JPH04507096A - 自己免疫疾患用剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 自己免疫疾患用剤 本発明のりゾレシチン誘導体を含有する免疫疾患の治療用医薬調剤の製法に関す る。

***特許公開第２００９３４２号公報及び同第２００９３４３号公報から、合成 リゾレシチン化合物を免疫学的アジュバントとして及び抵抗性の上昇のために使 用することができるということはすでに公知である。更に、この種のアルキルリ ゾホスホリピドが抗腫瘍剤として有効であるということは***特許公開第２６１ ９６８６号公報から公知である。更に、リゾホスファチドの投与後、不所望な影 響に対する身体の抵抗性を高くするであろう活性化細胞が形成されるということ も公知である。更に***特許公開第３５３０７６７号公報中には多発性硬化症の 治療のために合成リゾレシチン化合物を使用することが記載されている。

有機体のすべての免疫学的反応においてＴ−リンパ球は大きな役割をはたしてい る。その際、このＴ−リンパ球の任務及びその作用方法は２つの主要な作用機構 に分けることができる、すなわち １　バクテリア、ビールス、寄生物及び抗原を有する他の物質のような異物の直 接の防御、この際Ｔ−リンパ球は直接エフェクター機構に関与している、および ２　免疫応答の調節、これにより免疫応答の過剰はない。

どちらの場合にも、Ｔ−リンパが高い特異性を有す゛るということ、すなわちこ れらの細胞が唯一の全く特定の抗原を認識するこという特性を有しているという ことが、Ｔ−リンパ球の作用法に関して特徴的である。しかしながら、Ｔ−細胞 がこの特性を示す前に、このＴ−細胞がまず静止状態から活性化されることが必 要である、このことは増殖及び分化を前提とする。

Ｔ−リンパ球は蛋白質により形成される異なる膜構造により２種の大きな亜群、 すなわちＣＤ４”″及びＣＤ１Ｔ−細胞に分類される。ＣＤ’“はヘルパーもし くはインデューサーニー細胞とも呼ばれ、特に外来蛋白質の認識及び抗原に対す る防御反応の惹起に関与する。

サプレッサーもしくは細胞毒Ｔ細胞とも呼ばれるＣＤ１−細胞は特にウィルスに 感染した細胞の認識及び破壊に関与する。

特に、動物界の高度に進化した種において自己反応特性を示すＴ−細胞が生じる ということが今や示された。このことは、このようなＴ−リンパ球が有機体の身 体自体構造に対して向けられており、こうして身体自体の物質及び細胞を攻撃す るように予めプログラムされている。通常、この自己反応性Ｔ−細胞は他の細胞 又はファクターの調節性の影響により不活性であり、こうして有機体の保護のた めに平衡が生じる。しかしながら、この平衡が妨害されると、これにより自己免 疫疾患が誘発される。このことは自己攻撃細胞又は自己抗体の形成に導びき、こ れは最後に自己免疫疾患を惹起する。しかしながら、従来どの抗原が人における この症候に関与しているのか知られていない。

このような自己免疫疾患は従来免疫抑制物質、例えばコルチコステロイド、シク ロホスファミド、シクロスポリンＡ等で処置されている。しかしながら、これら の物質が全免疫システムを抑制するだけでなく、更に著しい副作用、例えば骨髄 の抑制、発ガン性、並びに高い毒性を有するということが示された。

本発明の課題は前記欠点を示さない、他の自己免疫疾患治療剤を製造することで ある。

アントレーセン（Ｒ，Ａｎｄｒｅｅｓｅｎ）及びムンダー（Ｐ、Ｍｕｎｄ、ｅｒ ）（Ｎｅｗ　ＴｒｅｎｄｓＬｉｐｉｄ　Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ　Ｒｅｓ、Ｂａ５ｅ １、Ｋａｒｇｅｒ、１９８８、第１、巻、第１．６〜２９頁及びＩｍｍｕｎｂｉ ｏｌ、（１９７９）１５６．４９８〜５０８）はアルキルリゾホスホリピドがリ ンパ球の非特異的増殖を抑制する立場にあるということをすでに証明することが できた。

意外なことに、自己免疫反応に関与する特異的な自己反応性Ｔ−細胞の増殖がま さに全く特定のアルキルリゾホスホリピドにより抑制され得ることが今や見い出 された。

こうして、本発明の課題は一般式Ｉ ［式中、Ｒ１は炭素原子数１２〜１８のアルキル基を表わし、Ｒ２は炭素原子数 １〜８のアルキル基を表わし、かつＲ８はＨ又は炭素原子数１〜３のアルキル基 を表わす］の化合物を使用することを特徴とする医薬調剤の製法である。

アルキル基Ｒ，，Ｒ，及び／又はＲ３は分枝していてよいが、有利には直鎖であ る。一般式■の化合物において、Ｒ８が炭素原子数１〜３のアルキル基であるの は有利であり、特にメチル基であり、かっ／又はＲ３は有利にＨである。有利な 化合物は特にＲ，＝ｎ−ヘキサデシル、及びＲ，＝メチル及びＲ３＝Ｈの式■の 化合物（化合物■）、及びまず第１にＲ，＝ｎ−オクタデシル、及びＲ，＝メチ ル及びＲｓ　＝Ｈの式ｒの化合物（化合物■）である。

式■の化合物の製造は公知であり、文献に記載された方法で行なうことができる （例えばり、Ａｒｎｏｌｄ等著、Ｌｊｅｂｉｇｓ、Ａｎｎ、Ｃｈｅｍ、７０９． ２３４〜２３９　（１９６７）　；Ｈ，Ｕ、Ｗｅ　Ｉ　ｔ　ｚｔｅｎ及びＯ，Ｗ ｅｓｔｐｈａｌｌＬｉｅｂｉｇｓＡｎｎ、Ｃｈｅｍ、７０９．２４０〜２４３　 （１９６７）参照）。

本発明により製造した医薬調剤がリウマチ様関節炎又は強直性を椎炎の治療に特 に良好に適しているということが示された。

この非常にしばしば発現する疾患は一般的疾患である進行性慢性多発関節炎であ り、この疾患は慢性的に、又は−気に進行する。この疾患は多くの場合、３才〜 ４才で発現し、男性よりも女性が約３倍罹病する。

この疾患は最も重い奇形に導ひくことがある。

本発明により製造した調剤はハシモト甲状腺炎、前身性紅斑性狼癒のためにも、 グッドパスチュア症候群、天庖癒において、バセドー病及び重症筋無力症におい て並びにインシュリン抵抗に対して、更に自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血 小板減少性紫斑病、進行性全身系硬化症、混合結合組織疾患、悪性貧血、特発性 アジラン病、抗***抗体により誘発される不肖症の場合、糸球体腎炎、水底性エ ンフィトイド（ｂｕｌｌｏｅｓｅｓ　Ｅｍｐｈｉｄｏｉｄ）、ショーブレーン症 候群において、細胞が媒介免疫性及び高細胞に対する抗体により惹起される真性 糖尿病の場合、アドレナーゲン（ａｄｒｅｎｅｒｇｅｎ）薬剤抵抗、慢性活性肝 炎において、並びに組繊特異性抗体により惹起される内分泌腺の脱落において治 療のために好適である。

自己免疫の発現のためには遺伝学的素因が存在しなくてはならないということは 公知であるが、免疫学的現象を導入した独得な方法は知られていない。しかしな がら、ウィルス又はバクテリア感染がこの際重要であるということは想像される 。

すでに前記のようにＥ　Ｔ　−１８０ＣＨｓは特にリウマチ様関節炎及び強直性 を椎炎に好適である。ＥＴ−１８−ＯＣＨ，の作用をバルブ／ｃ（Ｂａｌｂ／ｃ ）−マウスのプロテオグリカン−誘発進行性多発関節炎において調べた。この動 物モデルは、例えば臨床検査、例えば放射線分析及びシンチグラフィー骨検査に より及び関節結合及びを柱の組織病理学的調査により、人におけるリウマチ様関 節炎及び強直性を椎炎に強い一致を示した（Ｇｉａｎｔ等著、Ａｒｔｈｒｉｔｉ ｓ　ｒｈｅｕｍ、３０　（１９８７）　、２０１〜２１２；Ｍｉｋｅｃｚ等著、 Ａｒｔｈｒｔｔｊｓ　ｒｈｅｕｍ、３０　（１９８７）　、３０６〜３１８）。

この関節炎は両側の小さい末梢関節における多関節滑膜炎として始まり、を椎炎 をも包含し、これは関節の中の軟骨及び骨の強い破壊を伴なつて進行する。関節 炎症のはじめの外見的症状（はれ及び赤変）は関節炎を惹起するプロテすグリカ ンの第３または第４回目の腹腔内注射の後に発現する。

バルブ／Ｃ−マウスにおける関節炎の発現は宿主マウスの軟骨プロテオグリカン に対する細胞における並びに体液における免疫応答の出現に依存する。しかしな がら、循環する自己抗体は超免疫関節炎動物においてのみ、軟骨崩壊が多かれ少 なかれ現われるとき、発現する。この自己抗体は完全な（崩壊していない）、か つコンドロイチナーゼＡＢＣで処理したマウスの軟骨−プロテオグリカンと反応 し、かつ免疫化するプロテオグリカンと交差反応を示す（Ｍｉｋｅｃｚ等著、Ａ ｒｔｈｒｉｔｉｓ　ｒｈｅｕｍ、３０（１９８７）、３０６〜３１８）。

ＥＴ　１８　０Ｈｚでの前処置は動物を疾患から保護するか、又は関節炎を惹起 するプロテオグリカンでの免疫化の間に処置を開始するかぎり、関節炎の進行は 著しく遅くなる。更に、処置した群において関節炎が発生するかぎり、臨床的症 状、例えば赤くはれることは、あまり強くない。更に、処置していない動物にお いてより、より少ない末梢関節が罹病した。ＥＴ−１８−ＯＣＨ，での処置の開 始は全実験期間の間循環−（自己）−抗体の水準を低下させ、特異的抗体の生産 を抑制した。予めＥ　Ｔ　−１８−ＯＣＨｓで処置した動物からのＴ−リンパ球 は免疫のために使用した抗原の存在において増殖しない。コンカバリンＡでの非 特異的Ｔ−細胞−刺激が同様に明らかに抑制される。

本発明により使用すべきアルキルリゾホスホリピドを用いて自己反応性Ｔ−細胞 は抑制され、かつこの際Ｔ−細胞がＣＤ”−又はＣＤ”−細胞であるかはどちら でもよく、この際この抑制は細胞のホスファチジルコリン物質代謝の妨害により 惹起されるということも見い出された。この妨害が活性化Ｔ−細胞に関してのみ 特異的であり、かつこの際活性化されていないＴ−細胞はその合成能において影 響されないということは特に注目に値する。自己反応性Ｔ−細胞の増殖はこれが 自己攻撃性に作用するための不可欠の前提であるので、アルキルリゾホスホリピ ド誘発抑制により免疫サプレッションが実施される。

次に図面と組み合わせて実施例につき本発明をより詳細に説明する。図面におい ては次のものを示す：第１図　種々の作用物質による自己反応性ＣＤ４“−細胞 の増殖抑制の、その量に関連するグラフ図；第２図　第１図と同様であるが、実 験時間に関連するグラフ図； 第３図　第１図と同様であるが、ＣＴＬＬＩ−細胞の増殖抑制に関するグラフ図 ； 第４図　ＥＴ−１８−ＯＣＨｓの存在におけるＴ−リンパ球の新規合成能（コリ ン組込み）の細胞の活性化状態に関連するグラフ図； 第５図　ＥＴ−１８−ＯＣＨ３の存在におけるＡＲ１７Ｔ−細胞によるホスファ チジルコリンの分解のグラフ図； 第６図　第５図と同様であるが、活性化していないＴ−細胞に関する図。

第７図　第２〜５群の免疫Ｂａ１ｂ／ｃ−マウスのリンパ球刺激テストのグラフ 図： 第８図　牛関節軟骨のプロテオグリカン（ＢＡＣ−ＰＣ）で免疫した第４群の動 物中の抗体水準のグラフ図； 第９図　牛関節軟骨のプロテオグリカン（ＢＡＣ−ＰＣ）で免疫された第５群の Ｂａ１ｂ／ｃマウスの血清中の抗体水準に対するＥＴ−１８−ＯＣＲ，の作用の 図： 第１０図　人骨増殖体−軟骨（ＨＹＡＣ−ＰＧ）のプロテオグリカンで免疫され た第７群の動物の血清中の抗体水準のグラフ図； 第１１図　第６群〜第９群のマウスの第７図と同様の図； 第１２図　ＨＹＡＣ−ＰＧで免疫化された第８群のＢａ１ｂ／ｃ−マウスの血清 中の抗体水準に関するＥＴ−１８−ＯＣＲ，の作用のグラフ図；第１３図　ＥＴ 　１８　０ＣＨｓで前処置し、かつ引き続きＨＹＡＣ−ＰＧで免疫したバルブ／ Ｃマウスの血清中の抗体水準のグラフ図。

例１ ここで使用される自己反応性ＣＤ４”″　Ｔ−リンパ球細胞は、ラットにおいて 実験的自己免疫−関節炎（アジュバント関節炎とも称される）を発生させる原因 となる。このようなリンパ球細胞はＪ、Ｈｏ１ｏｓｈｉｔｚ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ 、Ｖｏｌ、２１９　（１９８３）、５６〜５８頁）の方法により単離されている 。

）で誘発された。

抗原の存在における特異的残留刺戟の間にアルキル溶解燐脂質によってＣＤ４” −細胞の増殖を阻止するＴ−リンパ球細胞（ＡＲ１７）ＩＸＩＯ’個を、ＲＰＭ Ｉ＋１０％ウシ胎児血清＋抗原１μｇ中で４８時間培養する。抗原提供細胞とし て照射した（３０Ｇｙ）胸腺細胞ｌＸｌ０’個を一緒に培養する。前記時間後に 培養物ごとに３Ｈ−チミジン０．５μＣｊを加え、引続き６時間の培養後にリン パ球細胞のＤＮＡ中へのチミジンの組込み量を測定する。

結果はＦｉｇ、１に示しである。このグラフから、このようにして惹起されたＡ Ｒ１７−細胞の増殖が物質１−オクタデシル−２−メチル−グリセロ−３−ホス ホコリン（以下ＥＴ−１８−ＯＣＨ，と称する）によって阻止される。

例２ 例１で記載したようにして単離されたＡＲ１７−細胞を、培地中で増殖するため に成長因子（ＩＬ−２）を加えて刺戟する。この際アリキル溶解燐脂質によるこ の増殖の阻止を試験する。実験は次のように行ったＴ−リンパ球細胞（ＡＲ１７ ）ＩＸＩＯ’個を、ＲＰＭ１１６４０＋１０％ウシ胎児血清＋ＣｏｎＡ刺戟牌臓 細胞（ＩＬ２）の１肺臓培養上澄み中で２４時間及び４８時間培養する。この時 間後に培養物あたり３Ｈ−チミジン０．５μＣｉを加え、さらに６時間の培養後 にリンパ球細胞のＤＮＡへのチミジンの組込み量を測定する。

結果をＦｉｇ、２で示しである。このグラフから、この場合にも物質ＥＴ−１８ −ＯＣＨ８が増殖に対する抜群の阻止効果を示すことがわかる。

例３ 細胞毒性Ｔ−リンパ球細胞（ＣＴＬＬＩ）［Ｍ、Ｍ、Ｓｉｍｏｎ等によってＥｕ ｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８６）、１６．１２６９〜１２７６で記載］を 単離し、この細胞系のアルキル溶解燐脂質による増殖阻止を試験した。ここで使 用した細胞系は、自己反応性ＣＤ　８　”Ｔ−細胞である。実験を実施するため に、Ｔ−リンパ球細胞（ＣＧＬＬ−１）ＩＸＩＯ’をＲＰＭＩ　１６４０＋１０ ％６４０＋１０％ランｎＡ刺戟牌臓細胞（ＩＬ２）の１０％培養上澄み中で４８ 時間増殖した。この時間後に培養物ごとに３Ｈ−チミジン０．５μＣｉを加え、 さらに６時間の培養後にＴ−細胞のＤＮＡへのチミジンの組込み量を測定する。

結果はＦｉｇ、３で対照測定値に対する百分率で示しである。このグラフかられ るように、ＥＴ−１８−ＯＨ及びＥＴ−１８−ＯＣＨ３は抜群の増殖阻止を示す 。

例４ ホスファチジルコリン中への放射性標識コリンの導入を検へ、このようにして細 胞の新たな合成能力を測定した。この場合にはＴ−リンパ球細胞ｌＸｌ０’個を 、コリンを含まないＤＮＥＭ（Ｄ　ｕ　］　ｂ　ｅ　ｃ　ｃ　ｏ’ｓＭｏｄｉｆ ｉｋａｔｆｏｎ　ｖａｎ　旦ａｇｌｅ’ｓＭｅｄ　ｉ　ｕｍ）＋１０％ウシ胎児 血清＋ＣｏｎＡ刺戟膵臓細胞（ＩＬ２）の１０％培養上澄み十ＩＣ−コリン０． ５１Ｃｉ中で所定の時間の間培養する。細胞燐脂質を抽出し、薄層クロマトグラ フィーで分離し、ホスファチジルコリンのバンドの放射能をＤＣ−スキャナで測 定する。

結果はＦｔｇ、４に図示しである。ここで断線は、未刺戟Ｔ−細胞におけるコリ ン組込み量を示し、実線は刺戟ＣＤ４”　Ｔ−細胞（ＡＲ１７）におけるコリン 組込み量を示す。個々の結果は対照値に対する百分率で示しである。さらに、意 外にもＥＴ−１８−ＯＣＨ９は活性化自己反応性ＡＲ１７Ｔ−細胞の合成のみを 阻止するが、自己免疫反応に関与しない未活性化Ｔ−リンパ球細胞は、その合成 能力に関して前記物質の作用を受けていないことがわかる。

例５ ホスファチジルコリンの脂肪酸構造は、脱アシル化酵素としてホスホリパーゼＡ 及び再アシル化酵素としてのアシルトランスフェラーゼの作用によって不断に更 新される。この物質代謝を検出するために、Ｔ−細胞を予め１４Ｃ−油酸と一緒 にインキュベートする。すると、ホスファチジルコリンがこの脂肪酸の組込みに よって放射性標識された。

さて、ＡＲ１７Ｔ−細胞におけるホスファチジルコリンの分解を、種々のアルキ ル溶解燐脂質を加えた後測定した。この場合ＤＭＥＭ＋　１％ウシ胎児血清＋ｌ ４Ｃ−油酸０．１μＣｉ中でＴ−リンパ球細胞１×１０６を４時間培養した。次 にこの標識細胞をＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清＋ＣｏｎＡ刺戟牌臓細胞（ＩＬ 肺臓の１０％培養上澄み中で種々のアルキル溶解燐脂質と一緒に２４時間及び４ ８時間さらに培養した。Ｔ−細胞の燐脂質を抽出し、薄層クロマトグラフィーで 分離し、ホスファチジルコリンのバンドの放射能をＤＣ−スキャナを用いて測定 する。

結果は対照値に対する百分率としてＦｉｇ、５に示しである。このグラフから、 ＥＴ−１８０ＣＨｓと一緒にインキュベートされた細胞が高い放射能損失（これ はホスファチジルコリンの損失を意味する）を有することがわかる。これに対し て未活性化Ｔ−細胞は、Ｆｉｇ、５からもわかるように、前記物質とのインュベ ーションに対する効果を示さない。

例６ プロテオグリカン誘導関節炎の形成に対するＥＴ−１８−ＯＣＨ，の作用 一次関節炎の誘導： Ｂａ１ｂ／ｃｖウス（Ｃｈａｒｌｅｓ　ＲｉｖｅｒＣｏｌｏｎｙ、Ｍｏｎｔｒｅ ａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ）の５〜６週令雌を免疫するために、コンドロイチナーゼＡ ＢＣで分解された、ヒト軟骨増殖体のプロチオグリカン［未成熟のヒト関節炎軟 骨（ＨＹＡＣ）からのプロチオグリカンに相当する］を、既述のように使用した （Ｇｌａｎｔ等：Ａｒｔｈｒｆｔｉｓ　ｒｈｅｕｍ、３０　（１９８７）、２０ １〜２１２；Ｍｉｋｅｃｚ等：Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ｒｈｅｕｍ、３０（１９８ ７）、３０６〜３１８）。燐酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ（ｐＨ７，２）１００μｍ 中のコンドロイチナーゼＡＢＣ分解ＨＹＡＣのプロチオグリカン−タンパク質１ ００μｇを、ＰＢＳを含む１：１乳濁液中のフロイント完全アジュバントと一緒 に腹腔内注射した。９日、３５日及び６５日目に、前記タンパク質を再び３回フ ロイント不完全アジュバント中の抗原と一緒に注射した。Ｂａ１ｂ／ｃ一対照マ ウス（雌）を、関節炎発生性（ウシの関節）プロチオグリカン（ＢＡＣ−ＴＧ） 又は燐酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）及びプロトチオグリカン抗原を含まないアジュ バントで免疫した。

この実験のグループを表Ｉに記載しである。グループ９では初めに１０頭の動物 をＥ　Ｔ　−１８−ＯＣＨｓで前処置し、次にヒト軟骨増殖体起源の関節炎発生 性プロチオグリカンを用いて処置した。同プロチオグリカンはグループ６（免疫 、未処理）、グループ７（免疫、未処理、但し毎日牛乳で飼養）及びグループ８ （免疫、牛乳中に溶解したＥＴ−１８−ＯＣＨ，を用いて処置）でも使用した。

動物には塩溶液及びフロインドアジュバントの乳液を注射するか又は動物をフロ インドアジュバント中のプロテオグリカン抗原で免疫した。

略語： ＨＹＡＧ−ＰＧ−＝ヒトの軟骨増殖体（骨増殖体の関節）のプロテオグリカン（ Ｐｒｏｔｏに１ｙｃａｎ）ＢＡＣ−ＰＧ＝ウシの関節軟骨のプロテオグリカン塩 溶液＝燐酸塩緩衝塩溶液、ｐＨ７，４（Ｎａｃｌ　Ｏ，１４ｍ。

１／１中のＰＯ４０，０１ｍｏｌ／１）溶剤＝牛乳（通常はＥＴ−１８−ＯＣＩ ’ｌｓを溶解させるために使用した） ２グループ（Ｎｏ４及びＮｏ５）からの動物を、ＢＡＧ−ＰＧで免疫し、ＥＴ− １８−ＯＣＨ，を用いて処置するか又は処置しなかった。他方他の３グループで は１５頭のマウスを負対照として用いた（表Ｉ参照）。各グループには、実験当 初５〜６週令のＢａ１ｂ／Ｃ−マウス５〜１０頭が存在した。これらのマウスを 、牛乳（脂肪の少ない牛乳）中に溶かしたＥＴ−１８０ＣＨｓで、１２週間（５ 〜６週間は２５ｍｇ／ｋｇ、６週間は２Ｑｍｇ／ｋｇ）食道用ゾンデ（薬剤の経 口投与）によって処置した。ＥＴ−１８−ＯＣＨ３の用量は、２５　ｍ　ｇ　／ 　ｋ、　ｇから２０ｍｇ／ｋｇｌ−減少させた、それというのも処置の第２週か ら処置Ｂａ１ｂ／ｃ−マウスの身体状態が悪化し、ＥＴ−１８−０ＣＨ３処置の ３〜４週でグループ９の４頭及びグループ８の２頭が死んだからである。実験の ５〜１７週でマウス（グループ９を除く、上記参照）をＥ　Ｔ　−１，８−ＯＣ Ｈ，で処置して殺した。

この報告で記載しである時間の数値（Ｆｉｇ、８〜１０、Ｆｉｇ、１２及び１３ 参照）は初めの注射日から始まっている。

血清試料、抗体テスト・ １日、９日、１９日、２７日、３５日、４４日、５５日、６５日、７７日、８５ 日、９７日及び１１２日に、眠窩後静脈叢から血清試料を採取した。これらの試 験を一２０℃で１２２日の最終出血死まで保管し、次に各動物の１３種の血清試 料中の抗体力価を測定し、比較した。

血清中の抗体を溶液中の放射免疫テストによって測定し、この際ヒトの新生児（ コンドロイチナーゼＡＢＣ処置（＝追跡））及びマウス（無傷（（＝米麦）及び コンドロイチナーゼＡＢＣ処置）の１２５■標識軟骨プロテオグリカンを使用し た。各血清を希釈度１：１００．１：５００及び１　：　２５００で、時には１ ：１２５００で、既述のように試験した（Ｍｉｋｅｃｚ等：５ｕｐｒａ、Ｇｉａ ｎｔ等＋Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ。

２３４．３１〜４１）。このために希薄血清１００μｌを、＋！５１標識プロテ オグリカン（５０μｌ中１００００　Ｉ　ａｓ）と−緒に室温で４時間インキュ ベートした。このインンキュベーンコン後にタンパク質を有する黄色ブドウ球ｍ 　（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕ、５）（５重量％／容積）２５μ ｌを加え、３７℃で３０分インキュベート、２回洗浄した。残留物の放射能をバ ックマンガンマ計数器で測定した。

リンパ球細胞の反応性のテスト。

コンカバリン（Ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ）Ａ　（Ｃｏ　ｎ　Ａ　Ｉｔ　７　’）ス ーＴ−細胞−マイトジェンとして）及び軟骨プロテオグリカン抗原（ＢＡＣ−Ｐ Ｇ及びＨＹＡＣ−ＰＧ）に対する牌細胞の応答を既述のように測定した（Ｍｉｋ ｅＣＺ等：５ｕｐｒａ）。リンパ球細胞の刺戟は、抗原又はマイトジェン（Ｍｉ ｔｏｇｅｎ）刺戟培養物の１、、：未刺戟培養物の■３、の比である指数として 表現した。

関節炎の評価。

すべてのマウス（関節炎及び非関節炎、免疫及び未免疫）の四肢の寸法を毎日検 べて、既述のように記録された（Ｇｌａｎｔ等：Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕ ｍ、３０　（１９８７）、２０１〜２１２）臨床的関節炎変化を立証した。関節 炎発生の初期臨床的徴候としての腫張及び発赤、膝、（子ぶし、手首の厚さく直 径）及び手の背掌側厚さを記録した。

臨床的及び組織学的試験： 赤色及び白色血球（Ｅｒｙｔｈｒｏｚｙｔｅｎ及びＬｅｕｋｏｚｙｔｅｎ）の数 及び白色血球の血液像を、実験前、実験１１週（６週の処置１＆）及び実験の最 後（１２２日）に検へた。

四肢、尾部、腰椎韓及び器官を固定し、骨を脱灰して、組織学的研究のための解 剖の準備をした。

これらのＢ　ａ　１　ｂ　／　ｃ−マウス（１グループに各５頭）を、プロテオ グリカン抗原が免疫しなかった、しかしグループ２及び３の動物に生理的塩溶液 及びフロインドアジュバントの乳濁液（表Ｉ）を注射した。これらの動物はプロ テオグリカン及びコラーゲン■型を含む、なんらかの軟骨成分に対する抗体を生 産せず、関節炎を発生しなかった。

グループ３の処置動物は体重を減少し、軽い貧血になった（表■）（おそらく頻 繁な血液採取のため）が、他の臨床的徴候又は実験室パラメーターは変化しなか った。Ｔ細胞マイトジェン（Ｃｏ　ｎ　Ａ　）によるリンパ球細胞の刺戟のみは 著しく減少された（　Ｆｉｇ、　７　）。

グループ４及び５（非関節炎性プロテオグリカンで免グループ４及び５の動物は 、ウシ関節軟骨（ＢＡＣ）起源のプロテオグリカンで免疫したが、グループ５の みはＥ　Ｔ　１．８　０　ＣＨｓで処置した（表Ｉ）。評価されているように、 グループ４及び５の動物は関節炎を発生しなかった。

グループ４の動物は、免疫性ウシ関節プロテオグリカンに対する“正常の”抗体 産生及びヒト（ＨＹＡＣ）及びマウスのプロテオグリカン上の交差反応性である が、非関節炎性エピトープに対する、連続的に増大する抗体力価を示す（Ｆｉｇ 、８）。マウスの軟骨プロテオグリカンに対する抗体は見出されたけれども、こ れらの交差反応性抗体は発症に関与していないと考えられる。刺戟指数として表 現されるリンパ球細胞の応答（Ｍｉｋｅｃｚ等、５ｕｐｒａ）は、ＢＡＣ及びＨ ＹＡＣ−プロテオグリカン（ＰＧ）の存在で著しく増大された（ＦＩｇ、７）。

グループ５の動物（表ｒ１）は、ウシ（結果は示してない）又はヒトのプロテオ グリカンに対する低い抗体水準を生じ、マウスの軟骨プロテオグリカンに対する 自己抗体は１　：　１．００の血清希釈度でさえも認められなかった（Ｆｉｇ、 ９）。循環抗体の水準はＥＴ−１８−ＯＣＨ、での２週間の処置後に減少され、 ２５ｍｇ　／　ｋ　ｇ　／日の用量でのこの効果は２　Ｑ　ｍ　ｇ　／　ｋ、　 ｇ　／日の用量の場合より特徴的であった。しかし抗体生産は全処置期間の間連 続的に増大した（Ｆｉｇ、９）。

プロテオグリカン抗原又はＣｏｎＡによるリンパ球細胞刺戟は、Ｅ　Ｔ　−１， ８−ＯＣＨ３の経口投与の終了後でさえも明らかに減少された（Ｆｉｇ、７）。

グループ６及び７　（ＨＹＡＣで免疫したが、ＥＴ−１８−ＯＣＨ、が処置しな かった動物）：この２グループの動物（表Ｉ）を免疫し、既述のように試験した （Ｇｉａｎｔ等、Ａ、ｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ、３０　（１９８７）、２０ １〜２１２：Ｍｉｋｅｃｚ等、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ、３０　（１， ９８７）、３０６〜３１８）。グループ６及び７の動物の間には相違は認められ なかったが、グループ７は全処置期間の間ＥＴ−１８−ＯＣＨ，を含まない牛乳 で毎日飼養した。これらの動物はｉ（Ｙ　Ａ　Ｃ−プロテオグリカンに対する抗 体及びマウス軟骨−プロテオグリカンに対する高水準の自己抗体を生産した。全 動物は、ＨＹＡＣ−プロテオグリカンの第３回の腹腔内注射後又は第４回の腹腔 的注射直後に関節炎を発生した（Ｆｉｇ、１０）。この関節炎は進行性であって １．既述のように周辺関節の変形及び強直を惹起した（Ｑ　Ｉ　ａ　ｎ　を等、 Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ｒｈｅｕｍ、３０　（１９８７）、２０１−２１２）。こ れらの関節炎動物の胛細抱の試験管内増殖はＦｉｇ、ｉｌにまとめである。この グラフはプロテオグリカン抗原及びＣ。

ｎＡの存在でリンパ球細胞の特徴的な刺戟を示している。

グループ８（ＨＹＡＣで免疫しかつＥ”ｒ−１，８−ＯＣＨ３で処置した動物） ニ グループ８の６頭の動物をＨＹＡＣのプロテオグリカンで（グループ６及び７の 動物と同様に）免疫したが、１２週間Ｅ　Ｔ　＝　１８−　ＯＣＨ３で処置した 。動物は不良な身体状態にあり、２頭が第３及び第５処置週に死んだので、ＥＴ −１８−ＯＣＨ，の２５　ｍ　ｇ　／　ｋｇ／日の用量を、第６週の処置から２ ０ｍｇ／ｋｇ／日の用量に減少させねばならなかりた（Ｆｉｇ、１２）。この用 量の減少は、前には不良な身体状態にあった動物が回復した点では有利であった 。このグループの３〜４頭は関節炎を発症したが、関節炎の発生は著しくおそく なり、すべての臨床的徴候（例えば発赤及び疎開直径として表現される腫張）は より緩和し、罹患関節の数はグループ６及び７の場合よりも少なくなった（表■ ）。

このグループ（Ｎｏ８）の動物及びすべての処置グループ（Ｎｏ３．５及び９） はＥＴ−１８−ＯＣＨ３で処置しなかった他のグループ（Ｎｏ２．４．６及び７ ）の動物よりも若干貧血していた（表■）。これは、骨随細胞に対するＥＴ−１ ８−ＯＣＨ，の直接的作用の結果又は、例えば表■で体重によって表わされてい る、一般に不良の身体状態の間接的作用であるかも知れない。しかしすべてのマ ウスでは軽い貧血は頻繁な血液採取の結果と認められた。他の実験室パラメータ ー、例えばタンパク尿（確認されない）、白色細胞の数及び割合は、処置動物と 未処置動物との間で顕著な相違を示さなかった。

ＨＹＡＣ及びマウス軟骨のプロテオグリカンに対する循環抗体の水準は、第２週 の処置から減少されたが、短期間後にはＥ　Ｔ　−１８−ＯＣＨｓの高い用量（ ２５ｍｇ／ｋｇ／日）で処置する間でさえ増大し始めた（Ｆｉｇ、１２）。他方 抗原刺戟された、非特異的な（ＣｏｎＡで誘導された）Ｔ−リンパ球細胞の増殖 は、すべての処置動物で同様に減少された（Ｆｉｇ、１このグループの動物（当 初１０頭）を、抗原の第１回の注射の２週間前にＥＴ−１８−ＯＣＨ３を経口投 与した。残念ながらこの前処置グループの４頭が実験の初めの６週間以内に死ん だ、これはＥＴ−１８−ＯＣＨ，の用量２５　ｍ　ｇ　／　ｋ、　ｇ　／日がお そら（Ｂａ１ｂ／ｃ−マウスにとって高すぎる用量であることを示す。しかし比 較理由からＥＴ−１８−ＯＣＨ３の用量を、グループ８の２頭の動物が死ぬまで 減少させなかった（上記参照）。

動物臨床的パラメーター及び身体状態は、これらの前処置動物が関節炎の臨床的 徴候を示さながうた点を別にして、グループ８の場合と同じであった。ウシ又は ヒト軟骨のプロテオグリカン又はコンカバリンＡによるリンパ球細胞の刺戟はグ ループ８の動物の場合と同様であった（すなわち特異的及び非特異的Ｔ−リンパ 球細胞の応答は著しく減少した）。さらに軟骨プロテオグリカンに対する抗体の 産生は著しく遅延され、抗体は通常は第４回の抗原注射後に初めて血清中に確認 された。

結論： Ｅ　Ｔ　−１８−ＯＣｉ（、によりＢａ１ｂ／ｃ−７ウスの処置は急性炎症を抑 制することができ、プロテオグリカン誘導関節炎の場合には慢性関節炎の進行を 阻止する。さらにＥＴ−１８−ＯＣＨ３による動物の前処置はＢ　ａ　Ｉ　ｂ　 ／　ｅ−マウスを炎症の発現から守ると思われる。これはおそらくＴ−細胞を媒 介する免疫応答の抑制のためであろう。ヒト及びマウス軟骨のプロテオグリカン に対する抗体力価として測定される自己抗体の産生は、処置の間に著しく抑制さ れた。この抑制効果は、ＥＴ　１８　０ＣＨｓの経口投与後の抗体産生の３−４ 週は一定であり、次に未知のメカニズムによって再び消失される。

５ｔｕｎｄｅｎ −−−−ｒｉｃｈｔｉｋｔｉｖｉｅｒｔｅ　Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｚｙｔｅｎａｋｔ ｉｖｉｅｒｔｅ　Ｔ−ＬｙｍｐｈｏｚｙｔｅｎＬｙｍｐｈｏｚｙｔｅｎ−５ｔｉ ｍｕｌａｔｉｏｎｓｔｅｓｔＷ　ＨＹＡ（−ＰＧ　ｍ　ＢＡＣ−ＰＧ　Ｅ２Ｚ３ 　Ｃｏｎ＾ｕｎｂｅｈａｎｄｅｌｔ　ｂｅｈａｎｄｅｌｔ　ｍｊ　ｕｎｂｅｈａ ｎｄｅけ　ｂｅｈａｎｄｅｌｔ　ｍ１ｔＥＴ−１８−ＯＣＨ３ＥＴ−１８−０［ Ｈ３Ｄｉｅ　Ｐｆｅｉｌｅ　ｚ！ｉｇｅｎ　ｄｉｅ　Ｔａｇｅ　ｄｅｒ　Ａｎｔ ｉｇｅｎ−１ｎｊｅｋｔｉｏｎｅｎＴａｇｅ　ｄ！ｒ　ｔｍ＋ｎｕｎｉｓｉｅｒ ｕｎｇＷｉｒｋｕｎｇ　ｗｏｎ　ＥＴ−１８−ＯＣＨ３ａｕｆ　ｄａｒ＋　Ｓｅ ｒｕｍ−Ａｎｔｉｋａｒｐｅｒｓｐｉｅｇｅｌ　ｖａｎ　［１ｒｕ垂垂■@５ τｉｇｅ　ｄｅｒ　ｍｕｒｉｓｉｅｒｕｎｇ　１ａｇｅ　ｄｅｒ　１ｍｍｕｒｉ ｓｉｗｕｎｇロー市＾（−ＰＧ　口ＢＡ（−ＰＧ　口輸＾国際調査報告 １、、ｌ□、、、　ＰＣＴ／ＥＰ　９０１００８７０−、−−＾−−−隊ＰＣＴ ／ＥＰ　９０１００８７０

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．一般式Ｉ ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）［式中、Ｒ１は炭素原子数１２〜１８ のアルキル基を表わし、Ｒ２は炭素原子数１〜８のアルキル基を表わし、かつＲ ３はＨ又は炭素原子数１〜３のアルキル基を表わす］ の化合物を使用することを特徴とする、多発性硬化症を除いた自己免疫疾患の治 療用医薬調剤の製法。
2. ２．一般式（Ｉ）において、Ｒ２が炭素原子数１〜３のアルキル基を表わし、か つＲ１及びＲ３が請求項１記載のものを表わす請求項１記載の方法。
3. ３．構造 ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）の一般式（Ｉ）の化合物を使用する 請求項１又は２記載の方法。
4. ４．構造 ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩＩ）の一般式（Ｉ）の化合物を使用す る請求項１又は２記載の方法。
5. ５．自己免疫疾患がリウマチ様関節炎又は強直性脊椎炎である請求項１から４ま でのいずれか１項記載の方法。
6. ６．作用物質として一般式Ｉの化合物を常用の薬理学的溶剤又は／及び助剤と共 に投与することを特徴とするリウマチ様関節炎又は強直性脊椎炎の治療法。
7. ７．作用物質として式（ＩＩＩ）の化合物を使用する請求項６記載の方法。