JPH0454125A - レトロウイルス感染症治療および予防用薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、レトロウィルスによる感染症を治療または予
防するための薬剤に関し、特に、ヒト免疫不全ウィルス
（ＨＩ　Ｖ）に起因するエイズ（ＡＩＤＳ）の治療およ
び予防に期待できる新規な薬剤に関する。

今世紀最大の奇病とされ、注目を浴びている後天性免疫
不全症候群（ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ｄｅｆ
ｉｃｉｅｎ−ｃｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＡＩＤＳ）はレ
トロウィルスに属するヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ
）に起因するウィルス症疾患である。この疾患は、１９
８１年アメリカＣＤＣの週報に、ロサンゼルスの男性同
性愛者５人にカリニ肺炎が発症したことに端を発する（
Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒ
ｏｌ：ＭＭＶＲ，３０２５０゜１９８１）。その後、こ
の病気は、またたく間に世界中に広がり、世界保険機構
（ＷＨＯ）の集計によれば、１９８７年８月１２日の時
点においてすでに１２２力国に発生が認められ、患者総
数は６万人を越している。わが国においても１９８７年
９月４日の時点で５０人の患者が確認され、そのうち２
８人はすでに死亡している。ＡＩＤＳが、このように急
速に世界中に広がりをみせているにもかかわらず、木偶
の予防法はほとんど確立されていない。本店予防のため
のワクチン開発の研究はさかんに行われてはいるが、Ｈ
ＩＶの型が少なくともＨＩ　Ｖ　−１ｔ−ＨＩ　Ｖ−２
（７）２ツは存在すること、さらには、このウィルスが
インフルエンザウイルス以上の速度で変異していること
などがワクチン開発の実用化を困難にしている。世界の
主たるＡＩＤＳ学者は、今後新たなＨｉ　Ｖの型が発見
される可能性を否定していない。

このように、ＡＩＤＳ制圧の手段として、ワクチンによ
る対処は極めて困難であると考えられるので、抗ＨＩＶ
剤による治療又は予防的治療法が期待されている。ＡＩ
ＤＳ患者数の急激な増加の背景にはｒＡＩＤＳ予備群」
とも言われる多数の未発症ＨＩＶ感染者（キャリア）の
存在がある。これらキャリアをいかに発症させないかが
、ＡＩＤＳ対策上、重要な課題である。抗ＨＩＶ剤はま
さにこの命題にかなうものであり、その開発が強くのぞ
まれている。

［従来の技術］ 抗ＨＩＶ剤として、唯一実用化されているものとしてア
シドチミジン（ＡＺＴ）がある（Ｎａｔｕｒｅ　３２６
゜４３０、１９８７）。これは、制がん剤として合成さ
れたものであり、ＨＩＶの逆転写酵素阻害作用に基づく
抗ＨＩＶ剤であるが、生体の造血組織に強い毒性を有す
るため、多くの例で貧血をもたらすことがわかっている
。その他、多くの物質が、抗ＨＩＶ剤の候補として研究
か行われているが、有効且つ安全な抗ＨＩＶ剤はまだ開
発されているとは言えない。

抗ＨＩＶ作用を有する物質を生体又は生体由来物質に求
めた例として、インターフェロンがある（Ｉｎｔ、　Ｊ
、　Ｃａｎｃｅｒ　３Ｂ、　４３３．１９８６）がその
有効性に関しての明確な報告はない。さらに、最近、筋
肉内にふくまれている内槽（イノシトール）に硫酸基を
結合したものの抗ＨＩＶ作用が試験管内反応（インビト
ロテスト）により確認されたが、この化合物は培養液１
ｍｌ当りｍｇ単位の濃度が必要とされることから、抗Ｈ
ＩＶ活性の低いものと考えられる。

糖類を硫酸化したものについては、例えば硫酸デキスト
ランが、ある種のウィルスに対して抗ウィルス作用を示
すことが知られており（Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　１３，３６５，１９６５）　　　Ｈ
Ｉ　Ｖに対しても抗ウィルス作用を示すことが報告され
ている（ＴＨＥＬＡＮＣＥＴ、　ＪＵＮＥ　１３．１３
７９．１９８７）。しかしながら、デンプンやデキスト
ラン等のα−グルコシド結合をもった多糖体は体内酵素
によって分解されることが懸念される一方、多糖の生理
活性は分子量に依存することが多いため、生体中（イン
ビボ）においては期待される効果が必ずしも出るとは言
えない要素を持つ。そこで本発明者の一部は体内酵素−
の分解を受けにくい、１，３−β−Ｄ−グルカンを主鎖
とする硫酸化多糖がこの問題点を解決する手段として望
ましいと考え、スエヒロタケが産生ずるシゾフィランの
硫酸化物（特開昭６３−１１６４９９）について抗エイ
ズ活性を見出した。この他、１．３−β−Ｄ−グルカン
の硫酸化物の抗エイズ効果は昆布類のラミナリン（Ｌａ
ｍｉｎａｒｉｎ）や椎茸のレンチナン住ｅｎｔｉｎａｎ
）等が知られている。

しかし、これらに含まれる１、３−β−Ｄ−グルカンは
含有量が少なく、また微生物由来のものに比べ生産性に
劣る。また、原料である１、３−β−Ｄ−グルカンの分
離においても多くは温水やアルカリ等を用いた抽出法に
頼るため、この抽出溶媒可溶性の夾雑物も多く抽出され
、医薬原体として用いるには目的物質からこれら夾雑物
の排除に複雑な工程が必要となる。本発明者らは今後も
増加することが予想されるエイズ感染者や、感染予防を
期している人々のニーズに対して、抗ＨＩＶ医薬原体の
入手の困難さや強い副作用はエイズ患者増加の歯止め策
としても望ましくないと考え、抗ＨＩＶ作用を有する硫
酸化多糖の原料で、生体中でも比較的安定で、また生産
性に優れ、且つ高純度なものを探索してきた。

［問題点を解説するための手段］ 本発明者らは、前述したような状況下において、レトロ
ウィルスに起因する各種の疾患の治療または予防的治療
に有効な新規な薬剤を求めて研究を重ねた結果、ユーグ
レナを培養して得られる多糖類（１，３−β−Ｄ−グル
カン）であるパラミロンの硫酸化物（硫酸化パラミロン
）がレトロウィルスの増殖を抑制する機能を有すること
を見出し、本発明を導くに至った。本発明で使用される
パラミロンはユーグレナの細胞内に不水溶性顆粒として
存在するため、分離、精製が容易で、さらに最適培養条
件のもとて細胞の乾燥重量の約７０％という高い含有率
が得られる。このユーグレナの効率的な培養方法、およ
びパラミロンの分離、精製方法に関しては既に本発明者
の一部によってすでに述べられているところである（特
開昭６４−３７２９７）。ここで述べるユーグレナとは
動物学の分類上ユーグレナ属（ミドリムシ属）に属する
原生動物で、これに属する種、変種、変異種のすべてを
含むものとする。代表的なものとしては、ユーグレナ・
グラシリス株（Ｅｕ　１ｅｎａ　　ｒａｃｉｌｌｉｓ）
、ユーグレナ・グラシリス・バシラリス変種（Ｅｕ　１
ｅｎａ　　ｒａｃｉｌｌｉｓ　ｖａｒ、ｂａｃｉｉｌａ
ｒｉｓ）、ユーグレナ・ビリディス（Ｅｕ　１ｅｎａ　
ｖｉｌｉｄｉｓ）、アスタシア・ロンガ（Ａｓｔａｓｉ
ａ　Ｊｏｎ　ａ）などである。更にユーグレナは、池や
沼等の天然水系にも自然に生息しており、これらを採取
して利用することも可能である。又、これらを紫外線処
理、熱処理、抗生物質処理、化学変異剤処理等の公知の
方法で処理して得られた、各種の変異株も使用すること
ができる。また、これらのユーグレナ細胞より得たパラ
ミロンに関しては、使用上、あるいは薬効上の機能性の
増強または付与のため、必要に応じ酸や酵素による減成
、硫酸基以外の官能基による二次修飾、架橋処理を加え
ることが可能であるが、本質的にパラミロンを原料とし
、硫酸化を施した化合物であれば本発明で云うところの
薬剤の範晴から出るものではない。

パラミロンを硫酸化する方法としては多糖類を硫酸化す
る既知の方法のいずれを用いてもよいが例えば、硫酸を
用いる方法、クロルスルホン酸を用いる方法、スルファ
−トリオキサイドを用いる方法等が使用できる。これら
の方法のうち、ルイス塩基との組合せで用いる、クロル
スルホン酸法およびスルファ−トリオキサイドを用いる
方法は硫酸を用いる方法に比較して多糖体の分解が少な
いので、医薬材料としての品質安定性を確保する面から
製造方法として優れている。ルイス塩基としては、ピリ
ジン、トリエチルアミン、ジオキサンおよびビス（２−
り四ロエチル）エーテル等か用いられる。また、ピリジ
ン無水硫酸コンプレックスをピリジン中或はジメチルス
ルホキシド中でパラミロンと反応させて硫酸化する方法
も簡便法として用いられる。調製した硫酸化パラミロン
は、保存性の面からアルカリ金属塩又はアンモニウム塩
等の適当な塩の形にしておくのが望ましい。

本発明に用いる硫酸化パラミロンは、後の実施例からも
明かなように、ヒトＴ細胞由来株化細胞（Ｍｏｌｔ−４
Ｃ１ｏｎｅ　Ｎ１１８細胞）を用いたインビトロの抗Ｈ
ＩＶ活性テストにおいて、ＨＩＶの増殖を完全に抑える
最小有効濃度は約１０ｇｇ／ｍｌであり、従来より最も
有効であったと言われる硫酸デキストランの最小有効濃
度が数μｓ／ｍ　ｌ〜１０μｇ／ｍｌであることに比べ
てもほぼ同等と見られる。

本発明の薬剤は、ウィルス増殖を抑制するという薬効が
優れていることに加えて、その原料であるパラミロンが
、１．３−β−Ｄ−グルカンである点においても有利で
ある。即ち、硫酸化パラミロンは１．３−β−Ｄ−グル
カンの硫酸化物であるため、生体内酵素によって分解さ
れてしまう可能性は少なく、患者に投与した場合にも有
効濃度を比較的長時間保持できると期待される。

以下、本発明の理解を深めるために、本発明の薬剤の抗
ＨＩＶ活性を示す実施例に沿って、本発明を説明するが
、本発明はこの実施例に制限されるものではない。例え
ば、以下の実施例においては、ＨＩＶ　（ヒト免疫不全
ウィルス）としてＨＩＶ−１（ＬＡＢまたはＨＴＬＶ−
ＩＩ［８とも呼ばれる）を用いているが、本発明の薬剤
は、ＨＩＶ−２や他のウィルスに対しても同様の効果を
奏するものである。

［製造例１］パラミロンの調製 本発明におけるパラミロンは例えば以下に述べる方法で
調製した。ユーグレナグラシリス（Ｅｕｇ−１ｅｎａ　
ｇｒａｃｉｌｉｓ）株を前培養培地（第１表）５ｍｌを
含む試験管に植菌し２８℃において３日間振盪培養した
。ついで、培養液を前培養培地１００ｍ１を含む坂ロフ
ラスコに植菌し２８℃において６０時間振盪培養した。

得られた培養液を本培養培地（第２表）　１．２１を含
む２Ｌジャーファーメンター中でグルコース濃度を２％
以内に制御しながら２８℃６０時間培養を行った。ここ
で得られる培養液から遠心分離機で細胞を集め、水２Ｌ
に再懸濁し３５０　ｋｇ／ａｍ”の圧で高圧乳化機にか
け細胞を破砕した。その後で遠心分離機にかけ下層の白
色グルカン層を回収した。さらにラウリル硫酸ナトリウ
ム１％水溶液２Ｌに懸濁して１００℃で６０分間攪はん
して脂質及びタンパク質を除去した。

次いでこれを遠心分離水洗を繰り返し、アセトン中で分
散脱水した後、乾燥させ純度９９６８％のパラミロン白
色粉末３０ｇを得た。ここで得られたパラミロンの数平
均分子量はマナーズ法（Ｍａｎｎｅｒｓｅｔ　ａＬ　、
　１９７１）の改変法を用いて約１２万と測定された。

第 表 第 表 ［製造例２］硫酸化パラミロンの調製 製造例１の方法で得られたパラミロンは例えば以下のよ
うにしての硫酸化物に調製した。

無水ピリジン３０ｍ１を１００ｍ１の共栓付三角フラス
コに入れ、水冷下クロルスル示ン酸２．０ｍｌ及びパラ
ミロン１．０ｇのジメチルスルホキシド３０ｍ１混合溶
液を徐々に添加した。８５℃にて３時間攪拌反応を行い
、室温に冷却後傾斜して上澄のピリジンを除いた。下層
に蒸留水１０ｍ１を加え、次いでメタノール２００＋ｎ
ｌを加えた。生じた沈澱を濾過し５％塩化ナトリウム１
５０ｍ１を加え、次いで６Ｎ水酸化ナトリウムを加えｐ
Ｈ９とした。この溶液に３倍容アセトンを加え、生じた
沈澱を乾燥し置換率５３％（グルカンを構成する結合に
携わっていない全水酸基に対し硫酸エステル化した水酸
基の比率）の硫酸化パラミロン０．７ｇを得た。

以上に述べた方法で調製した硫酸化パラミロンについて
、抗レトロウイルス活性を評価するために、以下の実施
例で述べる試験を実施した。

［実施例１］抗ＨＩＶ活性の測定（ウィルスによる細胞
変性効果の抑制活性のテスト） Ｍｏｌｔ−４ｃｌｏｎｅ　　Ｎｏ、　８株の培養細胞由
来のＨＩＶウィルスをＯ，Ｏｌｍ、　ｏ、　ｉの濃度で
感染させた後、細胞を培地で洗って吸着していないウィ
ルスを除去し、この細胞を試験に供した。また、対照と
してウィルスの非感染細胞も試験に供した。

２４穴マイクロプレートの各ウェルに３．５Ｘ１０’個
／ｍｌの細胞懸濁液を１ｍｌ入れ、さらに試料即ち製造
例２で調製した硫酸化パラミロンを最終濃度１０μｓ／
ｍｌになるようにし添加した培地１ｍｌを加えて、６日
間培養した。また、対照として硫酸デキストランを最終
濃度１０μｇ／ｍ　ｌになるように添加した培地１ｍｌ
、および無添加の培地１ｍｌを加えたものを同様に培養
した。

培養後の細胞を観察し、ウィルスによる細胞変性効果の
有無を確認した結果、無添加の培地では、ウィルスによ
る細胞変性効果が認められたが、硫酸化パラミロン及び
硫酸デキストランではウィルスによる細胞変性効果が認
められず、これらの試料にウィルスによる細胞変性効果
の抑制活性即ち、抗ＨＩＶ活性があることが確認された
。

［実施例２］抗ＨＩＶ活性の測定（ウィルス逆転写酸素
活性の測定） 実施例１の培養上清のウィルス逆転写酵素活性を５ｃｉ
ｅｎｃｅ　２２８（１９８３）３３６頁記載の方法で測
定した。即ち、培養上清１ｍｌを１２．ＯＯＯＸｇで９
０分遠心分離し得られた沈澱物に、１％ＮＰ−４０及び
１ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７、８の１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩバッファーを１ｏＪ、Ｌｌ加え、さらニ０．
１Ｍ　ＭｇＣｌ２゜０．０４５Ｍ　ＫＣＩ、　　４ｍＭ
　ＤＴＴ、　　１００　μｇ／ｍｌのＰｏ１ｙ（ｒＡ）
　：ｏｌｉｇｏ　（ｄＴ）　１２−１８　（ｒＡｄＴ）
を含むｐＨ７，８の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩバッフ
ァーを９０μｌ加えた。これに２．５μｍの（ｍｅｔｈ
ｙｌ−３Ｈ）　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　５°−ｔｒｊｐｈ
ｏ−ｓｐｈａｔｅ　　（３０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を添加し
、３７℃で６０分反応させた。反応後１００μｌを２．
４ｃｍのろ紙（Ｗａｔｍａｎｎ社）にスポットし、５％
ＮａａＨＰＯ４溶液で洗浄し、９９％エタノールに浸漬
後に液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定
した。その結果、第３表に示すように無添加の培地では
、ウィルス逆転写酵素活性が認められたが、硫酸化パラ
ミロン及び硫酸デキストランではウィルス逆転写酵素活
性が認められず、これらの試料に抗ＨＩＶ活性があるこ
とが確認された。

第３表　ウィルス逆転写酵素活性の測定結果特許出願人
　ハリマ化成株式会社 明治製菓株式会社

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）有効成分としてユーグレナ由来の１，３−β−Ｄ
   −グルカン（以下パラミロンと呼ぶ）を硫酸化して得ら
   れるパラミロン由来の硫酸化多糖を有効成分として含有
   することを特徴とするレトロウイルス感染症治療および
   予防用薬剤。
2. （２）レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ
   ）である特許請求の範囲第（１）項に記載の薬剤。