JPH04505709A - oligomeric immunoglobulin - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 ２７、前記モノマー抗体が前記細胞系列によって分泌される抗体の少なくとも約 ５０％を構成する請求の範ｖＩＪ２６記載の細胞系列。[Detailed description of the invention] 27, wherein said monomeric antibody is at least about the amount of antibody secreted by said cell lineage; 50% of the cell line according to claim vIJ26.
２８、前記オリゴマー抗体が分泌される抗体の約１０〜１５％を構成する請求の 範囲２７記載の細胞系列。28, wherein said oligomeric antibodies constitute about 10-15% of the secreted antibodies. Cell line according to range 27.
２９、結合してオリゴマー抗体を形成するモノマー免疫グロブリンの免疫グロブ リン軽鎖の１つまたは両方が実質的に重複する可変領域を育する請求の範囲２６ 記載の細胞系列。29. Immunoglobulins of monomeric immunoglobulins that combine to form oligomeric antibodies Claim 26 wherein one or both of the phosphorus light chains harbor substantially overlapping variable regions. Cell lineages listed.
３０、実質的に軽鎖の全可変領域が重複している請求の範囲２９記載の細胞系列 。30. The cell line according to claim 29, wherein substantially all variable regions of the light chains overlap. .
３１、実質的にＡＴＣＣＮｏ、 ＣＲＬ １０２９３の特徴を育する抗体を産生 ずる細胞系列。31, produces antibodies that substantially develop the characteristics of ATCC No. CRL 10293 Zuru cell lineage.
３２、 ＡＴＣＣＮｏ、 ＣＲＬ １０２９３である請求の範囲３１記載の細胞 系列。32, ATCC No. CRL 10293. series.
３３、請求の範囲３１記載の細胞系列によって産生されるオリゴマーＩｇＧモノ クローナル抗体。33, oligomeric IgG mono produced by the cell line according to claim 31 Clonal antibodies.
３４、選択された抗原特異的オリゴマー１ｇＧモノクローナル抗体を産生ずる方 法で、 ａ）実質的に重複する可変領域および定常領域をコードする機能的に結合した軽 鎖遺伝子をガンマ重鎖を発現する宿主細胞にトランスフェクトする。該宿主細胞 によって発現された該軽鎖およびガンマ重鎖が選択された抗原を結合するオリゴ マー抗体を構築する。34. Those who produce selected antigen-specific oligomer 1gG monoclonal antibodies By law, a) functionally linked light molecules encoding substantially overlapping variable and constant regions; The chain gene is transfected into host cells expressing gamma heavy chain. the host cell The light chain and gamma heavy chain expressed by an oligonucleotide that binds the selected antigen. Construct a mer antibody.
ｂ）該トランスフェクト宿主細胞を培養し、該オリゴマー［ｇＧ抗体を分泌する トランスフェクト細胞を同定する。b) culturing the transfected host cell and secreting the oligomer [gG antibody]; Identify transfected cells.
以上（ａ）および（ｂ）のステップを含む方法。A method comprising steps (a) and (b) above.
３５、ガンマ重鎖をコードする遺伝子を宿主細胞にトランスフェクトする請求の 範囲３４記載の方法。35. Claims for transfecting a gene encoding gamma heavy chain into a host cell The method according to range 34.
３６、ガンマ重鎖が宿主細胞に内在する請求の範囲３４記載の方法。36. The method of claim 34, wherein the gamma heavy chain is endogenous to the host cell.
３７、オリゴマー１ｇＧモノクローナル抗体が実質的にヒトに属するものである 請求の範囲３４記載の方法。37. The oligomeric 1gG monoclonal antibody is substantially human. The method according to claim 34.
３８、１ｍｌ乳類新生児のグループＢストレプトコッカス感染を防ぐ方法で、新 生児の出産前に母親に胎盤を通過し、胎児の循環系に到達してグループＢストＩ ／ブトコツカス感染を防ぎ得るオリゴマーモノクローナル抗体を投与することを 含む方法。38. A new method for preventing group B streptococcal infection in 1ml newborn mammals. Before the birth of a live baby, it passes through the mother's placenta and reaches the fetus's circulatory system. / Administering oligomeric monoclonal antibodies that can prevent Butococcus infection How to include.
３９、抗原を結合し得るオリゴマーモノクローナル抗体で、細胞から産生され、 かつ同じ抗原結合特異性を育する２個以上の免疫グロブリンモノマーを含むオリ ゴマー抗体および医薬的に許容し得るキャリヤーを含む医薬組成物。39. Oligomeric monoclonal antibodies capable of binding antigens, produced from cells, and contains two or more immunoglobulin monomers that develop the same antigen-binding specificity. A pharmaceutical composition comprising a sesame antibody and a pharmaceutically acceptable carrier.
４０、前記オリゴマーＩｇＧ抗体がグループＢストレプトコッカスに結合し、か つこれを防画する請求の範囲３９記載の医薬組成物。40. The oligomeric IgG antibody binds to Group B Streptococcus and 40. The pharmaceutical composition according to claim 39, wherein the pharmaceutical composition is anti-inflammatory.
４１、実質的に重複する可変領域を有する免疫グロブリン軽鎖をコードする単離 ＤＮＡ配列。41. Isolations Encoding Immunoglobulin Light Chains Having Substantially Overlapping Variable Regions DNA sequence.
４２、実質的にＳｅｑ、 ＩＤ、 Ｎｏ、１３に対応する請求の範囲４１記載の ＤＮＡ配列。42, Claim 41 which substantially corresponds to Seq, ID, No. 13 DNA sequence.
鎖の可変領域をコードする単離ＤＮＡ配列。An isolated DNA sequence encoding the variable region of a chain.
４４、免疫グロブリン重鎮可変領域をコードする単離ＤＮＡ配列で、実質的＋： Ｓｅｑ、 ＩＤ、 Ｎｏ、ｌ ５に対応するＤＮＡ配列。44, an isolated DNA sequence encoding an immunoglobulin heavy variable region, substantially +: DNA sequence corresponding to Seq, ID, No, l 5.
４５、以下に示す機能的に結合する要素：ａ）転写プロモーター、 ｂ）実質的に重複する可変領域を育する免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡ 配列、および Ｃ）転写ターミネータ− を含むＤＮＡ構築物。45, an element operably linked to: a) a transcription promoter; b) DNA encoding immunoglobulin light chains that develop substantially overlapping variable regions. array, and C) Transcription terminator A DNA construct containing.
４６、前記ＤＮＡ構築物が実質的にＳｅｑ、 ＩＤ、 Ｎｏ、１３に対応する請 求の範囲４５記載のＤＮＡ構築物。46, the DNA construct substantially corresponds to Seq, ID, No. 13. A DNA construct according to claim 45.
４７、請求の範囲４５記載のＤＮＡ構築物を含む培養哺乳類細胞。47. A cultured mammalian cell comprising the DNA construct according to claim 45.
明細書 （関連分野） 本発明は免疫診断および免疫療法の分野、特に新しいオリゴマー型免疫グロブリ ンに関する。Specification (Related fields) The present invention relates to the field of immunodiagnosis and immunotherapy, particularly to new oligomeric immunoglobulins. Regarding
（関連技術） モノクローナル抗体の出現以来抗体の診断的および治療的用途が爆発的に増した 。現在診断的用途は非常に感度が良くかつ特異性の高いインビトロイムノアッセ イからインビボイメージングまでの範囲に及ぶ。治療的にはモノクローナル抗体 は広範囲のがんや感染症の治療、患者の免疫応答の調節および抗イデオタイプ抗 体に関する免疫原としての使用を目的として成型されている。抗体技術および遺 伝子工学技術の進歩に従かい研究者の意識は抗体の構造、ある場合には抗体の機 能の改変に集中してきた。たとえば現在では抗体の結合アフィニティーの改変、 抗体クラスの変換、抗体の種類の変換または抗体鎖の異種非免疫グロブリンポリ ペプチドの付加などが可能である。(Related technology) The diagnostic and therapeutic uses of antibodies have exploded since the advent of monoclonal antibodies. . Currently, in vitro immunoassays are used for diagnostic purposes because they are highly sensitive and highly specific. ranging from in-vivo imaging to in-vivo imaging. Monoclonal antibodies therapeutically is used to treat a wide range of cancers and infectious diseases, modulate the patient's immune response and It is formulated for use as an immunogen for the body. Antibody technology and genetics With the advancement of genetic engineering technology, researchers are becoming increasingly aware of the structure of antibodies and, in some cases, the mechanism of antibodies. I have been concentrating on changing Noh. For example, it is now possible to modify the binding affinity of antibodies, Conversion of antibody class, conversion of antibody type or heterologous non-immunoglobulin polynucleotides of antibody chains It is possible to add peptides, etc.
構造的には抗体は各々一般的にはＹ型をしている１つ以上の単位またはモノマー から成り立っている。モノマーは４つのポリペプチド−重鎮（Ｈ鎖）として知ら れている２本の同一のポリペプチドおよび軽鎖（Ｌ鎖）と呼ばれている２本の同 一のポリペプチド−を含んでいる。２つの重鎮ポリペプチドは各々約４４０アミ ノ酸残基長で約５５，０００ダルトンである。２つの軽鎖は各々約２２０アミノ 酸残基長で約２５，０００ダルトンである。１つの軽鎖は１つの重鎮と会合して おり、どの抗体分子も１種類の軽鎖および１種類の重鎮を有している。軽鎖のア ミノ末端可変領域は１つの重鎮のアミノ末端可変領域と会合しており抗原結合部 位をｆ５Ｊ９ｆ、している。２つの重鎮のカルボキシ末端は一緒に折りたたまれ てＦｃ ドメインを形成している。この免疫グロブリン分子の４つのポリペプチ ド鎖はジスルフィド結合および非共有結合で一緒にまとまっている。Structurally, antibodies each consist of one or more units or monomers, generally in the shape of a Y. It consists of The monomers are composed of four polypeptides known as heavy chains (H chains). two identical polypeptides, called light chains, and two identical polypeptides, called light chains. It contains one polypeptide. The two key polypeptides each contain approximately 440 amino acids. The length of the amino acid residue is approximately 55,000 Daltons. The two light chains each have approximately 220 amino acids The length of the acid residue is approximately 25,000 Daltons. One light chain associates with one heavy chain Therefore, every antibody molecule has one type of light chain and one type of heavy chain. light chain a The amino-terminal variable region is associated with the amino-terminal variable region of one heavyweight and is the antigen-binding site. The position is f5J9f. The carboxy termini of the two heavyweights fold together and form an Fc domain. The four polypeptides of this immunoglobulin molecule The chains are held together by disulfide bonds and non-covalent bonds.
抗体はそれらが含む重鎮ポリペプチドのタイプ（γ、μ、α、εおよびδ）に基 づき各々のクラス−ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ。Antibodies are classified based on the type of key polypeptide they contain (γ, μ, α, ε, and δ). Each class - IgG, IgM, IgA.
ＩｇＥおよびＩｇＤに分類される。軽鎖にはカッパ（に）およびラムダ（λ）の ２つのタイプがある。またクラスによって完全な抗体を形成するために結合する モノマーの数が異なる。たとえばＩｇＭ抗体は５個のモノマーを有し、その各々 が２つの抗原結合部位を含むことから各分子量り１０個の同一の抗原結合部位が 存在する。この場合ＩｇＭは１０価であるという。一般的にＩｇＧ、ＩｇＥおよ びＩｇＤは単一のモノマーユニットを含みしたがって２価である。またＩｇＡは １つかまたはそれ以上のモノマーから成る。Classified into IgE and IgD. The light chain has kappa (ni) and lambda (λ) There are two types. also combine to form complete antibodies by class The number of monomers is different. For example, an IgM antibody has five monomers, each of which contains two antigen-binding sites, each molecular weight has 10 identical antigen-binding sites. exist. In this case, IgM is said to be decavalent. Generally IgG, IgE and Both IgD and IgD contain a single monomer unit and are therefore divalent. Also, IgA Consists of one or more monomers.
抗体の本質的なアフィニティーはそのエピトープに対する結合力の尺度である。The intrinsic affinity of an antibody is a measure of its avidity for its epitope.
原則的にそれは１つの抗原結合領域、すなわちモノマー全体の結合部位の半分に よる結合を示している。一方、結合活性は抗体と抗原の複合体の全体的安定性の 尺度である。結合活性はエピトープに対する抗体の本質的アフィニティー、抗体 および抗原の結合価および相互作用する成分の幾何学的配置などに影響される。In principle it can be applied to one antigen binding region, i.e. half of the binding sites of the entire monomer. This shows the bond due to On the other hand, avidity is a measure of the overall stability of the antibody-antigen complex. It is a measure. Avidity is the intrinsic affinity of an antibody for an epitope, an antibody and the valence of the antigen and the geometric arrangement of interacting components.
オリゴ価相互作用は低アフィニティー抗体の抗原への強い結合を可能にし、かつ 免疫複合体を非常に安定化し得る。このように高結合活性抗体は低アフィニティ ーおよび低結合活性の同様の抗体に比べて高い診断的または治療的価値を有して いる。不幸なことに望ましい結合活性を有するモノクローナル抗体を常に生産す みにとはできない。たとえば特定のエピトープに対するモノクローナル抗体を作 ることはできるが、それらがＩｇＭではないことやＩｇＭでもアフィニティーが 低いことがある。さらにＩｇＭは意図した用途には望ましくない特性を有するこ とがある。たとえばＩｇＧと比べてＩｇＭは胎盤を通過しないし、また安定性が 低く、シェルフライフが短く、インビボでの寿命が短かいことやまた大量に生産 し難いことがあげられる。Oligovalent interactions allow strong binding of low-affinity antibodies to antigen and It can greatly stabilize immune complexes. Thus, high avidity antibodies have low affinity - and have high diagnostic or therapeutic value compared to similar antibodies of low avidity. There is. Unfortunately, monoclonal antibodies with the desired binding activity cannot always be produced. I can't do it with Mini. For example, creating a monoclonal antibody against a specific epitope. However, they are not IgM, and even IgM has affinity. It can be low. Additionally, IgM may have properties that are undesirable for its intended use. There is. For example, compared to IgG, IgM does not cross the placenta and is less stable. low shelf life, short shelf life in vivo and production in large quantities. There are some things that are difficult to do.
ポＯツク（Ｐｏｌｌｏｃｋ）等（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ 、 ＵＳＡ ８５：２２９８（１９８８））は低結合能の抗体集団中からの高い 結合能を有する抗体の生産について報告している。著者は活性の変化に関する抗 体の構造変化は重鎮の定常領域に起っており、また結合活性の増加は抗体の重合 によるものではないことを示した。したがって、当分野で必要とされているもの はＩｇＭを扱う上で本質的な多くの困難を回避し得る高い結合活性を有する抗体 である。このような抗体があれば標的抗原とのより完全で安定な相互作用を生じ 、それによってより有効な治療および診断が可能となるであろう。Pollock, etc. (Proc, Natl, Acad, Sci , USA 85:2298 (1988)) is a high We report on the production of antibodies with binding ability. The authors are concerned with changes in activity. Structural changes in the body occur in the constant region of heavy antibodies, and increases in binding activity are due to antibody polymerization. It was shown that it was not caused by Therefore, what is needed in the field is an antibody with high avidity that can avoid many of the difficulties inherent in working with IgM. It is. Such antibodies would result in a more complete and stable interaction with the target antigen. , thereby allowing more effective treatment and diagnosis.
驚くべきことに本発明はこれらの問題点や他の必要事項を満足している。Surprisingly, the present invention meets these and other needs.
（本発明の概要） 本発明は細胞によって生産され、かつ２つ以上の免疫グロブリンモノマーを含む 新しいオリゴマーモノクローナル抗体の発見に関する。本発明の１つの特徴にお いて、この新しい抗体はそれらが誘導される二価抗体と比べて抗原に対する結合 活性が高い。別の特徴においてこのオリゴマー抗体はγ−重鎮を有しておりした がってＩｇＧアイソタイプである。また２個から約６個またはそれ以上のモノマ ーユニットを含んでいる。ある態様においてその軽鎖はカッパタイプである。軽 鎖は可変または定常領域ドメイン２個などアミノ酸配列の挿入を有しており、し たがってそれが誘導される親分子よりも実質的に大きい分子量を有している。こ のように細胞によってマルチマーに会合される少なくとも１個のモノマーは１本 の異常な軽鎖および１本の正常な軽鎖または２本の異常な軽鎖を有している。(Summary of the present invention) The present invention is produced by a cell and includes two or more immunoglobulin monomers. Concerning the discovery of new oligomeric monoclonal antibodies. One feature of the present invention is This new antibody has a higher ability to bind to antigen than the bivalent antibody from which they are derived. Highly active. In another feature, this oligomeric antibody had a γ-heavyweight. Therefore, it is an IgG isotype. Also, from 2 to about 6 or more monomers. - Contains units. In certain embodiments, the light chain is of the kappa type. light The chain has insertions of amino acid sequences, such as two variable or constant region domains, and It therefore has a substantially higher molecular weight than the parent molecule from which it is derived. child At least one monomer associated with the multimer by the cell is one abnormal light chains and one normal light chain or two abnormal light chains.
・ １つの態様において本発明は細胞によって生産され、かつ同じ抗原結合特異 性で各々ガンマ重鎖を有する２つ以上の免疫グロブリンモノマーを含む抗原の結 合が可能なオリゴマーモノクローナル抗体を含んでいる。このマルチマーは非共 有結合的に会合しており、その重鎮はガンマ−ｌクラスに、軽鎖はカッパクラス に属１ する。重鎮および軽鎖の可変領域をコードする遺伝子はその軽鎖および 重鎖定常領域遺伝子の起源である細胞系列とは異なる供与細胞系列から得る。こ の態様において重鎮および軽鎖は元来ヒトのものである。ある態様のオリゴマー 免疫グロブリンはグループＢストレプトコッカスに結合し、それが由来する親Ｉ ｇＧモノマ−抗体よりもインビボで実質的により保護的である。- In one embodiment, the present invention provides a The combination of antigens containing two or more immunoglobulin monomers each having a gamma heavy chain Contains oligomeric monoclonal antibodies that can be combined. This multimer is non-cooperative. The heavy chain is associated with the gamma-l class and the light chain is with the kappa class. Belongs to 1. The genes encoding the heavy and light chain variable regions are It is obtained from a donor cell line that is different from the cell line from which the heavy chain constant region gene originates. child In this embodiment, the heavy and light chains are human in origin. Certain embodiments of oligomers Immunoglobulin binds to group B streptococci and to the parent I from which it is derived. Substantially more protective in vivo than gG monomer antibodies.
他の態様において本発明はオリゴマーモノクローナル抗体を生産する方法に関す る。マルチマーがＩｇＧアイソタイプの場合、この方法にはカッパもしくはラム ダタイプの軽鎖をコードする連結遺伝子の不死化宿主細胞へのトランスフェクシ ョンが含まれる。In another aspect, the invention relates to a method of producing oligomeric monoclonal antibodies. Ru. If the multimer is of the IgG isotype, this method may include kappa or ram. Transfection of linked genes encoding the datypic light chain into immortalized host cells. Includes options.
またその宿主細胞は軽鎖同様その細胞系列に内在する、またはその定常および可 変領域をコードする連結遺伝子が該細胞中にトランスフェクトされた重鎮も発現 する。軽鎖および重鎮可変領域遺伝子は一般的に選択した抗原に対する機能性抗 体が形成可能なように同じ供与細胞系列に由来する。しかし重鎮定常領域をコー ドする遺伝子は供与細胞系列と同じもしくは違うものに由来する。Also, the host cell may be endogenous to the cell lineage as well as light chains, or its constant and variable A linked gene encoding a variable region is also transfected into the cell and expressed. do. Light chain and heavy variable region genes generally produce functional antibodies against selected antigens. derived from the same donor cell lineage so that the body can be formed. However, the heavy stationary region The donor gene may be derived from the same or different donor cell lineage.
つぎにトランスフェクトした宿主細胞を培養し、ガンマ重鎖トランスフェクトン トの場合それが誘導される正常なモノマー抗体より結合活性が高い、および、ま たは約１５０，０００ｋＤの分子量を有する抗体の存在に関しその培養上清をス クリーニングする。Next, the transfected host cells are cultured and the gamma heavy chain transfection If the antibody has higher avidity than the normal monomeric antibody from which it is derived, and or the culture supernatant for the presence of antibodies with a molecular weight of approximately 150,000 kD. Clean.
またこの上清は最初に分子量の増加した軽鎖についてスクリーニングされるがた とえば結合活性の増加などに関するスクリーニングも必要であろう。オリゴマー 抗体を分泌するトランスフェクト細胞を同定し、必要ならばクローニングしてそ の培養上清から抗体を回収する。別の態様において本発明は特に病気の治療に有 用なオリゴマー抗体の生産方法を含む。たとえばグループＢストレプトコッカス （ストレブトコッ力スアガラクチェ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｓａｇａｌａｃｔ ｉａｅ）のＢ炭水化物に結合するオリゴマーＩｇＧを用いてこの生物の感染を予 防または治療できる。１つの応用においてはこの抗体を用い胎児または新世児の 感染を妨げている。ここでは誕生の前またはその過程でこの抗体組成物を妊婦に 投与する。こ能カリゴマー抗体は胎盤を通過し、胎児の血液に到達する。This supernatant is also first screened for light chains of increased molecular weight. Screening for increased binding activity, for example, may also be necessary. oligomer Transfected cells that secrete antibodies can be identified and, if necessary, cloned. Collect antibodies from the culture supernatant. In another aspect, the invention is particularly useful for treating diseases. including methods for producing oligomeric antibodies. For example, group B Streptococcus (Streptococcus agalact iae) that binds to the B carbohydrate of this organism to prevent infection of this organism. Can be prevented or treated. In one application, this antibody could be used to treat fetal or newborn infants. Preventing infection. Here, this antibody composition is administered to pregnant women before or during birth. Administer. The calligomer antibodies cross the placenta and reach the fetal blood.
（図面の簡単な説明） 第１ａ図および第１ｂ図は各々ｐＮγＩＡ２．１およびｐＮにＡ１、１の構造を 示している。第１ａ図において７１定常領域遺伝子はｐＮ、１のＢａｍＨＩ部位 への挿入物として示されている。可変領域遺伝子は定常領域遺伝子のＨｉｎｄｌ Ｉ［部位への挿入物として示されている。免疫グロブリン遺伝子上の矢印は転写 の方向を示している。第１ｂ図においてカッパ免疫グロブリン遺伝子はｐＮ、１ のＢａｍＨ１部位中の挿入物として示されている。また免疫グロブリン遺伝子上 の矢印は転写の方向を示している。第２Ａ図は未分画ＩＢＩモノクローナル抗体 のゲル濾過クロマトグラフィーの分析クロマトグラムである。第２Ｂ図および第 ２Ｃ図は各々高および低分子量フラクションのクロマトグラムである。(Brief explanation of the drawing) Figures 1a and 1b show the structure of A1,1 in pNγIA2.1 and pN, respectively. It shows. In Figure 1a, the 71 constant region genes are pN, 1 BamHI site. Shown as an insert to. The variable region gene is the constant region gene Hindl. I [shown as an insert into the site. Arrows on immunoglobulin genes indicate transcription It shows the direction. In Figure 1b, the kappa immunoglobulin gene is pN, 1 The insert is shown as an insert in the BamH1 site of . Also on immunoglobulin genes The arrow indicates the direction of transcription. Figure 2A shows unfractionated IBI monoclonal antibody. This is an analytical chromatogram of gel filtration chromatography. Figures 2B and Figure 2C is the chromatogram of the high and low molecular weight fractions, respectively.
第３図はサイズ分画したモノクローナル抗体の尿素含有バッファを用いた非ＳＤ Ｓ ＰＡＧＥサイズ分析の結果である。レーン１はＩｇＧ１モノマーヒトモノク ローナル抗体、レーン２は１８１の低分子量フラクション、レーン３はＩＢＩの 高分子量フラクションおよびレーン４は未分画ＩＢＩである。Figure 3 shows size fractionated monoclonal antibodies in non-SD format using urea-containing buffer. This is the result of S PAGE size analysis. Lane 1 is IgG1 monomer human monochrome local antibody, lane 2 is the low molecular weight fraction of 181, lane 3 is IBI. High molecular weight fraction and lane 4 are unfractionated IBI.
第４Ａ図はβ−メルカプトエタノールで還元した未分画のＩＢＩモノクローナル 抗体のＰＡＧＥ分析の結果である。レーン１は抗体ＩＢＩ、レーン２は正常Ｉｇ Ｇ１ｔ−ランスフェクトーマ由来の抗ＧＢＳヒトモノクローナル抗体およびレー ン３は正常Ｉ ｇＧ ２トランスフエクトーマ由来の抗ＧＢＳヒトモノクローナ ル抗体である。第４Ｂ図は還元剤を除いた以外は第４Ａ図のサンプルと同じもの のＰＡＧＥ分析の結果である。第４Ｃ図は１次元では非還元で、２次元では還元 した抗体ＩＢＬを用いた二次元ゲルを示す。Figure 4A shows unfractionated IBI monoclonal reduced with β-mercaptoethanol. These are the results of PAGE analysis of antibodies. Lane 1 is antibody IBI, lane 2 is normal Ig. Anti-GBS human monoclonal antibody and laser derived from G1t-transfectoma 3 is an anti-GBS human monoclonal clone derived from a normal IgG2 transfectoma. antibody. Figure 4B is the same sample as Figure 4A except that the reducing agent is removed. These are the results of PAGE analysis. Figure 4C is non-reducing in one dimension and reducing in two dimensions. This figure shows a two-dimensional gel using the antibody IBL.
第５図は還元条件下でプロティンＡ精製したＩＢＩモノクローナル抗体のサイス 分画、ついで各フラクションのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動および銀 染色によるたんばく質の検出の結果である。Figure 5 shows the size of IBI monoclonal antibody purified under reducing conditions. fractionation, followed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis and silver This is the result of protein detection by staining.
第６図はｐＧγ２−Ａ２Ｈの構造でる。γ２定常領域はｐＧのＢａｍＨＩ部位へ の挿入物として示してあり、また可変領域Ａ２Ｈは定常類・域遺伝子のＨｉｎｄ Ｉ［Ｉ部位への挿入物として示しである。FIG. 6 shows the structure of pGγ2-A2H. γ2 constant region to BamHI site of pG The variable region A2H is shown as an insert of the constant class/region gene Hind I [shown as an insertion into the I site.
免疫グロブリン上の矢印は転写の方向を示していてる。またＥｃｏＲＩ部位はト ランスフェクション前の制限処理を示している。The arrow on the immunoglobulin indicates the direction of transcription. Also, the EcoRI site is Restriction treatment prior to transfection is shown.
第７図は部分的に精製したグループＢストレプトコッカス抗原を用いた結合検定 の結果であり、正常モノマーＩｇＧ２ （８Ｂ８）、ＩｇＧ１モノマー（Ｄ３） 、ＩＢＩ ＩｇＧ１オリゴマーおよび親４Ｂ９ＩｇＭと比較したＩｇＧ２オリ ゴマーの結合活性を示している。Figure 7 shows binding assay using partially purified group B streptococcal antigen. The results are normal monomer IgG2 (8B8), IgG1 monomer (D3) , IBI IgG1 oligomer and IgG2 oligomer compared to the parent 4B9IgM It shows the binding activity of sesame.
第８図は指示されているプライマーを用いた異常軽鎖Ｖ領域のシーケンシングの 戦略を示している。Figure 8 shows the sequencing of the abnormal light chain V region using the indicated primers. Shows strategy.
第９図はプロモーターおよびリーダーを含めないＬ’Ｖエクソンの二重化物を構 築するためのクローニング戦略を示しである。Figure 9 shows the construction of a duplication of L’V exons that does not include the promoter and leader. We present a cloning strategy for constructing.
ＥはＥｃｏＲＩ、ＸはＸｂａＩ、Ｓは５ａｃＩ、ＨはＨ１ｎｄＩｆｆ、ＢｇはＢ ｇｌｎ、ＣはＣ１ａｌ、ＮはＮｏｔＩ、Ｓｐは５ｐｈＩおよびＰはＰｖｕｌを表 わす。E is EcoRI, X is XbaI, S is 5acI, H is H1ndIff, Bg is B gln, C stands for C1al, N stands for NotI, Sp stands for 5phI and P stands for Pvul. Was.
第１０図は４Ｂ９モノクローナル抗体のＣに領域を有するｐＧＫ。Figure 10 shows pGK containing the C region of the 4B9 monoclonal antibody.
５の構築を示しており、これに重複したＶに遺伝子をクローン化してＩ）ＧＫＡ ｌ、１２を作製した。I) GKA by cloning the gene into the duplicated V 1, 12 were produced.
第１１図は尿素で処理したベクターｐＧＫＡ１．１２由来の抗体２３Ｂ１の非５ ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅ分析の結果である。レーン１は未分画抗体２３Ｂｌ、レーン２ は抗体ＩＢＩ低分子量フラクション（９９％モノマー）、レーン３は抗体ＩＢＩ 高分子量フラクション（８５％ダイマー）およびレーン４は未分画ＩＢＩ抗体（ １５％タイマー）である。Figure 11 shows the non-50% antibody 23B1 derived from vector pGKA1.12 treated with urea. This is the result of DS-PAC;E analysis. Lane 1 is unfractionated antibody 23Bl, lane 2 is antibody IBI low molecular weight fraction (99% monomer), lane 3 is antibody IBI High molecular weight fraction (85% dimer) and lane 4 are unfractionated IBI antibody ( 15% timer).
第１２図は重複した可変領域のＮ末端への９個のアミノ酸リンカ−の挿入を示し ている。Figure 12 shows the insertion of a 9 amino acid linker at the N-terminus of the overlapping variable regions. ing.
第１３図は同じ結合特異性を有するモノマーおよびオリゴマーｔｇＧＩＢ１およ びＩｇＭ（１６／２Ｂ）および抗原としてグループＢストレプトコッカスを用い た結合実験の結果を示している。Figure 13 shows monomers and oligomers tgGIB1 and tgGIB1 with the same binding specificity. and IgM (16/2B) and group B Streptococcus as the antigen. The results of a binding experiment are shown.
結合は抗ヒトを鎖特異的抗体で検定した。Binding was assayed with anti-human chain-specific antibodies.
第１４Ａ図および第１４Ｂ図はＩＢ１１ｇＧモノマーと比較したＩｇＭ親抗体４ Ｂ９（第１４Ａ図）およびＩＢＩマルチマー（第１４Ｂ図）への抗イデイオタイ プ抗体の結合を示している。Figures 14A and 14B show IgM parent antibody 4 compared to IB11gG monomer. Anti-idiots to B9 (Figure 14A) and IBI multimer (Figure 14B) The binding of the antibody is shown.
第１４Ａ図において、白四角はｌ：４０希釈のＰ Ｂ Ｓ ／ Ｔ ｗｅｅｎ／ ヒト血清に懸濁した４Ｂ９の結合を表わしている。黒ダイヤは検体希釈物（２０ ｍＭクエン酸ナトリウム中２．５％ｗ／ｖ脱脂ドライミルク、０．０１％チメロ ーサル、ｏ、 ｏ ｏ ｓ％アンチフオームＡ）および１：４０希釈血清中の４ Ｂ９を表わしている。白丸はＰＢＳおよびＴｗｅｅｎ中の４Ｂ９を表わしている 。白ダイヤは検体希釈物中の４８９を表わしている。黒四角は抗イデイオタイプ 抗体の特異性をコントロールとして検体希釈物中で希釈した結合特異性が４Ｂ９ と異なるヒトＩｇＭを表わしている。第１４Ｂ図では白四角はオリゴマーＩＢＩ を表わしており、黒ダイヤはヒト血清１：１００希釈物中のオリゴマーＩＢＩを 表わしており、黒四角はヒト血清１：５００希釈物中のオリゴマーｌＢｌを表わ しており、白ダイヤは七ツマー型ＩＢＩを表わしている。In Fig. 14A, white squares indicate PBS/Tween/1:40 dilution. Represents binding of 4B9 suspended in human serum. Black diamonds are sample dilutions (20 2.5% w/v nonfat dry milk in mM sodium citrate, 0.01% thimelo - monkey, o, o o s % antiform A) and 4 in 1:40 diluted serum It represents B9. White circles represent 4B9 in PBS and Tween . The white diamond represents 489 in the sample dilution. Black squares are anti-idiotypes The binding specificity of the antibody diluted in the sample diluent was 4B9 as a control. represents a different human IgM. In Figure 14B, the white square is the oligomer IBI. The black diamond represents oligomeric IBI in a 1:100 dilution of human serum. The black square represents the oligomer IBl in a 1:500 dilution of human serum. The white diamond represents a seven-point IBI.
第１５図はオプンニン作用検定における七ツマ−およびオリゴマーＩｇＧのイン ビトロ機能分析の結果である。ＩＢ１抗体モノマーは白丸、ＩＢＩ抗体オリゴマ ーは黒丸およびＩｇＭｔ４Ｂ９は白三角で表わされている。Figure 15 shows the effects of hepatoma and oligomer IgG in the openin action assay. These are the results of in vitro functional analysis. IB1 antibody monomer is a white circle, IBI antibody oligomer - is represented by a black circle and IgMt4B9 is represented by an open triangle.
第１６図はＩＢＩ軽鎖のＤＮＡ配列とそれから誘導されるアミノ酸配列を示して いる。Ｌ’ Ｖ （１）およびＬ’ Ｖ （２）はＬ’ Ｖ領域の第１および第 ２コピーを示している。Figure 16 shows the DNA sequence of IBI light chain and the amino acid sequence derived from it. There is. L'V (1) and L'V (2) are the first and the first in the L'V area. 2 copies are shown.
第１７図は本来の４Ｂ９Ｖ領域クローンのシーケンシングから得られた配列であ る。Figure 17 shows the sequence obtained from sequencing the original 4B9V region clone. Ru.
第１８図は４Ｂ９ヒトモノクローナル抗体の重鎮可変領域の配列である。FIG. 18 is the sequence of the key variable region of the 4B9 human monoclonal antibody.
（特定の態様の説明） 病原の攻撃を妨ぐ抗体の能力は補体カスケードを開始し得る十分な結合活性を有 する抗体の抗原結合能に依存する。たとえばＩｇＧ分子の二価結合性のためＩｇ Ｇクラスの抗体は防御すべき抗原への十分な結合活性を持っていないが同様のア フィニティーおよび抗原特異性を有するＩｇＭは１０価であるため十分防御的に 働く。しかし、治療や診断を目的として特定のクラスの抗体の使用にはそれら抗 体クラスに本質的な性質によって制限がある。たとえば通常ＩｇＭ抗体は胎盤を 通過する能力は持っていないがＩｇＧ抗体はこの能力を有しており、これにより 胎児を保護し得る。この性質は病気の治療、特に胎児や新生児の感染の治療にモ ノクローナル抗体を基礎とした薬剤を開発する上で非常に重要となる。本発明は 新しいオリゴマー免疫グロブリンの生成を通じてこれらの問題を解決する方法を 提供する。(Description of specific aspects) The ability of antibodies to thwart pathogen attack depends on their ability to possess sufficient avidity to initiate the complement cascade. It depends on the antigen-binding ability of the antibody. For example, due to the bivalent binding nature of IgG molecules, Ig G-class antibodies do not have sufficient binding activity to the antigen to be protected, but they have similar IgM has high affinity and antigen specificity and is 10 valent, so it is highly protective. work. However, the use of specific classes of antibodies for therapeutic or diagnostic purposes requires There are limitations due to the inherent properties of the body class. For example, IgM antibodies usually attack the placenta. Although it does not have the ability to pass through, IgG antibodies have this ability, and this allows May protect the fetus. This property is useful in the treatment of diseases, especially in the treatment of infections in fetuses and newborns. This is extremely important in developing drugs based on noclonal antibodies. The present invention How to solve these problems through the generation of new oligomeric immunoglobulins provide.
このオリゴマー免疫グロブリンはどのタイプの重鎮も持ち得、そのオリゴマーの 形成に寄与するモノマー中の重鎮が同じクラスのものである限り、そのサブクラ スは利用される抗体の種に開っている。特にオリゴマーＩｇＧ分子を作るのには ガンマ重鎮が好ましいが、アルファ、ミュー、ニブシロンまたはデルタタイプの 貫鎖または各動物種に知られているサブクラスのものも使用し得る。たとえばヒ トＩｇＧのサブクラスにはタイプ１，２．３および４が含まれる一方マウスＩｇ ＧのサブクラスにはタイプＬ２ａ。This oligomeric immunoglobulin can have any type of heavyweight and its oligomeric As long as the heavyweights in the monomers contributing to the formation are of the same class, their subclasses The system is open to the species of antibody utilized. Especially for making oligomeric IgG molecules. Gamma heavy is preferred, but alpha, mu, nibsilon or delta types are preferred. Trans-chains or subclasses known for each animal species may also be used. For example, Subclasses of mouse IgG include types 1, 2.3, and 4, while mouse IgG subclasses include types 1, 2.3, and 4; The subclass of G is type L2a.
２ｂおよび３が含まれる。オリゴマーまたはマルチマーとは上記アイソタイプと して知られている以上のモノマー単位（たとえばＨ２Ｌ２）を有する抗体を意味 し、それらの単位は機能的抗原結合部位を生ずるように非共有結合的または共有 結合的に会合している。一般にＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＥは単一のモノマーを 含むことが報告されており、一方ＩｇＭは５個のモノマーを有し、またＩｇＡは 通常は１つのモノマーを有するが、Ｊ鎖を介し共有結合的に会合する２つ以上の モノマー単位を有することもある。軽鎖はカッパまたはラムダタイプのいずれか である。以下に述べる態様において、好ましいマルチマーはガンマクラスの重鎮 （ヒト）およびカッパタイプの軽鎖を有している。オリゴマー免疫グロブリンは それからモノクローナル抗体を調製するすべての種またはそれらの組合せたもの に属する。マウスおよびヒト免疫グロブリンが最も一般に使用されるがウサギ、 ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、トリなどの種も用い得る。ヒトへの治療投与の場合 、実質的にヒトの免疫グロブリンの患者の免疫系による異物としての認識が最小 となることが望ましい。モノクローナル抗体技術および遺伝子工学技術は１つの 種の抗体配列が他の種のものと相互交換し得るよう十分進歩してきたと理解すべ きである。したがって本明細書で用いられているようにたとえば“ヒト”抗体は 本来ヒト由来のものであるがある非ヒトおよび、または非免疫グロブリン配列も 含むものを意味する。同様に“免疫グロブリン”に関しては、い（つかの非免疫 グロブリン配列がその分子中に存在し、一方では抗原を結合する能力を維持して いるものと理解される。2b and 3 are included. What is an oligomer or multimer? means an antibody with more monomer units (e.g. H2L2) than is known as and those units can be bonded non-covalently or covalently to create a functional antigen-binding site. Associatively associated. Generally, IgG, IgD and IgE contain a single monomer. It has been reported that IgM has 5 monomers, and IgA has 5 monomers. Usually has one monomer, but two or more monomers are covalently associated via the J chain. It may also have monomer units. Light chains are either kappa or lambda type It is. In the embodiments described below, preferred multimers are gamma class heavyweights. (human) and has a kappa-type light chain. oligomeric immunoglobulin any species or combination thereof from which monoclonal antibodies are prepared belongs to Rabbit, although mouse and human immunoglobulins are most commonly used. Species such as bovine, ovine, equine, porcine, and avian species may also be used. For therapeutic administration to humans , virtually no human immunoglobulin is recognized as foreign by the patient's immune system. It is desirable that Monoclonal antibody technology and genetic engineering technology are one It should be understood that a species' antibody sequences have evolved sufficiently to be interchangeable with those of other species. It is possible. Thus, as used herein, for example, a "human" antibody is Certain non-human and/or non-immunoglobulin sequences that are of human origin may also be used. It means something that includes. Similarly, regarding “immunoglobulin,” Globulin sequences are present in the molecule while retaining the ability to bind antigen. It is understood that there are
オリゴマー免疫グロブリンは生合成的に、すなわち架橋剤を用いるなど従来の実 験操作を用いた抗体の化学的結合とは区別し得る細胞系列または細胞抽出物によ って生産される。マルチマーは目的の抗原またはそのエピトープに結合するモノ クローナル抗体を分泌する細胞系列から出発して簡便に生産され得る。親抗体産 生細胞系列は当分野でよく知られている融合、ウィルストランスホーメーション または他の不死化技術を用い数種のＢ細胞から単離し得る。たとえはヒトモノク ローナル抗体はエプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ））ランスホーメーション 、ハイブリドーマ融合技術またはこれらを組合せて生成される。たとえばコスポ ー（Ｋｏｚｂｏｒ）等、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳ Ａ工９ ： ６６５１（１９８２）および米国特許Ｎｏ、４．４６４．４６５お よび４．６２４．９２１参照。これらは参考として引用している。親モノクロー ナル抗体はどのクラスまたはサブクラスの免疫グロブリンでもよい。モノクロー ナル抗体とは別の抗原結合特異性をもつ抗体を産生ずる細胞とは区別されるクロ ーン化した継続的細胞系列によって生産される抗体を意味する。したがってこれ らのモノクローナル抗体を生産し、他のモノクローナル抗体から単離される。つ まり、Ｂ細胞源である動物種由来の血清中の通常の濃度以上の濃度かつ実質的に 純粋な形（他の抗体と比較して）で生産し得る。別にＰＣＲまたは同様の技術を 用いＶ領域をトランスホームまたは非トランスホーム細胞からクローン化し得る 。Oligomeric immunoglobulins are produced biosynthetically, i.e. by conventional methods such as using cross-linking agents. Chemical conjugation of antibodies using laboratory procedures with distinguishable cell lineages or cell extracts is produced. Multimers are monomers that bind to the antigen of interest or its epitope. They can be easily produced starting from cell lines that secrete clonal antibodies. Parent antibody production Live cell lineage is achieved by fusion, viral transformation, which are well known in the art. or can be isolated from several types of B cells using other immortalization techniques. The parable is a humanoid Local antibodies are Epstein-Barr virus (EBV) transformation. , hybridoma fusion techniques or a combination of these. For example, cospo - (Kozbor) etc., Proc, Natl, Acad, Sci, US A Eng 9: 6651 (1982) and U.S. Patent No. 4.464.465 and 4.624.921. These are cited for reference only. Parent monochrome Null antibodies can be immunoglobulins of any class or subclass. monochrome A clone that is distinct from cells that produce antibodies with antigen-binding specificities different from null antibodies. refers to an antibody produced by a continuous cell line that has been cloned. Therefore this These monoclonal antibodies are produced and isolated from other monoclonal antibodies. One concentration above and substantially above the normal concentration in serum from the animal species that is the source of B cells. Can be produced in pure form (compared to other antibodies). Separate PCR or similar technology The V regions used can be cloned from transformed or non-transformed cells. .
軽鎖および重鎮の可変領域をコードする遺伝子を親細胞からクローン化し抗体発 現が可能な宿主細胞にトランスフェクトする。Genes encoding light chain and heavy chain variable regions are cloned from parent cells to develop antibodies. transfect into a host cell capable of expression.
本明細書で示している異常軽鎖をコードする遺伝子も適当な特異性をもつ免疫グ ロブリンを発現する細胞または対応するＨ鎖のみを発現する細胞にトランスフェ クトし得る。宿主細胞は真核性細胞、好ましくは哺乳類細胞であり、これはリー ダー配列除去、正しい折したたたみや集合、正しい部位でのグリコジル化、およ び細胞からの機能性抗体の分泌を含む免疫グロブリンたんぽ（質に対する翻訳後 修正を提供し得るものである。リンパ球系列、特にＢ細胞系列のリンパ球は宿主 として好ましい。宿主細胞は以下で述べるＡｇ ８．６５３などのミエローマ系 列でも良い。The gene encoding the abnormal light chain shown here can also be used as an immunoglobulin with appropriate specificity. Transfect into cells expressing Robulin or only the corresponding heavy chain. can be used. The host cell is a eukaryotic cell, preferably a mammalian cell, which is a lead cell. removal of the sequence, correct folding and assembly, glycosylation at the correct site, and Immunoglobulin proteins (post-translational for quality), including the secretion of functional antibodies from Modifications may be provided. Lymphocyte lineage, especially B cell lineage lymphocytes, are host cells. preferred as The host cell is a myeloma type such as Ag 8.653 described below. A row is fine.
宿主細胞のトランスフェクションはエレクトロポレーション、ＤＮＡのリン酸カ ルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン沈殿、プロトプラスト融合およびマイク ロインジェクションなど多くの手段で行なわれる。トランスフェクション後は一 般に細胞を非選択性培地中で短時間インキュベーションし、つづいて選択性培地 に移して増殖を観察する。細胞の自然増殖のための十分な時間の後、その上清を 以下に示すようにオリゴマー免疫グロブリンについてスクリーニングした。Transfection of host cells is carried out by electroporation, phosphorylation of DNA. Lucium coprecipitation, DEAE dextran precipitation, protoplast fusion and microphone It can be done by many means, including loin injection. After transfection, one Generally, cells are incubated briefly in non-selective medium, followed by selective medium. and observe growth. After sufficient time for natural cell growth, remove the supernatant. Screened for oligomeric immunoglobulins as shown below.
トランスフェクトした免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスフェクトの同定 および選択を容易にするため、一般に選択可能な発現型（選択可能マーカー）を 与える遺伝子を目的の免疫グロブリン遺伝子と共に細胞中に導入する。好ましい 選択可能マーカーにはネオマイシン、カナマイシン、メトトレキセートおよびマ イコフェノール酸などの薬剤に対する耐性を与える遺伝子が含まれる。選択可能 マーカーは増巾可能な選択可能マーカーでもよい。Identification of transfectants expressing transfected immunoglobulin genes and generally selectable expression types (selectable markers) to facilitate selection. The given gene is introduced into cells together with the desired immunoglobulin gene. preferable Selectable markers include neomycin, kanamycin, methotrexate and Contains genes that confer resistance to drugs such as icophenolic acid. chooseable The marker may be a selectable marker that can be amplified.
選択可能マーカーはチリ−（Ｔｈｉｌｌｙ）、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅ１ｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 。Selectable markers are Tilly and Mammalian Ce1l. Technology.
バターワース出版社、ストーンハム、ＭＡにまとめられており、またそのマーカ ーの選択は当業者によく知られている。選択可能マーカーは目的遺伝子と同じプ ラスミドまたは別のプラスミドで細胞中に導入する。一般的にはここで参考とし て引用する米国特許Ｎｏ、 ４．６３４．６６５参照。もしも同じプラスミド上 にある場合選択可能マーカーおよび目的遺伝子は別々または同じプロモーターの コントロール下にある。軽鎖可変領域をコードする遺伝子はその軽鎖の残りの部 分すなわち定常領域をコードする遺伝子と共にあるいはそれとは別にクローン化 する。もし可変領域のみをクローン化するなら、それは適当な軽鎖クラスのＣ領 域を含むカセットに挿入される。その結果宿主細胞にトランスフェクトした時、 この遺伝子は完全な軽鎖をコードするよう機能的に結合する。このＣ領域遺伝子 はＶ遺伝子として同じまたは異なる親細胞系列から入手する。このカセットはよ り高レベルの発現を指令するように転写エンハンサ−エレメント、プロモーター などを含む。またこのカセットにはトランスフェクシントを同定および選択する 上で便利な選択可能マーカーが含まれる。Published by Butterworth Publishers, Stoneham, MA, and its markers The choice of - is well known to those skilled in the art. A selectable marker is the same protein as the gene of interest. Introduced into cells with a lasmid or another plasmid. For general reference here See U.S. Pat. No. 4,634,665, cited in . If on the same plasmid If the selectable marker and gene of interest are located on separate or the same promoter Under control. The gene encoding the light chain variable region encodes the rest of the light chain. cloned together with or separately from the gene encoding the minute or constant region do. If only the variable region is cloned, it should be the C region of the appropriate light chain class. inserted into a cassette containing the area. As a result, when transfected into host cells, This gene is operably linked to encode a complete light chain. This C region gene may be obtained from the same or different parental cell line as the V gene. This cassette is Transcriptional enhancer elements, promoters, to direct high-level expression Including. This cassette is also used to identify and select transfectants. Includes a convenient selectable marker.
ヒトカッパ軽鎖遺伝子の構造はヒーター（）Ｉｉｅｔｅｒ）等、Ｃｅ１ｌ。The structure of the human kappa light chain gene is described by Iieter et al., Ce11.
２２．１９７−２０７ （１９８０） 、ヒーター（）Ｉｉｅｔｅｒ）等、Ｊ。22.197-207 (1980), Heeter et al., J.
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７ ； １５１６−１５２２ （１９８２）およびク ロベック等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １２ ； ６９９５−７ ００６（１９８４）に報告されている（これらは参考として引用している）。生 殖系列構造においては半数体ゲノム当り単一のカッパ定常領域遺伝子がある。定 常領域の上流には５Ｊ力ツパ領域遺伝子群があり、また可変領域遺伝子はおそら くもっと上流にある。組換えカッパ可変領域遺伝子をクローン化するため生殖系 列Ｊカッパ遺伝子を探るプローブを用いた。Ｊ領域と定常領域間に認識配列を持 たない特定の制限酵素（たとえばＢａｍＨＩ）とともにＣカッパプローブを用い て組換えカッパ可変領域遺伝子を検出し得る。Biol, Chem, 257; 1516-1522 (1982) and Robek et al., Nucleic Ac1ds Res, 12; 6995-7 006 (1984) (these are cited by reference). Living In germline structure there is a single kappa constant region gene per haploid genome. fixed Upstream of the constant region, there is a 5J power region gene group, and the variable region genes are probably It's much further upstream. Germline for cloning recombinant kappa variable region genes A probe probing the column J kappa gene was used. It has a recognition sequence between the J region and the constant region. Using a C kappa probe with a specific restriction enzyme (e.g. BamHI) can detect recombinant kappa variable region genes.
ヒトラムダ軽鎖遺伝子の構造はヒーター（Ｈｉｅｔｅｒ）等、Ｎａｔｕｒｅ。The structure of the human lambda light chain gene is described by Hieter et al., Nature.
２９４：５３６−５４０ （１９８１）およびウディ（Ｕｄｅｙ）およびプロム バーグ（Ｂｌｏｍｂｅｒｇ）、 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ、 ２５ ： ６３− ７０（１９８７）に報告されている（これらは参考として引用している）。組換 えラムダ遺伝子をクローン化するため、Ｃ−ラムダプローブを用い、Ｊラムダお よびＣ−ラムダ遺伝子の類似性を利用してＪ−ラムダ部位でその５′側で起こる 組換えを検出した。294:536-540 (1981) and Udey and Prom. Blomberg, Immunogenet, 25: 63- 70 (1987) (these are cited by reference). recombination To clone the E lambda gene, use the C-lambda probe and the J lambda and Taking advantage of the similarity of the and C-lambda genes, the J-lambda site Recombination was detected.
カッパ鎖産生細胞においては１つまたは両方のカッパ対立遺伝子が組換え得るが ラムダ部位はほとんどまたは全く組換わることはない。ラムダ鎖産生細胞におい ては１つまたは両方のラムダ対立遺伝子が組換わり得るし、また通常両方のカッ パ対立遺伝子が組換えを起こす。もっとも非産生的様式なので完全なカッパ鎖は 発現し得ない。重鎮と同様に組換え軽鎖がたんばく質レベルに発現されるＤＮＡ レベルは測定できない（ＲＮＡレベルでも測定し得ない）。それゆえ両組換えカ ッパまたは両組換えラムダ遺伝子は各々カッパまたはラムダ産生細胞からクロー ン化するべきで、またその機能性遺伝子はトランスフェクション実験で測定すべ きである。Although one or both kappa alleles can recombine in kappa chain producing cells, Lambda sites undergo little or no recombination. In lambda chain producing cells One or both lambda alleles can recombine, and usually both lambda alleles can recombine. The pa allele undergoes recombination. Since it is the most unproductive mode, a complete kappa chain is It cannot be expressed. DNA in which recombinant light chains as well as heavyweights are expressed at the protein level. Levels cannot be measured (nor can RNA levels be measured). Therefore, both recombinant pappa or both recombinant lambda genes are cloned from kappa or lambda producing cells, respectively. should be transfected, and its functional gene should be measured in transfection experiments. It is possible.
ヒト軽鎖遺伝子をクローン化するために目的の供与細胞から入手したゲノムＤＮ Ａを適当なエンドヌクレアーゼで制限処理し、望ましいサイズのＤＮＡフラグメ ント（Ｊ−カッパ、Ｃ−カッパまたはＣ−ラムダなど適当なプローブを用いたサ ウザントランスファーで測定する）を分取用スクロース勾配遠心で濃縮し、これ を用いてバクテリオファージライブラリーを構築する。それからこのライブラリ ーを適当なプローブを用いてスクリーニングし、ポジティブプラークを同定し精 製後増巾する。それからこのプラークからバクテリオファージＤＮＡを単離する 。Genomic DNA obtained from the desired donor cell for cloning the human light chain gene Restrict A with an appropriate endonuclease to obtain a DNA fragment of the desired size. sample using a suitable probe such as J-kappa, C-kappa or C-lambda. (measured by Uzan transfer) was concentrated by preparative sucrose gradient centrifugation, and this Construct a bacteriophage library using then this library screen with appropriate probes, identify positive plaques, and refine the Width is increased after manufacturing. The bacteriophage DNA is then isolated from this plaque. .
もし、組換え軽鎖可変領域および定常領域遺伝子が単一ベクターにクローン化す るのに十分に小さい単一の制限フラグメント上に存在するならそれらは一緒にク ローン化され、宿主細胞にトランスフェクトする前に発現カセットにサブクロー ン化する必要はない。他の場合には可変および定常領域遺伝子は１つのベクター に納まらず、可変領域遺伝子は定常領域遺伝子を含む発現カセットにサブクロー ニングする必要があろう。さらに他の場合、単一ベクター上に可変および定常領 域遺伝子をクローン化できるが、その遺伝子は発現レベルを促進させる他の要素 を含むカセット中に移すことが望ましい。If the recombinant light chain variable region and constant region genes are cloned into a single vector, If they are on a single restriction fragment small enough to cloned and subcloned into expression cassettes before transfecting into host cells. There is no need to convert it into In other cases, the variable and constant region genes are contained in one vector. variable region genes are subcloned into expression cassettes containing constant region genes. You will probably need to do some cleaning. Still other cases include variable and constant regions on a single vector. region genes can be cloned, but the genes are not affected by other factors that drive expression levels. It is preferable to transfer it into a cassette containing.
制限地図化および発現ベクターまたはカセットへのサブクローニングが容易に行 なえるように組換え軽鎖可変領域遺伝子（ＶＪエレメント）をまずサブクローニ ングする。組換え遺伝子を含むプラスミドＤＮＡは適当なＪまたはＣ領域プロー ブによるハイブリダイゼーションで同定できる。それからこの可変領域遺伝子を 適合する末端を生ずるエンドヌクレアーゼを用いたベクターおよび遺伝子の制限 により望ましい発現ベクターに移す。このライゲーション混合物でバクテリアを トランスホームし、完全な軽鎖遺伝子（可変および定常領域）を正しい方向で含 むトランスホーマントを制限消化で同定する。一度軽鎖をコードする遺伝子を発 現ベクター（バクテリオファージまたはプラスミド）中に構築すればこのベクタ ーを線状化しその遺伝子を発現し得る適当な真核宿主細胞中に対応する重鎮をコ ードする遺伝子とともに同時に、または連続的にトランスフェクトし得る。Easily restriction mapped and subcloned into expression vectors or cassettes. First, the recombinant light chain variable region gene (VJ element) is subcloned. ing. The plasmid DNA containing the recombinant gene is labeled with an appropriate J or C region probe. can be identified by hybridization with Then this variable region gene Restriction of vectors and genes using endonucleases that generate compatible ends into a more desirable expression vector. This ligation mixture allows bacteria to transform and contain the complete light chain gene (variable and constant regions) in the correct orientation. The transformants are identified by restriction digestion. Once the gene encoding the light chain is produced, This vector can be constructed into a current vector (bacteriophage or plasmid). linearize the gene and co-incorporate the corresponding heavyweight into a suitable eukaryotic host cell capable of expressing the gene. can be transfected simultaneously or sequentially with the encoding genes.
抗体モノマー中に構築されたこの軽鎖はそれが二重の軽鎖配列、特に可変領域の ものなど付加的アミノ酸配列を含むという意味で“異常”と考えられる。挿入ア ミノ酸は軽鎖の可変領域遺伝子な長でかつ適当な位置に存在することでオリゴマ ー化を可能にする。This light chain constructed into antibody monomers is composed of two light chain sequences, particularly the variable region. It is considered "abnormal" in the sense that it contains additional amino acid sequences such as Insert a Mino acids are long enough to be present in light chain variable region genes and at appropriate positions, allowing oligomerization. - Enables
一般にはこの挿入物はより大きなものがモノマーをオリゴマーにするにはより効 果的であるけれども約２０個の連続するアミノ酸を用いる。たとえば約７５から １１０個のアミノ酸、またはそれ以上の実質的に二重の（７０％以上）のＶ領域 を含む約５０個のアミノ酸からなる挿入物が好ましい。このように挿入物は一般 的には抗体特に抗体軽鎖と会合した配列の誘導体であることが望ましいが、重合 を誘導する他の配列も使用し得る。この配列は軽鎖Ｖ領域から誘導されることが 最も好ましく、またＶ領域シグナル配列は含んでも含まなくてもよい。In general, larger inserts are more effective at converting monomers into oligomers. Although approximately 20 contiguous amino acids are used. For example, from about 75 Substantially double (70% or more) V region of 110 amino acids or more Inserts of about 50 amino acids containing are preferred. Inserts are generally Generally, derivatives of sequences associated with antibodies, particularly antibody light chains, are desirable, but polymerization Other sequences that induce . This sequence can be derived from the light chain V region. Most preferably, a V region signal sequence may or may not be included.
この付加的配列は重鎮と会合する、または抗原と結合する軽鎖の能力を実質的に 妨害しない部分の軽鎖（カッパまたはラムダ）領域に挿入されることが望ましい 。したがってどの挿入物も軽鎖の骨組み領域、すなわち重鎮および軽鎖可変領域 の接触残基を保存している。オリゴマー化を起こす付加的配列の挿入は軽鎖のＶ 領域とＣ領域の間またはＶ領域のアミノ末端側に存在することが最も望ましい。This additional sequence substantially reduces the ability of the light chain to associate with the heavy chain or bind antigen. Preferably inserted into the light chain (kappa or lambda) region of the non-interfering part . Therefore, any inserts will include the backbone regions of the light chain, i.e. the heavyweight and light chain variable regions. The contact residues are conserved. Insertion of additional sequences that cause oligomerization occurs in the V of the light chain. It is most desirable to exist between the region and the C region or on the amino terminal side of the V region.
またアミノ酸リンカ−を用いてオリゴマー化を起こすことも可能である。リンカ −とは挿入された配列に構造的柔軟性を提供するように選ばれた約３個から１０ 個またはそれ以上のアミノ酸からなる配列である。たとえば本明細書で説明して いる好ましい態様におけるリンカ−はたんばく質分解酵素因子Ｘａ由来の４残基 および比較的中性の５つのアミノ酸、基本的にＧｌｙおよびＳｅｒからなる配列 を含む９個のアミノ酸の配列である。一般にリンカ−は挿入された配列（たとえ ば重複したＶ領域）のＮ末端またはＣ末端に挿入される。It is also possible to cause oligomerization using an amino acid linker. linker - is about 3 to 10 selected to provide structural flexibility to the inserted sequence. A sequence consisting of one or more amino acids. For example, as described herein In a preferred embodiment, the linker comprises 4 residues derived from the proteolytic enzyme factor Xa. and a sequence consisting of five relatively neutral amino acids, essentially Gly and Ser. It is a sequence of nine amino acids including. In general, the linker uses the inserted array (for example It is inserted at the N-terminus or C-terminus of an overlapping V region).
オリゴマー化が起こる詳細なメカニズムは完全には分っていないが、１つの鎖に 由来する余分な軽鎖配列は他のＩｇＧモノマー上の同様の異常軽鎖と会合するの かもしれない。また別のメカニズムでは１つの可変領域由来の余分な配列が他の ＩｇＧモノマーの正常または異常な軽鎖由来の対応する可変領域と置換し、それ によりその七ツマ−のＨ鎖の可変領域と会合する。このように軽鎖の分子量は通 常的２５，０００ダルトンであるが、異常な軽鎖はそれより約ｌθ％、しばしば ２０％、そして典型的には５０％以上（３７，０００ダルトン以上）増加する。Although the detailed mechanism by which oligomerization occurs is not completely understood, The derived extra light chain sequence associates with similar abnormal light chains on other IgG monomers. Maybe. Another mechanism is that extra sequences from one variable region Substitute the corresponding variable region from the normal or abnormal light chain of the IgG monomer and It associates with the variable region of the heavy chain of the heptadome. In this way, the molecular weight of the light chain is Normally 25,000 daltons, but abnormal light chains are about 1θ% lower, often 20%, and typically more than 50% (more than 37,000 Daltons).
このような異常軽鎖様分子は抗カッパ免疫グロブリンのような典型的抗軽鎖試薬 で認識される。このような軽鎖の１つまたは２つが細胞（または抽出物）によっ てオリゴマー形成に用いられる少なくとも１つのモノマーに取り込まれる。この オリゴマー（またはマルチマー）にはこの様な異常軽鎖を有する少な（とも１つ のモノマーが含まれる。Such aberrant light chain-like molecules can be detected by typical anti-light chain reagents such as anti-kappa immunoglobulin. It is recognized by One or two of these light chains are carried by the cell (or extract). and incorporated into at least one monomer used in oligomer formation. this Oligomers (or multimers) contain a small number (or one) of such abnormal light chains. Contains monomers.
正常およびここで述べられている異常軽鎖の両方が同じ細胞によって合成される メカニズムは完全には理解されていない。これに限定される訳ではないが可能性 のある１つの仮説を以下に示す。Both normal and abnormal light chains described here are synthesized by the same cell The mechanism is not completely understood. Possible but not limited to this One hypothesis is shown below.
２つのポリペプチド鎖が宿主ゲノム中に組込まれた多コピーのベクターから、ま たは単一コピーのベクター由来のＲＮＡ転写物の別のスプライシングにより作ら れ得る。もしも多コピーのベクターがある場合、これらのコピーの１つ以上が組 込み過程の前、間または後に修正される。これに限定されるわけではないがこれ らの修正には軽鎖、特に可変領域をコードするエクソンの１つまたは両方の全て または一部の二重化が含まれる。別のスプライシングメカニズムの場合、このベ クター配列はベクター中の潜在的スプライスアクセプタ一部位が活性化され、か つベクターまたは宿主ゲノムのいずれか由来のスプライスドナー配列と結合する ように組込まれる。正常および異常スプライシングのいずれも同じ細胞内で異な る効率で起こる。from a multicopy vector with two polypeptide chains integrated into the host genome. or by alternative splicing of a single copy of the vector-derived RNA transcript. It can be done. If you have a multicopy vector, one or more of these copies modified before, during or after the embedding process. Although not limited to this These modifications include all of one or both exons encoding the light chain, particularly the variable region. Or some duplication is included. For alternative splicing mechanisms, this base The vector sequence is activated when a potential splice acceptor site in the vector is activated. splice donor sequences from either the vector or the host genome It will be incorporated like this. Both normal and aberrant splicing differ within the same cell. This happens with efficiency.
重鎮の可変領域をクローン化し、同じ、または別の細胞系列由来の定常領域を含 むカセットに挿入する。この定常領域は親杭体の定常領域のアイソタイプまたは サブクラスと同じものでも違うものでもよいし、種も同じものでも違うものでも よい。それから機能的に結合する遺伝子を用い適合し得る軽鎖を発現する宿主細 胞系列をトランスフェクトする。Clone the variable regions of key players and include constant regions from the same or another cell lineage. cassette. This steady region is the isotype of the steady region of the parent pile body or It can be the same or different from the subclass, and the species can be the same or different. good. The operably linked genes are then used to create a host cell expressing a compatible light chain. transfect the cell lines.
重鎮遺伝子の一般的構造はよく分っている。たとえばエクソン（Ｅｌｌｉｓｏｎ ）およびフード（Ｈｏｏｄ）、Ａｄｖ、 Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ、１３．１１ ３−１４７ （１９８３） 、ジョホ（Ｊｏｈｏ）等、Ｃｕｒｒ、 Ｔｏｐｉｃ ｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ。The general structure of key genes is well understood. For example, Exon (Ellison ) and Hood, Adv, Human Genet, 13.11 3-147 (1983), Joho et al., Curr, Topic s Develop.
Ｂｉｏｌ、１８．１５−５８ （１９８３）、およびカラン（Ｃａｌａｍｅ）、 Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、３ ：１５９−１９５ （１９８５）参 照（これらは参考として引用している）。機能性重鎮をコードする遺伝子は定常 領域遺伝子、ガンマ、ミュー、アルファ、ニブシロンまたはデルタ、またはそれ らのサブクラスのいずれか１つに由来するイントロンによって分離されている組 換え可変領域から成る。Biol, 18.15-58 (1983), and Calame, See Ann, Rev. Immunol, 3:159-195 (1985). (these are cited for reference only). Genes encoding functional keystones are stationary region gene, gamma, mu, alpha, nibsilon or delta, or pairs separated by introns derived from any one of the subclasses of It consists of variable regions.
可変領域遺伝子が定常領域遺伝子の５′側に挿入し完全な発現可能重鎮遺伝子を 含む発現ベクターを生じ得るようＤＮＡベクター中に重鎮定常領域遺伝子を含む カセットを構築することが望ましい。このことは重鎮定常領域遺伝子をその５′ 側にリンカ−を用いてベクターに挿入することで行う。それから可変領域遺伝子 をそのリンカ−領域に挿入する。制限エンドヌクレアーゼの部位を提供するポリ リンカーは当分野でよく知られている。The variable region gene is inserted on the 5' side of the constant region gene to create a fully expressible key gene. The key constant region genes are included in the DNA vector to generate an expression vector containing the key constant region genes. It is desirable to construct a cassette. This indicates that the key constant region genes are This is done by inserting it into a vector using a linker on the side. Then variable region genes into its linker region. Polymers that provide sites for restriction endonucleases Linkers are well known in the art.
以下の実施例で用いている発現カセット構築用に適したベクターはサウザーン（ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）およびバーブ（Ｂｅｒｇ） （Ｊ、 Ｍｏ１． Ａｐｌ）Ｉ 。A suitable vector for expression cassette construction used in the following examples is Southern ( Southern) and Berg (J, Mo1. Apl) I .
Ｇｅｎｅｔ、ｌ：３２７−３４１ （１９８２）、参考として引用する）によっ て報告されている。ｐ５Ｖ２−ｎｅｏはＩ）ＢＲ３２２複製オリジン、ベーター ラクタマーゼをコードする遺伝子、哺乳類細胞中での複製を可能にするＳＶ４０ 複製オリジンおよびバクテリアおよび曙乳類細胞における選択可能マーカーを提 供するネオマイシン−カナマイシン耐性遺伝子を有している。種々の細胞への遺 伝子の安定な移行に適した他のベクターはよく知られており、たとえばコフィン （Ｃｏｆｆｉｎ） 、Ｒ，ＮＡ腫瘍ウィルス、第２巻、ウニイス（Ｗｅｉｓｓ） 等編、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ、ニューヨーク（１９８５）、ｐ ｐ３６−６３およびウォク（Ｋｖｏｋ）等、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 ＵＳＡ、８３ ： ４５５２ （１９８６） （これらは参考と して引用している）に報告されている。Genet, l:327-341 (1982), cited by reference). It has been reported that p5V2-neo is I) BR322 replication origin, beta SV40, a gene encoding a lactamase that allows replication in mammalian cells Providing replication origins and selectable markers in bacterial and mammalian cells. It has a neomycin-kanamycin resistance gene. Legacy to various cells Other vectors suitable for stable transfer of genes are well known, such as coffin (Coffin), R, NA Tumor Virus, Volume 2, Weiss et al., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1985), p. p36-63 and Kvok et al., Proc, Natl, Acad, Sci, USA, 83: 4552 (1986) (These are for reference only. (quoted).
免疫グロブリン遺伝子の発現用カセットの構築において、後のクローニングステ ップを妨害する制限部位を含まないようベクターを修正する必要がある。また、 修正は選択可能マーカーをコードする遺伝子のより高レベルの発現を指令しこの ベクターを取り込んだ細胞の選択が容易になるよう設計する。In the construction of immunoglobulin gene expression cassettes, subsequent cloning steps are The vector needs to be modified so that it does not contain restriction sites that would interfere with the replication. Also, The modification directs higher levels of expression of the gene encoding the selectable marker and this Designed to facilitate selection of cells that have taken up the vector.
ある場合、重鎮定常領域（ＣＨ）遺伝子を挿入したベクターに依存してまずＣＨ 遺伝子の５′末端がポリリンカー領域に隣接するような方向でシャトルベクター 中にサブクローン化することが便利である。それからこのシャトルベクターを適 当な制限酵素で消化し、その５′末端にポリリンカーをもっＣＨ遺伝子を放出さ せる。このフラグメントを単離し発現ベクターにクローン化してそのポリリンカ ー領域に目的のＶ領域遺伝子を挿入するための簡便なカセットを生成する。In some cases, depending on the vector into which the heavyweight constant region (CH) gene has been inserted, the CH Orient the shuttle vector so that the 5' end of the gene is adjacent to the polylinker region. It is convenient to subclone within. Then apply this shuttle vector Digest with the appropriate restriction enzyme to release the CH gene with a polylinker at its 5' end. let This fragment was isolated and cloned into an expression vector to link its polylinker. Generates a simple cassette for inserting the desired V region gene into the -region.
種々のヒトアイソタイプのＣＨ遺伝子のクローンについての報告がある。生殖系 列ヒトガンマ−１遺伝子のクローニングは、フラナガン（Ｆｌａｎａｇａｎ）お よびロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）、Ｎａｔｕｒｅ、 ３００ニア０９−７１３ （１９８２）およびエリソン（Ｅｌｌｉｓｏｎ）等、Ｎｕｌｃ。There are reports of CH gene clones of various human isotypes. reproductive system The cloning of the human gamma-1 gene was carried out by Flanagan et al. and Roberts, Nature, 300 Near 09-713 (1982) and Ellison et al., Nulc.
Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、１０：４０７１−４０７９ （１９８２）に報告されている 。またガンマ−２遺伝子はフラナガン（Ｆｌａｎａｇａｎ） 、上述、およびエ リソン（Ｅｌｌｉｓｏｎ）およびフード（）ｆｏｏｄン、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ 。Ac1dsRes, 10:4071-4079 (1982). . The gamma-2 gene has also been described by Flanagan, supra, and E. Ellison and Food, Proc, Natl .
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 ＵＳＡ ７９ ：１９８４−１９８９ （１９８２） およびタカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）等、Ｃｅ１ｌ、２９ ： ６７１−６７ ９ （１９８２）に報告されている。ガンマ−３およびガンマ−４遺伝子はフラ ナガン（Ｐｌａｎａｇａｎ） 、上述、に報告されており、またガンマ−４遺伝 子もエリソン（Ｅｌｌｉｓｏｎ）上述およびエリソン（Ｂｌｌｉｓｏｎ）等、Ｄ ＮＡＩ ： １１−１８ （１９８１）に報告されている。ミュー遺伝子はラベ ック（Ｒａｖｅｔｃｈ）等Ｃｅ１ｌ ２７ ： ５８３−５９１（１９８１）に 報告され、またアルファー１１アルフアー２およびニブシロン遺伝子はフラナガ ン（Ｆｌａｎａｇａｎ） 、上述に報告されている。これらの文献は参考として 引用している。１つまたは両方の重鎮染色体はＶＤＪ組換えを行ない得るが、Ｒ ＮＡ種の１だけ（もしも両方がｍＲＮＡとして発現される場合）が完全な重鎮ポ リペプチドに翻訳される（対立遺伝子排除）。したがって両方の組換え対立遺伝 子をクローニングし、ついで適当な宿主細胞へのトランスフェクションによりど ちらの対立遺伝子が発現されているか決定する必要がある。これを行うためにゲ ノムＤＮＡを適当なエンドヌクレアーゼで制限処理し、分取用スクロース勾配遠 心により目的サイズ（サウザーントランスファーおよびＪＨ領域プローブによる ハイブリダイゼーションにより決定される）のＤＮＡフラグメントを濃縮し、こ れを用いてバクテリオファージライブラリーを作る。それからこのライブラリー をＪＨ領域プローブでスクリーニングし、ポジティブプラーグを同定、精製およ び増巾する。制限地図作製およびＣＨカセットへのサブクローニング化を行うた め組換え重鎮可変領域遺伝子（ＶＤＪ遺伝子）をサブクローン化する。組換えＶ 領域遺伝子を含むプラスミドＤＮＡをＪＨプローブおよびＪ領域３′側の保存的 ０．８ ｋｂＨ１ｎｄｎ［−Ｂ ｇｌＩ［フラグメントによるハイブリダイゼー ションで同定する。それからＶ領域遺伝子を適合末端を生ずるエンドヌクレアー ゼによる各成分の制限処理および２つの成分のライゲーションによりＣＨカセッ ト中のＣＨ遺伝子の５′側の１つの部位に移す。このライゲーション混合物でバ クテリアをトランスホームし、正しい方向で完全な重鎮遺伝子を含むトランスホ ーマントを制限消化により同定する。Acad, Sci, USA 79:1984-1989 (1982) and Takahashi et al., Ce1l, 29: 671-67. 9 (1982). gamma-3 and gamma-4 genes are Planagan, supra, and the gamma-4 gene. Ellison, supra and Bllison et al., D. Reported in NAI: 11-18 (1981). The mu gene is labeled Ravetch et al. Ce1l 27: 583-591 (1981). reported, and the alpha 11 alpha 2 and nibsilon genes were Flanagan, as reported above. These documents are for reference only. I am quoting. One or both heavyweight chromosomes can undergo VDJ recombination, but R Only one of the NA species (if both are expressed as mRNA) is a complete heavyweight. translated into repeptides (allelic exclusion). Therefore both recombinant alleles The offspring are cloned and then transfected into suitable host cells. It is necessary to determine whether either allele is expressed. game to do this The genomic DNA was restricted with an appropriate endonuclease and subjected to preparative sucrose gradient centrifugation. Target size (by southern transfer and JH region probe) Concentrate the DNA fragments (determined by hybridization) and Use this to create a bacteriophage library. Then this library screened with a JH region probe to identify, purify, and identify positive plaques. Increase in width. For restriction mapping and subcloning into CH cassettes. The recombinant heavyweight variable region gene (VDJ gene) is subcloned. Recombinant V The plasmid DNA containing the region gene was used with the JH probe and the conservative 3' side of the J region. Hybridization by 0.8 kbH1ndn[-B glI[fragment] Identification by section. The V region gene is then endonucleated to create compatible ends. The CH cassette is created by restriction treatment of each component with enzyme and ligation of the two components. into one site on the 5' side of the CH gene in the host. This ligation mixture transform Cacteria and contain the complete key genes in the correct orientation. The cloak is identified by restriction digestion.
１度合重鎮遺伝子が構築されればそれを線状化し軽鎖遺伝子と共発現に適した宿 主にトランスフエクトし得る。Once the polymer chain gene is constructed, it is linearized and found in a suitable host for co-expression with the light chain gene. Mainly can be transfected.
当業者は広範囲の組換えＤＮＡ技術を用いてモノマーのオリゴマー化に寄与する 領域を含むオリゴマー抗体をコードするＤＮＡまたはその領域を単離し生産用の 種々の宿主に移行させ得る。ここで述べられている操作に加え、修正された定常 領域を含む抗体同様キメラ、クラススイッチまたはヒューマナイズド（超可変領 域移行）抗体は申請中の米国継続Ｎｏ、２５４，００４、米国特許４．８１６， ３９７およびＥＰＯ刊行ＥＰ１７３，４９４およびＥＰ２３９．４００に報告さ れている（これらは参考として引用している）。Those skilled in the art will utilize a wide range of recombinant DNA techniques to contribute to the oligomerization of monomers. DNA encoding an oligomeric antibody containing the region or the region is isolated and used for production. It can be transferred to a variety of hosts. In addition to the operations described here, a modified stationary chimeric, class-switched or humanized (hypervariable regions) as well as antibodies containing (regional transfer) antibody is pending U.S. Continuation No. 254,004, U.S. Patent No. 4.816, 397 and reported in EPO publications EP 173,494 and EP 239.400. (these are cited for reference only).
たとえばこのような技術を用いてオリゴマーのＦ（ａｂ’）ｚフラグメントを作 る。異常軽鎖を含むＦ（ａｂ’）ｔフラグメントは組換え技術を用いて作り得る 。そこでは異常軽鎖は上述のごとく作製し、また重鎮は鎖間ジスルフィド結合を 担うシスティンの後に停止コドンを挿入することにより未成熟である。たとえば ヒトγ１鎖の場合、これはたとえば部位指定突然変位誘発により残基２２６（ユ 、エデルＴ：／ （Ｅｕ、 Ｅｄｅｌｍａｎ）等、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ ｃａｄ、 Ｓｃｉ、。For example, such techniques can be used to create oligomeric F(ab')z fragments. Ru. F(ab')t fragments containing abnormal light chains can be produced using recombinant techniques. . There, the abnormal light chain was created as described above, and the heavy chain had an interchain disulfide bond. It is immature by inserting a stop codon after the responsible cysteine. for example In the case of the human γ1 chain, this can be achieved, for example, by site-directed mutagenesis at residue 226 (the , Edel T:/ (Eu, Edelman), etc., Proc, Natl, A cad, sci.
ＵＳＡ ６３ニア８−８５ （１９６９）の番号付けに従う）のシスティンの後 の読み枠に翻訳停止コドンを導入することにより行い得る。この方法はＲＮＡ構 造の変化が少なくその結果正常なＲＮＡスプライシングおよび安定性が保存され るという利点がある。ヒト１ｇＧの重鎮間ジスルフィド結合に関する最初のシス ティン残基はＩ ｇＧｔ 、Ｉ ｇＧｔおよびＩｇＧ＊に対し各々残基２２１． ２２６および２２６である。After the cysteine of USA 63 Near 8-85 (according to the numbering of 1969) This can be done by introducing a translation stop codon into the reading frame. This method uses RNA constructs. Few structural changes result in preservation of normal RNA splicing and stability. It has the advantage of being The first cis-sulfide bond between the heavyweights of human 1gG The tin residue is at residue 221. for IgGt, IgGt and IgG*, respectively. 226 and 226.
免疫グロブリンマルチマーの検出は液体クロマトグラフィー、勾配遠心およびゲ ル電気泳動などを含む多くの技術で行ない得る。Detection of immunoglobulin multimers is performed using liquid chromatography, gradient centrifugation and gelatinization. This can be done by a number of techniques, including electrophoresis and the like.
マルチマーの活性の増加は定量的抗原結合検定、抗体競争実験およびオブンニン 作用検定で測定できる。これらの技術は当業者によく知られており、たとえばバ ーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ） 、抗体、ラボラトリ−マニ ュアル、コールドスプリングハーバ−１Ｎ、Ｙ、（１９８８）（参考として引用 する）に報告されている。先に述べたように宿主細胞は多種の免疫グロブリン分 子を分泌する。もしこの宿主がミエローマの場合トランスフェクトした遺伝子と は異なる結合特異性の抗体を本質的に生産することも生産しないこともある。こ の細胞は多価マルチマーに加えて二価モノマーを分泌する。マルチマーは先に述 べたように軽鎖の１つまたは両方が異常な少な（とも１つのモノマーを有してい る。したがって培養上清中に含まれる抗体の５０％以上が正常なモノマーで５〜 １０％程がマルチマーである。このマルチマーは細胞培養で生ずる抗体の少なく とも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは約５０％、もっとも 好ましくは９０％以上であることが望ましい。結合活性の高い抗体は巾広い症状 の病気の治療や診断に有用である。もしオリゴマー抗体が親モノクロー六ル抗体 産生細胞系列から誘導されるなら、このマルチマーは改良された治療特性および 診断特性を提供する。たとえばもし親抗体がＩｇＭ分子でありかつそのマルチマ ーが１ｇＧ七ツマツマーむなら、そのマルチマーはＩｇＭなどの特定の多価抗体 に内在する抗感染治療特性を有しており、また胎盤を通過し、たとえば胎児を感 染から守るというこれらに独特の能力などＩｇＧモノマーに本質的な性質を有し ている。ＩｇＧマルチマーは精製、安定性の増加、シェルフライフの増加、およ びインビボでの寿命の増加など一般的にＩｇＧに関する性質も有している。マル チマーの結合活性の増加により、たとえば腫瘍や感染にたいして非防御的抗体を 防御的に変換すること、または特定の抗原に対する宿主の免疫応答を活性化また は調節することにより免疫調節因子として働くことが可能である。親抗体が非防 御的ｒｇＧである場合、本方法で生産されるマルチマーは有意な防御能を与える 十分な結合活性を提供する。もちろん結合活性の増加が低アフィニティーおよび 、または低結合活性の二価親分子については使用できないすべての診断操作を可 能にするので、本発明は防御的またはインビボにおけるそのような機能的寄与を 示す抗体マルチマーに限定されるのではないことが理解されよう。Increased activity of multimers was demonstrated in quantitative antigen binding assays, antibody competition experiments, and obunin assays. It can be measured using an effect assay. These techniques are well known to those skilled in the art and include, for example, Harlow and Lane, antibodies, laboratory manufacturers Cold Spring Harbor 1N, Y. (1988) (cited for reference) ) has been reported. As mentioned earlier, host cells contain various types of immunoglobulins. secrete offspring. If this host is a myeloma, the transfected gene may or may not produce antibodies of essentially different binding specificities. child cells secrete divalent monomers in addition to multivalent multimers. Multimers were mentioned earlier. One or both of the light chains have an abnormally small number (both have one monomer), as shown in Ru. Therefore, more than 50% of the antibodies contained in the culture supernatant are normal monomers. About 10% is multimer. This multimer reduces the amount of antibodies produced in cell culture. preferably at least 25%, more preferably about 50%, most preferably Preferably it is 90% or more. Antibodies with high binding activity cause a wide range of symptoms It is useful in the treatment and diagnosis of diseases. If the oligomer antibody is the parent monoclonal antibody If derived from the producing cell line, this multimer exhibits improved therapeutic properties and Provide diagnostic properties. For example, if the parent antibody is an IgM molecule and its multimer If 1 gG is combined with 7 molar molecules, that multimer is a specific multivalent antibody such as IgM. It has inherent anti-infective therapeutic properties and also crosses the placenta, e.g. IgG monomers have essential properties, including their unique ability to protect against ing. IgG multimers can be purified, increased stability, increased shelf life, and It also has properties commonly associated with IgG, including increased longevity in vivo. Maru Increased avidity of zymers may result in the release of non-protective antibodies against tumors and infections, for example. transform in a protective manner, or activate or activate the host's immune response against a particular antigen. can act as an immunomodulatory factor by regulating it. Parent antibody is non-protective When the target rgG is Provide sufficient binding activity. Of course increased avidity is associated with low affinity and , or all diagnostic procedures not available for divalent parent molecules with low avidity. The present invention enables such functional contribution in defense or in vivo. It will be understood that the antibody multimers shown are not limited.
また、本発明はここで例示する特定のマルチマーの抗原結合特異性に限定されな いことも理解されよう。巾広いモノクローナル抗体について技術および特許文献 に報告されており、その多くは細胞系列保管所から入手し得る。ここで述べた方 法はこのような細胞系列由来の免疫グロブリン遺伝子から新しいオリゴマー組成 物を作る能力を提供している。Furthermore, the present invention is not limited to the antigen-binding specificity of the specific multimers exemplified herein. I hope you understand that. Technical and patent literature about broad monoclonal antibodies Many of them are available from cell lineage repositories. The one mentioned here The method generates new oligomer compositions from immunoglobulin genes derived from such cell lineages. It provides the ability to create things.
腫瘍を阻害し、免疫調節因子として働き、または病原体の攻撃を防御するなどの これら抗体の能力は当業者によく知られているインビトロおよびインビボでの巾 広いシステムで測定し得る。非防御的または弱防御的ＩｇＧから誘導されるオリ ゴマー抗体を誕生後投与することによるグループロストレプトコッカスに対する 防御力の増加をテストする操作は以下に示す実施例■に述べられ゛ ている。such as inhibiting tumors, acting as an immunomodulator, or defending against pathogen attack. The potency of these antibodies has a range of in vitro and in vivo capabilities that are well known to those skilled in the art. Can be measured in a wide range of systems. Origen derived from non-protective or weakly protective IgG against group Streptococcus by postnatal administration of Gomer antibody. The procedure for testing the increase in defense power is described in Example 2 below.
特に新しいオリゴマーモノクローナル抗体およびその医薬組成物は予防およびま たは治療を目的とした非経口投与に有用である。In particular, new oligomeric monoclonal antibodies and their pharmaceutical compositions are useful for prevention and treatment. It is useful for parenteral administration for therapeutic purposes.
したがって本発明は許容可能キャリヤー好ましくは水性キャリヤーに溶かしたオ リゴマーモノクローナル抗体またはオリゴマーおよび非オリゴマー抗体の混合物 の溶液を含む非経口投与に適した組成物を提供する。たとえば水、緩衝液、０． ４％食塩水、０．３％グリシンなど多（の水性キャリヤーを使用し得る。これら の組成物は従来からよく知られている方法で滅菌する。この組成物はたとえば酢 酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウ ムなどｐＨ調整および緩衝剤、毒性調整剤のような生理的条件に必要とされる医 薬的に許容可能な補助物質を含む。これら製剤中の抗体濃度は様々で、約０．５ ％以下、通常少なくとも１％から１５または２０％（重量）の範囲にあり、基本 的に投与様式に従かい液体容積、粘度などにより選択される。Accordingly, the present invention provides an oleaginous solution dissolved in an acceptable carrier, preferably an aqueous carrier. Ligomeric monoclonal antibodies or mixtures of oligomeric and non-oligomeric antibodies There is provided a composition suitable for parenteral administration comprising a solution of. For example, water, buffer, 0. Aqueous carriers such as 4% saline, 0.3% glycine, etc. may be used. The composition is sterilized by conventional, well-known methods. This composition can be used, for example, in vinegar. Sodium chloride, sodium lactate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride Pharmaceuticals required for physiological conditions such as pH adjustment and buffering agents, toxicity modifiers, etc. Contains pharmaceutically acceptable auxiliary substances. The antibody concentration in these formulations varies, approximately 0.5 % or less, usually in the range of at least 1% to 15 or 20% (by weight), basically It is selected according to the mode of administration, liquid volume, viscosity, etc.
成人の感染を治療するための静脈投与用の典型的医薬組成物は２５０ｍ！！の無 菌リンゲル液と１０ Ｏｎ＋ｇ−１０ｇの抗体で調合し得る。非経口投与調合物 を調製する実際的方法は当業者によく知られており、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏ ｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ５ｃｉｅｎｃｅ、第１６編、マック出版社 、エーストン、ＰＡ（１９８２）（参考として引用した）により詳しく報告され ている。A typical pharmaceutical composition for intravenous administration to treat infections in adults is 250 m! ! nothingness It can be prepared with bacterial Ringer's solution and 10 On+g - 10 g of antibody. Parenteral formulations Practical methods for preparing are well known to those skilled in the art and are described, for example, by Remingto n Pharmaceutical 5science, 16th edition, Mac Publishing , Astone, P. A. (1982) (cited for reference). ing.
本発明のオリゴマー抗体またはその混合物を含む組成物は予防および、または治 療用に投与し得る。治療に使用する場合、すでに病気にかかっている患者にその 病気およびその併発症を治すかまたは部分的に停止させるのに十分な量の組成物 が投与される。Compositions containing oligomeric antibodies or mixtures thereof of the present invention can be used for prophylactic and/or therapeutic purposes. Can be administered therapeutically. When used therapeutically, it is given to patients who already have the disease. a composition in an amount sufficient to cure or partially arrest the disease and its complications; is administered.
これを行うのに適当な量を“治療有効投与量″と呼ぶ。この用途に有効な量は感 染の重度や患者自身の免疫系の状態に依存するが一般に投与当り体重キログラム 当り抗体量０．１〜約５０ｍｇの範囲にあり、より一般的には患者キログラム当 り抗体５〜２５ｍｇの範囲である。一般に本発明の物質は重度の病状、すなわち 致命的または将来的に致命的となる状態で使用しなければならない。このような 場合、本発明により容易に作られる実質的ヒトオリゴマー抗体で達成される外来 物質の最小化および“外来物質”拒絶の可能性の軽減の見地から実質的に過剰な これら抗体の投与が可能でありかつ担当医によっても望ましいと感じられるであ ろう。An amount adequate to do this is referred to as a "therapeutically effective dose." The effective amount for this application is Depending on the severity of the infection and the state of the patient's own immune system, it is generally a kilogram of body weight per dose. The amount of antibody per kilogram of patient ranges from 0.1 to about 50 mg per kilogram of antibody. The amount of antibody used ranges from 5 to 25 mg. In general, the substances of the invention are suitable for severe medical conditions, i.e. Must be used in conditions that are fatal or will become fatal. like this In this case, the foreign Substantially excessive amounts of material should be removed from the standpoint of material minimization and reducing the possibility of “foreign material” rejection. If the administration of these antibodies is possible and felt desirable by the attending physician, Dew.
予防的応用の場合、本発明の抗体またはその混合物を含む組成物はまた病気にか かっていないヒトに耐性を与えるために投与される。その量は“予防有効投与量 ”と呼ぶ。この場合も詳細な量は患者の健康状態や免疫の一般的レベルに依存す るが、一般にはキログラム当り０．１〜２５ｍｇ、特にキログラム当り０．５〜 ２．５ｍｇの範囲にある。好ましい予防的用途には母体を介しての感染の危機に ある胎児および新生児の予防である。処置が胎盤の通過に依存する場合、その投 与量は妊婦の血液から胎児の血液に移り得る抗体の割合に応じて調整する必要が ある。この組成物の単一または多重投与は担当医が選ぶ投与量レベルや投与様式 に応じて行なわれる。いかなる場合でもこの医薬製剤は患者の治療に十分な量の 本発明のオリゴマー抗体を提供しなければならない。For prophylactic applications, compositions containing antibodies of the invention or mixtures thereof may also be used to prevent disease. It is administered to create tolerance in humans that have not previously experienced it. The amount is “prophylactic effective dose” Again, the exact amount depends on the patient's health status and general level of immunity. However, generally 0.1 to 25 mg per kilogram, especially 0.5 to 25 mg per kilogram. It is in the range of 2.5 mg. Preferred prophylactic uses include those at risk of maternal infection. Some fetal and neonatal prophylaxis. If the procedure depends on passage through the placenta, The dose needs to be adjusted depending on the proportion of antibodies that can be transferred from the pregnant woman's blood to the fetal blood. be. Single or multiple administration of this composition may be determined at the dosage level and mode of administration selected by the attending physician. This will be done accordingly. In no case should this pharmaceutical preparation be used in sufficient quantities to treat the patient. Oligomeric antibodies of the invention must be provided.
さらに本発明の抗体はインビトロでの診断検定にも使用し得る。Additionally, antibodies of the invention may be used in in vitro diagnostic assays.
例として以下の実施例ＩのオリゴマーＩｇＧ抗体はグループロストレプトコッカ スの検出、ワクチン調製などに使用し得る。By way of example, the oligomeric IgG antibody of Example I below It can be used for detection of cancer, vaccine preparation, etc.
診断に使用するときは、この抗体を標識する場合としない場合がある。非標識オ リゴマー抗体は凝集検定で使用できるし、またＦｃ領域に特異的な抗体のような オリゴマー抗体と反応する他の標識抗体（第二抗体）と組合せて使われる。それ とは別に抗体は直接標識される。標識には放射性核種、粒子（たとえば金、フェ リチン、磁性粒子、赤血球）、蛍光物質、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素イ ンヒビター、リガンド（特にハブテン）などが用いられる。多くの免疫検定が使 用でき、たとえば米国特許４．３７６．１１０（参考として引用している）およ びバーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、（上述）に報告されて いるような競合およびサンドイッチ検定など当業者によく知られている。When used for diagnosis, this antibody may or may not be labeled. Unlabeled o Ligomeric antibodies can be used in agglutination assays, and antibodies specific for the Fc region can also be used in agglutination assays. It is used in combination with another labeled antibody (secondary antibody) that reacts with the oligomer antibody. that Alternatively, antibodies can be directly labeled. Labels may include radionuclides, particles (e.g. gold, lithin, magnetic particles, red blood cells), fluorescent substances, enzymes, enzyme substrates, enzyme cofactors, enzyme Inhibitors, ligands (especially habten), etc. are used. Many immunoassays are used For example, U.S. Pat. No. 4.376.110 (cited by reference) and and Harlow and Lane, (supra). Such competitive and sandwich assays are well known to those skilled in the art.
また選択された抗原に対する防御またはその検出に使用できる本抗体を用いたキ ットも提供し得る。したがって本発明の抗体組成物は通常は凍結乾燥形で容器中 に単独に、または他の抗体と一緒に提供される。標識またはトキシンに結合した 形の抗体または未結合の抗体はトリス、リン酸塩、炭酸塩などのバッファ、安定 化剤、防腐剤、血清アルブミンなどの不活性たんばく質および使用説明書ととも にキットに含められる。一般にこれらの物質は活性抗体量の約５重量パーセント 以下でかつ、抗体濃度の少なくとも約０．０００１重量パーセントの量が存在す る。しばしば不活性希釈剤または賦形剤が添加される。賦形剤は全組成物の約１ 〜９９％を占める。オリゴマー抗体に結合し得る第２抗体を検定に用いる場合、 これは別のバイアルに入れる。一般に２次抗体は標準と結合しており先に示した 抗体製剤と類似する様式で成型する。In addition, a kit using this antibody that can be used to protect against or detect a selected antigen. may also be provided. Accordingly, the antibody compositions of the present invention are typically packaged in lyophilized form. alone or together with other antibodies. bound to a label or toxin Antibodies in the form or unbound are stable in buffers such as Tris, phosphate, carbonate, etc. Along with antioxidants, preservatives, inert proteins such as serum albumin, and instructions for use. included in the kit. Generally these substances are present at about 5 percent by weight of the amount of active antibody. or less and is present in an amount of at least about 0.0001 weight percent of the antibody concentration. Ru. Often inert diluents or excipients are added. Excipients account for about 1% of the total composition It accounts for ~99%. When a second antibody capable of binding to the oligomeric antibody is used in the assay, Place this in a separate vial. Generally, the secondary antibody is conjugated to a standard and is shown above. Molded in a manner similar to antibody formulations.
以下の実施例は説明のために提供されるもので本発明を制限するものではない。The following examples are provided by way of illustration and are not intended to limit the invention.
（実施例１） （結合活性が増加した高分子量抗体の生産）グループＢストレプトコッカス（Ｃ ＢＳ）のグループＢ炭水化物に特異的なモノクローナル抗体は出願中の米国特許 出願Ｎｏ。(Example 1) (Production of high molecular weight antibodies with increased binding activity) Group B Streptococcus (C BS)'s monoclonal antibodies specific for Group B carbohydrates are subject to a pending U.S. patent application. Application No.
１８９．３５９（参考として引用している）に報告されているように単離され、 特性が明らかにされた。本来ＩｇＭアイソタイプのこれらの抗体は出願中のＵＳ ＳＮ２５４．ＯＱ４ （参考として引用している）に述べられている組換えＤＮ Ａ技術によりＩｇＧにクラススイッチした。189.359 (cited by reference), characteristics have been revealed. These antibodies, which are originally IgM isotype, have a pending U.S. SN254. Recombinant DNA stated in OQ4 (cited as reference) The class was switched to IgG using the A technique.
典型的ＩｇＧ抗体よりも実質的に大きい分子量のモノクローナル抗体が上述のク ラススイッチング操作で採用している技術と同様の技術を用いて４Ｂ９リンパ芽 球親細胞系列（ＬＣＬ）からクローン化したＶ領域遺伝子を用いて生産した。簡 単にいうとまずマウスミエローマ系列Ａｇ８，６５３を４Ｂ９の軽鎖をコードす るベクターでトランスフェクトした。抗原結合活性が増加した免疫グロブリンを 分泌するトランスフェクト−マクローンは分子量が増加したＩｇＧ分子および軽 鎖を生産することが分った。Monoclonal antibodies of substantially larger molecular weight than typical IgG antibodies are used in the clones described above. 4B9 lymph buds using a technique similar to that employed in the las switching operation. It was produced using a V region gene cloned from the parent cell line (LCL). simple Simply put, first, mouse myeloma series Ag8,653 was encoded for the light chain of 4B9. transfected with a vector. Immunoglobulin with increased antigen binding activity The secreted transfected macrolones contain IgG molecules of increased molecular weight and light It was found to produce chains.
Ａ、一般的操作 １、ゲノムＤＮＡの調製 ペルチョ（Ｐｅｒｕｃｈｏ）等、１９８ＬＣｅ１１．．２７ ：４６フー７６の 操作と同じ方法で１〜２ＸｌＯ’個の４８９細胞から全高分子量ＤＮＡを精製し た。簡単に云うと、細胞をＰＢＳ （リン酸緩衝液）またはＴＢＳ （）リス緩 衝液）中での遠心で洗浄した後、ＳＤＳ、ＥＤＴＡおよびプロティナーゼＫを含 むトリスバッファ中で溶解した。プロティナーゼ消化につづいてフェノールおよ びクロロホルムでＤＮＡを抽出し、エタノール沈殿後ＴＥに再懸濁した。この操 作を以下に詳細に説明する。A. General operations 1. Preparation of genomic DNA Perucho et al., 198LCe11. ．． 27: 46 Fu 76 Purify total high molecular weight DNA from 1-2XlO' 489 cells using the same method as in the procedure. Ta. Briefly, cells were incubated in PBS (phosphate buffer) or TBS (). After washing by centrifugation in a solution containing SDS, EDTA and proteinase K. lysed in Tris buffer. Following proteinase digestion, phenol and The DNA was extracted with chloroform, precipitated with ethanol, and resuspended in TE. This operation The work will be explained in detail below.
培養物から約１〜２Ｘ１０’個の４８９細胞を採取し、１０００×ｇで１０分間 遠心した。この細胞を５０ｍｌ１のＴＢＳ（１１９８ｇのＮａＣ１，０，３８ｇ Ｋｌ、３．０ｇトリスペース、ＩＮ［（Ｃ１でｐＨ７，４に調整）またはＰＢ Ｓに懸濁し、遠心した後再び懸濁し、また遠心する。最後の遠心後、細胞を少量 のＰＢＳまたはＴＢＳに懸濁する。ある場合にはこれを一２０℃で保存した。各 １０’個の細胞に２００μｇ／ｍｌのプロティナーゼＫ（ベーリンガーマンハイ ム）を含む溶解バッファ（１０！ＩＩＭ）ＩＪＸ、ｐＨ８，０，５０ｏ＋Ｍ Ｅ ＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｆ）を添加した。この容積を以後ｌ容と考える。４ ０分の１容の２０％ＳＤＳを添加し、チューブを素早く混合してから３７℃で一 層インキユベーションする。ついでｌ容の２×フエノール抽出バツフア（１０ｍ Ｍトリス、ｐＨ８，０，１２ｍＭ ＥＤＴＡ、６５０ｔｎＭ Ｎａ１）を添加し 、ついで０．１％８−ＯＨキノリンを含む２容のフェノール（トリスで中性に平 衡化した）を添加した。チューブにフタをし、緩やかに５〜ＩＯ分間混合した後 、２５００ｒｐｍで２０分間遠心した。Harvest approximately 1-2 x 10' 489 cells from the culture and incubate at 1000 x g for 10 min. Centrifuged. The cells were dissolved in 50 ml of TBS (1198 g of NaCl, 0.38 g of Kl, 3.0g trispace, IN [(adjusted to pH 7.4 with C1) or PB After suspending in S and centrifuging, suspend again and centrifuge again. After the final centrifugation, aliquot the cells. of PBS or TBS. In some cases this was stored at -20°C. each 200 μg/ml proteinase K (Boehringermann High Lysis buffer (10! IIM) IJX, pH 8,0,50o+ME DTA, 150mM NaCf) was added. This volume will be considered as 1 volume from now on. 4 Add 1/2 volume of 20% SDS, mix the tube quickly and incubate at 37°C. Layer incubation. Then add 1 volume of 2x phenol extraction buffer (10 m Add M Tris, pH 8, 0, 12mM EDTA, 650tnM Na1). , then 2 volumes of phenol (neutralized with Tris) containing 0.1% 8-OH quinoline. (equilibrated) was added. After capping the tube and gently mixing for 5-IO minutes. , centrifuged at 2500 rpm for 20 minutes.
水層を新しいチューブに移し、中間層が消失するまで１〜３回フェノール抽出を 繰り返した。再びこの水層を新しいチューブに移し、２５：２４：ｌの比のフェ ノール：クロロホルム：イソアミルアルコールＣＰＣＩ）２容を添加した。チュ ーブを混合し、遠心後、その水層を新しいチューブに移した。中間層が消失する まで１〜３回ＰＣＩ抽出を繰り返した。再び水層を新しいチューブに移し、クロ ロホルム、イソアミルアルコール、（２４：１）で２回抽出した。最後に、この 水層を新しいチューブに移し、緩やかに４容のエタノールを重層した。ＤＮＡが しっかりした塊りを作るまでこのチューブを逆さにしながらゆっ（りと混合する 。ガラス棒でＤＮＡを取り出し、エタノール希釈バッファ （１０ｍＭ ）リス 、ｐＨ８，０，１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ ｍＭ ＮａＣ１’ ）で希釈した ７０％エタノール、８５％エタノールおよび１００％エタノールですすいだ。ペ ーパー・タオル上でエタノールを吸い取ることでＤＮＡ−を乾燥し、３７℃、１ 晩かけて数ｍｊ７のＴＥバッファに懸濁した。この容積を以後１容とする。Transfer the aqueous layer to a new tube and perform phenol extraction 1 to 3 times until the middle layer disappears. repeated. Transfer this aqueous layer again to a new tube and add a fertilizer with a ratio of 25:24:l. 2 volumes of alcohol:chloroform:isoamyl alcohol CPCI) were added. Chu After mixing the tubes and centrifuging, the aqueous layer was transferred to a new tube. The middle class disappears PCI extraction was repeated 1 to 3 times until Transfer the aqueous layer again to a new tube and chlorinate it. Extracted twice with loform and isoamyl alcohol (24:1). Finally, this The aqueous layer was transferred to a new tube and gently layered with 4 volumes of ethanol. DNA is Mix slowly by inverting the tube until a firm clump forms. . Remove the DNA with a glass rod and add it to ethanol dilution buffer (10mM). , pH 8,0, 10mM EDTA, 150mM NaCl) Rinsed with 70% ethanol, 85% ethanol and 100% ethanol. Pe Dry the DNA by blotting the ethanol on a paper towel and incubate at 37°C for 1 It was suspended in several mj7 of TE buffer overnight. This volume will hereinafter be referred to as 1 volume.
１容の２ Ｘ ＲＮａｓｅ Ａバッフｙ（１００ｍＭ）リス、ｐＨ８，０，２０ ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＮａＣ１）を加え、さらに１００μｇ／ｍｌｌとな るようにＲＮａｓｅ Ａ （シグマ、＃Ｒ−５１２５）を加えた（ＲＮａｓｅＡ は予め３０分間煮沸して微量混合するＤＮａｓｅ活性を除去した）Ｄこの混合物 を３７℃で３時間インキュベーションした。５分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムを 加え、フェノール／クロロホルムで２回抽出後、このＤＮＡをエタノールで沈殿 し、上述のようにＴＨに懸濁した。1 volume of 2X RNase A buffer (100mM), pH 8,0,20 Add mM EDTA, 20mM NaCl) and further adjust to 100μg/ml. RNase A (Sigma, #R-5125) was added to This mixture was pre-boiled for 30 minutes to remove trace amounts of DNase activity.) was incubated at 37°C for 3 hours. Add 1/5 volume of 3M sodium acetate After extraction with phenol/chloroform twice, the DNA was precipitated with ethanol. and suspended in TH as described above.
生殖系列ＤＮＡ源としてヒト胎盤の細胞から高分子量ＤＮＡを調製した。約５ｇ の胎盤組織から結合組織の除いた。この組織をメスでミンチしＴＢＳ中の遠心（ 各々、１１０００Ｘ、４℃で１０分間）と懸濁により３回洗浄した。この組織（ ３，５ｇ）を２０ｒｒｌＴＢＳに懸濁し、モーター駆動のガラス−テフロンホモ ジナイザー中でホモジナイズしてから再び１０００Ｘｇで１０分間遠心し３．５ ｍｌのＴＥに懸濁した。これで非常に濁ったサスベーンジョンとなる。溶解バッ ファ（０，５Ｍ ＥＤＴＡ、０．５％サーコシルおよび１００μｇ ／ ｍ Ｉ ｌブロティナーゼＫ）を添加し、５０℃で１時間インキユベートシ、ついで３７ ℃で一層インキユベートした。この操作の他の部分はマニアチス（Ｍａｎ ｉａ ｔ ｉｓ ）等、１９８２、モレキュラークローニング、ラボラトリ−マニュア ル、ｐｚｓｏ（参考として引用している）に述べられている様に行った。High molecular weight DNA was prepared from human placental cells as a source of germline DNA. Approximately 5g The connective tissue was removed from the placental tissue. Mince this tissue with a scalpel and centrifuge it in TBS ( The cells were washed three times by suspension at 11,000X for 10 minutes each at 4°C. This organization ( 3.5 g) was suspended in 20rrl TBS and placed in a motor-driven glass-Teflon homogeneous tube. Homogenize in a genizer and centrifuge again at 1000Xg for 10 minutes.3.5 ml of TE. This results in a very muddy suspension. Dissolution bag Fa (0.5M EDTA, 0.5% Sarcosyl and 100μg/m I 1 brotinase K) and incubated at 50°C for 1 hour, then incubated at 37°C. A further incubation was carried out at °C. The other part of this operation is Mania t is) et al., 1982, Molecular Cloning, Laboratory Manual The procedure was carried out as described in Le, pzso (cited for reference).
ただし、ＲＮＡａｓｅＡ消化の後でかつフ↓ノール抽出の前にもう１度サンプル にプロティナーゼＫ（１００μｇ／ｍｊりによる３７℃、−晩の消化を行った。However, one more sample should be taken after RNAase A digestion and before phenol extraction. Digestion with proteinase K (100 μg/mj) was performed at 37° C. overnight.
胎盤ＤＮＡの最終的濃度は０．１５ｇｇ／ｍｉであった。The final concentration of placental DNA was 0.15 gg/mi.
２、バクテリオファージλＬ、４７．１の調製これらの実験ではベクターとして バクテリオファージλＬ４７、ｌを用いた。このバクテリオファージの増殖のた めの宿主としては大腸菌ＬＥ３９２株（ＡＴＣＣ番号３３５７２）および８０３ ｓｕｐＦ株（Ｎ、ホズミ （Ｈｏｚｕｍｉ） 、シナイ山病院、トロント、オン タリオ州から入手した）を用いた。λＬ４７．１についてはマニアチス（Ｍａｎ ｉａｔｉｓ）等、モレキュラークローニング、ラボラトリ−マニュアル、ｐ４１ およびローネン（Ｌｏｅｎｅｎ）およびブラマー（Ｂｒａｍｍｅｒ）、１９８０ 、Ｇｅｎｅ、１０：２４９に示されている。ベクターとしてλＬ４７．１を用い るため、中間の“スタファ−”フラグメントを除き、こうすることにより外来Ｄ ＮＡの組込みを可能にした。簡単に云うと、これはベクターの粘着末端をライゲ ーションし、スタファーを除去する適当な制限エンドヌクレアーゼでこのベクタ ーを消化し、そしてスクロース勾配遠心によりスタファー断片をバクテリオファ ージアームから分離することにより行った。2. Preparation of bacteriophage λL, 47.1 As a vector in these experiments Bacteriophage λL47,1 was used. Due to the proliferation of this bacteriophage, E. coli strains LE392 (ATCC number 33572) and 803 supF strain (N, Hozumi), Mount Sinai Hospital, Toronto, ON (obtained from Tarrio) was used. Regarding λL47.1, Maniatis (Man iatis) et al., Molecular Cloning, Laboratory Manual, p41 and Loenen and Brammer, 1980 , Gene, 10:249. Using λL47.1 as a vector In this way, the foreign D Enables the incorporation of NA. Simply put, this involves ligating the sticky ends of the vector. This vector is digested with a suitable restriction endonuclease to remove the stuffer. and the stuffer fragments were purified by sucrose gradient centrifugation. This was done by separating it from the stage arm.
実験操作は以下のとおりである。１０ ｍＭ ＭｇＣ１’ ｔおよび１５０１１ Ｍトリス、’ｐＨ８，０を含むバッファ中４２℃１時間インキュベーションする ことにより１００μｇλＬ４７．１ＤＮＡの粘着末端をアニールした。このアニ ール末端をライゲーションした後、残存するりガーゼを熱で失活させた。Ｈｉｎ ｄｌＩ［アームを調製するため、このベクターＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢ ａｍＨＩで完全に消化した。後者の酵素はスタファー断片をさらに消化するため に働いており、その結果この末端（ＢａｍＨＩ）がもはやベクターアーム（Ｈ１ ｎｄＩ［［）の末端に適合しないようにしている。さらにこのベクターをウシア ルカリホスファターゼで処理し、このバクテリオファージアームが互いにライゲ ーションしないようにしている。このＤＮＡをフェノールおよびクロロホルム抽 出し、エタノール沈殿後ＴＥバッファに溶解した。Experimental operations were as follows. 10mM MgC1't and 15011 Incubate for 1 hour at 42°C in buffer containing M Tris, pH 8.0. The sticky ends of 100 μg λL47.1 DNA were annealed. This anime After ligating the ends of the membrane, the remaining ligase was inactivated with heat. Hint dlI [To prepare the arms, this vector DNA was diluted with HindIII and B Digested completely with amHI. Because the latter enzyme further digests the stuffer fragments As a result, this end (BamHI) is no longer part of the vector arm (H1). It is made so that it does not fit the end of ndI[[). In addition, use this vector treatment with bacteriophage phosphatase, the bacteriophage arms ligate each other. I try not to This DNA was extracted with phenol and chloroform. After precipitation with ethanol, it was dissolved in TE buffer.
消化したバクテリオファージＤＮＡ５０マイクログラムを２０ａ＋Ｍトリス、 ｐＨ８，０，１，０Ｍ ＮａＣ１，２，５ｍＭ ＥＤＴＡ中１〇−４０％直線ス クロース勾配４０ｍ１上に重層した。このチューブを５Ｗ２８ｏ−ター（ベック マン製）中２６．００ Ｏｒｐｍ、２０℃で２０時間遠心した。この勾配を底か ら抜き取り、スタッファ−断片を含まずベクターアームを含むフラクションをア ガロースゲルで少量のサンプルを電気泳動することにより同定した。これらのフ ラクションからエタノール沈殿でＤＮＡを回収し、ＴＥバッファに溶解した。50 micrograms of digested bacteriophage DNA was added to 20a+M Tris. pH 8, 0, 1, 0M NaCl 1, 2, 5mM 10-40% linear strip in EDTA It was overlaid on a 40 ml cloth gradient. Connect this tube to a 5W28 o-tor (Beck). The mixture was centrifuged at 20° C. for 20 hours at 26.00 Orpm (manufactured by Mann). Is this slope the bottom? Collect the fraction containing the vector arm but not the stuffer fragment. Identification was achieved by electrophoresis of a small sample on a galose gel. These frames DNA was recovered from the filtration by ethanol precipitation and dissolved in TE buffer.
場合によっては効率が悪いが別の操作を採用した。簡単に云うと、λＬ４７．１ ＤＮＡをＨｉｎｄＩ［［で消化し、ＣＯ８部位のアニーリング、スクロース勾配 遠心による分離、およびスタファフラグメントを含まずファージアームを含むフ ラクションの回収によりバクテリオファージアームを調製した。このファージア ームは高いバックグランドを有しているので、このＤＮＡをさらにＢａｍＨＩで 消化し、混入するスタファーフラグメントを切断した。これで挿入ＤＮＡを添加 しないライゲーションおよびパッケージングの際に見られるバックグランドは有 意に減少した。In some cases, other operations were adopted, although they were less efficient. Simply put, λL47.1 DNA was digested with HindI, CO8 annealing, sucrose gradient Separation by centrifugation and separation of phages containing phage arms without stuffer fragments. Bacteriophage arms were prepared by collection of fractions. This phagia Since this DNA has a high background, this DNA was further analyzed with BamHI. Digestion was performed to cut out contaminating stuffer fragments. Now add the insert DNA The background that can be seen during ligation and packaging is It decreased significantly.
３、ＤＮＡハイブリダイゼーションの調製ここで述べられているすべてのＤＮＡ ハイブリダイゼーションプローブはファージまたはプラスミドベクターＤＮＡか ら単離される挿入物として使用され、かつベセスダリサーチラブ社から市販され ているキットにックトランスレーションリエージェントキット、Ｃａ” Ｎｏ、 ８１６０ ＳＢ）およびニューイングランドニュークリアまたはアマ−ジャムか ら市販されている”Ｉ）−ｄＣＴＰを用いたニックトランスレーションで標識さ れた。一般に、このプローブは１〜２Ｘ１０”ＣＰＭ／μｇの放射能を有してい る。3. Preparation of DNA hybridization All DNA mentioned here Is the hybridization probe phage or plasmid vector DNA? and commercially available from Bethesda Research Labs. Translation Reagent Kit, Ca” No. 8160 SB) and New England Nuclear or Amarjam Labeled by nick translation using “I)-dCTP,” which is commercially available from It was. Generally, this probe has a radioactivity of 1-2X10"CPM/μg. Ru.
ハイブリダイゼーション前、このプローブを約９５℃１０分間で変性し、素早く 氷水中で冷却してからハイブリダイゼーションミックスに添加した。他言しない かぎり、ハイブリダイゼーションは以下のように行った。４２℃水溶中密封した プラスチックバック内で少なくとも２時間、フィルターを１％グリシンおよび０ ．１％ＳＤＳを補ったベーシックミックス（５０％ホルムアミド、５ｘｓｓｃ、 ５×デンハルド液、５０μｇ／ｍｌ超音波処理サケ***ＤＮＡ、５０ｍＭへベス 、ｐＨ６，８，５ｍＭ ＥＤＴＡ、およびｌＯμｇ／ｍ１ポリＡ）でプリハイブ リダイズした。ハイブリダイゼーションバッファはハイブリダイゼーションのタ イプにより変化させた。ゲノムサウザーントランスファーの場合、ベーシックミ ックスには１０％硫酸デキストラン０．２％ＳＯ３，および１０’ ＣＰＭ／ｍ ｆプローブを補った。ファージライブラリーの最初のスクリーニングにはベーシ ックミックスの０．２％ＳＤＳと１０ ＠ＣＰＭ／ｍｆのプローブを補ったが、 以後のスクリーニングにはより少ないプローブを含めた。ハイブリダイゼーショ ンは通常４２℃、−晩で行った。ハイブリダイゼーションにつづいてまずフィル ターを室温、２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で、さらに６５℃、ｏ、１ｘｓｓｃ 、ｏ、ｔ％ＳＤＳ中で洗浄した。コノフィルターで種々の時間、−７０℃、増感 スクリーンを用いてＸ線フィルムを感光させた。シグナルが非常に強いとき増感 スクリーンを使わずフィルムは室温で感光させた。Before hybridization, denature this probe at approximately 95°C for 10 minutes and quickly It was cooled in ice water and added to the hybridization mix. don't say anything else Hybridization was carried out as follows. Sealed in water at 42℃ Filters were soaked in 1% glycine and 0 for at least 2 hours in a plastic bag. ．． Basic mix (50% formamide, 5xssc, 5x Denhard's solution, 50μg/ml sonicated salmon sperm DNA, 50mM Heves , pH 6, 8, 5mM EDTA, and lOμg/ml polyA). Redized. The hybridization buffer is the hybridization Changed depending on the type. In the case of genome southern transfer, the basic The box contains 10% dextran sulfate, 0.2% SO3, and 10' CPM/m I supplemented the f probe. Basis is used for initial screening of phage libraries. I supplemented the probe mix with 0.2% SDS and 10 @ CPM/mf probe, Subsequent screens included fewer probes. Hybridization The test was normally carried out at 42°C overnight. Following hybridization, first fill The sample was incubated at room temperature in 2X SSC, 0.1% SDS and further at 65°C, 1x SSC. , o, t% SDS. Sensitized at -70°C for various times in a conofilter. The X-ray film was exposed using a screen. Sensitize when the signal is very strong The film was exposed at room temperature without a screen.
Ｂ、軽鎖遺伝子構築 ４８９細胞系列由来の両カッパ軽鎖対立遺伝子をＲＮＡレベルで発現され得るの で、両組換えカッパ軽鎖対立遺伝子をクローン化し、トランスフェクションによ って適当な重鎮と組合さって抗原を結合し得るたんばく賞が翻訳されているか調 べた。B, light chain gene construction Both kappa light chain alleles from the 489 cell line can be expressed at the RNA level. Both recombinant kappa light chain alleles were cloned and expressed by transfection. I'm looking into whether the protein award that can bind antigens in combination with suitable heavyweights has been translated. Beta.
カッパＪ領域プローブ（Ｊに）およびカッパ定常領域（Ｃに）プローブを用いた サザントランスファー分析で組換えカッパ鎖ＶＪ遺伝子を含むと思われる細胞系 列由来のゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩフラグメントのサイズを測定した。ＢａｍＨ Ｉフラグメントが完全な可変領域遺伝子を含むのに十分な大きさであるか、なら びに適当なレベルの転写を起こすために十分上流にあるかを測定することは重要 である。このサイズはＣにの３′側のＢａｍＨＩ部位から最も５′側のＪに遺伝 子までの距離（ｋｂ）を測定し、Ｌ−Ｖ遺伝子およびプロモーター配列のおよそ ２ｋｂを加えることにより決定した。（多くのＶに遺伝子の場合、Ｌ−Ｖに複合 体の間にＢａｍＨＩ部位がある。このような場合、ＨｉｎｄＩＩ［やＥｃｏＲＩ のような別の酵素を用い得る）。ＶにおよびＣに遺伝子は１９ｋｂ以下の同じＢ ａｍＨＩフラグメント上に存在し、それゆえ単一のファージベクターλＬ４７． １にクローン化し得る。ＶにおよびＣに遺伝子は単一の制限断片上に一緒にクロ ーン化される。Using the kappa J region probe (in J) and the kappa constant region (in C) probe Cell lines that appear to contain recombinant kappa chain VJ genes by Southern transfer analysis The size of the BamHI fragment of genomic DNA from the sequence was determined. BamH If the I fragment is large enough to contain the complete variable region gene, then It is important to determine whether the protein is sufficiently upstream to cause appropriate levels of transcription. It is. This size is inherited from the BamHI site on the 3' side of C to the most 5' side of J. The distance (kb) to the offspring was measured, and the approximate distance of the L-V gene and promoter sequence was determined. It was determined by adding 2 kb. (In the case of genes in many V, complex in L-V There is a BamHI site between the bodies. In such cases, HindII [or EcoRI Other enzymes may be used, such as The genes in V and C are less than 19kb of the same B amHI fragment and therefore a single phage vector λL47. can be cloned into 1. The V and C genes were cloned together on a single restriction fragment. will be turned into a zone.
バクテリオファージライブラリーをＬＣＬ４Ｂ９由来のＢａｍＨＩ消化およびサ イズ分別したゲノムＤＮＡから作製した。このライブラリーをＪにおよびＣにプ ローブでスクリーニングし、ポジティブプラークからＤＮＡを調製し、このクロ ーンのカッパ遺伝子を同定するためファージＤＮＡの消化を行った。それからこ のファージＤＮＡを発現カセットにサブクローニングした。Bacteriophage library was digested with BamHI from LCL4B9 and It was prepared from genomic DNA that was fractionated. Plug this library into J and C. DNA was prepared from the positive plaques and this clone was screened. Digestion of phage DNA was performed to identify the kappa gene of the gene. Then this phage DNA was subcloned into the expression cassette.
１、 カッパ遺伝子クローニング 細胞系列４Ｂ９由来のＤＮＡ １２０マイクログラムおよびヒト胎盤ＤＮＡ１０ μｇをＢａｍＨＩで消化し、各々の７．５ μｇをＴＡＢバッファ（０，０４Ｍ トリス−酢酸、０．ＯＯＩＭ ＥＤＴＡ）中１．１％アガロースゲルの電気泳動 で分画した。ＢａｍＨＩ消化したＤＮＡのサザントランスファーを行ないＪに領 域を含むＪにプローブで探った。Ｊｔｃプローブはヒーター（Ｈｉｅｔｅｒ）等 、１９８０、Ｃｅ１１２２： １９７−２０７およびＪ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ ｗ、 ２５７ ： １５１６−１５２２ （１９８２）に報告されている生殖系 列ヒトカッパクローンの１．８ｋｂ ５ａｃＩフラグメントを含むプラスミドか ら得た。1. Kappa gene cloning 120 micrograms of DNA from cell line 4B9 and 10 human placental DNA μg was digested with BamHI, and 7.5 μg of each was added to TAB buffer (0.04M Tris-acetic acid, 0. Electrophoresis of 1.1% agarose gel in OOIM (EDTA) It was fractionated with Southern transfer of BamHI-digested DNA was carried out to infect J. A probe was used to probe J including the area. Jtc probe is a heater etc. , 1980, Ce1122: 197-207 and J. Biol, Che. Reproductive system reported in W, 257: 1516-1522 (1982) A plasmid containing the 1.8 kb 5acI fragment of the human kappa clone I got it from
このプローブは胎盤ＤＮＡ中の１ｌｋｂ生殖系列フラグメントおよび４ Ｂ ９ ＤＮＡの１６ｋｂ組換えフラグメントにハイブリダイズした。This probe contains a 1lkb germline fragment in placental DNA and a 4B9 Hybridized to a 16kb recombinant fragment of DNA.
同じプローブを用いるが、ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄｌＩ［消化物に対するサザ ントランスファー実験は、４Ｂ９中には２つの組換えカッパ遺伝子があることを 示しており、このことはＢ ａｍＨＩ 消化が同様の分子量のフラグメントを２ つ生じ、その結果それらを互いに区別できないことを示している。The same probe is used, but EcoRI or HindlI [Suther for digests] Transfer experiments revealed that there are two recombinant kappa genes in 4B9. This shows that B amHI digestion produces two fragments of similar molecular weight. The result is that they are indistinguishable from each other.
ＢａｍＨＩ消化４Ｂ９ＤＮＡ５０フィクログラムを１０〜４０％スクロース勾配 で分画し、目的サイズ（１６ｋｂ）のＤＮＡを含むフラクションをＪにプローブ を用いたサザントランスファー分折でスクリーニングした。最も強くハイブリダ イズするものを用いてライブラリーを構築した。50 phyclograms of BamHI-digested 4B9 DNA on a 10-40% sucrose gradient Probe the fraction containing DNA of the desired size (16 kb) with J. Screening was performed using Southern transfer spectroscopy. the strongest hybrid A library was constructed using the following data.
ピークフラクションのＤＮＡのおよそ５％をＴ４ＤＮＡリガーゼと５％ＰＥＧ含 有ライゲーションバッファ（５０ｍＭトリス、ｐＨ７，８，１０ｍＭ ＭｇＣ１ ｔ 、１ ｍＭ ＤＴＴｌ ６ ｍＭ ＫＣｊ７．１ｍＭＡＴＰおよび１ ｍＭ スペルミジン）を用いてλＬ４７．１ファージアーム（ＢａｍＨＩで消化したＤ ＮＡ）にライゲーションした。それからこのライゲーション反応物を重鎮遺伝子 クローニングに関して以下に述べるようにインビトロでパッケージングした。バ クテリオファージの活性は大腸菌の８０３ｓｕｐＦ株で測定し、通常各うイゲー ション反応当り総計０．５〜１５Ｘ１０’プラ一ク形成単位（ｐｆｕ）であった （これはスクロース勾配フラクションの５％に相当する。およそ１０″ｐｆｕを ブレーティングした。Approximately 5% of the DNA in the peak fraction was treated with T4 DNA ligase and 5% PEG. Ligation buffer (50mM Tris, pH 7, 8, 10mM MgCl) t, 1mM DTTl 6mM KCj7.1mMATP and 1mM λL47.1 phage arm (D digested with BamHI) using ligated to NA). This ligation reaction is then combined with the key gene In vitro packaging was performed as described below for cloning. Ba Cteriophage activity was measured in E. coli strain 803supF, and each phage A total of 0.5 to 15 x 10' plaque forming units (pfu) per reaction. (This corresponds to 5% of the sucrose gradient fraction. Approximately 10" pfu Brated.
各プレートからニトロセルロースベーパー（シュレイチャー・アンド・シュニル 社）を用いて２回プラークリフトを取った。１組のフィルターはＪにプローブを ハイブリダイズさせ、別のフィルターはＣにプローブをハイブリダイズさせた（ 先に述べたものと同じ生殖系列ヒトカッパクローン由来の２．７ｋｂ ＥｃｏＲ Ｉフラグメント）。両方のプローブがハイブリダイズするプラークだけをつり上 げ重鎮可変領域遺伝子クローニングに関して述べた方法で精製した。Nitrocellulose vapor (Schleicher & Schnier) was removed from each plate. Plaque lifts were performed twice using a One set of filters probes J. and another filter hybridized the probe to C ( 2.7kb EcoR derived from the same germline human kappa clone as mentioned above I fragment). Lift only the plaques where both probes hybridize. The main variable region genes were purified using the method described for cloning.
Ａｌ／ＣおよびＡ２にと命名し、いずれも１６ｋｂ ＢａｍＨＩ挿入物を含む２ つのカッパクローンを同定した。両クローンからのファージＤＮＡを７２重重鎮 カセット両重鎖Ｖ領域を含む）とともにＡｇ８．６５３細胞にコトランスフェク トした。ＩｇＧ２発現について培養上清を検定した。ＡｌにおよびＡ２重鎖対立 遺伝子でトランスフェクトした細胞のみが正しい特異性のＩｇＧを分泌した。こ のことはＡ１に対立遺伝子は４Ｂ９抗体中に存在するものであることを示してい る。2, named Al/C and A2, both containing a 16 kb BamHI insert. Two kappa clones were identified. Phage DNA from both clones was combined with 72 heavyweights. cassette containing both heavy chain V regions) into Ag8.653 cells. I did it. Culture supernatants were assayed for IgG2 expression. Al and A2 heavy chain opposition Only cells transfected with the gene secreted IgG of the correct specificity. child This indicates that the A1 allele is present in the 4B9 antibody. Ru.
バクテリオファージＤＮＡ Ａｌにの全ＢａｍＨＩフラグメントを以下に述べる ｐＮ、ｌベクターのＢａｍＨＩ部位にサブクローン化しｐＮにＡ１．１を作製し た。それからミエローマ系列Ａ ｇ８．６５３を予めＡｐａｌで線状化したｌＯ μｇのｐＮにＡ１．１と約２Ｘ１０’個／ｒｎｌのミエローマ細胞を用いたエレ クトロポレーションによりｐＮにＡ、１にトランスフェクトした。この細胞を完 全培地中４８時間インキュベートし、ついで２０％ＦＣ３および０．２５ ｍｇ ／ｍｊ！Ｇ４１８（ギブコ８６０−１８１１１Ｊ）を含むＲＰＭＩ中１０中細０ ４細胞／ウエルようにマイクロプレートのウェルに移した。この細胞に４〜５日 毎に栄養を与えた。２〜３週間後細胞を蛍光染色を用い、細胞内ヒトカッパ鎖の 存在について検定した。３つのマスターウェルは陽性を示し、これらをソフトア ガロース中でクローン化した。ソフトアガロースクローン７Ｇ−４Ｂは４＋の蛍 光強度を与え、かつ１００％の細胞が陽性であった。The entire BamHI fragment of bacteriophage DNA Al is described below. pN,1 was subcloned into the BamHI site of the vector to create A1.1 in pN. Ta. Then, myeloma series A g8.653 was pre-linearized with Apal. Electrolysis using A1.1 and approximately 2X10' cells/rnl of myeloma cells in μg of pN. A,1 was transfected into pN by chotroporation. complete this cell Incubate for 48 hours in total medium, then 20% FC3 and 0.25 mg /mj! RPMI medium 10 medium fine 0 containing G418 (Gibco 860-18111J) 4 cells/well were transferred to the wells of a microplate. 4-5 days for this cell nourished each time. After 2 to 3 weeks, the cells were stained using fluorescent staining to detect intracellular human kappa chains. The presence was tested. Three master wells tested positive and these were Cloned in galose. Soft agarose clone 7G-4B is a 4+ firefly. Light intensity was applied and 100% of cells were positive.
この細胞を２４穴プレートにブレーティングし、全抗体レファレンスを用い１． ７μｇ ／ ｍ １２で抗体を検定した。再度ソフトアガロースによりクローン ７Ｇ−Ｂ４をクローン化した。２次クローン７Ｇ＝４Ｂ−１は４＋蛍光強度を与 えた。この系列を“Ｂ４−１″と呼ぶ。The cells were plated into 24-well plates and 1. Antibodies were assayed at 7 μg/m12. Clone again with soft agarose 7G-B4 was cloned. Secondary clone 7G=4B-1 gives 4+ fluorescence intensity. I got it. This series is called "B4-1".
Ｂ１重鎮定常領域遺伝子構築物ｐＮγ１．１ヒトγ１重鎖定常領域遺伝子を含む 重鎮カセットを構築した。B1 heavy chain constant region gene construct pNγ1.1 containing human γ1 heavy chain constant region gene Built a heavyweight cassette.
ファージクローン、ファージ３Ａ（エリソン（Ｅｌｌｉｓｏｎ）等、１９８２、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １０ ： ４０７１−４０７９）を生 殖系列Ｃ７１遺伝子源として用いた。このクローンは先に述べたγ１ ｃＤＮＡ 定常領域プローブでヒト胎児肝臓ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングす ることにより得た。Phage clone, phage 3A (Ellison et al., 1982, Nucleic Ac1ds Res, 10: 4071-4079) The germ line C71 was used as a gene source. This clone is the γ1 cDNA mentioned above. Screening a human fetal liver genomic DNA library with constant region probes Obtained by
簡単に伝うとγｌ定常領域遺伝子の５′側および３′側の両弁コード配列を含む ７１カセツトを、まずＣγ１遺伝子の適当な配列をｐＵＣベクターのポリリンカ ー領域にサブクローニングしｐγ１，１を生成することにより作製した。それか らＣγｌ配列を望ましいポリリンカー配列と一緒にベクターから取り出しｐＮ。Simply put, it contains both the 5' and 3' valve coding sequences of the γl constant region gene. 71 cassette, first insert the appropriate sequence of the Cγ1 gene into the polylinker of the pUC vector. - region to generate pγ1,1. Or is it? The Cγl sequence along with the desired polylinker sequence was removed from the vector pN.
１（上述）に挿入してｐＨ７１，１を作製した。このカセットを構築するのに用 いた方法の詳細を以下に示す。1 (described above) to create a pH of 71.1. used to build this cassette. The details of the method used are shown below.
ファージ３Ａ ＤＮＡ２マイクログラムをＢａｍＨＩで完全に消化し、ＰＣＩに よる抽出を行った後エタノール沈殿させてから２０μｍのＴＥバッフｙ （’１ ０ ｍＭ トリス、ｐＨ７，８，１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解した（０．１ｍｇ／ｍ １）、ｐＵＣ１８１０ｔｔｇをＢａｍＨＩで完全に消化し、ＰＣＩ抽出、エタノ ール沈殿を行った後４４μｌの水に溶かした。このＤＮＡをウシ腸アルカリホス ファターゼ（ＣＩ Ｐ ； ２８ユニツト、ベーリンガーマンハイム）で処理し 、ＰＣＩ抽出、エタノール沈殿後、５０ｎｇ／μｌとなるようにＴＥに溶かした 。ＢａｍＨＩ消化ファージＤＮＡ２００ｎｇを２００ｎｇのＢａｍＨＩ消化およ び脱リン酸化ｐＵｃ１８と最終容積２０μｌのライゲーションバッファ中４００ ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを用い、室温、１５分間処理してライゲーション した。この反応液をＰＥＧを含まないライゲーションバッファで８０μｌに希釈 した。１６０ユニツトの７４ＤＮＡリガーゼにューイングランドバイオラブ）を 添加し、この混合物を１５℃で一層インキユベートした。このライゲーション反 応物５μｌを用いて２００μｌのコンピテントＪＭ８３細胞をトランスホームし た。このトランスホームしたバクテリアをアンピシリン（１００μｇ／ｉ１）お よびカラーインジケーターとしてＸ −ｇａｉを含むＬＢ−寒天上にブレーティ ングした。白コロニーをつり上げＬＢ−寒天およびアンピシリンを含むプレート 上にストリークした。Two micrograms of Phage 3A DNA was completely digested with BamHI and transferred to PCI. After ethanol precipitation, 20 μm TE buffer y ('1 (0.1 mg/m 1), pUC1810ttg was completely digested with BamHI, PCI extracted, and ethanol After performing precipitation, it was dissolved in 44 μl of water. This DNA was converted into bovine intestinal alkaline phos treated with fatase (CIP; 28 units, Boehringer Mannheim) After PCI extraction and ethanol precipitation, it was dissolved in TE to a concentration of 50 ng/μl. . 200ng of BamHI-digested phage DNA was digested with 200ng of BamHI and and dephosphorylated pUc18 in ligation buffer in a final volume of 20 μl. Ligation was performed using Unit T4 DNA ligase at room temperature for 15 minutes. did. Dilute this reaction solution to 80 μl with PEG-free ligation buffer. did. 160 units of 74 DNA ligase (New England Biolab) and the mixture was further incubated at 15°C. This ligation anti- Transform 200 μl of competent JM83 cells using 5 μl of the reaction product. Ta. This transformed bacteria was treated with ampicillin (100 μg/i1). and LB-agar containing X-gai as a color indicator. I nged. Pick up a white colony and place it on a plate containing LB-agar and ampicillin. Streaked on top.
これらのコロニーを増殖し、クラウィンケル（ＫｒａｗｉｎｋｅＪ ）、 ＥＭ ＢＯＪ、（１９８２）１ ： ４０３−４０７およびフラナガン（Ｆｌａｎａｇ ａｎ）およびラビッツ（Ｒａｂｂｉｔｓ）、１９８２． Ｎａｔｕｒｅ、３００ ： ７０９−７１３に報告されているｐａ、６ＲＨ４，２由来のＥｃｏＲＩ− ＨｉｎｄＩＩＩ挿入物、ニックトランスレーションγ３プローブを用いたコロニ ーハイブリダイゼーションでスクリーニングした。These colonies were propagated and described by Krawinke J, EM BOJ, (1982) 1: 403-407 and Flanag. an) and Rabbits, 1982. Nature, 300 : EcoRI- derived from pa, 6RH4,2 reported in 709-713 Colonies using HindIII insert, nick translation γ3 probe - Screened by hybridization.
このプローブがハイブリダイズしたコロニーからＤＮＡを調製した。このＤＮＡ をＢａｍＨＩで消化し、電気泳動後写真を擦りニトロセルロースペーパーに移し てから同様の７３プローブをハイブリダイズさせた。１０．５ ｋ ｂ挿入物を 含むＤＮＡが検出され、このベクターをｐγ１．１と命名した。DNA was prepared from colonies hybridized with this probe. this DNA was digested with BamHI, and after electrophoresis, the photograph was rubbed and transferred to nitrocellulose paper. After that, similar 73 probes were hybridized. 10.5 k b insert DNA containing the vector was detected, and this vector was named pγ1.1.
Ｃγ１重鎖重鎮カセット構築のステップはベクターからのＣγ１配列の切り出し とベクターｐＮ、１への挿入による重鎮カセットｐＮ７１．１の生成である。The step for constructing the Cγ1 heavy chain heavy chain cassette is cutting out the Cγ1 sequence from the vector. and the generation of the heavyweight cassette pN71.1 by insertion into the vector pN,1.
ベクターｐＮ、ｌはサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）およびバーブ（Ｂｅｒｇ）、Ｊ 。Vector pN, l is derived from Southern and Berg, J. .
Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、（１９８２） １ ；３２７−３４１に報 告されているｐＳＶ２−ｎｅｏベクター、ＡＴＣＣＮｏ、３７１４９から構築し た。このｐ Ｓ Ｖ ２−ｎｅｏベクターを後のクローニングステップを妨害す るＨｉｎｄＩ［［部位を含まないよう修正した。簡単に云うとこれは、ｐ Ｓ Ｖ ２−ｎｅｏのＨｉｎｄｌ［Ｉによる消化、ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフ ラグメントによる末端の平滑化、ＤＮＡのセルフライゲーション、およびこれを 用いたコンピテントバクテリアへのトランスホーメーションで行った。このベク ターはｐＮ、１と命名した。Mo1. Appl, Genet, (1982) 1; 327-341. Constructed from the announced pSV2-neo vector, ATCC No. 37149. Ta. This pSV2-neo vector should be used to prevent later cloning steps. HindI[[Corrected to not include the site. Simply put, this is pS V2-neo digestion with Hindl[I, DNA polymerase Klenov blunting of ends by fragments, self-ligation of DNA, and this Transformation into competent bacteria was performed. This vector The target was named pN,1.
ｐＮ、１ベクターにＣγｌ配列を挿入するため、まず２．４μｇのｐＮ、１を９ ９ユニツトのＢａｍＨＩで消化し、フェノール抽出、エタノール沈殿後５０μｌ のＴＥに溶かした（０．０５μｇ／μｌとなる）。またｐγ１．１をＢａｍＨＩ で消化した。約１μｇのｐγ１．１消化物を容積９８μβ中ライゲーシヨンバツ フア内でｐＮ、１消化物と合わせ、６５℃、５分間加熱する。２μｌのＴ４ＤＮ Ａリガーゼにューイングランドバイオラブ）を添加しこのサンプルを室温で３０ 分間、さらに１４℃で一晩インキユベーションする。このライゲーション反応物 １０〜５０μｌを用いて２００μｌのコンピテントＤＨ５α細胞をトランスホー ムした。このバクテリアを１００μｇ ／ ｍ ｌアンピシリンおよび２００μ ｇ／ｍＪカナマイシンを含むＬＢ寒天上にブレーティングした。９〜ｌｌｋｂＢ ａｍＨＩ挿入物を含むプラスミドＤＮＡの存在に関して、このトランスホーマン トをスクリーニングした。ｐＮ、ｌ中の約９．６ｋｂ挿入物を含むトランスホー マントを選択した。またこのＤＮＡをＨｊｎｄｌｌｒおよびＢｇｌｌＩで消化し γ１挿入物の存在を確認すると同時にその方向も確認した。ＨｉｎｄｌｌＩでこ のＤＮＡを線状化した。To insert the Cγl sequence into the pN,1 vector, first add 2.4 μg of pN,1 to 9 After digestion with 9 units of BamHI, phenol extraction, and ethanol precipitation, 50 μl of TE (0.05 μg/μl). In addition, pγ1.1 is BamHI I digested it. Approximately 1 μg of pγ1.1 digest was ligated into a volume of 98 μβ. Combine pN, 1 digested product in a furnace and heat at 65°C for 5 minutes. 2μl T4DN New England Biolabs) was added to A ligase and the sample was incubated at room temperature for 30 min. Incubate for 1 minute and overnight at 14°C. This ligation reaction Transfect 200 μl of competent DH5α cells using 10-50 μl. I missed it. This bacteria was treated with 100μg/ml ampicillin and 200μg/ml. Blated onto LB agar containing g/mJ kanamycin. 9～llkbB Regarding the presence of plasmid DNA containing the amHI insert, this transformer were screened. A transformer containing an approximately 9.6 kb insert in pN,l I chose the cloak. This DNA was also digested with Hjndllr and BgllI. The presence of the γ1 insertion was confirmed as well as its orientation. HindllI DNA was linearized.
８ｇ１ｍ消化で２．１ｋｂおよび約１０ｋｂのフラグメントが生成した。このこ とはもし欠失が存在する場合、γ１コード領域の５′側のＢｇｌｎ部位を含むｎ ｅｏ遺伝子に対して方向が反対のγ１遺伝子と一致している。ＨｉｎｄＩＩＩ＋ ＢｇｌＩＩ消化は２．１ｋｂのバンドおよび約６ｋｂのダブレットのバンドを生 ずる。これらのトランスホーマントから単離したベクターをｐＮ７１．１と命名 した。The 8g1m digestion produced fragments of 2.1 kb and approximately 10 kb. this child and, if a deletion exists, include the Bgln site 5′ of the γ1 coding region. It corresponds to the γ1 gene, which is opposite in direction to the eo gene. HindIII+ BglII digestion produced a 2.1 kb band and an approximately 6 kb doublet band. Cheating. The vector isolated from these transformants was named pN71.1. did.
１、 重鎮定常領域カセットへの重鎮可変領域遺伝子の挿入細胞系列４８９由来 の両組換え重鎮対立遺伝子を適当な方向で７２重鎖定常領域を含むカセットにク ローン化および挿入した。Ａ２Ｈ対立遺伝子が適当な軽鎖と組合さって最終的に 抗原を結合するポリペプチド鎖に翻訳されることをトランスフェクションで検定 した（出願中のＵＳＳＮ２５４，００４参照、これは参考として引用している） 。詳細を以下に示す。1. Insertion of heavyweight variable region gene into heavyweight constant region cassette Derived from cell line 489 Both recombinant heavyweight alleles of 72 were cloned in the appropriate orientation into a cassette containing the 72 heavy chain constant region. Loaned and inserted. The A2H allele combines with the appropriate light chain and finally Assay by transfection that it is translated into a polypeptide chain that binds the antigen (See pending USSN 254,004, which is incorporated by reference) . Details are shown below.
ヒトＪＨ領域プローブｐＪＨによるサザントランスファー分析を用いて組換え重 鎖ＶＤＪ遺伝子を含む細胞系列４Ｂ９のＤＮＡのＨｉｎｄ［［フラグメントの大 きさを測定した。ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは完全な可変領域遺伝子を十分含 み得る大きさでかつ適当な転写を行い得るよう十分上流の配列であることが重要 である。このことはＪＨＣμイントロン中のＨｉｎｄＩ［１部位からＪ、エレメ ントの最も５′側までの距離を測定し、Ｌ−Ｖおよびプロモーター配列の約２ｋ ｂを加えること鳴より決定した。Recombinant polymers were detected using Southern transfer analysis with human JH region probe pJH. Hind[[Fragment size] of DNA of cell line 4B9 containing chain VDJ gene The roughness was measured. The HindIII fragment is sufficient to contain the entire variable region gene. It is important that the sequence is large enough to be seen and sufficiently upstream to allow proper transcription. It is. This indicates that the HindI [1 site to J, elemental The distance to the most 5' side of the promoter sequence was measured, and approximately 2k of the L-V and promoter sequences were measured. It was decided from the sound that b should be added.
細胞系列４Ｂ９のＨｉｎｄＩＩＩ消化およびサイズ分別ゲノムＤＮＡからバクテ リオファージライブラリーを構築した。このライブラリーをＪ領域プローブでス クリーニングし、そのポジティブプラークからＤＮＡを調製してからその可変領 域遺伝子をｐＵｃ１８にサブクローンして制限部位の地図作製や二重クローンの 同定を容易にした。４Ｂ９の可変領域遺伝子をｐＮ７１．１ベクターに挿入し発 現可能な重鎮遺伝子を作製した。Bacteria from HindIII-digested and size-fractionated genomic DNA of cell line 4B9 A reophage library was constructed. Scan this library with the J region probe. Clean, prepare DNA from the positive plaque, and then extract the variable region. Region genes were subcloned into pUc18 for restriction site mapping and double cloning. Made identification easier. Insert the 4B9 variable region gene into the pN71.1 vector and generate it. We have created a key gene that can be used in this study.
２．４Ｂ９ゲノム重鎖可変領域ＤＮＡ挿入物の調製上記のように調製したＬＣＬ ４８９由来のＤＮＡ１２０マイクログラムおよびヒト胎盤ＤＮＡｌ０μｇを別 々にＨｉｎｄｌｌ［で消化し、各々７，５μｇをＴＡＢバッファ中１．１％アガ ロースゲルの電気泳動で分画した。標準的操作でＤＮＡをニトロセルロースペー パーに移し、非減圧オーブン中８０℃で一晩加熱して！ｆｉＰ標識ヒト重鎖Ｊ領 域プローブ（ｐＪｌ（挿入物）とハイブリダイズさせた。2.4 Preparation of B9 Genomic Heavy Chain Variable Region DNA Insert LCL prepared as above Separate 120 micrograms of DNA derived from 489 and 0 μg of human placental DNA. 7.5 μg of each was digested with 1.1% agar in TAB buffer. It was fractionated by low gel electrophoresis. Transfer DNA to nitrocellulose paper using standard procedures. Transfer to a parlor and heat at 80℃ in a non-vacuum oven overnight! fiP labeled human heavy chain J region region probe (pJl (insert)).
このプローブ挿入物（ｐＢＲ３２２中）はＪ領域の５′端付近の人工的ＥｃｏＲ Ｉ部位からＪ領域とミュ一定常領域間の主要イントロン中のＨｉｎｄＩ［Ｉ部位 に及んでいる。Ｊ領域および同様のクローン由来のイントロンの一部のＤＮＡ配 列はラベツチ（Ｒｅｖｅｔｃｈ）等、１９８１、 Ｃｅ１１． ２７ ： ５８ ３−５９１およびラビッツ（Ｒａｂｂｉｔｓ）等、１９８３、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３０６ ： ８０６−８０９に報告されている。免疫グロブリン遺伝子が発現す るためには組換えが起こらなければならないので、４Ｂ９には存在するが、生殖 系列（胎盤）ＤＮＡ中には存在しないＤＮＡフラグメントを探した。１方または 両方の対立遺伝子が組換えを起こしたかによって各々１つまたは２つの組換えバ ンドが期待される。ｐＪ□プローブは胎盤ＤＮＡ中の９ｋｂ生殖系列フラグメン トにハイブリダイズし、また４ Ｂ ９ ＤＮＡの１０．６および７．８ ｋ ｂ組換えフラグメントにハイブリダイズした。This probe insert (in pBR322) was inserted into an artificial EcoR near the 5' end of the J region. HindI in the major intron between the I site and the J region and Mu constant region [I site It extends to The DNA sequence of the J region and part of the intron from similar clones. Column is Revetch et al., 1981, Ce11. 27: 58 3-591 and Rabbits et al., 1983, Nature. 306: Reported in 806-809. Immunoglobulin genes are expressed Although present in 4B9, recombination must occur in order to We searched for DNA fragments that are not present in lineage (placental) DNA. one side or One or two recombinant variants each, depending on whether both alleles have undergone recombination. expected. The pJ□ probe is a 9kb germline fragment in placental DNA. and 10.6 and 7.8k of 4B9 DNA. b Hybridized to the recombinant fragment.
ＨｉｎｄＩ［［消化４８９ＤＮＡ５０ｖイクログラムをベクターＤＮＡアームの 調製に関して上述した方法により１０〜４０％スクロース勾配で分画した。望ま しいサイズのＤＮＡを含むフラクションを！８ｐ標識したｐＪｎ挿入物プローブ を用いたサザントランスファー分析でスクリーニングした。１０．６および７． ８ｋｂフラグメントは容易に分離し得るので、各バンドが最も濃いフラクション を用いてライブラリーを構築した。このピークフラクション中のＤＮＡの約５〜 １０％を先に述べたように調製したλＬ４７．１ファージアームにＴ４ＤＮＡリ ガーゼおよびライゲーションバッファを用いてライゲーションした。このライゲ ーション反応物はインビトロでパッケージングした。パッケージング抽出物はグ ロスベルド（Ｇｒｏｓｖｅｌｄ）等、１９８１．Ｇｅｎｅ、１３：２２７−２３ ７の方法に従い大腸菌ＢＨＢ２６８８株（ＡＴＣＣＮｏ、 ３５１３１）から調 製した冷凍−融解分解物およびＢＨＢ２６９０株（ＡＴＣＣＮｏ、３５１３２） から調製した超音波処理抽出物を用いて調製した。他の操作法または市販のパッ ケージング抽出物も使用し得る。バクテリオファージの活性は大腸菌８０３ｓｕ ｐＦ株を用いて測定し、通常路ライゲーション反応物から総計０．５〜１．５Ｘ １０’プラ一ク形成単位（ｐｆｕ）であった（スクロース勾配フラクションの５ 〜１０％に相当する）。HindI [[Digested 489 DNA 50v cyclogram of vector DNA arm] Fractionation was performed on a 10-40% sucrose gradient by the method described above for preparation. desire Fraction containing DNA of the correct size! 8p labeled pJn insert probe Screening was performed using Southern transfer analysis. 10.6 and 7. The 8 kb fragments can be easily separated, so each band is concentrated in the darkest fraction. The library was constructed using Approximately 5 to 50% of the DNA in this peak fraction 10% of T4 DNA was added to the λL47.1 phage arm prepared as described above. Ligation was performed using gauze and ligation buffer. This lige tion reactions were packaged in vitro. Packaging extract is Grosveld et al., 1981. Gene, 13:227-23 Prepared from E. coli BHB2688 strain (ATCC No. 35131) according to method 7. The produced freeze-thaw decomposition product and BHB2690 strain (ATCC No. 35132) was prepared using a sonicated extract prepared from Other operating methods or commercially available patches Caging extracts may also be used. Bacteriophage activity is E. coli 803su Measured using pF strain, total 0.5-1.5X from normal route ligation reaction. 10' plaque forming units (pfu) (5 of the sucrose gradient fraction) ~10%).
サザントランスファー分析で見られる特定のバンドに対応する ・各ライブラリ ーには少なくとも１０’個のプラークを含んでいた（１〜３個のスクロース勾配 フラクションに由来する）。このライブラリーを５ｔｐ−標識ｐＪ）Ｉ挿入物で スクリーニングした。ポジティブプラークを取り出し、希釈し、ブレーティング した後同じプローブでスクリーニングした。このプロセスをプレート上のプラー クが全てポジティブになるまで繰り返した（通常全部で３〜５回）。・Each library corresponds to a specific band seen in Southern transfer analysis - contained at least 10' plaques (1-3 sucrose gradients) fraction). This library was modified with a 5tp-labeled pJ)I insert. Screened. Remove, dilute, and brate positive plaques and then screened with the same probe. This process is done using a puller on the plate. Repeat until all tests are positive (usually 3-5 times total).
３、ｐＮγ１カセットへの重鎮可変領域遺伝子のサブクローニング 上述のように４Ｂ９重鎖可変領域遺伝子をｐＮγｌカセットに挿入した。特に、 ｐＮ７１．１ベクターをＨｉｎｄｆｌＩで消化しさらにＣ１２で処理した。４８ ９可変領域遺伝子源としてはＨｉｎｄｍ消化ファージＡ２Ｈ（上述）を用いた。3. Subcloning of key variable region genes into pNγ1 cassette The 4B9 heavy chain variable region gene was inserted into the pNγl cassette as described above. especially, The pN71.1 vector was digested with HindflI and further treated with C12. 48 Hindm digested phage A2H (described above) was used as the 9 variable region gene source.
さらにベクターＤＮＡを混合し、ファージＤＮＡとライゲーションしてからこの ライゲーション混合物を用いてコンピテントＤＨ５α細胞をトランスホームした 。可変領域遺伝子の存在についてトランスホーマントをスクリーニングし、また その遺伝子の方向を種々の制限酵素による消化で決定した。このように７１定常 領域遺伝子の隣りに４８９可変領域遺伝子を含む構築物を調製し、ｐＮγＩＡ２ ．１と命名した。Furthermore, vector DNA is mixed, ligated with phage DNA, and then this The ligation mixture was used to transform competent DH5α cells. . Screen transformants for the presence of variable region genes and The orientation of the gene was determined by digestion with various restriction enzymes. In this way, 71 steady A construct containing the 489 variable region gene next to the region gene was prepared, and pNγIA2 ．． It was named 1.
ｐＮγＩＡ２．１の構築を以下に示す。The construction of pNγIA2.1 is shown below.
７、５ μｇのＡ２ＨファージＤＮＡを８０ユニツトのＨｉｎｄＩＩＩで消化し 、エタノール沈殿後、１５０ＡｔｉのＴＥに溶かした。ＩＮＮγ１．１ ｓｏμ ｇを２００ユニツトのＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、ＣＩＰで処理後エタノール沈殿 してから１００μｌのＴＥに溶かした（０．５μｇ／μｌ）。それから２０μｌ の反応容積で１ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを用い（ベーリンガーマンハイム ）５００ｒ＋ｇのＡ２ＨＤＮＡおよび２５ｎｇのｐＨ７１，ｌＤＮＡを３７℃で ３０分間かけてライゲーションした。５μｌをライゲーション反応物を３０μｌ のＴＥで希釈し、これを用いて６０μｌのコンピテントＤＨ５α細胞をトランス ホームした。トランスホームした細胞を１００μｇ／ｍｌｌのアンピシリンを含 むＬＢ寒天上にブレーティングした。１２個のコロニーをつり上げそのＤＮＡを 調製した。7. Digest 5 μg of A2H phage DNA with 80 units of HindIII. After ethanol precipitation, it was dissolved in 150Ati of TE. INNγ1.1 soμ Digested with 200 units of HindI[I, treated with CIP, and precipitated with ethanol. It was then dissolved in 100 μl of TE (0.5 μg/μl). Then 20μl using 1 unit of T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim) in a reaction volume of ) 500 r+g of A2HD DNA and 25 ng of pH 71,1 DNA at 37°C. Ligation was performed for 30 minutes. Add 5 μl to 30 μl of ligation reaction. of TE and used to transduce 60 μl of competent DH5α cells. I homed. Transformed cells were incubated with 100 μg/ml ampicillin. It was plated on LB agar. Pick up 12 colonies and extract their DNA Prepared.
このＤＮＡをＨｉｎｄＩｌｌで消化することにより適当な大きさく約８．４ｋｂ ）の挿入物が存在することが示された。その方向はＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ による消化で検定した。γ１遺伝子の５′側にＢｇ！１１部位がないことに基づ き、２．０．３．７．６．１．４．８および７．８ｋｂのバンドを生じるトラン スホーマントを選択した。この構築物をｐＮγＩＡ２．１と命名した。By digesting this DNA with HindIll, it was reduced to an appropriate size of approximately 8.4 kb. ) inserts were shown to be present. Its direction is BamHI and BglII The assay was performed by digestion with Bg on the 5' side of the γ1 gene! Based on the absence of 11 parts 2.0.3.7.6.1.4.8 and 7.8 kb bands. I chose Suho Manto. This construct was named pNγIA2.1.
４、重鎖構築物ｐＮγＩＡ２．Ｉによるトランスフェクションこの重鎮構築物を カッパ軽鎖を発現するＢ４−１細胞にトランスフェクトした。この軽鎖ベクター （ｐＮにＩＡｌ、１）はこの細胞にＧ４１８耐性を与える遺伝子を含んでいるの で、別の選択可能マーカーＥｃｏｇｐｔ遺伝子を含む別のベクターとその重鎮ベ クターをコトランスフェクトする必要がある。ｐＳＶ２−ｇｐｔの誘導体であり 、継続番号、２５４，００４に記述されているｐＧ、３をこの目的のために使用 した。１０μｇ ｐＮγｌＡ２．１ （ＢａｒｎＨＩで制限処理したもの）およ び１μｇのｐＧ、３の存在下約５×ｉｏ’個のＢ４−１細胞のエレクトロポレー ションを行った。エレクトロポレーションの４８時間後、細胞をＩμｇ ／ ｍ １のマイコフェノール酸、１５μｇ ７ｍ ＩＩヒボキサンチンおよび２５０ μｇ／ｍ１キサンチンを含むＲＰＭＩ １６４０／１０％ＦＣ３中２×１中２側 １０４ル（２Ｘ １０Ｓ／ｍｊりとなるようマイクロプレートにブレーティング した。２〜３週間後、ＩｇＧ生産に関し培養上清を検定し、１０個のウェルの細 胞についてソフトアガロースクローニングを行った。細胞系列ＬＢＩ−Ｄ３−Ｆ ３−Ｄ２−Ｆ３についてソフトアガロースクローニングを２回行った。このクロ ーンを“ｌＢビと呼ぶ。この特許出願を提出する前にＩＢＩトランスフェクトー マをアメリカンタイプカルチャーコレクション、１２３０１パークローンＤｒ １０ツクビル、ＭＤ、２０８５２に登録し、ＡＴＣＣ受理番号ＣＲＬ １０２９ ３として１９８９年１１月７日に登録された。4, heavy chain construct pNγIA2. Transfection of this heavyweight construct with I B4-1 cells expressing kappa light chain were transfected. This light chain vector (IAl in pN, 1) contains the gene that confers G418 resistance to this cell. and another vector containing another selectable marker Ecogpt gene and its heavy vector. It is necessary to co-transfect the vector. It is a derivative of pSV2-gpt. pG,3, described in , continuation number, 254,004, is used for this purpose. did. 10 μg pNγlA2.1 (restricted with BarnHI) and Electroporation of approximately 5×io′ B4-1 cells in the presence of 1 μg of pG, 3 I did a session. 48 hours after electroporation, cells were incubated at Iμg/m 1 mycophenolic acid, 15μg 7m II Hyboxanthin and 250 RPMI containing μg/ml xanthine 2x1 in 1640/10% FC3, 2 sides Brate the microplate to 104 μl (2X 10S/mj) did. After 2-3 weeks, culture supernatants were assayed for IgG production and cells from 10 wells were assayed for IgG production. Soft agarose cloning was performed on the cells. Cell line LBI-D3-F Soft agarose cloning was performed twice for 3-D2-F3. This black The IBI transfection vector is referred to as “IBI transfection” prior to filing this patent application. American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Dr Registered at 10 Tsukubiru, MD, 20852, ATCC receipt number CRL 1029 3 on November 7, 1989.
ＩＢＩ）ランスフエフトーマは同じトランスフェクションで生成した他の細胞系 列よりも高い結合活性を有すると思われるＩｇＧ１モノクローナル抗体を産生じ た（ＧＢＳでコートしたマイクロプレートを用いて測定した）。抗体産物をＦＰ ＬＣで分析することにより、生産されたほとんどのモノクローナル抗体が１５０ ｋＤの典型的分子量を有しており、一方生産された抗体の６〜１５％が３００〜 ４５０ｋＤの分子量を有していることが示された。このようにｌＢ１Ｂ１トラン スフエフトーマつの分子量型のＩｇＧ＋モノクローナル抗体を生産した。IBI) Lanshu Efftoma was generated in the same transfection with other cell lines. produced an IgG1 monoclonal antibody that appeared to have higher avidity than the (measured using a GBS-coated microplate). FP the antibody product Most of the monoclonal antibodies produced were analyzed by LC. kD, while 6-15% of the antibodies produced have a typical molecular weight of 300-kD. It was shown to have a molecular weight of 450 kD. In this way, lB1B1 trans Two molecular weight types of IgG+ monoclonal antibodies were produced.
プロティンＡ精製ＩＢＩモノクローナル抗体はさらにゲル濾過クロマトグラフィ ーにより分析するのに用いた。ＩＢＩ細胞の栄養涸渇上清をプロティンＡアフィ ニティーカラムに通した（ランボン（Ｌａｎｇｏｎｅ） 、 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、 Ｍｅｔｈ、５５ ： ２７７ （１９８２））。Protein A purified IBI monoclonal antibody was further subjected to gel filtration chromatography. was used for analysis. The nutrient-depleted supernatant of IBI cells was converted into protein A affix. (Langone, J, Immuno 1, Meth, 55: 277 (1982)).
抗体は０．１Ｍクエン酸バッファ、ｐＨ３，５（０，０２％アジ化ナトリウム） で溶出し、ついでＰＢＳ、９８７．２に対して透析した。Antibody was in 0.1M citrate buffer, pH 3.5 (0.02% sodium azide) and then dialyzed against PBS, 987.2.
第２Ａ図はスパロース１２カラム（ｌ ｘ ２５ ｃｍ）と直列に継いだスパロ ース５ＦＰＬＣカラム（１ｘ２５ｃｍ）を用いた未分画ＩＢＩモノクローナル抗 体の分析クロマトグラムである。１００μβ中２０マイクログラムの抗体をロー ドし、流速０．３０ ｍＡ／ｍｉｎのＰＢＳバッファで運転した。モノクローナ ル抗体は２つのピークに分れた。低分子量物質は七ツマ−１ｇＧ （１６０−１ ８０ｋＤ）に期待される場所に溶出し、また高分子量クラクションはＩｇＧマル チマー（＞３００ｋＤ）に対して期待される範囲に溶出した。Figure 2A shows a Sparose 12 column (l x 25 cm) connected in series. Unfractionated IBI monoclonal anti- This is an analytical chromatogram of the body. Load 20 micrograms of antibody in 100 μβ It was operated with PBS buffer at a flow rate of 0.30 mA/min. monoclonal The antibody was divided into two peaks. The low molecular weight substance is Nanatsuma-1gG (160-1 80kD), and the high molecular weight horn was eluted at the expected location for IgG malt. It eluted in the range expected for zymer (>300 kD).
非関連トランスフエフトーマに由来するモノクローナル抗体は単一のモノマービ ークを与えた。Monoclonal antibodies derived from unrelated transfectomas contain a single monomeric antibody. I gave you a link.
モノマーおよびオリゴマー１ｇＧの調製のためＰＢＳ中２つのスバロース１２カ ラム（１，６Ｘ ５０ｃｍ）および１つのスバロース６カラム（５ｘ５０ｃｍ） を直列に継いだカラムでプロティンＡ精製抗体（１４６ｍｇ）を分画した。１４ ６ｍｇのプロティンＡ精製モノクローナル抗体から出発して、５．２ｍｇの高分 子量画分および７０ｍｇの低分子量画分を回収し、濃縮後Ａ ２ ｍ。を調整し て最初のサンプルとしてＦＰＬＣで分析した。第２Ｂ図および第２Ｃ図は各々高 および低分子量フラクションのクロマトグラムである。高分子量画分には約８５ ％の高分子量物質および１５％低分子量物質が含まれ、一方低分子量画分は約９ ９％の純度であった。２つの画分からのモノクローナル抗体を以下で議論する抗 体結合活性および生物学的活性についてテストするとこの高分子量物質は非常に 高い活性を示した。For the preparation of monomers and oligomers 1gG, two sbarose in PBS were prepared. column (1,6X 50cm) and one Sbarose 6 column (5x50cm) Protein A purified antibody (146 mg) was fractionated using a column connected in series. 14 Starting from 6 mg of Protein A purified monoclonal antibody, 5.2 mg of high The molecular weight fraction and 70 mg of the low molecular weight fraction were collected and concentrated to A2m. adjust The first sample was analyzed by FPLC. Figures 2B and 2C are each high and a chromatogram of the low molecular weight fraction. Approximately 85% for the high molecular weight fraction % of high molecular weight material and 15% of low molecular weight material, while the low molecular weight fraction is approximately 9. The purity was 9%. The monoclonal antibodies from the two fractions are the anti-antibodies discussed below. When tested for body binding activity and biological activity, this high molecular weight material is highly It showed high activity.
（実施例■） （高分子量モノクローナル抗体の免疫学的分析）免疫化学的手法を用いた高分子 量フラクション中のＩｇＧ分子の物理学的会合を測定した。各画分からの抗体を 標準的レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）非還元ボリアクルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧ Ｅ）条件下ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。回収物由来の抗体はサイズ 排除データに対応する高および低分子量バンドに分離し０．５Ｍ尿素を用いた非 ＳＤＳ ＰＡＧＥは以下に示すように低ｐＨ不連続バッファシステムで行った。(Example ■) (Immunological analysis of high molecular weight monoclonal antibodies) Polymers using immunochemical techniques The physical association of IgG molecules in the volume fractions was determined. Antibodies from each fraction Standard Laemmli non-reducing polyacrylamide gel electrophoresis (PAG) E) Electrophoresis was performed on a polyacrylamide gel under the following conditions. Antibodies derived from recovered materials have a size Separation into high and low molecular weight bands corresponding to exclusion data was performed using 0.5M urea. SDS PAGE was performed in a low pH discontinuous buffer system as shown below.
２．５％アクリルアミド、０．１Ｍ ＫＯＨ，０，５Ｍ尿素、ｐＨ６，８からな るスタッキングゲルを６０ｍＭ ＫＯＨ，０，３７Ｍ酢酸、０．５Ｍ尿素、ｐＨ ４，３を含む３〜５％直線勾配分離ゲルバッファに注いだ。スタッキングゲルお よび分離ゲルの両方とも、アクリルアミド：ビスアクリルアミド比は１９：１で 行った。リザーバーバッファには０．３５Ｍβ〜アラニン、０．１４Ｍ酢酸、ｐ Ｈ４，５が含まれる。このゲルをサポートとしてゲルポンドＰＡＧフィルム上で 重合した。サンプルは電気泳動前、１０％グリセリンを含むスタッキングバッフ ァ中室温で１時間インキュベーションした。From 2.5% acrylamide, 0.1M KOH, 0.5M urea, pH 6.8. 60mM KOH, 0.37M acetic acid, 0.5M urea, pH 4,3 into a 3-5% linear gradient separation gel buffer. stacking gel The acrylamide:bisacrylamide ratio was 19:1 for both the separation gel and the separation gel. went. Reservoir buffer contains 0.35M β to alanine, 0.14M acetic acid, p Includes H4 and 5. This gel is used as a support on Gelpond PAG film. Polymerized. Samples were placed in a stacking buffer containing 10% glycerin before electrophoresis. The mixture was incubated for 1 hour at room temperature in a vacuum chamber.
これらの条件下、第３図に示されているように、高分子量抗体には主にダイマー （分子量が七ツマ−の２倍）が含まれ、モノマーおよびトライマー成分が少量含 まれている一方、低分子量画分には基本的に全てモノマーが含まれていた。した がってＩｇＧダイ７−はある条件（２２％５ＤＳ）下では解離しやすい非共有結 合相互作用で結合しているが変性条件下（０，５Ｍ尿素）では結合していないと 結論し得る。Under these conditions, high molecular weight antibodies mainly contain dimers, as shown in Figure 3. (with a molecular weight twice that of 7-mer), and contains a small amount of monomer and trimer components. On the other hand, the low molecular weight fraction basically contained all monomers. did Therefore, IgG dye7- is a non-covalent bond that tends to dissociate under certain conditions (22%5DS). Although they are bound by binding interactions, they are not bound under denaturing conditions (0.5M urea). It can be concluded.
精製した非分面ＩＢＩモノクローナル抗体をＳＤＳ存在下、還 。The purified unsectioned IBI monoclonal antibody was refluxed in the presence of SDS.
元および非還元条件のポリアクリルアミドゲルで分析し、２つの異常なバンドパ ターンが示された。Ｉ％β−メルカプトエタノールで還元したプロティンＡモノ クローナル抗体サンプルの電気泳動をレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）によって報告さ れている５〜１５％直線勾配５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで行ない、コマ− ジブルーＲ−２５０でたんばく質を検出した。還元剤とＳＤＳを用いた銀染色ゲ ル（ダマ−パル（Ｄａｍｅｒｖａｌ ）等、 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ８．１５Ｂ（１９８７） ）はＩＢＩとコントロールモノクローナル抗体の両 方に典型的りおよびＨ鎖（２５および５０ｋＤバンド）の存在を示した。しかし ＩＢＩは別に３７ｋＤのバンドを含んでいた（第４Ａ図）。イムノプロットはカ ッパし特異的試薬とは反応するがＨ鎖特異的試薬とは反応しない３７ｋＤおよび ２５ｋＤのバンドを示した。３７ｋＤのバンドは“異常り鎖”または“Ｌｌと命 名した。本来のし埴生産細胞系列（Ｂ ４−１細胞）は両り鎖を作り、またこの 細胞系列から誘導さる他のトランスフェクシントは２つのし鎖を含み種々の量の ダイマーを生産した。Analyzed on polyacrylamide gels under original and non-reducing conditions, two unusual band patterns were detected. A turn was indicated. Protein A mono reduced with I% β-mercaptoethanol Electrophoresis of clonal antibody samples was reported by Laemmli. A linear gradient of 5-15% was performed on a 5DS-polyacrylamide gel. Protein was detected with Diblue R-250. Silver staining gel using reducing agent and SDS Electrophoresis (Damerval, etc.) 8.15B (1987)) contains both IBI and control monoclonal antibodies. It showed the presence of typical light and heavy chains (25 and 50 kD bands). but IBI contained an additional 37 kD band (Figure 4A). Immunoplot is A 37kD and It showed a 25kD band. The 37kD band is the “abnormal chain” or “Ll”. I named it. The original shibani-producing cell line (B4-1 cells) produces both chains, and this Other transfectants derived from cell lines contain two chains and contain varying amounts of produced dimer.
未分画ＩＢＩモノクローナル抗体を還元剤なしで電気泳動したとき（第４Ｂ図） 、分子種の異なる３つのバンドに分離した。最も小さい分子種は分子量１８０ｋ Ｄに相当し、正常なＩｇＧ１と同じ移動度を示した。中間の分子種は分子量１９ ０ｋｄに相当する。最も高い分子量の分子種は分子量約２０３ｋＤの免疫グロブ リンに対応する。When unfractionated IBI monoclonal antibody was electrophoresed without reducing agent (Figure 4B) It was separated into three bands with different molecular species. The smallest molecular species has a molecular weight of 180k D, and showed the same mobility as normal IgG1. The intermediate molecular species has a molecular weight of 19 Corresponds to 0kd. The molecular species with the highest molecular weight is an immunoglobulin with a molecular weight of approximately 203 kD. Corresponds to phosphorus.
さらに各バンドの抗体を還元二次元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し た。−次元は先に述べたモノクローナル抗体ＩＢＩの非還元サンプルである。電 気泳動後このサンプルレーンを切り出し、１％β−メルカプトエタノール中１０ 中間０沸し、各々運転８７７７９５分間２回の洗浄を行った。このゲル片を５〜 １５％直線勾配５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１，５ｍｍ）上のスタッキン グゲル領域に入れ、さらにスタッキングゲルでうまく抑えた。このゲルで上述の ように泳動し、ついで銀染色した。Furthermore, each band of antibodies was electrophoresed on a reducing two-dimensional SDS polyacrylamide gel. Ta. -dimension is a non-reduced sample of the monoclonal antibody IBI mentioned above. electric After pneumophoresis, this sample lane was cut out and incubated in 1% β-mercaptoethanol for 10 min. Two washes of 877,795 minutes each were carried out at an intermediate boiling point. 5 to 5 pieces of this gel Stacking on 15% linear gradient 5DS-polyacrylamide gel (1,5 mm) It was placed in the Gugel region and was further suppressed successfully with a stacking gel. In this gel, The cells were electrophoresed and then silver stained.
非還元／還元２次元ＰＡＧＥにおける３種の分子量の抗体の泳動結果を第４Ｃ図 に示す。３つ全ての分子種は典型的重鎮分子量に対応する同様のたんばく質バン ドを示した。しかし、３つの分子種は異なる量の２つの軽鎖バンド、１つは正常 な分子量（２５ｋＤ）、もう１つはより大きい分子量（３７ｋＤ）を含んでいた 。Figure 4C shows the migration results of antibodies with three different molecular weights in non-reducing/reducing two-dimensional PAGE. Shown below. All three species have similar protein bands corresponding to typical heavyweight molecular weights. indicated. However, the three species showed different amounts of two light chain bands, one normal one with a larger molecular weight (25 kD) and one with a larger molecular weight (37 kD). .
両軽鎖および重鎖バンドは抗軽鎖および抗重鎮抗体との反応で確認した。これら のデータはモノマーおよびオリゴマー抗体の少なくとも３つの分子種がＩＢ！細 胞系列によって生産される集合体中に存在する。これら３つは全て相対的に正常 なＨｔＬｔ ＩｇＧ化学量論比を有している。つまり１８０ｋＤバンドに関して は２つの正常な軽鎖が２つの正常な重鎮と会合しており（ＨｔＬｎＬｎ）、１９ ０ｋＤバンドに関しては１つの正常な軽鎖および１つの異常軽鎖に２つの正常な 重鎮が会合しており（ＨＬｎＬａ） 、また２０３ｋＤバンドに関しては２つの 異常な軽鎖が２つの正常な重鎮と会合していた。Both light chain and heavy chain bands were confirmed by reaction with anti-light chain and anti-heavy chain antibodies. these The data shows that at least three molecular species of monomeric and oligomeric antibodies are IB! Thin present in aggregates produced by the cell lineage. All three are relatively normal It has a stoichiometric ratio of HtLt and IgG. In other words, regarding the 180kD band has two normal light chains associated with two normal heavy chains (HtLnLn), 19 For the 0 kD band, one normal light chain and one abnormal light chain have two normal The heavyweights are meeting (HLnLa), and regarding the 203kD band, there are two The abnormal light chain was associated with two normal heavy chains.
さらにオリゴマー抗体分子を形成する上でのＬａの役割を調べた。プロティンＡ 精製ＩＢＩ抗体をＦＰＬＣサイズ排除カラムで分離し、２９および４０分の間に 回収されたたんばく質含有フラクションを還元ＰＡＧＥで分析した。銀染色は事 実上全てのサンプルが分子量２５．３７および５０ｋＤの３つの鎖を有している ことを示した（第５図）。しかし、この高分子量物質（フラクション２９−３４ ）はＬｎ（２５ｋＤ）に対するＬａ （３７ｋＤ）の割合が増加していた。これ らのデータは全てのＬａ含有免疫グロブリン分子が必ずしもオリゴマーを形成し ないがオリゴマー形成はＬａを伴っていることを示している。Furthermore, the role of La in forming oligomeric antibody molecules was investigated. Protein A Purified IBI antibodies were separated on a FPLC size exclusion column between 29 and 40 minutes. The recovered protein-containing fractions were analyzed by reducing PAGE. Silver staining is a thing Virtually all samples have three chains with a molecular weight of 25.37 and 50 kD. This was shown (Figure 5). However, this high molecular weight substance (fractions 29-34 ) had an increased ratio of La (37kD) to Ln (25kD). this Their data suggest that all La-containing immunoglobulin molecules do not necessarily form oligomers. However, oligomer formation is accompanied by La.
（実施例■） １ｇＧ２オリゴマーの調製 さらにオリゴマー形成に対するＬａの鎖の形成を確認するため、別に２つのタイ プのトランスフエフトーマを調製した。Ｉ ｇ Ｇ ＋を生産する細胞系列を同 じＨ鎖ベクターおよび正常なし鎖のみを生産する受容細胞系列を用いて作製した 。ＩｇＧｔを生産する細胞系列は同じＨ鎖Ｖ領域遺伝子（すなわち４Ｂ９）を含 むγ２ベクターをＬａおよびＬｎ両方を発現するＢ４−１細胞系列にトランスフ ェクションすることによって作製した。ＩｇＧ＋抗体はオリゴメリゼーションの 証拠は示さなかったが、ＩｇＧｔ系列はＩＢ１細胞系列同様１０〜１５％ダイマ ーを含むモノクローナル抗体を発現した。このことはＬａが高分子量オリゴマー 形成に必要であることを確認している。(Example ■) Preparation of 1gG2 oligomer Furthermore, in order to confirm the formation of La chains with respect to oligomer formation, we conducted two separate A transfectoma was prepared. The cell lineage that produces IgG+ is using the same heavy chain vector and a recipient cell line that produces only the normal non-chain. . The cell lines that produce IgGt contain the same H chain V region gene (i.e. 4B9). γ2 vector was transfected into the B4-1 cell line expressing both La and Ln. It was fabricated by injection. IgG+ antibodies undergo oligomerization Although no evidence was shown, the IgGt lineage, like the IB1 cell lineage, has a 10-15% diminution rate. We expressed a monoclonal antibody containing -. This means that La is a high molecular weight oligomer. It has been confirmed that it is necessary for formation.
オリゴマーを分泌するＩｇＧｔ）ランスフエフトーマを以下のように作製した。An IgGt (IgGt) transfectoma that secretes oligomers was produced as follows.
γ２遺伝子を含むファージ５Ａ由来のＨｉｎｄｌｌＩフラグメントを５′端がポ リリンカー領域の隣りにくるような方向でｐＵｃ１８にサブクローニングした。The HindllI fragment from phage 5A containing the γ2 gene was inserted with the 5' end pointing. It was subcloned into pUc18 in an orientation adjacent to the relinker region.
この構築物をＢａｍＨＩで消化し、５′端にポリリンカーを有するγ２遺伝子を 放出した。This construct was digested with BamHI to extract the γ2 gene with a polylinker at the 5' end. Released.
この単離したフラグメントをｐＧのＢａｍＨ１部位にクローニングしカセットＩ ）ｃ７２を作製した。ｐＧは１２１ｂｐ ＨｉｎｄｌＩ［−ＢｇｌＩ［フラグメ ントを消化し、クレノー充填および再連結で除去したｐＳＶ２−ｇｌ）ｔの誘導 体である。This isolated fragment was cloned into the BamH1 site of pG and cassette I ) c72 was produced. pG is 121bp HindlI[-BglI[fragment Induction of pSV2-gl)t, which was removed by digestion, Klenow filling and religation. It is the body.
重鎮可変領域遺伝子をＨｉｎｄｌｌｌ消化物から低融点アガロースの電気泳動に よって精製した。またｐｃｙ７２カセットをＨｉｎｄｌＩＩで消化し、ＣＩＰ処 理後低融点アガロース電気泳動で分画した。線状化カセットおよび可変領域遺伝 子挿入物を含む低慕点アガローススライスを合わせ、ＤＮＡをライゲーションし てからそれを用いてコンピテントバクテリアをトランスホームした。トランスホ ーマントをｐＧγ２ベクター中の７２遺伝子と同じ向きに挿入されているＶ遺伝 子を含むものについてスクリーニングした。Key variable region genes were analyzed from Hindlll digests by electrophoresis on low melting point agarose. Therefore, it was purified. The pcy72 cassette was also digested with HindlII and treated with CIP. After washing, it was fractionated by low melting point agarose electrophoresis. Linearization cassette and variable region genetics Combine the low-temperature agarose slices containing the child inserts and ligate the DNA. and then used to transform competent bacteria. Transho - V gene inserted in the same direction as the 72 gene in the pGγ2 vector Screened for those containing children.
望ましい挿入物を含むトランスホーマントを同定するため生成したコロニーを１ ％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌｌアンピシリンを含むＬＢ培地２ｍＡに接 種し、３７℃で一晩増殖した。−晩培養物からＤＮＡを調製し、ＨｉｎｄＩ［［ で消化してサンプルがｐＧγ２ベクター中の可変領域挿入物を含むことを検定し た。ベクター内の挿入物の方向はＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩによる消化で決定 した。同じ方向の可変および定常領域遺伝子を含むサンプルを選択しｐＧγ２− Ａ２Ｈと命名した（第１５図）。このＤＮＡはＬａおよびＬｎの両方を発現する Ｂ４−１細胞系列へのトランスフェクションに用いた。One colony generated to identify transformants containing the desired insert. % glucose and 100 μg/ml ampicillin at 2 mA. Seed and grown overnight at 37°C. - Prepare DNA from late cultures and prepare HindI[[ Digest the sample to assay that it contains the variable region insert in the pGγ2 vector. Ta. The orientation of the insert within the vector was determined by digestion with BglII and BamHI. did. Select samples containing variable and constant region genes in the same orientation, pGγ2- It was named A2H (Fig. 15). This DNA expresses both La and Ln It was used for transfection into the B4-1 cell line.
６Ｆ５と命名したこのＩｇＧｔ抗体を培養上清からプロティンＡを用いて精製し た。精製抗体のＦＰＬＣ分析（Ｆ Ｐ Ｌ Ｃバッファは１０ｍＭリン酸ナトリ ウム、０．９％ＮａＣｊ２５ｐＨ７，２）は異常軽鎖を分泌する同じ細胞系列の トランスフェクションによって生産されるＩＢＩ抗体に類似する全抗体の約１２ ％にあたる高分子量ショルダーを示した。ゲルが５〜１５％ではなく４〜１２％ であること以外は一般に上述されている方法で行った５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分 析を行ったときＩＢＩ抗体と同様３つの分子種：正常なＩｇＧｚ （ＨｚＬｎＬ ｎ） 、１ツの異常軽鎖を含むＩｇＧ＊分子（ＨｔＬｎＬａ）および２つの異常 軽鎖を含むＩｇＧｔ分子（ＨｔＬａＬａ）が出現した。This IgGt antibody, named 6F5, was purified from the culture supernatant using protein A. Ta. FPLC analysis of purified antibodies (FPLC buffer is 10mM sodium phosphate um, 0.9% NaCj25pH7,2) from the same cell lineage secreting abnormal light chains. Approximately 12 of the total antibodies similar to IBI antibodies produced by transfection % of the high molecular weight shoulder. 4-12% gel instead of 5-15% Analysis by 5DS-PAGE performed as generally described above, except that When analysis was performed, three molecular species were detected, similar to the IBI antibody: normal IgGz (HzLnL n), an IgG* molecule containing one abnormal light chain (HtLnLa) and two abnormal IgGt molecules containing light chains (HtLaLa) appeared.
高分子量ＩｇＧｔオリゴマーの結合活性の増加は抗原結合検定で確認された。こ の検定はバクテリア自体ではなくＧＢＳ抗原をマイクロプレートに吸着させてお く以外は以下の実施例■に述べる方法で行った。コントロールとしては正常モノ マーＩｇＧｔ抗体（８８８）、正常モノマーＩｇＧ＋抗体（Ｄ３）、および親Ｉ ｇＭｈランスフエクトーマ抗体（ｔ４Ｂ９）を用いた。第７図に示したこの結果 はＩ ｇＧ ２オリゴマー抗体６Ｆ５はＩｇＣ；＋オリゴマー抗体ＩＢＩと同様 に著るしい反応性を有することが示された。ｔ４Ｂ９ＩｇＭ結合はわずかに高い が異なる第２ステツプ試薬を用いて０．Ｄ、値の増加のいくらかを説明するＩｇ Ｍを検出した。The increased binding activity of high molecular weight IgGt oligomers was confirmed in an antigen binding assay. child The assay involves adsorbing GBS antigen to a microplate rather than the bacteria itself. Except for the above, the method described in Example 2 below was used. Normal as a control monomer IgGt antibody (888), normal monomer IgG+ antibody (D3), and parent I gMh Transfectoma antibody (t4B9) was used. This result is shown in Figure 7. is IgG 2 oligomer antibody 6F5 is IgC; + oligomer antibody IBI It was shown to have significant reactivity to. t4B9IgM binding is slightly higher 0.0 using second step reagents with different values. D, Ig which explains some of the increase in value M was detected.
（実施例ｍ （異常軽鎖の配列分析） 異常軽鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列を決定した。(Example m (Sequence analysis of abnormal light chain) The DNA and amino acid sequences of the abnormal light chain were determined.
マツダイラ（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ）、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２６ １ ＋ １００３５−１００３８ （１９８７）に報告されている方法でミニ・ トランスプロット電気泳動トランスファーセル（バイオラドラボラトリーズ、リ ッチモンド、ＣＡ）を用いイムノピロンメンブレン（ミリポア、ベッドフォード 、ＭＡ）上にエレクトロブロッティングすることによりＬａおよびＬｎを５ＤＳ −ＰＡＧＥから回収した。Matsudaira, J, Biol, Chem, 26 1 + 10035-10038 (1987). Transplot electrophoresis transfer cell (Bio-Rad Laboratories, Reliance) Immunopirone membrane (Millipore, Bedford) , MA) by electroblotting onto 5DS - Recovered from PAGE.
このメンブレンをコマージブリリアントブルーで染色し、脱染色後染色バンドを （分子量３７ｋＤおよび２５ｋＤ）次のアミノ末端分析のためにメスで切り出し た。パルスリキッドプロティンシーケンサ−（モデル４７５Ａ、アプライドバイ オシステムズ、フォスターシティ−１ＣＡ）で自動エドマン分解を行った。この フ工二ルチオハイダントインアミノ酸誘導体をＰＴＨＣ−１８カラム（２，Ｉ Ｘ ２２０ｍｍ、 ＡＢ Ｉ）および溶離液として酢酸ナトリウム／テトラヒド ロフラン／アセトニトリル勾配を用いたモデル１２０ＡオンラインＨＰＬＣユニ ツト（アブライドバイオシステムズ）による逆相高速液体クロマトグラフィーで 分析した。この結果は両軽鎖の２１個のＮ末端アミノ酸が同一であることを示し た。This membrane was stained with Comerge Brilliant Blue and the stained bands were removed after destaining. (Molecular weight 37kD and 25kD) Cut out with a scalpel for next amino-terminal analysis. Ta. Pulse Liquid Protein Sequencer (Model 475A, Applied Bi Automated Edman degradation was performed on an OSystems, Foster City-1CA). this The phenylthiohydantoin amino acid derivative was applied to a PTHC-18 column (2, I X 220 mm, AB I) and sodium acetate/tetrahydride as eluent Model 120A online HPLC unit using Lofuran/acetonitrile gradient by reversed-phase high-performance liquid chromatography using Tuto (Abride Biosystems). analyzed. This result indicates that the 21 N-terminal amino acids of both light chains are identical. Ta.
Ｇｌｕ−目ｅ−Ｖａ ｌ−Ｌ、ｅ ｕ−Ｔｈｒ−Ｇ Ｉ ｎ−５ｅｒ−Ｐｒｏ −Ａ Ｉａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ −５ｅ ｒ−Ｌｅｕ −（Ａｒｇ）−Ｐｒｏ−Ｇ ｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ部位１４の（Ａｒｇ）の割合は 低く、いくつかはセリンを示した。Glu-E-Va l-L, e u-Thr-G I n-5er-Pro -A Ia-Thr-Leu -5e r-Leu -(Arg)-Pro-G The ratio of (Arg) in ly-Glu-Arg-Ala-Thr-Leu site 14 is Low and some showed serine.
ＤＮＡ配列はセリンに対応している。The DNA sequence corresponds to serine.
４Ｂ９ＶＬ遺伝子に特異的なＶ領域プローブを用い、ｌＢ１細胞系列由来のｃＤ ＮＡライブラリーを探った。このプローブはｐＵｃＡＩＫ（ｐＵＣ中５ｋｂのＥ ｃｏＲＩ−８ａｃＩ挿入物を含む。ＶＪ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ （Ｅ）−Ｓａ ｃｌ （Ｓ）フラグメントの位置を第１ｂ図で確認せよ）を５ａｃＩおよびＸｂ ａｌで消化して得た。この３ｋｂバンドを低融点アガロースゲルで精製した。こ のＤＮＡには配列“Ｆｉｎａｌ Ａ １ ｋ″が含まれている。ｍＲＮＡをＩＢ Ｉ細胞からファーストトラックｍＲＮＡアイソレーションキット（インビトロゲ ン、サンディエゴ、ＣＡ）を用いて精製した。またオリゴ（ｄＴ）プライマーお よびライブラリアン■キット（インビトロゲン）を用いｐＣＤＭ８ベクター中に ｃＤＮＡライブラリーを構築した。このライブラリーを４Ｂ９Ｖ領域プローブを 用いたコロニーハイブリダイゼーションでスクリーニングした。ポジティブクロ ーンは第８図に示した方策を用いてグイデオキシチェーンターミネーション法（ サンガー（Ｓａｎｇｅｔ）でシーケンシングした。Using a V region probe specific to the 4B9VL gene, cD derived from the lB1 cell lineage was I searched the NA library. This probe is pUcAIK (5kb E in pUC). Contains coRI-8acI insert. EcoRI (E)-Sa containing VJ gene cl(S) fragment (see Figure 1b) for 5acI and Xb Obtained by digestion with al. This 3 kb band was purified on a low melting point agarose gel. child The DNA of contains the sequence "Final A1k". IB mRNA Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen) from I cells Purification was carried out using the following methods: Also, oligo(dT) primer and into the pCDM8 vector using the Librarian Kit (Invitrogen). A cDNA library was constructed. Use this library to probe the 4B9V region. Screening was performed using colony hybridization. positive black The process is performed using the guideoxy chain termination method (Fig. 8). Sequencing was performed on Sanger (Sanget).
Ｌ’Ｖ領域のプライマーは２個所にアニールし、２重ラダーを生じるのでいくつ かのＤＮＡは一方向のみのシーケンシングを行った。用いたプライマーを以下に 示す。The primer in the L’V region anneals at two locations, creating a double ladder, so The DNA was sequenced in only one direction. The primers used are below. show.
１、Ｃ０Ｍ８ リバース ＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＣＡＧＡＡ２、 ４Ｂ９ ＶＪ／Ｃセンス ＴＣＡＡＣＡＣＣＧＴＧＡＣＡＡＴＴＧ３、 ４Ｂ９８４０ アンチセンス ＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧ４、 ４Ｂ９１０８０ アンチセンス ＴＣＴＣＧＴＡＧＴＣＴＧＣＴＴＴＧＣ５、Ｔ７ フォワード ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧシーケンシングはｃＤＮＡクローン４Ｂ ９−Ｖ／Ｃ１５がり、 Ｖ領域エクソンの反復を含み、“リーダーＬ’ Ｖ−Ｌ ’ Ｖ−Ｃ”構造（Ｌ’ Ｖはリーダー配列の最後の３つのアミノ酸と組換えＶ Ｊ遺伝子をコードするエクソンを表わしている）となっていることを明らかにし た。この軽鎖のＤＮＡ配列およびそれから誘導されるアミノ酸配列を第１６図に 示す。４Ｂ９−Ｖに１５は完全なｃＤＮＡクローンではないことに注意せよ。こ れは開始メチオニンをコードするＡＴＧのＧから開始する。Ｌ’ Ｖ （１）お よびＬゝｖ（２）はＬ’Ｖ領域の第１および第２コピーを示している。1, C0M8 Reverse CGACCTGCAGGCGCAGAA2, 4B9 VJ/C sense TCAACACCGTGACAATTG3, 4B9840 Antisense CAGATGGTGCAGCCACAG4, 4B91080 Antisense TCTCGTAGTCTGCTTTGC5, T7 forward AATACGACTCACTATAG sequencing is cDNA clone 4B 9-V/C15, contains repeats of V region exons, “Leader L” V-L 'V-C' structure (L'V is the last three amino acids of the leader sequence and recombinant V (representing the exon encoding the J gene) Ta. The DNA sequence of this light chain and the amino acid sequence derived from it are shown in Figure 16. show. Note that 4B9-V15 is not a complete cDNA clone. child It starts with the G of ATG, which encodes the starting methionine. L'V (1) and L'v(2) indicate the first and second copies of the L'V region.
Ｌ’Ｖ領域中の配列は第１７図に示されているように本来のＶ領域クローンのシ ーケンシングから得られたものに対応する。別の実験で、４Ｂ９ヒトモノクロー ナル抗体の重鎮可変領域が決定されている（第１８図）。ｃＤＮＡクローニング におけるアーチファクトの可能性を除外するため、Ｌａ鎖のアミノ酸組成を測定 した。サンプルをウォーターズビコタグワークステーションを用い６ＨＣｊ７／ １％フェノール中１１０℃で２４時間加熱し加水分解した。分析はＯ−オルトフ タルア／ｌｚ、テヒドによるプレカラム誘導体化およびＨＰ Ｉ Ｏ９０液体ク ロマトグラフによる逆相クロマトグラフィーで行った。第１表に示した分析結果 はＤＮＡ配列から予測されたものとよく対応している。The sequence in the L'V region is the same as that of the original V region clone, as shown in Figure 17. - Corresponds to what was obtained from kensing. In another experiment, 4B9 human monochrome The key variable regions of the null antibody have been determined (Figure 18). cDNA cloning Measure the amino acid composition of the La chain to exclude possible artifacts in did. Samples were processed using the Waters Bikotag Workstation 6HCj7/ Hydrolysis was carried out by heating in 1% phenol at 110° C. for 24 hours. Analysis is O-Orthof Talua/lz, precolumn derivatization with Tehyde and HP I O90 liquid column Reverse phase chromatography using a romatograph was performed. Analysis results shown in Table 1 corresponds well to that predicted from the DNA sequence.
第１表 異常軽鎖のアミノ酸分析 実験 予測 アミノ酸 常 正 アスパラギン酸／アスパラギン ２０．７＠２２．０ １６．０グルタミン酸／ グルタミン ３６．１ ３５．０ ２４．０セリン ４０．１ ４２．０ ２９ ．０ヒスチジン ４．９ ５．０ ３．０ グリシン ２９．７ ２７．０ １５．０スレオニン ２７，５ ２８．０ １ ７．０アラニン ２７．９ ２７．０ １７，０アルギニン １４．８ １５． ０ ９．０チロシン １３．０ １４．０ ９．０システイン” ＮＤ ６．０ ４．０ バリン １９．６ １８．０ １４．０メチオニン ｏ、ｏ ｏ、ｏ ｏ、。Table 1 Amino acid analysis of abnormal light chain Experiment prediction Amino acid normal Aspartic acid/Asparagine 20.7 @ 22.0 16.0 Glutamic acid/ Glutamine 36.1 35.0 24.0 Serine 40.1 42.0 29 ．． 0 histidine 4.9 5.0 3.0 Glycine 29.7 27.0 15.0 Threonine 27.5 28.0 1 7.0 Alanine 27.9 27.0 17.0 Arginine 14.8 15. 0 9.0 Tyrosine 13.0 14.0 9.0 Cysteine” ND 6.0 4.0 Valine 19.6 18.0 14.0 Methionine o, o o, o o,.
イソロイシン １１．４ １１．０ ６．０フエニルアラニン １１．８ １２ ．０ ８．０ロイシン ２６．１ ２４．０ １６．０リジン １４．８ １４ ．０ １１．０プロリン ＮＯ２３，０１４，０ １残基１モル、１１測定されず この配列のｍＲＮＡはＬ’ＶエクソンのみまたはリーダーおよびＬ’Ｖエクソン を２個含むゲノムＤＮＡによってコードされ得る。後者の場合、このリーダーエ クソンの、第２コピーはスプライスアクセプタ一部位を欠いているのでｍＲＮＡ 中には含まれないであろう。ＬＢＩ細胞系列由来のＤＮＡのゲノムサザンプロッ トを行ない２つのコピー中のｖｌＣおよびｎｅｏプローブのハイブリダイゼーシ ョン強度を比較した。■領域プローブはコピーの１つにより強力にハイブリダイ ズした。これはＬ’Ｖ領域の二重化に関する説明と一致している。Isoleucine 11.4 11.0 6.0 Phenylalanine 11.8 12 ．． 0 8.0 Leucine 26.1 24.0 16.0 Lysine 14.8 14 ．． 0 11.0 Proline NO23,014,0 1 mole of 1 residue, 11 not measured The mRNA for this sequence contains only the L'V exon or the leader and L'V exon. can be encoded by genomic DNA containing two. In the latter case, this reader The second copy of the splice lacks the splice acceptor site, so the mRNA It will not be included. Genomic Southern plot of DNA derived from the LBI cell line. hybridization of the vlC and neo probes in the two copies. The strength of the motion was compared. ■A region probe hybridizes more strongly with one of its copies. I lost it. This is consistent with the explanation regarding duplication of the L'V region.
（実施例Ｖ） （オリゴマー化に影響する重複したＬ’Ｖエクソンの構築と発現）さらに先の結 果を発展させるため、重複したＬ’Ｖエクソンをコードするがプロモーターおよ びリーダーはコードしないベクターを構築した。このベクター（ｐＧＫＡｌ、１ ２）とＨ鎖に関するベクター（ｐＮγＩＡ２．２）のコトランスフエクションを 行ないＬａが発現される唯一の軽鎖であるときのオリゴマー化への影響を示した 。(Example V) (Construction and expression of duplicated L’V exons that affect oligomerization) Further conclusions To develop the fruit, it encodes duplicate L’V exons, but the promoter and The leader constructed a non-coding vector. This vector (pGKAl, 1 2) and cotransfection of H chain vector (pNγIA2.2). demonstrated the effect on oligomerization when La is the only light chain expressed. .
一般的なりローニング方策を第９図に示した。簡単に云うとｐＵｃＡｌｋ、ｌの ３．２ ｋ ｂ Ｘｂａｌフラグメントをｐｌｃ２０Ｒにクローン化しくマーシ ュ（Ｍａｒｓｈ）等、 Ｇｅｎｅ３２ ： ４８１−４８５（１９８４） ） 、この構築物をｐｌｃＡｌに、２とした。ｐｌｃＡｌに、２中のＶに遺伝子をプ ライマーＡｌｋ ＰＲＩＭＩ （５’プライマー、センス、ＣＡＧＣＡＧＡＧＡ ＴＣＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＡＣＴＡＣＡＴ ）およびＡｌに ＰＲＩＭ２ （３’プライマー、アンチセンス、ＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡ Ｔ−ＧＡＡＣＴＡＡＴＴＴＴＣＴＡＴＣＣＣＴＴＡＣ）を用いたＰＣＲにより増 巾した。プライマーは上流のリーダーおよびプロモーターがＶに遺伝子の第２コ ピーの一部とならないよう選択した（Ｖに、に対する５′ リーダーおよびプロ モーター配列がないことは２つの長さの異なるｍＲＮＡ（１つは単一のＶに遺伝 子をコードし、またもう１つはＶに遺伝子の２つのコピーを含むｍＲＮＡをコー ドする）の転写を阻止する。しかし、これらのプライマーはＶに遺伝子の５′側 に位置しＶに遺伝子の５′側のスプライス部位を維持して■に遺伝子の第１コピ ーに対して第２コピーをスプライスさせるように選択した。さらに、プライマー には５’Ｂｇ？１１部位および３′ＢａｍＨ１部位を含み、粘着端が共通である ことがらＢａｍ８１部位にクローニングすることが容易なように選択した。また 同様の操作を用いて他のＶに遺伝子も複製し得る。さらに正しい配向では（Ｖに 遺伝子の第１コピーに対するＶに２の方向）、ＢａｍＨｆ部位はＶに遺伝子の２ つのコピーの３′側に保存され、一方、正しくない方向の場合、ＢａｍＨｆ部位 はＶに遺伝子の２つのコピーの間に存在する。Ｖに２が正しい方向で挿入されて いる場合、２つのＶに遺伝子コピーを含む挿入物はＢａｍＨＩ＋ＢｇＩＵ消化で 切り出すことができ、これは粘着端共通のため今度はｐ Ｇ ｋ 、５／ Ｂａ ｍＨＩにクローン化し得る。A general roning strategy is shown in Figure 9. Simply put, pUcAlk, l 3.2 kb Xbal fragment cloned into plc20R Marsh et al., Gene32: 481-485 (1984)) , this construct was given plcAl as 2. PlcAl, insert the gene into V in 2. Limer Alk PRIMI (5' primer, sense, CAGCAGAGA TCTACAGTTGGTTTGATCCTGACTACAT) and Al PRIM2 (3' primer, antisense, GCCCGAGGATCCGA Increased by PCR using T-GAACTAATTTTCTATCCCTTAC) It was wide. The primers are used to identify the upstream leader and promoter of the second copy of the gene. (to V, 5' leader and professional) The absence of a motor sequence means that two different lengths of mRNA (one inherited in a single V one that encodes a child, and another that encodes an mRNA containing two copies of the gene in V. to prevent the transcription of However, these primers are The first copy of the gene is located in V, maintaining the 5' splice site of the gene in The second copy was chosen to be spliced to the second copy. Additionally, primer 5'Bg? Contains 11 sites and 3'BamH1 sites, with a common sticky end It was selected so that it could be easily cloned into the Bam81 site. Also Genes can also be cloned into other V using similar operations. Furthermore, in the correct orientation (to V 2 orientation of the gene for the first copy of the gene), the BamHf site is BamHf site is conserved on the 3′ side of two copies, whereas in the incorrect orientation, the BamHf site is present between the two copies of the gene in V. 2 is inserted into V in the correct direction. Inserts containing gene copies in two Vs are digested with BamHI+BgIU. It can be cut out, and since the sticky end is common, this time p G k, 5/Ba Can be cloned into mHI.
このＰＣＲ産物（Ｖ／Ｃ１）をＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ｐＩｃＡ ｌｋ、２中のＶ／Ｃ遺伝子の第１コピーの３′側のＢａｍＨＩにクローン化した 。正しい配向の場合、この構築物をｐＩｃＡｌに、２とする。しかし、まずＰＣ Ｒ産物をｐＵｃ１９などのベクターにクローン化し、ついでＶに遺伝子の単一コ ピーを含む構築物にクローン化することが望ましい。このことはＰＣＲで用いて いるＴａｑポリメラーゼのヌクレオチド取り込みミス頻度のため重要であるＰＣ Ｒ産物の配列の迅速な確認を可能とする。この操作において、ｐｌｃＡｋ、４か ら５ｓｔＩ＋ＢａｍＨｒフラグメントとしてＶに、を切り出し、シーケンシング 情報を得るためｐＵｃ１９にクローニングした。この新しい構築物をｐＵｃＡｌ に、２とする。This PCR product (V/C1) was digested with BamHI and BglII, and pIcA lk, cloned into BamHI 3' of the first copy of the V/C gene in 2. . For correct orientation, this construct is given pIcAl as 2. But first, the PC The R product is cloned into a vector such as pUc19 and then a single copy of the gene is inserted into the V. It is desirable to clone the construct into a construct containing the P.I. This can be used in PCR PC is important because of the frequency of nucleotide incorporation mistakes of Taq polymerase in Allows rapid confirmation of the sequence of the R product. In this operation, plcAk, 4 or Excise and sequence V as a 5stI+BamHr fragment. Cloned into pUc19 for information. This new construct was converted into pUcAl 2.
第９図に示されているように、Ｖに遺伝子２コピーを含む３．８ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ ＋Ｂｇ１ｍフラグメントをｐＧｋ、５／ＢａｍＨＩにクローニングした。ま たこの構築物は４８９抗体に対するＣにを有している。ｐＧｋ、５は第１θ図お よび以下に示す方法で構築した。ＥＰＯ刊行ＥＰ３１４，１６１（参考として引 用している）に報告されているｐｓ Ｖ ２−ｇｌ）を由来のベクターであるｐ Ｇ、３からＳＶ４０を欠失させた。ｐＧ、３を５ｐｈｌで消化し、その粘着末端 をクレノーフラグメントで充填した。それからこのベクターをＰｖｕＵで消化し ライゲーションした。このライゲーション産物でコンピテント細胞をトランスホ ームした。プラスミドＤＮＡをＰｖｕｆｆおよび５ｐｈｉ制限部位のないことで スクリーニングした。As shown in Figure 9, 3.8kb BamH containing 2 copies of the gene in V The I+Bg1m fragment was cloned into pGk, 5/BamHI. Ma The octopus construct has C for the 489 antibody. pGk, 5 is shown in Figure 1θ and and was constructed using the method shown below. EPO publication EP 314, 161 (cited for reference) psV2-gl), which is a vector derived from psV2-gl) reported in SV40 was deleted from G,3. pG,3 was digested with 5phl and its sticky ends were was filled with Klenow fragment. Then this vector was digested with PvuU. Ligated. Transfect competent cells with this ligation product. I started a game. The plasmid DNA is free of Pvuff and 5phi restriction sites. Screened.
この産物をｐＧ、９と呼ぶ。This product is called pG,9.
次のステップでこのベクターにＮｏｔＩ認識配列を挿入した。In the next step, a NotI recognition sequence was inserted into this vector.
ｐＧ、９をＮｄｅＩで消化し、ＣＩＰ処理してから低融点アガロースで精製した 。それからＮｏｔＩ認識配列およびＮｄｅｌ粘着末端を含むリンカ−とアニール した。ライゲーション後、バクテリアにトランスホームし、そのプラスミドＤＮ ＡをＮｏｔ １部位の存在に関してスクリーニングした。さらにこのＤＮＡをＮ ｏｔ Ｉで消化し、再び環状化した。このことはリンカ−の潜在的フンカテマー を除去している。このベクターは単一コピーのリンカ−を含むものでｐＧ、ＩＯ と呼んだ。使用したリンカ−を以下に示す。pG, 9 was digested with NdeI, treated with CIP, and purified with low melting point agarose. . Then anneal with a linker containing a NotI recognition sequence and an Ndel sticky end. did. After ligation, the bacteria are transformed and the plasmid DNA A was screened for the presence of the Not1 site. Furthermore, this DNA is N Digested with otI and recyclized. This means that the linker's potential linker is being removed. This vector contains a single copy of the linker, pG, IO I called it. The linker used is shown below.
５’ ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡ ３’ ３’ ＣＧＣＣＧＧＣＧＴＡＴ ５’ 別にｐＧ、１２を構築した。このベクターはＮｄｅＩ部位の隣りにＮｏｔ １部 位が付加していることでｐＧ、５とは異なる。これはｐＧ、 ９をｐＧ、３から 調製するのと同じ方法で行った。ｐｃ、 ５はＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの間にあ る７５］ｂｐをｐＩｃ２０Ｒ由来のポリリンカーで置換えた点でｐＧ、３とは異 なる。5’ TAGCGGGCCGCA 3’ 3' CGCCGGCGTAT 5' Separately, pG, 12 was constructed. This vector has a Not1 site next to the NdeI site. It differs from pG and 5 by having an additional position. This is pG, 9 is pG, 3 to It was prepared in the same way. pc, 5 is between EcoRI and BamHI It differs from pG,3 in that the pIc20R-derived polylinker replaces the pIc20R-derived polylinker. Become.
ｐＧ、 １１をｐＧ、 １２由来のＮｏｔｌ−ＢａｍＨＩフラグメントを含むポ リリンカーとアンピシリン耐性遺伝子、Ｅ ｅｏｇｐｔ遺伝子を含み、かつＳＶ ４０エンハンサ−を欠＜ｐＧ、１０の大きい方のＢａｍＨＩ −Ｎｏｔ Ｉフラ グメントと合せることにより構築した。このことは両ベクターをＮｏｔｌおよび ＢａｍＨＩで消化し、低融点アガロースで精製することで行った。ライゲーショ ンおよびトランスホーメーション後、トランスホームしたバクテリアからＤＮＡ を調製し、ポリリンカー由来のＥｃｏＲＩ 、 ＢｇｌＩＩおよび５ｐｈｌ部位 の存在、およびＳＶ４０エンハンサ−領域から欠失したＰｖｕＩＩおよびＮ５ｉ １部位の欠失に関してスクリーニングした。pG, 11 and pG, a port containing the Notl-BamHI fragment derived from 12. Contains a relinker, an ampicillin resistance gene, and an E eogpt gene, and contains an SV 40 enhancer-<pG, larger of 10 BamHI-Not I fl It was constructed by combining it with the component. This means that both vectors are Notl and This was done by digesting with BamHI and purifying with low melting point agarose. Liguesho After conversion and transformation, the DNA from the transformed bacteria is extracted. and the EcoRI, BglII and 5phl sites derived from the polylinker presence of PvuII and N5i deleted from the SV40 enhancer region. Screened for single site deletions.
第１Ｏ図に示したようにｐＧｋ、４を構築するためｐｃ、 ｔ ｔをＥｃｏＲＩ で切断し、ＣＩＰで処理した。ｐＣＫはｐＥＭＢＬ ｌ ＢのＥｃｏＲＩ部位に 挿入したヒトＣ遺伝子を含む２．７ ｋｂ ＥｃｏＲ１フラグメントを含んでい る。ｐＣＫをＥｃｏＲＩで消化し、その２．７ｋｂフラグメントをゲルで精製し た。、２つのフラグメントをライゲーションし、その産物を用いてコンピテント ＪＭ８３細胞をトランスホームした。このトランスホーマントをＣにプローブを 用いてコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。ポジティブ コロニーのＤＮＡを５ｏｃｌの消化による６、５．０．５及び０．１２５ｋｂフ ラグメントの存在についてスクリーニングした。To construct pGk,4 as shown in Figure 1O, pc, tt was added to EcoRI. and treated with CIP. pCK is inserted into the EcoRI site of pEMBL lB. Contains a 2.7 kb EcoR1 fragment containing the inserted human C gene. Ru. pCK was digested with EcoRI and the 2.7 kb fragment was gel purified. Ta. , ligate the two fragments and use the product to create a competent JM83 cells were transformed. Probe this transformant to C. was used for screening by colony hybridization. positive Colony DNA was digested into 6, 5, 0.5, and 0.125 kb fragments by 5 ocl digestion. Screened for the presence of fragments.
第１０図に示されているように、ｐＧｋ、４をＣ１ａｌおよびＨｉｎｄＩＩＩで 制限切断し、ＣＩＰで処理した後その大きい方のフラグメントを低融点アガロー スで精製した。ｐＩｃ１９ＲのＢｇｌＩ［部位に挿入したマウス重鎮エンハンサ −を含む１ ｋｂ Ｘｂａｌフラグメントを含む（両ＸｂａＩおよびＢｇｌｎ部 位は２つのフラグメントのライゲーション前にクレノーポリメラーゼで平滑化し た）ｐｌＣＭＨＥＸＸをＣ１ａＩおよびＨｉｎｄｌ［［で制限切断し、エンハン サ−を含むｌｋｂフラグメントを低融点アガロースで精製した。pGk,4 with C1al and HindIII as shown in Figure 10. After restriction cleavage and treatment with CIP, the larger fragment was transferred to a low melting point agarose. It was purified using Mouse heavy enhancer inserted into the BglI site of pIc19R - Contains a 1 kb Xbal fragment containing (both XbaI and Bgln portions) The positions were blunted with Klenow polymerase before ligation of the two fragments. ) pICMHEXX was restricted with C1aI and Hindl[[ and enhanced. The lkb fragment containing the cer was purified on low melting point agarose.
２つのフラグメントをライゲーションし、この生成物を用いてコンピテントＪＭ ８３細胞をトランスホームした。このトランスホーマントのＤＮＡをＥｃｏＲＩ およびＨｉｎｄｌＩ［による消化由来の４．３．２．７．０．７および０．３ｋ ｂのフラグメントの存在についてスクリーニングした。Ligate the two fragments and use this product to create a competent JM 83 cells were transformed. The DNA of this transformant was and 4.3.2.7.0.7 and 0.3k from digestion with HindlI [ Screened for the presence of fragments of b.
Ｖ／Ｃ遺伝子２コピーを含むｐｌｃＡｌに、４由来の３．８ ｋｂ ＢａｍＨＩ ＋ＢｇｌＩＩフラグメント（第９図）のｐＧｋ、５／ＢａｍＨＩへのクローニン グから生ずるベクターをｐＧＡｋｌ、１２と命名し、これを用いてＨ鎖をコード するベクターｐＮγＩＡ２．２と共にＡｇ８．６５３にコトランスフェクトした 。The 3.8 kb BamHI derived from 4 was added to plcAl containing 2 copies of the V/C gene. Cloning of the +BglII fragment (Figure 9) into pGk, 5/BamHI The resulting vector was named pGAkl,12 and was used to encode the heavy chain. Ag8.653 was co-transfected with vector pNγIA2.2 to .
このトランスフェクトの培養上清をグループＢ多糖類に対する結合に関してスク リーニングした。最も強く結合するものをオリゴマーの存在に関して尿素−ＰＡ ＧＥ系で分析した。２３Ｂ１と命名される１つのマスターウェル由来の栄養涸渇 上清中の抗体を先の実施例■で述べたように精製し、尿素−ＰＡＧＥ系で分析し た。電気泳動後ゲルボンドを除き（アルボ−（Ａｌｂａｕｇｈ）等、Ｅｌｅ−ｃ ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、８ ：１４０ （１９８７） ） 、ゲル中のたんぽ （質を２０％メタノールを含む泳動バッファーを用いてニトロセルロースベーパ ーに移しく４００ｍＡから開始して、１８時間）、ラフ（Ｒａｆｆ）等、Ｊ、 Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｄｉｓ、 １５７：１１８ （１９８８）に報告されている方 法でイムノプロットした。第１１図に示したこの結果はダイマーおよびそれ以上 のオリゴマーがＬａおよびＨのみ発現し、Ｌｎは発現しない細胞によって合成し 得ることを示している。Culture supernatants of this transfection were screened for binding to group B polysaccharides. Leaned. The strongest binding is determined by the presence of oligomers in urea-PA. Analyzed with GE system. Nutrient depletion from one master well designated 23B1 The antibodies in the supernatant were purified as described in the previous Example ① and analyzed using the urea-PAGE system. Ta. After electrophoresis, remove the gel bond (Albaugh et al., Ele-c trophoresis, 8:140 (1987)), dandelion in gel (Nitrocellulose vapor using a running buffer containing 20% methanol.) (starting at 400mA for 18 hours), Raff et al., J. Those reported in Infect, Dis, 157:118 (1988) Immunoplotting was performed using the method. This result, shown in Figure 11, indicates that dimers and higher oligomers are synthesized by cells that express only La and H but not Ln. It shows that you can get.
（実施例■） （Ｌ’ （２）およびＶＪ （２）遺伝子間へのリンカ−の挿入）二重の可変領 域をそのＮ末端にリンカ−を有するように合成しオリゴマーの形成を容易にする かまたは増加するようにした。この実施例ではたんばく質分解酵素因子Ｘａ （ Ｉ １ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａ ｒｇ）に対する４個のアミノ酸認認配列および ５個のアミノ酸リンカ−配列（Ｇ ｌｙ −Ｓ ｅｒ −Ｇ ｌｙ −Ｇ ｌｙ −Ｓ ｅｒ）を含む９個のアミノ酸挿入物をコードするヌクレオチド配列を第 １２図に示したように上述のＣＢＳに対する抗体をコードするカッパ軽鎖のＶＪ （２）遺伝子とＬ’ （２）遺伝子の間に挿入した。２ステツプＰＣＲプロトコ ールを用いてこのＤＮＡ配列の挿入を可能にした。(Example ■) (Insertion of linker between L' (2) and VJ (2) genes) Double variable region Synthesize the domain with a linker at its N-terminus to facilitate oligomer formation. or increased. In this example, the protein-degrading enzyme factor Xa ( 4 amino acid recognition sequences for I1e-Glu-Gly-A rg) and 5 amino acid linker sequence (Gly-Ser-Gly-Gly The nucleotide sequence encoding a nine amino acid insertion containing As shown in Figure 12, the VJ of the kappa light chain encoding the antibody against the above-mentioned CBS (2) gene and L' (2) inserted between the gene. 2-step PCR protocol A tool was used to enable insertion of this DNA sequence.
使用した最初のテンプレートはＨｉｎｄＩ［［で消化したｐＩｃＡｌに、 ２で ある。最初のステップでは５′センスプライマー（ＡＩｋＰＲｒＭＩ、上述）お よび３′アンチセンスプライマー（Ａ１ｋＰＲＩＭ６：ＡＧＡＣＴＧＴＧＴＣＡ ＡＣＡＣＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＡＣＣＧＣＴを用いた。ＡＩｋＰＲＩＭｌｉ ；！ Ｖ遺伝子の５′側のＢｇｌＩＩ部位をコードする非相同的５′側配列を有 し、またＡ１ｋＰＲＩＭ６は２７ヌクレオチド挿入物をコードする非相同的５′ 配列を有している。第２反応についてはＡＩｋＰＲＩＭ２（上述）はＢａｍＨＩ 部位をコードする５′側非相同的配列を含む３′アンチセンスプライマーであり 、また Ａ１ｋＰＲＩＭ７は２７ヌクレオチド配列をコードする非相同的配列を 含む５′センスプライマーである、２つの反応の結果２７ヌクレオチド挿入配列 と相同的な領域を有する２つの産物ができる。The initial template used was diluted into pIcAl digested with HindI [[ be. The first step is to use the 5′ sense primer (AIkPRrMI, described above) and and 3' antisense primer (A1kPRIM6:AGACTGTGTCA ACACAATTTCGCTACCACCGCT was used. AIkPRIMli ;! It has a non-homologous 5' sequence encoding the BglII site on the 5' side of the V gene. and A1kPRIM6 is a non-homologous 5' encoding a 27 nucleotide insert. It has an array. For the second reaction, AIkPRIM2 (described above) is It is a 3' antisense primer containing a 5' non-homologous sequence encoding the site. , A1kPRIM7 also contains a non-homologous sequence encoding a 27 nucleotide sequence. The result of two reactions is a 5' sense primer containing a 27 nucleotide insert sequence. This results in two products with regions of homology.
ＰＣＲ法の第２ステツプでは、相同領域をもつテンプレートを合わせ、変性アニ ールおよび伸長によりテンプレートを完全に伸長させた。このような条件下で伸 長させる産物は第２反応の３′アンチセンスＰＣＲ産物の３′末端とその３′末 端をアニールさせる第１ＰＣＲ反応由来の５’ ＰＣＲ産物センス鎖であった。In the second step of the PCR method, templates with homologous regions are combined and a denaturing animation is applied. The template was fully extended by rolling and elongating. Stretching under these conditions The elongated product is the 3' end of the 3' antisense PCR product of the second reaction and its 3' end. This was the 5' PCR product sense strand from the first PCR reaction that allowed the ends to anneal.
ＡｌｋＰＲＩＭｌとＡ１ｋＰＲＩＭ２をＰＣＲ増巾用のテンプレートとして働く 産物に添加した。ＰＣＲ産物をｐｆＣベクターに挿入し、これをｐｌｃＡｌに、 ６とした。これで挿入した２７ヌクレオチドＤＮＡを含む完全長産物が生成する 。ｐｌｃＡＩｋ、６６中の挿入物の配列をＩＳＳ標識ｄＡＴＰを取り込ませるダ イデオキシターミネーションシーケンシングで決定した。AlkPRIMl and A1kPRIM2 serve as templates for PCR amplification added to the product. Insert the PCR product into pfC vector and transfer it to plcAl. It was set at 6. This will generate a full-length product containing the inserted 27 nucleotide DNA. . The sequence of the insert in plcAIk, 66 was modified to incorporate ISS-labeled dATP. Determined by ideoxy termination sequencing.
ｐＩｃＡｌに、６のクローン中の０．６ ｋｂ挿入物をｐｌｃＡｌに、２のＢａ ｍＨ１部位に挿入しＶＪにの複製物を生成して、構築物ｐＩｃＡ１に、８とした 。その配向はＢｇｌＩＩ＋ＢａｍＨＩの１次切断およびＢｇｌｌに次切断で決定 した。２つのＶＪに遺伝子をコードするｐＩｃＡｌに、８の３．８ ｋｂ Ｂａ ｍＨＩ ＋ ＢｇｌＩ［挿入物をカナマイシン耐性遺伝子を有するベクターｐＨ ５５６に挿入した。この挿入物をＣＩ Ｐ ｐＨ５５６／ＥｃｏＲＩのＥｃｏＲ １部位に挿入し構築物ｐＨＡ１に、１を作製した。The 0.6 kb insert in the clone of 6 was added to plcAl, and the Ba of 2 was added to plcAl. By inserting into the mH1 site and creating a clone in the VJ, construct pIcA1 was given as 8. . Its orientation is determined by the first cleavage of BglII+BamHI and the second cleavage of Bgll. did. pIcAl encoding the gene in two VJs, 3.8 kb Ba of 8 mHI + BglI [insert into vector with kanamycin resistance gene pH I inserted it into 556. This insert was added to CI P pH556/EcoR of EcoRI. 1 was inserted into the construct pHA1.
ｐＨＡＬｋ、１由来の３．８ ｋｂ ＢａｍＨＩ ＋ ＢｇｌＩＩ挿入物をＣＩ Ｐ処理ｐＧｋ、５１１ｉ＠乳類発現ベクターのＢａｍＨＩ部位に挿入した。また その配向はＢａｍＨＩ＋Ｃ１ａＩ消化で確認した。この構築物は二重Ｌ’Ｖエク ソンをコードするがプロモーターおよびリーダーはコードせず、かつそのエクソ ン中のＬ′およびＶ領域の間に２７ヌクレオチドのリンカ−を有する。これをｐ ＧＫＡｌ、１３と命名した。ｐＧＫＡｌ、１３／ＮｏｔＩおよびｐＮ ｙ Ｉ Ａ２．２ ／ ＥｃｏＲＩの各ＤＮＡｌ０μｇをＡｇ８，６５３マウスミエロー マ細胞にトランスフェクトした。３週間後、培養上清を抗−１ｇＧ＋ポリ血清お よびＣＢＳ多糖類への結合に関してスクリーニングした。最も強く結合するもの を上述の尿素−ＰＡＧＥ系で分析し、オリゴマーの存在を確認した。The 3.8 kb BamHI + BglII insert from pHALk, 1 was CI P-treated pGk, 511i was inserted into the BamHI site of the mammalian expression vector. Also Its orientation was confirmed by BamHI+C1aI digestion. This construct is a double L’V code for the son but not the promoter and leader, and its exo It has a 27 nucleotide linker between the L' and V regions in the clone. This is p It was named GKAl, 13. pGKAl, 13/NotI and pNyI A2.2 / 0 μg of each EcoRI DNA was added to Ag8,653 mouse myeloid transfected into ma cells. After 3 weeks, the culture supernatant was treated with anti-1gG+polyserum and and for binding to CBS polysaccharides. the strongest bond was analyzed using the above-mentioned urea-PAGE system to confirm the presence of oligomers.
（実施例■） （結合活性増加のインビトロにおける特徴）第１３図に示されているようにより 高分子量の抗体は１５０ｋＤ型よりも高い結合活性を育していた。この実験にお いて０８３１３３４株をポリーＬ−リジンを用いてマイクロプレートに結合させ た。ＩＢＩ抗体をセファクリルＳ−３００カラムによるゲル濾過で分画し、高分 子量型を濃縮した。同じ結合特異性をもつトランスフエフトーマ由来のＩｇＧ抗 体（ｔ４Ｂ９）とＩＢＩの低分子量型および高分子量型は等価なたんばく質濃度 でＣＢＳと反応した。結合はホースラディツシュパーオキシダーゼ標識抗ヒトミ ュー鎖およびガンマ鎖特異的抗体で検定した。(Example ■) (In vitro characteristics of increased binding activity) As shown in Figure 13, The high molecular weight antibody developed higher binding activity than the 150 kD type. In this experiment 0831334 strain was bound to a microplate using poly-L-lysine. Ta. The IBI antibody was fractionated by gel filtration using a Sephacryl S-300 column, and The molecular form was concentrated. An IgG anti-transfectoma-derived antibody with the same binding specificity (t4B9) and the low and high molecular weight types of IBI have equivalent protein concentrations. I had a reaction with CBS. Conjugation is with horseradish peroxidase-labeled antihuman The assay was performed using antibodies specific for the gamma chain and the gamma chain.
ＩＢＩの多価性は抗体捕縛検定で測定した。第１４Ａ図および第１４Ｂ図におい てマイクロプレートをＩｇＭｔ４Ｂ９、ＩｇＧモノマー、およびＩｇＧマルチマ ーと反応する抗イデイオタイプ抗体でコードした。平行したテストで、ＩｇＭｔ ４Ｂ９（第１４Ａ）およびＩＢＩの高分子量濃縮フラクションに対する低分子量 フラクション（第１４Ｂ図）を同じテストウェルに反応させた。洗浄後、結合し た抗体がさらに検出のためビオチンで標識した同じ抗イデイオタイプ抗体を結合 する能力を測定した。高分子量濃縮フラクションはさらに抗体イディオタイプ結 合に使用可能なＩｇＭと同じ別の結合部位を有しており、一方、低分子量フラク ションは結合に使用し得る別の部位を有していないことは明白である。IBI multivalency was determined with an antibody capture assay. In Figures 14A and 14B IgMt4B9, IgG monomer, and IgG multimer It was encoded with an anti-idiotype antibody that reacts with In parallel tests, IgMt Low molecular weight versus high molecular weight enriched fractions of 4B9 (No. 14A) and IBI Fractions (Figure 14B) were reacted in the same test wells. After washing, combine The antibody then binds the same anti-idiotype antibody labeled with biotin for further detection. The ability to do this was measured. The high molecular weight enriched fraction is further used for antibody idiotype binding. It has the same alternative binding sites as IgM that can be used for It is clear that the cation has no additional sites available for attachment.
さらにモノマーおよびオリゴマーＩｇＧのインビトロにおける機能比較を行った 。通常抗原への結合はオプソニン活性を調節する抗体の基本的機能であるが結合 活性だけでは抗体が効果的に食作用を促進させるかどうかは予測できない。それ ゆえ、モノクローナル抗体をオプソニン作用調節およびＧＢＳ血清血清型床臨床 単離物滅化に対する相対的能力で比較した。基本的にオプソニン作用検定はＩＩ ＩＲ株（ポンサク（Ｂｏｈｎｓａｃｋ）等、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４３：３ ３３８ （１９８９））を用いラフ（Ｆａｆｆ）等、上述の方法に従って行った 。この実験ではＩＢＩモノマーおよびＩＢＩダイマーとＩｇＭｔ４Ｂ９の活性を 比較した。第１５図に示したデータは以下に示すように表わした。死滅率＝１０ ０Ｘ （１−（（好中球、補体およびテスト抗体とのインキュベーション後残存 するＣＦＵ）／（好中球、補体およびネガティブコントロール抗体）〕）。各モ ノクローナル抗体をヒト好中球およびヒト血清（補体）とインキュベートした後 種々のバクテリアを定量することによりダイマーフラクションがモノマーの１０ ００倍以上の活性を有することが示された。補体を反応混合物から省くと、どの モノクローナル抗体もオプソニン活性は示さなかった。Furthermore, we compared the functions of monomeric and oligomeric IgG in vitro. . Binding to antigen is usually the basic function of antibodies that regulates opsonic activity; Activity alone cannot predict whether an antibody will effectively promote phagocytosis. that Therefore, monoclonal antibodies can be used to modulate opsonization and GBS serotype clinical trials. The relative ability to destroy isolates was compared. Basically, the opsonization assay is II. IR strain (Bohnsack et al., J. Immunol, 143:3 338 (1989)) according to the method described above by Faff et al. . In this experiment, the activity of IBI monomer and IBI dimer and IgMt4B9 was investigated. compared. The data shown in FIG. 15 were expressed as shown below. Mortality rate = 10 0X (1-((neutrophils remaining after incubation with complement and test antibodies CFU)/(neutrophils, complement and negative control antibodies)]). Each model After incubating noclonal antibodies with human neutrophils and human serum (complement) By quantifying various bacteria, the dimer fraction was found to be 10% of the monomer fraction. It was shown to have 00 times more activity. If complement is omitted from the reaction mixture, which Monoclonal antibodies also showed no opsonic activity.
（実施例■） （ネオネイタルラットのグループＢストレプトコッカス感染の治療を目的とした オリゴマーＩｇＧの使用）時間台４８才以下の異系交配スプラークードーリーラ ットの子供（母親と一緒に住む）に８０〜５００個のストレプトコッカス（株に より変える）を腹腔的注射し、４時間後、オリゴマー高含有ＩＢＩ抗体、モノマ ーｌＢ１抗体、ｔ４Ｂ９抗体、またはシュードモナスエルジノサ（Ｐｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ＞のフラジエラに対するコントロール抗体を ５〜８０マイクログラム与えた。全ての実験において、ラットの子供の症状を毎 日２回確認し、生存数を記録した。第■表にまとめたこの実験結果は、オリゴマ ー高含有抗体は抗体濃度が高い場合も低い場合も有意な数の動物を死から救った ことを示している。一方、モノマーｌＢ１抗体は１つの株について有意な防御を 示しただけで、しかもそれは高抗体濃度のときであった。(Example ■) (Intended for the treatment of group B streptococcal infections in neonatal rats) Use of oligomer IgG) Outbred Sprague Dollilla under 48 years old 80 to 500 Streptococci 4 hours later, oligomer-rich IBI antibody, monomer -lB1 antibody, t4B9 antibody, or Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa) A control antibody against Frasiella of Monas aeruginosa 5 to 80 micrograms were given. In all experiments, the symptoms of rat pups were The animals were checked twice a day and the number of survivors was recorded. The results of this experiment, summarized in Table ■, indicate that the oligomer – High antibody content saved a significant number of animals from death at both high and low antibody concentrations It is shown that. On the other hand, the monomeric IB1 antibody provided significant protection against one strain. only at high antibody concentrations.
１４００ （Ｉｃ） ポリ？ −２５／２５ｂ−’ １２／１６ｂ５／９ｂモノ マー １９／４９“ −１７８− Ｉ ｇＭ −−２４／２６ｂ１２／１６ｂネガテイブ コントロール − １／ ２８ − −Ｍ９４ （ＩＩＩ） ポリマー −４／７” １／７モノマー ０ ／６ ０／７ − ａ ＝ｐ＜０．０５ ｂ ＝ｐ＜０．０１ ｃｍ＝行なわず （実施例ＩＸ） （妊娠ラットの胎児へのオリゴマー抗体の胎盤通過）高分子量 抗体が胎盤を通過し胎児に到達する能力をモノマー型およびポリマー型で比較し た。動物モデルとしては小供のラットを用いた。同様のラットモデルを用いてヒ トの胎児への抗体および他の分子の胎盤通過を予測した。ブランベル（Ｂｒａｍ ｂｅｌｌ）、ＦｒｏｎｔｉｅｒｓＢｉｏｌ、１８ ： ２３４−２７６ （１９ ７０）。1400 (Ic) Poly? -25/25b-' 12/16b5/9b mono Mar 19/49" -178- I gM --24/26b12/16b negative control --1/ 28--M94 (III) Polymer-4/7" 1/7 monomer 0 /6 0/7 - a=p<0.05 b=p<0.01 cm=not done (Example IX) (Placental passage of oligomeric antibodies to fetuses of pregnant rats) High molecular weight Comparing the ability of monomeric and polymeric antibodies to cross the placenta and reach the fetus. Ta. Infant rats were used as the animal model. Humans using a similar rat model predicted the placental passage of antibodies and other molecules to the fetus. Brambell bell), Frontiers Biol, 18: 234-276 (19 70).
−組の実験において、精製上ツマ−、ダイマー（８５％オリゴマー）、およびＩ ｇＭモノクローナル抗体を懐胎１８〜１９日目の同調妊娠させたスブラークード ーリーラットに静脈注射した。- In a set of experiments, purified upper tumers, dimers (85% oligomers), and I Subra Kudo with gM monoclonal antibody during synchronous pregnancy on 18th to 19th gestation day -injected intravenously into rats.
出産後、その日から２〜３日毎に２１日目まで母親と子供から採血した。同じ母 親を連続的追跡したが子供は殺す前に一度採血するだけであった。それゆえ、子 供における寿命は各サンプリング時間の別の子供を用いて計算した。ラット血清 中のヒトモノクローナル抗体濃度を多価血清由来の抗ヒトＩｇＧをマイクロプレ ートのウェルに吸着させた以外は、先の実施例■で述べた抗ヒト免疫グロブリン ＥＬ Ｉ ＳＡを用い、または、ラフ（Ｒａｆｆ）等、上述により報告されてい る抗グループＢ多糖類抗原ＥＬＩ ＳＡを用いて定量した。抗免疫グロブリン検 定ではモノマーおよびオリゴマーが等しく検出されたがオリゴマーが本来の形を 保っているかどうかは分らなかった。一方、抗原結合検定はモノマーに比ベオリ ゴマーに対して１００倍も感度が高かった。２つの検定間で免疫グロブリン濃度 の比を比較することにより、全免疫グロブリンのうちの何パーセントがオリゴマ ーかを確認することができる。抗体の寿命はシュメイカー（Ｓｈｕｍａｋｅｒ） 等、叶ｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌ、 Ｒａｙ。After delivery, blood was collected from mothers and children every 2 to 3 days from that day until day 21. same mother The parents were followed continuously, but the children were only given one blood sample before being killed. Therefore, child Lifespan in children was calculated using a separate child at each sampling time. rat serum The concentration of human monoclonal antibodies in The anti-human immunoglobulin described in the previous example Using EL I SA or as reported by Raff et al. Quantification was performed using anti-Group B polysaccharide antigen ELI SA. Anti-immune globulin test Although monomers and oligomers were detected equally in the I didn't know if it was preserved or not. On the other hand, antigen binding assays It was 100 times more sensitive to sesame. Immunoglobulin concentration between two assays By comparing the ratio of You can check whether the The lifespan of antibodies is Shumaker etc., UG Metabol, Ray.
１７・３３１（１９８６）により報告されているコンピューターソフトウェアプ ログラムを用いた抗原結合ＥＬＩＳＡデータから計算した。この結果を第■表に 示す。17.331 (1986) Calculated from antigen binding ELISA data using The results are shown in Table ■ show.
第■表 母親ラット中および胎盤通過して子供に到達したモノクローナル抗体オ リゴマーの寿命 ラット 抗 、命（日） 母 親 モノマー ３ 母親において各モノマーおよびダイマーの寿命は３日であった。Table ■ Monoclonal antibody molecules that reached the offspring in the mother rat and through the placenta Ligomer lifespan Rat resistance, life (day) Mother Parent Monomer 3 The lifetime of each monomer and dimer in the mother was 3 days.
子供の場合、モノマーおよびダイマーの寿命は各々１０日および７日と延びた。In children, monomer and dimer lifetimes were increased to 10 and 7 days, respectively.
ＩｇＭの寿命は母親では１日であり、かつ胎盤を通過して子供には到達しなかっ た（ｌｎｇ／ｍｌの検出限界以下）。The lifespan of IgM is one day in the mother, and it does not cross the placenta and reach the child. (below the detection limit of lng/ml).
出産の日の母親および子供におけるダイマー濃度は各々血清ｍ４７当り２９０± １２０ｎｇおよび３６０±１２０ｎｇであった。The dimer concentration in the mother and child on the day of birth was 290±/m47 serum respectively. 120ng and 360±120ng.
胎盤通過を測定するのに別の方法を使用した。出産日の２〜３日前に、妊娠ラッ トに低分子量ＩｇＧ（七ツマ−）（母親１および２）またはオリゴマー（３０％ ）ＩｇＧ（母親３および４）２４６μｇを静脈注射する。抗体投与２時間後、出 産の日に母親から、また誕生直後の子供から血液サンプルを採取した。定量結合 検定（ＥＬＩＳＡ）を用い各血液サンプル中の全ヒトＩｇＧおよびヒトＩｇＧ抗 グループＢストレプトコッカス抗体を測定した。A different method was used to measure placental passage. 2-3 days before the birth date, take a pregnancy test. Low molecular weight IgG (Septum) (mothers 1 and 2) or oligomers (30% ) 246 μg of IgG (mothers 3 and 4) is injected intravenously. 2 hours after antibody administration, Blood samples were taken from the mother on the day of birth and from the child shortly after birth. quantitative binding Total human IgG and human IgG anti- Group B streptococcal antibodies were measured.
抗ヒ）ＩｇＧ特異的酵素標識化二次抗体を用いることにより、ラットｉｇＧは検 出されず、また注入したヒトＩｇＧの定量が妨害されることもなかった。Rat IgG can be detected by using an enzyme-labeled secondary antibody specific for anti-human (human) IgG. The quantification of the injected human IgG was not interfered with.
胎盤を通過した抗体の量の計算は以下のように行った。低分子量１ｇＧおよび高 分子量１ｇＧをＩｇＧ定量検定で比較したとき、高分子量高含有ＩｇＧは同濃度 の低分子量１ｇＧよりもＩｇＧマイクログラム当りわずかに高いシグナルを与え ただけであった（各々１．２ ： １．０’）。しかし、２つの抗体を生物全体 のＥＬＩＳＡで比較すると、ＩｇＧマイクログラム当りの結合活性は高分子量抗 体の方が低分子量抗体よりも非常に大きかった（３．５：１．０）。Calculation of the amount of antibody that passed through the placenta was performed as follows. Low molecular weight 1gG and high When comparing molecular weight 1gG in IgG quantitative assay, high molecular weight high content IgG has the same concentration. gives a slightly higher signal per microgram of IgG than the lower molecular weight 1gG of (1.2:1.0', respectively). However, if two antibodies are used as a whole organism, ELISA shows that the binding activity per microgram of IgG is higher than that of high molecular weight antibodies. The body was much larger than the low molecular weight antibody (3.5:1.0).
したがって、マイクログラム当りでは、オリゴマー高含有ＩｇＧはグループＢス トレプトコッカス抗原に対し１、モノマー１ｇＧより約３〜４倍大きい結合活性 を有している。それゆえ、胎盤通過上ツマ−１ｇＧに対するＩｇＧ定量検定と抗 原結合検定の値の比は約１．０になるはずである。一方、同様の計算で高分子量 高含有１ｇＧを注射した母親に対しては２つの検定値の比が約３．５となる。Therefore, on a per microgram basis, oligomer-rich IgG is 1 for treptococcal antigens, approximately 3 to 4 times greater binding activity than monomer 1gG. have. Therefore, IgG quantitative assay against Tuma-1gG and anti- The ratio of raw binding assay values should be approximately 1.0. On the other hand, similar calculations show that high molecular weight For mothers injected with high 1gG content, the ratio of the two assay values will be approximately 3.5.
第■表のデータは、モノマーＩｇＧを注射した母親から生れた子供の場合、両検 定により計算されるＩｇＧ濃度の比はおよそ１．０であることを示している（母 親ｌの子供０．８９と母親２の子供１．４の平均）。これと比較して、高分子量 高含有ＩｇＧを注射した母親から生まれた子供の血清から決定したこの比は約３ ．０であった（母親３の子供２．６と母親４の子供３．６の平均）。これらのデ ータは低分子量および高分子量高含有ＩｇＧフラクションを用いて作った標準曲 線からの予想と一致した。このように、低分子量および高分子量高含有抗体がほ ぼ等しい効率で胎盤を通過すると結論し得る。他の実験では親ＩｇＭクラス抗体 は胎盤を通過しなかった（データ示さず）。それゆえ、致命的グループロストレ プトコッカス感染にかかりやすい子供を出産する危険性を有する妊婦の予防に多 価ＩｇＧモノクローナル抗体は有効である。The data in Table ■ shows that children born to mothers injected with monomeric IgG The ratio of IgG concentrations calculated by (mean of 0.89 for children of parent 1 and 1.4 for children of mother 2). In comparison, high molecular weight This ratio, determined from the serum of children born to mothers injected with high IgG content, was approximately 3 ．． 0 (average of 2.6 children of mother 3 and 3.6 children of mother 4). These de The data is a standard song prepared using low molecular weight and high molecular weight high content IgG fractions. This was consistent with the prediction from the line. In this way, most low molecular weight and high molecular weight high content antibodies are It can be concluded that they cross the placenta with approximately equal efficiency. In other experiments, parental IgM class antibodies did not cross the placenta (data not shown). Therefore, fatal group loss training There are many ways to prevent pregnant women who are at risk of giving birth to a child susceptible to putococcal infections. IgG monoclonal antibodies are effective.
本発明は明確に理解されるように図式および実施例で詳細に説明されているか、 請求の範囲内で変化および修正が可能であることは明白であろう。The present invention has been described in detail by way of diagrams and examples for a clear understanding; It will be obvious that changes and modifications may be practiced within the scope of the claims.
■ 浄書（内容に変更なし） ｐＮｋＡｌ 、１ 特表千４−５０５７０９ （２０） 浄書（内容に変更なし） ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ε 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ。■ Engraving (no changes to the content) pNkAl, 1 Special Table Sen4-505709 (20) Engraving (no changes to the content) SDS-PAGE ε Engraving (no changes to the content) FIG.
ＦｌＧ−５８゜ 浄書（内容に変更なし） 用にここで制限切断 ＥＬＩＳＡ ０Ｄ ＦＩＧ、−８゜ 浄書（内容に変更なし） （ｌ ＯＦ ２） 浄書（内容に変更なし） ｐＧｋ、５ Ｘ／ＢＧＩ Ｂ Ｓｙｍｂｏｌｓ： Ｅ ＃ ＥｃｏＲｌ； Ｘ −Ｘｂａ＋；Ｓ −５ａｃｌ； Ｈ−Ｈｉｎｄ３； Ｂｇ −８ｇ１２； Ｃ−Ｃ１ａｉ；Ｎ@＃ Ｎｏ１ｉ；５ｐ＝Ｓｐｈｊ；Ｐ−〜ｕ１浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） Ｐｖｕ２／５ｐｈｌ −浄書（内容に変更なし） ＢａｒｒｉＨＩ ＳＶ４０ ｘプライス部位浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ＋ｌ ＯＦ ２） 浄書（内容に変更なし） （２０Ｆ ２） ＥＬＩＳＡ ００ ％ＧＢＳ 死亡率（％） 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、Ｊａ （２０Ｆ ２） 浄書（内容に変更なし） 浄書〔内容に変更なし） （２０Ｆ＋ ３１ Ｆｌ（３，、Ｉ７゜ （３０Ｆ ３） 鳥害（肉食に寥１か１１ 浄書（内容Ｖｃ変更な！１ １Ｆｗｔｒ］ｔデ１−ａＪｃｌ！ｕノ 平成 年 月 日FlG-58゜ Engraving (no changes to the content) Cut the limit here for ELISA 0D FIG, -8° Engraving (no changes to the content) (l OF 2) Engraving (no changes to the content) pGk, 5 X/BGI B Symbols: E # EcoRl; X -Xba+;S -5acl; H-Hind3; Bg-8g12; C-C1ai; N@# No1i;5p=Sphj;P-~u1 engraving (no change in content) Engraving (no changes to the content) Pvu2/5phl -Engraving (no changes in content) BarriHI SV40 x price part engraving (no changes in content) Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) +l OF 2) Engraving (no changes to the content) (20F 2) ELISA 00 %GBS Mortality rate (%) Engraving (no changes to the content) FIG.Ja (20F 2) Engraving (no changes in content) Engraving (no changes in content) (20F+31 Fl(3,,I7゜ (30F 3) Bird damage (1 or 11 for meat eaters) Engraving (change the content Vc! 1 1Fwtr]tde1-aJcl! u no Heisei Year Month Day
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