JPH04506818A - 造血細胞の成熟 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 造血細胞の成熟 本発明は、インターロイキン−１（ＩＬ−１）との関連において骨髄前駆細胞の 成熟、即ち分化および増殖の刺激のためのＩｇＥ−結合因子（ＩｇＥ−ｂｆ）の 用途に関する。本発明は更に、骨髄前駆細胞の成熟を刺激することによる病気の 治療または予防のだめの、単独でまたは比−１と組み合わせてｉｇＥ−ｂｆを含 んで成る医薬製剤に関する。

発明の背景 血液は、異なる系統、即ち骨髄系とリンパ系の細胞に分けることができる細胞の 不均質集団を含む。リンパ系集団はＢ−およびＴ−リンパ球並びにそれらの前駆 体から成り、一方骨髄系集団は単球、マクロファージ、赤血球、血小板および種 々の型の顆粒球並びにそれらの始原体を含んで成る。

血液細胞の全不均質集団は、骨髄中の多分化能性幹細胞の共通セラ１〜から発す る。血液細胞の生産、即ち造血は、強力に制御された複雑な過程である。血液細 胞の発生経路は分岐している。多分化能性幹細胞から出発して、段階的過程にお いて次第に分化した始原細胞および最後には完全に発達した血液細胞が生じる。

始原細胞の段階的分化は、種々の細胞型に特異的である表面マーカーの成るパタ ーンの発生によりモニタリングすることかできる。細胞の複製および分化は、造 血の調節因子として作用する特定のタンパク質因子の連続供給に依存する（概説 についてはＳ、　Ｃ，Ｃ１ａｒｋおよびＲ，Ｋａｍｅｎ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２３６：　１２２９−３７．１９８７を参照のこと）。

試験管内培養系で同定される全骨髄系統の始原細胞はいわゆるｒＦＩｌ−ｒ：ｐ −！Ｍ（コロニー形成単位顆粒球−赤血球一単球一巨核球）である。それは骨髄 前駆体ＢＦυ−Ｅ　（バースト形成単位赤血球）、ＣＦＵ−ＭＥＧ　（コロニー 形成単位巨核球）　、ＣＦＵ−Ｅｏ　（コロニー形成単位好酸球）およびＣＦＵ −ＧＭ　（コロニー形成単位顆粒球−単球）のもとである。ＣＦＵ−ＧＥＭＭの 分化は、ＩＬ−３（インターロイキン−３、マルチコロニー刺激因子またはマル チ−ＣＳＦとも呼ばれる）と（ＩＪＪ−Ｃ３Ｆ　（顆粒球−マクロファージコロ ニー刺激因子）により触発される。

骨髄前駆体ＢＦＵ−Ｅは更にＣＦＵ−Ｅ　（、コロニー形成単位赤血球）に分化 し、そして最後に赤血球に分化する。それらの分化段階に必要なタンパク質因子 は［Ｌ−３、ＧＭ−ＣＳＦおよびエリトロボイエチンである。

ＣＦＵ−ＭＥＧは、ＩＬ−３、ＧＭ−Ｃ３Ｆおよびエリトロボイエチンの存在下 で血小板産生巨核球を生じる。

ＣＦｔＪ−ＧＭはＩＬ−３、ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＭ−Ｃ３Ｆ　（マクロファージ コロニー刺激因子）の存在下では単球および／またはマクロファージに発達し、 一方ＩＬ−３、ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＧ−Ｃ３Ｆ　（顆粒球コロニー刺激因子）の 存在下では顆粒球を生成する。

Ｇ−、Ｍ−、ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＩｔ、−３Ｃマルチ−Ｃ３Ｆ）は初めにマウス 系において検出された。一方で対応するヒト因子も記載されている。マウスとヒ トの因子の性質は同様である（概説にっいてはＳ、　Ｃ，Ｃ１ａｒｋおよびＲ， Ｋａｍｅｎ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３６：　１２２９−３７゜１９８７を参照の こと）。

造血の適切な調節の不全により引き起こされる病気が知られており、重要である 。そのような病気の例は、赤血球生成不全、難治性貧血または造血不全といった 造血機能不全である。造血に関連する別の問題は、骨髄移植後の形成不全におけ る遅い回復である。主に血液中の顆粒球の発生は移植後数週間を要する。骨髄系 の細胞は腫瘍を引き起こすこともある。

それらの腫瘍は未分化骨髄細胞の白血病、例えば骨髄単球性白血病または骨髄性 急性白血病である。

発明の目的 本発明の目的は、造血機能不全を有する個体における造血の調節のための手段を 提供することである。他の目的は、未分化骨髄細胞を非悪性状態に分化せしめる ことによる未分化骨髄細胞の腫瘍の治療のための手段を提供することである。

驚くべきことに、可溶性ＣＤ２３　（ＳＣＤ２３）とも呼ばれる周知の２５ｋＤ 　ＩｇＢ−結合因子（２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆ）は、ＩＬ−１で前処理された骨 髄前駆細胞の成熟を誘導する。

発明の詳細な説明 本発明は、−緒に使用され混合物としてまたは連続使用のための別々な形で、配 列表に示される配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、）■のアミノ酸配列を有する２ ５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたは薬理学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体 、およびＩｔ、−１または薬理学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体の 有効量を含む医薬製剤に関する。前記医薬製剤は、以後本発明の医薬製剤とも呼 称される。

他に特記しない限り、２５ｋＤ　［ｇＥ−ｂｆなる用語は、配列表に示される配 列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、）　１のアミノ酸配列を有する２５ｋＤ　［ｇＥ −ｂｆを意味する。

２５ｋＤ　ｒｇＥ−ｂｆまたは薬理学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導 体は既知であり、既知の方法に従って調製することができる。２５ｋＤ　［ｇＥ −ｂｆ　、その変異体、断片および誘導体並びにそれらの生産方法は、例えばＥ Ｐ−Ａ−０２５４２４９およびＥＰ−Ａ−０２０５４０５に開示されている。Ｉ Ｌ−１およびその生産方法は、例えばＢＰ−Ａ−０１６２９０１およびＢＰ−Ａ −０１６５６５４に開示されている。

２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆの変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に比較して変更 されたアミノ酸配列を有するタンパク質である。

変異体は、天然に存在する変異体、例えばヒト対立遺伝子変異体または非ヒト哺 乳動物種例えばマウスもしくはサルから単離された変異体を包含する。変異体は 人工的に作られた変異体も包含する。

２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたはその変異体は、好ましくは組換えＤＮＡ技術を使 って生産され、例えば異種宿主細胞中での発現により生産される。ＮまたはＣ末 端に１または複数のアミノ酸をイ４加することもできる。特に発現産物が大腸菌 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）から得られる時、Ｎ末端にメチオニン、 Ｎ−ホルミルメチオニンまたはＮ−アセチルメチオニンが付加され得る。本発明 の人工的に作られたＩｇＥ−ｂｆ変異体または天然の変異体としては、本発明の ｒｇＥ−ｂｆのまたは天然変異体の人工的に作られた変異体としては、１または 複数、約１０までのアミノ酸を１または複数の別のアミノ酸で置換することによ り特徴付けられるタンパク質が挙げられる。

２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたはその変異体の断片は、本発明に相当する配列また はその変異体の配列中の少なくとも１０個であって且つ３７３個までの連続アミ ノ酸を有するアミノ酸鎖である。

異なる断片または同一断片をペプチド結合により共有結合せしめてもよい。

２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆの断片は、特に、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸 ２もしくは３で始まりそしてアミノ酸１７４で終わるか、またはアミノ酸１４で 始まりそしてアミノ酸１４０で終わるポリペプチドから成る群のものである。最 も好ましい断片は、それがアミノ酸３〜１７４から成ることを特徴とするもので ある。この断片は、ＲＰＭＩ８８６６細胞の上清において本発明の２５ｋＤ　［ ｇＥ−ｂｆに加えて見つけることかでき、よって天然の断片に相当する。それは ２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆと同じ活性を有する。

２５ｋＤ　ｒｇＥ−ｂｆの断片の意味の範囲内には、２５Ｋ　ＩｇＢ−ｂｆの変 異体の断片も含まれる。

２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたはその変異体の誘導体は、官能基、例えばアミン、 ヒドロキシル、メルカプトまたはカルボシキル基が誘導化、例えばそれぞれグリ コジル化、アシル化、アミド化またはエステル化されているものである。グリコ ジル化誘導体では、オリゴ糖が通常はアスパラギン、セリン、スレオニンおよび ／またはリジンに結合する。アシル化誘導体は、特に天然の有機または無機酸、 例えば酢酸、リン酸または硫酸によりアシル化される。通常はＮ末端アミン基ま たはヒドロキシ基、特にチロシンもしくはセリンのヒドロキシ基がアシル化され る。エステルは、天然のアルコール、例えばメタ７ノールまたはボタノールのエ ステルである。２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆ　マたはその変異体の別の誘導体は、メ チオニン、Ｎ−ホルミルメチオニンまたはＮ−アセチルメチオニンによってＮ末 端が延長されたものである。そのような誘導体は、組換え２５ｋＤＩｇＥ−ｂｆ またはその変異体が原核生物中で発現される場合に得ることができる。

その他の誘導体は、塩、特に医薬上許容される塩、例えば金属塩、例えばアルカ リ金属およびアルカリ土類金属塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム 、カルシウムもしくは亜鉛塩、またはアンモニアもしくは適当な有機アミン、例 えば低級アルキルアミン、例えばトリエチルアミン、ヒドロキシ−低級アルキル アミン、例えば２−ヒドロキシエチルアミン等とで形成されたアンモニウム塩で ある。

本発明の誘導体という用語には、２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆの変異体または断片の 誘導体も含まれる。

２５ｋＤ　［ｇＥ−ｂｆの薬理学的に活性な変異体、断片または誘導体は、ＩＬ −１または薬理学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体により前処理また は同時に処理された骨髄前駆体の成熟に対して、測定可能な刺激作用を有するも のである。

ｒＬ−１なる用語は、天然にＩＬ−１を生産する哺乳動物細胞の上清から、例え ば単球から、所望によりそのような細胞におけるＩＬ−１生産を刺激した後に、 精製された［Ｌ−１を包含する。【Ｌ−１は、種々の種、例えばヒト、サルまた はマウス、優先的にはヒトに由来することができる。ＩＣ−１は組換えＩＬ−１ 、例えば大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）または哺乳動物細胞中で生産された、組換 えｒＬ−１αまたは組換えｒＬ−１βも含む。

［Ｌ−１の変異体は、天然の変異体、例えばヒト対立遺伝子変異体または非ヒト 哺乳動物種、例えばマウスもしくはサルから単離された変異体を包含する。変異 体には人工的に作られた変異体も含まれる。

ｒｔ、−ｉの誘導体の意味は、上記に与えた２５ｋＤ　ｒｇＥ−ｂｆの変異体の 意味に準じる。ＩＬ−１の変異体または断片の誘導体も本発明の範囲内に含まれ る。

ｒＬ−１の薬理学的に活性な変異体、断片または誘導体は、試験管内では２５ｋ Ｄ　ＩｇＥ−ｂｆまたはそれの変異体、断片もしくは誘導体により前処理または 同時に処理された骨髄前駆体の成熟、即ち増殖および分化、に対する測定可能な 刺激作用により定義される。

本発明の医薬製剤は、骨髄前駆体の成熟に対する測定可能な刺激作用を有する。

それは、２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたは薬理学的に活性なその変異体、断片もし くは誘導体、好ましくは配列番号ｌの配列の２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたはアミ ノ酸３〜１７４に及ぶ断片、およびＩＬ−１または薬理学的に活性なその変異体 、断片もしくは誘導体の有効量を含有する。

本発明の医薬製剤の活性成分の有効量は、骨髄前駆体の成熟を刺激するのに適当 な量である。本発明の医薬製剤は、１Ｌ−１または当量の薬理学的に活性なその 変異体、断片もしくは誘導体、および２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたは当量の薬理 学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体、好ましくは配列番号１の配列を 有する２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたはアミノ酸３〜１７４に及ぶ断片を、それぞ れ約５０〜約１００単位対約０．２５〜約１２５　ｎｇ、好ましくは約２５〜約 １００　ｎｇの割合において含んで成る。それらの活性成分は混合されるかまた は別々の形であることができる。

本発明は、本発明の医薬製剤の適用を含んで成る骨髄前駆体の成熟の刺激方法に も関する。

骨髄前駆体は、適当な分化因子による刺激後に、別の骨髄前駆体にまたは骨髄系 の成熟細胞、例えば赤血球、巨核球、血小板、単球、マクロファージ、好酸性、 好中性および好塩基性顆粒球に成熟することができる造血細胞である。骨髄前駆 体はそれらがＣＤ２表面マーカーを欠くことにより特徴づけられ、そして更に骨 髄前駆体のサブセットはＣＤ３４細胞表面マーカーの発生により特徴づけられる 。細胞表面マーカー、例えばＣＤ２または３４の決定方法は当業界で周知であり 、例えば間接免疫蛍光法である。本発明に従って刺激することができる骨髄前駆 体は、例えば、哺乳動物、例えばマウス、サルまたは好ましくはヒトに由来する ことができる。

骨髄前駆体の例はＣＦＵ−ＧＥＭＭ　（コロニー形成単位顆粒球−赤血球一単球 一巨核球）である。それは、ＩＬ−１または薬理学的に活性なその変異体、断片 もしくは誘導体と２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたは薬理学的に活性なその変異体、 断片もしくは誘導体とでの刺激後に、別の骨髄前駆体を生じる。前記の別の骨髄 前駆体は、例えばＢＦＵ−Ｅ　（バースト形成単位赤血球＞　、ＣＦＵ−ＭＥＧ （コロニー形成単位巨核球）　、ＣＦＵ−Ｅｏ　（コロニー形成単位好酸球）お よびＣＦＵ−ＧＭ　（コロニー形成単位顆粒球−単球）である。

ＢＦＵ−Ｅは、エリトロポイエチン、ＩＬ−１または薬理学的に活性なその変異 体、断片もしくは誘導体および２５ｋＤ　ｒｇＥ−ｂｆまたは薬理学的に活性な その変異体、断片もしくは誘導体の存在下で、骨髄前駆体ＣＦＵ−Ｅ　（コロニ ー形成単位赤血球）におよび更に赤血球に分化する。

ＣＦＬＩ−ＧＭは、ＩＬ−１または薬理学的に活性なその変異体、断片もしくは 誘導体および２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたは薬理学的に活性なその変異体、断片 もしくは誘導体の存在下で、単球／マクロファージに分化する。

あるいはＣＦＵ−ＧＭは、ＩＬ−１または薬理学的に活性なその変異体、断片も しくは誘導体および２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたは薬理学的に活性なその変異体 、断片もしくは誘導体の存在下で、顆粒球にも分化する。

ＣＦＬＩ−ＭＥＧは、エリトロポイエヂン、ＩＬ−１＃よび２５ｋＤ　ＩｇＥ− ｂｆの存在下で血小板産生巨核球に成熟する。

ＣＦＬＩ−Ｅｏは、ＩＬ−１および２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆの存在下で顆粒球に 分化する。

いずれの場合でも、２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆとＩｆ−１とが同時に存在するかま たは細胞をＩＬ−１で前処理し次いで２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆで処理したならば 、分化が起こる。

骨髄前駆体の成熟の刺激は、試験管内で、例えば骨髄前駆体を含む細胞培養物へ の本発明の医薬製剤の適用により、行われる。

骨髄前駆体を含む細胞培養物は、前記細胞を含む組織、例えば骨髄、胚組織また は血液から得られる。前記組織は生検により得ることができ、そして前記細胞培 養物は該組織の破砕、例えば密度勾配中での遠心による骨髄前駆細胞の単離、お よび適当な培地中での骨髄細胞の培養により得ることができる。リンパ系細胞の 単離および培養方法は当業界において既知である。

骨髄前駆細胞は、常法に従って、例えば細胞をプラスチック表面上でまたは細胞 選別器上で選別する（ここで粘着細胞集団が付着する）ことにより、更に精製す ることができる。

次いで粘着細胞集団を、前胸腺細胞に対しては向けられないが粘着細胞中のその 他の細胞の細胞表面マーカーに対して向けられる特異的な細胞毒性抗体の組合せ と補体とで処理することができる。

医薬製剤は、約０．２５　ｎｇ／ｍｊ　〜約１２５　ｎｇ／ｒｎｌ、好ましくは 約２５　ｎｇ／ｙｄ〜約１００　ｎｇ／ｙｄの最終濃度の２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂ ｆまたは当量、即ち同じ活性を存する量の薬理学的に活性なその変異体、断片も しくは誘導体、および約５０〜約１０００／ｍｊ’の最終濃度の［Ｌ−１または 薬理学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体が達成されるような量におい て適用される。活性成分が別々の形で存在する場合、約５０〜約１００　Ｕ／ｄ のｒＬ−１または薬理学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体と共に細胞 をブレインキュベートし、常法、例えば遠心により洗浄し、次いで約０．２５　 ｎｇ／ｍｅ　〜約１２５　ｎｇ／ｍｊ、好ましくは約２５　ｎｇ／ｙｎＡ’　〜 約１００　ｎｇ／ｍｌの２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたは当量の薬理学的に活性な その変異体、断片もしくは誘導体、好ましくは配列番号ｌの配列を有する２５ｋ Ｄ　ＩｇＥ−ｂｆまたはアミノ酸３〜１７４に及ぶその断片で処理することがで きる。

しかしながら、生体、例えばマウス、サルまたは好ましくはヒトへの本発明の医 薬製剤の適用により生体内で骨髄前駆体の成熟の刺激を行うこともできる。

このためには、本発明の医薬製剤は、通常は一回量形、例えばアンプルまたはバ イアルにおいて、非経口、例えば筋向、皮下、静内、または骨髄前駆体の成熟が 起こる組織、例えば骨髄中に直接投与することができる。投与すべきポリペプチ ドの量は、それらの比活性、年齢、体重および患者の一般状態、病気の種類およ び重度並びに投与の形式に依存し、そして医者の判断に基づかなければならない 。一般に、体重１　ｋｇおよび１日あたり、約ｌＯμｇ〜約５０００μｇの２５ ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたは薬理学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体、 好ましくは配列番号１の配列を有する２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたはアミノ酸３ 〜１７４に及ぶ断片、および約２〜４Ｍ１ｏＬＩのＩＬ−１または薬理学的に活 性なその変異体、断片もしくは誘導体の各用量が投与される。

骨髄前駆体の成熟の刺激は、細胞培養物もしくは生体において成熟骨髄細胞プー ルの増大および／または骨髄前駆体プールの減少をもたらすことができる。従っ て、本発明は、成熟骨髄細胞プールの増大のだめの、例えば骨髄造血の機能不全 により引き起こされる病気の治療または予防のための、骨髄前駆体の成熟の刺激 用の本発明の医薬製剤の用途に関する。

骨髄造血の機能不全により引き起こされる病気の範囲内には、赤血球生成不全、 難治性貧血および造血不全が含まれる。本発明は、骨髄移植後の形成不全の回復 の促進のだめの骨髄前駆体の成熟の刺激用の本発明の医薬製剤の用途にも関する 。

本発明は更に、骨髄前駆体プールの減少のための、例えば未分化骨髄細胞の腫瘍 、例えば骨髄単球性白血病または骨髄性急性白血病、好ましくは腫瘍細胞がＣＤ ３４表面マーカーを含む未分化の骨髄細胞の白血病の治療または予防のための、 骨髄前駆体の成熟の刺激用の本発明の医薬製剤の用途にも関する。

本発明の医薬製剤では、活性成分は混合物の形または別々の形で存在する。活性 成分が別々の形で医薬製剤に含まれる場合、それらは別々の経路により投与して もよい。

本発明の医薬製剤は、特に骨髄細胞の発達の不全または骨髄前駆体の白血病の治 療もしくは予防に使用される場合、非経口、例えば静内、筋向、皮■または腹腔 内投与に適当であり且つ活性成分と存害に相互作用しない常用の医薬上許容され る担体を含んで成る。

固体粉末を含有するバイアル、または注入液、好ましくは水溶液もしくは懸濁液 を含有するバイアル、アンプル等が適当である。それらは、例えば活性成分を単 独でまたは担体、例えばマンニトール、ラクトース、グルコース、デキストロー ス、アルブミン等と一緒に含有する凍結乾燥製剤から使用前に調製することがで きる。医薬製剤は滅菌することができ、そして所望であれば、補助剤、例えば保 存剤、安定剤、乳化剤、可溶化剤、緩衝剤および／または浸透圧を調節するため の塩、例えば０．９％塩化ナトリウムと混合することができる。

滅菌は、小さいポアサイズのフィルターを通した滅菌濾過により達成することが でき、その後、所望であれば製剤を凍結乾燥することができる。無菌を維持する のを助けるために抗生物質を添加することもできる。

本発明の医薬製剤は、１回量あたり約１〜約２０００　ｍｇの医薬上許容される 担体と１回量あたり約０．００１〜約１．００　ｍｇ、好ましくは約０．１〜約 ５０　ｍｇの各活性成分とを含んで成る１同量形態、例えばアンプル中に分配さ れる。

本発明は、試験管内、例えば細胞培養物中、または生体内、例えばマウス、サル もしくは好ましくはヒトといった生物体中の骨髄前駆体の成熟の刺激用の医薬製 剤の製造のだめの、単独で或いはＩＬ−１または薬理学的に活性なその変異体、 断片もしくは誘導体との組み合わせにおける、２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたは薬 理学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体、好ましくは配列番号１の配列 を有する２５ｋＤ　ｆｇＥ−ｂｆまたはアミノ酸３〜１７４に及ぶ断片の用途に も関する。活性成分は常法により処理される。

本発明は更に、活性成分が常法により処理される本発明の医薬製剤の製造方法に も関する。面記方法は、２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたは薬理学的に活性なその変 異体、断片もしくは誘導体、好ましくは配列番号１の配列を有する２５ｋＤ　Ｉ ｇＥ−ｂｆまたはアミノ酸３〜１７４に及ぶ断片、および所望によりｒＬ−１ま たは薬理学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体を、医薬上許容される担 体と混合し、または活性成分か医薬製剤中別々の形で存在する場合にはそれらを 別々に医薬上許容される担体と混合することを特徴とする。

本発明の医薬製剤は、それ自体既知の方法に従って、例えば常用の混合、溶解、 凍結乾燥等の方法により製造され、そして約０．１％〜約１００％、特に約１％ 〜約５０％の活性物質を含有する。

本発明は、更に、所望により使用説明書と共に本発明の医薬製剤を含ん、で成る 包装品にも関する。

十分なＩＬ−１を有するかまたはＩＬ−１で前処理されている生物体または細胞 培養物では、骨髄前駆体の成熟を刺激するのに２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたは薬 理学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体、好ましくは配列番号１の配列 を有する２５ｋＤ　ｒｇＥ−ｂｆまたはアミノ酸３〜１７４に及ぶ断片のみを投 与する必要がある。同様に、十分な２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆを有する生物体また は細胞培養物では、骨髄前駆体の成熟を刺激するのにＩＬ−１または薬理学的に 活性なその変異体、断片もしくは誘導体のみを投与する必要がある。更に、骨髄 前駆体、特に腫瘍細胞が活性化前の状態であって２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆに応答 するｒｔ−ｉを必要としない場合にも、骨髄前駆体の成熟を刺激するのに２５ｋ Ｄ　ＩｇＥ−ｂｆまたは薬理学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体、好 ましくは配列番号ｌの配列を有する２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまた従って、本発明 の主題は、ＩＬ−１の投与が不要である細胞培養物または生物体、例えばマウス 、サルもしくは好ましくはヒト、例えば十分な量のＩし−１を有するかあるいは ＩＬ−１または薬理学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体で前処理され ている場合における骨髄前駆体の成熟の刺激方法であって、上記に示したものと 同じやり方および量において、２５ｋＤ［ｇＥ−ｂｆまたは薬理学的に活性なそ の変異体、断片もしくは誘導体、好ましくは配列番号１の配列を有する２５ｋＤ 　１．ｇＥ−ｂｆまたはアミノ酸３〜１７４に及ぶその断片を投与することを含 んで成る方法である。

本発明の他の主題は、十分な２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたは薬理学的に活性なそ の変異体、断片もしくは誘導体を有する細胞培養物または生物体、例えばマウス 、サルもしくは好ましくはヒトにおける骨髄前駆体の成熟の刺激方法であって、 上記に示したものと同じやり方および量において、ＩＬ−１または薬理学的に活 性なその変異体、断片もしくは誘導体を投与することを含んで成る方法である。

しかしながら、この場合、ＩＬ−１が投与される時と同時に２５ｋＤ　ＩｇＥ− ｂｆが存在しなければならない。ＩＬ−１の意味および好ましい形態は上記に記 載したものと同じである。

既に上述したように、骨髄前駆体の成熟の刺激は、細胞培養物または生物体中の 成熟骨髄細胞プールの増大および／または骨髄前駆体プールの減少をもたらすこ とができる。

従って、本発明は、ＩＬ−１の投与が不要である細胞培養物または生物体、例え ばマウス、サルもしくは好ましくはヒト、例えば十分な量のＩＬ−１を有するか あるいはＩＬ−１または薬理学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体で前 処理されているものにおける、例えば骨髄細胞プールの増大のための、例えば骨 髄細胞の発達の不全の治療もしくは予防のための、または骨髄前駆体プール、特 に白血病性骨髄前駆体プールの減少のための、例えば骨髄前駆体の白血病の治療 もしくは予防のための、骨髄前駆体の成熟の刺激方法であって、上記に示したも のと同じやり方および量において、２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたは薬理学的に活 性なその変異体、断片もしくは誘導体、好ましくは配列番号１の配列を有する２ ５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたはアミノ酸３〜１７４に及ぶその断片を投与すること を含んで成る方法にも関する。

同様に、本発明は、十分な２５ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆまたは薬理学的に活性なその 変異体、断片もしくは誘導体を有する細胞培養物または生物体、例えばマウス、 サルもしくは好ましくはヒトにおける、例えば骨髄細胞プールの増大のための、 例えば骨髄細胞の発達の不全の治療もしくは予防のための、または骨髄前駆体プ ール、特に白血病性骨髄前駆体プールの減少のための、例えば骨髄前駆体の白血 病の治療もしくは予防のための、骨髄前駆体の成熟の刺激方法であって、上記に 示したものと同じやり方および量において、ＩＬ−１または薬理学的に活性なそ の変異体、断片もしくは誘導体を投与することを含んで成る方法に関する。

本発明は、骨髄前駆体の成熟の刺激用の医薬製剤の製造のための、２５ｋＤ　ｒ ｇＥ−ｂｆまたは薬理学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体および／ま たはＩＬ−１または薬理学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体の用途に 関する。

下記の実施例は本発明を説明するためのものであるが、それらは本発明を限定す るものではない。

実施例 次の実施例において、配列番号１のアミノ酸配列を有する組換え２５ｋＤ　ｒｇ Ｅ−ｂｆをｒｓＣＤ２３と称する。

１、骨髄分画の単離 股間接部置換を受けた患者の転子骨髄断片からまたは同種異系移植提供者の骨髄 試料から骨髄細胞を得る。

常法に従ったＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ’勾配中での骨髄細胞の懸濁液の遠 心により、単核細胞を単離する。

プラスチック表面上への粘着により粘着細胞を除去する。

次いてＭｏ５ｓｏｌａｙｉ　ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３４：　２４００ 　（１９８５）に記載されたようにして臭化２−アミノエチルイソチオウロニウ ム臭化水素塩で処理したヒツジ赤血球を使って非粘着細胞からＣＤ２＋サブセツ トを除去する。得られた非粘着性ＣＤ２−集団を実施例２と３に使用する。

精製ＣＤ３４”細胞の調製のためには、非粘着性ＣＤ２−サブセットを間接免疫 蛍光法により抗−ＣＤ３４モノクローナル抗体（抗−ＩＰＣＩ、　Ｂｅｃｋｔｏ ｒ＋　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＦＩＴＣ接合ヤギ抗−マウス抗体で標識する 。次いでＢａｔら、Ｂｌｏｏｄ　７１：　１６０９　（１９８８）に従って、Ｆ ＡＣ３ｔａｒ　（Ｂｅｃｋｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使って蛍光陽性細胞 を選別する。

２、刺激された非粘着ＣＤ２＝細胞の増殖能半固体培地中ての５０細胞より多い コロニーの形成を測定することにより増殖能を測定する。

実施例１に従って非粘着ＣＤ２−骨髄細胞を調製する。ウェルあたり４Ｘｌｆｌ ’細胞を、３７°Ｃにて７％ＣＯ□／空気中で１％メチルセルロースを含むイス コツ改良ダルベツコ培地（Ｌｕｄｉｎら、ＥＭＢＯＪ、　６：　１０９．１９８ ７）　２００μ！中に接種する。

ウェル中の細胞培養物に下記のものを補足する：なし、 ｒｌＬ−１β　（１００ＩＪ／ｍｌ　；　Ｇｌａｘｏ、Ｇｅｎｅｖａ）、ｒｌＬ −１β　（１００Ｌｌ／ｍｊ）　＋ｒｌＬ−３（１０Ｕ／　ｒｄ　；　Ｂｏｅｈ ｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）、 ｒｌＬ−］β　（１００１Ｊ／ｍ１）−ｔ−＋ｔＬ−３（１０Ｕ／　ｍｌ）十抗 −ＩＬ＝３モシクローナル抗体（マウス抗−ヒトＩＬ−３モノクローナル抗体Ｂ Ｌ−３Ｍ、　１１５０最終希釈度；　Ｔｅｂｕ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ　） 、ｒｓＣＤ２３　（２５ｎｇ／　ｍｌ）、ｒｓＣＤ２３　（２５ｍｇ／　ｍｌ） 　＋　ｒｌＬ−１β（１００υ／ｍｌ’）、ｒｓｃＩ１２３　（２５ｍｇ／　７ ７１ρ）　＋　ｒＩＬ−１β　（１００（Ｊ／ｍｌ’）十抗−ＩＬ−３モノクロ ーナル抗体、または ｒｓＣＤ２３　（２５ｍｇ／　ｍ＃）　＋　ｒ［Ｌ−１β　（１００ｔＪ／ｍｌ ）＋抗−ＣＤ２３モノクローナル抗体（ＩＯＢ６　；　２５１ｔｇ／ｍｌ　；　 ！ｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、　Ｆｒａｎｃｅ）。

培養を開始し、そして誘導した後、１０日１にウェル中のコロニーを記録する。

コロニーは典型的な多系統形態を有する。

５０細胞より多いコロニーの数を表１に与える。

表１＝ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　Ｒマイクロピペットを使って幾つかのコロニーを収得し、 遠心し、そしてギムザ染色する。この細胞学分析は、ｒｓＣＤ２３＋ｒＩＬ−１ βでおよびｒｒＬ−３＋　ｒＩＬ−１βで誘導した培養物は共に同じ割合（２３ ％〜２９％、　Ｐ＜０．０１）の好塩基球含有コロニーを含むことを示す。

実施例Ｉに従って非粘着ＣＤ２−骨髄細胞を調製する。培地にｒｓＣＤ２３　（ ２５μｇ／ｙ＋＋Ａ’）またはｒＩＬ−］β（５０［Ｊ／ｙｄ）　（“前インキ ュベーション”）のいずれかを補足し、１％メチルセルロースを含む・イスコツ 改良ダルベツコ培地中で３７°Ｃにて７％ＣＯ□下で細胞を２４時間培養し、遠 心により洗浄し、次いで他方の因子（“後インキュベーション”）が補足されて いる同培地中で２４時間培養する。実施例２と同様にして増殖能を測定し、その 結果を表２に与える。

表２： 非粘着ＣＤ２−骨髄細胞によるコロニー形成に対するｒｓＣＤ２３およびｒｌＬ −１の連続適用の効果 使用する因子 前インキコベーノヨン　後インキ１ベーン３ン　コロニー／４　ＸＩＯ’　細胞 ｒＬ、Ｉ−１β　ｒｓＣＤ２３　２　６　±　３ｒｓＣＤ２３　ｒｓＣＤ２３　 ６　±　１ｒｓＣＤ２３　ｒＬｆ−１β　７土　２″２つの異なる実験からの平 均上標準偏差４、刺激されたＣＤ３４′細胞の増殖能実施例１に従って調製した ＣＤ３４″″細胞を使用する以外は実施例２と同様にして増殖能を測定する。結 果を表３１与える。

表３＝ 実施例１に従って調製しまたＣＤ３４“細胞のヂミジ：ノ取込みを液体培地中で 測定する。１０’細胞を１００ｆＪｆｆｉのイスコツ改良ダルベツコ培地中で３ ７°Ｃにて７％ＣＯ□／空気下で培養する。実施例４と同様にして細胞培養物に 因子を補足する。因子の添加の２４時間後、３Ｈ−チミジン（比活性ＸＣｉ、／ Ｂ：りそル：ＣＥＡ、Ｇｉｆ−ｓｕｒ−Ｙｖｅｔｔｅ、　Ｆｒａｎｃｅ）を１　 μＣｉ／１００　μｌ！　Ｃ＝３７ｋＢｑ　／１００μ！２）の最終希釈度にお いて添加する。２４時間のインキプベーション後に常法に従って放射能の取込み を測定する１、結果を表４に与える。

表４＝ 上記のデータは、ＩＬ−１の存在下または比−１で前処理した後の骨髄前駆体の 成熟、即ち増殖および分化を促進するｒｓＣＤ２３の能力を明白に証明する。そ のようなｒｓｃＤ２３の効果は、非粘着ＣＤ２−細胞と高度に富化されたＣＤ３ ４＋細胞の両方において観察される。この結果は、ｒｌＬ−１かｒＳＣＤ２３に 応答する骨髄前駆細胞の能力を誘導することも示している。ｒｓＣＤ２３が直接 的に且つＩＬ−３誘導を介さずに骨髄前駆細胞を触発させることは、抗−【Ｌ− ３抗体か該細胞の成熟を阻害することができなかったことにより立証される。

配列表 配列番号１ 配列の型：ポリペプチド されたＣＨＯ細胞の上滑 特徴：　ｒｓＣＤ２３とも称する組換え２５　ｋＤ　ＩｇＥ−ｂｆＬｅｕ　Ａｒ ｇ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈ ｅ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａ、ｓｎ　ＴｈｒＣｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｒ ｐ工ｌｅ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ 　ＰｈｅＧｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　 Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ３５４０　・　４５ Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ、　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ 　Ｈｌｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　にｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇ１ｎＡｓｐ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　 Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　 Ｔｒｐ工ｌｅ　Ｇ３．ｙＬｅｕ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌ ｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ工ｌｅ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　ＧｌｙＳｅｒ 　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｐｒｏ 　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　５ｅｒ５Ａｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　 Ｇｌｙ　Ａｒｇｌｌｏ　１１５　１２０ Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　 Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　（二ｙｓＡｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　 Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａ、１ａ１４０　１４５、　１．５０ Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　入ｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　 Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ要　約　書 造血細胞の成熟 本発明は、インターロイキン−１（ＩＬ−１）との関連において骨髄前駆細胞の 成熟、即ち分化および増殖の刺激のためのＩｇＥ−結合因子（ＩｇＥ−ｂｆ）の 用途に関する。本発明は更に、骨髄前駆細胞の成熟を刺激することによる病気の 治療または予防のための、単独でまたはＩＬ−１と組み合わせてＩｇＥ−ｂｆを 含んで成る医薬製剤に関する。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (49)

【特許請求の範囲】
1. １．一緒に使用される混合物としてまたは連続使用のための別々の形で、配列表 に示される配列番号１のアミノ酸配列を有する２５ｋＤＩｇＥ−ｂｆまたは薬理 学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体、およびＩＬ−１または薬理学的 に活性なその変異体、断片もしくは誘導体の有効量を含んで成る医薬製剤。
2. ２．配列表に示される配列番号１のアミノ酸配列を有する２５ｋＤＩｇＥ−ｂｆ または前記アミノ酸配列のアミノ酸３〜１７４から成る断片の有効量を含んで成 る、請求項１に記載の医薬製剤。
3. ３．ＩＬ−１を含んで成る、請求項１に記載の医薬製剤。
4. ４．ＩＬ−１βを含んで成る、請求項１に記載の医薬製剤。
5. ５．ヒトＩＬ−１を含んで成る、請求項１に記載の医薬製剤。
6. ６．組換えＩＬ−１を含んで成る、請求項１に記載の医薬製剤。
7. ７．組換えヒトＩＬ−１βを含んで成る、請求項１に記載の医薬製剤。
8. ８．約０．２５〜約２５０ｍｇの配列番号１のアミノ酸配列を有する２５ｋＤＩ ｇＥ−ｂｆまたは当量の薬理学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体に対 して約５０単位の割合のＩＬ−１または当量の薬理学的に活性なその変異体、断 片もしくは誘導体を含んで成る、請求項１に記載の医薬製剤。
9. ９．約２５〜約１００ｍｇの配列番号１のアミノ酸配列を有する２５ｋＤＩｇＥ −ｂｆまたは当量の薬理学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体に対して 約５０単位の割合のＩＬ−１または当量の薬理学的に活性なその変異体、断片も しくは誘導体を含んで成る、請求項１に記載の医薬製剤。
10. １０．前記活性成分が混合物の形で存在する、請求項１に記載の医薬製剤。
11. １１．前記活性成分が別々の形で存在する、請求項１に記載の医薬製剤。
12. １２．１回量形である請求項１に記載の医薬製剤。
13. １３．非経口適用のための請求項１に記載の医薬製剤。
14. １４．静内適用のための請求項１３に記載の医薬製剤。
15. １５．骨髄前駆体の成熟の刺激のための請求項１に記載の医薬製剤の用途。
16. １６．試験管内での請求項１５に記載の用途。
17. １７．生体内での請求項１５に記載の用途。
18. １８．哺乳動物の骨髄前駆体の成熟の刺激のための請求項１５に記載の用途。
19. １９．ヒト骨髄前駆体の成熟の刺激のための請求項１８に記載の用途。
20. ２０．ＣＤ３４＋表現型を有する骨髄前駆体の成熟の刺激のための請求項１８に 記載の用途。
21. ２１．配列番号１のアミノ酸配列を有する２５ＫＩｇＥ−ｂｆまたは薬理学的に 活性なその変異体、断片もしくは誘導体を約０．２５ｎｇ／ｍｌ〜約１２５ｎｇ ／ｍｌの最終濃度で適用し、そしてＩＬ−１または薬理学的に活性なその変異体 、断片もしくは誘導体を約５０Ｕ／ｍｌの最終濃度で適用することを特徴とする 、請求項１５に記載の用途。
22. ２２．配列番号１のアミノ酸配列を有する２５ＫＩｇＥ−ｂｆまたは薬理学的に 活性なその変異体、断片もしくは誘導体を約２５ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍ ｌの最終濃度で適用し、そしてＩＬ−１または薬理学的に活性なその変異体、断 片もしくは誘導体を約５０Ｕ／ｍｌの最終濃度で適用することを特徴とする、請 求項２１に記載の用途。
23. ２３．成熟骨髄細胞プールの増大のための請求項１５に記載の用途。
24. ２４．骨髄造血の不全の治療または予防のための請求項２３に記載の用途。
25. ２５．赤血球生成不全の治療または予防のための請求項２３に記載の用途。
26. ２６．難治性貧血の治療または予防のための請求項２３に記載の用途。
27. ２７．造血不全の治療または予防のための請求項２３に記載の用途。
28. ２８．骨髄移植後の形成不全の回復の促進のための請求項２３に記載の用途。
29. ２９．骨髄前駆体プールの減少のための請求項１５に記載の用途。
30. ３０．未分化骨髄細胞の腫瘍の治療または予防のための請求項２９に記載の用途 。
31. ３１．骨髄単球性白血病または骨髄性急性白血病の治療または予防のための請求 項３０に記載の用途。
32. ３２．前記腫瘍細胞がＣＤ３４＋表現型を有する請求項３０に記載の用途。
33. ３３．成分が常法に従って処理される、請求項１に記載の医薬製剤の製造方法。
34. ３４．所望により使用説明書と一緒に請求項１に記載の医薬製剤を含んで成る包 装品。
35. ３５．十分なＩＬ−１を含む細胞培養物または生物体における骨髄前駆体の成熟 の刺激のための、配列番号１のアミノ酸配列を有する２５ＫＩｇＥ−ｂｆまたは 薬理学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体の用途。
36. ３６．成熟骨髄細胞プールの増大のための請求項３５に記載の用途。
37. ３７．骨髄前駆体プールの減少のための請求項３５に記載の用途。
38. ３８．十分な２５ＫＩｇＥ−ｂｆを含む細胞培養物または生物体における骨髄前 駆体の成熟の刺激のための、ＩＬ−１または薬理学的に活性なその変異体、断片 もしくは誘導体の用途。
39. ３９．成熟骨髄細胞プールの増大のための請求項３８に記載の用途。
40. ４０．骨髄前駆体プールの減少のための請求項３８に記載の用途。
41. ４１．骨髄前駆体の成熟の刺激用の医薬製剤の製造のための、配列番号１のアミ ノ酸配列を有する２５ＫＩｇＥ−ｂｆまたは薬理学的に活性なその変異体、断片 もしくは誘導体の用途。
42. ４２．骨髄前駆体の成熟の刺激用の医薬製剤の製造のための、ＩＬ−１または生 物学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体の用途。
43. ４３．前記医薬製剤が試験管内で使用される、請求項４１または４２に記載の用 途。
44. ４４．前記医薬製剤が生体内で使用される、請求項４１または４２に記載の用途 。
45. ４５．請求項１〜４に記載の医薬製剤の適用を含んで成る、骨髄前駆体の成熟の 刺激方法。
46. ４６．特に実施例と関連して本明細書中に記載されるような医薬製剤。
47. ４７．特に実施例と関連して本明細書中に記載されるような、骨髄前駆体の成熟 の刺激のための請求項１に記載の医薬製剤の用途。
48. ４８．特に実施例と関連して本明細書中に記載されるような、配列番号１のアミ ノ酸配列を有する２５ＫＩｇＥ−ｂｆまたは薬理学的に活性なその変異体、断片 もしくは誘導体の用途。
49. ４９．特に実施例と関連して本明細書中に記載されるようなＩＬ−１または薬理 学的に活性なその変異体、断片もしくは誘導体の用途。