつて、構造的な差を生じる。 したがつて、市販ヘパリンの正確な組成は、そ
の原料や精製法によつて異なつてくる。ヘパリン
は、その分子をＮ−硫酸化−Ｄ−グルコサミン−
６−サルフエートとＬ−イドウロン酸２−サルフ
エートの間のα−グリコシド結合を開裂して、そ
れぞれ単に鎖が短縮され、末端基にわずかな変化
を生じた（末端ウロン酸残基の△−4.5不飽和に
分解を生じた）ヘパリン断片である二糖類、四糖
類、六糖類およびそれ以上のオリゴサツカライド
を形成する（Linhardtら：J.Biol，Chem.，
257：7310−7313、1982）バクテリア起源のヘパ
リナーゼ（Langerら：米国特許第4341869号）に
よつて処理すると分解される。 本発明はヘパリンまたは六糖類以上の多糖類で
あるヘパリン断片とコーチゾンまたはハイドロコ
ーチゾンもしくはハイドロコーチゾンの11−α異
性体を投与すると、哺乳類動物の脈管形成が抑制
され、哺乳類動物の腫瘍塊の退行（および転移の
防止）が起こることを発見し、完成されたもので
ある。この異性体の完全な名称は11α，17，21−
トリヒドロキシプレグナ−４−エン−３，20−ジ
オンである。成熟して生長していない血管や脈管
組織には本発明の操作は影響しないように思われ
る。本発明による脈管形成の抑制は、担腫瘍動物
の腫瘍の退行や転移の防止のほか、受精後にはじ
めて投与しても女性の避妊剤として、また骨粗鬆
症の軽減、眼の脈管新生疾患のような脈管新生の
関与する疾患の治療にも有効である。 コーチゾンもハイドロコーチゾンも、またハイ
ドロコーチゾンの11−α異性体も、ヘパリンまた
はヘパリン断片が存在しないと脈管形成を有効に
抑制しないし、腫瘍の退行も生じない。ヘパリン
単独では脈管形成を抑制しないのみか、逆に促進
するのである。 ヘパリン（またはその断片）およびコーチゾン
（またはハイドロコーチゾンもしくはその11−α
異性体）は投与に先立つて混合してもよいし、ま
た別個に投与してもよい。投与は経口的に、また
はとくに局所、静脈内、動脈内、皮下投与を含む
非経口的投与によつて行われ、吸収ならびに体腔
または体口内への注射、導入が包含される。ヘパ
リナトリウムの形で市販されているヘパリンの場
合、経口投与すると胃腸管内で分解され坑凝固活
性は低下するが、分解生成物には二糖類やそれよ
り大きい断片が含まれていて、ヘパリンでもヘパ
リン断片でもこの投与経路が本発明の効果を達成
するのにきわめて有効である。ヘパリンおよびそ
の断片は、生理学的に許容される任意の非毒性形
態、たとえば金属塩、好ましくはナトリウム塩と
して使用できる（これらのすべての形態が本明細
書において用いられるヘパリンまたはその断片の
語に包含される）。“Panheparin”の商品名
（Abbott Laboratories）で市販されているヘパ
リンが最良の結果を得るためには好ましいが、他
の原料からのヘパリンたとえばHepar，Inc.の製
品も、やや効果は劣るが同様に使用できる。コー
チゾンおよびその生理的に許容される非毒性塩、
たとえば酢酸塩は水にはきわめてわずかしか溶け
ないので、非経口的にたとえば皮下投与するのが
好ましく、経口投与は適当でない。経口投与の場
合は、ハイドロコーチゾンまたはその11−α異性
体（コーチゾンに比較すれば水に溶けやすい）ま
たはその生理的に許容される非毒性、水溶性塩、
たとえばリン酸塩を用いるのが好ましい。ハイド
ロコーチゾンまたはその11−α異性体の生理的に
許容される非毒性の水不溶性塩は非経口的に投与
される。本明細書に使用されるコーチゾン、ハイ
ドロコーチゾンおよびハイドロコーチゾンの11−
α異性体の語は、ステロイド自体および上に定義
したようなその塩の両者を包含するものである。 コーチゾン、ハイドロコーチゾンまたはその11
−α異性体の投与量は、その通常の効果を得るた
めに個々の薬剤を投与する際によく知られている
限界によつてのみ制限される。ヘパリンを皮下投
与する場合は、望ましくない坑凝固作用に耐えら
れる限りの投与量を採用できる。ヘパリンは経口
的に投与しても坑凝固作用を生じないし、また六
糖類断片は坑凝固作用を示さないので、経口でも
その他の経路でも、出血の危険なく大量を投与す
ることができる。ヘパリンは１日、27000〜45000
単位／Kg体重のオーダーを経口投与すると効果が
あることが明らかにされている。しかし皮下投与
の場合には１日２回、約600単位／Kg体重以上の
用量では望ましくない抗凝固作用が発現する。六
糖類断片の場合７mg／Kg体重、１日２回の皮下注
で効果が認められる。酢酸コーチゾンは皮下投与
の場合は250mg／Kg日から37mg／Kg／日の用量で、
ハイドロコーチゾンの経口投与の場合は飲水中
0.45mg／ml（約75mg／Kg／日）で有効であつた。
ハイドロコーチゾンの11−α異性体は、本発明の
目的に関しては、ハイドロコーチゾンにほぼ匹敵
する活性を示す。 腫瘍の退行または転移の防止に必要な投与量は
腫瘍の種類によつてある程度変動し、腫瘍の完全
な退行までの時間によつても変わる。治療初期の
腫瘍の大きさも完全な退行に要する時間に影響す
る。乾癬や関節炎でも脈管形成が起こることか
ら、本発明はこの種の疾患に対しても有用である
ことが期待される。コーチゾンの投与を何日間も
続けると、ヘパリンまたはヘパリン断片を同時に
投与していてもいなくても肺感染を起こすことが
あるので、本発明による治療中には予防のため適
当な抗生物質を投与していることが望ましい。 ヘパリン（または断片）およびコーチゾン、ハ
イドロコーチゾンまたはハイドロコーチゾンの11
−α異性体は、それ自体非毒性で生理的に許容さ
れる適当な担体、たとえば水または生理食塩水に
溶解または懸濁するのが最善である。活性成分混
合物が乾燥状態で、あるいは適当な担体中に含有
された組成物を使用することができる。 例 １ 酢酸コーチゾン0.9mgを食塩水0.9mlにとり、８
日目のヒヨコ胚にあらかじめ殻に設えた孔部から
の絨毛尿膜上に加えた。９日目に肝癌細胞からの
腫瘍抽出物（100μｇ、Zetter：Nature、285：41
−43、1980参照）を水5μにとつて、円形の径
15mmのプラスチツク製オーバースリツプ上に置
き、乾燥させた。各オーバースリツプの中央に、
ヘパリン（6μｇすなわち１単位）または水のい
ずれかを含む標準液5μを加え、それぞれ少な
くとも20個の胚を処置する。乾燥後、オーバース
リツプを絨毛尿膜上に置いた。腫瘍抽出物およ
び／またはヘパリン処置はしたが、酢酸コーチゾ
ン前処置をしなかつた対照胚も設けた。第11日目
に12倍の立体鏡で膜を検査した。オーバースリツ
プの中央のスポツト上に集まる新生毛細管を認め
た場合は脈管形成ありとした。水またはヘパリン
処置はしたがコーチゾン処置しなかつた胚はすべ
て、コーチゾン単独処置の胚の80％に脈管形成が
みられた。ヘパリンおよび酢酸コーチゾンの両者
で処理した胚で脈管形成を示したものは２％以下
であつた。 例 ２ ブタ粘膜ヘパリンをヘパリナーゼを用い、
Langerら（Science、217：261−263、1982）の
方法に従つて完全に分解し、生成物を1M
NH₄OAcで平衡加したSephadexカラムによつて
分画した。分解したヘパリンは、活性加部分トロ
ンボプラスチン時間または全血カルシウム再添加
時間による抗凝固活性を示さなかつた。生成物ま
たは生成混合物（250mg）を1M NH₄OAc1c.c.に
溶解し、75×2.5cmＧ−15カラムにかけ、0.5c.c.／
分で溶出した。この結果、四糖類、六糖類および
それ以上のオリゴサツカライドに相当する、完全
には分離しない数個のピークと二糖類に相当する
分離したピークが得られた。二糖類のピークを凍
結乾燥し、1M NH₄OAc0.2c.c.に溶解し、Ｇ−15
上再クロマトグラフイーに付すと、同じ鋭いピー
クが得られ、これを凍結乾燥した。四糖類、六糖
類およびオリゴサツカライドの混合物を凍結乾燥
し、1M NH₄OAc1c.c.に再溶解し、50×1.25cmＧ
−50から２c.c.／分で溶出すると、四糖類および六
糖類断片に相当する分離していない二重のピーク
と、さらにオリゴサツカライドに相当するピーク
が得られ、後者を凍結乾燥した。四糖類および六
糖類断片を合し、凍結乾燥し、1M NH₄OAcに
再溶解し、Ｇ−15カラムにかけた。四糖類はＧ−
15カラムから単一ピークに溶出され、その中心部
分を凍結乾燥した。六糖類分画は凍結乾燥し、
1M NH₄OAc0.3c.c.に再溶解し、Ｇ−15カラムか
ら溶出すると単一ピークとなり、その中心部分を
凍結乾燥した。 断片の大きさは、各分画の一定量を0.03M塩酸
に溶解し、この溶液の232nｍにおける吸収を測
定することにより決定した。各断片の分子量は、
各生成物にはα、β不飽和カルボキシレート末端
基が存在するので分子吸収率ξ＝5500を用いて計
算した。二糖類および四糖類についてはＧ−15上
Ｋ平均値を単糖類、二糖類、三糖類の標品と比較
して、さらに特性を明らかにした。二糖類、四糖
類、六糖類およびオリゴサツカライド分画の分子
量の測定値はそれぞれ、530、1210、1600および
1870であつた。 各種ヘパリン断片をメチルセルロースのデイス
クに単独または酢酸コーチゾンとともに溶解し
た。ついでデイスクを、TaylorとFolkmanの方
法（Nature、297：307−312、1982）によつてペ
トリ皿で培養したヒヨコ胚の卵黄嚢膜（４日目）
に適用した。次表に示すように、酢酸コーチゾン
（100μｇ）の存在下には六糖類断片が最高の脈管
形成活性を示した。 The present invention relates to the inhibition of angiogenesis, and more particularly, to treating mammals with heparin or heparin fragments and cortisone, hydrocortisone, or the 11-a isomer of hydrocortisone to inhibit angiogenesis and to inhibit tumor-bearing animals. Concerning achieving regression of tumor masses and prevention of tumor metastasis. It is critical to normal processes such as embryonic development, angiogenesis, the growth of new capillaries, luteinization, and wound healing. However, it is also involved in pathological processes such as chronic inflammation, certain immune responses, and tumorigenesis. Moreover, angiogenesis is a characteristic of most solid tumors;
This is essential for continued growth. That heparin enhances tumor-induced angiogenesis in vivo, but that in the absence of tumor cells or tumor extracts, neither heparin nor heparin-releasing mast cells induce angiogenesis. known (Taylor & Folkman,
Nature, 297:307-312, 1982). Shubik et al. (J.
Natl. Cancer Inst., 57:769-774, 1976). There are many other reports regarding continued tumor growth even in the presence of large amounts of cortisone. Gross et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
78:1176-1180, 1981) reported that medroxyprogesterone, dexamethasone, and to a lesser extent cortisone had the effect of inhibiting tumor angiogenesis in rabbit corneas, whereas estradiol and testosterone had no such effect. There is. Heparin, a highly sulfated uronic acid and glucosamine copolymer with alpha, beta glycosidic bonds, has been used clinically as an anticoagulant for half a century. Despite its importance and widespread use, neither the exact structure of heparin nor the mechanism by which it acts as a blood anticoagulant is known. Much of the difficulty in determining the structure of heparin is due to the fact that it is not a homogeneous substance. Heparin is a polydisperse substance with a molecular weight of 5,000 to 40,000. Even within the chain, there are variations in the degree of sulfation, N-acylation, and C-5 epimerization of uronic acid residues, resulting in structural differences. Therefore, the exact composition of commercially available heparin will vary depending on its source and purification method. Heparin has its molecule N-sulfated-D-glucosamine-
Cleavage of the α-glycosidic bond between 6-sulfate and L-idouronic acid 2-sulfate resulted in a simple chain shortening and a slight change in the terminal group (Δ−4.5 discontinuity of the terminal uronic acid residue). saturated decomposition) to form heparin fragments, disaccharides, tetrasaccharides, hexasaccharides, and higher oligosaccharides (Linhardt et al.: J. Biol, Chem.,
257:7310-7313, 1982) is degraded upon treatment with heparinases of bacterial origin (Langer et al., US Pat. No. 4,341,869). The present invention shows that administration of heparin or a heparin fragment, which is a polysaccharide of hexasaccharide or higher, and cortisone, hydrocortisone, or the 11-α isomer of hydrocortisone suppresses angiogenesis in mammals and causes regression of tumor masses in mammals. (and prevention of metastasis) was discovered and perfected. The full name of this isomer is 11α, 17, 21−
It is trihydroxypregna-4-ene-3,20-dione. Blood vessels and vascular tissue that are not mature and growing appear to be unaffected by the procedures of the present invention. The inhibition of angiogenesis by the present invention can be used not only to prevent tumor regression and metastasis in tumor-bearing animals, but also as a contraceptive for women even when administered for the first time after fertilization, to reduce osteoporosis, and to treat ocular neovascular diseases. It is also effective in treating diseases involving angiogenesis. Neither cortisone nor hydrocortisone, nor the 11-α isomer of hydrocortisone, effectively inhibits angiogenesis or causes tumor regression in the absence of heparin or heparin fragments. Heparin alone does not suppress angiogenesis, or on the contrary, promotes it. Heparin (or a fragment thereof) and cortisone (or hydrocortisone or its 11-alpha
The isomers) may be mixed prior to administration or may be administered separately. Administration may be carried out orally or parenterally, including in particular topical, intravenous, intraarterial, subcutaneous administration, and includes absorption as well as injection, introduction into body cavities or mouth. Heparin, which is commercially available in the form of heparin sodium, is degraded in the gastrointestinal tract when administered orally, reducing its anticoagulant activity; however, the degradation products include disaccharides and larger fragments, and even heparin Even in fragments, this route of administration is highly effective in achieving the effects of the present invention. Heparin and its fragments can be used in any physiologically acceptable non-toxic form, such as metal salts, preferably sodium salts (all these forms are included in the term heparin or fragments thereof as used herein). ). Although heparin sold under the brand name "Panheparin" (Abbott Laboratories) is preferred for best results, heparin from other sources, such as those from Hepar, Inc., is equally effective, although less effective. Can be used. cortisone and its physiologically acceptable non-toxic salts;
For example, acetate salts are only very slightly soluble in water and are therefore preferably administered parenterally, eg subcutaneously; oral administration is not appropriate. For oral administration, hydrocortisone or its 11-α isomer (more soluble in water than cortisone) or a physiologically acceptable, non-toxic, water-soluble salt thereof;
For example, it is preferable to use phosphates. The physiologically acceptable non-toxic water-insoluble salt of hydrocortisone or its 11-α isomer is administered parenterally. 11- of cortisone, hydrocortisone and hydrocortisone as used herein
The term alpha isomer is meant to encompass both the steroid itself and its salts as defined above. Cortisone, hydrocortisone or 11
The amount of -alpha isomer administered is limited only by the well-known limitations in administering the individual drug to its normal effect. When heparin is administered subcutaneously, doses can be used as long as undesirable anticoagulant effects are tolerated. Since heparin does not produce an anticoagulant effect when administered orally, and hexasaccharide fragments do not exhibit an anticoagulant effect, large amounts can be administered orally or by other routes without risk of bleeding. Heparin costs 27,000 to 45,000 per day.
Oral administration in doses on the order of units/Kg body weight has been shown to be effective. However, when administered subcutaneously twice a day, doses of more than about 600 units/kg body weight produce undesirable anticoagulant effects. In the case of hexasaccharide fragments, efficacy was observed with subcutaneous injection of 7 mg/Kg body weight twice a day. Cortisone acetate is administered subcutaneously at a dose of 250 mg/Kg/day to 37 mg/Kg/day;
In drinking water if hydrocortisone is administered orally
It was effective at 0.45 mg/ml (approximately 75 mg/Kg/day).
The 11-α isomer of hydrocortisone exhibits approximately comparable activity to hydrocortisone for the purposes of the present invention. The dosage required to prevent tumor regression or metastasis will vary to some extent depending on the type of tumor and will also vary depending on the time taken for complete tumor regression. The size of the tumor at the beginning of treatment also influences the time required for complete regression. Since angiogenesis also occurs in psoriasis and arthritis, the present invention is expected to be useful for these types of diseases as well. Appropriate antibiotics should be administered prophylactically during treatment with the present invention, as cortisone administration for many days can result in lung infections, with or without concurrent administration of heparin or heparin fragments. It is desirable that 11 of heparin (or fragments) and cortisone, hydrocortisone or hydrocortisone
The -α isomer is best dissolved or suspended in a suitable carrier that is itself non-toxic and physiologically acceptable, such as water or saline. Compositions can be used in which the active ingredient mixture is contained in dry form or in a suitable carrier. Example 1 Add 0.9 mg of cortisone acetate to 0.9 ml of saline solution,
It was added onto the chorioallantoic membrane of a day-old chick embryo through a hole previously made in the shell. Tumor extract from hepatoma cells (100 μg, Zetter: Nature, 285:41
-43, 1980) in 5μ of water, and make a circular diameter
Placed on a 15 mm plastic overslip to dry. In the center of each overslip,
Add 5 μ of a standard solution containing either heparin (6 μg or 1 unit) or water and treat at least 20 embryos each. After drying, the overslip was placed on the chorioallantoic membrane. Control embryos were also provided that received tumor extract and/or heparin treatment, but no cortisone acetate pretreatment. On the 11th day, the membrane was examined under a 12x stereoscope. If new capillaries were observed to gather on the central spot of the overslip, angiogenesis was considered to be present. All embryos treated with water or heparin but not cortisone showed vasculogenesis in 80% of embryos treated with cortisone alone. Less than 2% of embryos treated with both heparin and cortisone acetate showed vasculogenesis. Example 2 Using heparinase with porcine mucosal heparin,
The product was completely degraded according to the method of Langer et al. (Science, 217:261-263, 1982) and the product was
Fractionation was performed using a Sephadex column equilibrated with NH ₄ OAc. Degraded heparin showed no anticoagulant activity with activated partial thromboplastin time or whole blood recalcification time. The product or product mixture (250 mg) was dissolved in 1 M _NH4OAc1c.c . and applied to a 75 x 2.5 cm G-15 column at 0.5 cc/
It eluted in minutes. As a result, several peaks corresponding to tetrasaccharides, hexasaccharides, and higher oligosaccharides, which were not completely separated, and separated peaks corresponding to disaccharides were obtained. The disaccharide peak was lyophilized, dissolved in 1M _NH4OAc0.2c.c .
Rechromatography of the top gave the same sharp peak, which was lyophilized. The mixture of tetrasaccharides, hexasaccharides and oligosaccharides was lyophilized, redissolved in 1M _NH4OAc1c.c .
Elution from -50 to 2 c.c./min yielded unresolved double peaks corresponding to the tetrasaccharide and hexasaccharide fragments, as well as a peak corresponding to the oligosaccharides, the latter of which was lyophilized. The tetrasaccharide and hexasaccharide fragments were combined, lyophilized, redissolved in 1M _NH4OAc and applied to a G-15 column. Tetrasaccharide is G-
A single peak was eluted from column 15, and the central portion was lyophilized. The hexasaccharide fraction was lyophilized and
It was redissolved in 0.3c.c. of 1M NH ₄ OAc and eluted from the G-15 column, resulting in a single peak, and the central portion was lyophilized. The size of the fragments was determined by dissolving an aliquot of each fraction in 0.03M hydrochloric acid and measuring the absorbance of this solution at 232 nm. The molecular weight of each fragment is
Since each product has an α,β unsaturated carboxylate end group, the molecular absorption rate ξ=5500 was used for calculation. The characteristics of disaccharides and tetrasaccharides were further clarified by comparing the G-15 upper K average values with those of monosaccharides, disaccharides, and trisaccharides. The measured molecular weights of the disaccharide, tetrasaccharide, hexasaccharide and oligosaccharide fractions were 530, 1210, 1600 and
It was 1870. Various heparin fragments were dissolved in methylcellulose disks alone or with cortisone acetate. The disc was then used to prepare the yolk sac membrane (day 4) of a chick embryo cultured in a Petri dish according to the method of Taylor and Folkman (Nature, 297:307-312, 1982).
applied to. As shown in the following table, the hexasaccharide fragment showed the highest angiogenic activity in the presence of cortisone acetate (100 μg).

【表】 四糖類および二糖類は活性を示さなかつた。 オリゴサツカライドの活性は低く、高濃度では
毒性を示した。したがつて、以後の実験には六糖
類断片を用いた。生育中の６日目の絨毛尿膜では
六糖類（12μｇ）および酢酸コーチゾン（100μ
ｇ）を含有するデイスクは、48時間までに12.6±
0.1mm直径に及ぶ大きな駆血域が生成した。ヘパ
リン（および酢酸コーチゾン）の場合には、中胚
葉層の毛細管が欠如し、一方、膜の他の２組織層
は無傷で生存していた。六糖類単独ではヘパリン
のような腫瘍脈管形成の促進は認められなかつ
た。 デイスクはすべて酢酸コーチゾン（100μｇ）
とヘパリン断片の組合せを含有させた。どのヘパ
リン断片も単独では、またコーチゾンもメチルセ
ルロースも単独では、駆血域の生成はみられなか
つた。各群10個の胚を用いた。六糖類（＋コーチ
ゾン）では、駆血域の面積は12μｇの場合、脈管
膜の17％、0.1μｇの場合15％であつた。オリゴサ
ツカライドの場合、最大駆血域面積は10％であつ
た。 例 ３ 受精ヒヨコ胚を殻から３日目または４日目に取
り出し、外部の皿と抗生物質を使用しなかつたほ
かはAuerbachら（J.Devel.Biol、41：391〜394、
1974）の方法に従い、ペトリ皿中、高湿、５％
CO₂でインキユベートした。６日目に、ヘパリン
（6μｇ）、または六糖類ヘパリン断片（12μｇ）、
または酢酸コーチゾン（Sigma、防腐剤、懸濁剤
を含まない粉末）、または酢酸コーチゾンとヘパ
リンの配合物、または酢酸コーチゾンと六糖類の
配合物のいずれかを含むメチルセルロース・デイ
スク（10μ）を絨毛尿膜に移植した。48時間後
に胚を検査し、メチルセルロース・デイスクの周
囲に明らかな駆血域を生じた場合には、Nikonプ
ロフイルプロジエクター（20倍）によつて駆血域
の直径を測定した。各群とも30個の胚を使用し
た。一部の胚の心臓にはホルマリン固定の直前に
インドインクを注入し、組織切片中で駆血域の端
まで脈管を追跡できるようにした。 六糖類＋酢酸コーチゾンでは、すべての胚に直
径12.6±0.1mmの駆血域を生じた。ヘパリン＋酢
酸コーチゾンでは直径8.9±0.7mmの駆血域を生じ
た。いずれかの化合物の単独、またはメチルセル
ロース単独の存在下には駆血域を生じなかつた。 絨毛尿膜の組織切片には、いずれの化合物単独
の存在下には、毛細管の正常な発育が認められ
た。一方、六糖類＋酢酸コーチゾン、またはヘパ
リン＋酢酸コーチゾンのいずれかを適用した中胚
葉胚からは毛細管が完全に消失し、一方、外胚葉
および内胚葉細胞層への影響は認められなかつ
た。脈管がも早生育していない成熟絨毛尿膜に
は、酢酸コーチゾン−ヘパリンまたは−六糖類断
片配合物による影響はみられなかつた。 例 ４ 直径約１mmのエチレン−酢酸ビニル共重合体
（EVA）のポリマーペレツトに、Langerらの方
法（Nature、263：797−780、1976）に従い、ヘ
パリン（Sigma）180μｇ、または六糖類断片
300μｇ、または酢酸ハイドロコーチゾン
（Sigma）1.5mg、またはコーチゾンとヘパリンの
配合物のいずれかを浸透させた。このペレツトを
ウサギの眼の角膜に植え込み、縁から１mmに位置
させ、このポリマーからは遠位の縁から２mmの位
置にV2癌組織を移植した。それぞれのウサギの
反対側の眼には何も含まない対照ペレツトを腫瘍
の近位に同様に植え込んだ。 放出速度はヘパリンで平均15μｇ／日、六糖類
断片で21μｇ／日、コーチゾンで5μｇ／日であつ
た。化合物を混合しても、それぞれの放出速度は
変化しない。比色法によれば、ペレツトはヘパリ
ンを14日間、六糖類を11日間、コーチゾンを30日
以上放出した。 毛細血管が移植腫瘍の方向に生育する場合、３
日間毎日、最大血管長を立体スリツトランプ（10
倍、±0.1mm）で測定した。14日目にウサギを署殺
し、各頚動脈にインドインクを注射した。角膜を
取り、立体鏡で検査した。 新しい毛細血管が腫瘍の方向に生育し、空のペ
レツトまたはヘパリン単独含有ペレツトを平均速
度0.44mm／日で通過するのが観察され、コーチゾ
ン単独を含有するペレツトの場合は0.22mmであつ
た。これらのペレツトの後方の腫瘍は６〜８日間
までに脈管形成した。ペレツトがコーチゾンとヘ
パリンの両者を含む場合には、13日間、毛細血管
の生育はなかつた。ヘパリン−コーチゾン・ヘパ
レツトを除去するか、またはペレツトのヘパリン
が枯渇すると、毛細血管の生育が再開した。組織
学的観察では、腫瘍細胞がヘパリン−コーチゾ
ン・ペレツトに隣接していても、生存能は維持し
ていて分割能を示した。 例２のヘパリンを六糖類断片で置換したペレツ
トを植え込んだ場合、新しい毛細血管が腫瘍の方
向に、六糖類ペレツトの存在下では平均0.30mm／
日、ペレツトがコーチゾンを含む場合には平均
0.14mm／日、ペレツトが何も含まない場合は平均
0.32mm／日の速度で生育した。六糖類とコーチゾ
ンの配合物の存在下には、13日の観察期間を通じ
て４匹のウサギでは毛細管の生育は全くみられ
ず、１匹に速度0.07mm／日の２、３の毛細管生育
を認めたのみであつた。 例 ５ (a) 卵巣腫瘍：腫瘍片１mm³を１群５匹、30匹のマ
ウスの背中に套管針で移植した。10日後、腫瘍
の平均容量が1.5×10²mm³になつたとき開始し
た。飲水にヘパリン200単位／mlを添加した。
平均１日消費量は22ｇのマウス１匹につき、３
〜５mlであつた。酢酸コーチゾンは１日１回
250mg／Kgの用量を６日間、125mg／Kgを１日、
75mg／Kgを１日、以後37mg／Kgを維持用量（減
衰投与）を皮下投与した。対照動物には食塩水
の注射、またはヘパリン単独もしくは酢酸コー
チゾン単独のいずれかを実施した。すべての対
照動物は34日目までに一次腫瘍または肺転移腫
瘍が大きくなつて死亡した。経口ヘパリンとコ
ーチゾンの減衰用量を投与したマウスは15日目
までに腫瘍が消失し、治療中断後にも消失状態
を維持した。 他のマウス群はヘパリンを１日２回、627単
位の用量で皮下投与し、酢酸コーチゾンは１日
１回、一定用量の75mg／Kgを皮下投与したほか
は同様に処置した。マウスの反応は初期には同
じであつたが、治療中止後に腫瘍が再発した。
これらのマウスをついで、前述のヘパリン経口
投与と酢酸コーチゾンの減衰用量による治療に
付したところ、腫瘍は永久的に消失した。これ
らのマウスの１匹は31日目に死亡したが、原発
腫瘍は肉眼では観察されず、転移もなかつた。 (b) ルイスの肺癌：腫瘍片１mm³を１群７匹、42匹
のマウスに移植し、７日後に治療を開始した。
治療は前述のヘパリン経口投与とコーチゾンの
減衰用量の皮下投与によつた。対照動物はすべ
て、大きな腫瘍と無数の肺転移を示して33日目
までに死亡した。ヘパリン＋酢酸コーチゾン群
の治療は各マウスとも腫瘍が肉眼で見られなく
なつた後、約７日間中断した。ヘパリン経口＋
酢酸コーチゾン投与群は全マウスが33日目まで
に治療を中止され、腫瘍が消失した状態に維持
された。ヘパリン皮下投与および酢酸コーチゾ
ン（75mg／Kg）皮下投与群では、５匹のマウス
が37日目に治療を中止され、腫瘍が消失した状
態に維持された。２匹はそれぞれ30日目および
33日目に肺炎で死亡したが、小さな原発性腫瘍
が認められた。１匹のマウスには転移が１個所
にみられた。 コーチゾンに代えて他のステロイドが使用で
きるかどうかを調べるため、ヘパリンをハイド
ロコーチゾン、デキサメサゾンまたはメドロキ
シプロゲステロンとともに投与した。ヘパリン
とともに投与して腫瘍の退行を生じる点で酢酸
コーチゾンと同様に有効なものは、ハイドロコ
ーチゾンのみであつた。最大耐容量を用いて
も、デキサメサゾン（3.2mg／Kg）も、メドロ
キシプロゲステロン（112mg／Kg）も、ヘパリ
ンを同時投与してもしないでも、ルイス肺腫瘍
の退行は生じなかつた。 (c) Ｂ−16黒色腫：黒色腫細胞7.4×10⁶個を１群
５匹、40匹のマウスに皮下注射した。１群は上
述のヘパリンの経口投与とハイドロコーチゾン
の0.45mg／Kg飲水経口投与による治療を行つ
た。他の群にはヘパリンの経口投与と酢酸コー
チゾンの減衰用量の皮下投与を行い、第３の群
にはヘパリンと酢酸コーチゾン75mg／Kgの皮下
投与を行つた。対照には、水、ヘパリン単独、
ハイドロコーチゾンもしくはコーチゾンの単独
を投与した。対照動物はすべて、大きな腫瘍と
肺への転移を示し、31日目までに死亡した。ヘ
パリン＋酢酸コーチゾン群は、腫瘍がみられな
くなつてから、約７日間、治療を中断した。経
口ヘパリン＋酢酸コーチゾン減衰用量群では、
24日目に１匹のマウスが死亡したが、部分的に
退行した腫瘍と２個所の肺転移を認めた。これ
らは駆血性で0.1mm以下であつた。この群の残
りのマウスはすべて腫瘍が消失し、この治療を
中断した後も32日目まで腫瘍の再発はみられな
かつた。皮下ヘパリン＋酢酸コーチゾン群では
18日目に１匹のマウスが死亡し、もう１匹が21
日目に死亡した。いずれも肺への転移は認めら
れなかつた。他の３匹は32日目に治療を中断
し、３週後に経口ヘパリン＋酢酸コーチゾン減
衰用量によつて治療を始めたところ成功し、そ
の後腫瘍は消失した。経口ヘパリン＋経口ハイ
ドロコーチゾン群では、全マウスが治療を中止
した47日目以後も腫瘍の再発も認めなかつた。
経口ヘパリン＋経口ハイドロコーチゾンよる治
療は、卵巣腫瘍やルイス肺癌よりも黒色腫に有
効であるように思われた。 (d) 膀胱癌：各群７匹、70匹のマウスに腫瘍１mm³
を皮下移植した。対照動物は大きな原発性腫瘍
をもつて、31日目までに全例死亡した。膀胱癌
をもつたマウスで肺転移を生じた例はなかつ
た。１群は経口ヘパリン＋皮下酢酸コーチゾン
減衰用量の治療を、腫瘍の容量が140mm³になつ
た９日目に開始した。腫瘍の生長は停止した
が、退行は部分的で、腫瘍の容量が約70mm³にな
つた時点で、一定した状態を維持し、これは治
療を行つている限り続いた（すなわち61日以
上）。１匹の動物が肺炎で19日目に死亡したの
みであつた。休止腫瘍が生存していることは、
治療を中止すれば腫瘍の生長が再開することか
ら明らかであり、１匹の動物は中止した70日目
に生長が始まつた。皮下ヘパリン＋皮下酢酸コ
ーチゾン（75mg／Kg）で上述のように治療した
第２群でも結果は同様で、長期間にわたり休止
状態が続いた。１匹のマウスは21日目に死亡し
た。 経口ヘパリン＋酢酸コーチゾンの標準治療法
では完全な退行が得られないので、他の群では
もつと高濃度のヘパリンを経口投与した。経口
ヘパリン（600単位／ml）−酢酸コーチゾン減衰
用量では、さらに優位な腫瘍の退行を生じ、も
つと小さい腫瘍容量、すなわち約45mm³で定常状
態に達した。１匹のマウスが死亡した。しかし
ながら、ヘパリン1000単位／mlで完全な退行を
生じ、マウスは治療中止後、39日目にも腫瘍は
認められなかつた。この群には死亡例はなかつ
た。 要約すると、ヘパリン−酢酸コーチゾンの併
用投与を行うと、すべての腫瘍は生長を停止す
るかまたは退行する。逆に、いずれかの化合物
を単独に用いても、腫瘍の生長は食塩水のみの
注射を受けている場合と同じ速度で続く。この
種の対照動物はすべて、腫瘍が大きくなつて死
亡した。 ヘパリン＋酢酸コーチゾンで治療した動物の
大部分で、完全な退行が可能であつた。すなわ
ち、治療を中止しても腫瘍は再発しなかつた。
たとえば、最も有効な基準、経口ヘパリン
（200単位／ml）＋コーチゾン（皮下、減衰用量）
によれば、卵巣腫瘍で100％、ルイス肺癌で100
％、Ｂ−16黒色腫で80％の完全退行を認めた。
しかしながら、この基準で治療した膀胱癌には
完全退行はみられず、ヘパリンの用量を1000単
位／mlに上げて、再発をみない100％の完全退
行が得られた。効果のやや劣る治療基準、ヘパ
リン（皮下）＋コーチゾン（75mg）での完全退
行は、卵巣腫瘍で80％、ルイス肺癌で71％、Ｂ
−16黒色腫で60％、膀胱癌で０％であつた。 例 ６ 例２の六糖類ヘパリン断片を食塩水1.5mg／ml
に溶解した。移植卵巣腫瘍をもつマウス３匹を六
糖類断片７mg／Kg、１日２回の皮下注射、および
酢酸コーチゾン減衰用量の皮下注射によつて治療
した。対照のマウスには酢酸コーチゾン単独また
は食塩水を投与した。対照の腫瘍が進行的に生長
したのに対し、六糖類＋酢酸コーチゾン処置した
腫瘍は急速に退行し、４日後には肉眼ではみられ
なくなかつた。ついでこの六糖類による治療を中
断したところ、３〜５日後に腫瘍が再現した。 例 ７ 全身治療中の駆血域腫瘍を直接観察するため、
Muthukkaruppanら（Science、205：1416−
1418、1979）の方法に従つて、マウスの角膜にル
イス肺腫瘍を移植し、24時間後に治療を開始し
た。ヘパリン（経口）−酢酸コーチゾン減衰用量
は毛細血管の生長を、酢酸コーチゾン単独（0.24
mm／日）、ヘパリン単独（0.32mm／日）、食塩水
（0.23mm／日）に比べて有意に阻止した（0.02
mm／日）。ヘパリン−酢酸コーチゾンの存在下に
は、腫瘍の薄い板が駆血性を示す。三次元の腫瘍
の生長は起こらない。これに対して、食塩水対
照、またはヘパリンもしくは酢酸コーチゾン単独
を投与した場合は、腫瘍は脈管形成を行い、三次
元方向への生長を、角膜を穿孔してしまうまで続
ける。これらの大きな腫瘍は、ヘパリン−酢酸コ
ーチゾンの併用により、平面状の薄い角膜内相に
退行させることができた。しかしながら、角膜内
腫瘍細胞は根絶できなかつた。ヘパリン−酢酸コ
ーチゾンを中止すると脈管形成腫瘍が再生した。 死亡した全動物について肺への転移数を数え
た。６倍の立体鏡を使用した。対照動物では、肺
には３種類の転移腫瘍からなる転移が一面に認め
られた。これに対して、ヘパリン＋酢酸コーチゾ
ンの併用を行つた場合には、卵巣腫瘍を有するマ
ウスには転移は全くみられず、ルイス肺癌のマウ
スに１例を肺転移、黒色腫を有するマウスに径
0.1mm以下の駆血性転移を認めたにすぎなかつた。
ヘパリン−コーチゾン処置マウスにほぼ完全に転
移を認めなかつたことは全く驚くべきことであ
る。この効果は以下のデータによつてさらに明白
であろう。 肺転移数： 対照＝73動物中4553個 ヘパリン＋コーチゾン＝39動物中３個 しかも、治療を中止した生存動物にも肺転移は
みられなかつた。 この腫瘍の退行が直接的な細胞毒性である可能
性を排除するため、４種の腫瘍細胞すべてを、ヘ
パリン、酢酸コーチゾン、ヘパリン−酢酸コーチ
ゾンまたは薬剤なしのいずれかの処置を受けてい
るマウスの血清10％の存在下に培養した。ヘパリ
ン−酢酸コーチゾンは細胞の生長を阻害せず、実
際には刺激した。また、組織学的検索によつて
も、ヘパリン−酢酸コーチゾン投与を受けた動物
の骨髄または小腸粘膜に細胞毒性を示すような微
候は認められなかつた。 ヘパリン−酢酸コーチゾンが免疫反応を促進す
ることによつて腫瘍の退行を誘発する可能性を排
除するため、治療中断後のマウスに各種の間隔で
新しい腫瘍細胞を接種した。腫瘍は最初の植え込
みの場合と同じ速さで生長した。しかも、腫瘍の
退行がほぼ完全になる前にヘパリン−酢酸コーチ
ゾンを中止すると、最初の腫瘍の生長が再開す
る。また、治療の中止や開始により、またヘパリ
ン−コーチゾンを至適用量より少なく使用するこ
とにより、膀胱腫瘍がほぼ一定の小容量（すなわ
ち、45〜70mm³）に８週間もの長期間維持できたこ
とがある。 ウサジの角膜にシリカ粒子を植え込んで誘発し
た炎症性脈管形成、別のウサギからの別のリンパ
結節の植え込みによる免疫性脈管形成も、コーチ
ゾン−ヘパリンペレツトで完全に防止された。コ
ーチゾン自体も一時的に両型の脈管形成の発現を
遅延させ（空のペレツトに比べて）、またヘパリ
ン自体も免疫性脈管形成の発現を遅らせるが、両
者とも単独では、コーチゾン−ヘパリン併用の場
合のような長期にわたる脈管形成は生じない。 例 ８ ヒト結腸癌をヌード（胸腺欠如）マウスの皮下
に接種し、容量0.5cm³まで生長させた。対照も処
置動物も、飲水中のヘパリン量が1000単位／ml
で、他の群には経口ハイドロコーチゾン（0.45
mg／ml）および経口ヘパリン投与があるほかは、
同じ化合物を投与された。動物はミリポアフイル
ターで保護されたケージ内において飼育した。対
照動物では腫瘍は進行的に生長したが、ヘパリン
とコーチゾンまたはヘパリンとハイドロコーチゾ
ンで処理した動物では退行が認められた。処置腫
瘍は治療６週で触知しないとわからない程度にな
つた。 例 ９ CD−１スイス種マウスを使用した。この種の
マウスは受精しやすく、ほとんど常に妊娠してい
て、満腹の同産群を分娩するからである。雄１匹
を24時間ケージ内に放置した。敷きわらを変え、
午後５時に雌２匹を加えた。翌朝８時に膣栓をチ
エツクし、その存在を受精と判定した。少なくと
も20匹の妊娠動物を得ることができるだけの雄−
雌ケージを準備した。 受精の翌日に受精した雌動物の治療を、次の飲
水投与によつて開始した。 群−ヘパリン（Hepar）1000単位／水ml 群−リン酸ハイドロコーチゾン0.45mg／水ml 群−（）および（）を水に加える 群−水単独 治療は４日間のみ行い、以後１匹ずつ別のケー
ジに入れて、分娩を注意深く観察した。ケージは
毎日チエツクして流産の徴候を調べた（毛、遺残
胎仔等）。 、および群ではいずれも健康な産仔を出
産した。第群には産まれたマウスはなく、流産
の微候もなかつた。これはヘパリン−コーチゾン
が着床を、多分、子宮からの毛細血管の生長阻害
によつて阻止した、脈管形成抑制作用によるもの
と考えられる。[Table] Tetrasaccharides and disaccharides showed no activity. Oligosaccharides had low activity and were toxic at high concentrations. Therefore, hexasaccharide fragments were used in subsequent experiments. The chorioallantoic membrane on the 6th day of growth contained hexasaccharides (12 μg) and cortisone acetate (100 μg).
g) containing 12.6± by 48 hours.
A large avascular zone with a diameter of 0.1 mm was generated. In the case of heparin (and cortisone acetate), capillaries in the mesodermal layer were absent, while the other two tissue layers of the membrane remained intact and viable. Hexasaccharide alone did not promote tumor angiogenesis like heparin. All discs contain cortisone acetate (100μg)
and heparin fragments. No heparin fragments alone, nor cortisone nor methylcellulose alone produced a hemostatic zone. Ten embryos were used in each group. For hexasaccharide (+cortisone), the area of avascular zone was 17% of the vascular membrane at 12 μg and 15% at 0.1 μg. In the case of oligosaccharides, the maximum avascular area was 10%. Example 3: Fertilized chick embryos were removed from the shell on day 3 or 4, except without the use of external dishes and antibiotics.
1974) in a Petri dish, high humidity, 5%
Incubated with _CO2 . On day 6, heparin (6 μg) or hexasaccharide heparin fragment (12 μg);
or methylcellulose disks (10μ) containing either cortisone acetate (Sigma, powder without preservatives or suspending agents), or a combination of cortisone acetate and heparin, or a combination of cortisone acetate and hexasaccharides in chorionic urine. transplanted into the membrane. Embryos were examined after 48 hours and if a clear aemic zone developed around the methylcellulose disk, the diameter of the aemic zone was measured using a Nikon profile projector (20x magnification). Thirty embryos were used in each group. Some embryonic hearts were injected with India ink just before formalin fixation, allowing blood vessels to be traced to the edge of the avascular zone in histological sections. Hexasaccharide plus cortisone acetate produced a hemorrhagic zone with a diameter of 12.6±0.1 mm in all embryos. Heparin + cortisone acetate produced a hemostatic zone with a diameter of 8.9±0.7 mm. Neither compound alone nor in the presence of methylcellulose alone produced a hemostatic zone. In tissue sections of chorioallantoic membrane, normal growth of capillaries was observed in the presence of either compound alone. On the other hand, capillaries completely disappeared from mesoderm embryos to which either hexasaccharide + cortisone acetate or heparin + cortisone acetate was applied, while no effect on the ectoderm and endoderm cell layers was observed. Mature chorioallantoic membranes, in which vessels were not growing prematurely, were not affected by the cortisone acetate-heparin or -hexasaccharide fragment formulations. Example 4 Polymer pellets of ethylene-vinyl acetate copolymer (EVA) approximately 1 mm in diameter were injected with 180 μg of heparin (Sigma) or hexasaccharide fragments according to the method of Langer et al. (Nature, 263:797-780, 1976).
They were infiltrated with either 300 μg, or 1.5 mg of hydrocortisone acetate (Sigma), or a combination of cortisone and heparin. The pellet was implanted into the cornea of a rabbit eye, 1 mm from the limbus, and V2 cancer tissue was implanted 2 mm from the limbus distal to the polymer. The contralateral eye of each rabbit was similarly implanted with a blank control pellet proximal to the tumor. Release rates averaged 15 μg/day for heparin, 21 μg/day for hexasaccharide fragments, and 5 μg/day for cortisone. Mixing the compounds does not change their respective release rates. Colorimetrically, the pellets released heparin for 14 days, hexasaccharides for 11 days, and cortisone for over 30 days. If capillaries grow in the direction of the transplanted tumor, 3
Every day, measure the maximum vessel length using a stereoscopic slit lamp (10
(±0.1 mm). On the 14th day, the rabbits were sacrificed and each carotid artery was injected with India ink. The cornea was removed and examined using a stereoscope. New capillaries were observed to grow towards the tumor and pass through empty pellets or pellets containing heparin alone at an average rate of 0.44 mm/day, compared to 0.22 mm for pellets containing cortisone alone. Tumors behind these pellets became vascularized by 6-8 days. When the pellets contained both cortisone and heparin, there was no capillary growth for 13 days. When the heparin-cortisone heparet was removed or the pellet was depleted of heparin, capillary growth resumed. Histological observation showed that the tumor cells remained viable and had the ability to divide even though they were adjacent to the heparin-cortisone pellet. When the pellet in Example 2 in which heparin was replaced with a hexasaccharide fragment was implanted, new capillaries were directed toward the tumor by an average of 0.30 mm/mm in the presence of the hexasaccharide pellet.
days, average if the pellets contain cortisone.
0.14mm/day, average if no pellets
It grew at a rate of 0.32 mm/day. In the presence of the hexasaccharide and cortisone combination, no capillary growth was observed in 4 rabbits throughout the 13-day observation period, and 1 rabbit had a few capillary growths at a rate of 0.07 mm/day. It was just a matter of time. Example 5 (a) Ovarian tumor: Tumor pieces of 1 mm ³ were implanted into the backs of 30 mice, 5 mice per group, using a trocar. It started after 10 days when the average tumor volume was 1.5×10 ² mm ³ . Heparin 200 units/ml was added to the drinking water.
The average daily consumption is 3 for each 22g mouse.
It was ~5 ml. Cortisone acetate once a day
250mg/Kg for 6 days, 125mg/Kg for 1 day,
75 mg/Kg was administered subcutaneously for 1 day, followed by a maintenance dose (decrease administration) of 37 mg/Kg. Control animals received either saline injections or heparin or cortisone acetate alone. All control animals died from enlarging primary tumors or lung metastases by day 34. Mice treated with attenuated doses of oral heparin and cortisone had tumors that disappeared by day 15 and remained tumor-free even after treatment was discontinued. Other groups of mice were treated similarly except that heparin was administered subcutaneously twice a day at a dose of 627 units, and cortisone acetate was administered subcutaneously once a day at a fixed dose of 75 mg/Kg. The mice initially responded similarly, but tumors recurred after treatment was discontinued.
These mice were then treated with oral heparin and decreasing doses of cortisone acetate as described above, and the tumors permanently disappeared. One of these mice died on day 31, but the primary tumor was not visible to the naked eye and there were no metastases. (b) Lewis's lung cancer: 1 mm ³ of tumor pieces were transplanted into 42 mice, 7 mice per group, and treatment was started 7 days later.
Treatment consisted of oral heparin as previously described and subcutaneous administration of attenuated doses of cortisone. All control animals died by day 33 with large tumors and numerous lung metastases. Treatment in the heparin + cortisone acetate group was discontinued for approximately 7 days after tumors were no longer visible to the naked eye in each mouse. Heparin oral +
All mice in the cortisone acetate group stopped treatment by day 33 and remained tumor-free. In the subcutaneous heparin and subcutaneous cortisone acetate (75 mg/Kg) groups, five mice were discontinued from treatment on day 37 and remained tumor-free. The two animals were on the 30th day and
He died of pneumonia on day 33, but a small primary tumor was found. One mouse had one metastasis. To investigate whether other steroids could be used in place of cortisone, heparin was administered with hydrocortisone, dexamethasone, or medroxyprogesterone. Hydrocortisone was the only drug that was as effective as cortisone acetate in producing tumor regression when administered with heparin. Even using the maximum tolerated dose, neither dexamethasone (3.2 mg/Kg) nor medroxyprogesterone (112 mg/Kg), with or without co-administration of heparin, caused regression of Lewis lung tumors. (c) B-16 melanoma: 7.4×10 ⁶ melanoma cells were subcutaneously injected into 40 mice, 5 mice per group. Group 1 was treated with the above-mentioned oral administration of heparin and oral administration of hydrocortisone at 0.45 mg/Kg in drinking water. Another group received oral heparin and subcutaneous administration of attenuated doses of cortisone acetate, and a third group received heparin and cortisone acetate 75 mg/Kg subcutaneously. Controls included water, heparin alone,
Hydrocortisone or cortisone alone was administered. All control animals developed large tumors and metastases to the lungs and died by day 31. In the heparin + cortisone acetate group, treatment was discontinued for approximately 7 days after no tumor was observed. In the oral heparin + cortisone acetate attenuated dose group,
One mouse died on day 24, but a partially regressed tumor and two lung metastases were observed. These were hemostatic and less than 0.1 mm in diameter. All remaining mice in this group lost their tumors, and their tumors did not recur until day 32 after the treatment was discontinued. In the subcutaneous heparin + cortisone acetate group,
One mouse died on day 18 and the other mouse died on day 21.
He died on the first day. No metastasis to the lungs was observed in either case. The other three animals discontinued treatment on day 32 and were successfully started 3 weeks later with oral heparin plus cortisone acetate attenuated doses, after which the tumors disappeared. In the oral heparin + oral hydrocortisone group, no tumor recurrence was observed after 47 days, when all mice stopped treatment.
Treatment with oral heparin plus oral hydrocortisone appeared to be more effective for melanoma than for ovarian tumors or Lewis lung cancer. (d) Bladder cancer: 7 mice in each group, 70 mice with 1 ^mm3 tumor.
was implanted subcutaneously. Control animals had large primary tumors and all died by day 31. None of the mice with bladder cancer developed lung metastases. Group 1 started treatment with oral heparin plus subcutaneous cortisone acetate tapering doses on day 9 when the tumor volume reached 140 mm ³ . Tumor growth stopped, but regression was only partial and remained constant until the tumor volume reached approximately 70 ^mm3 , which continued for the duration of treatment (i.e., >61 days). . Only one animal died of pneumonia on day 19. The survival of a dormant tumor means that
Discontinuation of treatment was evidenced by resumption of tumor growth, with one animal beginning to grow 70 days after discontinuing treatment. Results were similar in the second group treated as above with subcutaneous heparin + subcutaneous cortisone acetate (75 mg/Kg), with prolonged quiescence. One mouse died on day 21. Because the standard therapy of oral heparin plus cortisone acetate did not result in complete regression, the other groups received higher concentrations of heparin orally. Oral heparin (600 units/ml)-cortisone acetate attenuation doses produced even more predominant tumor regression, reaching steady state with a smaller tumor volume, approximately 45 mm ³ . One mouse died. However, complete regression occurred at 1000 units/ml of heparin, and the mice remained tumor-free 39 days after treatment was discontinued. There were no deaths in this group. In summary, upon administration of the heparin-cortisone acetate combination, all tumors either stop growing or regress. Conversely, with either compound alone, tumor growth continues at the same rate as when receiving injections of saline alone. All control animals of this type died due to tumor growth. Complete regression was possible in the majority of animals treated with heparin plus cortisone acetate. That is, the tumor did not recur even after treatment was discontinued.
For example, the most effective standard, oral heparin (200 units/ml) + cortisone (subcutaneous, attenuated doses)
According to 100% for ovarian tumors and 100% for Lewis lung cancer.
%, complete regression of 80% was observed in B-16 melanoma.
However, complete regression was not observed in bladder cancer treated with this standard, and when the heparin dose was increased to 1000 units/ml, 100% complete regression without recurrence was achieved. Complete regression with a slightly less effective treatment standard, heparin (s.c.) + cortisone (75 mg), was 80% for ovarian tumors, 71% for Lewis lung cancer, and B
-16 melanoma was 60%, and bladder cancer was 0%. Example 6 The hexasaccharide heparin fragment of Example 2 was added to saline solution at 1.5 mg/ml.
dissolved in Three mice with implanted ovarian tumors were treated with subcutaneous injections of 7 mg/Kg of hexasaccharide fragments twice daily, and subcutaneous injections of decreasing doses of cortisone acetate. Control mice received cortisone acetate alone or saline. While the control tumors grew progressively, the tumors treated with hexasaccharide plus cortisone acetate regressed rapidly and were no longer visible to the naked eye after 4 days. Treatment with this hexasaccharide was then discontinued, and the tumor reappeared 3 to 5 days later. Example 7 To directly observe a hematopoietic tumor during systemic treatment,
Muthukkaruppan et al. (Science, 205: 1416−
1418, 1979), Lewis lung tumors were implanted into the corneas of mice, and treatment was started 24 hours later. Heparin (oral) - attenuated doses of cortisone acetate inhibited capillary growth, whereas cortisone acetate alone (0.24
mm/day), heparin alone (0.32 mm/day), and saline (0.23 mm/day).
mm/day). In the presence of heparin-cortisone acetate, tumor thin plates are hemostatic. Three-dimensional tumor growth does not occur. In contrast, when saline controls or heparin or cortisone acetate were administered alone, the tumors angiogenic and continued to grow in three dimensions until they perforated the cornea. These large tumors could be regressed to a planar, thin intracorneal phase using a combination of heparin and cortisone acetate. However, intracorneal tumor cells could not be eradicated. When heparin-cortisone acetate was discontinued, the angiogenic tumor regenerated. The number of lung metastases was counted for all animals that died. A 6x stereoscope was used. In control animals, the lungs were covered with metastases consisting of three types of metastatic tumors. On the other hand, when heparin and cortisone acetate were administered in combination, no metastasis was observed in mice with ovarian tumors, one case of lung metastasis was observed in a mouse with Lewis lung cancer, and one case of tumor metastasis was observed in a mouse with Lewis lung cancer.
Only hematogenous metastases smaller than 0.1 mm were observed.
It is quite surprising that the heparin-cortisone treated mice were almost completely free of metastases. This effect will be more evident from the following data. Number of lung metastases: Control = 4553 out of 73 animals Heparin + cortisone = 3 out of 39 animals Moreover, no lung metastasis was observed even in the surviving animals in which treatment was discontinued. To exclude the possibility that this tumor regression was due to direct cytotoxicity, all four tumor cells were isolated from mice receiving either heparin, cortisone acetate, heparin-cortisone acetate, or no drug. Cultured in the presence of 10% serum. Heparin-cortisone acetate did not inhibit cell growth and in fact stimulated it. Furthermore, histological examination revealed no signs of cytotoxicity in the bone marrow or small intestinal mucosa of animals receiving heparin-cortisone acetate administration. To exclude the possibility that heparin-cortisone acetate induces tumor regression by promoting an immune response, mice were inoculated with new tumor cells at various intervals after treatment was discontinued. The tumor grew at the same rate as the initial implant. Moreover, if heparin-cortisone acetate is discontinued before tumor regression is almost complete, initial tumor growth resumes. Furthermore, by stopping and starting treatment and by using less than the optimal dose of heparin-cortisone, the bladder tumor could be maintained at a small, almost constant volume (i.e., 45-70 mm ³ ) for as long as 8 weeks. There is. Inflammatory angiogenesis induced by implantation of silica particles in the rabbit cornea and immune angiogenesis induced by implantation of another lymph node from another rabbit were also completely prevented by cortisone-heparin pellets. Cortisone itself temporarily delays the onset of both types of angiogenesis (compared to empty pellets), and heparin itself delays the onset of immune angiogenesis, but both alone and in combination with cortisone-heparin Long-term angiogenesis does not occur as in the case of . Example 8 Human colon cancer was subcutaneously inoculated into nude (thymic deficient) mice and allowed to grow to a volume of 0.5 cm ³ . Both control and treated animals had a heparin content of 1000 units/ml in their drinking water.
and other groups received oral hydrocortisone (0.45
mg/ml) and oral heparin administration.
received the same compound. Animals were housed in cages protected by Millipore filters. Tumors grew progressively in control animals, whereas regression was observed in animals treated with heparin and cortisone or heparin and hydrocortisone. The treated tumor was palpable by 6 weeks of treatment. Example 9 CD-1 Swiss mice were used. This type of mouse is easy to fertilize and is almost always pregnant and gives birth to full litters. One male was left in the cage for 24 hours. Change the bedding,
Two females were added at 5 p.m. The vaginal plug was checked at 8 a.m. the next morning, and its presence was determined to indicate fertilization. - enough males to obtain at least 20 pregnant animals
A female cage was prepared. Treatment of fertilized female animals was started on the day after fertilization with the following drinking water administrations. Group - Heparin (Hepar) 1000 units/ml water Group - Hydrocortisone phosphate 0.45 mg/ml water Group - () and () added to water Group - Water alone Treatment was given for only 4 days, after which each animal was treated separately. She was placed in a cage and her birth was carefully observed. Cages were checked daily for signs of miscarriage (hair, retained fetuses, etc.). Both groups gave birth to healthy pups. No mice were born in the group and there were no signs of miscarriage. This is thought to be due to the angiogenesis-inhibiting effect of heparin-cortisone, which prevented implantation, possibly by inhibiting the growth of capillaries from the uterus.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １ 活性成分は(1)ヘパリンまたは六糖類以上の多
糖類であるヘパリン断片、および(2)コーチゾンま
たはハイドロコーチゾンもしくはハイドロコーチ
ゾンの11−ａ異性体を主成分とした、哺乳類動物
における脈管形成の抑制用医薬組成物。 ２ 活性成分はヘパリンとハイドロコーチゾンを
主成分とした特許請求の範囲第１項記載の医薬組
成物。 ３ 活性成分は六糖類ヘパリン断片とコーチゾン
を主成分とした特許請求の範囲第１項記載の医薬
組成物。 ４ 活性成分は六糖類ヘパリン断片とハイドロコ
ーチゾンを主成分とした特許請求の範囲第１項記
載の医薬組成物。 ５ 活性成分は六糖類ヘパリン断片とハイドロコ
ーチゾンを主成分とし、抗生物質を含む特許請求
の範囲第１項記載の医薬組成物。[Scope of Claims] 1. The active ingredients are (1) heparin or a heparin fragment which is a polysaccharide of six or more saccharides, and (2) cortisone or hydrocortisone or the 11-a isomer of hydrocortisone, which is a mammalian Pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis in animals. 2. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the active ingredients are heparin and hydrocortisone as main ingredients. 3. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the active ingredients are hexasaccharide heparin fragments and cortisone as main ingredients. 4. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the active ingredients are hexasaccharide heparin fragments and hydrocortisone as main ingredients. 5. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the active ingredient is mainly composed of hexasaccharide heparin fragments and hydrocortisone, and contains an antibiotic.