JPH04505857A - Monoclonal antibody against C-reactive protein - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ反応性蛋白質に対するモノクローナル抗体発明の背景 Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）は、組織の壊死及び炎症の最初の２４−４８時間の間 に血中濃度を劇的に増加させる基本型の急性期蛋白質であり（ゲウルツ（Ｇｅｗ ｕｒｚ）、　）Ｉｏｓｐｉｔａｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　、　１７．６７（１９ｇ ２））　、ＣＲＰを測定する試験は炎症反応の経過をモニターするために臨床的 に利用される。ＣＲＰ及び／またはＣＲＰ複合体は補体系を活性化することがで きる（カブランとボラナキス（ＫａｐｌａｎとＶｏｌａｎａことができ、それら の活性化を促進し、試験管内でのある種の刺激に対するそれらの細胞のレスピラ トリーバースト反応を高める（モルテンセン等（Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ　ｅ染を防 ぎ、クリアランス反応に影響を及ぼし、ある種の抗原に対する抗体産生を修飾し 、及びある種の腫瘍の転移を抑制する能力を有する（モールド等（Ｍｏｌｄ　ｅ 割を提示している。[Detailed description of the invention] Background of the invention of monoclonal antibodies against C-reactive protein C-reactive protein (CRP) is involved in tissue necrosis and inflammation during the first 24-48 hours. It is the basic acute-phase protein that dramatically increases the blood concentration (Gewurtz). urz), )Iospital Practice, 17.67 (19g 2)) Tests that measure CRP are used clinically to monitor the course of the inflammatory response. used for. CRP and/or the CRP complex can activate the complement system. Kaplan and Volana (Kaplan and Volana) and the respira of those cells in response to certain stimuli in vitro. Enhances the tree burst reaction (Mortensen et al. prevents e-staining) , affect the clearance response, and modify antibody production against certain antigens. , and has the ability to suppress the metastasis of certain tumors (Mold et al. We are offering a discount.

生ＣＲＰ　（Ｎａｔｉｖｅ　ＣＲＰ）は５つの同じ、非共有結合的に会合したサ ブユニットからなる環状三量体であり、カルシウムの存在下でホスホリルコリン （ＰＣ）　５に対するその基本型の結合反応性を有する（ボラナキスとカブラン （Ｖｏｌａｎａｋｉｓとれている。このネオＣＲＰ抗原性は、尿素−キレート化 、酸処理、加熱、またはポリスチレンプレート上の直接固定によって修飾された 生ＣＲＰによって発現される。ネオＣＲＰ抗原性はまた、完全なＣＲＰのサブユ ニットで、及び組換えＤＮＡ技術による遺伝子で形質転換された宿主によって生 産されたＣＲＰ遺伝子のＣＲＰのこれらの２つの分子形態は、抗原性により、ま た電気泳動的に、及びリガンド結合反応性によって区別することができる（ポテ ムバ等（Ｐｏｔｅｍｐａ　ｅｔ　ａｌｌラム存在下において、遊離の、及びリガ ンドと結合したＣＲＰ　（すなわち、生ＣＲＰのエピトープと）の両方と好まし くは反応するが、固相表面上に直接固定されるか、または尿素、酸または熱で処 理されたＣＲＰとは、カルシウムの不在下ではまったく反応性を示さないか、あ るいは最小の反応性を示した。これに対して、ヤギのポリクローナル抗−ネオＣ ＲＰ抗体は、修飾または固定されたＣＲＰ（すなわち、ネオＣＲＰのエピトープ ）との反応性をカルシウムの不在下で好ましく示し、カルシウムの存在下ではリ ガンドと結合したＣＲＰとの反応性を僅かに示すか、または全く示さない。Native CRP is made up of five identical, non-covalently associated cells. It is a cyclic trimer consisting of phosphoryl choline units, and in the presence of calcium, phosphorylcholine (PC) with its prototypical binding reactivity towards 5 (Boranakis and Kabran (Volanakis et al.) This neo-CRP antigenicity is due to urea-chelation , modified by acid treatment, heating, or direct fixation on polystyrene plates Expressed by live CRP. Neo-CRP antigenicity is also a subunit of intact CRP. nits and by hosts transformed with genes by recombinant DNA technology. These two molecular forms of CRP produced by the CRP gene are different depending on their antigenicity. can be differentiated electrophoretically and by ligand binding reactivity (potato In the presence of Potempa et al., free and Riga CRP bound to CRP (i.e., with an epitope of live CRP) and preferably can be immobilized directly on a solid surface or treated with urea, acid or heat. Processed CRP is one that shows no reactivity in the absence of calcium or showed the least reactivity. In contrast, goat polyclonal anti-neoC The RP antibody is an epitope of modified or immobilized CRP (i.e. neo-CRP). ) shows favorable reactivity with calcium in the absence of calcium, and shows reactivity with calcium in the presence of calcium. Shows little or no reactivity with CRP bound to Gund.

ＣＲＰが発現するネオＣＲＰエピトープの形態は、血小板、多形核白血球及び単 球の機能的応答を活性化し、及び調節する能力を有する（ポテンバ等（Ｐｏｔｅ ｍｐａ　ｅｔ　ａｌ、）、　Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、　１２　、３９１（１ ９８８））　ｏ更に、ネオＣＲＰに対するポリクローナル抗血清は血清及び組織 中のネオＣＲＰ抗原決定基を探すために使用されている。ネオＣＲＰ抗原性はヒ トＮＫ　（ｎａｔｕｒａｌ　ｋｉｌｌｅｒ）細胞及びＢリンパ球の（１９８９） 　）。ポテムバ等（Ｐｏｔｅｍｐａ　ｅｔ　ａｌ、）のＭｏｌｅｃｊｍｍｕｎｏ ｌ、、　２４．５３１（１９８７）は、リウマチ様関節炎患者の血清または血漿 中のネオＣＲＰ反応性を記載している。The forms of neo-CRP epitopes expressed by CRP are platelets, polymorphonuclear leukocytes, and mononuclear leukocytes. It has the ability to activate and modulate the functional responses of the bulb (Potemba et al. mpa et al, ), Inflammation, 12, 391 (1 988)) o Furthermore, polyclonal antiserum against neo-CRP can be used in serum and tissue has been used to search for neo-CRP antigenic determinants in Neo-CRP antigenicity is human NK (natural killer) cells and B lymphocytes (1989) ). Molecjmmuno of Potempa et al. 1, 24.531 (1987), serum or plasma of patients with rheumatoid arthritis. The NeoCRP reactivity in

リース等（Ｒｅｅｓ　ｅｔ　ａｔ、　）のＣｌ１ｎ、１ｍｍｕｎｏｌ、１ｍｍｕ ｎｏｐａｔｈｏ１．　、４８．９５（１９８８）は、正常なウサギの肝臓にはな く急性期の凍結切片中にあり、及び正常なウサギの筋肉にはなく壊死性の筋肉中 にあるネオＣＲＰ反応性を示している。急性期肝臓中のネオＣＲＰ抗原決定基の 存在は、ヒトＣＲＰ（マントウラニス等（Ｍａｎｔｚｏｕｒａｎｉｓ　ｅｔ　ａ ｌ、）、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｒｅｓ、、　１８，２６０（１９８４））及びウ サギＣＲＰ（サモルス等（Ｓａｍｏｌｓ　ｅｔ　ａｔ、）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ 、、　２２７．７５９（１９８５））の両者の一次翻訳産物が、ネオＣＲＰエピ トープに特異的なポリクローナル抗体と沈＃ｒることか見出されたので、ＣＲＰ サブユニットのｄｅ　ｎｏｖｏ合成から生じると解釈される。壊死組織中のネオ ＣＲＰエピトープの発現は、このＣＲＰ分子の現場急性期修飾に帰するものであ った。これらの性質は、生ＣＲＰと同様にネオＣＲＰの有意な生物学的役割を提 ｔｉｄｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｆｌｕｉｄｓ、３４．　２ ８７（１９８６）；Ｂｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｌ１ｎ、　hｍｍｕｎｏｌ 、　Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ、　８．１３７（１９８７）；Ｓａｍｂｅｒｇ　ｅｔ 　ａｌ、Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　ｌｉｍｕｎｏｌｏｇｙ、　ｉｎ@ｐｒｅｓｓ ；Ｇｕｐｔａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｒｔｈｒｉｔ’ｓ　＆　Ｒｈｅｕｍａｔｉｓ ｍ、３１．　Ｒ３９ａ（１９８８）；Ｃｈｕ　ｅｔ　ａｌ、AＡｍｅｒ。Cl1n, 1mmunol, 1mmu of Rees et al. nopath1. , 48.95 (1988) is not found in normal rabbit liver. present in frozen sections during the acute phase, and in necrotic muscle but not in normal rabbit muscle. This shows the neo-CRP reactivity. Neo-CRP antigenic determinants in the acute liver The presence of human CRP (Mantzouranis et al. ), Pediatric Res, 18, 260 (1984)) and Sagi CRP (Samols et al.), Biochem, J , 227.759 (1985)), both primary translation products of It was found that CRP can be precipitated with a polyclonal antibody specific for CRP. It is interpreted to result from de novo synthesis of subunits. Neo in necrotic tissue Expression of CRP epitopes is attributable to in situ acute phase modification of this CRP molecule. It was. These properties suggest a significant biological role for neo-CRP, similar to live CRP. Tides of the Biological Fluids, 34. 2 87 (1986); Bray et al, Cl1n, hmmunol , Newsletter, 8.137 (1987); Samberg et al. al, Ce1lular limunology, in@press ;Gupta et al, Arthrit’s & Rheumatis m, 31. R39a (1988); Chu et al, AAmer.

Ａｓ５ｏｃ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５１．２９．３７１ａ（１９８ｇ）；Ｄｏｕ ｇｈｅｒｔｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｔｉｄｅｓ　ｏｆ　ｔ■■@Ｂｉ。As5oc, Cancer Re51.29.371a (198g); Dou gherty et al,, Protides of t■■@Bi.

ｌｏｇｉｃａｌ　Ｆｌｕｉｄｓ、　３４．２９１−９３（１９８６）　；及びＣ ｈｕｄｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ａｌｌｅｒｇｙ　ＣP１ｎ、１ 画ｕｎｏ１．．７７、２１６９（１９８６）を含む。logical Fluids, 34.291-93 (1986); and C hudwin et al, J, Allergy CP1n, 1 Picture uno1. ．． 77, 2169 (1986).

免疫原として生ＣＲＰを使用して調製した抗ＣＲＰモノクローナル抗体は公知で ある。Ｋ１１ｐａｔｒｉｃｋ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｍｏ１ｅｃ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、 、旦１１５９（１９８２）　；Ｔｓｅｎｇ　ａｔ　ａｌ、@、　Ｈｙ ｂｒｉｄｏｍａ、　７．　１８５（１９８８）；Ｋｅａｒｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、！１D　２７５− ８２（９１８２）　；　Ｈｉｒａｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｔｉｄｅｓ　ｏｆ　 ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｆｌｕｉｄｓ、　３４．２W３（１９８６）　 ； ＴｓｅｎｇとＭｏｒｔｅｎｓｅｎ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇ ｙ、　２５．６７９（１９８８）；Ｒｏｕｘ　ｅｔ　ａｌ、A　Ｊ。Anti-CRP monoclonal antibodies prepared using live CRP as an immunogen are known. be. K11patrick et at, Mo1ec Immunol, , Dan 1159 (1982); Tseng at al, @, Hy bridoma, 7. 185 (1988); Kearney et al. , Immunol, Communications,! 1D 275- 82 (9182); Hirai et al, Protides of the Biological Fluids, 34.2W3 (1986) ; Tseng and Mortensen, Mo1ecular 1mmunolog y, 25.679 (1988); Roux et al., A.J.

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３１．２４１１−１５＜１９８３）；Ｖｏｌａｎａｋｉｓ とＫｅａｒｎｅｙ、　Ｊ、ＥＸＰ、　Ｍｅｄ、、１５３．　P６０４ （１９８１）を参虱しかしながら、本出願人らは、本発明のモノクローナル抗体 の特性を有するモノクローナル抗体を記載している報告はないと熟知している。Immunol, 131.2411-15<1983); Volanakis and Kearney, J. EXP. Med, 153. P604 (1981) However, the present applicants have disclosed that the monoclonal antibodies of the present invention We are well aware that there are no reports describing monoclonal antibodies with these characteristics.

特に、本発明の先に、修飾されたＣＲＰと反応するモノクローナル抗体は知られ てぃな生ＣＲＰ、修飾ＣＲＰまたはその両者の分子形態のいずれかと反応するヒ ）ＣＲＰに対するモノクローナル抗体（“ｍＡｂｓ”）が調製されている。本明 細書中で使用される“修飾ＣＲＰ”とは、蛋白質のコンホメーションの変化をも たらす固相表面上の固定化、加熱、尿素キレート化、ドデシル硫酸ナトリウム処 理、酸処理、他の変性方法または他の方法によって修飾されたＣＲＰを意味する 。その言葉はまた、ネオＣＲＰ抗原性を発現する、いずれのＣＲＰの形態をも意 味する。In particular, prior to the present invention, monoclonal antibodies that react with modified CRP are not known. human reacting with either raw CRP, modified CRP, or both molecular forms. ) Monoclonal antibodies ("mAbs") against CRP have been prepared. Honmei “Modified CRP” as used in the specification refers to a protein that also changes the conformation of the protein. immobilization on the solid phase surface, heating, urea chelation, sodium dodecyl sulfate treatment. means CRP modified by chemical treatment, acid treatment, other modification methods or other methods. . The term also refers to any form of CRP that expresses neo-CRP antigenicity. Taste.

本発明のｍＡｂｓは、ＥＬＩＳＡ法、ドツトプロット法及びウェスタンプロット 法の組合せを使用した、多様なＣＲＰ標本とのそれらの結合の特徴によって４つ のグループに分けらた。使用されるＣＲＰ標本は、生ＣＲＰ；カルシウムの不在 下のポリウレタンプレート上への固定化、尿素キレート化、及びドデシル硫酸ナ トリウム処理によって修飾されたＣＲＰ、プロナーゼ分解ＣＲＰ断片：及びＣＲ Ｐペプチドを含む。そのｍＡｂｓはさらに、カルシウムの存在下でのＣＲＰとの 反応性、ホスホリルコリン（ＰＣ）によるそれらの阻害、血清アミロイドＰ成分 との反応性及びウサギＣＲＰとの反応性に基づいて特徴づけられた。The mAbs of the present invention can be used in ELISA, dot plot and Western plot methods. 4 by the characteristics of their combination with diverse CRP specimens using a combination of methods. divided into groups. CRP specimen used is raw CRP; absence of calcium Immobilization onto polyurethane plates, urea chelation, and sodium dodecyl sulfate CRP modified by thorium treatment, pronase-degraded CRP fragment: and CR Contains P peptide. The mAbs further demonstrate the ability to interact with CRP in the presence of calcium. reactivity, their inhibition by phosphorylcholine (PC), serum amyloid P component and rabbit CRP.

ｍＡｂの第１グループは次の特異性を有する。The first group of mAbs has the following specificities:

（ａ）生ヒトＣＲＰと反応する； （ｂ）修飾ヒトＣＲＰど反応しない； （Ｃ）完全ヒトＣＲＰサブユニットとは反応しない；（ｄ）プロナーゼ分解ヒト ＣＲＰのフラグメンｌ−Ａど反応しない；（ｅ）プロナーゼ分解ヒトＣＲＰのフ ラグメントＢと反応しない：（ｆ）ＣＲＰペプチド１．２．３または４（これら のペプチドは下車に記載される）とは反応しない：及び （ｇ）血清アミロイドＰ成分と反応しない。(a) Reacts with live human CRP; (b) Modified human CRP does not react; (C) does not react with fully human CRP subunits; (d) pronase-degraded human CRP fragment l-A does not react; (e) Pronase-degraded human CRP fragment Does not react with fragment B: (f) CRP peptide 1.2.3 or 4 (these The peptides listed below do not react with: and (g) Does not react with serum amyloid P component.

この第１グループのｍＡｂのさらなる反応性は、生ヒ１−ＣＲＰ上の少なくとも ４種のエピトープを規定する：　（１）カルシウム−依存性、ＰＣ−阻害性イデ ィオトーブ；（２）カルシウム−依存性、非ＰＣ−阻害性エビトープ；（３）カ ルシウム−感化性、ＥＤＴＡ−増強性エピトーブ；及び（４）ウサギＣＲＰと独 特の交叉反応性をまた示すカルシウム非依存性エピトープ。The additional reactivity of this first group of mAbs is at least Four epitopes are defined: (1) calcium-dependent, PC-inhibitory epitopes; biotobe; (2) calcium-dependent, non-PC-inhibiting evitope; (3) calcium Lucium-sensitive, EDTA-enhancing epitope; and (4) rabbit CRP and Calcium-independent epitopes also exhibit particular cross-reactivity.

ｍＡｂの第２グループは生ヒ）ＣＲＰ及び修飾ヒ）ＣＲＰと反応し、ゆえに５番 目の生ヒトＣＲＰエピトープを規定する。これらのｍＡｂｓは修飾ＣＲＰとより も生ＣＲＰと有意に大きな反応性を示す。この第２グループのｍＡｂは次の付加 的な特異性を有する： （ａ）完全ヒトＣＲＰサブユニットと反応する；（ｂ）プロナーゼ分解ヒトＣＲ ＰのフラグメントＡと反応しない；（Ｃ）プロナーゼ分解ヒトＣＲＰのフラグメ ントＢと反応しない；（ｄ）生ヒ）ＣＲＰ上のカルシウム非依存性エピトープを 認識する；（ａ）それらの生ヒトＣＲＰとの反応性がＰＣによって阻害されない ：（ｆ）ＣＲＰペプチド１．２．３または４と反応しない；（ｇ）修飾ウサギＣ ＲＰと反応する：及び（ｈ）血清アミロイドＰ成分と反応しない。The second group of mAbs reacts with raw (human) CRP and modified (human) CRP, and therefore no. Define live human CRP epitopes in the eye. These mAbs are modified CRP and more also shows significantly greater reactivity with raw CRP. This second group of mAbs is added to It has specificity: (a) Reacts with fully human CRP subunits; (b) Pronase-degraded human CR does not react with fragment A of P; (C) fragment of pronase-degraded human CRP; (d) living human) does not react with calcium-independent epitope on CRP. recognize; (a) their reactivity with live human CRP is not inhibited by PC; : (f) does not react with CRP peptide 1.2.3 or 4; (g) modified rabbit C Reacts with RP: and (h) does not react with serum amyloid P component.

ｍＡｂの第３グループは次の特異性を有する。The third group of mAbs has the following specificities:

（ａ＞ヒト生ＣＲＰと反応しない； （ｂ）修飾ヒトＣＲＰど反応する； （ｃ）完全ヒトＣＲＰサブユニットと反応する；（ｄ）プロナーゼ分解ヒトＣＲ ＰのフラグメントＡど反応する；（ｅ）プロナーゼ分解ヒｌ−ＣＲＰの７ラグメ ントＢと反応しない：（ｆ）ＣＲＰペプチド１．２．３または４と反応しない； （ｇ）カルシウムの存在または不在下で液相生ヒトＣＲＰと結合することができ ない： （ｈ、）血清アミロイドＰ成分と反応しない。(a>Does not react with human live CRP; (b) reacts with modified human CRP; (c) reacts with fully human CRP subunits; (d) pronase-degraded human CR Reacts with fragment A of P; (e) 7 lag fragments of pronase-cleaved H1-CRP does not react with peptide B: (f) does not react with CRP peptide 1.2.3 or 4; (g) capable of binding to liquid phase human CRP in the presence or absence of calcium; do not have: (h,) Does not react with serum amyloid P component.

第３グループのある種のｍＡｂは、さらなる特異性を有する：（ｉ）修飾ウサギ ＣＲＰと反応する； （ｊ）完全なウサギＣＲＰサブユニットと反応する；（ｋ）プロナーゼ分解ウサ ギＣＲＰのフラグメントＡと反応する；及び（１）プロナーゼ分解ウサギＣＲＰ のフラグメントＢと反応しない。Certain mAbs of the third group have additional specificities: (i) Modified rabbit Reacts with CRP; (j) reacts with intact rabbit CRP subunit; (k) pronase-degraded rabbit reacts with fragment A of CRP; and (1) pronase-degraded rabbit CRP. does not react with fragment B of

ｍＡｂの１４グループは次の特異性を有する。The 14 groups of mAbs have the following specificities:

（ａ）生ヒトＣＲＰと反応しない； （ｂ）修飾ヒトＣＲＰと反応する； （Ｃ）完全ヒトＣＲＰサブユニットと反応する；（ｄ）プロナーゼ分解ヒトＣＲ Ｐの７ラグメントＡと反応しない：（ｅ）プロナーゼ分解ヒトＣＲＰの７ラグメ ントＢと反応する；（ｆ）ＣＲ，Ｐペプチド１．２また３と反応しない；（ｇ） カルシウムの存在または不在下で液相生ヒ）ＣＲＰと結合することができない； （ｈ）血清アミロイドＰ成分と反応しない。(a) does not react with live human CRP; (b) reacts with modified human CRP; (C) Reacts with fully human CRP subunits; (d) Pronase-degraded human CR Does not react with 7-ragment A of P: (e) 7-ragment A of pronase-degraded human CRP (f) Does not react with CR, P peptide 1.2 or 3; (g) incapable of binding to CRP in the presence or absence of calcium; (h) Does not react with serum amyloid P component.

第４グループのｍＡｂのほとんどがまた、ＣＲＰペプチド４と反応する。このペ プチドは、ヒトＣＲＰのカルボキシル末端配列と一致するオクタペプチドである 。Most of the fourth group of mAbs also react with CRP peptide 4. This page peptide is an octapeptide that matches the carboxyl-terminal sequence of human CRP. .

最後に、この第４グループのある種のｍＡｂは、次の付加的な特異性を有する： （ｉ）修飾ウサギＣＲＰと反応する； （ｊ）完全ウサギＣＲＰサブユニットと反応する；（ｋ）プロナーゼ分解ウサギ ＣＲＰのフラグメン）Ａと反応しない；及び（＋）プロナーゼ分解ウサギＣＲＰ のフラグメン）Ｂと反応しない。Finally, certain mAbs of this fourth group have the following additional specificities: (i) reacts with modified rabbit CRP; (j) reacts with complete rabbit CRP subunit; (k) pronase-degraded rabbit CRP fragment) does not react with A; and (+) pronase-degraded rabbit CRP fragment) does not react with B.

本発明はまた、上記の特性を有するｍＡｂｓを生産することが可能なバイブリド −７を包含する。本発明はさらに、生ＣＲＰまたは修飾ＣＲＰを適当な特異性を 有する本発明のｍＡｂと接触させることを含む、生ＣＲＰまたは修飾ＣＲＰを検 出または定量するための免疫学的検定法を提供する。最終的に本発明は、適当な 特異性を有する本発明のｍＡｂの容器を含む、生ＣＲＰまたは修飾ＣＲＰを検出 または定量するためのキットを提供する。The present invention also provides hybrids capable of producing mAbs with the above-mentioned properties. -7 included. The present invention further provides that raw CRP or modified CRP is treated with appropriate specificity. Detecting live CRP or modified CRP by contacting it with a mAb of the invention having provides an immunoassay method for detecting or quantifying Finally, the present invention Detection of live CRP or modified CRP containing containers of mAbs of the invention with specificity Or provide a kit for quantitative determination.

ｎ＋Ａｂ　（その特性はさらに下車に記載される）の、カルシウムの存在下での 固定化ＰＣ−にＬＣによって捕捉されたＣＲＰとの結合（・）及びカルシウムの 不在下の直接固定化ＣＲＰとの結合（○）　（図Ｉ　Ａ−Ｉ　Ｄ）。図ＩＥとＩ Ｆは、優勢的に生−及びネオーＣＲＰエピトープと反応するポリクローナル−ヤ ギ抗血清抗体の反応性を、それぞれ示している。n+Ab (the properties of which are further described in the disembarkation) in the presence of calcium. Binding of CRP captured by LC to immobilized PC- and calcium Binding to directly immobilized CRP in the absence (○) (Figures I A-I D). Figures IE and I F is a polyclonal protein that reacts predominantly with neo- and neo-CRP epitopes. The reactivity of each antiserum antibody is shown.

図２：　ｍＡｂを使用した５ＯＳ−ＰＡＧＥでのＣＲＰのウェスタンプロット法 である。最初の３つのレーン（レーン１、標準；レーン２、ＣＲＰ、レーン３、 プロナーゼ処理ＣＲＰ）の蛋白質プロットは、ブロッキングすることなく直接ア ミドブラックで染色され、他のレーンでは、ブロッキング後にＩＩＩＡｂをプロ ットとインキュベートさせた。レーン４をｍＡｂ　１０６と；レーン５をｍＡｂ 　２Ｃ１０と；レーン６をｍＡｂ　６８７と；レーン７をｍＡｂ　３Ｈ１２と； レーン８をｍＡｂ　６Ａ５と；レーン９をマウス１ｇコントロールと：レーン１ ０をポリクローナルヤギ抗生ＣＲＰ　ＩＡＩ抗体と：レーン１１をポリクローナ ルヤギ抗ネオＣＲＰＬＰ８抗体と：及びレーン１２をヤギ１ｇコントロールとイ ンキュベートさせた。Figure 2: Western blotting of CRP on 5OS-PAGE using mAb It is. The first three lanes (lane 1, standard; lane 2, CRP; lane 3; Protein plots of pronase-treated CRP can be directly applied without blocking. stained with Midoblack, and in other lanes, treated with IIIAb after blocking. The cells were incubated with Lane 4 with mAb 106; Lane 5 with mAb with 2C10; lane 6 with mAb 687; lane 7 with mAb 3H12; Lane 8 with mAb 6A5; Lane 9 with mouse 1g control: Lane 1 0 with polyclonal goat antibiotic CRP IAI antibody: lane 11 with polyclonal goat antibiotic CRP IAI antibody lane 12 with goat anti-neo CRPLP8 antibody: and lane 12 with goat 1g control. Incubated.

図３：ＥＬＩＳＡ法を使用した、ｍＡｂ　３ｆｌ１２の固定化ＣＲＰへの結合の 合成ペプチドによる阻害。ペプチドｌ　（・）はＣＲＰ残基２３−３０と同一で ；ペプチド２（Ｏ）はＣＲＰ残基１０９−１２３と同一で：ペプチド３（ロ）は ＣＲＰ残基１３７−１５２と同一で；及びペプチド４（△）はＣＲＰ残基１９９ １０６と害。そのｍＡｂは最大変色の２５−５０％を得るような濃度で使用され た。ビオチン化ＣＲＰはｌＸｌ０−９Ｍの濃度で添加された。増加するＰＣの濃 度の、ｍＡｂ　４Ｈ２（・）　、ＪＥＶ−ＨＡ４−ＨＡ）　、１５−２Ｃ１０（ ロ）及びＪＥＶ−ＨＯ２−４（△）　ヘ０：）効果カ示すｎｍＡｂｓ　（ｍＡｂ ）を調製する技術は公知であり、生ＣＲＰ及び修飾ＣＲＰに対するｍＡｂはそれ らの公知の技術のいずれか使用して調製されてもよい。簡単に言うと、生ＣＲＰ 及び修飾ＣＲＰで免疫された動物からの免疫グロブリン分泌細胞をミエローマ細 胞のような増殖細胞系の細胞と融合させる。得られたハイブリッド細胞（“ハイ ブリドーマ”）が、目的とする特異性を有する抗体の産生のためにクローン化さ ｔＬ、スクリーニングされる。Figure 3: Binding of mAb 3fl12 to immobilized CRP using ELISA method. Inhibition by synthetic peptides. Peptide l (・) is identical to CRP residues 23-30 ; Peptide 2 (O) is identical to CRP residues 109-123; Peptide 3 (B) is Identical to CRP residues 137-152; and peptide 4 (Δ) is CRP residue 199 106 and harm. The mAb is used at a concentration to obtain 25-50% of the maximum color change. Ta. Biotinylated CRP was added at a concentration of 1X10-9M. Increased PC density degree, mAb 4H2 (・), JEV-HA4-HA), 15-2C10 ( b) and JEV-HO2-4 (△) f0:) nmAbs (mAb ) is known, and mAbs against raw CRP and modified CRP are may be prepared using any of the known techniques of et al. Simply put, raw CRP and myeloma cells from animals immunized with modified CRP. Fuse with cells of a proliferating cell line such as vesicles. The resulting hybrid cells (“high A hybridoma”) is cloned for the production of antibodies with the desired specificity. tL, screened.

本発明のｍＡｂｓは、免疫学的検定法において使用されて生ＣＲＰ及び修飾ＣＲ Ｐを検出または定量してもよい。生ＣＲＰの固相免疫学的検定法が実施されると きは、プラスチック固相表面上の生ＣＲＰの固定化がＣＲＰ修飾を起こすので、 ある種の付加的考慮が必要であるが、それ以外ではいずれかの公知の免疫学的検 定法の技術が使用されてもよい。この問題を克服するために、生ＣＲＰ固相検定 方法が望まれるときには、下記の実施例２に記載されるようなりがンド捕捉検定 方法が使用されるべきである。The mAbs of the invention can be used in immunoassays to detect live CRP and modified CR. P may be detected or quantified. When a solid-phase immunoassay for live CRP is performed In this case, immobilization of live CRP on the plastic solid phase surface causes CRP modification. Certain additional considerations are necessary, but otherwise any known immunoassay may be used. Standard techniques may be used. To overcome this problem, live CRP solid-phase assay When a method is desired, a spontaneous capture assay as described in Example 2 below. method should be used.

生ＣＲＰまたは修飾ＣＲＰを検出または定量するためキットはまた、本発明の一 部分である。適当なキットは適当な特異性を有する本発明のｍＡｂを保持する容 器を含む。そのｍＡｂは標識されていてもよい。Kits for detecting or quantifying live CRP or modified CRP are also part of the invention. It is a part. Suitable kits contain containers holding mAbs of the invention with appropriate specificity. Including utensils. The mAb may be labeled.

免疫複合物を検出または定量し、及び液体から凝集した免疫グロブリンまたは免 疫複合物を除去するために、修飾ＣＲＰ及び修飾ＣＲＰに対する抗体を使用する 方法は、米国特許出願５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、０７／１７６．９２３及びＰＣＴ出 願ＩＩｓ／８９１０１２４７に記載されていて、それらの開示は本明細書中に参 照として織り込まれている。特に、これらの出願は、例えば、血清、血漿または 診断または治療用の試薬液のような液体から、凝集した免疫グロブリンまたは免 疫複合物を除去する方法を記載している。その方法は、該液体を修飾ＣＲＰと接 触させて、凝集した免疫グロブリンまたは免疫複合物がその修飾ＣＲＰと結合し ；及び修飾ＣＲＰと結合した凝集した免疫グロブリンまたは免疫複合物から液体 を分離することを含む。Detect or quantify immune complexes and detect aggregated immunoglobulins or immunoglobulins from fluids. Using modified CRP and antibodies against modified CRP to remove the epidemic complex The method is described in U.S. Patent Application No. 5erial No. 07/176.923 and PCT Publication No. Application IIs/89101247, the disclosure of which is incorporated herein by reference. It is incorporated as a light. In particular, these applications apply, for example, to serum, plasma or Aggregated immunoglobulin or immunoglobulin from liquids such as diagnostic or therapeutic reagent solutions It describes how to remove the epidemic compound. The method involves contacting the liquid with modified CRP. upon contact, the aggregated immunoglobulin or immune complex binds to the modified CRP. ; and liquid from aggregated immunoglobulins or immune complexes bound to modified CRP. including separating.

これらの出願はさらに、凝集した免疫グロブリンまたは免疫複合物を除去する方 法であって、それらを修飾ＣＲＰに対する抗体と接触させることを含む方法を記 載している。免疫複合物または凝集した免疫グロブリンは元からある種の修飾Ｃ ＲＰを含んでいてもよく、または修飾ＣＲＰに対する抗体と接触される前か、ま たは同時に修飾ＣＲＰと反応されられてもよく、そのようにして抗体によって液 体から除去されてもよい。These applications further describe methods for removing aggregated immunoglobulins or immune complexes. method, comprising contacting them with an antibody against modified CRP. It is listed. Immune complexes or aggregated immunoglobulins originally contain certain modifications. RP or modified CRP before being contacted with an antibody to the modified CRP. Alternatively, it may be reacted with modified CRP at the same time, so that the antibody can May be removed from the body.

また、免疫複合物を検出または定量する方法が記載されていて、それは、免疫複 合物を修飾ＣＲＰと接触させて、その免疫複合物が修飾ＣＲＰと結合し；及び修 飾ＣＲＰと結合した免疫複合物を、修飾ＣＲＰまたは免疫複合体と結合する標識 された成分を添加することによって検出または定量することを含む方法である。Also described are methods for detecting or quantifying immune complexes, which contacting the immune complex with the modified CRP, the immune complex binds to the modified CRP; and A label that binds the immune complex bound to the decorated CRP to the modified CRP or the immune complex. This method involves detecting or quantifying by adding a component that has been detected.

標識された成分は修飾ＣＲＰに対する抗体であってもよい。The labeled component may be an antibody against modified CRP.

これらの出願はさらに、免疫複合物を検出または定量する方法であって、それら を修飾ＣＲＰに対する抗体と接触させることを含む方法を記載している。上述の 除去方法のように、免疫複合物または凝集した免疫グロブリンが元から修飾ＣＲ Ｐを含んでいてもよく、または修飾ＣＲＰに対する抗体と接触される前か、また は同時に修飾ＣＲＰと反応されられてもよい。These applications further provide methods for detecting or quantifying immune complexes, comprising: A method is described that includes contacting a modified CRP with an antibody against modified CRP. mentioned above As in the removal method, immune complexes or aggregated immunoglobulins are originally modified CR. P or before being contacted with antibodies against modified CRP; may be simultaneously reacted with modified CRP.

その２つの出願はまた、液体から凝集した免疫グロブリンまたは免疫複合物を除 去する装置を記載している。適当な装置は、固相表面に結合した修飾ＣＲＰ及び その固相表面を覆う手段を含んでいてもよく、あるいは固相表面に結合した修飾 ＣＲＰに対する抗体及びその固相表面を覆う手段を含んでいてもよい。The two applications also remove aggregated immunoglobulins or immune complexes from fluids. The equipment to be removed is described. A suitable device includes modified CRP bound to a solid surface and may include a means of covering the solid surface or a modification attached to the solid surface; It may also include an antibody against CRP and a means for coating the solid surface.

修飾ＣＲＰまたは修飾ＣＲＰに対する抗体が固定化される固相表面及び装置の覆 う手段は、いかなる生物学的適合性材料であってもよい。例えば、その固相表面 は修飾ＣＲＰもしくは修飾ＣＲＰに対する抗体で塗被された膜の表面、アガロー ス基体ビーズまたは中空繊維であってもよい。その装置は、ビーズで充填された カラム、腎臓透析で使用されるようなシリンダーの中に入れられた中空繊維の膜 、ウェルを含んだミクロタイタープレートなどの修飾ＣＲＰまたは修飾ＣＲＰに 対する抗体で塗被された適当な表面のどれかであってもよい。その装置はまた、 それを患者に連結するための管材料、及びその装置を通しての液体の通過を助け 、空気がシステムに入ることを防ぐポンプを含んでもよい。その装置は治療用途 のために滅菌されてもよく、かつ滅菌はエチレンオキシドでパージするか、また は装置を放射線照射するような慣用の方法でなされてもよい。solid phase surface and device covering on which modified CRP or antibodies against modified CRP are immobilized; The means for carrying can be any biocompatible material. For example, the solid surface is the surface of a membrane coated with modified CRP or an antibody against modified CRP; They may be base beads or hollow fibers. The device was filled with beads column, a hollow fiber membrane encased in a cylinder such as used in kidney dialysis , modified CRP or modified CRP, such as a microtiter plate containing wells. It may be any suitable surface coated with an antibody against it. The device also tubing to connect it to the patient and to help pass fluids through the device , may include a pump to prevent air from entering the system. The device is for therapeutic use may be sterilized, and sterilization may be by purging with ethylene oxide or may be done in a conventional manner, such as by irradiating the device.

最終的に、これらの２つの出願は免疫複合物を検出または定量するためのキット を記載している。適当なキットは修飾ＣＲＰに対する抗体を保持する容器を含ん でいる。別の適当なキットは修飾ＣＲＰを保持する容器、及び必要により、免疫 複合物または修飾ＣＲＰに結合してその免疫複合物が検出または定量されるよう にする標識成分の容器を含む。標識成分は修飾ＣＲＰに対する抗体であってもよ い。Ultimately, these two applications provide kits for detecting or quantifying immune complexes. is listed. A suitable kit includes a container holding an antibody against modified CRP. I'm here. Another suitable kit includes a container holding the modified CRP and, optionally, immunization. complex or modified CRP so that the immune complex can be detected or quantified. Contains containers for labeled components. The label component may be an antibody against modified CRP. stomach.

これらの２つの出願に記載されている方法、キット及び装置に使用される修飾Ｃ ＲＰは、本明細書中に記載される修飾ＣＲＰと同じである。従って、修飾ＣＲＰ 上のエピトープへ向けられた本発明のモノクローナル抗体は、修飾ＣＲＰに対す る抗体が使用されるべきであることを提示している米国特許出願５ｅｒｉａｌ　 Ｎｏ、０７／１７６、９２３及びＰＣＴ出ＩＩＩＵｓ／８９１０１２４７中に記 載されている方法、キット及び装置に使用されてもよい。Modification C used in the methods, kits and devices described in these two applications RP is the same as the modified CRP described herein. Therefore, modified CRP The monoclonal antibodies of the invention directed against the above epitope are directed against modified CRP. US Patent Application 5erial which suggests that antibodies should be used No. 07/176, 923 and PCT No. IIIUs/89101247. It may be used in the methods, kits, and devices described.

本発明の抗体がまた使用されて、修飾ＣＲＰを利用するこれらの２つの出願中に 記載されているアッセイ法に使用するための修飾ＣＲＰを精製してもよい。特に 、本発明のｍＡｂｓは、上述したようにネオＣＲＰを発現するＣＲ，Ｐを産生ず るように遺伝子操作された微生物の細胞培養物上清から修飾ＣＲＰを精製するこ とにおいて有用である。もちろん、生ＣＲＰに特異性を有する本発明のｍＡｂｓ が使用されて、生ＣＲＰを精製してもよい。Antibodies of the invention were also used in these two applications utilizing modified CRP. Modified CRP may be purified for use in the assays described. especially , the mAbs of the present invention do not produce CR,P, which expresses neo-CRP, as described above. Purification of modified CRP from cell culture supernatants of microorganisms that have been genetically engineered to It is useful in Of course, mAbs of the invention with specificity for live CRP may be used to purify raw CRP.

抗体で抗原を精製する方法は公知である。例えば、修飾ＣＲＰまたは生ＣＲＰは 、その修飾または生ＣＲＰを適当な特異性を有する本発明の抗体と接触させるこ とによって精製されることが可能である。その抗体は、アガロースビーズのよう な固相表面上に固定化され、カラムとして使用されることができる。抗体に結合 した修飾または生ＣＲＰは、既知の手段によって溶離されつる。Methods for purifying antigens with antibodies are known. For example, modified CRP or raw CRP , its modified or raw CRP is contacted with an antibody of the invention having appropriate specificity. It can be purified by The antibody is like agarose beads. It can be immobilized on a solid phase surface and used as a column. binds to antibody The modified or raw CRP is eluted by known means.

修飾ＣＲＰ、生ＣＲＰまたは免疫複合物を検出または定量するための免疫学的検 定法は、先に述べたように、生ＣＲＰ用の固相アッセイはリガンド捕捉技術によ って実施されなければならないことは例外として、当分野では公知である。他に 使用されてもよいこのような適当な慣用の免疫学的検定法は、コンペテイテイブ アッセイ及びイムノメトリックアッセイを含む。後者の型の例としては、ラジオ イムノメトリックアッセイ　（ＩＲＭＡ）及び酵素結合免疫測定法（ＥＲＩ　Ｓ Ａ）がある。コンペティティブアッセイでは、抗原が検出可能な標識で標識され る。Immunological assays for detecting or quantifying modified CRP, live CRP or immune complexes As mentioned above, solid-phase assays for live CRP are based on ligand capture technology. Exceptions are known in the art. other Such suitable conventional immunoassays that may be used include competitive Includes assays and immunometric assays. An example of the latter type is radio Immunometric assay (IRMA) and enzyme-linked immunosorbent assay (ERIS) There is A). In competitive assays, the antigen is labeled with a detectable label. Ru.

抗原を含む試料が抗体及び標識された抗原とともにインキュベートされて、免疫 複合物の形成、分離及び検出の後、試料中の抗原のレベルが測定される。A sample containing an antigen is incubated with an antibody and a labeled antigen to immunize After complex formation, separation and detection, the level of antigen in the sample is measured.

イムノメトリックアッセイを実施する１つの態様では、抗原が固相上に、例えば 、ミクロタイタープレートのウェルの表面上に固定化される。抗体、または抗体 の抗原結合性フラグメントが検出可能なように標識される。標識された抗体との 試料のインキュベートは、固定化された抗原−抗体複合物をもたらし、未結合抗 体の分離後、標識量が抗原の量に比例する。In one embodiment of performing an immunometric assay, the antigen is on a solid phase, e.g. , immobilized on the surface of the wells of a microtiter plate. antibody or antibody The antigen-binding fragment of is detectably labeled. with labeled antibodies Incubation of the sample results in immobilized antigen-antibody complexes and unbound anti-antibody complexes. After separation of the bodies, the amount of label is proportional to the amount of antigen.

別のイムノメトリック（サンドウィッチ）アッセイでは、１種の抗原結合性抗体 が検出可能なように標識される。同じ抗原に結合する別の抗体が固相に固定化さ れる。抗原と標識された抗体及び固定化された抗体とのインキュベートはサンド ウィッチをもたらし、未結合の抗体の分離後、標識量が抗原の量に比例する。In another immunometric (sandwich) assay, one antigen-binding antibody is is detectably labeled. Another antibody that binds to the same antigen is immobilized on a solid phase. It will be done. Incubation of antigen with labeled antibody and immobilized antibody is performed using sand After separation of unbound antibody, the amount of label is proportional to the amount of antigen.

イムツメ）　ＩＪフックッセイは、固定化及び／または標識された抗体の添加す る順序によって、前進、後退または同時モードで実施されることができる。IJ hookup is suitable for adding immobilized and/or labeled antibodies. It can be performed in forward, backward or simultaneous mode depending on the order in which it is performed.

具体的な濃度、温度及びインキュベートの時間は他のアッセイ条件と同様に、試 料中の抗原の濃度、試料の性質等のような要素に依存して変化する。当分野に技 能を有する者は、慣例の実験法を利用しながら、それぞれの測定法における効果 的かつ至適なアッセイ条件を決定することが可能であろう。The specific concentration, temperature and incubation time will depend on the assay conditions, as well as other assay conditions. This will vary depending on factors such as the concentration of antigen in the sample, the nature of the sample, etc. Skills in this field A competent person can use conventional experimental methods to determine the effectiveness of each measurement method. It would be possible to determine specific and optimal assay conditions.

抗原または抗体が固定化され、かつ本発明において使用することのできる多くの 固相表面がある。適当な固相表面は公知であり、それらはガラス、ポリスチレン 、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、天然及び修飾セル ロース、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスフレホン、ポリ アクリロニトリル、ラテンリスビーズ、ポリビニルアルコール、ゲル、クレー、 ポリアクリルアミド及びアガロースを含む。当業者は結合用の多くの他の適当な 固相表面を知っているだろうし、また、慣例の実験法を利用しながら突きとめる ことができるだろう。There are many antibodies on which antigens or antibodies can be immobilized and which can be used in the present invention. There is a solid surface. Suitable solid surfaces are known and include glass, polystyrene, , polypropylene, polyethylene, dextran, nylon, natural and modified cells loin, polymethyl methacrylate, polycarbonate, polyfrephone, poly Acrylonitrile, Latenlis beads, polyvinyl alcohol, gel, clay, Contains polyacrylamide and agarose. Those skilled in the art will appreciate that there are many other suitable You will know the solid phase surface and also locate it using conventional experimental methods You could do that.

本発明のアッセイの特定の実施態様によって、抗体またはその抗原結合性フラグ メントを酵素、放射性同位体、蛍光化合物または金属、化学発光化合物、または 生物発光化合物のような検出可能な標識でつなぐ。さらに、これらの標識の所望 する分子への結合が、当分野に通常の技能を有する者にとっては共通の標準的な 技術によって行われる。Certain embodiments of the assays of the invention provide antibodies or antigen-binding flags thereof. enzymes, radioisotopes, fluorescent compounds or metals, chemiluminescent compounds, or Tethered with a detectable label, such as a bioluminescent compound. Additionally, the desired The linkage to the molecule is known to those of ordinary skill in the art, done by technology.

抗体が検出可能なように標識される方法の１つは、それを酵素に結合することに よる。この酵素は、後にその基質にさらされた時に、例えば、分光光度法または 蛍光光度法の手段（ＥＬＩＳＡ系）によって検出可能な化学的分子を作るような 様態で、その基質と反応する。検出可能な標識として使用されうる酵素の例は、 セイヨウワサビペルオキシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ヌクレアーゼ、 Δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリ セロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ア ルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラ クトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６− ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリシエステ ラーゼである。ＥＬＩ　ＳＡ系において増大した感度のために、記載された手順 はアビジン−酵素複合体と反応するビオチン化した抗体を使用して修正されるこ とができる。One way an antibody can be detectably labeled is by conjugating it to an enzyme. evening. This enzyme, when subsequently exposed to its substrate, can be used, e.g., spectrophotometrically or such as those that make chemical molecules detectable by fluorometric means (ELISA systems). reacts with its substrate in a certain manner. Examples of enzymes that can be used as detectable labels are: horseradish peroxidase, malate dehydrogenase, nuclease, Δ-5-steroid isomerase, yeast alcohol dehydrogenase, α-glycan Cellophosphate dehydrogenase, triosephosphate isomerase, a Lucary phosphatase, asparaginase, glucose oxidase, β-gala Tosidase, ribonuclease, urease, catalase, glucose-6- Phosphate dehydrogenase, glucoamylase, and acetyl colicieste It's laase. For increased sensitivity in the ELI SA system, the procedure described can be modified using a biotinylated antibody that reacts with an avidin-enzyme complex. I can do it.

抗原の量はまた、放射性同位体で抗体を標識することによって測定されつる。The amount of antigen can also be measured by labeling the antibody with a radioactive isotope.

その放射性同位体の存在はその後、例えば、ガンマカウンターまたはシンチレー ションカウンターの使用によって測定される。特に有用な同位体は、３Ｎ、　＋ ２５１゜１″１，３２ｐ、３ＳＳ、＋４（：、ＳＩ［ｒ、Ｓ７［：ｏ、ＳＩＩｃ ｏ、５９ｐ、７５Ｓｅ、１１１１０，９８＊Ｔｃ、６７Ｇａ、及び、ｓｏＹであ る。The presence of that radioactive isotope is then detected, for example by a gamma counter or a scintillator. measured by the use of a tion counter. Particularly useful isotopes are 3N, + 251゜1″1,32p,3SS,+4(:,SI[r,S7[:o,SIIc o, 59p, 75Se, 11110, 98*Tc, 67Ga, and soY. Ru.

抗原の測定はまた、抗体を蛍光化合物で標識することによって可能である。蛍光 的に標識された分子が適当な波長の光にさらされた時に、その存在がその染料の 蛍光によってその後に検出される。中でも最も有力な蛍光標識用化合物は、フル オレセインイソチオシアネート、ロダミン、フィコエリセリン、フィコシアニン 、アロフィコシアニン、Ｏ−フタルデヒド、及びフルオレスカミンである。Measurement of antigen is also possible by labeling antibodies with fluorescent compounds. fluorescence When a dye-labeled molecule is exposed to light of the appropriate wavelength, its presence is detected by the dye. It is subsequently detected by fluorescence. Among these, the most powerful fluorescent labeling compounds are Olesein isothiocyanate, rhodamine, phycoerycerin, phycocyanin , allophycocyanin, O-phthaldehyde, and fluorescamine.

Ｅｕ（ユーロピウム）のような蛍光発光金属原子、及び他のランタニド類がまた 使用できる。これらはＤＴＰＡまたはＥＤＴＡのような金属キレート生成グルー プによって、所望する分子に付着させることができる。Fluorescent metal atoms such as Eu (europium) and other lanthanides also Can be used. These include metal chelating glues such as DTPA or EDTA. It can be attached to a desired molecule by a step.

抗体が検出可能なように標識されつる別の方法は、それを化学発光化合物へつな ぐことによる。化学発光化合物を付着された免疫グロブリンはその後、化学反応 の経過中に起こる発光の存在を検出することによって測定される。とくに有用な 化学発光標識用化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニ ウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、及びオキサレートエステルで ある。Another method in which an antibody is detectably labeled is by linking it to a chemiluminescent compound. Depends on what you do. Immunoglobulins attached with chemiluminescent compounds are then subjected to a chemical reaction. It is measured by detecting the presence of luminescence that occurs during the course of . particularly useful Examples of chemiluminescent labeling compounds are luminol, isoluminol, aromatic acridinium with umesters, imidazoles, acridinium salts, and oxalate esters. be.

同様に、生物発光化合物がまた、標識として使用されてもよい。生物発光は化学 発光の特定の型であり、生物系に見出さ＞触媒蛋白質がその化学ルミネセンス反 応の効率を増加させる。生物発光分子の存在は発光の存在を検出することによっ て測定される。標識の目的のための有力な生物発光化合物は、ルシフェリン、ル シフェラーゼ、及びアエクオリンである。Similarly, bioluminescent compounds may also be used as labels. Bioluminescence is chemistry A specific type of luminescence found in biological systems in which catalytic proteins produce their chemiluminescent reaction. increase response efficiency. The presence of bioluminescent molecules can be determined by detecting the presence of luminescence. measured. Potential bioluminescent compounds for labeling purposes include luciferin, luciferase, and aequorin.

先に記載したように、本発明はまた、生ＣＲＰ、修飾ＣＲＰ及び免疫複合物を検 出または定量するためのキットを包含する。このようなキットは、ボトル、バイ アル、チューブ等のような容器であって、その各々が所望する免疫学的検定法に 使用する分離した要素の１種を含む、１またはそれ以上の容器を含んでもよい。As previously described, the present invention also detects live CRP, modified CRP and immune complexes. This includes kits for detecting or quantifying. Such kits are available in bottles, by containers, such as bottles, tubes, etc., each suitable for the desired immunoassay method. It may include one or more containers containing one of the separate components used.

例えば、そのキットは、適当な特異性を有する本発明の標識されていないか、ま たは検出可能なように標識されたｍＡｂの容器を含んでもよい。その抗体は凍結 乾燥した形、または溶液状でもよく、あるいは、上記されたような固相表面上に 固定化されていてもよい。他の容器が標識された抗体の量を測定するための試薬 、または緩衝液及び照準液のような補助的な試薬を含んでもよい。For example, the kit may contain unlabeled or or a container of detectably labeled mAb. the antibody is frozen It may be in dry form or in solution, or on a solid surface as described above. It may be fixed. Reagents for measuring the amount of labeled antibodies in other containers , or may contain auxiliary reagents such as buffers and targeting solutions.

マドグラフィー、ＤＥ５２でのイオン交換クロマトグラフィー及びバイオゲルＡ 　０゜５ｍのカルシウム依存性吸着クロマトグラフィーによって、ヒトＣＲＰを 胸膜液及び腹水から精製し、ポテムバ等（Ｐｏｔｅｍｐａ　ｅｔ　ａｌｊのＭｏ １ｅｃ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、２０゜１１６５＜１９８３）に記載されている ように残留する血清アミロイドＰ戊分（ＳＡＰ）を除去した。その精製蛋白質を １ｍｇ／＋ｎｌに調整して、０．０２％（Ｗ／Ｖ）のアジ化ナトリウムとＴＢＳ −カルシウム（０，０１１４）リス−塩酸、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ及び０．００ ２Ｍ　ＣａＣ１，、ｐＨ７゜３）に対して透析し、滅菌濾過し、及び４℃で保持 した。最終的なＣＲＰ調製物の純度は、ＳＡＰ及びＩｇＧについては放射状免疫 拡散法によって、ＩｇＧ　、ＩｇＡ　、ＩｇＭ　。Maddography, ion exchange chromatography on DE52 and Biogel A Human CRP was detected by calcium-dependent adsorption chromatography at 0°5 m. It was purified from pleural fluid and ascites, and Mo. 1ec, Immunol, 20°1165<1983) The remaining serum amyloid P (SAP) was removed. The purified protein Adjust to 1 mg/+nl with 0.02% (W/V) sodium azide and TBS. - Calcium (0,0114) Lis-HCl, 0.15M NaCl and 0.00 Dialyzed against 2M CaCl, pH 7°3), sterile filtered, and kept at 4°C. did. The purity of the final CRP preparation was determined by radial immunization for SAP and IgG. IgG, IgA, IgM by diffusion method.

ＳＡＰ　、フィブロネクチン、Ｃ１ｑ　、　Ｃ１ｒ　、Ｃ１ｓ　、　Ｃ３、セル ロブラスミン、アルブミン及びα−リポプロティンについてはオフタロ二−分析 法によって、及び、ボテ５−ＰＡＧＥ分析法によって確認された。SAP, fibronectin, C1q, C1r, C1s, C3, cell Ophthalonia analysis for lobrasmin, albumin and α-lipoprotein and by both 5-PAGE analysis.

で尿素処理した。簡単に言うと、１ｍｇ／ｍｌ　ＣＲＰ　ＴＢＳ−カルシウム溶 液を０．　Ｏ０５ＭＥＤＴＡでキレート化し、謂のウルトラピュアー尿素の中で ３７℃、２時間インキュベートした。その尿素を低イオン強度のＴＢＳ（０，０ １Ｍ　トリス−塩酸及び、０．０５ＭＮａＣ１、ｐＨ７，４＞に対して透析して 除去し、得られた可溶性ＣＲＰ調製物を“尿素−ＣＲＰ”と呼ぶ。was treated with urea. Simply put, 1mg/ml CRP TBS-calcium solution 0. Chelated with O05MEDTA and in the so-called ultra pure urea It was incubated at 37°C for 2 hours. The urea was dissolved in low ionic strength TBS (0,0 Dialyzed against 1M Tris-HCl and 0.05M NaCl, pH 7.4> The resulting soluble CRP preparation is referred to as "urea-CRP."

”５ＤＳ−ＣＲＰ″を調製するために、カルシウムの不在下でＣＲＰを沸騰した 水浴で５分間、０．１％（ｗ／ｖ）　ＳＯ３とインキュベートした。To prepare “5DS-CRP”, CRP was boiled in the absence of calcium. Incubated with 0.1% (w/v) SO3 for 5 minutes in a water bath.

カルシウムの不在下でＣＲＰを６３℃、２分間加熱することによってＣＲＰの変 性及び修飾を起こし、熱処理ＣＲＰを調製した。Modification of CRP by heating CRP at 63°C for 2 minutes in the absence of calcium. heat-treated CRP was prepared.

Ｃ，マウス：雌の５−６週令Ｂａ１ｂ／ｃマウスをジャクソン　ラボラトリーズ （バーハーバ−（Ｂａｒ　Ｂａｒｂｅｒ＞、ＭＥ）またはＨａｒｌａｎ　Ｓｐｒ ａｇｕｅ口ａｗｌｅｙ　Ｉｎｃ、（インジアナポリス、ＩＮ）から得た。雌の５ −６週令ＲＢＦ１０Ｎマウスをジャクソン　ラボラトリーズ（バーハーバ−１Ｍ Ｅ＞から得た。すべてのマウスをＲｕ５ｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　ＣｏＣｏ１１ｅの Ｃａｍｐａｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒの設備に収容し飼養 した。免疫感作は８−９週令から開始した。C, Mouse: Female 5-6 week old Ba1b/c mouse from Jackson Laboratories. (Bar Barber, ME) or Harlan Spr. Obtained from Awley Inc. (Indianapolis, IN). female 5 -6 week old RBF10N mice were transferred to Jackson Laboratories (Bar Harbor-1M). Obtained from E>. All mice are Ru5h Medical CoCo11e. Housed and raised in the facilities of Camparative Re5earch Center did. Immunization started at 8-9 weeks of age.

Ｄ、　ハイブリドーマの作製二ヶネット等（Ｋｅｎｎｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ、）の “Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈｒａｃｔｅｒ ｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”　ｉｎ 　Ｍｏｎｏｃｌｏｎ≠戟@Ａｎｔｉｂ。D. Production of hybridomas by Kennett et al. “Methods for Production and Character ization of Monoclonal Antibodies” in 　Monoclon≠戟@Antib.

ｄｉｅｓ、　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：　Ａ　Ｎｅｗ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　Ｉｎ 　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、　ｐ、３６３i１９８０）に 記載されているｉｎ　ｖｉｖｏ全身免疫感作及びポリエチレングコール（ＰＥＧ ）融合を使用する、標準のハイブリドーマ技術によってｍＡｂを作製した。マウ スを、等量の完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ、）または不完全フロインド アジュバント（ＩＦＡ）中で乳化された、または製造元（ＲｉＢｉ　Ｉｍｍｕｎ ｏｃｈｅｍ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、、ハミルトン、ＭＴ）によって記載さ れているようなＲＩＢＩＴシュバント系で乳化された精製免疫原で、鼠躾部皮下 を免疫した。２週間後及び６週間後の２回の腹膜内（ｉ。dies, Hybridomas: A New Dimension In Biological Analysis, p. 363i1980) Described in vivo systemic immunization and polyethylene glycol (PEG) ) mAbs were generated by standard hybridoma technology using fusion. Mau The solution was mixed with an equal volume of complete Freund's adjuvant (CFA) or incomplete Freund's adjuvant (CFA). Emulsified in adjuvant (IFA) or manufactured by the manufacturer (RiBi Immun) (Ochem Research Inc., Hamilton, MT) Purified immunogen emulsified with RIBIT Schwand system, such as immunized. Two intraperitoneal injections (i.e. after 2 and 6 weeks).

ｐ、）ブースター免疫感作を滅菌生理的食塩水、ＩＦＡまたはＲＩＢＩアジュバ ント中の抗原を使用して実施した。そのマウスを２−４週間の間、休ませ、融合 の３日前に、マウス１匹当たり滅菌生理的食塩水中１００μｇ免疫原で最終的な ｉ、　ｐ、注射を与えた。p.) Booster immunization with sterile saline, IFA or RIBI adjuva. The test was carried out using the antigen in the sample. Let the mouse rest for 2-4 weeks and let it fuse. 3 days before the final injection with 100 μg immunogen per mouse in sterile saline. i, p, injection was given.

融合１５では、カルシウム存在下での非修飾ヒ１−ＣＲＰを、ＲＢＰ／ＤＮマウ スにおいてフロインドアジュバント系で免疫原として使用した。融合１３．２１ 及び２２では、ネオＣＲＰ抗原決定基を発現する尿素−及び熱−修飾ヒ）ＣＲＰ の混合物を、Ｂａ１ｂ／ｃマウスの免疫感作のためにフロインドアジュバント中 で使用した。In fusion 15, unmodified human 1-CRP in the presence of calcium was transferred to RBP/DN mice. was used as an immunogen in Freund's adjuvant system. Fusion 13.21 and 22, urea- and heat-modified human) CRP expressing neo-CRP antigenic determinants. in Freund's adjuvant for immunization of Ba1b/c mice. It was used in

融合２６では、Ｒ［ＢＩアジュバント系中での尿素−ＣＲＰと熱−修飾ウサギＣ ＲＰの組合せ免疫原をＢａ１ｂ／ｃマウスに注射した。すべての免疫感作は、そ の免疫型への応答が優勢である傾向があったが、ヒト生ＣＲＰ及びネオＣＲＰの 両者の特異性に対する抗体をもたらした。In fusion 26, R[urea-CRP in BI adjuvant system and heat-modified rabbit C A combined immunogen of RP was injected into Balb/c mice. All immunizations are responses to human live CRP and neo-CRP tended to be predominant. yielded antibodies for both specificities.

免疫されたマウスからの膵臓の免疫リンパ球を、ＰＥＧ１５００（Ａｌｄｒｉｃ ｈ　Ｃｈｅｎ＋１ｃａｌ　Ｃｏ、Ｉｎｃ、ミルウオーキー、１１［）を使用して 、ヒポキサンチングアニン　ホスホリボンルトランスフエラーゼ欠損ミエローマ ＦＯＸ−ＮＹ　（タガートとサムロフ（ＴａｇｇａｒｔとＳａｍｌｏｆｆ）、５ ｃｉｅｎｃｅ、　２１９．１２２８（１９８３）に記載されている）と融合させ た。ハイブリドーマを、ヒポサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ； 　シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、　Ｓｔ、　Ｌ ｏｕｉｓ、ＭＯ）　、またはアデノシン、アミノプテリン及びチミジン＜ＡＡＴ ；シグマケミカル社）をそれぞれ含む適当な規定培地（ＨＢＩＯＩまたは）１８ １０２；Ｈａｎａ　８ｉｏ１ｏｇｉｃｓ　Ｉｎｃ、、バークレー、ＣＡ）で選択 した。抗原特異性クローンを直接酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）　（下文 に記載される）によってスクリーニングし、限界希釈法によって少なくとも２回 クローニングした。抗原−陽性クローンを、生ＣＲＰ、修飾ＣＲＰ　（ネオＣＲ Ｐエピトープを表す）及び非特異性コントロール蛋白質（ヒト−トランスフェリ ン、シグマケミカル社、またはヒト［ｇＥ　、　Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｕｎｏＲ ｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、Ａｖｏｎｄａｌｅ、 　Ｐ`） を塗布したプレート上での直接ＥＬＩＳＡ法によって、及びＰＣ−ＫＬＨを塗布 したプレート　（下文に記載される）に結合したＣＲＰを使用するリガンド捕捉 アッセイ上の直接ＥＬＩＳＡ法によってイソタイプ化された。Pancreatic immune lymphocytes from immunized mice were purified using PEG1500 (Aldric Using h　Chen+1cal　Co, Inc., Milwaukee, 11 [) , hypoxanthine guanine phosphoribol transferase-deficient myeloma FOX-NY (Taggart and Samloff), 5 science, 219.1228 (1983)). Ta. Hyposanthine, aminopterin and thymidine (HAT; Sigma Chemical Co., St. L ouis, MO), or adenosine, aminopterin and thymidine <AAT ; Sigma Chemical Co.) 18 102; Hana 8io1ogics Inc., Berkeley, CA) did. Direct enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method) for antigen-specific clones (see below) (as described in ) and at least twice by limiting dilution. Cloned. Antigen-positive clones were isolated from live CRP, modified CRP (NeoCR P epitope) and non-specific control protein (human-transfer human [gE, Jackson ImmunoR] esearch Laboratories, Inc., Avondale, 　P`) and by direct ELISA method on plates coated with PC-KLH. Ligand capture using CRP bound to a plate (described below) Isotyped by direct on-assay ELISA method.

Ｅ、ハイブリドーマの培養二安定したハイブリドーマを、２％または５％の熱− 失活ウシ胎児血清（ＰＣ３）　（Ｂｉｏｌｏｇｏｓ　Ｉｎｃ、、　Ｎａｐｅｒｖ ｉｌｌｅ、　ＩＬ）、０．００２Ｍ　Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ 　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）　、１００ニー’−７ト／ｍｌのペニシリン−ストレ プトマイシン（ＧＩＢＣＤ）　、０．００１Ｍのピルビン酸ナトリウム（ＧＩＢ ＣＯ）　、及び５．５　ｘｌＯ−’Ｍの２−メルカプトエタノール（シグマケミ カル社）を含む適当な補助物（Ｈａｎａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ＞を有するＨＢＩ ＯＩまたはＨＢ１０２規定培地で培養した。生存可能な細胞を２−２、５　Ｘ　 Ｌ　Ｏ’　／ｍｌで、３７℃、５％ρＣ０２の増湿した雰囲気中でプラスチック 培養フラスコの中で培養した。保存のために、細胞（５Ｘ　１０’／ｍｌ／バイ アル）を洗浄し、２０％ＦＣ３及び１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；　 Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、、　Ｆａｉｒｌａｗｎ、　ＮＪ） を含むＨＢ基礎培地に再懸濁し、及び液体窒素でゆっくりと凍結した。E. Culture of hybridomas Stable hybridomas were incubated with 2% or 5% heat. Inactivated fetal bovine serum (PC3) (Biologos Inc., Naperv ille, IL), 0.002M L-glutamine (GIBCO, Grand 15land, NY), 100 knee'-7t/ml penicillin strain Ptomycin (GIBCD), 0.001M sodium pyruvate (GIB CO), and 2-mercaptoethanol (Sigma Chem. HBI with appropriate supplements (Hana Biologics) Cultured in OI or HB102 defined medium. 2-2, 5X viable cells Plastic in a humidified atmosphere at 37°C and 5% ρC02 at L O’/ml. Cultured in culture flasks. For storage, cells (5X 10'/ml/bicycle) Al) was washed with 20% FC3 and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO; Fisher 5 Scientific Co., Fairlawn, NJ) and slowly frozen in liquid nitrogen.

ｅｔａｌ、）のＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈｙｂｒｉｄｏ ｍａｓ：　Ａ　Ｎｅｗ　Ｄｉｍｅｎｔｉｏｎ　Ｉｎ　Ｂｉｏ撃盾■奄■ ａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓρ、　３６３　（１９８０）に記載されているように５ ０％硫酸アンモニウムでの沈降による培養物上清から、次いで、ｐＨ７，２のＰ 　Ｂ　Ｓ　（Ｂａｃｔｏ−ＦＡ緩衝液、Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　ｉｅ ｓ、デトロイト、罰）への即時透析によって調製した。すべての免疫グロブリン 調製物はベックマンミクロフユージ中で遠心分離され、アジ化ナトリウムで０． ０２％に調整され、−７０℃で保存され、及びマウスの免疫グロブリンの消衰係 数を用いて定量された。etal, ) Monoclonal antibodies, Hybrido mas: A New Dimension In Bio Gekishi ■奄■ 5 as described in al Analysis ρ, 363 (1980). from the culture supernatant by precipitation with 0% ammonium sulfate, then P BS (Bacto-FA buffer, Difco Laboratorie s, Detroit, Punishment) by immediate dialysis. all immunoglobulins The preparation was centrifuged in a Beckman microfuge and diluted with sodium azide to 0. adjusted to 0.02%, stored at -70°C, and used for mouse immunoglobulin decay. quantified using numbers.

実施例２：ＣＲＰに対するモノクローナル抗体の特徴付は実施例１で作製された ｍＡｂｓをＥＬＩＳＡ、　ドツトプロット及びウェスタンプロット法によって特 徴付けた。Example 2: Characterization of monoclonal antibodies against CRP generated in Example 1 mAbs were identified by ELISA, dot plot and western plot methods. Commanded.

Ａ、参照抗体：ＥＬＩＳＡ、　ドツトプロット及びウェスタンプロット法で使用 されるポリクローナル抗体は、Ｐｅｌ　Ｆｒｅｅｚ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（ Ｒｏｇｅｒｓ、ＡＫ）から得られる非結合及びセイヨウワサビペルオキシド（Ｈ ＲＰ）−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ　＋１ｇＭ（Ｈ＋Ｌ）及びＨＲＰ−結合ウサギ 抗ヤギＩｇ’Ｇ　、及びベーリンガーマンハイムバイオケミカルズ（インディア ナポリス、ＩＮ）から得られるＨＲＰ−結合アビジンを含む。A. Reference antibody: used in ELISA, dot plot and Western plot methods The polyclonal antibodies used are available from Pel Freez Biologicals ( unconjugated and horseradish peroxide (H RP)-conjugated goat anti-mouse IgG +1 gM (H+L) and HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG, and Boehringer Mannheim Biochemicals (India) HRP-conjugated avidin obtained from Napolis, IN).

そのｍＡｂは、マイバスサイエンティフィック（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、　ＩＬ ）から得られるウサギ抗−重鎖及び軽鎖イソタイプー特異性試薬、及びＫｉｒｋ ｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、（ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＯ）から得られるＨＲ，Ｐ−結合ヤギ抗ウサギ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を使用してイソタイプ化した。The mAb was purchased from MyBath Scientific (Naperville, IL). ) and rabbit anti-heavy chain and light chain isotype-specific reagents obtained from Kirk egaard and Perry Laboratories, Inc. HR,P-conjugated goat anti-rabbit obtained from Gaithersburg, MO) Isotyped using IgG (H+L).

他の研究所から得られるヒトＣＲＰに対するｎ＋Ａｂは、Ａｌｌ１ｅｒｉｃａｎ 　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅグハム、　ＡＬ）のアラバマ大学Ｄｅｐｔ、ｏｆ　 ＭｅｄｉｃｉｎｅのＯｒ、Ｊｏｈｎ　Ｅ、　Ｖｏｌａｎａｋｉｓから得られ、キ ルバトリック等（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、）の　Ｍｏ１ｅｃ　１ｍ ｍｕｎｏ１．、１９．１１５９（１９８２）に記載されているＥＡ４−１；及び オハイオ州立大学（コロンバス、口Ｈ）　Ｄｅｐｔ、　ｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅの 口ｒ、Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｆ、　Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎから得られ、Ｔｓｅｎｇ等の ｌｙｂｒｉｄｏｍａ、７゜１８５　（１９８８）に記載されているＢＢ−９を含 む。n+Ab against human CRP obtained from other laboratories is Type Culture Graham, AL) University of Alabama Dept. of Obtained from Or, John E., Volanakis of Medicine; Kilpatrick et al.'s Mo1ec 1m muno1. , 19.1159 (1982); and Ohio State University (Columbus, H) Dept. of Medicine Obtained from Richard F. Mortensen, Tseng et al. lybridoma, 7° 185 (1988). nothing.

うにジアゾ化したバラ一二トロフェニルホウホリルコリン（シグマケミカル）と インキュベートすることによって、ホスホリルコリン（ＰＣ）置換キーホールリ ンベットヘモシアニン（ＰＣ−ＫＬＨ）を調製した。最終的な誘導の結果は、１ ｘｔｏ−’μＫＬＨ当たり２８モルのＰＣとなった。Sea urchin diazotized rose ditrophenylbouphorylcholine (Sigma Chemical) and By incubating the phosphorylcholine (PC)-substituted keyhole library Embedded hemocyanin (PC-KLH) was prepared. The final induction result is 1 This resulted in 28 moles of PC per xto-'μKLH.

Ｃ，ＣＲＰのビオチン化：　１ｍｇ／ｍｌの精製ヒトＣＲＰを１／８容量の１ｍ ｇ／ｍｌ　Ｎ１（Ｓ−ＬＣ−ビオチンと４時間、室温で、随時攪拌でインキュベ ートした。ビオチン化された蛋白質を４℃で２４時間の間、８リツトルのＴＢＳ −カルシウム緩衝液に対して透析した。そのビオチン化された蛋白質調製物はＰ Ｃ−ＫＬＨに対してカルシウム依存性結合を示し、かつ抗−生ＣＲＰ及び抗−ネ オＣＲＰｍＡｂに関与するＥＬＩＳＡ法において非標識ＣＲＰに匹敵するほど反 応した。C. Biotinylation of CRP: 1 mg/ml purified human CRP in 1/8 volume of 1 m g/ml N1 (S-LC-biotin and incubate for 4 hours at room temperature with occasional stirring. I started. Biotinylated protein was added to 8 liters of TBS for 24 hours at 4°C. - Dialyzed against calcium buffer. The biotinylated protein preparation is P It shows calcium-dependent binding to C-KLH and has anti-biotic CRP and anti-neoplastic Anti-CRP mAbs are as reactive as unlabeled CRP in ELISA assays involving CRP mAbs. I responded.

Ｄ１合成ＣＲＰペプチド：　ＬｉｎｄｎｅｒとＲｏｂｅｙのＩｎｔ、Ｊ、　Ｐｅ ｐｔ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、、　３０゜７９４　（１９８７）に記載され ているように合成されたＣＲＰペプチド１．２及び４が、口ｒ、　Ｆ、Ａ、　Ｒ ｏｂｅｙ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｄｅｎｔａｌ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ、（ベセスダ、ＭＯ）■ よって置火に提供された。ペプチド１（ヒトＣＲＰの２３−３０残基と同一）、 ペプチド２（ヒトＣＲＰの１０９−１２３残基と同一）及びペプチド４（ヒトＣ ＲＰの１９９−２０６残基と同一）は、Ｏｓｍａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏ ｃ　Ｎａｔ’　１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ旦７４．１２１４（１９７７）；　Ｒｏ ｂｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６２．７０５３ （１９潤に記載されているようにヒ）ＣＲＰ分子中で先に同定されたタフトシン 様配列を含むように調製された。ペプチド３（ヒ１−ＣＲＰの１３７−１５２残 基と同一）はＯｒ、Ｒｉｃｈａｒｄ　ｆｌｏｕｇｈｔｏｎ（Ｓｃｒｉｐｐｓ　Ｃ １１ｎｉｃ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉ’ｏｎ、　Ｌ＝@Ｊ ｏｌｌａ、　Ｃ Ａ）によって好意的に合成さね、及び置火に提供されて、ＣＲＰによるカルシウ ム結合に関与していると提案されているアミノ酸配列を複製した（Ｎｇｕｙｅｎ 　ｅｔ　ａｌ、。D1 synthetic CRP peptide: Lindner and Robey's Int, J, Pe pt, Protein Res, 30°794 (1987). CRP peptides 1.2 and 4, synthesized as shown in FIG. obey, National In5 posture of Dental R e5earch, (Bethesda, MO) ■ Therefore, it was offered to set fire. Peptide 1 (identical to residues 23-30 of human CRP), Peptide 2 (identical to residues 109-123 of human CRP) and peptide 4 (human CRP) (identical to residues 199-206 of RP) were described by Osman et al., Pro. c Nat' 1. Acad, Scidan 74.1214 (1977); Ro bey et al, J, Biol, Chem, 262.7053 (as described in 19 Jun) Tuftsin previously identified in CRP molecules prepared to contain similar sequences. Peptide 3 (137-152 residues of human 1-CRP) group) is Or, Richard floughton (Scripps C 11nic and Re5search Foundation, L=@J olla, C Calcium by CRP is favorably synthesized by A) and provided for heating. We cloned an amino acid sequence proposed to be involved in membrane binding (Nguyen et al. et al.

修飾ＣＲＰ用の直接ＥＬＩＳＡ法において、各ウェル当たり５０μｍのＣＲＰ　 （５μｇ／ｍｌ）をポリスチレンＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｌａｂ ｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、ドイツ）上でインキュベートした。ＣＲＰ溶液中のカルシ ウムは塗布する前に、プレート上でのＣＲＰネオ−抗原性の発現を助けるために 、０．０１１１　ＥＤＴＡの０．０１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液ＰＨ９，０でキ レート化した。ウェルを、０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ２０及び０゜０１ Ｍ　ＢＤＴＡを含むＶＢＳ　（０，０５Ｍベロナール、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、 　ｐＨ７，３）　（洗浄用緩衝液）で洗浄し、１％ＢＳＡ　（蒸留水中）で３０ 分間、３７℃でブロッキングした。抗ＣＲＰｍＡｂを洗浄用緩衝液で連続的に希 釈し、５０μＩづつを各ウェルに３０分間、３７℃で添加し、続いて洗浄した。In the direct ELISA method for modified CRP, 50 μm of CRP per well (5 μg/ml) on a polystyrene ELISA plate (Greiner Lab ortechnik, Germany). Calci in CRP solution To aid in the expression of CRP neo-antigenicity on the plate before application, , 0.0111 EDTA in 0.01 M sodium bicarbonate buffer pH 9.0. It was rated. The wells were treated with 0.05% (v/v) Tween20 and 0°01 VBS containing M BDTA (0.05M veronal, 0.15M NaCl, Wash with pH 7, 3) (washing buffer) and rinse with 1% BSA (in distilled water) for 30 minutes. Blocking was performed at 37° C. for minutes. Continuously dilute the anti-CRP mAb with washing buffer. 50 μl was added to each well for 30 minutes at 37° C., followed by washing.

洗浄用緩衝液中のペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ及びＩｇＭ（Ｈ＋ Ｌ）をウェルに３０分間、３７℃で加えた。洗浄後、５０μｍのＡＢＳＴ基質（ ２−２′アジノービス（３−エチルベンジチアソ′リンー６−スルホン酸）、シ グマケミカル社）を各ウェルに１５分間、室温で加えた。そのプレートで、タイ ターチックマルチスキャン　プレートリーダー（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ、ヘルシンキ、フィンランド）を使用して４１４ｎｍ（Ａ、１−）の吸光 度を読んだ。ペプチドの阻害測定法では、最大変色の半分を生じる濃度のｍＡｂ とペプチドの連続的な希釈液とを、その混合物をＣＲＰを塗布したウェルに添加 する前に、前もって３０分間、３７℃でインキュ“生”ＣＲＰを規定するリガン ド捕捉ＥＬＩＳＡでは、プレートを、各ウェル当たり５０μ！のＰＣ−ＫＬＨ（ ６，２５μｇ／ｍｌ）重炭酸塩緩衝液溶液と一夜、４℃でインキュベートし、Ｖ ＢＳ洗浄用緩衝液で洗浄し、上記のように１％ＢＳＡでブロッキングした。洗浄 後、０．００２Ｍ　ＣａＣｌ２を含むＣＲＰ　（５μｇ／ｍｌ）ＶＢＳ−Ｔｗｅ ｅｎ溶液を各ウェル当たり５０μｌ加え、３０分間、３７℃でインキュベートし た。ａｌＡｂ　、ペルオキシダーゼ−結合抗マウス免疫グロブリン試薬及び基質 を記載したように添加した。Peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG and IgM (H+ L) was added to the wells for 30 minutes at 37°C. After washing, 50 μm ABST substrate ( 2-2'azinobis(3-ethylbendithiazorine-6-sulfonic acid), Guma Chemical Co.) was added to each well for 15 minutes at room temperature. With that plate, Thailand Tartic Multiscan Plate Reader (Flow Laborator) ies, Helsinki, Finland) at 414 nm (A, 1-). I read the degree. For peptide inhibition assays, the concentration of mAb that produces half the maximum color change is and serial dilutions of the peptide, and the mixture was added to the CRP-coated wells. Incubate “live” CRP at 37°C for 30 minutes before incubating the ligand. For decapture ELISA, plate 50 μl per well! PC-KLH ( 6,25 μg/ml) in bicarbonate buffer solution overnight at 4°C and Washed with BS wash buffer and blocked with 1% BSA as above. Washing After that, CRP containing 0.002M CaCl2 (5 μg/ml) VBS-Twe Add 50 μl of en solution per well and incubate for 30 minutes at 37°C. Ta. alAb, peroxidase-conjugated anti-mouse immunoglobulin reagent and substrate was added as described.

エピトープ＃Ｉｊｌ識のカルシウム依存性及びＰＣ阻害性を同定するリガンド捕 捉測定法は、ポリクローナル−ヤギ抗マウス［ｇＧ　（１５Ｍｇ／ｍ　Ｉ重炭酸 塩緩衝液溶液ｐｉ（！Ｉｔ、　６の５０μｌ）を塗布したウェルを利用し、前記 のようにブロッキングした。洗浄後、最大捕捉の半分を生じる濃度のｍＡｂ　（ ５０μｍ）を添加し、３０分間、３７℃でインキュベートした。０．００５Ｍ　 ＢＤＴＡ　、０．００２Ｍ　ＣａＣ１，または０．００２Ｍ　ＣａＣｌ２＋ＰＣ （１０−’から１０−７Ｍ）の存在下でビオチン化ＣＲＰ　（Ｉ　Ｘ１０−”Ｍ （０，０２Ｍｇ／ｍｌ）ＶＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液溶液の５０μｍ）をその ｍＡｂと３０分間、３０℃でインキュベートした。ウェルを洗浄し、５０μｌの アビジンペルオキシダーゼと３０分間、３７℃でインキュベートし、ＡＢＴＳ基 質で発色させた。Ligand capture to identify calcium-dependent and PC-inhibitory properties of epitope #Ijl The capture assay was performed using polyclonal goat anti-mouse [gG (15 Mg/mI bicarbonate)]. Using a well coated with a salt buffer solution pi (!It, 50 μl of 6), I blocked it like this. After washing, mAb at a concentration that produces half-maximal capture ( 50 μm) and incubated for 30 minutes at 37°C. 0.005M BDTA, 0.002M CaCl, or 0.002M CaCl2+PC Biotinylated CRP (I (0.02 Mg/ml) of VBS-Tween20 buffer solution). Incubated with mAb for 30 minutes at 30°C. Wash wells and add 50 μl Incubate with avidin peroxidase for 30 minutes at 37°C to remove ABTS groups. Colored with texture.

Ｆ、ドットブａ−７ト法：Ｚｈａｎｇ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３８．５ ７５（１９８７）の手順の修飾法に次いで、ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉ ｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ、　Ｋｅｅｎｅ、　ＮＨ）を、ＶＢＳ　（ｐｔ１ ７．４）中に３０分間予備浸漬し、過剰の緩衝液を濾紙で除き、バイオ−ドツト 　ミクロフィルトレージョン装置（Ｂ　１ｏ−Ｒａｄ）に装着した。５μｇ／ｍ ｌ濃度の各種試験蛋白質の５０μＩづつを　−夜４℃で膜上にドツトし、及び吸 引濾過してウェルからすべての液体を除去した。ブロッキング溶液（１％ＢＳＡ の１００μＩ）をウェルに加え、３０分間、室温（ＲＴ）でインキュベートし、 膜を通して吸引濾過した。ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．００２Ｍ 　ＣａＣｌ２を含むＶＢＳ（洗浄用緩衝液）で３回洗浄した。ＥＬＩＳＡ法にお いて最大反応性に要する濃度の５倍またはそれ以上の濃度のモノクローナル及び ポリクローナル抗ＣＲＰ抗体を３０分間、室温で加え、次いで洗浄した。洗浄用 緩衝液中のＨＲＰ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ及びＴｇＭ　、及びウサギ抗ヤギＩ ｇＧを３０分間、室温でインキュベートした。バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ）　（リッチモンド、ＣＡ）に指示されているように調製した基質溶液（メタノ ール及びＨ２０□を含む１０ｍＭ　ＴＢＳ中の４−クロロ−１−ナフトール）を 、ウェルに加え、インキュベートを３０分間、室温で発色させるために続けた。F, dot board a-7 method: Zhang, J, Immunol, 138.5 75 (1987), followed by a modification of the procedure of nitrocellulose membrane (Schlei cher & 5chuell, Keene, NH), VBS (pt1 7.4) Pre-soak for 30 minutes, remove excess buffer with filter paper, and remove the bio-dots. It was attached to a microfiltration device (B1o-Rad). 5μg/m 1 concentration of each test protein was dotted onto the membrane at 4°C overnight, and absorbed. All liquid was removed from the wells by filtration. Blocking solution (1% BSA 100 μl of 100 μl of 100 μl of 100 μl of 100 μl of 100 μl of 100 μl of 100 μl was added to the wells, incubated for 30 min at room temperature (RT), and It was filtered with suction through a membrane. Fill wells with 0.05% Tween20 and 0.002M Washed three times with VBS (washing buffer) containing CaCl2. For ELISA method monoclonal and at a concentration five times or more than that required for maximum reactivity Polyclonal anti-CRP antibody was added for 30 minutes at room temperature and then washed. For cleaning HRP-conjugated goat anti-mouse IgG and TgM in buffer, and rabbit anti-goat I gG was incubated for 30 minutes at room temperature. Bio-Rad ) (Richmond, CA). 4-chloro-1-naphthol in 10mM TBS containing alcohol and H20□. , to the wells, and incubation continued for 30 minutes at room temperature for color development.

ディエゴ、ＣＡ）で３時間、３７℃で分解した。その分解物はｌ　ｘｌＱｃｍの スベロース１２のゲル濾過カラムを使って０．３ｍｌ／ｆｆｌ１ｎの流量のＯ， ＯＩＭ　ＴＢＳでＰＰＬＣクロマトグラフィーにかけた。溶出液の２８０ｎｍの 吸光度を連続的にモニターし、三量体ＣＲＰの位置に当たるピークの溶出を集め た。チログロブリン（６７０ｋＤａ）、免疫グロブリンＧ　（１５８ｋＤａ）　 、オボアルブミン（４５ｋＤａ）　、ミオグロブリン（１７ｋＤａ）及びビタミ ンＢ１□（１，３５ｋＤａ）を含むバイオラッドゲル濾過標準物を、ＦＰＬＣカ ラムの分子量測定によって記載されている緩衝液系を使用して１３％ポリアクリ ルアミドミニスラブゲル（バイオラッド）で実施した。蛋白質をバイオラッドプ ロット系を使用してニトロセルロース膜へ移した。イムツブロフト法を行うため の手順は、ドツトプロット法で記載されているように実施した。Diego, CA) for 3 hours at 37°C. The decomposition product is lxlQcm O at a flow rate of 0.3 ml/ffl1n using a gel filtration column of Suberose 12, PPLC chromatography was performed on OIM TBS. 280nm of eluate Continuously monitor the absorbance and collect the elution peak corresponding to the position of trimeric CRP. Ta. Thyroglobulin (670kDa), immunoglobulin G (158kDa) , ovalbumin (45kDa), myoglobulin (17kDa) and vitamin A Bio-Rad gel filtration standard containing B1□ (1,35 kDa) was added to the FPLC camera. 13% polyacrylic using the buffer system described by Lamb Molecular Weight Determination. Performed on Luamide Mini Slab Gel (Bio-Rad). Biorad protein protein Transfer to nitrocellulose membrane using lot system. To perform the Imtsubroft procedure The procedure was performed as described for the dot plot method.

１、ＥＬＩＳＡの結果＝１７種の安定したｍＡｂをヒ）ＣＲＰに対して生じさせ 、まずＥＬＩＳＡで、カルシウム存在下でのＰＣ−ＫＬＨと結合したＣＲＰ（即 ち、“生″ＣＲＰエピトープ）及びカルシウム不在下での尿素−修飾ＣＲＰ（即 ち、“ネオ−ＣＲＰ″エピトープ）の両者との反応性を特徴付けた。表１はポリ スチレンプレート上のこれら２つの分子の型に対するｍＡｂの相対的アビシティ −を示す。５つのｍＡｂ　＜グループＩに指定される）は生ＣＲＰとのみ反応し ：２つのｉ＋Ａｂ　（グループＩＩに指定される）は生及び修飾ＣＲＰの両者と 反応し；及び１０のｍＡｂ（グループＩ＋［及びＩＶに指定される）は修飾ＣＲ Ｐとのみ反応した。図ＬＡ−ＩＤは、各グループの代表的なｍＡｂのＥＬＩＳＡ 結合カーブを示し、図ＩＥ及びＩＦはそれぞわ、生及び修飾ＣＲＰに対するポリ クローナル抗血清の反応性を比較のために示す。1. ELISA results = 17 stable mAbs raised against CRP First, ELISA was performed to detect CRP (immediately) bound to PC-KLH in the presence of calcium. i.e. “live” CRP epitopes) and urea-modified CRP in the absence of calcium (i.e. The reactivity with both the "neo-CRP" epitope and the "neo-CRP" epitope was characterized. Table 1 shows poly Relative avidity of mAbs for these two molecule types on styrene plates - indicates. Five mAbs <designated as Group I) react only with live CRP. : Two i+Abs (designated to Group II) with both raw and modified CRP. and 10 mAbs (designated group I+ [and IV) were modified CR Reacted only with P. Figure LA-ID shows representative mAb ELISA of each group. The binding curves are shown in Figures IE and IF, respectively. Reactivity of clonal antiserum is shown for comparison.

グループ■に指定されたｍＡｂは、挙げられた濃度（一般的に〉２０ａｇ／ｍｌ ）よりも大きい濃度でさえも、修飾ＣＲＰとは反応せず、生ＣＲＰとは０．０７ ａｇ／ｍ　＋はどの少量で最大活性の半分を生じたので、本発明者らはこれらの 抗体が生ＣＲＰエピトープとのみ結合特異性を有すると結論付けた。グループＩ ＩのｍＡｂは、生及び修飾ＣＲＰの両者と結合することができる。しかしながら 、両方のｍＡｂは、生ＣＲＰとより強く反応する。対して、グループＩ１１及び ＴＶのｎ＋Ａｂは修飾ＣＲＰに有意な特異性を示し、試験に使用したどの濃度に おいてもリガンド結合した生ＣＲＰとは反応しなかった。mAbs assigned to group ) does not react with modified CRP and 0.07 with raw CRP. ag/m + produced half the maximal activity at which small amounts, we It was concluded that the antibody has binding specificity only with live CRP epitopes. Group I The I mAb is capable of binding both native and modified CRP. however , both mAbs react more strongly with live CRP. On the other hand, groups I11 and The TV n+Ab showed significant specificity for modified CRP, at all concentrations used in the study. No reaction was observed with ligand-bound raw CRP.

一般的に、生及びネオＣＲＰ特異性の同定は、適当なＣＲＰの生または修飾型と の７倍より大きい優勢的な反応性を表している。ｍＡｂ　３Ａ１（グループ■） 及び６Ａ５（グループＩＶ）の有意に低い反応性は、ＥＬＴＳＡ法での高濃度免 疫グロブリンの使用、相互作用のより低い親和性、または塩析操作に右ける抗体 のより低い安定性から生じる技術的複雑性を反映しているかもしれない。Generally, the identification of live and neo-CRP specificity involves the identification of the appropriate live or modified form of CRP. represents a predominant reactivity of more than 7 times greater than mAb 3A1 (group ■) The significantly lower reactivity of 6A5 (Group IV) and 6A5 (Group IV) was due to the high concentration Antibodies that depend on the use of epiglobulins, lower affinity interactions, or salting-out procedures may reflect technical complexity resulting from the lower stability of

表１ 生ＣＲＰ　修飾ＣＲＰ Ｔ−１５−１０６ｒ２ａ、ｋ　０．０７　＞２０．０１−２６−８０８　ｙａｋ 　Ｏ，１１）２０．０Ｉ　−２２−３Ｇ１２　ｒ　ｌ　、　ｋ　０．２１　＞２ ０．０Ｉ　−１−４Ｈ２ｒ　２ａ、　ｋ　２．５０　＞４０．０Ｉ−２１−３Ａ ｌ　ｒｌ、　ｋ　２４．５０　＞４０．０１１−１５−２Ｃ１０７２ａ、ｋ　Ｏ ，０５３，０４１１−２６−ＩＡ８　ｒＬｋ　Ｏ，０６１，４８Ｉ１１−２６− ７Ａ８　ｒ２ｂ、ｋ　＞２０．０　０．６ｇＩ　ｆ　［−２６−８Ｃ１０ｒｌ　 、　ｋ　＞２０．０　１−５９ＩＩＩ−２６−６８７ｒ　ｌ　、ｋ　＞２０．０ 　１．６９ＩＶ−１３−３Ｈ１２ｒ　１　、　ｋ　＞２０．　ＯＯ，１６ＩＶ− ２６−２Ｈ５ｒ　Ｉ　Ｓｋ　＞２０．０　０．１６ＩＶ−２６−９Ｃ９ｒ　１　 、ｋ　＞２０．０　０．２１１Ｖ−１５−３Ｇ８　ｒ　１　、ｋ　＞２０．　Ｏ Ｏ，２６ＩＶ−２６−７Ｃ６ｒ　１　、　ｋ　＞２０．０　０．４１１Ｖ−１３ −１２０７ｒ２ａ、ｋ　＞２０．０　０．９０ＩＶ−２６−６Ａ５　ｒ　１　、 ｋ　＞５１４．００　２５７．００ヤギ抗−生ＣＲＰ　１．８８　＞２０．００ ヤギ抗−ネオＣＲＰ　８．７５　０．３９＊値はＥＬＩＳＡ法において、最大反 応性の半分に要されるｍＡｂ　１ｇＧのμｇｅｍ　ｌを表す。Table 1 Raw CRP Modified CRP T-15-106r2a, k 0.07 > 20.01-26-808 yak O, 11) 20.0I -22-3G12 r l, k 0.21 > 2 0.0I-1-4H2r 2a, k 2.50>40.0I-21-3A l rl, k 24.50 > 40.011-15-2C1072a, k O ,053,0411-26-IA8 rLk O,061,48I11-26- 7A8 r2b,k >20.0 0.6gI f [-26-8C10rl , k >20.0 1-59III-26-687r l, k >20.0 1.69IV-13-3H12r 1, k>20. OO,16IV- 26-2H5r I Sk > 20.0 0.16IV-26-9C9r 1 , k > 20.0 0.211V-15-3G8 r 1, k > 20. O O, 26IV-26-7C6r 1, k>20.0 0.411V-13 -1207r2a,k>20.0 0.90IV-26-6A5r1, k >514.00 257.00 Goat anti-live CRP 1.88 >20.00 Goat anti-neo CRP 8.75 0.39* value is the maximum reaction in ELISA method. Represents 1 g of mAb required for half response.

Ｊ、ｍＡｂとＣＲＰのプロナーゼ分解フラグメントとの反応性：ｓＡｂど反応す るＣＲＰエピトープをさらに特徴付けするために、ＣＲＰは部分的にプロナーゼ で分解され、そのフラグメントはウェスタンプロット法によって多様な抗体との 反応性を評価された。限定プロナーゼ分解はゲル濾過ＦＰＬＣにおいてＳＯＳゲ ル中で分子量１６ｋＤ及び６．５ｋＤと確認しつる２つのフラグメントを生じ、 それぞれをフラグメントＡ及びフラグメントＢと呼び、それぞれ分子のアミノ末 端とカルボキシル末端を含む。フラグメン）Ａはｌ−１４６残基及び／または付 加的な分解産物で１０残基短いものからなる（本明細書中ではこの混合物を“フ ラグメントＡ”または“１−１４６残基”と呼ぶ）。フラグメントＢは１４７− ２０６残基からなる（キノシタ等、ＰＡＳ［ｉＢ　Ｊ、、　２．１１４９ａ（１ ９８８）；キノシタ等、投稿済）。J, Reactivity of mAbs with pronase-cleaved fragments of CRP: To further characterize CRP epitopes, CRP is partially mediated by pronase The fragments are then combined with various antibodies by Western blotting. Reactivity was evaluated. Limited pronase digestion is performed using SOS gel in gel filtration FPLC. Two fragments with molecular weights of 16 kD and 6.5 kD were obtained in the sample. They are called fragment A and fragment B, respectively, and are including the end and carboxyl terminus. fragment) A is the l-146 residue and/or It consists of an additional degradation product that is 10 residues shorter (this mixture is referred to herein as Fragment A" or "residues 1-146"). Fragment B is 147- Consists of 206 residues (Kinoshita et al., PAS [iB J, 2.1149a (1 988); Kinoshita et al., submitted).

３つのバンドが、プロナーゼ処理ＣＲＰのウェスタンプロットでアミドブラック で染色されて、肉眼で諺識されたく図２、レーン３）。最も遅く移動するバンド は完全なＣＲＰサブユニット（見かけの分子量２３ｋＤａ）に相当し、２番目の バンドはフラグメントＡに相当し、及び３番目のバンドはフラグメントＢに相当 する（図２、上から下へ）。その結果は、図２に示された各グループの代表的な ｍＡｂのウェスタンプロットのパターンで、表２に概説される。Three bands appear in the Western plot of pronase-treated CRP using amido black. (Figure 2, lane 3). slowest moving band corresponds to a complete CRP subunit (apparent molecular weight 23 kDa), and the second The band corresponds to fragment A, and the third band corresponds to fragment B. (Figure 2, from top to bottom). The results are representative of each group shown in Figure 2. The pattern of mAb Western plots is outlined in Table 2.

表２ 抗体　ウェスタンプロット雰 （プロナーゼ処理ＣＲＰ） 完全　フラグメント　フラグメント ■−２１−３ＡＩ　−−− ＋ｌ−１５−２Ｃ１０＋　−− ＋１ｌ−２６−７Ａ８　＋　＋　− １１１−２６−８Ｃ１０＋　＋　− ［１１−２６−６８７＋　→−− ＩＶ（３−３）１１２　＋　＋ ＩＶ−２６−２）１５　＋　＋ ＩＶ−２６−９Ｃ９＋　＋ ヤギ抗−生ＣＲＰ　−−− ヤギ抗−ネオＣＲＰ　＋　＋　＋ ５ＥＬＩＳＡ法での最大反応性に要する濃度の少なくとも５倍高い濃度でのｍＡ ｂを使用した、プロナーゼ処理ＣＲＰのウェスタンプロット／５Ｏ３−ＰＡＧＥ 測定法。Table 2 Antibody Western plot atmosphere (Pronase treated CRP) complete fragment fragment ■-21-3AI　--- +l-15-2C10+ -- +1l-26-7A8 + + - 111-26-8C10+ + - [11-26-687+ →-- IV (3-3) 112 + + IV-26-2) 15 + + IV-26-9C9+ + Goat anti-live CRP --- Goat anti-Neo CRP + + + mA at a concentration at least 5 times higher than that required for maximum reactivity in the 5ELISA method. Western plot/5O3-PAGE of pronase-treated CRP using b. Measurement method.

グループ■のｍＡｂはウェスタンプロットのどのバンドとも反応しない。グルー プＩＩのｍＡｂは、完全なＣＲＰサブユニットと反応するが、フラグメントＡま たはＢのどちらとも反応しない。グループＩＩＩのｍＡｂは、完全なＣＲＰサブ ユニット及びフラグメンｌ−Ａ　（１−１４６残基）と反応し、グループ１ｖの ｍＡｂは、完全なＣＲＰサブユニット及びフラグメントＢ　（１４７−２０６残 基）と反応する。これらの結果は、グループＩ１１及びグループＩＶのｉ＋Ａｂ をそれぞれ区別する基礎を提供する。Group ■ mAbs do not react with any bands in the Western plot. glue Fragment II mAb reacts with intact CRP subunits, but fragments A or or B. Group III mAbs are complete CRP sub- unit and fragment l-A (residues 1-146), group 1v The mAb contains the complete CRP subunit and fragment B (residues 147-206). reacts with These results demonstrate that group I11 and group IV i+Ab provide the basis for distinguishing between the two.

このように、グループＩＩのｍ八すによって認工される抗原決定基とともに、修 飾ＣＲＰ分子上に発現される少なくとも３種のエピトープ（即ち、２種のネオＣ ＲＰと１種の生ＣＲＰの抗原決定基）がある。生ＣＲＰに対するポリクローナル 抗体はＳＯＳゲル上のどのバンドとも反応しないが、ポリクローナル抗ネオＣＲ Ｐ抗体はすべての３つのバンドと反応し、これはこの後者の抗体が少なくとも２ 種の異なる抗ネオＣＲＰ特異性を含むことを強調している。Thus, along with the antigenic determinants recognized by group II m8s, At least three epitopes expressed on decorated CRP molecules (i.e., two neo-C RP and one antigenic determinant of live CRP). Polyclonal to live CRP The antibody does not react with any band on the SOS gel, but the polyclonal anti-neo CR The P antibody reacts with all three bands, indicating that this latter antibody reacts with at least two It is emphasized that different species contain different anti-neo-CRP specificities.

Ｋ、ドツトプロット法によるｍＡｂのさらなる特徴付け：　ＥＬＩ　ＳＡ法及び ウェスタンプロット法によって定義された抗−生ＣＲＰ及び抗−ネオＣＲＰｍＡ ｂのグループ分けをさらに評価するために、そのｍＡｂを、ニトロセルロース上 のドツトプロット法の連続でＣＲＰの種々の分子形態と反応させた。使用された 形態は、カルシウム存在下でＰＣ−ＫＬＩＩと結合していない生ＣＲＰ、及びポ リスチレン上への吸着なしでネオＣＲＰのエピトープを発現する試薬−修飾ＣＲ Ｐ　（尿素−ＣＲＰ及び５Ｏ３−ＣＲＰ）を含む。関連したベントラキシンＳＡ Ｐ及び血清蛋白質であるヒトＩｇＧ及びトランスフェリンを特異性コントロール として使用した。その結果を表３に示す。K. Further characterization of mAbs by dot plot method: ELI SA method and Anti-live CRP and anti-neo CRP mA defined by Western blotting To further evaluate the grouping of b, the mAbs were grown on nitrocellulose. A series of dot plots were used to react with various molecular forms of CRP. used The morphology is that of raw CRP that is not bound to PC-KLII in the presence of calcium, and Reagents to express epitopes of NeoCRP without adsorption onto Listyrene - Modified CR Contains P (urea-CRP and 5O3-CRP). Related Ventraxin SA Specificity control for P and serum proteins human IgG and transferrin used as. The results are shown in Table 3.

ＥＬＩＳＡ法のとおりに、グループＩのｍＡｂ　（１０６，８０８，３Ｇ１２． ４Ｈ２及び３Ａ１）は生ＣＲＰとのみ反応し、修飾型とは反応しなかった（表３ ）。グループＩＩのｍＡｂ　（２Ｃ１０及びＩＡ８）は、生及び修飾ＣＲＰの両 者と反応した。残りｍＡｂ（グループＩＩＩ及び［Ｖ）は尿素−または５ＯＳ− ４１飾ＣＲＰのみと反応するが、生ＣＲＰとはカルシウムの存在下または不在下 のどちらでも反応しなかった。Group I mAb (106,808,3G12. 4H2 and 3A1) reacted only with raw CRP and did not react with modified forms (Table 3 ). Group II mAbs (2C10 and IA8) target both native and modified CRP. reacted with someone. The remaining mAbs (group III and [V) are urea- or 5OS- 41 Reacts only with decorated CRP, but reacts with raw CRP in the presence or absence of calcium. Neither of them responded.

表３ 抗体０　生ＣＲＰ　５Ｏ３−ＣＲＰ　尿素−ＣＲＰ　ＣＲＰペプチド　５ＡＰＩ −２６−８０８＋　−−−−−−−−１−２２−３Ｇ１２　＋　−−−−一−− １−１−４１１２＋　−−−−−−− ＋ｌ−１５−２Ｃ１０＋　＋　＋　−−−−−−１１−２６−ＩＡ８　＋　＋　 ＋　−−−−−Ｉｉｌ−２６−７Ａ８　−　＋　＋　−−−−−＋１ｌ−２６− ８Ｃ１０−＋　＋　−−−−−１１１−２６−６Ｂ？−−１−＋　−−−−−Ｉ Ｖ−１３−３旧２−＋＋−−−＋− ＩＶ−２６−２Ｈ５＋　＋　−−−＋　−ＩＶ−２６−９Ｃ９＋　＋　−−−＋ 　−ＩＶ−１５−３Ｇ８　＋　＋　−−−＋　−ＩＶ−２６−７Ｃ６奨 ＩＶ−１３−１２０７−＋　＋　−−−−１−−ＩＶ−２６−６Ａ５ｔ ヤギ抗−生ＣＲＰ＋　−−−−−−− ヤギ抗−ネオＣＲＰ　−＋　＋　−−−−−＊　抗体は、ＥＬＩＳＡ法での最大 反応性に要する濃度の少なくとも５倍より高い濃度で使用した。Table 3 Antibody 0 Raw CRP 5O3-CRP Urea-CRP CRP peptide 5API −26-808+ −−−−−−−−1−22−3G12 + −−−−1−− 1-1-4112+ −−−−−− +l-15-2C10+ + + −−−−−−11−26−IA8 + + + −−−−−Iil-26-7A8 − + + −−−−−+1l−26− 8C10-+ +-----111-26-6B? −−1−+　−−−−−I V-13-3 old 2-++−−−+− IV-26-2H5+ + −−−+ −IV-26-9C9+ + −−−+ −IV-15-3G8 + + −−−+ −IV-26-7C6 recommended IV-13-1207-+ +----1--IV-26-6A5t Goat anti-live CRP+ ------- Goat anti-neo CRP -+ + -------* antibody has a maximum Concentrations were used at least 5 times higher than the concentration required for reactivity.

＃　グループＩＶの抗体２６−７Ｃ６及び２６−６Ａ５は、ニトロセルロースと の高いバックグラウンド反応性のため、試験することができなかった。# Group IV antibodies 26-7C6 and 26-6A5 are nitrocellulose and could not be tested due to high background reactivity.

Ｌ、１ＩＩＡｂと合成ＣＲＰペプチドとの反応性：ＣＲＰエピトープのより正確 なマツピングのために、ｍＡｂを４種の合成ＣＲＰペプチドとの反応性について 、まずドツトプロット法によって試験した。結果は表３に示される。フラグメン トＢと結合した５種のｍＡｂ　（３旧２．９Ｃ９，２Ｈ５，３６８及び１２０７ ＞は、ＣＲＰのＣ末端オクタペプチド（ペプチド４）との反応性を示した。グル ープ１ｖの他の２種のｍＡｂ　（７Ｃ６及び６Ａ５）は、バックグラウンド反応 性のためこの測定法では評価されることができなかった。ペプチド１．２及び３ は、どのｍＡｂによっても認識されなかった。Reactivity of L, 1IIAb with synthetic CRP peptides: more accurate identification of CRP epitopes The reactivity of mAbs with four synthetic CRP peptides was tested for , first tested by dot plot method. The results are shown in Table 3. Fragmen Five mAbs (3 former 2.9C9, 2H5, 368 and 1207 > indicates reactivity with C-terminal octapeptide (peptide 4) of CRP. Guru The other two mAbs (7C6 and 6A5) in loop 1v Due to their gender, they could not be evaluated using this measurement method. Peptides 1.2 and 3 was not recognized by any mAb.

さらにペプチド４の特異性を詳しく述べるために、ＥＬＩＳＡ法によって、ｍＡ ｂのＣＲＰとの結合を阻害する末端オクタペプチドの能力を評価した。ドツトプ ロット法によってペプチド４と反応するすべてのｍＡｂは、これらのＥＬＩＳＡ 法でこのペプチドによって阻害された。７Ｃ６のＣＲＰとの結合はまた、ペプチ ド４によって完全に阻害され、一方、６Ａ５の相互作用はなかった。Furthermore, to describe the specificity of peptide 4 in detail, mA The ability of the terminal octapeptide to inhibit the binding of b to CRP was evaluated. dot top All mAbs that react with peptide 4 by lot method were tested in these ELISAs. method was inhibited by this peptide. The binding of 7C6 to CRP also It was completely inhibited by 6A5, while there was no interaction with 6A5.

図３は、ペプチド４によるグループ１ｖの代表的なｍＡｂ　（３８１２）の結合 の阻害カーブ、及びペプチド１−３による阻害がないことを示す。直接の結合ま たはペプチド阻害によるｍＡｂ　６Ａ５のペプチド４との反応性を示すことの無 能力性が、真の特異性の差異または、例えば、その見かけ上のより低い力価また は低い親和性のような別の要因を反映しているかどうかは、まだはっきりしない 。Figure 3 shows the binding of a representative mAb of group 1v (3812) by peptide 4. and the lack of inhibition by peptides 1-3. direct join or or the absence of reactivity of mAb 6A5 with peptide 4 due to peptide inhibition. efficacy may be due to differences in true specificity or, e.g., to its apparent lower titer or It is not yet clear whether this reflects other factors, such as lower affinity. .

Ｍ、他の研究所から得られたヒ）ＣＲＰに対するｍＡｂの特徴付け：先に報告さ れたヒ）ＣＲＰに対するｍＡｂが他の研究所から得られ、生及び修飾ＣＲＰの両 者に対する反応性を試験した。これらは、抗−ＰＣイディオタイプ活性を欠くカ ルシウム非依存性ｍＡｂである８０２−４　、及びＥＡ４−１とＢＢ−９を含み 、この両者は抗−ＰＣＣイブイオタ４反応性を有するカルシウム依存性抗体であ る。ＥＬＩＳＡ法、ドツトプロット法及びウェスタンプロット法の結果は表４に 示される。M, H) Characterization of mAbs against CRP obtained from other laboratories: previously reported. mAbs against CRP have been obtained from other laboratories and have been used to target both raw and modified CRP. The reactivity towards people was tested. These are pathogens lacking anti-PC idiotypic activity. 802-4, which is a lucium-independent mAb, and contains EA4-1 and BB-9. Both are calcium-dependent antibodies with anti-PCC iota 4 reactivity. Ru. The results of ELISA method, dot plot method and Western plot method are shown in Table 4. shown.

ＨＯ２−４はグループＩのｍＡｂの抗−生ＣＲＰ反応性から区別できない抗−生 ＣＲＰ反応性を示し、一方、ＢＡ４−１と８８−９はグループＩＩの抗体に特有 のパターンで抗−生及び抗−ネオＣＲＰ反応性の両者を表した。HO2-4 is an antibiotic that is indistinguishable from the antibiotic CRP reactivity of group I mAbs. showed CRP reactivity, while BA4-1 and 88-9 were specific for group II antibodies. This pattern represented both anti-bio and anti-neo CRP reactivity.

表４ 他の研究所で調製された抗−ＣＲＰｍＡｂの分類抗体　イソタイプ　ＥＬＩＳＡ 　反応性０生　修飾 ＣＲＰ　ＣＲＰ ＪＥＶ−ＨＯ２−４８７−２ａ、ｋ　０．４４　＞８．８５ＲＦＭ−ＢＯ２−２ ＃　γ−１．ｋ　１２．５０　１００−００ＪＦＶ−ＥＡ４−１ｓ　ｔ−１，ｋ 　２．５　１．５抗体　ウェスタンプロット　ドツトプロット法プロナーゼ処理 ＣＲＰ 完全　Ｆｒａ　Ｆｒａ　生ＣＲＰ　Ｓ口５−ＣＲＰ　尿素−ＣＲＰサブユニット 　八８ ＪＥＶ−８口２−４貫　＝　−−＋−−ＲＰＭ−ＢＯ２−２雰　＋　−−＋＋＋ ＪＢＶ−ＥＡ４−１８　＋　−−＋　＋　＋１ロｒ、　Ｊｏｈｎ　Ｂ、Ｖｏｌａ ｎａｋｉｓとＯｒ、Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｆ、　Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎによって好意的 に提供された。Table 4 Classification of anti-CRP mAbs prepared in other laboratories Isotype ELISA Reactivity 0 raw modification CRP CRP JEV-HO2-487-2a, k 0.44>8.85RFM-BO2-2 # γ-1. k 12.50 100-00JFV-EA4-1s t-1,k 2.5 1.5 Antibody Western plot Dot plot method Pronase treatment CRP Complete Fra Fra raw CRP S mouth 5-CRP urea-CRP subunit 88 JEV-8 mouth 2-4 pieces = −−+−−RPM−BO2−2 atmosphere + −−+++ JBV-EA4-18 + −-+ + +1 r, John B, Vola Favored by nakis and Or, Richard F. Mortensen provided to.

零値は最大反応性の半分を生ずるのに要される抗体μｇ／ｍ　Ｉを示す。The zero value indicates the μg/ml of antibody required to produce half-maximal reactivity.

Ｎ、　ｍＡｂと反応するエピトープのカルシウム依存性とＰＣ阻害性：ｍＡｂの 液相ＣＲＰとの反応性に及ぼすカルシウム及びホスホリルコリン（ＰＣ）の効果 を捕捉ＥＬＩＳＡによって試験し、それで、ｍＡｂがヤギ抗マウスＩｇＧを塗布 したアッセイプレート上に固定化された時に、ビオチン化したＣＲＰと結合する ｎ＋Ａｂの能力を測定した。その結果を表５に示す。N, Calcium-dependent and PC-inhibitory properties of epitopes that react with mAb: Effect of calcium and phosphorylcholine (PC) on reactivity with liquid phase CRP was tested by capture ELISA, in which the mAb was coated with goat anti-mouse IgG. binds to biotinylated CRP when immobilized on a The potency of n+Ab was determined. The results are shown in Table 5.

表５ 抗ＣＲＰモノクローナル抗体のＣＲＰ”との反応性へのカルシウムの効果抗体　 ＣＲＰ　ＣＲＰ　変化率 （カルシウム中）　（ＥＤＴＡ中）　％Ｉ　−１５−１０６０，７５９０，２５ ８−６６％１−２６−１１１口８　０．２５３　０．２８８　＜１５％ｌ−２２ −３Ｇ１２　１．０４９　０．８１６　、−２２％１−１−４８２　０．２４８ 　０．０００　−１００％ｌ−２１−３Ａｌ　Ｏ，１９５０，８８５＋４５４％ ＪＥＶ−ＨＤ２−４　０．８８８　０．８１３　＜１５％ｌｔ−１５−２Ｃ１０ １，６２０１，４４３＜１５％１ｌ−２６−ＩＡ８　１．５４１　１．４８２　 ４５％ＪＥＶ−ＥＡ４−１　０．９１８　＜０．００２　−１００％ＩＩ＋−２ ６−７Ａ８　０．０１８　０．０２２＋１ｌ−２６−８Ｃ１００，００７０，０ ０２ＩＩＩ−２６−６８７０，０６２０，０６９ＩＶ（３−３）１１２　＜０． ００２　０．００８ＩＶ−２６−２Ｈ５＜０．００２　０．０１７ＩＶ−２６− ９Ｃ９０，０３３０，００２ＩＶ−１５−３Ｇ８　０．０１５　０．０１１１Ｖ −２６−７Ｃ６＜０．００２　＜０．００２ＩＶ−１３−１２０７＜０．００２ 　＜０．００２ＩＶ−２６−６Ａ５　＜０．００２　＜０．００２本〇、　００ ２Ｍ　ＣａＣＩｚまたは０．００５Ｍ　ｉＥ［ｌＴＡの存在下でのビオチン化Ｃ ＲＰとのポリスチレン−固定化ｍＡｂの反応性。値は、ビオチン化ＣＲＰとの最 大結合の半分を示す。＋Ａｂの濃度でのＡ４１４を表す。Table 5 Effect of calcium on the reactivity of anti-CRP monoclonal antibody with CRP CRP CRP change rate (in calcium) (in EDTA) %I -15-1060,7590,25 8-66% 1-26-111 mouth 8 0.253 0.288 <15% l-22 -3G12 1.049 0.816, -22% 1-1-482 0.248 0.000 -100% l-21-3Al O, 1950, 885+454% JEV-HD2-4 0.888 0.813 <15%lt-15-2C10 1,6201,443<15%1l-26-IA8 1.541 1.482 45%JEV-EA4-1 0.918 <0.002 -100%II+-2 6-7A8 0.018 0.022+1l-26-8C100,0070,0 02III-26-6870, 0620, 069IV (3-3) 112 <0. 002 0.008IV-26-2H5<0.002 0.017IV-26- 9C90,0330,002IV-15-3G8 0.015 0.0111V -26-7C6<0.002<0.002IV-13-1207<0.002 <0.002IV-26-6A5 <0.002 <0.002 pieces〇, 00 Biotinylated C in the presence of 2M CaCIz or 0.005M iE[lTA Reactivity of polystyrene-immobilized mAbs with RP. Values are the highest with biotinylated CRP. Showing half of the large bond. Represents A414 at a concentration of +Ab.

グループ■及びグループ＋１の抗−生ＣＲＰｍＡｂのすべては、カルシウムの存 在下で液相ＣＲＰと結合した。しかしながら、これらの抗体の殆どとＣＲＰの反 応性はカルシウムの濃度によって有意に影響を受けていた。グループ■抗体の３ 種の抗体のＣＲＰとの反応性は、ＢＤＴＡの存在で減ぜられ（４Ｈ２，１０６及 び３Ｇ１２でそれぞれ、１００％、６２％及び２２％）　、３Ａ１のそれはおよ そ４倍強められ、８０８のそれはほとんど影響されなかった（＜１５％変化）。All of the group ■ and group +1 antibiotic CRP mAbs In the presence of liquid phase CRP. However, most of these antibodies are anti-CRP. The response was significantly influenced by the concentration of calcium. Group ■Antibody 3 The reactivity of species antibodies with CRP is reduced in the presence of BDTA (4H2,106 and and 3G12 (100%, 62% and 22%, respectively), and that of 3A1 is approximately It was strengthened by a factor of 4, and that of 808 was hardly affected (<15% change).

グループＩ抗体の４種はそれゆえ、カルシウム依存性またはカルシウム感化性エ ピトープとして記載されうる。グループ１１の抗体２Ｃ１０及びＩＡ８の結合は 、ＥＤＴＡの存在下でＣＲＰと反応させた時に有意には変化しなかった。先に報 告したカルシウム非依存性ｍＡｂのＨＯ２−４及びカルシウム依存性ｍＡｂのＢ Ａ４−１の反応性は比較のために示されている。グループＩ１１またはグループ Ｉｖのいずれかからの抗−ネオＣＲＰｍＡｂは、どれも、カルシウムまたはＥＤ ＴＡのいずれかの存在下でも液相のＣＲＰと結合できなかった。The four group I antibodies are therefore calcium-dependent or calcium-sensitive antibodies. May be described as a pitope. The binding of group 11 antibodies 2C10 and IA8 is , did not change significantly when reacted with CRP in the presence of EDTA. report first HO2-4 for the calcium-independent mAb and B for the calcium-dependent mAb The reactivity of A4-1 is shown for comparison. Group I11 or Group None of the anti-neo-CRP mAbs from either calcium or ED It was not possible to bind to liquid phase CRP in the presence of either TA.

カルシウムの存在下でのグループＩ及びグループ！１のｍＡｂとＣＲＰとの相互 作用を、ＰＣによる阻害性で試験した。図４は代表的なｍＡｂを使用した阻害デ ータを示す。この紙上で報告されたｍＡｂのうち、ｍＡｂ　４Ｈ２だけが上記に 利用された測定で完全なカルシウム依存性を示し、かつＰＣによって阻害された 。比較のために試験された既知のＰＣ−阻害性ｍＡｂであるｍＡｂ　ＥＡ４−１ の反応性は、同様にＰＣによって阻害された。Group I and Group in the presence of calcium! Mutual interaction between mAb 1 and CRP The effect was tested by inhibition by PC. Figure 4 shows inhibition tests using representative mAbs. shows the data. Of the mAbs reported in this paper, only mAb 4H2 is listed above. showed complete calcium dependence in the measurements utilized and was inhibited by PC . mAb EA4-1, a known PC-inhibiting mAb tested for comparison reactivity was similarly inhibited by PC.

０、ウサギＣＲＰとＳＡＰとの交叉反応性二アミノ酸配列のデータが、異なる種 のＣ反応性蛋白質間の高度に維持された相同を確認する以前に、血清学的な証拠 が異なる種のＣ反応性蛋白質間の拡張された免疫学的交叉反応性を示していた。0. Data on the cross-reactive diamino acid sequences of rabbit CRP and SAP are from different species. Previous serological evidence confirmed the highly conserved homology between the C-reactive proteins of showed extended immunological cross-reactivity between C-reactive proteins of different species.

ヒ）ＣＲＰに対するある種の抗血清が、ウサギ、サル、鶏、犬、馬、マウス、モ ルモット及びビラットの急性期血清蛋白質と交叉反応した＜Ｂａ１ｔｚ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　２７３．４９（１９ ８２）で検討されている）。エルシン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）は比較オフタロニー法 を使用して、ヒトＣＲＰ上の３種の抗原決定基を同定した：１つはヒ）ＣＲＰ上 にのみ見出される抗原決定基；１つはヒト及びサルのＣＲＰに見出さね、ウサギ のＣＲＰ上にはない：及び１つはヒト、ウサギ及びウサギの蛋白質にともにある 。エルシン（Ｎ　ｉ　ｌ５ｓｏｎ）。h) Certain antisera against CRP have been shown to be effective in rabbits, monkeys, chickens, dogs, horses, mice, and mice. <Ba1tz et> cross-reacted with acute phase serum proteins of Lumotte and Virat. al,, Ann, N, Y, Acad, Sci, 273.49 (19 82)). Nilsson is a comparative ophthalony method. have been used to identify three antigenic determinants on human CRP: one on human CRP; antigenic determinants found only in human and monkey CRP; one in rabbit Not on CRP: and one on both human, rabbit and rabbit proteins . Elsin (Ni l5son).

反応するが、生ＣＲＰと反応しないポリクロナール抗体、抗原決定基が修飾ウサ ギＣＲＰと反応することを示している。A polyclonal antibody that reacts with live CRP but does not react with live CRP, a rabbit with modified antigenic determinants. It has been shown that it reacts with CRP.

本明細書中に記載される幾つかのｍＡｂｓは、ヒト生−及びネオーＣＲＰエビ） 　−プとの反応性に選択されるが、ウサギＣＲＰとの幾らかの交叉反応性を示し た。Some of the mAbs described herein are related to human live- and neo-CRP (shrimp). - selected for its reactivity with CRP, but showed some cross-reactivity with rabbit CRP. Ta.

選ばれたｍＡｂでの予備研究は、グループ］のｍＡｂである８０８が化ウサギＣ ＲＰと交叉反応することを示した。他のグループｌの特異性（例えば、１０６及 び４■２）はヒ１−ＣＲＰにのみ向けられていた。抗ネオＣＲＰ反応性を有する グループＩＩ、ＩＩ］及びＩＶのｒａＡｂ（２Ｃ１Ｏ１６Ｂ？　、７Ａ８．３Ｈ １２及び９Ｃ９が試験された）は、適当なＥＬＩＳＡ法及びウェスタンプロット 法において修飾ウサギＣＲＰと有意に交叉反応し、これは抗−ネオＣＲＰｍＡｂ が一般的にＣ反応性蛋白質の系統発生の調査に有用であるかもしれないことを示 唆している。さらに、試験されたグループＩｌｌ及びＩＶのｍＡｂは、ヒトＣＲ Ｐと同様にウサギＣＲＰのプロナーゼで生じるフラグメントに同じようにマツピ ングした。Preliminary studies with selected mAbs have shown that the group's mAb 808 was synthesized from rabbit C. It was shown to cross-react with RP. Other group l specificities (e.g. 106 and and 4.2) were directed only to Hi-1-CRP. Has anti-neo CRP reactivity group II, II] and IV raAb (2C1O16B?, 7A8.3H 12 and 9C9) were tested using the appropriate ELISA method and Western blot. The anti-neo-CRP mAb significantly cross-reacted with modified rabbit CRP in the assay. may be useful for investigating the phylogeny of C-reactive proteins in general. is suggesting. Furthermore, the tested group Ill and IV mAbs Similarly to P, the fragment generated by pronase of rabbit CRP is I nged.

ヒ）ＣＲＰとヒ）ＳＡＰの間の高度な相同度にもかかわらず（Ｏｓａｌａｎｄ　 ｅｔ　ａｌ、。Despite the high degree of homology between h) CRP and h) SAP (Osaland et al.

中に記載されるｍＡｂのどれもＳＡＰとは反応しなかった。同様の交叉反応性の 欠落が、これらの分子に対して産されたポリクローナル抗体でも報告されている （ＭａｕｄｓｌｅｙとＰｅｐｙｓ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６２．１７（１９ ８７））　ｏしかしながら、本明細書中で記載される結果は、使用された免疫感 作及びスクリーニング操作に阿定される。None of the mAbs described therein reacted with SAP. Similar cross-reactivity Deficiencies have also been reported in polyclonal antibodies raised against these molecules. (Maudsley and Pepys, Immunology, 62.17 (19 87)) o However, the results described herein are The production and screening operations are determined.

Ｐ、結果の概要：本明細書中のｍＡｂは観察された反応性に基づいて４つのグル ープに分類された。すべての抗−生ヒ）ＣＲＰｍＡｂ　（グループＩとＩＩ）は 、カルシウム存在下でリガンド会合−及び遊離の（即ち、生の）ＣＲ，Ｐの両者 との反応性を示した。しかしながら、グループＩの抗−生ＣＲＰｉＡｂは、カル シウム不在下では修飾ＣＲＰとは反応せず、５ＯＳ−ＰＡＧＥではＣＲＰサブユ ニットを検出しなかった。グループＩ＋のｍＡｂは、カルシウム不在下でネオＣ ＲＰ抗原決定基との、減じられてはいるが有意な反応性を示し、５ＯＳ−ＰＡＧ Ｅでは容易にＣＲＰサブユニットを検出した。グループＩＩＩ及びＩＶのｍＡｂ はカルシウム存在下でも不在下でも生ＣＲＰと反応しなかったが、ＣＲＰの修飾 型とは強く反応した。これらの結果はグループＩのＩＩＩＡｂによって認識され るエピトープがアミノ酸配列の中で高次で、かつ不連続的であり、一方、グルー プ１１．目■及びＩＶのｍＡｂによって認識されるエピトープがおそらく、その 分子がある種の他の方法で開かれるか、または修飾されるまでは、暴露されたり 、発現されたりしない連続的なアミノ酸配列を含むことを示唆している。P. Summary of Results: The mAbs herein were classified into four groups based on observed reactivity. group. All anti-viral CRP mAbs (groups I and II) , both ligand-associated and free (i.e. raw) CR,P in the presence of calcium. showed reactivity with However, group I antibiotic CRPiAbs In the absence of C, it does not react with modified CRP, and in 5OS-PAGE, the CRP subunit No knit was detected. Group I+ mAbs have neoC in the absence of calcium. 5OS-PAG showed reduced but significant reactivity with RP antigenic determinants. CRP subunits were easily detected in E. Group III and IV mAbs did not react with raw CRP in the presence or absence of calcium, but the modification of CRP There was a strong reaction to the mold. These results were recognized by Group I IIIAb. epitopes are higher-order and discontinuous in the amino acid sequence; 11. It is likely that the epitopes recognized by the mAbs of eyes ■ and IV are Until the molecule is opened or modified in some other way, it cannot be exposed or , suggesting that it contains a contiguous amino acid sequence that may or may not be expressed.

ＣＲＰは１つのサブユニットに１または２のカルシウム結合部位を有するカルカ ルシウム−依存性、ＰＣ−阻害性、並びにカルシウム−非依存性のｍＡｂ反応性 を記載したボラナキス（Ｖｏ　１ａｎａｋ　ｉｓ）とその同僚によって示された （　Ｋｉ　１ｐａｔｏｒｉｃｋ　ｅｔａｌ、、Ｍｏ１ｅｃ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 １９．　１１５９（１９８２）　；Ｖｏｌａｎａｋｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂ ＸＰ、Ｍｅｄ、、P５３．ユ １６０４　（１９８１）を参照）。抗−生ＣＲＰｍＡｂによるエピトープ認識へ のカルシウムの影響を明確にする本発明者らの捕捉測定法は、カルシウム依存性 の２つの型を同定した。それらはカルシウム存在下で増強される反応性及びＥＤ ＴＡ存在下で増強される反応性である。重要なことは、本明細書中で記載される ｍＡｂとの反応性に関与するカルシウム感化性エピトープのすべてが、生ＣＲＰ 抗原決定基であり、ネオＣＲＰ抗原決定基ではなく、かつグループＩに指定され るｍＡｂと反応するという事実である。しかしながら、５種のグループＩ抗体の うち１種及びグループＩＩの２種の抗体は、カルシウムの存在または不在によっ て影響されないエピトープと反応した。最も強いカルシウムへの依存性を表すＩ ｎＡｂ　（４Ｎ２）はまた、ＰＣによって阻害され、これは、Ｋ１１ｐａｔｏｒ ｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、Ｊｏｌｅｃ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１９．１１５９（１ ９８２）に記載されたｍＡｂのように、このｍＡｂがＣＲＰのＰＣ−結合部位と の“抗イデイオタイプ”反応性を有することを示唆している。CRP is a calcium binding site with one or two calcium binding sites per subunit. Lucium-dependent, PC-inhibitory, and calcium-independent mAb reactivity was shown by Voranakis and his colleagues who described (Ki1patorick etal, Mo1ec, Immunol, 19. 1159 (1982); Volanakis et al, J, B XP, Med,, P53. Yu 1604 (1981)). Epitope recognition by anti-live CRP mAb Our scavenging measurement method clarifies the influence of calcium on calcium-dependent We identified two types of . They have enhanced reactivity and ED in the presence of calcium. The reactivity is enhanced in the presence of TA. Importantly, as described herein All of the calcium-sensitive epitopes involved in mAb reactivity are present in raw CRP. is an antigenic determinant, is not a neo-CRP antigenic determinant, and is designated as Group I. The fact is that it reacts with mAbs. However, the five group I antibodies One of these and two of Group II antibodies are sensitive to the presence or absence of calcium. reacted with an unaffected epitope. I represents the strongest dependence on calcium nAb (4N2) was also inhibited by PC, which was associated with K11pator ick et al, Jolec, Immunol, 19.1159 (1 982), this mAb interacts with the PC-binding site of CRP. It has been suggested that it has "anti-idiotypic" reactivity.

本発明者らのｍＡｂのデータの概要は、生ヒ１−ＣＲＰ上にグループ■のｍＡｂ によって検出可能な少なくとも４種のエピトープがあることを示唆していて、そ れらは、１　）　ｍＡｂ　４ｆ１２によって同定されるカルシウム依存性、ＰＣ −阻害性イディオトーブ；　２）　ｍＡｂ　１０６によって同定されるカルシウ ム依存性、非−ＰＣ−阻害性エピトーブ：　３）　ｍＡｂ　３Ａ１によって同定 されるカルシウム依存性、ＥＤＴＡ−増強性エピトーブ；及び４）ウサギＣＲＰ との独特の交叉反応性をまた示す、ｍＡｂ　８０８によって同定されるカルシウ ム非依存性エピトープである。グループＩＩのｍＡｂ（即ち、２Ｃ１０及びＩＡ ８）は５番目の生ＣＲＰエピトープを認識し、それは他の４種とはちがって、種 々の処理によってその分子が変化しながら保持される。A summary of our mAb data shows that mAbs of group This suggests that there are at least four types of epitopes that can be detected by These are: 1) calcium-dependent, PC identified by mAb 4f12; - Inhibitory idiotobes; 2) Calcium identified by mAb 106; 3) Identified by mAb 3A1 and 4) rabbit CRP Calcium, identified by mAb 808, also shows unique cross-reactivity with It is a mu-independent epitope. Group II mAbs (i.e. 2C10 and IA 8) recognizes the fifth raw CRP epitope, which, unlike the other four, is unique to species. The molecules are retained while being changed by various treatments.

ネオＣＲＰエピトープは、カルシウム不在下、プラスチック上での固定化、尿素 またはＳＤＳ処理またはプロナーゼでの限定的分解によって修飾されたＣＲＰを 使用して規定され、さらに合成ＣＲＰペプチドを利用して位置付けされた。ネオ ＣＲＰエピトープ発現は、先の研究にふいて主として、カルシウムの不在下でラ ムの存在下、または不在下でのポリスチレンＥＬＩＳＡプレート上のＣＲＰの固 定化は抗ネオＣＲＰエピトープの同等の発現を生じた。加えて、抗体捕捉測定は 、液相ＣＲＰのキレート化単独ではネオＣＲＰエピトープ発現をもたらさないこ とを示す。カルシウムの不在は、例えば、尿素、熱及びプロテアーゼ処理のよう なネオＣＲＰエピトープがさらされる修飾を助けるが、ネオＣＲＰの発現自体は カルシウムの存在、または不在のいずれにも依存しないようである。Neo-CRP epitopes were immobilized on plastic in the absence of calcium, urea or CRP modified by SDS treatment or limited degradation with pronase. was further defined using synthetic CRP peptides and localized using synthetic CRP peptides. Neo CRP epitope expression was primarily observed in the absence of calcium in line with previous studies. Immobilization of CRP on polystyrene ELISA plates in the presence or absence of Standardization resulted in equivalent expression of anti-neo CRP epitopes. In addition, antibody capture measurements , chelation of fluid-phase CRP alone does not result in neo-CRP epitope expression. and Absence of calcium can be caused by, for example, urea, heat and protease treatments. neo-CRP epitopes are exposed, but neo-CRP expression itself It appears to be independent of either the presence or absence of calcium.

カルシウムの存在下で液相またはＰＣ−結合ＣＲＰ上に発現されないが、尿素− 及び５ＯＳ−修飾ＣＲＰによって発現されるネオＣＲＰエピトープに対する抗体 は、ウェスタンプロット法において、ＣＲＰのＣＲＰサブユニット及びプロナー ゼで発生するフラグメントと反応する。グループＩＩ＋の抗ネオＣＲＰ反応性は ＣＲＰサブユニットの１−１４６残基（プロナーゼ分解のフラグメン）Ａ）に局 在していて、グループＩＶのｍＡｂの反応性はＣＲＰサブユニットの１４７−２ ０６残基（プロナーゼ分解のフラグメントＢ）に局在していて、かつ主にＣＲＰ のＣ末端オクタペプチドに局在している。このデータは、修飾ＣＲＰコンホメー ション上にのみ発現される最も少なくても２種のネオＣＲＰエピトープと、生Ｃ ＲＰ上に見られる、種々の修飾後に保持される少なくとも１種のエピトープがあ ることをｍＡｂの研究は、グループ■及びＩＩの抗−生ＣＲＰｍＡｂ　（１０６ ，８０８及び２Ｃ１０）は急性期血清のＣＲＰを〉８μｇ／ｍｌの濃度で検出す ることができることを示す。is not expressed on liquid phase or PC-bound CRP in the presence of calcium, but urea- and antibodies against neo-CRP epitopes expressed by 5OS-modified CRP. In the Western blot method, the CRP subunit and pronar of CRP reacts with the fragments generated in the enzyme. Group II+ anti-neo CRP reactivity is Localized to residues 1-146 of CRP subunit (fragment for pronase degradation) A) The reactivity of group IV mAbs is 147-2 of the CRP subunit. 06 residue (fragment B of pronase degradation) and is mainly localized to CRP localized to the C-terminal octapeptide of This data is based on the modified CRP conformation. at least two neo-CRP epitopes expressed only on There is at least one epitope found on RP that is retained after various modifications. mAb studies have shown that group II and II antibiotic CRP mAbs (106 , 808 and 2C10) detect CRP in acute phase serum at concentrations >8 μg/ml. Show that you can.

血清の少数（１５患者）かつ無作為なサンプリングにおいては、グループＩ１１ または１ｖからの抗−ネオＣＲＰｍＡｂとの有意な相互作用は見られなかった。In a small (15 patients) and random sampling of sera, group I11 No significant interaction with anti-neo-CRP mAb from 1v or 1v was seen.

ｍＡｂ　２Ｃ１０での結果は、Ｐｏｔｅｍｐａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃ、 　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　２４．５３Ｈ１９８７）による急性期血清にふける抗− ネオＣＲＰ反応性の報告が、ポリクローナル試薬中でのグループＩＩ型の特異性 を有する抗体、即ち、修飾された形態で維持される生ＣＲＰエピトープによるこ と、及び新しく発現されたネオＣＲＰ抗原決定基を表示してはいないことを示唆 している。Results with mAb 2C10 are from Potempa et al, Molec, Immunol, 24.53H1987) indulging in acute phase serum Reports of neo-CRP reactivity demonstrate group II type specificity in polyclonal reagents. This can be achieved by antibodies with a native CRP epitope maintained in a modified form. and, suggesting that it does not display newly expressed neo-CRP antigenic determinants. are doing.

実施例４：免疫組織化学的測定法 研究はまた、ＣＲＰの免疫組織化学的局在限定へのこれらのｍＡｂの応用を確認 している。代表的な抗−ネオＣＲＰｉＡｂ　（８Ｃ１０及び３Ｈ１２）並びに抗 −生ＣＲＰｍＡｂ（１０６及び８０８）は、ある種のヒト肝臓標本の凍結切片と 反応し、これは生ＣＲＰ及びネオＣＲＰ特異性の両者が自然に発生することを示 唆している。Example 4: Immunohistochemical assay Studies also confirm the application of these mAbs to localize immunohistochemical localization of CRP. are doing. Representative anti-neo CRPiAbs (8C10 and 3H12) and - Live CRP mAbs (106 and 808) were tested on frozen sections of certain human liver specimens. This indicates that both native CRP and neo-CRP specificity occur naturally. is suggesting.

本発明者らは、生体内でネオＣＲＰエピトープを同定するために、及びＣＲＰ分 子の補体−及び細胞−活性化特性の構造−機能マツピングに、本明細中で規定さ れるｍＡｂが重要な道具になるであろうと予測する。In order to identify neo-CRP epitopes in vivo, we The structure-function mapping of the complement- and cell-activating properties of the child as defined herein. We predict that mAbs that will be developed in the future will become important tools.

ハイブリドーマの寄託： ４種のハイブリドーマ、４グループのそれぞれから好ましい１種が、アメリカン タイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に１９８９年６月２９日に寄託され た。その４種とは： 本明細書中で使用される　ＡＴＣＣ 呼称　受理番号 １−１５−１０６　ＤＢ　１０１７８ ＋ｌ−１５−２Ｃ１０Ｈａ　１０１７５１１１−２６−８Ｃ１０Ｈｅ　１０１７ ６ＩＶ−１３−３Ｈ１２）１８１０１７７である。Hybridoma deposit: Four types of hybridomas, one preferred type from each of the four groups is American Deposited in the Type Culture Collection (ATCC) on June 29, 1989. Ta. The four types are: ATCC as used herein Name Receipt number 1-15-106 DB 10178 +l-15-2C10Ha 10175111-26-8C10He 1017 6IV-13-3H12) 1810177.

ＦＩＧ、２ ペプチド　人９７ｍ１ １０−７　１０−６　１０−５　１０−４　ｌｏ−３ＰＣ（Ｍ） ＦＩＧ、４ 国際調査報告 力合衆国　イリノイ州　６００１５　ディアフイールド　モントブレイス　７１ ３FIG.2 Peptide person 97m1 10-7 10-6 10-5 10-4 lo-3PC (M) FIG.4 international search report United States Illinois 60015 Deerfield Montbrace 71 3

Claims (17)

【特許請求の範囲】[Claims] １．Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）に対するモノクローナル抗体であって、（ａ）生 ヒトＣＲＰと反応し； （ｂ）修飾ヒトＣＲＰと反応せず； （ｃ）完全ヒトＣＲＰサブユニットと反応せず；（ｄ）プロナーゼ分解ヒトＣＲ ＰのフラグメントＡと反応せず；（ｅ）プロナーゼ分解ヒトＣＲＰのフラグメン トＢと反応せず；（ｆ）ＣＲＰペプチド１、２、３または４と反応せず：及び（ ｇ）血清アミロイドＰ成分と反応しないという特異性を有するモノクローナル抗 体。1. A monoclonal antibody against C-reactive protein (CRP), comprising: Reacts with human CRP; (b) does not react with modified human CRP; (c) does not react with fully human CRP subunits; (d) pronase-degraded human CR Does not react with fragment A of P; (e) Fragment of pronase-degraded human CRP (f) Does not react with CRP peptide 1, 2, 3 or 4: and ( g) A monoclonal antibody that has the specificity of not reacting with serum amyloid P component. body. ２．請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体であって、さらに生ヒトＣＲＰ 上のカルシウムー依存性エピトープを認識するという特異性を有するモノクロー ナル抗体。2. The monoclonal antibody according to claim 1, further comprising live human CRP. A monoclonal protein with the specificity of recognizing calcium-dependent epitopes on null antibody. ３．請求の範囲第２項記載のモノクローナル抗体であって、さらに生ヒトＣＲＰ とのその反応性がホスホリルコリンによって阻害されるという特異性を有するモ ノクローナル抗体。3. The monoclonal antibody according to claim 2, further comprising live human CRP. A model with the specificity that its reactivity with phosphorylcholine is inhibited by phosphorylcholine. Noclonal antibodies. ４．請求の範囲第２項記載のモノクローナル抗体であって、さらに生ヒトＣＲＰ とのその反応性がホスホリルコリンによって阻害されないという特異性を有する モノクローナル抗体。4. The monoclonal antibody according to claim 2, further comprising live human CRP. It has the specificity that its reactivity with phosphorylcholine is not inhibited by phosphorylcholine. Monoclonal antibodies. ５．請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体であって、さらに生ヒトＣＲＰ 上のカルシウムー感化性、ＥＤＴＡ−増強性エピトープを認識するという特異性 を有するモノクローナル抗体。5. The monoclonal antibody according to claim 1, further comprising live human CRP. specificity in recognizing calcium-sensitive, EDTA-enhancing epitopes on A monoclonal antibody with ６．請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体であって、さらに生ヒトＣＲＰ 上のカルシウム−発依存性エピトープを認識し、かつ生ウサギＣＲＰと反応する という特異性を有するモノクローナル抗体。6. The monoclonal antibody according to claim 1, further comprising live human CRP. recognizes the above calcium-dependent epitope and reacts with live rabbit CRP. A monoclonal antibody with the specificity of ７．Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）に対するモノクローナル抗体であって、（ａ）生 ヒトＣＲＰと反応し； （ｂ）修飾ヒトＣＲＰと反応し； （ｃ）完全ヒトＣＲＰサブユニットと反応し；（ｄ）プロナーゼ分解ヒトＣＲＰ のフラグメントＡと反応せず；（ｅ）プロナーゼ分解ヒトＣＲＰのフラグメント Ｂと反応せず；（ｆ）生ヒトＣＲＰ上のカルシウムー非依存性エピトープを認識 し；（ｇ）生ヒトＣＲＰとのその反応性がホスホリルコリンによって阻害されず ；（ｈ）ＣＲＰペプチド１、２、３または４と反応せず；（ｉ）修飾ウサギＣＲ Ｐと反応し；及び（ｊ）血清アミロイドＰ成分と反応しないという特異性を有す るモノクローナル抗体。7. A monoclonal antibody against C-reactive protein (CRP), comprising: Reacts with human CRP; (b) reacting with modified human CRP; (c) reacts with fully human CRP subunits; (d) pronase-degraded human CRP; (e) Fragment of pronase-degraded human CRP Does not react with B; (f) Recognizes calcium-independent epitope on live human CRP (g) its reactivity with live human CRP is not inhibited by phosphorylcholine; (h) does not react with CRP peptide 1, 2, 3 or 4; (i) modified rabbit CR and (j) have the specificity of not reacting with serum amyloid P component. monoclonal antibody. ８．Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）に対するモノクローナル抗体であって、（ａ）生 ヒトＣＲＰと反応せず； （ｂ）修飾ヒトＣＲＰと反応し； （ｃ）完全ヒトＣＲＰサブユニットと反応し；（ｄ）プロナーゼ分解ヒトＣＲＰ のフラグメントＡと反応し；（ｅ）プロナーゼ分解ヒトＣＲＰのフラグメントＢ と反応せず；（ｆ）ＣＲＰペプチド１、２、３または４と反応せず；（ｇ）カル シウムの存在下または不在下で、液相生ヒトＣＲＰと結合できず；及び （ｈ）血清アミロイドＰ成分と反応しないという特異性を有するモノクローナル 抗体。8. A monoclonal antibody against C-reactive protein (CRP), comprising: Does not react with human CRP; (b) reacting with modified human CRP; (c) reacts with fully human CRP subunits; (d) pronase-degraded human CRP; (e) fragment B of pronase-digested human CRP; (f) Does not react with CRP peptide 1, 2, 3 or 4; (g) Cal unable to bind to liquid-living human CRP in the presence or absence of Sium; and (h) Monoclonal that has the specificity of not reacting with serum amyloid P component antibody. ９．請求の範囲第８項記載のモノクローナル抗体であって、さらに、 （ｉ）修飾ウサギＣＲＰと反応し； （ｊ）完全なウサギＣＲＰサブユニットと反応し；（ｋ）プロナーゼ分解ウサギ ＣＲＰのフラグメントＡと反応し；及び（ｌ）プロナーゼ分解ウサギＣＲＰのフ ラグメントＢと反応しないという特異性を有するモノクローナル抗体9. The monoclonal antibody according to claim 8, further comprising: (i) reacting with modified rabbit CRP; (j) reacts with intact rabbit CRP subunit; (k) pronase-degraded rabbit reacts with fragment A of CRP; and (l) pronase-degraded fragment A of rabbit CRP. Monoclonal antibody that has the specificity of not reacting with fragment B １０．Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）に対するモノクローナル抗体であって、（ａ） 生ヒトＣＲＰと反応せず； （ｂ）修飾ヒトＣＲＰと反応し； （ｃ）完全ヒトＣＲＰサブユニットと反応し；（ｄ）プロナーゼ分解ヒトＣＲＰ のフラグメントＡと反応せず；（ｅ）プロナーゼ分解ヒトＣＲＰのフラグメント Ｂと反応し；（ｆ）ＣＲＰペプチド１、２または３と反応せず；（ｇ）カルシウ ムの存在下または不在下で、液相生ヒトＣＲＰと結合できず；及び （ｈ）血清アミロイドＰ成分と反応しないという特異性を有するモノクローナル 抗体。10. A monoclonal antibody against C-reactive protein (CRP), comprising (a) Does not react with live human CRP; (b) reacting with modified human CRP; (c) reacts with fully human CRP subunits; (d) pronase-degraded human CRP; (e) Fragment of pronase-degraded human CRP (f) does not react with CRP peptide 1, 2 or 3; (g) calcium incapable of binding to liquid-living human CRP in the presence or absence of a protein; and (h) Monoclonal that has the specificity of not reacting with serum amyloid P component antibody. １１．請求の範囲第１０項記載のモノクローナル抗体であって、さらに、 （ｉ）修飾ウサギＣＲＰと反応し： （ｊ）完全なウサギＣＲＰサブユニットと反応し；（ｋ）プロナーゼ分解ウサギ ＣＲＰのフラグメントＡと反応せず；及び（ｌ）プロナーゼ分解ウサギＣＲＰの フラグメントＢと反応するという特異性を有するモノクローナル抗体。11. The monoclonal antibody according to claim 10, further comprising: (i) React with modified rabbit CRP: (j) reacts with intact rabbit CRP subunit; (k) pronase-degraded rabbit does not react with fragment A of CRP; and (l) pronase-degraded rabbit CRP. A monoclonal antibody that has the specificity of reacting with fragment B. １２．請求の範囲第１０項記載のモノクローナル抗体であって、さらにＣＲＰペ プチド４と反応するという特異性を有するモノクローナル抗体。12. The monoclonal antibody according to claim 10, further comprising a CRP protein. A monoclonal antibody that has the specificity of reacting with peptide-4. １３．請求の範囲第１項から第１２項記載のいずれか１項に記載のモノクローナ ル抗体を産生することができるハイプリドーマ。13. Monoclonal according to any one of claims 1 to 12 A hybridoma that can produce antibodies. １４．生Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）の免疫学的検定法であって、生ＣＲＰを含有 する試料を請求の範囲第１項から第７項のいずれか１項に記載されたモノクロー ナル抗体と接触させることを含む免疫学的検定法。14. An immunoassay for live C-reactive protein (CRP), comprising live CRP. A monochrome sample according to any one of claims 1 to 7. An immunoassay method comprising contacting with a null antibody. １５．修飾Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）の免疫学的検定法であって、修飾ＣＲＰを 含有する試料を請求の範囲第８項から第１２項のいずれか１項に記載されたモノ クローナル抗体と接触させることを含む免疫学的検定法。15. An immunoassay for modified C-reactive protein (CRP), the method comprising: The sample containing the product described in any one of claims 8 to 12 An immunoassay comprising contacting with a clonal antibody. １６．生Ｃ反応性蛋白質の免疫学的検定法を実施するためのキットであって、請 求の範囲第１項から第７項のいずれか１項に記載されたモノクローナル抗体の容 器を含むキット。16. A kit for carrying out an immunoassay method for live C-reactive protein, comprising: The content of the monoclonal antibody described in any one of Items 1 to 7 Kit including equipment. １７．修飾Ｃ反応性蛋白質の免疫学的検定法を実施するためのキットであって、 請求の範囲第８項から第１２項のいずれか１項に記載されたモノクローナル抗体 の容器を含むキット。17. A kit for carrying out an immunoassay method for modified C-reactive protein, the kit comprising: Monoclonal antibody according to any one of claims 8 to 12 Kit containing containers.