JPH04505329A - antifreeze polypeptide - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 ゛　ポリペプチド 発１廊とた証 本発明は一般的に、感受性有機物質の耐凍結性を改良することに有用な試薬に関 する。これらの試薬は、たとえば食物及び他の生物学的物質の凍結貯蔵寿命を高 め、そして貯蔵の間又は凍結に暴露される場合、種々の特性の保持を最大にする 。[Detailed description of the invention] ゛ Polypeptide Departing Hall 1 Tota proof The present invention generally relates to reagents useful in improving the freeze resistance of sensitive organic materials. do. These reagents can, for example, increase the frozen shelf life of foods and other biological materials. and maximize retention of various properties during storage or when exposed to freezing. .

発明の背景 近代、冷蔵及び特に、凍結法は、生物学的物質の貯蔵のために共通する好ましい 手段になって来た。冷蔵はある重要なサンプルの性質を保持するが、他の性質は 、ゆっくりした速度であるが、しかし有意な速度で劣化し続ける。凍結貯蔵は、 これらの劣化のほとんどを阻止することができるが、しかし凍結及び融解の組合 せは、他の重要な性質を破壊する他の変化を導入する。Background of the invention In modern times, refrigeration and especially freezing methods are common and preferred methods for storage of biological materials. It has become a means. Refrigeration preserves some important sample properties, but not others. , continues to degrade at a slow but significant rate. Frozen storage is Most of these deteriorations can be prevented, but the combination of freezing and thawing It introduces other changes that destroy other important properties.

近代世界においては、冷凍食品は、ヒトの飲食物の主要なものになって来た。要 求する消費者の味覚のために十分な高品質の製品を確保するために、冷凍野菜及 び冷凍デザート、たとえばアイスクリームが食品加工業者による集中的な研究の 対象になって来た。再結晶化は、冷凍食品の味覚及びきめに対して実質的に負の 衝撃を有することが知られている。霜−フリーフリーザーの出現は、この情況を 悪化し、そしてこれは、輸送の間、温度変動により伝統的に関連して来た。零下 以外の温度又はさらに維持された凍結温度での比較的短時間の後、多くの冷凍食 品は、ヒトの消費のために所望できなく又は悪く、完全に不適切なものになる。In the modern world, frozen foods have become a staple of human food and drink. Essential Frozen vegetables and Frozen desserts such as ice cream are the subject of intensive research by food processors. It has become a target. Recrystallization has a substantially negative effect on the taste and texture of frozen foods. It is known to have impact. The advent of frost-free freezers has changed this situation. aggravated, and this has traditionally been associated with temperature fluctuations during transport. Below zero After a relatively short period of time at temperatures other than or even maintained at freezing temperatures, many frozen foods The product becomes undesirable or bad and completely unsuitable for human consumption.

種々の技法が再結晶化に関連する損傷を緩和するために実施されて来たが、重要 な問題が残る。しばしば、冷凍食品の加工の改良は、それらの品質、色、風味及 び／又はきめに対して強く影響を及ぼす。さらに、追加の加工は、ひじょうに費 用がかかり、そして時間がかかり、その技法を非経済的にする。類似する困難性 が食品への添加剤の導入に関連して来た。Although various techniques have been implemented to alleviate damage associated with recrystallization, important A problem remains. Improving the processing of frozen foods often improves their quality, color, flavor and and/or texture. Furthermore, additional processing is very expensive. It is laborious and time consuming, making the technique uneconomical. Similar difficulties has been associated with the introduction of additives into foods.

生物学的物質、たとえば治療用薬物、血漿、組織培養に使用するための哺乳類細 胞及び同様のもののために、凍結は広範な損傷を引き起こす。特に、凍結工程自 体がほとんどの真核細胞を殺害し、そして１回の凍結及び融解サイクルにゆだね られた細胞は、ひじょうに低められた生存率を示す。また、凍結及び融解からの 酵母細胞における生存率の損失は、これらの細胞の発酵及び続くパン発酵活性を 減じる。生存細胞の弱められた機能はまた、器官移植物のための付随した欠点を 伴って、組織凍結保存において効果がある。同様に、植物に対する霜又は他の凍 結損傷は、農業において重大な問題を示す。最後に、薬物は、必要とされる厳確 な温度条件下で保持されなければ、無効果になり、又は危険にさえなる。Biological materials, e.g. therapeutic drugs, plasma, mammalian cells for use in tissue culture For cysts and the like, freezing causes extensive damage. In particular, the freezing process itself The body kills most eukaryotic cells and submits them to one freeze and thaw cycle. Cells that have been removed show significantly reduced viability. Also, from freezing and thawing Loss of viability in yeast cells reduces the fermentation and subsequent bread fermentation activity of these cells. decrease. The weakened function of viable cells also poses a concomitant drawback for organ transplants. Accordingly, it is effective in tissue cryopreservation. Similarly, frost or other frost on plants Knot damage represents a serious problem in agriculture. Finally, the drug is exactly as needed If it is not kept under suitable temperature conditions, it becomes ineffective or even dangerous.

従って、低温での有機物質の保存特徴、たとえば生物学的物質の生存性及び冷凍 食品の貯蔵性を改良するために適切な新規技法及び組成物のための必要性が存在 する。理想的には、これらの技法及び組成物は、安価で、完全に安全であり、そ してヒトへの消費又は旦■での治療的な使用のために適切である。Therefore, the preservation characteristics of organic substances at low temperatures, such as the viability and refrigeration of biological substances, There is a need for new techniques and compositions suitable for improving the shelf life of foods. do. Ideally, these techniques and compositions would be inexpensive, completely safe, and It is suitable for human consumption or therapeutic use in humans.

発明の要約 本発明は、凍結の多くの破壊的又は劣化的効果を回避するための新規及び効果的 な手段を提供し、そして凍結及び融解工程を通して有機物質の重要な性質の保持 を最大にするためにその種々の態様で広く通用できる。その種々の態様は、中で も、食品貯蔵、医学的に使用される生物学的物質の凍結保存及び農業的に価値あ る植物生成物の保護を包含する。Summary of the invention The present invention provides a novel and effective method for avoiding many of the destructive or degrading effects of freezing. and the preservation of important properties of organic materials through freezing and thawing processes. It can be widely used in its various aspects to maximize the Its various aspects include It is also used for food storage, cryopreservation of biological substances used medically and of agricultural value. This includes the protection of plant products.

１つの観点において、本発明は、実質的に純粋な形での不凍化ポリペプチドの使 用を通して、有機物及び生物学的物質、たとえば冷凍食品の凍結貯蔵寿命及び他 の特徴を改良するための新規方法及び組成物を提供する。それらは、凍結気候条 件からの損傷から農業製品を保護することに、さらに使用される。種々の不凍化 ポリペプチドが供給されているが、最っとも好ましいものは、典型的には、コン センサス配列ＬＴＡＡＮＡＡＡＡＡＡに対して相同の配列を有する少なくとも約 ２つのセグメント、及び所望する追加の特徴に依存して、追加のアミノ酸セグメ ント又は成分を含んで成る。他の使用に関しては、不凍化ポリペプチドは、食物 の所望する点に害を与えないで又は生物学的物質の生存性を低めないで、食品及 び生物学的物質における氷の結晶の成長を抑制することを助ける。In one aspect, the invention provides use of antifreeze polypeptides in substantially pure form. Throughout its use, organic and biological substances, such as the frozen shelf life of frozen foods and other New methods and compositions are provided for improving the characteristics of. They are It is further used in protecting agricultural products from damage from. Various antifreeze Although polypeptides are provided, the most preferred are typically at least about a sequence homologous to the census sequence LTAANAAAAAAA Depending on the two segments and additional features desired, additional amino acid segments may be added. It consists of a component or ingredient. For other uses, antifreeze polypeptides can be food and other materials without harming the desired point of the biological material or reducing the viability of the biological material. helps inhibit the growth of ice crystals in ice and biological materials.

もう１つの観点においては、本発明は、有機物質と一緒に不凍化ポリペプチドを 含んで成る新規の組成物を製造するための方法に関する。他の観点においては、 本発明は、好ましくは組換え手段又は化学的合成手段による不凍化ポリペプチド の製造に関する。特に、ポリペプチドをコードする核酸配列のクローニング及び 発現、それらの発現、精製及び種々の使用方法がまた提供される。In another aspect, the invention provides antifreeze polypeptides together with organic substances. A method for producing a novel composition comprising: From another point of view, The present invention provides antifreezing polypeptides, preferably by recombinant or chemical synthesis means. related to the manufacture of In particular, cloning of nucleic acid sequences encoding polypeptides and Expression, their expression, purification and various methods of use are also provided.

好ましい態様の特定の記載 本発明によれば、氷結晶成長抑制活性を示す、たとえば汚染性の天然に存在する 化合物（たとえば魚又は昆虫抽出物）を典型的には含まない実質的に純粋なポリ ペプチドが、冷凍又は急冷食品及び生物学的物質の種々の特徴を改良し、又は維 持することに使用するために供給される。不凍化ポリペプチドは、それらの生来 の形状で存在し、又は式（ＮＨ，）ＸＩ−Ｘ２−Ｘ３　（ＣＯＯＨ）Ｃ式中、Ｘ ｌは部位特異的切断成分を含んで成り、Ｘ２は配列ＬＴＡＡＮ　ＡＡＡＡＡＡに 対して相同の配列を有する少なくとも２つのセグメントを含んで成るポリペプチ ドであり、そしてＸ３は、存在するなら、末端のアミノ酸配列を含んで成る〕に 従って示される。Specific description of preferred embodiments According to the invention, naturally occurring substances exhibiting ice crystal growth inhibiting activity, e.g. Substantially pure polyamides typically free of compounds (e.g. fish or insect extracts) Peptides improve or maintain various characteristics of frozen or quenched foods and biological materials. Supplied for use in holding. Antifreeze polypeptides are or in the form of the formula (NH,)XI-X2-X3 (COOH)C, where X l comprises a site-specific cleavage component, and X2 comprises the sequence LTAAN AAAAAA. a polypeptide comprising at least two segments having sequences homologous to and X3, if present, comprises the terminal amino acid sequence] Thus indicated.

１つのＢ様において、Ｘｌは： ａ）異種融合パートナ−ポリペプチド及び存在するなら、スペーサーセグメント ； ｂ）実質的理論的分解性アミノ酸又はポリペプチド及び存在するなら、１又は複 数のスペーサーセグメント；Ｃ）非アミノ酸成分；又は ｄ）典型的には約２〜２０個のアミノ酸の間の不凍化セグメント以外のオリゴペ プチドセグメントから実質的に成る。In one person B, Xl is: a) a heterologous fusion partner polypeptide and, if present, a spacer segment ; b) Substantially theoretically degradable amino acids or polypeptides and, if present, one or more a number of spacer segments; C) a non-amino acid component; or d) oligopeptides other than the antifreeze segment, typically between about 2 and 20 amino acids; Consists essentially of petido segments.

最っとも好ましくは、Ｘｌは、アスバーテートを含まないアミノ酸配列を含んで 成り、そしてχ２は、少なくとも約３個のタンデムセグメントを含んで成り、こ こで個々のセグメントは長さ約１１個のアミノ酸を含み、そしてａ）すべてのア ラニン（但し、Ｄ、　Ｅ、　Ｋ、　Ｎ、　Ｑ、　Ｒ。Most preferably, Xl comprises an asbertate-free amino acid sequence. and χ2 comprises at least about 3 tandem segments, where the individual segments contain approximately 11 amino acids in length, and a) all the Lanin (However, D, E, K, N, Q, R.

Ｓ、Ｔ又はＬから成る群から選択された１〜４個の置換アミノ酸を除＜）； ｂ）１０個のアラニン（但し、Ｄ、Ｅ、に、Ｎ、Ｑ、Ｒ。excluding 1 to 4 substituted amino acids selected from the group consisting of S, T or L<); b) 10 alanines (however, D, E, N, Q, R.

Ｓ又はＴから成る群から選択された１〜４個のアミノ酸置換基を除＜）：又は ｃ）７個のアラニン又は６個のアラニン及び１個のロイシンを含んで成る。excluding 1 to 4 amino acid substituents selected from the group consisting of S or T<): or c) Comprising 7 alanines or 6 alanines and 1 leucine.

１つの態様において、不凍化ポリペプチドは、試薬、たとえば臭化シアン又は酵 素、好ましくはＸ　２　ｆＪ域を切断しない酵素により理論量的に切断できるＸ １領域を有するであろう。In one embodiment, the antifreeze polypeptide is treated with a reagent such as cyanogen bromide or an enzyme. X that can be stoichiometrically cleaved by an enzyme that does not cleave the element, preferably the X2 fJ region It will have one area.

特に好ましいアミノ末端セグメントは、メチオニン、ＭＡＡ、又はＩＥＧＲを含 んで成る。典型的には、Ｘ２セグメントは、コンセンサス配列に相同の約２〜１ ０個のセグメント及び好ましくは３〜５個の隣接セグメントであろう。Ｘ２内の 好ましいアミノ酸セグメントは、配列ＤＴＡＳＤ　ＡＡＡＡＡＡを有し、そして より好ましくはアミノ近位配列として有するであろう。Particularly preferred amino-terminal segments include methionine, MAA, or IEGR. It consists of Typically, the X2 segment has about 2 to 1 homologous sequences to the consensus sequence. There will be 0 segments and preferably 3 to 5 adjacent segments. inside X2 A preferred amino acid segment has the sequence DTASD AAAAAA, and More preferably, it will have it as an amino-proximal sequence.

同様に、ｘ３は、存在するなら、融合パートナ−アミノ酸配列及び任意の付随す るスペーサーセグメント又は末端アミノ酸配列から実質的に成る。ｘ３は好まし くは、次のアミノ酸配列：　ＡＴＡＡ　；　ＡＴＡＲ；　ＡＴＡＫ　；　ＡＴＡ ＡＡＡＡＲ；又はＡＴＡＡＡＡＡＫのいづれかを含んで成る。Similarly, x3 includes the fusion partner amino acid sequence and any accompanying consisting essentially of a spacer segment or a terminal amino acid sequence. x3 is preferable or the following amino acid sequence: ATAA; ATAR; ATAK; ATA AAAAR; or ATAAAAAAK.

ポリペプチドは好ましくは、所望する配列をコードする組換え核酸配列を発現す ることによって生成される。典型的には、不凍化ポリペプチドは、約７，０００ ドルトン以下であるが、しかし融合タンパク質が生成される場合、その分子量は 、最終的な使用に依存して、約１０，０００ドルトン又はそれ以上である。組換 え核酸は、典型的には、たとえば第３図のアミノ酸配列をコードする核酸配列に 相同であり、又は温度又は塩の緊縮条件下で、そのようなアミノ酸配列をコード する核酸配列にハイブリダイズするであろう少なくとも約２０個のヌクレオチド を含んで成る。好ましくは、組換え核酸配列は、選択されたコドン使用法を有し 、予定された制限又は切断部位を含んで成り、そしてさらに、最終的なタンパク 質の新しく導入されたプロテアーゼ切断部位をコードする配列を含んで成る合成 セグメントを有するであろう。組換え配列は典型的には、形質転換された宿主細 胞においてまだ操作可能な、天然に存在するポリペプチドに通常関連しないプロ モーター配列に結合されるであろう。The polypeptide preferably expresses a recombinant nucleic acid sequence encoding the desired sequence. It is generated by Typically, antifreeze polypeptides contain about 7,000 Dalton or less, but if a fusion protein is produced, its molecular weight is , about 10,000 Daltons or more, depending on the final use. recombination The nucleic acid typically comprises, for example, a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence of FIG. that are homologous or under stringent conditions of temperature or salt encode such an amino acid sequence. at least about 20 nucleotides that will hybridize to a nucleic acid sequence that It consists of Preferably, the recombinant nucleic acid sequence has selected codon usage. , a predetermined restriction or cleavage site, and further comprises a final protein a synthetic protein comprising a sequence encoding a newly introduced protease cleavage site. will have a segment. Recombinant sequences are typically transformed into host cells. proteins not normally associated with naturally occurring polypeptides that are still operable in cells. It will be coupled to the motor array.

本発明のポリペプチドは、氷結晶の成長を抑制するために十分な量で添加される 場合、生物学的又は食品組成物に対しての可能性ある凍結損傷を最少にすること ができる。種々の他の添加剤、特に添加されたポリペプチドのための既知の安定 剤がまた、組成物に導入され得る。たとえば、Ｚａｐｓａｌｉｓａｎｄ　Ｂｅｃ ｋ　（１９８５）　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｏ＋１ｓｔｒ　ａｎｄ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏ ｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ口山１．　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、 　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ａｎｄ　Ｂｅ１ｉｔｚ及びＧｒｏｓｃｈ　（１９８７）　 Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　＊　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｙ、　Ｎｅｗ 　Ｙｏｒｋ（両者とも、引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。The polypeptide of the invention is added in an amount sufficient to inhibit ice crystal growth. minimize possible freezing damage to biological or food compositions. Can be done. Known stability for various other additives, especially added polypeptides Agents can also be incorporated into the composition. For example, Zapsalisand Bec k (1985) Food Cheo+1str and Nutrition nal Biochem Kuchiyama 1. John Wiley and 5ons, New York and Beitz and Grosch (1987) Food Chemistry * Springer-Verlay, New See York (both incorporated herein by reference).

本発明のポリペプチドは、当業者に良く知られている方法に従って、生物学的物 質又は食品に直接添加され得る。他方、植物又は細胞は、ポリペプチドをコード する組換え核酸配列により形質転換され、次にこれは、たとえば植物、特に双子 葉類の成長の間、所望するように生成されるであろう。The polypeptides of the invention can be obtained from biological products according to methods well known to those skilled in the art. can be added directly to food or food. On the other hand, plants or cells encode polypeptides. the recombinant nucleic acid sequence, which is then transformed into, for example, plants, especially twins. It will be produced as desired during leaf growth.

特定の機構により制限されなければ、氷結晶の成長抑制の原則は、氷結晶の氷の 格子への水の付加による妨害（吸収阻害〕を包含する不凍化ポリペプチドの非束 −性であると思われる。この機構はまた、結晶の初期核形成に基づいて起こる工 程とは表面上具なる。結晶成長の速度は、結晶の大きさを決定し、そして核形成 速度は結晶の数を決定する。Unless limited by a specific mechanism, the principle of ice crystal growth inhibition is Unbundling of antifreeze polypeptides, including hindrance by addition of water to the lattice (absorption inhibition) -It seems to be sexual. This mechanism is also based on the initial nucleation of the crystal. The term is superficial. The rate of crystal growth determines the crystal size, and nucleation The speed determines the number of crystals.

生物学的サンプルにおいて、凍結に基づく損傷の多くは、結晶の大きさ又は結晶 の成長方法による。多くの数のひしように小さな結晶は通常、はとんど損傷を与 えないであろう。In biological samples, much of the damage caused by freezing is due to crystal size or Depends on how it's grown. Large numbers of very small crystals usually cause the least amount of damage. Probably not.

本発明の新規タンパク質は、成長する結晶表面に結合し、そして追加の結晶の成 長のための部位を阻止することによって氷結晶への新しい水分子の付加を阻害す るように表面上機能する。The novel proteins of the invention bind to the growing crystal surface and form additional crystals. inhibits the addition of new water molecules to ice crystals by blocking sites for It ostensibly works like this.

従って、本発明のポリペプチド配列は、種々の有機物質における氷結晶の成長及 び再結晶化を抑制することができる。Accordingly, the polypeptide sequences of the present invention can be used to inhibit ice crystal growth and growth in various organic materials. and recrystallization can be suppressed.

これらの不凍化ポリペプチドは、より詳しく下記に説明されるように、多くの明 確な性質及び使用を有する。These antifreeze polypeptides have many distinct uses, as explained in more detail below. It has a definite nature and use.

−ン　ボ１ペプチド 本明細書で使用される場合、用語“不凍化ポリペプチド”とは、サンプルにおけ る氷結晶の成長を阻害する活性を示すポリペプチドを言及する。この活性はまた 、氷結晶の成長の抑制としても言及される。成長阻害された氷結晶は、典型的に は、凍結の開始後すぐの塑性変形点で阻害されていない氷結晶よりも少なくとも 約ｌＯ％〜２０％小さく、好ましくは約４０〜５０％小さく、より好ましくは少 なくとも約６５％〜７５％小さく、そして最っとも好ましくは約９５％〜９９％ 小さい。従って、最終的な使用に依存して、不凍化ポリペプチドの凍結保護量は 、結晶成長の阻害の所望するレベルを提供するために十分な量であろう、そのよ うな活性を試験するためには多くの手段が存在するが、好ましい方法は、下記の 改良された“°スブラ２トアンセイ”の使用である。手始に言えば、このアンセ イは、冷却された金属ブロックにタンパク質溶液を適用し、そして適切な時間の 後に形成される氷結晶のサイズと不凍化ポリペプチドを欠くサンプルとを比較す ることから成る。不凍化ペプチドの一般的な説明に関しては、Ｄｅｖｒｉｅｓ　 （１９８３）、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　４５　：　２４５〜６ ０及びＦｅｅｎｅｇ（１９８８）鳥↓肌困」肛旦、憇ｄ　Ｆｏ剋匹蝕料□ユ、　 １　：　４７〜１８１（両者とも引用により本明細書に組込む）を参照のこと。-N Bo1 peptide As used herein, the term "antifreeze polypeptide" refers to refers to polypeptides that exhibit activity in inhibiting the growth of ice crystals. This activity also , also referred to as inhibition of ice crystal growth. Growth-inhibited ice crystals typically is at least as large as the undisturbed ice crystal at the point of plastic deformation immediately after the onset of freezing About 10% to 20% smaller, preferably about 40-50% smaller, more preferably less at least about 65% to 75% smaller, and most preferably about 95% to 99% smaller small. Therefore, depending on the final use, the cryoprotective amount of the antifreeze polypeptide will be , such amount will be sufficient to provide the desired level of inhibition of crystal growth. Although many means exist to test for such activity, the preferred method is as described below. This is the use of an improved "°Subura 2 Tonsay". To start with, this Anse Apply the protein solution to the cooled metal block and Compare the size of the ice crystals that subsequently form with a sample lacking the antifreeze polypeptide. It consists of For a general description of antifreeze peptides, see Devries (1983), Ann, Rev. Physiol, 45: 245-6. 0 and Feeneg (1988) Bird ↓ Skin Trouble” Andan, 憇d Fo 剋剋蚕 り □ Yu, 1:47-181 (both incorporated herein by reference).

好ましくは、ポリペプチド配列は、特定のコンセンサス配列に対して強い相同性 を示すアミノ酸セグメントを含む。単一の文字略語は生化学者により通常使用さ れ、そして第１図に列挙される略語である。５ｔｒｙｅｒ、　Ｂｉ匹ｈｅｍｉ■ ■、第３版、Ｈ，Ｈ，Ｆｒｅｅｗ＋ａｎ　＆　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏ ｒｋ　（１９８８）を参照のこと。これらのセグメントの例は、第２及び第４図 に列挙される。１つのタイプのコンセンサス配列は、 １ＴＡａｎ　ＡａａＡＡａ （ここで大文字は７個の与えられたセグメントに同等に保存されるアミノ酸であ り、そして小文字はそれらの位置における最っとも共通するアミノ酸である）で ある。ブランクは、いかに多くのアミノ酸がセグメントに存在するかを容易に計 数するために５番目と６番目のアミノ酸の間に存在する。相同なセグメントは、 コンセンサス配列のアミノ酸と約５０％以上、典型的には約７０％以上及び好ま しくは約９０％以上マツチする配列を有するそれらのセグメントである。第２図 におけるすべての７個のセグメント、すなわちタイプ１〜タイプ７は、コンセン サス配列と７０％〜１００％同一性の範囲の相同性を示す、類似する性質を示す 他のセグメントは第４図に列挙される。第２又は第４図のそれらのセグメントに 対して相同性を示すアミノ酸配列は、不凍化セグメントとして言及される。Preferably, the polypeptide sequence has strong homology to a particular consensus sequence. Contains an amino acid segment that represents Single letter abbreviations are commonly used by biochemists. and the abbreviations listed in FIG. 5tryer, Bi hemi■ ■, 3rd edition, H, H, Free+an & Company, New Yo See R.K. (1988). Examples of these segments are shown in Figures 2 and 4. are listed in. One type of consensus sequence is 1TAan AaaAAAa (Here uppercase letters are amino acids that are equally conserved in the seven given segments. and lowercase letters are the most common amino acids at those positions). be. The blank allows you to easily calculate how many amino acids are present in a segment. It is present between the 5th and 6th amino acids for counting purposes. The homologous segments are About 50% or more, typically about 70% or more and preferably about 70% or more of the amino acids of the consensus sequence. or those segments having sequences that match about 90% or more. Figure 2 All 7 segments in , i.e. type 1 to type 7, are Showing homology ranging from 70% to 100% identity with Sass sequences, exhibiting similar properties Other segments are listed in FIG. In those segments of Figure 2 or 4 An amino acid sequence that exhibits homology to an antifreeze segment is referred to as an antifreeze segment.

ｇ　これらの不凍化セグメントは、変性され得るが、しかし第２又は第４図にお ける配列に対して相同性を保持すべきである。それらは一般的に、好ましくは保 存性アミノ酸を種々の位置、好ましくは第２図の列挙されるセグメントに同一的 に保存されない位置に置換することによって変性される。保存的置換とは、次の ようなグループ内での置換を意味する：ｇｌｙ、　ａｌａ　；　ｖａｌ、　ｉｌ ｅ、　３ｅｕ　；　ａｓｐ、　ｇｌｕ　；　ａｓｎ、　ｇｌｎ　；　ｓｅｔ。g. These antifreeze segments can be modified, but as shown in Figures 2 or 4. Homology should be maintained with respect to the sequence used. They are generally preferably Common amino acids are placed at various positions, preferably identical to the listed segments of Figure 2. modified by substitution at a position that is not conserved in A conservative substitution is the following It means substitution within a group such as: gly, ala; val, il e, 3eu; asp, glu; asn, gln; set.

ｔｈｒ　；　ｌｙｓ、　ａｒｇ　；　及びｐｈｅ、　ｔｙｒ。thr; lys, arg; and phe, tyr.

従って、不凍化ポリペプチドは典型的には、好ましくはそれぞれ約１１個のアミ ノ酸の長さの複数の不凍化セグメントを含むであろう、追加の成分の不在下で、 不凍化ポリペプチド成分部分は、少なくとも約２，２００ドルトン〜約１０゜０ ００ドルトン、典型的には約３，０００〜７，０００ドルトン及び好ましくは約 ３．５００〜６，０００ドルトンである。Therefore, antifreeze polypeptides typically contain preferably about 11 amino acids each. In the absence of additional components, which will contain multiple antifreeze segments of no acid length, The antifreeze polypeptide component portion is at least about 2,200 Daltons to about 10° 00 Daltons, typically about 3,000 to 7,000 Daltons and preferably about 3.500 to 6,000 Daltons.

複数の不凍化セグメントは典型的にはタンデムであるが、しかしそれらの間に介 在アミノ酸セグメントによる活性を保持することができる。限定するものではな いが、介在配列はたぶん、不凍化セグメント内に構造的な制限を保存し、そして 介在スペーサーセグメントに対する適切な制限は複数の約２／３個のアミノ酸残 基（たとえば３，４，７，８，１１゜１４．１５等を意味するンを必要とする。Multiple antifreeze segments are typically in tandem, but with an intervening The activity due to the amino acid segment can be maintained. It is not limited However, the intervening sequences probably preserve structural constraints within the antifreeze segment and A suitable restriction for the intervening spacer segment is a plurality of approximately 2/3 amino acid residues. Requires a radical (eg, 3, 4, 7, 8, 11°, 14.15, etc.).

不凍化ポリペプチドは、セグメントにおけるアミノ酸の時おりの挿入又は欠失を 有してさえ、氷結晶の成長を抑制するその活性を保持するが、但し、活性の保持 と適合する可能な変性に対する制限が存在する。これらの相同不凍化セグメント のうち少なくとも２種のセグメントは通常、本発明のポリペプチド内に含まれる であろう。１つの特定のセグメントは、１つ以上のコピーに存在することができ る。Antifreeze polypeptides contain occasional insertions or deletions of amino acids in segments. retains its activity to inhibit ice crystal growth; however, retention of activity There are limits on possible modifications that are compatible with . These homologous antifreeze segments At least two of the segments are typically included within the polypeptide of the invention. Will. One particular segment can exist in more than one copy. Ru.

不凍化ポリペプチドは、１０個又はそれ以上のセグメントを有するが、しかし通 常、７個以下のセグメントを有し、そして好ましい態様においては、３〜５個の セグメントを有すル、相同セグメントの数は、結晶の成長を抑制することにおい て単一分子の有効性を決定することができ、又は効果を有する必要がある分子の モル数を決定することができる。結晶化狙害活性と３〜４、又は５に増加される 場合のセグメントの数（活性を反復体の数との間の直接的な関係を明示する）と の間の相互関係が観察された。Antifreeze polypeptides have 10 or more segments, but generally usually has 7 or fewer segments, and in preferred embodiments 3 to 5 segments. The number of homologous segments is important in suppressing crystal growth. can determine the efficacy of a single molecule, or determine the effectiveness of a molecule that needs to have an effect. The number of moles can be determined. Increased to 3-4 or 5 with crystallization targeting activity the number of segments in the case (clarifying the direct relationship between the activity and the number of repeaters) and A correlation between

ポリペプチドのアミノ末端は典型的には、１又は複数のアミノ酸、好ましくは下 記群： ａ）Ｍ（メチオニン）； ｂ）ＭＡＡ　ｉ Ｃ）配列Ｉ　ＥＧＲを含むスペーサーセグメント；ｄ）部位特異的切断に悪受性 のアミノ酸配列；及びｅ）融合ペプチドとして作用するアミノ酸配列から選択さ れたアミノ酸配列を含んで成る部位特異的切断成分を含み、それによって融合ポ リペプチドに多機能・特性をたぶん付与するであろう。これらのアミノ末端配列 は、典型的には、不凍化セグメントのタンパク質分解性劣化に対する耐性を付与 するが、しかしまた、他方では、第２の生物学的又は他の活性も付与する。その 成分はまた、糖、たとえばグルコース、ガラクトース及びフコースのような非ペ プチド延長部であり得、又はそのような糖のポリマーから構成され得る。The amino terminus of a polypeptide typically contains one or more amino acids, preferably Records: a) M (methionine); b) MAA i C) Spacer segment containing sequence I EGR; d) Not susceptible to site-specific cleavage and e) an amino acid sequence that acts as a fusion peptide; contains a site-specific cleavage moiety comprising an amino acid sequence that It will probably endow the lipeptid with multiple functions and properties. These amino terminal sequences typically confers resistance to proteolytic degradation of the antifreeze segment However, on the other hand it also confers a second biological or other activity. the Ingredients also include sugars, such as non-penetrating sugars such as glucose, galactose and fucose. It may be a peptide extension or may be composed of a polymer of such sugars.

メチオニン自体は、臭化シアノゲンによる処理により容易に除去でき、そして従 って、両カテゴリー（ａ）及び（ｄ）中に落ち入る。ＭＡＡ又はメチオニン−ア ラニン−アラニンは、短い単純な疎水性アミノ酸配列である。ＩＥＧＲはスペー サーとして作用し、そして血液凝固反応の第Ｘ、因子のための認識及び切断部位 である。Methionine itself can be easily removed by treatment with cyanogen bromide, and Therefore, it falls into both categories (a) and (d). MAA or methionine-a Lanine - Alanine is a short, simple hydrophobic amino acid sequence. IEGR is a space Acts as a receptor and recognition and cleavage site for factor X of the blood coagulation reaction It is.

部位特異的切断に敏感な成分は、典型的には、単純な方法で特異的に切断される 部位であり、そして氷結晶の成長抑制活性を保持するために不凍化セグメントに おいて内部的に分解しない。切断は理論量的である必要はないが、しかし通常、 はぼ定量的であろう。その反応は単一段階の反応である必要はなく、そして好ま しくは、それは複雑な一連の試薬を必要としないであろう。単純性が、定常状態 タイプの反応システムにより、又はたぶん、タンパク質分解酵素が、カラムを通 過するにつれてサンプルに対して作用するカラムを通過することによって付与さ れ得る。Components that are sensitive to site-specific cleavage are typically cleaved specifically by a simple method. site, and into the antifreeze segment to retain ice crystal growth inhibitory activity. It does not decompose internally. The cutting need not be stoichiometric, but usually It would probably be quantitative. The reaction need not be a single step reaction, and is preferably Alternatively, it would not require a complex series of reagents. Simplicity is steady state type of reaction system, or perhaps proteolytic enzymes are passed through the column. applied by passing through a column that acts on the sample as it passes through the column. It can be done.

部位特異的切断のための手段は一般的に、酵素的切断を包含するであろう。ポリ ペプチドのためには、これは、認識において特異性を示し、そして特定のアミノ 酸配列を切断する部位−特異的プロテアーゼにより行なわれるであろう、典型的 なプロテアーゼは、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、サブチ リシン、エラスターゼ又はｖ８プロテアーゼを包含する。他の方法は、特定の部 位での分解を引き起こす化学物質により処理することである。典型的な例は、メ チニオンを切断するために臭化シアノゲンの使用であり、反応は高い選択性を示 す。Means for site-specific cleavage will generally include enzymatic cleavage. Poly For peptides, this shows specificity in recognition and A typical procedure would be carried out by a site-specific protease that cleaves the acid sequence. Typical proteases include trypsin, chymotrypsin, pepsin, papain, subti Includes ricin, elastase or v8 protease. Other methods are treatment with chemicals that cause decomposition at high temperatures. A typical example is The use of cyanogen bromide to cleave the thinion, and the reaction shows high selectivity. vinegar.

不凍化ポリペプチドのカルボキシ−末端基は、通常、ｉ　）ＡＴＡＡ； １ｉ）ＡＴＡＲ； １ｊ）ＡＴＡＫ　。The carboxy-terminal group of the antifreeze polypeptide is typically i) ATAA; 1i) ATAR; 1j) ATAK.

１ｖ）ＡＴＡＡＡＡＡＲ；又は ｖ）ＡＴＡＡＡＡＡＫ であろう。これらは好ましい末端配列であるが、追加の配列が置換され得る。こ れらは一般的に、いく分線水性であるが、しかし他のものも利用され得る。最っ とも一般的な融合は、破壊又は分解に対する耐性について示されるように、得ら れたタンパク質に特定の好都合な性質を付与するであろうセグメントであろう。1v) ATAAAAAAR; or v) ATAAAAAAK Will. Although these are preferred terminal sequences, additional sequences may be substituted. child These are generally somewhat aqueous, but others may be utilized. Best Both common fusions are obtained as shown in their resistance to breakage or degradation. This would be a segment that would confer certain advantageous properties on the protein.

第５図を参照のこと、また、ポリペプチド鎖への変性、たとえばアセチル化、メ チル化、誘導体化及びグリコジル化（ここでポリペプチドは不凍化性質を有する ）を有するポリペプチドが、本発明において予想される。これらの変性は、不凍 化セグメント又は他のセグメント又は両方のセグメントのいづれかに位置するこ とができる。See Figure 5, and modifications to the polypeptide chain, such as acetylation, chillation, derivatization and glycosylation (where the polypeptide has antifreezing properties) ) is envisaged in the present invention. These modifications be located in either the segment segment or the other segment or both segments. I can do it.

所望により、異種融合タンパク質は、不凍化ポリペプチドのアミノ−又はカルボ キシ−末端（又は両者）に結合される追加のポリペプチド又は他のセグメントを 含むことができる。Optionally, the heterologous fusion protein comprises amino- or carbo-nucleotides of the antifreeze polypeptide. additional polypeptides or other segments attached to the x-terminus (or both) can be included.

驚くべき事には、不凍化セグメントの不凍化活性は、セグメントが融合タンパク 質に固定される場合でさえ、保持される。Surprisingly, the antifreeze activity of the antifreeze segment is Even when fixed in quality, it is retained.

本発明の融合タンパク質は通常、異種タンパク質、たとえば特定の細胞区画に通 常標的を向けられているタンパク質がらの１又は複数のドメインを含んで成り、 そしてこの中に、相同不凍化ポリペプチド又は不凍化セグメントが導入される予 定である。この部位特異的標的決定は、たとえば容易な又は宿主からの分泌（所 望により、これは、分泌工程の一部として標的成分の切断を包含することができ る）を通して改良された生成を提供することができる。これらのポリペプチドを 特定の細胞タイプに向けることもまた利用され得る。標的決定は、生成物の効能 のために重要である。融合パートナ−ポリペプチドのもう１つの所望する性質は 、特定の親和性又は反応性である。この親和性は、たとえば容易な精製（たとえ ば、プロティンＡ（Ｓｉｇｍａ）を通しての親和性クロマトグラフィーによる） 又は測定（たとえばウェスターンプロット又は酵素アッセイによる）を通して改 良された検出能力又は生成を提供することができる。The fusion proteins of the invention typically include heterologous proteins, e.g. comprising one or more domains of a protein that is normally targeted; And into this, a homologous antifreeze polypeptide or antifreeze segment is expected to be introduced. It is fixed. This site-specific targeting can be achieved by e.g. Optionally, this can include cleavage of the target component as part of the secretion process. can provide improved generation through These polypeptides Targeting specific cell types may also be utilized. Targeting determines product efficacy important for. Another desired property of the fusion partner polypeptide is , a specific affinity or reactivity. This affinity is important for example for easy purification (e.g. (e.g., by affinity chromatography through protein A (Sigma)) or modified through measurement (e.g. by Western plot or enzyme assay). Improved detection capabilities or production can be provided.

本発明の１つの態様において、融合セグメントは、予定された細胞区画に向けら れ又は輸送される性質を不凍化セグメント上に付与するであろう、そのようなセ グメントは、リーダー配列が細胞外分泌のために特に有用であるが、相同の不凍 化タンパク質のシグナルペプチドを排除するように特に向けられる０種々の例は 、分泌されるであろう酵母α−因子、クロロプラスト中に輸送され得るリブロー スビスリン酸カルボキシラーゼ、液胞中に輸送される植物凝集素、ミトコンドリ ア中に輸送されるシトクロムＣ１単子葉植物から分泌されるα−アミラーゼ及び 双子葉植物から分泌される病因関連タンパク質ＰＢＩＢを包含する。特に、核に 標的決定され、そして核酸又は核の他の成分の有意な凍結誘発性分解に高い耐性 を付与するであろうウィルスタンパク質が、本発明に包含される。In one embodiment of the invention, the fusion segment is directed to a predetermined cellular compartment. such a separator that would impart on the antifreeze segment The leader sequence is particularly useful for extracellular secretion, but homologous antifreeze Various examples specifically directed to eliminating signal peptides of conjugated proteins include , yeast α-factor that may be secreted, ribo-factor that may be transported into the chloroplast Subisphosphate carboxylase, plant agglutinin transported into vacuoles, mitochondria α-Amylase secreted from monocots and cytochrome C1 transported into the It includes the pathogenesis-related protein PBIB, which is secreted from dicotyledonous plants. especially in the nucleus targeted and highly resistant to significant freeze-induced degradation of nucleic acids or other components of the nucleus Viral proteins that will confer this are encompassed by the present invention.

融合タンパク質のもう１つのタイプにおいて、不凍化セグメントは、特定の細胞 タイプ中への結合又は組込みのための選択性を有する標的成分に結合される。特 定の細胞タイプへの不凍化活性の標的化は、保護の選択性をひじょうに高める。In another type of fusion protein, the antifreeze segment is The target component has selectivity for binding or incorporation into the target component. Special Targeting antifreezing activity to specific cell types greatly increases the selectivity of protection.

たとえば、標的決定後、及び細胞培養物の凍結化の後、凍結保護された細胞は、 凍結工程を選択的に生存することができる。For example, after targeting and freezing of the cell culture, cryoprotected cells are The freezing process can be selectively survived.

ペプチド融合のための他の同様の候補体は、プロティンＡ、β−ガラクトシダー ゼ、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ア ルコールデヒドロゲナーゼ、αアミラーゼ、ルシフェラーゼ、植物凝集素、Ｒｕ ＢＰＣａ　ｓ　ｅの小サブユニット、ファセオリン又は酵母α接合因子を包含す るが、但しこれだけには限定されない。第５図は、適切な融合タンパク質及びそ れらの性質の代表的な列挙を提供する。融合タンパク質及び種々の不凍化ポリペ プチドの配列は、たとえばＧｅｎ　Ｂａｎｋ　（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉ ｔｕｔｅｓ　ｏｆＨｅａｌｔｈ）　（その対応部分は引用により本明細書に組込 まれる）から入手できる。Other similar candidates for peptide fusions include protein A, β-galactosidin enzyme, β-lactamase, chloramphenicol acetyltransferase, alcohol dehydrogenase, α-amylase, luciferase, plant agglutinin, Ru including the small subunit of BPCa se, phaseolin or yeast α mating factor However, it is not limited to this. Figure 5 shows suitable fusion proteins and their We provide a representative enumeration of these properties. Fusion proteins and various antifreeze polypeptides For example, the sequence of the putido can be found in GenBank (National In5ti tutes of Health) (corresponding portions thereof are incorporated herein by reference) Available from

＼゛　ボｌペプ　ド　ツー′　る 組換え核酸配列は、天然において連結されない核酸の２つのセグメントの連結に 起因する。典型的には、別々の核酸セグメントは、異なった種に起因するが、し かし２種の異なった個体又は同じ個体の異なった細胞に起因することもできる。\゛　Volpep　do　2′ru A recombinant nucleic acid sequence involves the joining of two segments of nucleic acid that are not joined in nature. to cause. Typically, separate nucleic acid segments originate from different species, but However, it can also originate from two different individuals or from different cells of the same individual.

用語“組換え核酸配列”とは、いづれか他の源からのもう１つのセグメントに連 結された、選択された配列を有する化学的に合成された核酸セグメントを含む。The term "recombinant nucleic acid sequence" means a sequence that is linked to another segment from any other source. a chemically synthesized nucleic acid segment having a selected sequence linked together.

典型的には、合成セグメントは天然源の代わりに使用される。なぜならば、既知 の天然の配列とは異なる特定の核酸配列が所望されるからである。しばしば、合 成配列は、コドンを変え、又はコドン使用法を変え、又は制限酵素認識部位を導 入し又は除去するために使用される。特定のコドン選択は、特定のコドンを回避 し、又は得られるポリペプチドのアミノ酸配列を変えるために、与えられた宿主 の特異的なコドン利用法を使用する標的の発現システムにおけるより高い翻訳効 能のために異なることができる。特定のｉｌＪ限酵素認識又は切断部位の導入又 は除去は、所望する特徴を有する特定の配列の生成工程、たとえば新規の又は異 なった配列セグメントの導入又は除去において助力するために重要である。新規 配列、たとえばプロテアーゼ切断部位を導入することもまた利用され得る。Typically, synthetic segments are used in place of natural sources. Because known This is because a specific nucleic acid sequence that differs from the natural sequence is desired. often combined The generated sequence may change codons, change codon usage, or introduce restriction enzyme recognition sites. used for entering or removing. Specific codon selection avoids certain codons a given host, or to alter the amino acid sequence of the resulting polypeptide. Higher translation efficiency in targeted expression systems using specific codon usage You can do different things for your abilities. Introduction of specific ilJ restriction enzyme recognition or cleavage sites or Removal is the process of generating a specific sequence with desired characteristics, e.g. It is important to assist in the introduction or removal of sequence segments that have become obsolete. new Introducing sequences such as protease cleavage sites may also be utilized.

合成セグメントは、不凍化セグメントの一般的な反復性質の観点から特に有用で ある。反復体を製造する核酸セグメントの適切な企画により、特定の制限酵素切 断部位を有する個々のセグメントをコードする種々の核酸セグメントを生成する ことが可能である。適切な酵素の選択により、これまで製造された不凍化ポリペ プチド中に特定のコード配列と単純に導入することが可能である。従って、セグ メントの組合せを混合し、そして接合する可能性が容易に達成され得、種々の組 合せの試薬を一層容易に且つ早くすることができる。Synthetic segments are particularly useful in view of the generally repetitive nature of antifreeze segments. be. Proper design of nucleic acid segments to produce repeats allows for specific restriction enzyme cleavage. Generating different nucleic acid segments encoding individual segments with cleavage sites Is possible. By selecting appropriate enzymes, antifreeze polypeptides produced to date can be It is possible to simply introduce a specific coding sequence into a petid. Therefore, seg The possibility of mixing and joining combinations of components can be easily achieved and Combining reagents can be made easier and faster.

核酸配列の好ましい態様は末端で位置する制限部位を有する単一の不凍化セグメ ントをコードするが、特定の反復セグメントの境界を拡張する導入されたセグメ ントを有する反復セグメントの内部に制限酵素切断部位を有することが可能であ る。当業者は、本明細書に開示される好ましい配列に関して、種々の変性を容易 に行なうであろう。A preferred embodiment of the nucleic acid sequence is a single antifreeze segment with restriction sites located at the ends. code, but introduced segmentation that extends the bounds of a particular repeating segment. It is possible to have a restriction enzyme cleavage site within the repeat segment with the Ru. Those skilled in the art will readily be able to make various modifications to the preferred sequences disclosed herein. will do so.

従って、本発明の他の態様は、上記で定義されたような不凍化セグメントを含む 構築されたポリペプチドをコードする紐換え核酸配列を包含する。これらのＭ換 え核酸配列は、たとえば第２，３又は４図の不凍化ポリペプチド及び相同配列を コードするセグメントを包含する。Accordingly, other aspects of the invention include an antifreeze segment as defined above. It includes a recombinant nucleic acid sequence encoding the constructed polypeptide. These M exchanges The nucleic acid sequences include, for example, the antifreeze polypeptides and homologous sequences of Figures 2, 3, or 4. Contains the coding segment.

核酸含有物における実質的な相同性とは、セグメント又はそれらの相補的鎖が、 適切なヌクレオチド挿入又は欠失と比較される場合、最適に配置される場合同一 であり、又は少なくとも約６０％〜７０％の残基、通常少なくとも約８０％の残 基及び好ましくは少なくとも９０％のヌクレオチドと同一であることを意味する 。他方、実質的な相同性は、セグメントが、選択的なハイブリダイゼーション条 件下で、典型的には第２．３又は４図に由来する配列を用いて、鎖又はその相補 体にハイブリダイズするであろう場合に存在する。ハイブリダイゼーションの選 択性は、特異性の完全な欠失よりもより選択的であるハイブリダイゼーションが 生じる場合に存在する。典型的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少なく とも約１４／２５のヌクレオチドの長さに対して少な（とも約５５％、好ましく は少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％及び最っとも好まし くは少なくとも約９０％の相同性が存在する場合に生じるであろう。Ｋａｎｅｈ ｉｓａ。Substantial homology in nucleic acid content means that the segments or their complementary strands are Identical if optimally placed when compared to the appropriate nucleotide insertion or deletion or at least about 60% to 70% residues, usually at least about 80% residues. means identical groups and preferably at least 90% of the nucleotides . On the other hand, substantial homology indicates that the segments have been subjected to selective hybridization procedures. strand or its complement, typically using sequences derived from Figure 2.3 or 4. It is present when it will hybridize to the body. Hybridization selection Selectivity is a condition in which hybridization is more selective than complete lack of specificity. Exists if it occurs. Typically, selective hybridization is less Both are about 14/25 nucleotides in length (both about 55%, preferably is at least about 65%, more preferably at least about 75% and most preferably This will occur if there is at least about 90% homology. Kaneh isa.

Ｍ、（１９８４）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２　：　２０ ３〜２１３　（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと、緊縮ハイブリ ダイゼーション条件は、典型的には、約１Ｍ以下、より通常には約５００＋＊Ｍ 以下及び好ましくは約２００ｍＭ以下の塩濃度を包含するであろう。温度条件は 典型的には、２０℃以上、より通常には約３０″Ｃ以上及び好ましくは約３７° Ｃ以上であろう。M. (1984), Nucleic Ac1ds Res, 12: 20 3-213 (incorporated herein by reference), austerity hybrid Dization conditions are typically about 1 M or less, more usually about 500+*M Salt concentrations of less than and preferably less than about 200 mM will be included. The temperature conditions are Typically above 20°C, more usually above about 30"C and preferably about 37°C Probably C or higher.

他の要因、たとえば数ある中で、相補的鎖の塩基組成及び大きさ、有機溶媒の存 在及び塩基ミスマツチングの程度が、ハイブリダイゼーションの緊縮に対して有 意に影響を及ぼす場合、パラメーターの組合せが、いづれか１つの絶対的な測定 よりも一層重要である。Other factors, such as the base composition and size of the complementary strand, the presence of organic solvent, among others. The presence and extent of base mismatching are important for the stringency of hybridization. If the combination of parameters affects the It is even more important than

配列はまた、融合タンパク質セグメント、又は追加の所望する配列により構築さ れるセグメントのいづれかを含む不凍化ポリペプチドをコードする核酸を含む。Sequences can also be constructed with fusion protein segments or additional desired sequences. A nucleic acid encoding an antifreeze polypeptide comprising any of the segments included in the antifreeze polypeptide.

これは、典型的には、異なったコドンを置換し、（特に発現宿主細胞の好ましい コドン利用法にコドン利用法を適合せしめるために）、得られたポリペプチドの アミノ酸配列を変性し、制限酵素認識又は切断部位を除去し又は付加し、又はポ リペプチドの発現の制御において上流又は下流の配列を変性するために、導入さ れた非天然の配列を有する合成の核酸配列を含むであろう。This typically involves substituting different codons (particularly the preferred expression host cell). of the resulting polypeptide (in order to adapt the codon usage to the codon usage). Modify the amino acid sequence, remove or add restriction enzyme recognition or cleavage sites, or introduced to modify upstream or downstream sequences in the control of expression of the repeptide. synthetic nucleic acid sequences having non-naturally occurring sequences.

特に、不凍化セグメントの好ましいｎ様は、ヘキサ−及びオクタ−ヌクレオチド 特異性を有する制限酵素のための認識部位を有み、そしてそれを端に有する。特 に、それらは次の部位を端に有する：　ＥｃｏＲＴ、　５ｓｔ１．５ＬＩＩａｌ 、　Ｋｐｎｌ＋　Ｍｒｏｌ、　Ｂａｎ）ＩＴ。In particular, preferred n-types of antifreeze segments include hexa- and octa-nucleotides. It has a recognition site for a specific restriction enzyme and has it at the end. Special , they have the following parts at their ends: EcoRT, 5st1.5LIIal , Kpnl+ Mrol, Ban) IT.

５ｐｈｌ、　ＨｉｎｄＩ［［（すべての部位はいづれか１つの遺伝子を有すとは 限らない）。また、特にそれらは次の部位を含む：Ｎｃｏｌ＋Ｎｈｅｌ、　Ｂｇ ｌＩ、　Ｓａｎ　ＩＦ　、　Ｎｏｔｌ、　Ｐｖｕ　Ｉｒ及びＨｐａｌ、これらの 部位は、不凍化−コード配列の構成及び操作において有用である。5phl, HindI [[(All sites have at least one gene Not exclusively). Also, in particular they contain the following sites: Ncol+Nhel, Bg lI, San IF, Notl, Pvu Ir and Hpal, these The sites are useful in the construction and manipulation of antifreeze-coding sequences.

さらに、好ましいＢ祿のコドン利用法は、魚又は昆虫からの現在知られている不 凍化遺伝子の利用法とは異なる。最適なコドン利用法は、不凍化遺伝子の発現の ために標的決定された個々の種において翻訳を促進するであろう。特に、原核生 物、酵母及び高等植物における好ましいコドン利用法は、冬ヒラメの不凍化遺伝 子に見出されるコドン利用法とは異なる（Ｍａｒｕｙａｍａなど＋ｌ　Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１４５ｕｐｐ１．１５１〜１８９） 。より詳しくは、コドンＧＣＡ、ＧＣＧ及びＧＣＴは、旦、ユ４（Ｅ、　ｃｏｌ ｉ）、Ｓ、セレビシアエ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びＺ、マイス（Ｚ、 　＋咀■）の既知の遺伝子におけるアラニンコドンの６５％以上を占め、そして それらは冬ヒラメ（Ｌａ＋ｌ１ｅｒｉｃａｎｕｓ　）の既知の不凍化遺伝子にお けるアラニンコドンの３５％以下を占める。同様に、コドンＡＣＡ、ＡＣＧ及び ＡＣＴは、ｌ−ユニ（５１％）、Ｓ　セレビシアエ（７０％）及びＺ　マイス（ ６６％）の既知遺伝子におけるトレオニンコドンのほとんどを占め、そしてそれ らは一旦一−エエｌ≦Ｌ２２（Ｐ、　ａｎ＋ｅｒｉｃａｎｕｓ）の既知の不凍化 遺伝子におけるトレオニンコドンの２５％以下を占める。Furthermore, the preferred B-codon usage is from currently known non-codons from fish or insects. This is different from the usage of freezing genes. Optimal codon usage is important for antifreeze gene expression. will promote translation in the individual species targeted for the purpose. In particular, prokaryotes The preferred codon usage in plants, yeast, and higher plants is based on the antifreeze genetics of winter flounder. The codon usage differs from that found in the offspring (Maruyama et al. eic Ac1ds Re5search, 145upp1.151-189) . More specifically, the codons GCA, GCG and GCT are dan, yu4 (E, col i), S. cerevisiae and Z. It accounts for more than 65% of the alanine codons in the known genes of They are related to the known antifreeze genes of winter flounder (La+l1ericanus). It accounts for less than 35% of the alanine codons in the world. Similarly, the codons ACA, ACG and ACT was expressed by l-uni (51%), S. cerevisiae (70%) and Z. mais ( 66%) and account for most of the threonine codons in known genes. Once the known antifreeze of l≦L22(P, an+ericanus) It accounts for less than 25% of the threonine codons in genes.

不凍化ポリペプチド（たとえば約６５〜３５０個のヌクレオチド）をコードする 核酸セグメントの異なった周囲配列環境への配置は、たとえば、上流のプロモー ター又はエンハンサ−要素の操作的制御下で前記核酸セグメントを配置すること を企画する。配列がプロモーターの操作制御下にある場合、それはプロモーター に操作可能的に結合される。プロモーターとコード配列との間の操作上の結合は 、通常、リポソーム結合部位（存在するなら）の上流の約１．０００個のヌクレ オチド内に、好ましくは約５００個のヌクレオチド内に及び最っとも好ましくは 約３００個のヌクレオチド内に、及びプロモーターがその最っとも所望する効果 を有するであろう距離で配置される場合に存在するであろう。encodes an antifreeze polypeptide (e.g., about 65-350 nucleotides) Placement of a nucleic acid segment into a different surrounding sequence environment can be achieved, e.g. placing said nucleic acid segment under the operative control of a controller or enhancer element; plan. If a sequence is under the operational control of a promoter, it is operably coupled to. The operational link between the promoter and the coding sequence is , typically about 1.000 nuclei upstream of the liposome binding site (if present). within octides, preferably within about 500 nucleotides and most preferably within about 300 nucleotides and the promoter has its most desired effect. would exist if placed at a distance that would have .

プロモーターは典型的には、セグメントの強い転写をもたらすプロモーターであ るように選択されるであろう、典型的な構成的に強いプロモーターは、カリフラ ワーモザイクウィルスの３５３プロモーターである。他方、誘発性プロモータ− も所望されるであろう、典型的な誘発性プロモーターはｌａＣプロモーターであ る。さらに他の環境においては、発育的に調節されたプロモーター、たとえば植 物のＲＵＢＰＣａｓｅ小サブユニットプロモーターが好ましい。最終的な標的宿 主において機能的であるプロモーターが所望されるが、しかし時々、異なったプ ロモーターも選択され得る。The promoter is typically one that results in strong transcription of the segment. A typical constitutively strong promoter that would be selected to This is the 353 promoter of Warmosaic virus. On the other hand, inducible promoters A typical inducible promoter that may also be desired is the laC promoter. Ru. In still other environments, developmentally regulated promoters, e.g. The RUBPCase small subunit promoter is preferred. final target inn Primarily a functional promoter is desired, but sometimes a different promoter is desired. Romotors may also be selected.

多数のベクターが利用でき、そして意図される使用に依存して目的に対して適切 である。初期研究相においては、いくつかのベクター、たとえばｐＵＣベクター 又はファージベクターが、それらの単純性及びベクターのコピーの増幅における 効能により最っとも適切であった。他の段階においては、発現ベクター（典型的 には、約１，０００〜５．０００個又はそれ以上のヌクレオチド）が好ましく、 そしてこれは、核酸配列が多量のポリペプチドを生成するために発現されること を確保する強いプロモーターに操作可能的に結合され得る。A large number of vectors are available and appropriate for the purpose depending on the intended use. It is. In the early research phase, some vectors, e.g. pUC vector or phage vectors due to their simplicity and amplification of vector copies. It was the most appropriate according to its efficacy. In other steps, an expression vector (typical (about 1,000 to 5,000 or more nucleotides) is preferred; And this means that the nucleic acid sequence is expressed to produce large quantities of the polypeptide. can be operably linked to a strong promoter that ensures

旦、ユ悲における発現のためには、トリプトファンプロモーターを含むベクター が、高い発現レベルを存する好ましいベクターである。他の類似するプロモータ ーは、β−ガラクトシダーゼプロモーター又はファージλにおけるプロモーター であろう。プロモーター又はベクターの選択において有用な又は重要な性質が、 Ｍａｎｉａｔｉｓなど、翁おμ佳肛匹劫ｍ１１Ｌ」Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎ ｕａｌ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１ ９８２）に記載されている。プラスミド又はファージは典型的には、細胞のため の好ましいベクターであろう。For expression in human, a vector containing a tryptophan promoter is used. is a preferred vector with high expression levels. Other similar promoters is the β-galactosidase promoter or the promoter in phage λ Will. Characteristics useful or important in the selection of promoters or vectors include Maniatis, etc., "Laborator Man" ual+ Co1d Spring Harbor Laboratory (1 982). Plasmids or phages are typically would be the preferred vector.

特に低いレベルの汚染性メツセージを有する高いメツセージレベルの発現を可能 にするであろう１つの特定のシステムは、Ｔ７ポリマラーゼシステムである。旦 −ユ悲は、Ｔ７プロモーターに操作可能的に結合されるコードセグメントにより 及び誘発性及びリファンピシン非感受性Ｔ７ポリマラーゼにより同時形質転換さ れる。リファンピシンの存在下でのポリマラーゼの誘発に基づけば、意図された 配列の高い特異的転写がもたらされるであろう。Enables expression of high message levels with particularly low levels of contaminating messages One particular system that would be useful is the T7 polymerase system. Dan - The gene expression is activated by a code segment operably linked to the T7 promoter. and co-transformed with inducible and rifampicin-insensitive T7 polymerase. It will be done. Based on the induction of polymerase in the presence of rifampicin, the intended Highly specific transcription of the sequence will result.

真核細胞、特に哺乳類組織培養細胞における発現のためには、プロモーター、た とえばＳＶ４０　Ｔ抗原、チミジンキナーゼ又はβ−グロビンが好ましい。選択 され得る特定の酵母プロモーターは、ＧＡＬｌ、　１０　（Ｍｏ１．　＆　Ｃｅ １ｌ　Ｂｉｏｌ、、（１９８４）４　：　１４４０−１４４８）、ＡＤＨ２（Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ−、、（１９８３）　２５８　：　２６７４〜２６８２）及 びＰＨｒ）５　（ＥＭＢＯＪ、、　（１９８２）　６　：　６７５〜６８０）プ ロモーターを包含する。植物細胞においては、好ましいプロモーターは、カリフ ラワーモザイクウィルスからの３５Ｓプロモーター、リブロースビスリン酸カル ボキシラーゼ（ＲｕＢＰ　（ａｓｅ）の小サブユニットのためのプロモーター及 びヱｆ　ｌ：ｌ　、Ｒ／）　−１−皇涛ツノア　−６乱７Ｘ　（Ａ　ｒｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｗｅｆａｃｉｅｎｓ）からのツバリンシンターゼプロモータ ーを包含する。For expression in eukaryotic cells, especially mammalian tissue culture cells, promoters, For example, SV40 T antigen, thymidine kinase or β-globin are preferred. choice Particular yeast promoters that can be used include GALl, 10 (Mo1. & Ce 1l Biol, (1984) 4: 1440-1448), ADH2 (J , Biol, Che-, (1983) 258: 2674-2682) and and PHr) 5 (EMBOJ, (1982) 6:675-680) Includes lomotors. In plant cells, preferred promoters are cariph 35S promoter from lower mosaic virus, ribulose bisphosphate calcium Promoter and promoter for the small subunit of boxylase (RuBP(ase)) Bief l:l, R/) -1- Koto Tsunoa -6 Ran 7X (A robac Tubarin synthase promoter from T. tuwefaciens) - Includes.

高いレベルの発現のためには、昆虫バキエロウィルスシステムがひじょうに効果 的であり得る。Ｌｕｃｋｏｗ　＆　Ｓｕｍｓｅｒｓ（１９８８）旦ムクｌ山！匡 ■、　６　：　４７〜５５を参照のこと。これらのベクターシステムは典型的に は、単純且つ効果的なタンパク質精製を可能にする。For high-level expression, the insect baquierovirus system is highly effective. It can be a target. Luckow & Sumsers (1988) Mukuruyama!匡 ■, 6: See 47-55. These vector systems are typically allows simple and effective protein purification.

゛　ボ１ペブ　−ゼの 本発明の主な最終的使用は、結晶の成長を阻止する氷結晶面に結合する不凍化ポ リペプチドの使用である。氷結晶の成長の阻害は、そのポリペプチドの存在を必 要として、その結果、そのポリペプチドの生成がひじょうに重要である。合成は 、２つの形、すなわち生物学的又は合成的に行なわれる。゛Bo1peb-ze's The primary end use of this invention is to use an antifreeze polymer that binds to ice crystal faces to inhibit crystal growth. The use of lipeptides. Inhibition of ice crystal growth requires the presence of the polypeptide. In short, the production of the polypeptide is therefore of great importance. The synthesis is , is carried out in two forms: biologically or synthetically.

生物学的方法は、ポリペプチドコード配列又は遺伝子の発現によってであり；そ の合成方法は、ポリペプチドの化学的合成によってである。Biological methods are by expression of polypeptide coding sequences or genes; The method of synthesis is by chemical synthesis of polypeptides.

好ましい合成方法は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　（Ｊ、Ａｔｍ、Ｃｈｅａ、Ｓｏｃ 、＋　（１９６３）８５　：　２１４９〜２１５６）により開発されたような固 相ペプチド合成を利用する。この方法は、不凍化活性についての特定の組成物又 は配合物の試験において特に有用であろう。A preferred method of synthesis is described by Merrifield (J, Atm, Chea, Soc. , + (1963) 85: 2149-2156). Utilizes phased peptide synthesis. This method uses a specific composition or composition for antifreeze activity. may be particularly useful in testing formulations.

大規模な生成に関しては、生物学的発現が典型的には好ましい。コード核酸又は 遺伝子は、組換え変性による天然の遺伝子又は適切な発現システムに発現される であろう完全に合成の配列であり得る。適切なベクターへの天然の配列セグメン トの挿入のために利用される方法は、当業者に良く知られている。Ｍａｎｉａｔ ｉｓ又はＮｕ、など、（１９８７）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｌｌ１ｏ ｌｏ　。For large scale production, biological expression is typically preferred. coding nucleic acid or The gene can be expressed in the native gene or in a suitable expression system by recombinant modification. It could be a completely synthetic sequence. Natural sequence segments into appropriate vectors The methods utilized for the insertion of inserts are well known to those skilled in the art. Maniat is or Nu, etc. (1987) Methods in Enzll1o Lo.

第１５３巻、Ａｃａｄｅａ＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ、Ｙ 、を参照のこと。Volume 153, Acadea+ic Press, New York, N, Y ,checking.

合成配列は、配列の特定の部分を製造するためにホスホラミジフト化学により合 成され得る（Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａｎｄ　Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ。Synthetic sequences are synthesized by phosphoramidifth chemistry to produce specific portions of the sequence. (Beaucage and Carruthers).

（１９８１）　Ｔｅｔ、Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２２　：　１８５９〜１８６２）　 、オーバラップするセグメントが合成され、そして次に、−緒に連結され、大き な遺伝子が生成される。(1981) Tet, Letters, 22: 1859-1862) , overlapping segments are combined and then concatenated together to create a large genes are generated.

最後に、不凍化セグメントのために特定の配列を選択することによって、当業者 に明らかなように、タンデム反復体を生成するために一緒に容易に連結され又は 挿入され得る便利なセグメントを供給するであろう制限酵素切断部位が導入され 得る。Finally, by selecting a specific sequence for the antifreeze segment, one skilled in the art can easily linked together to produce tandem repeats or Restriction enzyme cleavage sites are introduced that will provide convenient segments that can be inserted. obtain.

不凍化ポリペプチドの精製法は、タンパク質精製の当業者に知られている方法に よってである。標準の精製技法は、細胞溶解物又は培養培地（タンパク質が分泌 される場合）のいづれかからである。典型的な方法は、カラムクロマトグラフィ ー法、硫酸アンモニウム塩沈殿法、抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィ ー法及び他の方法を包含する。天然に存在するポリペプチド（たとえば魚に生成 される）に関しては、好ましい精製方法はＤｅＶｒｉｅｓなと、　（１９７７） 　Ｂｉｏｃｈｅｍ。Purification of antifreeze polypeptides can be accomplished by methods known to those skilled in the art of protein purification. Therefore. Standard purification techniques include cell lysates or culture media (where proteins are secreted). (if applicable). The typical method is column chromatography - method, ammonium sulfate salt precipitation method, antibody affinity column chromatography - method and other methods. Naturally occurring polypeptides (e.g., produced in fish) (1977), the preferred purification method is as described by DeVries (1977). Biochem.

紅並狂り紅旦４９５　：　３８８〜３９２（引用により本明細書に組込まれる） により説明されている通りである。Beninami Kyori Kodan 495: 388-392 (incorporated herein by reference) As explained by.

好ましくは、不凍化ポリペプチドは、実質的に均質に、通常少なくとも約７０％ 〜８０％の純度に、好ましくは約９０％〜９５％の純度に、最っとも好ましくは ９９％又はそれ以上の純度に精製されるであろう。典型的には、ポリペプチドは 、汚染性の天然に存在する（たとえば魚の血液又は昆虫の細胞）化合物を実質的 に含まないであろう。Preferably, the antifreeze polypeptide is substantially homogeneous, usually at least about 70% ~80% purity, preferably about 90% to 95% purity, most preferably It will be purified to 99% purity or more. Typically, the polypeptide is , substantially eliminate contaminant naturally occurring (e.g. fish blood or insect cells) compounds. It will not be included in

・ン　ポリペプチド　び　゛　る゛　−のポリペプチド又はそのポリペプチドを コードする遺伝子は、氷結晶の成長を抑制するためにそれ相当に使用され得る。・N polypeptide and polypeptide or its polypeptide The encoding gene can correspondingly be used to suppress the growth of ice crystals.

ポリペプチドは、タンパク質形で導入され得、又はそれは、ポリペプチドを生成 するために適切な強いプロモーターの制御下で植物細胞に不凍化タンパク質を発 現することによって達成可能であるレベルで内在的に発現される遺伝子として導 入され得る。不凍化ポリペプチドの適切な濃度は、使用に依存して変化するが、 しかし典型的には、約１　ｐｐｂ〜約１　ｐｐｈ（たとえば、流体のためには、 約ｌμｇ／ｌ〜１　ｇｖ＊／　ｌ　、好ましくは約０．０１〜約０．１　ｒｓｇ ／ｍ１　）の範囲である。The polypeptide can be introduced in protein form or it can be Express antifreeze proteins in plant cells under the control of a strong promoter suitable for As a gene that is endogenously expressed at a level that is achievable by can be entered. The appropriate concentration of antifreeze polypeptide will vary depending on the use, but However, typically from about 1 ppb to about 1 pph (e.g., for fluids, About 1 μg/l to 1 gv*/l, preferably about 0.01 to about 0.1 rsg /m1).

本発明の１つの態様において、ポリペプチドは食品に導入されるであろう、これ は、多くの異なりた観点を有する。１つは、植物食品、たとえば完全な植物中に 導入し、そして従って零下の気候条件からの損傷に対しである程度の一般的な耐 性を付与し、又は凍結に基づいてこれらの特定の植物器官に対する特異的な損傷 を最少にするために植物部分、たとえば果物又は野菜部分中に導入することであ る。典型的な植物部分は、茎、根、葉、花、葉柄、果皮、種、成長組織、塊茎及 び同様のものである。In one embodiment of the invention, the polypeptide will be introduced into a food product, which has many different perspectives. One is plant foods, such as whole plants. introduction and therefore some general resistance to damage from sub-zero climatic conditions. specific damage to these specific plant organs based on freezing or can be introduced into plant parts, such as fruit or vegetable parts, to minimize Ru. Typical plant parts include stems, roots, leaves, flowers, petioles, pericarp, seeds, growing tissues, tubers and and similar.

冷凍野菜、たとえばセロリ、ジャガイモ、アスパラガス、エントウ、ニンジン、 豆、ブロッコリー、トウモロコシ及びホウレンソウのきめ、味覚及び有用な貯蔵 寿命が改良されるであろう。同様に、果物、たとえばイチゴ、ブルーベリー、ラ ーズベリー、柑橘類、バナナ、ブドウ、キウィ、モモ、パイナツプル、プラム、 サクランボ、トマト及びマンゴウのきめ、味覚及び有用な貯蔵寿命が増強される であろう。食品科学に対する一般的な論文に関しては、たとえばＺａｐｓａｌｉ ｓ　ａｎｄＢｅｃｋ（１９８５）、　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　ａｎｄ　Ｎ ｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　。Frozen vegetables such as celery, potatoes, asparagus, peas, carrots, Texture, taste and useful storage of beans, broccoli, corn and spinach Lifespan will be improved. Similarly, fruits such as strawberries, blueberries, berry, citrus, banana, grape, kiwi, peach, pineapple, plum, Texture, taste and useful shelf life of cherries, tomatoes and mangoes are enhanced Will. For general articles on food science, see e.g. Zapsali s and Beck (1985), Food Chemistry and N Utritional Biochemist.

Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　；　Ｂｅ１ｉｔｚ　 ａｎｄ　Ｇｒｏｓｃｈ（１９８７）。John Wiley & 5oz, New York; Be1itz and Grosch (1987).

Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ　；及びＪｕｌ（１９８４）ｑ　ｏｆ　Ｆｒｏｚｅｎ　Ｆｏｏｄｓ、Ａｃ ａｄｅ＋ｓｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（それぞれは、引用により本明 細書に組込まれる）を参照のこと。Food Chemistry Springer-Verlag, New Y ork; and Jul (1984) q of Frozen Foods, Ac ade+sic Press, New York (each by reference (incorporated into the specification).

植物及び他の製品中へのこの導入は、標的生物中への適切な核酸の遺伝的導入に より最っとも容易に達成され得る。食品加工が始まる前、又は収穫及び加工が始 まった後、核酸の発現は、構成的に又は誘発可能的に、全体の植物タンパク質の 約０．１を量％まで、食物を効果的に保護するために十分に高いレベルのポリペ プチドを導びくことかできる０発現はまた、組織特異的基礎に基づかれ得る。た とえば、果物における熟成遺伝子への結合は、生成植物からの収穫の後でさえ、 発現をもたらすことができる。This introduction into plants and other products involves the genetic introduction of the appropriate nucleic acids into the target organism. can be most easily achieved. Before food processing begins or when harvesting and processing begins. Once established, the expression of the nucleic acid can be constitutively or inducibly expressed in whole plant proteins. up to approximately 0.1% by volume, a level sufficiently high to effectively protect the food. 0 expression that can lead to peptides can also be based on a tissue-specific basis. Ta For example, binding to ripening genes in fruit can occur even after harvest from the producing plant. can bring about expression.

ポリペプチドはまた、凍結される予定である食物中に添加され得る。多くの凍結 食品、たとえばアイスクリーム、冷凍ヨーグルト、アイスミルク、シャーベット 、アイスキャンデー、冷凍ウィップドクリーム、冷凍クリームパイ、冷凍プディ ング及び同様のものが冷たい状態で消費される。特に、きめ及び風味は、はとん どの家庭の霜を有さないフリーザーに生じる凍結−融解サイクルを通して大きな 氷結晶の形成により又は冷凍状態における長期の貯蔵に基づいて、悪影響を受け る。この氷結晶の成長工程は、不凍化ポリペプチドの添加により、完全に防がれ 、又は少な（とも最少化され得る。不凍化剤は、食物じゆうに導入され、又は他 方、結露及び結晶形成が最っとも容易に生しる表面に適用され得る。Polypeptides can also be added to foods that are to be frozen. a lot of freezing Foods, such as ice cream, frozen yogurt, iced milk, sorbet , popsicles, frozen whipped cream, frozen cream pies, frozen pudi ngs and the like are consumed cold. In particular, the texture and flavor are Through the freeze-thaw cycles that occur in any home's frost-free freezer, adversely affected by the formation of ice crystals or due to long-term storage in frozen conditions. Ru. This ice crystal growth process can be completely prevented by the addition of antifreeze polypeptides. Antifreeze agents may be introduced throughout the food or otherwise Alternatively, it can be applied to surfaces where condensation and crystal formation occur most easily.

もう１つの重要な使用は、これらのタンパク質をコードする核酸によるドウ酵母 を形質転換することである。酵母中へのこの遺伝子の導入及び発現に基づけば、 及び凍結ドウへのこれらの酵母の使用に基づけば、ドウは、酵母生存率が融解後 、高く存続するので、融解に基づいて天然で発酵するであろう。損傷は、これら の不凍化ポリペプチドの存在下での貯蔵からはほとんど蓄積せず、そして融解さ れたサンプルは高い生存率を保持するので、より長い貯蔵時間が得られ又はより 少量のアリコートが貯蔵のために必要とされる。Another important use is in yeast production by nucleic acids encoding these proteins. is to transform the . Based on the introduction and expression of this gene into yeast, and based on the use of these yeasts in frozen dough, the dough has a low yeast viability after thawing. , will ferment naturally on the basis of melting, as it will persist highly. Damage is caused by these There is little accumulation from storage in the presence of antifreeze polypeptides and no thawing. samples retain high viability, resulting in longer storage times or Small aliquots are required for storage.

食物分野に特異的でない種々の態様が存在する。１つは、凍結気候条件から植物 を保護するために不凍化タンパク質の使用である。不凍化タンパク質又はポリペ プチドは、導入された遺伝子の発現により細胞質中に内部的に導入され得、又は ポリペプチドは植物に外部的に適用され得る。外部的な通用は、植物へのポリペ プチドの直接的な適用により、又はポリペプチドを分泌する生物の植物上への外 部的な付着により達成され得る。導入のためのこれらの同じ変法が他の使用にも 適用される。There are various embodiments that are not specific to the food sector. One is that plants are affected by freezing climate conditions. is the use of antifreeze proteins to protect. antifreeze protein or polype The peptides can be introduced internally into the cytoplasm by expression of an introduced gene, or Polypeptides can be applied externally to plants. External usage is polype to plants by direct application of polypeptides or by externalization onto plants of organisms that secrete polypeptides. This can be achieved by partial attachment. These same variants for introduction also have other uses. Applicable.

もう１つの態様は、器官、組織、又は他の生物学的サンプルをとり囲む液体中へ の不凍化ポリペプチドの導入である。Another embodiment is to introduce the method into the liquid surrounding the organ, tissue, or other biological sample. This is the introduction of an antifreeze polypeptide.

１つの特定の使用は、移植操作又は貯蔵目的のために病院への輸送の間に存在す る。不凍化ポリペプチドは、氷点下温度での短期間又は長期間の貯蔵を可能にし 、それによって生来の代謝又は劣化を最少にし、そして氷結晶の成長から細胞損 傷を実質的に減じる。他の医学的に重要な感湿性生物学的サンプルは、血液及び 血液製品、治療剤、タンパク質薬剤、バイオアッセイ試薬及びワクチンである。One particular use is during transportation to a hospital for transplantation operations or storage purposes. Ru. Antifreeze polypeptides allow for short or long term storage at sub-zero temperatures. , thereby minimizing innate metabolism or deterioration and reducing cell damage from ice crystal growth. Substantially reduces scarring. Other medically important moisture-sensitive biological samples include blood and blood products, therapeutic agents, protein drugs, bioassay reagents and vaccines.

さらにもう１つの態様は、凍結貯蔵に向けられた細胞又はそれらの抽出物中への 不凍化ポリペプチドの導入である。たとえば、不凍化タンパク質を含む細菌細胞 、酵母細胞、植物細胞及び特に動物細胞は、凍結−融解工程による固有の特徴の 最少の損失を伴って又はその特徴の損失を伴わないで、細胞又は組織生存率を高 めた。サブ細胞サンプル又は細胞抽出物は、凍結、特に長期の貯蔵に対して類似 する怒度を有する。Yet another embodiment provides for incorporation into cells or extracts thereof destined for cryopreservation. Introduction of antifreeze polypeptide. For example, bacterial cells containing antifreeze proteins , yeast cells, plant cells and especially animal cells, which have unique characteristics due to the freeze-thaw process. Increase cell or tissue viability with minimal or no loss of its characteristics I met. Subcellular samples or cell extracts are suitable for freezing, especially for long-term storage. He has a level of anger.

典型的な例は、インビトロタンパク質翻訳システム、酵素調製物及び特に、感受 性の膜成分を含むサンプル、たとえばクロロプラスト又はミトコンドリア膜調製 物であろう。特に、オルガネラを含むサンプルは、これらの不凍化ポリペプチド の添加に基づいて、凍結損傷に対して高められた耐性を示すことができる。動物 の柔組織は、本発明のポリペプチドの存在下での凍結に対してより少ない損傷を 示し、そしてポリペプチドの添加は、凍結及び続く融解に基づく細胞結合性が、 たとえば組織培養析出物のために重要であり又は所望される場合の情況において 有用であろう。従って、凍結貯蔵、たとえば細胞又は組織貯蔵所に向けられたサ ンプルは、それらに添加されるポリペプチドを通常前する。しばしば貯蔵される 細胞タイプの中には、細菌、菌！！（たとえば酵母）及び高等真核細胞（たとえ ばハイプリドーマ株及びｍ織培養細胞系）の遺伝的変異体が存在する。Typical examples are in vitro protein translation systems, enzyme preparations and especially sensitive Samples containing biological membrane components, e.g. chloroplast or mitochondrial membrane preparations It must be something. In particular, samples containing organelles should be treated with these antifreeze polypeptides. Based on the addition of , an increased resistance to freezing damage can be shown. animal parenchyma is less damaged upon freezing in the presence of the polypeptides of the invention. and addition of the polypeptide results in cell binding based on freezing and subsequent thawing. In situations where it is important or desired, for example for tissue culture precipitates. It would be useful. Therefore, cryopreservation, e.g. cell or tissue repositories, Samples usually precede the polypeptides added to them. often stored Among the cell types are bacteria and fungi! ! (e.g. yeast) and higher eukaryotic cells (e.g. Genetic variants exist, such as hybridoma lines and cell culture cell lines.

本発明の不凍化融合ポリペプチドは、すべて良く知られた方法に従って、特定の 細胞区画又は細胞外空間、特定の細胞又は特定の細胞タイプに標的決定され得る 。細胞区画への標的を特定し又は決定するポリペプチドセグメントの結合により 、不凍化セグメントは特定の細胞オルガネラに標的決定され得る。ペプチドはオ ルガネラに向けられるのみならず、また不凍化機能は、他のポリペプチドセグメ ントによりとり囲まれる場合でさえ機能を存続することができる。結合において 細胞特異性を有する抗体又は他の分子への融合により、凍結に基づく細胞損傷に 対する耐性がこれらの細胞タイプに付与され得る。この技法はまた、器官にも使 用されるであろう。The antifreeze fusion polypeptides of the present invention can all be prepared according to well-known methods. Can be targeted to cellular compartments or extracellular spaces, specific cells or specific cell types . By attachment of polypeptide segments that identify or determine targeting to cellular compartments , antifreeze segments can be targeted to specific cellular organelles. Peptides are The antifreeze function is not only directed to Luganella but also to other polypeptide segments. can remain functional even when surrounded by other objects. in conjunction Fusion to cell-specific antibodies or other molecules can help combat freezing-induced cell damage. resistance to can be conferred on these cell types. This technique can also be used for organs. will be used.

当業者に良く知られている安定剤及び他の添加剤と不凍化ポリペプチドとの混合 物に基づく組成物及び使用もまた、本発明に包含される。これらの化合物は、腐 敗を阻止し、酸化を阻止し、脱色を防ぎ、微生物の増殖を阻害し、エマルジョン を安定化することができる。Mixing antifreeze polypeptides with stabilizers and other additives well known to those skilled in the art. Compositions and uses based on the invention are also encompassed by the present invention. These compounds Prevents spoilage, prevents oxidation, prevents decolorization, inhibits microbial growth, emulsion can be stabilized.

゛　ポリペプチド゛　−乏　− 不凍化ポリペプチドをコードする天然又は合成の核酸フラグメントが、最終的な 標的発現細胞に導入することができ、そして／又は発現することができる核酸構 造体に導入されるであろう。通常、その核酸構造体は、単細胞又は多細胞宿主、 たとえば酵母又は細菌における複製のために適切であり、そしてまた、培養され た哺乳類又は他の真核細胞系、特に植物のゲノム内への導入及び組込みのために も向けられ得る。細菌又は酵母中への導入のために調製された核酸構造体は、宿 主により認識される複製システム、所望する不凍化ポリペプチド生成物をコード する核酸フラグメント、核酸配列をコードする不凍化ポリペプチドの５′−末端 に連結される転写及び翻訳開始調節配列及びその配列の３′−末端に連結される 転写及び翻訳停止調節配列を含むであろう、転写調節配列は、宿主により認識さ れる異種プロモーターを含むであろう０便利には、不凍化ポリペプチドをコード する配列のための挿入部位と共に、複製システム及び転写及び翻訳１１１ｗ１配 列を含む利用できる発現ベクターが使用され得る。゛゛　Polypeptide゛　-Poor　- A natural or synthetic nucleic acid fragment encoding an antifreeze polypeptide is used in the final Nucleic acid constructs that can be introduced into and/or expressed in target-expressing cells It will be introduced into the structure. Typically, the nucleic acid construct will be present in a unicellular or multicellular host, suitable for replication in e.g. yeast or bacteria and also cultured. for introduction and integration into the genome of mammalian or other eukaryotic cell systems, especially plants. can also be directed. Nucleic acid constructs prepared for introduction into bacteria or yeast are A replication system that is recognized by the master and encodes the desired antifreeze polypeptide product a nucleic acid fragment encoding a nucleic acid sequence, the 5'-end of an antifreeze polypeptide encoding a nucleic acid sequence; a transcription and translation initiation control sequence linked to and linked to the 3'-end of that sequence; Transcription control sequences, which may include transcription and translation termination control sequences, are recognized by the host. Conveniently, the promoter encoding the antifreeze polypeptide may contain a heterologous promoter. Replication systems and transcription and translation 111w1 sequences, along with insertion sites for sequences that Any available expression vector containing a sequence can be used.

その遺伝子は、不凍化ポリペプチドのためのコード配列を含むいづれかの核酸セ グメントを含むであろう０通常、遺伝子はコード配列及び上流及び下流のそれと 関連する配列、特にエンハンサ−、プロモーター、リポソーム結合部位又は転写 開始マーカーを含むであろう。下流セグメントはまた、メツセージポリアデニル 化及びプロセッシングのために重要であり、そして従って、また、通常の場合に も企画される。構造体はさらに、安定化ペプチドパートナ−をコードするＤＮＡ （たとえば植物形質転換のためのキチナーゼをコードするＤＮＡ）を含むことが できる。The gene contains any nucleic acid sequence containing the coding sequence for an antifreeze polypeptide. Typically, a gene contains a coding sequence and upstream and downstream components. Related sequences, especially enhancers, promoters, liposome binding sites or transcription It will contain a start marker. The downstream segment also contains the message polyadenylene important for structuring and processing, and therefore also in the normal case will also be planned. The construct further includes a DNA encoding a stabilizing peptide partner. (e.g. DNA encoding chitinase for plant transformation) can.

発現のために細胞又は細胞群中への遺伝子の導入は、対象のサンプル中へのポリ ペプチドを一般的に導入するためのもう１つの方法である。形質転換の最終生成 物がまた、本発明の生成物として包含され、そして用語“形質転換された細胞” とは、形質転換された実際の細胞及びその細胞のすべての子孫を包含するであろ う。典型的な場合、最終生物は細胞を含み、その細胞の個々は遺伝子を含むであ ろう、標準の形質転換方法が、細胞（Ｍａｎｉａｔｉｓ）　、菌＠　（Ｓｈｅｒ ｖａａｎなど、　（１９８６）ｎ崩ｎ豆■匹匹ｒｓｅハ朋旦ユ肛」口胚韮」Ｌ勤 並り飽匹且■・Ｃ５Ｈ）、植物（ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｅｌｚｅｎなど、（１９８５ ）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、。Introduction of a gene into a cell or group of cells for expression involves the introduction of a gene into a sample of interest. This is another method for introducing peptides in general. Final generation of transformation are also included as products of the invention and are included under the term "transformed cells". shall include the actual transformed cell and all progeny of that cell. cormorant. Typically, the final organism will contain cells, each of which may contain genes. However, standard transformation methods include cells (Maniatis), bacteria @ (Sher vaan et al. (1986) n collapse n bean ■ individual rse ha tomotan yu anal ``mouth germ'' L work (1985 ) Plant Mo1. Biol.

５　：　１４９〜１５４）及び動物（Ｈａｎａｈａｎ、　（１９８Ｂ）　Ａｎｎ 、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＋２２　：　４７９〜５１９）のために存在する。5: 149-154) and animals (Hanahan, (198B) Ann , Rev. Genetics+22: 479-519).

の　゛　−はボッペプチド 本発明はまた、氷結晶の成長抑制活性を示すであろう新規ポリペプチドを生成し 、又は単離するための手段を提供する。゛　- is boppeptide The present invention also generates novel polypeptides that will exhibit ice crystal growth inhibiting activity. or provide a means for isolation.

そのようなポリペプチドの発見は典型的には、その活性をアッセイするために正 確且つ好ましくは、すばやい手段を必要とする。Discovery of such polypeptides typically involves testing for assaying their activity. Reliable and preferably quick means are required.

選択方法は、Ｋｎｉｇｈｔなと、　（１９８８）　斂ｎ坦旦匡江、　２５　：　 ５５〜６０（引用により本明細書に組込まれる）から改良された“スプラットア ッセイ”である。再結晶化は、他を犠牲にしていくつかの結晶の成長を含む、典 型的には、成長は、長く薄い針状体の形で存在しくＤｅＶｒｉｅｓ　（１９８３ ）　−Ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓａｎｄ　Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉ ｅｓ　ｉｎ　Ｃｏ１ｄ−Ｗａｔｅｒ　Ｆｉｓｈ”、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｈ　５ ｉｏ１．＋４５　：　２４５〜２６０、第１図）、そしてこれは感受性の脂質膜 を突き刺し、そして破壊することができる。スプラットアッセイは、冷却された プレート上への適切な緩衝液におけるポリペプチドの溶液の小滴の滴下からなる 。プレート表面上への小滴“スブラッピは急速に凍結し、多くの小さな結晶を形 成し、そして再結晶化工程が、適切な時間の後、眼によりモニターされる。不凍 化ポリペプチドを含むサンプルは、一層低められた結晶サイズを示す。The selection method is Knight (1988), 25: 55-60 (incorporated herein by reference). recrystallization involves the growth of some crystals at the expense of others. Typical, the growths are present in the form of long thin needles and are described by DeVries (1983). ) -Antifreeze peptidesand Glycopepti es in Co1d-Water Fish”, Ann, Rev, Ph 5 io1. +45: 245-260, Figure 1), and this is a sensitive lipid membrane. can be pierced and destroyed. Splat assay cooled Consists of dropping a small drop of a solution of the polypeptide in an appropriate buffer onto the plate . A small droplet on the plate surface freezes quickly and forms many small crystals. formation and the recrystallization process is monitored by eye after a suitable period of time. antifreeze Samples containing conjugated polypeptides exhibit even lower crystal size.

合成相同ポリペプチド、たとえば上記式のポリペプチドは、特定の特徴又は配列 が最っとも効果的であることを決定するために容易にアッセイされ得る。他方、 セグメント自体は容易に増殖された合成核酸セグメントにコードされるので、存 在する配列中への挿入、欠失又は置換が容易に調製され、発現され、そしてアッ セイされる。Synthetic homologous polypeptides, e.g., polypeptides of the above formula, may have specific characteristics or sequences. can be easily assayed to determine which is most effective. On the other hand, The segment itself is encoded by a synthetic nucleic acid segment that is easily propagated, so Insertions, deletions, or substitutions into existing sequences are easily prepared, expressed, and tested. It will be said.

本発明のもう１つの態様においては、不凍化セグメントに含まれるエピトープに 対する抗体が、他の天然に存在するタンパク質における類領するポリペプチド配 列を見出すために産生され得る。北極又は冷水魚の他に、氷点下温度に天然にお いて暴露される昆虫又は他の生物は、タンパク質ブロセ・ノシング不凍化性質に ついて詳しく調べられる他方、遺伝子又は核酸をコードする既知セグメントが、 相同核酸セグメントを選択するために使用され得る。抗体スクリーンは、ポリペ プチド発現に依存し、これは成長的又は条件的に依存するかも知れない。In another embodiment of the invention, the epitope contained in the antifreeze segment Antibodies against similar polypeptide sequences in other naturally occurring proteins can be produced to find the column. In addition to arctic or cold water fish, there are Insects or other organisms that are exposed to On the other hand, known segments encoding genes or nucleic acids are can be used to select homologous nucleic acid segments. Antibody screens are Depending on peptide expression, this may be developmental or conditional.

新規ポリペプチドを選択するためのもう１つの方法は、既知のセグメントを変異 誘発し、そして得られる生成物をアツセイすることである。スプラットアッセイ はまた、本発明において有用であるが、発現細胞のより単純な凍結−融解サイク ルが、−ａ的に、効果的な不凍化ポリペプチドの発現のために、凍結工程に対し て最少の感受性の細胞について選択する。Another method for selecting novel polypeptides is to mutate known segments. and assaying the resulting product. Splat assay are also useful in the present invention, although simpler freeze-thaw cycles of expressing cells are also useful in the present invention. -a, for the expression of effective antifreeze polypeptides, against the freezing step. select for the least sensitive cells.

実　験 次の実験セクションは、例により提供されるが、これらは本発明を制限するもの ではない。experiment The following experimental sections are provided by way of example, but are not intended to limit the invention. isn't it.

一般的に、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素消化、ＤＮＡのアガロース及びポ リアクリルアミドゲル電気泳動、ゲルからのＤＮＡ回収、サザンプロット、ホル ムアルデヒド−アガロースゲル上でのＲＮＡの分離の後のノーザンプロット、Ｄ ＮＡ連結及び細菌性形質転換が標準の方法を用いて行なわれた。Ｍａｎｉａｔｉ ｓなど、（ｅｄ、）、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒＭａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　（１９８２）　（この後、Ｍａｎｉａｔｉｓとして言及し、そして引用 により本明細書に組込まれる）を参照のこと。類似する方法は、Ｗｕなど、　（ ｅｄ、）。Generally, preparation of plasmid DNA, restriction enzyme digestion, agarose and polymerization of the DNA Reacrylamide gel electrophoresis, DNA recovery from gel, Southern blot, hologram Northern plot after separation of RNA on a maldehyde-agarose gel, D NA ligation and bacterial transformation were performed using standard methods. Maniati s etc., (ed,), Mo1ecular C1onin A Labora torManual, Co1d Spring Habor Laborat ory (1982) (hereafter referred to and quoted as Maniatis) (incorporated herein). A similar method is described by Wu et al. ed,).

Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏ　、Ａｃａｄｅｍｉｃ　 Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）　に記載される。次の略語が使用される二合成不凍化 ポリペプチドをコードするＤＮＡ、ｓａｆ；合成不凍化ポリペプチド、Ｓａｆ； β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ、ｂａａ；スタフィロツーカスプロテイン ＡをコードするＤＮＡ、Ｓｐａ。Recombinant DNA Methodolo, Academic Press (1989). Bisynthetic antifreeze where the following abbreviations are used DNA encoding a polypeptide, saf; synthetic antifreeze polypeptide, Saf; DNA encoding β-lactamase, baa; Staphylothucus protein DNA encoding A, Spa.

５ａｆ３〜５ａｆｌＯの組成物は第３図に含まれる。核酸の大きさはｋｂｐであ り、これは二本鎖である場合、キロ塩基対を言及する。The compositions of 5af3-5aflO are included in FIG. The size of nucleic acid is kbp. This refers to kilobase pairs when double-stranded.

例１：β−ラクタマーゼー５ａｆ３−β−ラクタマーゼ融合タンパク質による再 結晶化の阻害 Ａ、入　”　−５ａｆ３の　。Example 1: Reactivation with β-lactamase 5af3-β-lactamase fusion protein Inhibition of crystallization A, enter ”-5af3.

それぞれ７１及び６３個の塩基の２種のＤＮＡ配列を、化学的に合成し、そして −緒にアニールし、ＤＳオリゴ１として示される付着端を有する二本鎖オリゴヌ クレオチドを生成した（第６図を参照のこと）。ＤＳオリゴ１を、ベクターＰＵ Ｃ１１８のＸｍａ　Ｉ及びＰｓｔ１部位間にクローン化し、プラスミドｐ　ＬＶ Ｃ７４を生成した。Two DNA sequences of 71 and 63 bases, respectively, were chemically synthesized and - a double-stranded oligo with cohesive ends annealed together and designated as DS oligo 1; Creotide was produced (see Figure 6). DS oligo 1, vector PU Cloned between the XmaI and Pst1 sites of C118 to create plasmid pLV C74 was produced.

４９個の塩基の２種のＤＮＡ配列を化学的に合成し、そして−緒にアニールし、 ＤＳオリゴ２として示される付着端を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを生成し た（第６図を参照のこと）。ＤＳオリゴ２を、ベクターｐＵｃ１１８のＫｐｎＩ 及びＰｓｔ１部位間にクローン化し、プラスミドｐ　ＬＶＣ７３を生成した。two DNA sequences of 49 bases are chemically synthesized and annealed together; Generate a double-stranded oligonucleotide with cohesive ends, designated as DS Oligo 2. (See Figure 6). DS oligo 2 was added to KpnI of vector pUc118. and Pst1 sites to generate plasmid pLVC73.

プラスミドｐＬＶＣ７３を制限酵素５ａｃＩＩにより処理し、ＤＳオリゴ３とし て示される付着端を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを開放した（第６図を参照 のこと）、ＤＳオリゴ３をプラスミドｐＬＶＣ７４の５ａｃｌ［部位中にクロー ン化し、そして子孫を配列決定することによってスクリーンし、プラスミドｐＬ ＶＣ８２を生成し、ここでＤＳオリゴ３は、センス方向に挿入されることが示さ れた。Plasmid pLVC73 was treated with restriction enzyme 5acII and designated as DS oligo3. The double-stranded oligonucleotide with the cohesive end shown in Fig. 6 was released (see Figure 6). ), DS oligo 3 was cloned into the 5acl site of plasmid pLVC74. plasmid pL and screened by sequencing the progeny. VC82, where DS oligo 3 is shown to be inserted in the sense direction. It was.

ｐＬＶＣ８２における５ａｃＩ［フラグメントを、ここに記載されるように、直 接的は置方で再重複した。再重複制限フラグメントの原理は、Ｇｒｅｅｎなど、 　（１９８８）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、。5acI fragment in pLVC82 directly as described here. Directives overlapped again in terms of placement. The principle of redundant restriction fragments is described by Green et al. (1988) Mo1. Gen, Genet.

２１５　：　１６５〜１７２に記載される。プラスミドｐ　ＬＶＣ８２のＤＮＡ をＲｅｃ＋Ｅ、コリに１２株ＳＫ　１５９２　（Ｗａｒｒｅｎ　＆Ｇｒｅｅｎ、 　（１９８５）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１６１　：　１１０３〜１１１ １）から抽出し、アザロースゲル電気泳動にかけ、そしてプラスミドダイマーに 対応するハンドを切り出し、そしてそのＤＮＡを回収し；この二量体ｐＬＶＣ８ ２を、ｒｅｃＡ−Ｅ、：］ユに１２株Ｊ　Ｃ１０２９１（Ｗｉｌ］ｉｓなど、　 （１９８１）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、。215: 165-172. DNA of plasmid p LVC82 Rec + E, 12 stocks SK 1592 (Warren & Green, (1985) J, Bacteriol, 161: 1103-111 1), subjected to azarose gel electrophoresis, and transformed into plasmid dimers. Excise the corresponding hand and recover its DNA; this dimeric pLVC8 2, recA-E, :] 12 stocks J C10291 (Will) is etc. (1981) Mo1. Gen, Genet.

１８３　：　４９７〜５０４）中への形質転換により増幅した。二量体ｐＬＶＣ ８２を、５ａｃＩ［により一部消化し、そしてアガロースゲル電気泳動にゆだね ；約半分のプラスミドダイマーに対応するバンドを切り出し、そしてそれらのＤ ＮＡを回収し；回収されたＤＮＡのフラグメントを、リガーゼ処理により再環状 化し、そして株ＪＣ１０２９１中に形質転換した。183:497-504). Dimeric pLVC 82 was partially digested with 5acI and subjected to agarose gel electrophoresis. ; Cut out the bands corresponding to about half of the plasmid dimers, and divide their D Collect the DNA; the recovered DNA fragments are recircularized by ligase treatment. and transformed into strain JC10291.

５ａｃＩＩフラグメント−再重複の子孫を、制限分析によりスクリーンし、プラ スミドｐＬＶＣ８３を見出し、ここでＤＳオリゴ３の２つのコピーはタンデムに 存在する。Ｐ　ＬＶＣ８３における不凍化−コード配列は、遺伝子として知られ る。The progeny of the 5acII fragment-reduplication were screened by restriction analysis and found pLVC83, where the two copies of DS oligo3 are in tandem. exist. The antifreeze-coding sequence in P LVC83 is known as a gene. Ru.

Ｂ、ｂａａ−ｓａｆ３−ｂｌａ’　”−”への　。B, baa-saf3-bla' to "-".

プラスミドｐＬＶＣ８３を、制限酵素ＰｓｔＴにより処理し、５ａｆ３配列を含 む約０．１ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを開放した。この短いフラグメントを、 プラスミドｐＢＲ３２（Ｂａｌｂａｓなと、　（１９８６）　Ｇｅｎｅ、　５０ 　：　３〜４０）のＰｓｔ１部位中にクローン化し、そしてその子孫を制限分析 によりスクリーンし、プラスミドｐＬＶＣ８４を見出し、ここで０，１ｋｂｐの フラグメントは指摘された方向にｐＢＲ３２２中に挿入されていることを示され た。これはｐＢＲ３２２のｂｌａ　（βラクタマーゼーコードの）遺伝子の内部 位置に５ａｆ３を挿入し、そしてｂｌａ−ｓａｆ３の上流部分からｂｌａの下流 部分中に読み取り枠を維持する。Plasmid pLVC83 was treated with the restriction enzyme PstT to contain the 5af3 sequence. A DNA fragment of about 0.1 kbp was released. This short fragment Plasmid pBR32 (Balbas Nato, (1986) Gene, 50 :3-40) into the Pst1 site and restriction analysis of the progeny. and found plasmid pLVC84, in which the 0.1 kbp The fragment is shown inserted into pBR322 in the indicated direction. Ta. This is inside the bla (β-lactamase coding) gene of pBR322. 5af3 at position and from the upstream part of bla-saf3 to the downstream of bla Maintain reading frame throughout the section.

Ｃ，ｊの　日　に・　る　−ク　ラーゼ−５ａｆ３−−プラスミドｐｌ、ＶＣ８ ４（遺伝子融合を担持する）及びｐＢＲ３２２（負の対照のために非融合βラク タマーゼを供給するための）を、旦−ユｐＫ１２株ＪＣ１０２９１中に形質転換 した。得られた細菌株を、６００ｎｍ　（０，Ｄ、ｂ。。）で約１．０の光学濃 度にＬｕｒｉａブイヨン（ＬＢ）中において３７°Ｃで増殖し、５Ｓ３４５ｏｒ ｖａｌｌローターにより７．００Ｏｒｐｍで１５分間の遠心分離により収穫し、 そして１０５ＭのＥＤＴＡ／３０５Ｍのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）におけ る高波処理により溶解した。得られた粗細胞抽出物を、例３に詳細に説明される ように再結晶化についてスプラット−冷却アツセイを用いて同時に試験した（Ｋ ｎｉｇｈｔなと、　（１９８Ｂ）斂ＲＪ且国証。C, on the day of j - Kurase-5af3--Plasmid pl, VC8 4 (carrying the gene fusion) and pBR322 (unfused β-lacquer for negative control). to supply tamase) into Dan-yu pK12 strain JC10291. did. The obtained bacterial strain was measured at an optical density of approximately 1.0 at 600 nm (0, D, b...). 5S345or Harvested by centrifugation for 15 minutes at 7.00 rpm in a Vall rotor, and in 105M EDTA/305M Tris-HCl (pH 8,0). It was dissolved by high wave treatment. The crude cell extract obtained was prepared as detailed in Example 3. Recrystallization was simultaneously tested using a splat-cooling assay (K night, (198B) RJ and national ID.

２５　：　５５〜６０）。負の対照においてよりも５倍以上に大きな平均直径に 成長する氷結晶を、融合タンパク質を含むサンプルに比較した。従って、βラク タマーゼー５ａｆ３−βラクタマーゼ畿合タンパク質を含む抽出物は再結晶化を 阻害するが、ところが負の対照は阻害しなかったことが示された。25: 55-60). to an average diameter more than 5 times larger than in the negative control. Growing ice crystals were compared to samples containing the fusion protein. Therefore, β easy Extracts containing tamase 5af3-beta lactamase Kyuai protein undergo recrystallization. However, the negative control showed no inhibition.

これは、そのアミノ−及びカルボキシ−末端で外来性ポリペプチドに結合される 不凍化ペプチドは再結晶化を阻害するように機能することができることを示した 。It is attached to a foreign polypeptide at its amino- and carboxy-terminus. showed that antifreeze peptides can function to inhibit recrystallization .

例２：タンパク質Ａ−３ａｆ５融合タンパク質による再結晶化の阻害及び前記融 合タンパク質の精製。Example 2: Inhibition of recrystallization by protein A-3af5 fusion protein and Purification of synthetic proteins.

Ａ、Ａ　Ｈ’−５ａｆ５の　。A, A H'-5af5.

プラスミドｐ　ＬＶＣ８３を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩ［Ｉにより処 理し、５ａｆ３を含む約０．１ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを得る。このフラグ メントを、ｐＵｃ１１９のＥｃ　ｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌ［部位間にクローン化 し、プラスミドｐＧＭＭｌを得る。ｐＧＭＭｌの内部５ａｃＩＩ７ラグメントを 、例１に記載されるようにして再重複した。この操作の生成物を、制限分析によ りスクリーンし、プラスミドＰＬＶＣ８５を見出し、ここでＤＳオリゴ３の３個 のコピーはタンデムで存在する。ｐＬＶＣ８５における合成配列は遺伝子５ａｆ ４として知られる。ｐＬＶＣ８５の内部５ａｃｌＴフラグメントを、例１に記載 のようにして再重複した。この操作の生成物を制限分析によりスクリーンし、プ ラスミドＰＬＶＣ８６を見出し、ここでＤＳオリゴ３の４個のコピーはタンデム で存在する。ｐ　ＬＶＣ８６における不凍化−コード配列は、遺伝子５ａｆ５と して知られる。Plasmid pLVC83 was treated with restriction enzymes EcoRI and HindI[I. A DNA fragment of approximately 0.1 kbp containing 5af3 is obtained. this flag cloned between the EcoRI and Hindll sites of pUc119. and obtain plasmid pGMM1. The internal 5acII7 fragment of pGMMl , was reduplicated as described in Example 1. The products of this operation were analyzed by restriction analysis. and found plasmid PLVC85, in which three of the DS oligos 3 Copies of exist in tandem. The synthetic sequence in pLVC85 is gene 5af Known as 4. The internal 5aclT fragment of pLVC85 is described in Example 1. I duplicated it again like this. The products of this operation were screened by restriction analysis and found the lasmid PLVC86, where four copies of DS oligo 3 are in tandem. exists in The antifreeze-coding sequence in pLVC86 is the gene 5af5 and It is known as

Ｂ、ｓ　ａ−ｓａｆ５’　−ムの　。B, sa-saf5'-mu.

プラスミドｐＬＶＣ８６（ｓａｆ５を含む）及びｐＲＴＴ５　（ｓｐａ遺伝子を 含む）（Ｎｉｌｓｓｏｎなど、　（１９８５）　ＥＭＢＯＪ、、　４　：１０７ ５〜１０８０）の両者を、制限酵素ＸｍａＴ及びＰｖｕ　Ｉにより消化し、そし て約１，６ｋｂｐ及び２．３ｋｂｐのフラグメントをそれぞれの消化物から単離 した。その単離されたフラグメントを一緒に連結し、プラスミドｐＲＬＭ１０５ を生成した。これは、ｓｐａ　（スタフィロツーカスプロテインＡ−コードの） から下流に５ａｆ５を配置し、そしてｓｐａ遺伝子〜５ａｆ５を読み取り枠を整 合して維持する。Plasmids pLVC86 (containing saf5) and pRTT5 (containing the spa gene) (including) (Nilsson et al., (1985) EMBOJ, 4:107 5-1080) with restriction enzymes XmaT and PvuI, and Fragments of approximately 1.6 kbp and 2.3 kbp were isolated from each digest. did. The isolated fragments were ligated together and plasmid pRLM105 was generated. This is spa (staphylothucus protein A-code) 5af5 downstream from the spa gene and align the open reading frame of the spa gene ~5af5. and maintain it.

Ｃ０′の　８　に・　るブローインＡ−３ａｆ５　ム　ンブラスミドｐＲＬＭ１ ０５　（融合遺伝子を担持する）及びｐＲＩＴ５（負の対照のために非融合プロ ティンＡを供給するための）を、旦−ユユに１２株５Ｋ１５９２中に形質転換し た。得られた株からの粗抽出物を、例１におけるようにして得、そして例３にお けるようにして再結晶化について試験した。負の対照においてよりも５倍以上に 大きな平均直径に成長する氷結晶を、融合タンパク質を含むサンプルに比較した 。従って、プロティンＡ−３ａｆ５融合タンパク質を含む抽出物は再結晶化を阻 害し、ところが負の対照は阻害しなかったことが示された。例３は、純粋な形で のこの融合タンパク質についてのデータを提供する。Blow-in A-3af5 mum plasmid pRLM1 at 8 of C0' 05 (carrying the fusion gene) and pRIT5 (carrying the non-fusion gene for negative control). to provide Tin A) was transformed into Dan-Yuyu 12 strain 5K1592. Ta. The crude extract from the resulting strain was obtained as in Example 1 and as in Example 3. It was tested for recrystallization as follows. 5 times more than in the negative control Ice crystals growing to a large average diameter were compared to samples containing the fusion protein. . Therefore, extracts containing protein A-3af5 fusion protein inhibit recrystallization. However, the negative control showed no inhibition. Example 3 is in pure form provides data about this fusion protein.

これは、外来性異種ポリペプチドにそのアミン末端により結合される不凍化ペプ チドが再結晶化を阻害するように機能することを示した。This is an antifreeze peptide that is attached by its amine terminus to a foreign, heterologous polypeptide. showed that tide functions to inhibit recrystallization.

Ｄ、ブローインＡ−３ａｆ５”　ンパク　の　１゜プラスミドｐＲＬＭ１０５を 担持する旦エユＪＫ１２株５Ｋ１５９２を、約１．０のＯ，Ｄ、ｈｏ。に達する まで、５０μｇ＋ｓ１０＋１のアンピシリンを含む１００ｍ１のＬｕｒｉａブイ ヨン（ＬＢ）中において３７°Ｃで培養した。細胞を、５３３４０−ターによる ３、ＯＯＯｒｐｍでの５分間の遠心分離によりペレット化し、そして３０■Ｈの トリス（ｐＨ８，１）１０ｓ＋１に再懸濁した。すべての続く操作は、０″〜４ °Ｃで行なわれた。D, 1° plasmid pRLM105 of broin A-3af5” protein Carrying DanEyu JK12 strain 5K1592 at an O,D,ho of approximately 1.0. reach up to 100 ml of Luria buoy containing 50 μg + s10+1 ampicillin. The cells were cultured at 37°C in LB (LB). cells by 53340-tar 3. Pellet by centrifugation for 5 minutes at OOOrpm and incubate for 30 hours. Resuspended in 10s+1 Tris (pH 8,1). All subsequent operations are 0″ to 4 It was carried out at °C.

前記のような２回目の遠心分離の後、細胞を、２０％（Ｗ／■）スクロース／３ ０＋ａＭのトリス−ＭＣＩ　（ｐＨ８，１）２４−１中に再懸濁した。０．１Ｍ のＥＤＴＡ　（ｐＨ７，３）中、１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム２，４ｍｌを添加し た０次に、細胞を氷上で３０分間維持し、そして続いて、３３３４０−グーによ り１１．５００ｒｐ−で１５分間、遠心分離した。上清液を取り、そして融合タ ンパク質を、ＩｇＧ−セファロース上でのクロマトグラフィー処理によりそれか ら精製した。After a second centrifugation as described above, cells were incubated with 20% (W/■) sucrose/3 Resuspend in 0+aM Tris-MCI (pH 8,1) 24-1. 0.1M Add 2.4 ml of 1 mg/ml lysozyme in EDTA (pH 7.3). Cells were then kept on ice for 30 minutes and subsequently incubated with 33340-Glue. The mixture was centrifuged at 11.500 rpm for 15 minutes. Take the supernatant and add the fusion tube. Proteins were isolated by chromatography on IgG-Sepharose. It was purified from

ＩｇＧ−セファロース１．５１を含むカラムを、２０ｓ＋ｌのＴＳＴ（１５０ｄ のＮａＣ１，０，０５％の↑−ｅｅｎ　２０．５０μｍＭのトリス−ＭＣＩ、ｐ Ｈ７，６）の通過により洗浄した。次に、それを、（ｉ）０．５Ｍの酢酸、ｐＨ ３，４、（ｉｉ）ＴＳＴ及び（ｉｊ）０．５Ｍの酢酸、ｐＨ３，４のそれぞれを ４ｍｌを連続的に通すことによって使用のために調製した。ＴＳＴを再び、その 流出緩衝液が中性ｐＨに達するまで通した。細胞周辺画分をそのカラムに通用し 、そして１５−１のＴＳＴ及び３−１の５　ｍＭ　Ｃ）Ｔ　３　ＣＯｚ　Ｎ　Ｈ ａを連続的に通した。プロティンＡ−３ａｆ５融合タンパク質を、０．５Ｍの酢 酸（ｐＨ３，４）２０＋１により溶出し、そしてその溶出された両分を２８０ｎ ｍでの吸光度によりモニターＬ　（Ａｔｅ。＝約２．　６ｍｇ／ｍｌタンパク質 のために１．０）ｉ吸光度が有意なタンパク質含有量を示す画分をポリプロピレ ン微小遠心分離管中で凍結乾燥せしめ、そして１０ｍＭのＥＤＴＡ／３０ｍＰＩ のトリス−ＭＣＩ（ｐＨ８，０）中に再懸濁し、０．４４１ｇ／ｍｌの最終濃度 にした。精製された融合タンパク質の溶液を４°Ｃで貯蔵した。この融合タンパ ク質の調製物は、Ｓ、ＤＳ　（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の存在下でのポリアクリルア ミドゲル電気泳動により示され、そして続いて、クーマシーブリリアントブルー による染色によるタンパク質の可視化により示される場合、実質的に純粋であっ た。The column containing IgG-Sepharose 1.51 was heated with 20s+l of TST (150d NaC1, 0,05% ↑-een 20.50 μM Tris-MCI, p Washed by passing H7,6). It was then combined with (i) 0.5M acetic acid, pH 3,4, (ii) TST and (ij) 0.5M acetic acid, pH 3,4, respectively. Prepared for use by passing 4 ml successively. TST again, its The effluent buffer was passed until it reached neutral pH. Pass the pericellular fraction through the column. , and 15-1 TST and 3-1 5mM C)T3COzNH a was passed continuously. Protein A-3af5 fusion protein was added to 0.5M vinegar. Elute with acid (pH 3, 4) 20+1, and both eluted portions are eluted with 280n Monitor L by absorbance at m (Ate. = approx. 2.6 mg/ml protein 1.0)i absorbance indicates significant protein content by polypropylene 10mM EDTA/30mPI resuspended in Tris-MCI (pH 8,0) to a final concentration of 0.441 g/ml. I made it. The purified fusion protein solution was stored at 4°C. This fusion Tampa Preparations of proteinaceous materials were prepared by polyacrylic acid in the presence of S,DS (SDS-PAGE). shown by midgel electrophoresis and subsequently Coomassie brilliant blue substantially pure as indicated by visualization of the protein by staining with Ta.

例３：水、ポブシクル混合物及びＡ＆Ｂ冷凍ルートビアーフロート混合物におけ る、精製されたプロティンＡ−３ａｆ５融合タンパク質による再結晶化の阻害。Example 3: In Water, Pobsicle Mixture and A&B Frozen Root Beer Float Mixture Inhibition of recrystallization by purified protein A-3af5 fusion protein.

Ａ、水及差並ｉ巨ｌ。A, water and difference i big l.

スプラットアッセイは次のことから成る：１０μｌの精製されたプロティンＡ− ３ａｆ５融合タンパク質（例２Ｄで製造された）を水９０μｌに添加し、そして 使用するまで、氷上で維持した。対照として、１０μｍのプロティンＡ溶液（２ ０ｓ＋Ｍのトリス−ＭＣＩ　（ｐＨ８，０）中、０．　５ｍｇ／ｍｌ）を水９０ μｍに添加し、そしてまた使用するまで、氷上で維持した。融合タンパク質又は 対照としてプロティンＡを含む液滴１０μｌを含む水性サンプルの液滴１０μｌ を、３．０ｍの高さから開放し、そしてドライアイス（約−７５°Ｃ）のブロッ ク上にあるみがかれたアルミニウムプレート上での衝撃を可能にした。前記液滴 が冷された金属の表面と接解するにつれて、それは即座に凍結し、そしてひじよ うに小さな氷結晶の組成を有する、直径約１０ｍｍ及び厚さ５０μｍｍの“スプ ラット”を形成する。次にそのスプラットを、冷たい炭素鋼の手術用刃（Ｂ−Ｐ 　＃１０）により、切開顕微鏡上に備えられるガラス低温台に移した。The splat assay consists of: 10 μl of purified protein A- Add the 3af5 fusion protein (produced in Example 2D) to 90 μl of water and It was kept on ice until use. As a control, a 10 μm protein A solution (2 0s+M in Tris-MCI (pH 8,0). 5mg/ml) in water 90% μm and kept on ice until further use. fusion protein or 10 μl droplet of aqueous sample with 10 μl droplet containing protein A as control. was released from a height of 3.0 m and placed in a block of dry ice (approximately -75°C). impact on the polished aluminum plate on the top. the droplet As it welds with the cooled metal surface, it freezes instantly and A “splash” with a diameter of about 10 mm and a thickness of 50 μmm has a composition of extremely small ice crystals. The splats are then cut with a cold carbon steel surgical blade (B-P #10), the sample was transferred to a glass cryostat provided on the dissection microscope.

再結晶化の写真：すべでの場合において、プロティンＡ−５ａｆ５融合タンパク 質を含むサンプルを、まずスプラット化し、その後すぐに（１分以内）、対照サ ンプルをスプラット化した０次に、スプラットを移し、そしてガラス低温台上に お互い次々に配置した。低温台を、７０％エタノールを含む循環水槽（Ｎｅｓｌ ａｂ　ｅｘａｃａｌ　ｍｏｄｅｌ　ＥＸ−３００）に連結し、そしてこれは、フ ロースルークーラー（Ｎｅｓｌａｂ　ａ＋ｏｄｅｌ　ＥＮ−３５０）に連結され た。スプラットがガラスと接触する点での温度は、−６°Ｃ〜−８　”Ｃに維持 された。このガラス低温台を、直交する偏光レンズ間の顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ　ｍ ｏｄｅｌ　４７５０５２）上に配置した。顕微鏡に３５１１ＩＩのカメラ（Ｚｅ ｉｓｓ　ｎ＋ｏｄｅｌ　Ｍ２Ｓ　）を固定し、そしてスプラットを、Ｘｏｄａｋ 　Ｔｒｉ−Ｘ　Ｐａｎｃｈｒｏｍａｔｉｃ　ＡＳＡ４００白黒フィルムを用いて 写真を取った。Photo of recrystallization: in all cases protein A-5af5 fusion protein The sample containing the quality is first splatted and then immediately (within 1 minute) the control sample is splatted. The sample was made into a splat, transferred to the splat, and placed on a glass cryogenic table. They were placed one after another. The low temperature table was placed in a circulating water tank (Nesl) containing 70% ethanol. ab exacal model EX-300), and this Connected to low-through cooler (Neslab a+odel EN-350) Ta. The temperature at the point where the splat contacts the glass is maintained at -6°C to -8”C It was done. This glass cryogenic table was placed under a microscope (Zeiss m) between orthogonal polarizing lenses. odel 475052). 3511II camera (Ze) on the microscope iss n+odel M2S), and the splat is Using Tri-X Panchromatic ASA400 black and white film I took a photo.

スプラット化及び移行の後、最初の数分以内に、プロティンＡ−３ａｆ５融合タ ンパク質を含むサンプル及びプロティンＡのみを含む対照サンプルの両者は、そ れらが均等なひじょうに小さな氷結晶を示すことにおいてひしように類似するよ うに思えた。スプラットは、少なくとも１時間、これらの条件下で維持され、そ して倍率下である間隔で写真を取られた。第７Ａ図のスライド１−１は、凍結及 び移行の後すぐでの（５分）、低倍率（１２Ｘ）の２つのスプラットを示す。Within the first few minutes after splatting and migration, the protein A-3af5 fusion protein Both the sample containing protein and the control sample containing only protein A They are similar to limestone in that they exhibit even, very small ice crystals. It seemed like a sea urchin. The splats are kept under these conditions for at least 1 hour and then Photographs were taken at certain intervals under magnification. Slide 1-1 of Figure 7A shows frozen and Two splats are shown at low magnification (12X) immediately after transfer (5 minutes).

右側のスプラットは、０．　１ｍｇ７’ａｌの合計タンパク質濃度で融合タンパ ク質混合物を含む、左側の対照スプラットは、０．１ｍｇ／＋ｎｌの濃度でプロ ティンＡのみを含む。次の３個のスライドは、時間にわたっての高い倍率（２０ ｘ）の再結晶化を示す。１５分でのスライド１−２．３０分でのスライド１−３ 、及び１時間でのスライド１−４゜この図は、１５分後、プロティンＡのみを含 むスプラット（対照）が氷結晶の大きさにおける明確な上昇を示し、そしてプロ ティンＡ−３ａｆ５融合タンパク質を含むサンプルは、それが最初に観察される 場合とほとんど同じように見えたことを示す。写真は、このアッセイ及び続くス プラットアッセイにおける平均の結晶の直径を測定するために、眼によって調べ られた。対照スプラット中の結晶は時間にわたって成長し続け、そして１時間後 、それらの元の直径の少なくとも１０倍になり、そしてプロティンＡ−３ａｆ５ 融合タンパク質を含むスプラットは結晶の成長の徴候を示さず、そして事際、そ れが最初に移される場合とほぼ同じように見えた（第７Ａ図を参照のこと）。The splat on the right is 0. Fusion protein at a total protein concentration of 1 mg 7’al. The control splat on the left containing the protein mixture was treated with protein at a concentration of 0.1 mg/+nl. Contains only tin A. The next three slides show high magnification (20 x) shows recrystallization. Slide 1-2 in 15 minutes.Slide 1-3 in 30 minutes , and slides 1-4 at 1 hour. This figure shows that after 15 minutes, only protein A was present. The splats (control) show a clear increase in ice crystal size, and the Samples containing the Tin A-3af5 fusion protein are the first observed Indicates that it looked almost the same as the case. The photos show this assay and the following steps. Examine by eye to measure the average crystal diameter in the Pratt assay It was done. Crystals in the control splat continued to grow over time and after 1 hour , at least 10 times their original diameter, and protein A-3af5 Splats containing the fusion protein show no signs of crystal growth and, in fact, It looked much the same as when it was first transferred (see Figure 7A).

従って、負の対照における結晶の平均直径は、実験サンプルにおける結晶の直径 の少なくとも１０倍になった。これは、不凍化成分を含む実質的に純粋な融合タ ンパク質が凍結水において再結晶化を阻害することができることを示した。Therefore, the average diameter of the crystals in the negative control is the diameter of the crystals in the experimental sample It's at least 10 times more expensive. This is a virtually pure fusion product containing antifreeze components. It was shown that proteins can inhibit recrystallization in frozen water.

Ｂ、ポブシクル°へ　におしる　。B. Go to Pobcicle°.

すべての実験条件は、上記３Ａについて記載される通りであるが、但し、水の代 わりに、プロティンＡ−３ａｆ５融合タンパク質がボプシクルからの融解サンプ ルに添加された。All experimental conditions were as described for 3A above, with the exception that water was replaced with In contrast, the protein A-3af5 fusion protein added to the file.

そのサンプルは、Ｅｓｋｉｍｏ　（商標）ブランドのＴｗｉｎＰｏｐ　（バナナ 風味）であった。成分は次の通りであった：水、糖、コーン甘味剤、クエン酸、 セルロースガム、カラゲーナン、人工風味剤、ビタミンＣ１人工着色剤及びＦＤ ＆Ｃイエロー＃５゜この製品はＴｏｍｏｒｒｏｗ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｉｎｃ −、ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ、　ＣＡにより販売されている。この実験における対 照として、１０μｍの緩衝液（２０＋ｗＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８゜０）が、 サンプル緩衝液における５ａｆ５融合タンパク質１０μｍの代わりに、融解サン プルに添加された。The sample was Eskimo(TM) brand TwinPop (Banana flavor). Ingredients were: water, sugar, corn sweetener, citric acid, Cellulose gum, carrageenan, artificial flavoring agent, vitamin C1 artificial coloring agent and FD &C Yellow #5゜This product is from Tomorrow Products, Inc. -, Los Angeles, CA. The pair in this experiment As a reference, 10 μM buffer (20+wM Tris-HCl, pH 8°0) was Instead of 10 μM of 5af5 fusion protein in sample buffer, molten sample Added to pull.

この方法は、室温で菓子類の小片を融解し、少量を取り出し、Ｓａｆ融合タンパ ク質（又は対照については緩衝液）を添加し、１０ｕｌのサンプルをスプラット し、そして時間にわたっての再結晶化を写真に取ることから成った。添加は全体 積の５％であり、そしてＳａｆ融合融合タンパク質物合物終濃度はＯ，ＩＢ／ｍ ｌであった。最初の写真は、スプラソティングの後５分以内に取られ、そして残 る写真は、１５分、３０分及び１時間での再結晶化を示す。すべてのサンプルは 、同じ倍率（２０倍）で写真を取られた。This method involves melting a small piece of confectionery at room temperature, removing a small amount, and using the Saf fusion protein. Add protein (or buffer for controls) and splat 10ul of sample. and then photographed the recrystallization over time. Addition is total and the final Saf fusion protein compound concentration was O,IB/m It was l. The first photo was taken within 5 minutes after suprasoting and the remaining The photographs shown show recrystallization at 15 minutes, 30 minutes and 1 hour. All samples are , photos were taken at the same magnification (20x).

スプラットし、そして低温段階へのサンプルの移行の後、それらは、氷結晶の大 きさにおいてひじょうに類似するように見えた。−６°Ｃ〜−８°Ｃでの１時間 の維持の後、緩衝液のみが添加されたサンプルは、結晶の平均サイズが目だって 大きいので、再結晶化し、ところがプロティンＡ−３ａｆ融合タンパク質が添加 されたサンプルは、いづれの有意な結晶成長も示さなかったことが明らかになっ た（第７Ｂ図を参照のこと）。これは、不凍化成分を含む融合タンパク質が市販 の冷凍食品混合物において再結晶化を阻害することができることを示した。After splatting and transferring the samples to the cold stage, they are large in size of ice crystals. They appeared to be very similar in size. 1 hour at -6°C to -8°C After maintenance, samples to which only buffer was added showed a noticeable average crystal size. Because it was large, it was recrystallized, but protein A-3af fusion protein was added. It was found that the samples tested did not show any significant crystal growth. (See Figure 7B). This is because fusion proteins containing antifreeze components are commercially available. It was shown that recrystallization can be inhibited in frozen food mixtures.

Ｃ，Ａ＆Ｗｉ　ルートビアーフロート　八　にお番る　。C, A & Wi Root Beer Float 8th.

すべての実験条件は例３Ａと同じであるが、但し、水の代わりに、プロティンＡ −３ａｆ５融合タンパク質が、冷凍Ａ＆Ｗ　（ＦＪｔりルートビアーフロートバ ーからの融解サンプルに添加された。サンプルは、ルートビアー殻及びバニラア イスクリームの混合材料であった。その成分は次の通りであった：乳脂肪及び非 脂肪ミルクを含むアイスクリーム、コーン甘味剤、糖及び乳清（グアーガムによ り安定化された）、モノ−及びジグリセリド（保存剤として添加されたクエン酸 を含む）、食品のキサンチンガム及びカラゲーナン（人工的に風味された）。ル ートビアー殻は、水、糖、コーンシロ・ノブ、グアーガム、カラメル着色剤、人 工及び天然の風味剤及びナトリウムベンゾエートを含む。その製品は、Ｍｅｒｒ ｉｔｔ　Ｆｏｏｄｓ（プラント＃２９−４０９）＋　２８４０　Ｇｕｉｎｏｔｌ ｅ、　Ｋａｎｓａｓ　Ｃ１ｔｙ、　ＭＯにより製造された。対照として、１０μ ｍの緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＭＣＩ、ｐＨ８，０）が、同じ緩衝液における １０μｌのプロティンＡ−３ａｆ５融合タンパク質の代わりに融解サンプルに添 加された。All experimental conditions were the same as in Example 3A, except that instead of water, protein A -3af5 fusion protein was added to frozen A&W (FJt root beer float). was added to the thawed sample from Samples include root beer shells and vanilla beans. It was a mixed ingredient for ice cream. Its ingredients were: milk fat and non-fat. Ice cream containing fatty milk, corn sweeteners, sugar and whey (with guar gum) (stabilized), mono- and diglycerides (citric acid added as preservative) (including), xanthine gum and carrageenan (artificially flavored) in foods. le Beer shells contain water, sugar, corn syrup, guar gum, caramel coloring, and human Contains engineered and natural flavoring agents and sodium benzoate. The product is Merr itt Foods (plant #29-409) + 2840 Guinotl e, Kansas C1ty, MO. As a control, 10μ m buffer (20mM Tris-MCI, pH 8,0) in the same buffer. Add 10 μl of Protein A-3af5 fusion protein to the thawed sample instead. added.

この方法は、室温で菓子類の小片を融解し、少量を取り出し、Ｓａｆ融合融合タ ンパクズは対照については緩衝液）を添加し、１０μ！のサンプルをスプラット し、そして時間にわたっての再結晶化を写真に取ることから成った。添加は全体 積の５％であり、そしてＳａｆ融合融合タンパク質物合物終濃度はＯ，１ｍｇ／ ｍｌであった。最初の写真は、スブラソティングの後５分以内に取られ、そして 残る写真は、１５分、３０分及び１時間での再結晶化を示す。すべてのサンプル は、同じ倍率（２０倍）で写真を取られた。This method involves melting a small piece of confectionery at room temperature, removing a small amount, and For control, add buffer) and add 10μ! Splat a sample of and then photographed the recrystallization over time. Addition is total and the final concentration of Saf fusion protein compound was O, 1 mg/ It was ml. The first photo was taken within 5 minutes after sowing, and The remaining photographs show recrystallization at 15 minutes, 30 minutes and 1 hour. all samples were photographed at the same magnification (20x).

二のサンプルによるスプラット分析の結果は、対照のスプラットが、１時間後、 氷結晶の成長の明確な上昇を示すが、ところがプロティンＡ−Ｓａｆ５融合タン パク質を含むサンプルは、同じ時間にわたって、ひじょうに小さな氷の結晶の成 長を示したことにおいて、初めの２つのサンプルに類似した（第７Ｃ図を参照の こと）、これは、不凍化成分を含む融合タンパク質が市販のアイスクリーム含有 冷凍食品において再結晶化を阻害することができることを示した。The results of the splat analysis using the second sample showed that the control splats after 1 hour However, protein A-Saf5 fusion protein showed a clear increase in ice crystal growth. Samples containing protein showed the formation of very small ice crystals over the same period of time. similar to the first two samples (see Figure 7C) in exhibiting length ), which means that the fusion protein containing the antifreeze component is used in commercially available ice creams. It has been shown that recrystallization can be inhibited in frozen foods.

例４ニブロチインＡ−３ａｆ６融合タンパク質による再結晶化の阻害。Example 4 Inhibition of recrystallization by nibrotiin A-3af6 fusion protein.

Ａ、ム　’　”’−５ａｆ６の　。A, MU’’”’-5af6’s.

それぞれ１９個の塩基の２種のＤＮＡ配列を化学的に合成し、そして−緒にアニ ールし、ＤＳオリゴ４として示される付着端を有する二本鎖オリゴヌクレオチド を製造した（第６図を参照のこと）、プラスミドｐ　（、ＭＭ　１を制限酵素Ａ ａｔ■及びＸｍａｌにより処理し、そして開放されてＤＮＡの０．４７ｋｂｐフ ラグメントを分離し、そして精製した。別々の反応において、プラスミドｐＧＭ Ｍ１をまた、制限酵素Ａａｔｌｌ及びＮｈｅ■により別々に処理し、そして開放 されたＤＮＡの２．７ｋｂｐフラグメントを分離し、そして精製した。Two DNA sequences of 19 bases each were chemically synthesized and then animated together. double-stranded oligonucleotide with cohesive ends designated as DS oligo 4 (see Figure 6), plasmid p (, MM1) was digested with restriction enzyme A processed by at■ and The fragment was isolated and purified. In separate reactions, plasmid pGM M1 was also treated separately with the restriction enzymes Aatll and Nhe and released A 2.7 kbp fragment of the isolated DNA was isolated and purified.

これらの０．４７ｋｂｐ及び２，７ｋｂｐのフラグメントを、ＤＳオリゴ４と一 緒に連結し、プラスミドｐＧＪ　１５１を生成した。この操作は、ｐＧＭＭｌに 存在する５ａｆ３遺伝子へのＤＳオリゴ４の配列の置換効果を示した。ｐＧＪ１ ５１における不凍化コード配列は、遺伝子５ａｆ６として知られている。These 0.47kbp and 2.7kbp fragments were combined with DS oligo 4. ligated together to generate plasmid pGJ151. This operation is performed on pGMMl. The effect of replacing the DS oligo 4 sequence on the existing 5af3 gene is shown. pGJ1 The antifreeze coding sequence in 51 is known as gene 5af6.

Ｂ、ｓ　ａ−ｓａｆ６’−”の　。B, sa-saf6'-''.

ｓｐａ遺伝子含有プラスミドＰＲＬＭＩＯＩを、５ａｆ６のためのベクターとし て使用した。ＰＲＬＭＩＯＩは、ＰＲＩＴ５に由来するｓｐａ遺伝子を含む、ｐ ＲＬＭｌｏｌの構成は、この文章に説明されている。プラスミドｐＧＭＭ１を、 制限酵素Ｘｍａｌ及びＰｖｕ　Ｉにより処理し、そして開放されたＤＮＡの１． ７５ｋｂｐフラグメントを分離し、そして精製した。プラスミドｐＲＩＴ５をま た、Ｘｍａ　Ｉ及びＰｖｕＩにより処理し、そして２．３ｋｂｐのフラグメント を精製した。その精製された１、７５及び２．３ｋｂｐのフラグメントを一緒に 連結し、プラスミドｐＧＭＭ２を生成した。プラスミドｐＧＭＭ２をＰｓｔｌに より消化し、そして開放されたＤＮＡの４．　２ｋｂｐフラグメントを精製し、 そしてＴ４　ＤＮＡリガーゼにより処理し、プラスミドＰＲＬＭＩＯＩを生成し た。The spa gene-containing plasmid PRLMIOI was used as a vector for 5af6. I used it. PRLMIOI contains the spa gene derived from PRIT5. The configuration of RLMlol is explained in this article. Plasmid pGMM1, 1. of the DNA treated with restriction enzymes Xmal and Pvu I and released. A 75 kbp fragment was isolated and purified. Plasmid pRIT5 was treated with XmaI and PvuI, and a 2.3 kbp fragment was purified. The purified 1, 75 and 2.3 kbp fragments were combined ligated to generate plasmid pGMM2. Plasmid pGMM2 to Pstl 4. of more digested and released DNA. Purify the 2kbp fragment, Then, it was treated with T4 DNA ligase to generate plasmid PRLMIOI. Ta.

プラスミドｐＲＬＭ１０１及びｐＧＪ１５１をそれぞれ、制限酵素ＮｃｏＩ及び Ｐｖｕ　Ｉにより処理し、そして約２６３ｋｂｐ及び１．８ｋｂｐのフラグメン トを、それぞれの消化物から単離した。その単離されたフラグメントを一緒に連 結し、プラスミドｐＬＶＣ９４を生成した。これは、５ａｆ６をＳｐａ遺伝子の 下流に配置し、そしてｓｐａ遺伝子〜５ａｆ６を読み枠を整合して維持する。Plasmids pRLM101 and pGJ151 were digested with restriction enzymes NcoI and Pvu I and fragments of approximately 263 kbp and 1.8 kbp were isolated from each digest. The isolated fragments are linked together. ligation to generate plasmid pLVC94. This indicates that 5af6 is the Spa gene. is placed downstream and maintains the spa gene ~5af6 in aligned reading frame.

Ｃ０ｉの　に・　るプローインＡ−３ａｆ６　ム　ンパＬ！生重来・ プラスミドｐ　ＬＶＣ９４を、プラスミドｐＬＶＣ９４を担持する旦−ユユに１ ２ＪＣ１０２９１中に形質転換し、そし”ＣｐＬＶＣ９４を担持する誘導体株を 、１．３０のＯ，Ｄ、ｂｏ。C0i's pro-in A-3af6 Mumpa L! Ikujuki・ Plasmid pLVC94 was added to the tank carrying plasmid pLVC94. 2JC10291 and the derivative strain carrying “CpLVC94” , 1.30 O, D, bo.

に達するまで、３７℃でＬＢ　１０ｍ１中において培養した。The cells were cultured in 10 ml of LB at 37° C.

細胞を、６．　ＯＯＯｘ　ｇで５分間の遠心分離により収穫し、そして細胞抽出 物を、１０ｍＭのＥＤＴＡ、３ＣｍＭのトリス−ＨＣ１％ｐＨ８，０の溶液０． ５ｍｌにおいて４℃で音波処理することによって調製した。水における再結晶化 に対する細胞抽出物に存在するプロティンＡ−３ａｆ６融合タンパク質の効果を 、例１においてβラクタマーゼー５ａｆ３−βラクタマーゼ融合タンパク質につ いて記載されるようにして測定した。再結晶化は、負の対照においてよりも低か った：対照における結晶サイズは、プロティンＡ−５ａｆ６サンプルにおけるよ りも少なくとも３倍大きくなった。これは、外来性融合パートナ−のポリペプチ ドにそのアミノ末端により結合される５ａｆ６が再結晶化を阻害するように機能 することができることを示した。cells, 6. Harvest by centrifugation for 5 min at OOOx g and cell extraction The material was added to a solution of 10mM EDTA, 3CmM Tris-HC 1% pH 8.0. Prepared by sonication in 5 ml at 4°C. Recrystallization in water The effect of protein A-3af6 fusion protein present in cell extracts on , for the β-lactamase 5af3-β-lactamase fusion protein in Example 1. Measurements were made as described. Is recrystallization lower than in the negative control? The crystal size in the control was similar to that in the protein A-5af6 sample. The size was also at least three times larger. This is an exogenous fusion partner polypeptide. 5af6, which is bound by its amino terminus to the molecule, functions to inhibit recrystallization. showed that it can be done.

例５ニブロチインＡ−３ａｆ８融合タンパク質による結晶化の阻害。Example 5 Inhibition of crystallization by nibrotiin A-3af8 fusion protein.

Ａ、ｘ　”　−５ａｆｅの　。A, x”-5afe.

それぞれ２１及び２９個の塩基の２種のＤＮＡ配列を化学的に合成し、そして− 緒にアニールし、ＤＳオリゴ５として示される付着端を有する二本鎖オリゴヌク レオチドを生成した（第６図を参照のこと）、プラスミドｐｃＪ１５１を制限酵 素Ｐｓｔｌ及びＡａｔＩＩにより処理し、そして開放されたＤＮＡの約０．９ｋ ｂｐフラグメントを分離し、そして精製した。プラスミドｐＧＭＭ１を制限酵素 ＡａｔｌＩ及びＨｉｎｄ■により処理し、そして開放されたＤＮＡの２，４ｋｂ ｐフラグメントを分離し、そして精製した。これらの０．９ｋｂｐ及び２．４ｋ ｂｐのフラグメントをＤＳオリゴ５と一緒に連結し、プラスミドｐＧＭＭ３を生 成した。この操作は、ｐｃＪｌ　５１に存在する５ａｆ６遺伝子中へのＤＳオリ ゴ５の配列の置換の効果を有する。ｐ（、ＭＭ３における不凍化コード配列は遺 伝子５ａｆ８として知られている。Two DNA sequences of 21 and 29 bases, respectively, were chemically synthesized, and- A double-stranded oligonucleotide with cohesive ends annealed together and designated as DS oligo 5 Plasmid pcJ151, which produced leotide (see Figure 6), was digested with restriction enzymes. About 0.9k of DNA was treated with Pstl and AatII and released. The bp fragment was isolated and purified. Plasmid pGMM1 with restriction enzyme 2.4 kb of DNA treated and released with AatlI and Hind■ The p fragment was isolated and purified. These 0.9kbp and 2.4k The bp fragment was ligated together with DS oligo 5 to generate plasmid pGMM3. accomplished. This operation involves inserting the DS origin into the 5af6 gene present in pcJl 51. This has the effect of replacing the sequence of Go5. p(, the antifreeze code sequence in MM3 is It is known as gene 5af8.

Ｂ、ｓ　ａ−ｓａｆ　”’−”の　。B, sa-saf “’-”.

プラスミドｐＲＬＭ１０１を制限酵素Ｎｃｏｌ及びＰｖｕＩによりそれぞれ処理 し、そして約２．３ｋｂｐ及び１．８ｋｂｐのフラグメントをそれぞれの消化物 から単離した。単離されたフラグメントを一緒に連結し、プラスミドｐＬＶＣ９ ５を生成した。これは、５ａｆ８を５ｐａ遺伝子の下流に配置し、そしてｓｐａ 遺伝子〜５ａｆ８を読み取り枠を整合して維持する。Plasmid pRLM101 was treated with restriction enzymes Ncol and PvuI, respectively. and fragments of approximately 2.3 kbp and 1.8 kbp were added to the respective digests. isolated from. The isolated fragments were ligated together and the plasmid pLVC9 5 was generated. This places 5af8 downstream of the 5pa gene and spa Gene ~5af8 is maintained in aligned reading frame.

プラスミドｐ　ＬＶＣ９５を、エエ≦Ｌ去に１２ＪＣ１０２９１中に形質転換し 、そしてｐＬＶＣ９５を担持する誘導体株を、１．３０のＯ，Ｄ、、。。に達す るまで、３７℃でＬＢＩＯ１ｌ中において培養した。細胞を、６．ＯＯＯｘｇで ５分間の遠心分離により収穫し、そして細胞抽出物を、１０ｍＭのＥＤＴＡ、３ （１＋Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐ）１８．０の溶液０．　５＋ｓｌにおいて４°Ｃ で音波処理することによって調製した。水における再結晶化に対する細胞抽出物 に存在するプロティンＡ−３ａｆ８融合タンパク質の効果を、例１においてβラ クタマーゼー５ａｆ３−βラクタマーゼ融合タンパク質について記載されるよう にしで測定した。その結果は、再結晶化が、負の対照におけるよりも少なくとも ６倍低かったことを示した。Plasmid p LVC95 was transformed into 12JC10291 with E≦L. , and the derivative strain carrying pLVC95 at an O,D, of 1.30. . reach The cells were cultured in 1 liter of LBIO at 37° C. until the cells were completely absorbed. cells, 6. OOOxg Harvested by centrifugation for 5 minutes, and cell extracts were added to 10 mM EDTA, 3 (1+M Tris-HCl, p) A solution of 18.0 0. 4°C at 5+sl Prepared by sonication. Cell extract for recrystallization in water In Example 1, the effect of protein A-3af8 fusion protein present in As described for the lactamase 5af3-beta lactamase fusion protein Measured at Nishi. The results show that recrystallization is at least It showed that it was 6 times lower.

これは、外来性ポリペプチドにそのアミノ末端により結合される５ａｆ８は、再 結晶化を阻害するように機能することができることを示した。This suggests that 5af8 bound by its amino terminus to a foreign polypeptide is It has been shown that it can function to inhibit crystallization.

例６：２種のプロティンＡ−ＳａｆｌＯ融合タンパク質の精製、水における前記 精製された融合タンパク質による氷再結晶化の阻害、ＣＮＢｒによる１つの精製 された融合タンパク質の切断及び前記ＣＮＢ　ｒ切断により開放される裸の３ａ ｆｌＯの活性。Example 6: Purification of two Protein A-SaflO fusion proteins in water Inhibition of ice recrystallization by purified fusion protein, one purification by CNBr cleavage of the fused protein and the naked 3a released by the CNBr cleavage. Activity of flO.

Ａ、ム　−５ａｆｌｏの　・ それぞれ２７個及び３３個の塩基の２種のＤＮＡ配列を化学的に合成し、そして −緒にアニールし、ＤＳオリゴ６として示される付着端を有する二本鎖オリゴヌ クレオチドを生成した（第６図を参照のこと）。プラスミドｐＧＭＭ３を、Ｎｏ ｔｌが不完全な消化を与えるように制限酵素Ｅｃ　ｏＲ１及びＮｏｔｌにより処 理し；約８１個のｂｐのＤＮＡフラグメントを分離し、そして精製した。別々の 反応において、プラスミドｐＧＭＭ３をまた、制限酵素ＥｃｏＲＩ及び５ａｃＩ Ｉにより処理し、そして開始されたＤＮＡの約３．　２ｋｂｐフラグメントを分 離し、そして精製した。これらの８１ｂｐ及び３゜２　ｋｂｐのフラグメントを 、ＤＳオリゴ６と一緒に連結し、プラスミドｐＧＭＭ５を生成した。この操作は 、ｐＧＭＭ３に存在する５ａｆ８遺伝子中へのＤＳオリゴ６の配列の置換の効果 を有する。ｐＧＭＭらにおける不凍化コード配列は、遺伝７−ｓａｆｌｏとしζ 知られている。A.Mu-5aflo's・ Two DNA sequences of 27 and 33 bases, respectively, were chemically synthesized, and - a double-stranded oligo with cohesive ends annealed together and designated as DS oligo 6; Creotide was produced (see Figure 6). Plasmid pGMM3, No. tl is treated with restriction enzymes EcoR1 and Notl to give incomplete digestion. An approximately 81 bp DNA fragment was isolated and purified. separate In the reaction, plasmid pGMM3 was also digested with the restriction enzymes EcoRI and 5acI. Approximately 3.0% of the DNA treated with I and initiated 2kbp fragment isolated and purified. These 81 bp and 3°2 kbp fragments , ligated together with DS oligo 6 to generate plasmid pGMM5. This operation , the effect of replacing the sequence of DS oligo6 into the 5af8 gene present in pGMM3. has. The antifreeze coding sequence in pGMM et al. Are known.

Ｂ　、−２」句ａ　−ｓ　ａ　ｆ　ｊＱｊ　−への　。B, -2'' to the phrase a -s a f jQj -.

ｓｐａルミ遺伝子含有ベクタープラスミドル０ＭＭ、この文章に記載されている ようにして構成した。プラスミドｐＵＣ１１Ｂを、Ｐｖｕｎにより切断し、そし て２．９ｋｂｐのフラグメン［をＢｇｌＩｌリンカ−に連結し、プラスミドｐＧ Ｊ１５３を得た。プラスミドｐＵｃ１１ＢをＥｃｏＲＩ及び１１ｉｎｄｆｆｌに より別々に切断し、そして開放されたＤＮＡの３．２ｋｂρフラグメントをＤＳ オリゴ７と一緒に連結し、プラスミドｐＧＪ　１５４を生成した。プラスミドｐ ＧＪ　１５３を酵素Ｂｇｌｉｌ及びΔａｔＩＩにより処理し、そして２．　１ｋ ｂｐのフラグメントを単離した。プラスミドｐＧＪ１５４を酵素Ｆ、　ｃ　ｏ　 ＲＩ及びΔａｔｌｌにより処理し、そして０．９５ｋｂｐのフラグメントを単離 した。プラスミドｐ　ＲＩ　Ｔ　２　Ｔ　（Ｎｉｌｓｓｏｎなど、　（１９８５ ）邸旦９２周４　：　１０７５〜１０８０）を酵素Ｂｇｌｌｌ及びＥｃｏＲＩに より処理し、そして０．９ｋｂｐのフラグメントを単離した。これらの２．１， ０．９５及び０．９ｋｂｐのフラグメントを一緒に連結し、プラスミドｐＧＭＭ ８を得た。spalumi gene-containing vector plasmidl 0MM, described in this text It was configured like this. Plasmid pUC11B was cut with Pvun and The 2.9 kbp fragment [] was ligated to the BglI linker, and the plasmid pG I got J153. Plasmid pUc11B into EcoRI and 11indffl cut the 3.2 kb ρ fragment of the released DNA into DS. ligated together with oligo 7 to generate plasmid pGJ154. plasmid p GJ 153 was treated with the enzymes Bglil and ΔatII, and 2.　1k A bp fragment was isolated. Plasmid pGJ154 with enzyme F, c treated with RI and Δatll and isolated a 0.95 kbp fragment. did. Plasmid pRIT2T (Nilsson et al., (1985 ) Teidan 92 Shu 4: 1075-1080) to enzyme Bgllll and EcoRI and a 0.9 kbp fragment was isolated. These 2.1, The 0.95 and 0.9 kbp fragments were ligated together to create plasmid pGMM I got 8.

プラスミドｐＧＭＭ８をＮｃｏｌ及びＢａｍＨＩにより処理し、そして約３．８ ｋｂｐのフラグメントを精製した。プラスミドｐＧＭＭ５を、Ｎｃｏｌ及びＢａ ｍＨＴにより処理し、そして約１２３ｂｐのフラグメントを精製した。その単離 された３、８ｋｂｐ及び１２３ｂｐのフラグメントを一緒に連結し、プラスミド ｐＧＭＭ９を得、従って、５ａｆｌｏをｓｐａ遺伝子の下流に配置し、ｓｐａ遺 伝子〜５ａｆｌｏを読み枠を整合して維持し、そして５ｐａ−ｓａｆｌｏ連結部 でメチオニンコドンを配置する。Plasmid pGMM8 was treated with Ncol and BamHI and ca. A kbp fragment was purified. Plasmid pGMM5 was transformed into Ncol and Ba mHT and purified a fragment of approximately 123 bp. Its isolation The 3, 8 kbp and 123 bp fragments were ligated together to create a plasmid. pGMM9 was obtained, thus 5aflo was placed downstream of the spa gene and the spa gene was Keep the gene~5aflo reading frame consistent and the 5pa-saflo junction Place the methionine codon with .

プロティンＡと５ａｆｌＯとの間の異なった長い連結の効果を試験するために、 その長い結合をコードする配列を５ａｆｌｏの上流端に結合し、プラスミドｐＧ ＭＭ７を得、そして次にその組合された配列を、次の通りにして、ｓｐａルミ遺 伝子含有プラスミドル０ＭＭ移した。プラスミドｐ　ＧＭＭ５をＥｃｏＲＩ及び ＮｈｅＩにより処理し、そして約３．２ｋｂｐのフラグメントを精製した。それ ぞれ３４個の塩基の２種のＤＮＡ配列を化学的に合成し、そして−緒にアニール し、ＤＳオリゴ８として示される付着端を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを生 成した（第６図を参照のこと）。ＤＳオリゴ８を、３．２ｋｂｐのフラグメント と一緒に連結し、プラスミドｐＧＭＭ７を得た。プラスミドｐＧＭＭ７をＥｃ　 ＯＲＩ及びＢａｍＨＴにより処理し、そして約０．１５ｋｂｐの開放されたＤＮ Ａフラグメントを精製し；プラスミドｐ　Ｇ　Ｍ　Ｍ　８をＥｃｏＲＩ及びＢａ ｍＨＩにより処理し、そして約３．　８ｋｂｐの開放されたＤＮＡフラグメント を精製した。０．１５及び３．８ｋｂｐのフラグメントを一緒に連結し、プラス ミドｐ　ＧＭＭ　１０を得た。プラスミドｐ（：、ＭＭＩＯは、ｐ　ＧＭＭ９に おける５ｐａ−ｓａｆｌｏ融合遺伝子に同等のものを含むが、但し、ＤＳオリゴ ８により供給されるペプチド結合コード領域は、ｓｐａと５ａｆｌｏ成分との間 に結合部として存在する。To test the effect of different long linkages between protein A and 5aflO, The sequence encoding the long linkage was ligated to the upstream end of 5aflo and the plasmid pG Obtain MM7 and then add the combined sequence to the spalumi residue as follows: A 0MM gene-containing plasmid was transferred. Plasmid p GMM5 with EcoRI and Treated with NheI and purified a fragment of approximately 3.2 kbp. that Two DNA sequences of 34 bases each are chemically synthesized and then annealed together. to produce a double-stranded oligonucleotide with cohesive ends, designated as DS oligo8. (See Figure 6). DS oligo 8, 3.2 kbp fragment were ligated together to obtain plasmid pGMM7. Ec plasmid pGMM7 processed with ORI and BamHT and released approximately 0.15 kbp of DN. Purify the A fragment; plasmid pGMM8 with EcoRI and Ba mHI and about 3. 8kbp open DNA fragment was purified. Ligate the 0.15 and 3.8 kbp fragments together, plus Mido p GMM 10 was obtained. Plasmid p(:, MMIO, pGMM9 Contains the equivalent of the 5pa-saflo fusion gene in The peptide binding coding region provided by 8 is located between the spa and 5aflo components. It exists as a joint in .

Ｃ，プロティンＡ−３ａｆｌＯ”　ンパク　の　。C, protein A-3aflO” protein.

それぞれプラスミドｐＧＭＭ９及びｐＧＭＭｌｏを担持する旦−二１１２株Ｎ４ ８３０の誘導体を、１．１のＯ，Ｄ、ｉｏ。Dan-2112 strain N4 carrying plasmids pGMM9 and pGMMlo, respectively. 830 derivative with 1.1 O, D, io.

に達するまで、ＬＢ中において２８℃で培養した。５ｐａ−ｓａｆｌＯ融合体の 発現は、培養物を４２°Ｃに９０分間、変えることによって誘発された。抽出物 を次の通りにして得た：細胞培養物を氷水において冷却し、そして次に、２．６ ００ｘｇで１０分間の遠心分離によりペレ・ノド化した。ベレ・ノドを液体窒素 中で凍結し、そして後での使用のために貯蔵した。The cells were cultured at 28° C. in LB until reaching 28°C. 5pa-saflO fusion Expression was induced by shifting the culture to 42°C for 90 minutes. extract was obtained as follows: the cell culture was cooled in ice water and then 2.6 The cells were pelleted by centrifugation at 00xg for 10 minutes. liquid nitrogen Frozen inside and stored for later use.

１００ｍ１の細胞培養物に由来するペレ・ノドを、１００ｍＭのトリス−ＨＣ１ ％ｐＨ８，０及び５００ｍＭのスクロースの溶液６ｍｌ、４０ｓ＋Ｈのロイペプ チン６０μｌ及び１００５ＭのＰＭＳ　Ｆ４００μｌ中に再懸濁した。この懸濁 液に、１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム１２０μｍを添加し、手始に混合し、そして 次に冷蒸留水６ｍｌを添加した。４°Ｃで２５分間インキュベートした後、１０ ｍｇ／ｍｌでのＤＮアーゼＴ　２５μｌを添加し、そしてその細胞を液体窒素及 び３７°Ｃでの水槽中にお０て８回の凍結−融解サイクルにゆだねた。細胞溶解 物を２０，０００ｘｇで１０分間遠心分離し、そしてペレット、は５ＤＳ−ＰＡ ＧＥにより融合タンパク質を有さないことが示された。融合タンパク質を含む上 清液は、はとんど細胞質タンパク質から成る。融合タンパク質を例２に記載され るようにして、抽出物から精製し、そして１００ｗ＋ＭのＮａＣ１，５０ｍＭの トリス−ＭＣＩ、ｐ）１８．０溶液に再懸濁し、それぞれ１４及び１８＋＊ｇ／ ｍｌの最終濃度にした。精製された融合タンパク質の溶液を一２０°Ｃで貯蔵し た。アリ−コートを、ＳＤＳの存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動にゆだ ね、そして続いて、そのゲルをクーマシーブリリアントブルーにより染色した。Pere nods from 100 ml of cell culture were treated with 100 mM Tris-HC1. 6 ml of a solution of % pH 8.0 and 500 mM sucrose, 40 s+H leupep Resuspend in 60 μl of Chin and 400 μl of 1005M PMS F. This suspension Add 120 μm of 10 mg/ml lysozyme to the solution, mix first, and Then 6 ml of cold distilled water was added. After incubation for 25 min at 4 °C, 10 Add 25 μl of DNase T at mg/ml and incubate the cells with liquid nitrogen. and subjected to 8 freeze-thaw cycles in a water bath at 37°C. Cell lysis Centrifuge the material at 20,000 x g for 10 minutes and pellet the 5DS-PA GE showed no fusion protein. Contains fusion protein The serum consists mostly of cytoplasmic proteins. The fusion protein described in Example 2 purified from the extract as described above and 100w+M NaCl, 50mM Tris-MCI, p) resuspended in 18.0 solution, 14 and 18+*g/respectively A final concentration of ml was made. Store the purified fusion protein solution at -20°C. Ta. Aliquots were subjected to polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of SDS. Then, the gel was stained with Coomassie brilliant blue.

単一の強く染色されたバンドの存在は、これらの融合タンパク質の調製物が実質 的に純粋であることを示した。The presence of a single strongly stained band indicates that these fusion protein preparations are It was shown to be pure.

水における再結晶化に対する２種の精製されたプロティンＡ−３ａ’ｆｌＯ融合 タンパク質の効果を、例３におけるプロティンＡ−３ａｆ５についてのように測 定した。個々の場合、再結晶化は、両融合タンパク質に関して、負の対照におい てよりも低かった：対照における結晶は、融合タンパク質のサンプルにおける結 晶の平均直径よりも５倍大きかった。ｐｃＭＭＩＯに由来するプロティンＡ−３ ａｆｌＯ融合タンパク質は、高い希釈度でのその活性Ｇこより明らかなように、 ｐＧＭＭ９に由来するタンパク質よりも約１０倍の再結晶化阻害活性を有した。Two Purified Protein A-3a'flO Fusions for Recrystallization in Water The effect of the protein was measured as for protein A-3af5 in Example 3. Established. In individual cases, recrystallization was effective in negative controls for both fusion proteins. The crystals in the control were lower than the crystals in the fusion protein sample. It was five times larger than the average diameter of the crystals. Protein A-3 derived from pcMMIO The aflO fusion protein has a high activity as evidenced by its activity at high dilutions. It had about 10 times more recrystallization inhibitory activity than the protein derived from pGMM9.

これらの観察は、まず、そのアミン末端で外来性ポリペプチドに結合される５ａ ｆｌＯが再結晶化を阻害するように機能し、そして第２に、あるスペーサー配列 が５ａｆｌＯと外来性ポリペプチドとの間の結合部で他のものより卓越すること ができることを示した。These observations first suggest that 5a attached to a foreign polypeptide at its amine terminus flO functions to inhibit recrystallization, and secondly, certain spacer sequences predominates at the junction between 5aflO and the exogenous polypeptide. showed that it is possible.

ｐＧＭＭ９に由来する精製されたプロティンＡ−３ａｆｌＯ融合タンパク質１蒙 ｇを、０．１ＭのＭＣＩにおいて、３゜６μＭの臭化シアノゲン（ＣＮＢｒ）の 存在下で約１６時間、２４℃でインキュベートした。このインキュベーションの 生成物を、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、そして精製されたプロティンＡ−５ ａｆｌＯ融合タンパク質の未処理サンプルと同時に、クーマシーブリリアントブ ルーにより染色した。Purified protein A-3aflO fusion protein derived from pGMM9 g of 3°6 μM cyanogen bromide (CNBr) in 0.1 M MCI. 24° C. for approximately 16 hours. This incubation The products were analyzed by 5DS-PAGE and purified protein A-5 At the same time as untreated sample of aflO fusion protein, Coomassie brilliant block was added. It was stained with Ru.

これは、ＣＮＢｒによる処理が元のタンパク質の濃度の低下及び元のタンパク質 よりも小さないくつかのタンパク質の出現（但し１０ｋＤａよりも大きい）をも たらすことを示した。This indicates that treatment with CNBr reduces the concentration of the original protein and We also observed the appearance of some proteins smaller than (but larger than 10 kDa) It was shown that

これらの中で最大且つ卓越した新規タンパク質は、そのプロティンＡ及び５ａｆ ｌＯ成分のほぼ結合部で融合タンパク質の切断を示すサイズのタンパク質であっ た。バンド密度は、裸の不凍化ペプチドの約８０％の開放性が生じ、そして他の 部位での切断が５０％以下であったことを示した。これに基づけば、裸の不凍化 ペプチドは、１０ｋＤａよりも小さなペプチドの７５％以上を構成することが予 測された（但し、５ＤＳ−ＰＡＧＥの後は眼に見えない）。ＣＮＢｒ処理に起因 するタンパク質混合物を、例３（Ａ）に記載される再結晶化−阻害アッセイにお いて試験し、そして再結晶化を遅らせる低下しない能力を保持することが見出さ れた（未処理の融合タンパク質に比べて）。その混合物を、１０ｋＤａをカント オフする分子フィルターに通し、そして濾液を採取した。この１０ｋＤａの濾液 は、ＣＮＢｒ処理が生成することが予測される“裸の”又は“ＭＨＩ”不凍化ポ リペプチド（すなわちＳＡＦの示されたポリペプチドセグメントのみを含む、ポ リペプチド）を含むが、しかし残留する損なわれていない融合タンパク質又は５ ＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化されるより小さなタンパク質のいづれも含まないこ とが予測された。１０ｋＤａの濾液を、３　ｋＤａのカットオフ分子フィルター にそれを通し、そして残留物を回収することによって濃縮した。その１０ｋＤａ の濾液の得られた濃縮物を、前記のように再結晶化阻害活性について試験した。The largest and predominant novel proteins among these are protein A and 5af. It is a protein of a size that indicates cleavage of the fusion protein at approximately the junction of the IO components. Ta. The band density is approximately 80% open for the naked antifreeze peptide, and the other It was shown that the cleavage at the site was less than 50%. Based on this, bare antifreeze Peptides are predicted to constitute more than 75% of peptides smaller than 10 kDa. (However, it is not visible after 5DS-PAGE). Due to CNBr treatment The protein mixture was subjected to the recrystallization-inhibition assay described in Example 3(A). tested and found to retain an undiminished ability to retard recrystallization. (compared to untreated fusion protein). The mixture can be reduced to 10 kDa. It was passed through a molecular filter that was turned off and the filtrate was collected. This 10kDa filtrate The “bare” or “MHI” defreeze points that CNBr processing is expected to produce polypeptide (i.e., a polypeptide containing only the indicated polypeptide segment of SAF) 5), but remaining intact fusion protein or 5 It does not contain any of the smaller proteins visualized by DS-PAGE. was predicted. The 10 kDa filtrate was passed through a 3 kDa cut-off molecular filter. It was concentrated by passing it through and collecting the residue. Its 10kDa The resulting concentrate of the filtrate was tested for recrystallization inhibition activity as described above.

再結晶化を遅らせることが観察された：負の対照の結晶は、実験サンプルにおけ る結晶の平均直径の１０倍大きかった。これは、“裸の”又は“遊離”不凍化ペ プチドが、融合タンパク質から開放され、すなわち、その再結晶化阻害性質を保 持しながら、それを生成する切断反応のある他の生成物から分離され得ることを 示した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ上での切断生成物の可視化により明らかなように、裸 の不凍化ポリペプチドは、実質的に純粋な形で（少なくとも７５％の純度で）、 これらの方法に従って得られた。Observed to retard recrystallization: negative control crystals It was 10 times larger than the average diameter of the crystals. This is “naked” or “free” antifreeze paste. peptide is released from the fusion protein, i.e. retains its recrystallization-inhibiting properties. that it can be separated from other products of the cleavage reaction that produces it, while retaining Indicated. Naked as evidenced by visualization of the cleavage products on 5DS-PAGE. The antifreeze polypeptide is in substantially pure form (at least 75% pure); obtained according to these methods.

例７：精製されたプロティンＡ−３ａｆ５融合タンパク質及び植物組織からの抽 出物による再構成実験。Example 7: Purified protein A-3af5 fusion protein and extraction from plant tissues. Reconstruction experiment using original materials.

再結晶化の阻害が植物組織に生じ、そして不凍化タンパク質の活性をたぶん阻害 する、植物細胞の成分が存在しないことを示すために、再構成実験が行なわれ、 ここで既知量のプロティンＡ−Ｓａｆ５融合タンパク質（例２Ｄで製造された） が植物組織からの、細胞を含まない抽出物に添加された。抽出物を、液体窒素中 でタバコカルチバーＳＲＩの小さな（長さ約８ｃｍ）の葉を凍結し、そして冷却 されたモーター及び乳棒でそれを細かな粉末に粉砕することによって製造した。Inhibition of recrystallization occurs in plant tissues and likely inhibits the activity of antifreeze proteins. Reconstitution experiments were performed to demonstrate the absence of plant cell components, where a known amount of Protein A-Saf5 fusion protein (produced in Example 2D) was added to cell-free extracts from plant tissue. Extract in liquid nitrogen Freeze small (approximately 8 cm long) leaves of tobacco cultivar SRI in It was manufactured by grinding it into a fine powder with a machined motor and pestle.

次にその粉末をキャップをされたポリカーボネート管に移し、そして２ｍｌの抽 出緩衝液（５０ｍＭのＮａＨＰＯ４、ｐ）１７．Ｏ１］＋ａＭのＤＴＴ、０．１ ％のＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００，１ｍＭのＮａ、ＥＤＴＡ）と共に２０秒間、撹 拌することによって混合した。次にその管を、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＴＪ−６遠心分 離機で５分間回転せしめ、残骸物をペレット化した。この回転からの上静液１ｍ ｌを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機で５分間、回転せしめた。透明な上滑液を 取り、そしてそのタンパク質濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄからのタンパク質アッセイ キットを用いて決定した。The powder was then transferred to a capped polycarbonate tube and a 2 ml extract was added. Output buffer (50mM NaHPO4, p)17. O1]+aM DTT, 0.1 % TRITON X-100, 1mM Na, EDTA) for 20 seconds. Mixed by stirring. The tube was then placed in a Beckman TJ-6 centrifuge. The machine was rotated for 5 minutes to pelletize the debris. 1 m of superstatic fluid from this rotation 1 was spun in an Eppendorf centrifuge for 5 minutes. clear synovial fluid and the protein concentration was measured using a protein assay from Bio-Rad. Determined using a kit.

プロティンＡ−３ａｆ５融合タンパク質を前記植物抽出物に添加し、そしてその 得られた混合物を、例３に記載されるようにして、再結晶化阻害についてアッセ イした。緩衝液のみを含む植物抽出物（負の対照）は、プロティンＡ−３ａｆ５ 融合タンパク質を含む植物抽出サンプルよりも少なくとも５倍大きな結晶の直径 の上昇を示した。この実験の結果は、プロティンＡ−Ｓａｆ５融合タンパク質が 合計タンパク質の０．１重量％を示す場合、再結晶化阻害を示した。Protein A-3af5 fusion protein is added to the plant extract and the The resulting mixture was assayed for recrystallization inhibition as described in Example 3. I did it. Plant extracts containing buffer only (negative control) contained protein A-3af5 Crystal diameter at least 5 times larger than the plant extract sample containing the fusion protein showed an increase in The results of this experiment showed that the protein A-Saf5 fusion protein Recrystallization inhibition was indicated when it represented 0.1% by weight of total protein.

例８：５ａｆｌＯによる植物の形質転換。Example 8: Transformation of plants with 5aflO.

植物における不凍化タンパク質の発現を得るために、不凍化遺伝子５ａｆｌｏ　 （例６Ａに記載される）を、アグロバクｉユニ人　ツメ　シエンス（Ａ　ｒｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による同時培養の方法により、植 物形質転換のために適切であるプラスミド中にクローン化した。ベクターを、不 凍化遺伝子が、カリフラワーモザイクウィルスに由来し、そして植物細胞におい て外来性遺伝子の高い発現レベルを付与することが知られている３５３プロモー ターの制御下で植物中に発現されるような態様で構成した。これらのベクターの 追加の特徴は、ペチュニアＣａｂ２２Ｌ遺伝子に由来するリーダー配列（植物に おける発現をさらに増強することが知られている）及びアゲロバクー１ウム　ラ メツ　シエンス　ツバリンシンターゼ遺伝子に由来する３′ポリアデニル化配列 （一部であるｍＲＮＡの有効な後−転写プロセッシングを可能にすることが知ら れている）の所有であった。さらに、いくつかのベクターは、植物細胞から分泌 される不凍化ポリペプチドを生成するために、分泌されたタンパク質のための細 菌又は植物遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含んだ。To obtain expression of antifreeze proteins in plants, the antifreeze gene 5aflo (described in Example 6A) is The method of co-culture with A. tumefaciens) cloned into a plasmid that is suitable for plant transformation. Vectors The freezing gene was derived from the cauliflower mosaic virus and found in plant cells. The 353 promoter is known to confer high expression levels of foreign genes. The vector was constructed in such a manner that it can be expressed in plants under the control of the target. of these vectors An additional feature is that the leader sequence derived from the petunia Cab22L gene (in plants is known to further enhance expression in 3' polyadenylation sequence derived from the Tubarin synthase gene (known to enable efficient post-transcriptional processing of some mRNAs) was owned by Additionally, some vectors are secreted from plant cells. cells for secreted proteins to produce antifreeze polypeptides. Contains DNA sequences derived from fungal or plant genes.

Ｂ、５ａｆｌＯ”　の　に　れるプラスミド。B, plasmid contained in 5aflO”.

プラスミドｐ３５Ｓ　（Ｊ）：Ｃａｂ２２Ｌ−ＣＨは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモー ター、次にペチュニアのＣａｂ２２Ｌに由来するリーダー配列を含む。これらの 配列の下流に、細菌性ｃｈｉＡ（キチナーゼＡ）が存在し、これはＡＴＣ開始コ ドンでユニークなＮｃｏ１部位を有するように変性されている。細菌性ｃｈｉＡ 遺伝子のためのコード配列の末端の向こうに、ユニークなりａｍ８１部位、続い てｎｏｓ　（ツバリンシンターゼ）ポリアデニル化シグナルが存在する。この向 こうに、ユニークなＨ５ｎｄＴＩｉ部位が存在する。このプラスミドの主鎖は、 市販されているベクターＰＵＣ１１Ｂである。Plasmid p35S (J): Cab22L-CH carries the CaMV35S promoter. ter, followed by a leader sequence derived from Petunia Cab22L. these Downstream of the sequence is bacterial chiA (chitinase A), which acts as an ATC initiation cofactor. It has been modified to have a unique Nco1 site at the end. bacterial chiA Beyond the end of the coding sequence for the gene is a unique am81 site, followed by There is a nos (tubalin synthase) polyadenylation signal. This direction Thus, a unique H5ndTIi site exists. The main chain of this plasmid is This is a commercially available vector PUC11B.

従って、−重鎖又は二本鎖の形でこのプラスミドを調製することが可能である。It is therefore possible to prepare this plasmid in -heavy or double-stranded form.

このプラスミドの構成法は出版されている（Ｍ、Ｈ，Ｈａｒｐｓｔｅｒなと、　 （１９８８）、　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、　２１２　：　１８２〜１９ ０）。The method for constructing this plasmid has been published (M.H.Harpster, etc.). (1988), Mo1. Gen, Genet, 212: 182-19 0).

プラスミドｐｃＨＩＴ−５０３は、ｃｈｉＡシグナル配列のためのコドンのすぐ 下流の位置で特定部位突然変異誘発によ／）Ｓｍａ１部位を導入することによっ て、プラスミドｐ３５Ｓ　（Ｊ）：Ｃａｂ２２Ｌ−ＣＨから誘導化された。使用 される特定部位突然変異誘発の方法は、Ｔ、Ａ、Ｋｕｎｋｅｌ＋　（１９８５） Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ＋　８２　：　４８８〜４９２ に記載される。これを行うためには、翻訳されたタンパク質におけるアミノ酸配 列に相補的であるオリゴヌクレオチド５　’　−ＴＴＧＣＣＣＧＧＧＧＣＧＧＣ Ｇ−３’を、旦−ユニ株ＢＷ３１３から調製された一本鎖ｐ３５Ｓ（Ｊ）：Ｃａ ｂ２２Ｌ−ＣＨにアニールした。そのオリゴヌクレオチドは、すべての４個のデ オキシリボヌクレオチドトリホスフェート及びＤＮＡポリマラーゼ１のフレノウ フラグメント及びＴ４　ＤＮＡリガーゼの存在下で拡張された。ポリマラーゼに より拡張され、そして連結されたプラスミドを用いて、旦−ユユＨＢＩＯＩを形 質転換した。個々の形質転換体を取り、そしてそれぞれからのプラスミドＤＮＡ を、新規のＳｍａ　１部位の存在についてスクリーンした。正しい制限消化パタ ーンを有する１つのそのような形質転換体を見出し、そてこれをｐｃＨＪＴ５０ ３と命名した。Plasmid pcHIT-503 is located immediately adjacent to the codon for the chiA signal sequence. By introducing a Sma1 site (by site-directed mutagenesis/) at a downstream position. The plasmid p35S (J): was derived from Cab22L-CH. use The method of site-directed mutagenesis is described by T. A. Kunkel+ (1985). Proc, Natl, Acad, Sci, USA+ 82: 488-492 It is described in To do this, the amino acid sequence in the translated protein must be oligonucleotide complementary to the column 5'-TTGCCCGGGGCGGC G-3' was replaced with a single-stranded p35S(J):Ca prepared from Dan-Uni strain BW313. b22L-CH was annealed. The oligonucleotides Oxyribonucleotide triphosphate and DNA polymerase 1 fragment and extended in the presence of T4 DNA ligase. to polymerase The more expanded and ligated plasmid was used to form the Dan-Yuyu HBIOI. It was transformed. Take individual transformants and extract plasmid DNA from each were screened for the presence of a novel Sma1 site. Correct restriction digestion pattern We found one such transformant with the pcHJT50 I named it 3.

プラスミドｐｃＨＴＴ５０３−２１を、特定部位突然変異誘発を用いて、野生型 ｃｈｉＡ遺伝子に存在するＳｍａ１部位を除去することによってプラスミドｐＣ ）（ｌＴ５０３から誘導した。これは、新しく導入されるＳｍａ１部位がプラス ミドにおいて唯一のＳｍａＩ部位であるように行なわれた。Plasmid pcHTT503-21 was transformed into wild type using site-directed mutagenesis. By removing the Sma1 site present in the chiA gene, plasmid pC ) (derived from IT503. This is because the newly introduced Sma1 site is plus This was done so that there was only one SmaI site in the mid.

これを行なうためには、オリゴヌクレオチド５’　−ＣＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧ ＧＧＡＡＣＴＣＣ−３’　（Ｓ　ｍ　ａ　Ｔ部位を破壊するが、しかしＣｈｉＡ タンパク質におけるいづれのアミノ酸も変更せず、そして位７＋９５１で単一の 塩基対変化を伴って位置＋９４２〜＋９６１でｃｈｉＡ配列に相補的である）が 、旦、ユニ株ＢＷ３１３から調製された一本鎖ｐｃＨＩＴ５０３にアニールされ た。そのオリゴヌクレオチドは、すべての４個のデオキシリボヌクレオチドトリ ホスフェート及びＤＮＡポリマラーゼＩのフレノウフラグメント及びＴ４　ＤＮ Ａリガーゼの存在下で拡張された。ポリマラーゼにより拡張され、そして連結さ れたプラスミドを用いて、旦−ユＪＨＢＩＯＩを形質転換した。個々の形質転換 体を取り、そしてそれぞれからのプラスミドＤＮＡを、Ｓｍａ　１部位の損失に ついてスクリーンした。正しい制限消化パターンを有する１つのそのような形質 転換体を見出し、そしてこれをｐｃＨＩＴ５０３−２１と命名した。To do this, oligonucleotide 5'-CTTTGCCGCCAG GGAACTCC-3' (destroys the S m a T site, but ChiA does not change any amino acids in the protein and creates a single at position 7+951 complementary to the chiA sequence at positions +942 to +961 with a base pair change) , was annealed to single-stranded pcHIT503 prepared from Uni strain BW313. Ta. The oligonucleotide contains all four deoxyribonucleotide trinucleotides. Phosphate and Flenow fragment of DNA polymerase I and T4 DN extended in the presence of A ligase. Extended by polymerase and ligated The obtained plasmid was used to transform Dan-yu JHBIOI. Individual transformation body, and the plasmid DNA from each was transferred to Sma1 site loss. Then I screened it. One such trait with the correct restriction digestion pattern A transformant was found and named pcHIT503-21.

プラスミドｐｃＨＩＴ５００は、２種のオリゴヌクレオチドとして合成され、そ してプラスミドｐｔＪｃ１１ＢにおけるＮｃｏＩ−３ｍａｌフラグメントとして クローン化されるタバコＰＲ１ｂシグナル配列のためのコドンを含む。オリゴヌ クレオチドは、アニールされ、そしてｐＵｃ１１Ｂ中にクローン化される場合、 それらは３′末端でＳｍａ　Ｉ部を有するように企画され、その部位は、ＰＲ１ ｂシグナル配列フラグメントをｐｃＨＩＴ５０３−２１中にクローン化するため に使用される場合、ｃｈｊＡタンパク質のためのコードと同じ読み取り枠と整合 してＰＲ１ｂシグナル配列のためのコドンを配置するであろう。オリゴペプチド は次のものである＝５　’　−ＣＡＴＧＧＧＡＴＴＴ　ＴＴＴＣＴＣＴＴＴＴ　 ＣＡＣＡＡＡＴＧＣＣＣＴＣＡＴＴＴＴＴＴ　ＣＴＴＧＴＣＴＣＴＡ　ＣＡＣＴ ＴＣＴＣＴＴ　ＡＴＴＣＣＴＡＡＴＡ　ＡＴＡＴＣＴＣＡＣＴ　ＣＴＴＣＴＣＡ ＴＧＣＣＣＡ八ＡへＣＣＣ−３’　ａｎｄ　５　’　−ＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧ　 ＣＡＴＧＡＧＡＡＧＡ　ＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＡＴＴＡＧＧＡＡＴＡ　ＡＧＡＧ ＡＡＧＴＧＴ　ＡＧＡＧＡＣＡＡＧＡ　ＡＡＡＡＡＴＧＡＧＧ　ＧＣＡＴＴＴＧ ＴＧＡ　ＡＡＡＧＡＧＴＡＡＡ　ＡＡＴＣＣＣ−３’。ＰＲ１ｂタンパク質は、 その合成が病原体の攻撃により誘発されるタンパク質である。それは分泌された タンパク質であり、そしてシグナル配列を有する（Ｊ、Ｐ、Ｃａｒｒなと、（１ ９８７）　Ｍｏ１．Ｃｅ］Ｉ　Ｂｉｏｌ、、　７　：　１５８０〜１５８３　； 　Ｂ、Ｊ、Ｃ，Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎなど、　（１９８６）　Ｅ？ｌＢＯＪ、 、　５　：　３７〜４０）。Plasmid pcHIT500 was synthesized as two oligonucleotides; as an NcoI-3mal fragment in plasmid ptJc11B. Contains codons for the tobacco PR1b signal sequence that is cloned. origone When the cleotide is annealed and cloned into pUc11B, They are designed to have a Sma I region at the 3' end, which is located at the PR1 b To clone the signal sequence fragment into pcHIT503-21 when used in the same open reading frame as the code for the chjA protein will place the codon for the PR1b signal sequence. oligopeptide is the following = 5’-CATGGGATTTTTTCTCTTTT CACAAATGCCCTCATTTTTTT CTTGTCTCTA CACT TCTCTT ATTCCTAATA ATATCTCACT CTTCTCA CCC-3' and 5'-GGGTTTTGGG to TGCCCA 8A CATGAGAAGA GTGAGATATTATTAGGAATA AGAG AAGTGT AGAGACAAGA AAAAAATGAGG GCATTTG TGA AAAGAGTAAA AATCCC-3'. PR1b protein is It is a protein whose synthesis is induced by pathogen attack. it was secreted It is a protein and has a signal sequence (J, P, Carr, etc., (1 987) Mo1. Ce] I Biol, 7: 1580-1583; B, J, C, Cornelissen et al. (1986) E? lBOJ, , 5: 37-40).

プラスミドｐＣＨＩＴ−ＰＲ３Ｓは、ｐＣＨＩＴ５０３−２１（ｃｈｉＡシグナ ル配列のためのコドンを担持する）からのＮｃｏＩ　Ｓｍａｌフラグメントとを 交換することによって、プラスミドｐＣＨＩＴ５０３−２１に由来された。これ を行なうためには、ｐｃＨＩＴ５０３−２１　ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＳ ｍａ　Ｉにより切断した。ｐＣ）（Ｉｒ２Ｏ３をＮｃｏＩ及びＳｍａ　Ｉにより 切断し、そして開放されるより小さなフラグメントをポリアクリルアミドゲルか ら精製した。その小さなフラグメントを、多くのモル過剰の前記より小さなフラ グメントを有する、Ｎｃ　ｏ　Ｉ−Ｓｍａ　Ｉにより切断されたｐｃＨＩＴ５０ ３−２１と連結し、そして旦−ユニ株ＭＶ１１９３中に形質転換せしめた。ＤＮ Ａをいくつかの形質転換体から調製し、そして所望するプラスミドを、制限酵素 分析により精製した。ｃｈｉＡコード配列に整合して融合されているＰＲ１ｂシ グナル配列を担持するプラスミドを、ｐ　ＣＨＩＴ−ＰＲＳＳと命名した。Plasmid pCHIT-PR3S is pCHIT503-21 (chiA signal carrying the codons for the sequence) and the NcoI Small fragment from The plasmid pCHIT503-21 was derived by exchanging. this In order to perform this, pcHIT503-21 DNA is treated with restriction enzymes Cleaved with maI. pC) (Ir2O3 by NcoI and SmaI The smaller fragments are cut and released in a polyacrylamide gel. It was purified from the smaller fragment in many molar excess pcHIT50 cleaved by Nc　I-Sma　with a component 3-21 and transformed into Dan-Uni strain MV1193. D.N. A was prepared from several transformants and the desired plasmid was digested with restriction enzymes. Purified by analysis. A PR1b sequence fused in alignment with the chiA coding sequence. The plasmid carrying the GNAR sequence was named pCHIT-PRSS.

プラスミドｐｃＨＩＴ−ＰＲＳＳ２は、プラスミドｐＣＨＩＴ−ＰＲ３Ｓにクロ ーン化されたＰＲ１ｂシグナル配列が、ＰＲ１ｂシグナル配列におけるアミノ酸 置換に導ひく単一の塩基対変化を担持することがＤＮＡ配列分析により発見され た後、特定部位突然変異誘発によりプラスミドｐｃＨＩＴＰＲ−３Ｓから誘導さ れた。これは、ＰＲ１ｂ配列の位置１２でのＴからＡへの変化であり、これはロ イシンのためのコドン（野生型配列）をフェニルアラニンのためのコドンに変化 せしめる。この変異が、翻訳的に融合されるタンパク質の分泌を介在するＰＲ１ ｂシグナル配列の能力に対して何の効果を有するかは知られていないので、この 変異は°、上記と同じ特定部位突然変異誘発を用いて、野生型に調整された。プ ラスミドｐｃＨＩＴ５００を生成するために合成され、そしてＰＲ１ｂ遺伝子の 先端鎖をコードするオリゴヌクレオチドが変異誘発のために使用された。正しい プラスミドを、ＤＮＡ配列分析により同定し、そしてｐＣＨＩＴ−ＰＲＳＳ２と 命名した。２種のブラスミＦｐＣ，ＨＩＴ−ＰＲ３Ｓ及びｐＣＨＩＴ−ＰＲＳＳ ２の間の唯一の差異は、ＰＲ１ｂシグナル配列をコードするプラスミドの領域に おける単一の塩基対の差異である。Plasmid pcHIT-PRSS2 was cloned into plasmid pCHIT-PR3S. The encoded PR1b signal sequence contains amino acids in the PR1b signal sequence. discovered by DNA sequence analysis to carry a single base pair change leading to the substitution. After that, the plasmid pcHITPR-3S was derived from the plasmid pcHITPR-3S by site-directed mutagenesis. It was. This is a T to A change at position 12 of the PR1b sequence, which Changed codon for isine (wild type sequence) to codon for phenylalanine urge This mutation results in PR1 mediating secretion of the translationally fused protein. b It is not known what effect it has on the performance of the signal sequence; Mutations were adjusted to wild type using the same site-directed mutagenesis described above. P was synthesized to generate the lasmid pcHIT500 and the PR1b gene Oligonucleotides encoding the tip strand were used for mutagenesis. correct The plasmid was identified by DNA sequence analysis and named pCHIT-PRSS2. I named it. Two types of Blasmi FpC, HIT-PR3S and pCHIT-PRSS The only difference between 2 is in the region of the plasmid encoding the PR1b signal sequence. is a single base pair difference in

ｐｃＨＩＴ５０３．　ｐｃＨＩＴ５０３−２１．　ｐＣＨＩＴ−ＰＲＳＳ及びｐ ｃＨＩＴ−ＰＲＳＳ２　（７）構成は第８Ａ図に要約される。pcHIT503. pcHIT503-21. pCHIT-PRSS and pCHIT-PRSS The cHIT-PRSS2 (7) configuration is summarized in Figure 8A.

プラスミドｐＪＪ２９６４は、アゲロバクー１ウム　エムヱＬ之エヱ困による植 物形質転換のために特別に企画されたプラスミドである。それは、旦−ユニ及び アグロバク′″ｉつＡ　”７）ヱＬ之エヱ囚の両者における複製を可能にする配 列、及びこれらの細菌の両者のためへの選択を可能にする耐テトラサイクリンを コードする遺伝子を含む。それは、植物細胞への効果的なトランスファー及び植 物のＤＮＡ中への組込みのために必要とされるＴ−ＤＮＡの左側のボーダー及び 右側のボーダー配列を含む、これらのボーダー間に、それは、ｎＯＳプロモータ ーの制御下でカナマイシンに対する耐性をコードする遺伝子及びオクトビンシン ターゼ遺伝子からポリアデニル化シグナルを含み、その結果、形質転換さるよう になった植物細胞は、この抗生物質上で増殖するそれらの能力により検出され得 る。それは、ベクターｐＲＫ２９０に起因する。それはまた、Ｔ−ＤＮＡの左側 ボーダーと右側ボーダーとの間にユニークなりａｍＨＩ及びＨｉｎｄｎ［部位を 含み、その結果、これらの２つの部位間にクローン化されるいづれかの配列が植 物ＤＮＡ中に効果的に移行され、そして組込まれるであろう、このプラスミドは 、次の通りにして構成された。広い宿主範囲のプラスミドｐ　ＲＫ　２９０　（ Ｇ、Ｄｉｔｔａなど。Plasmid pJJ2964 was derived from Agerobacter 1um M.L.E. This is a plasmid specially designed for the transformation of organisms. It is Dan-Uni and Agrobac'"itsuA" 7) Arrangements that enable replication in both L and E prisoners. column, and allow selection for both these bacteria and tetracycline resistance. Contains the encoding gene. It provides effective transfer and transplantation into plant cells. The left border of T-DNA and the Between these borders, including the right border array, it contains the nOS promoter The gene encoding resistance to kanamycin and octovincin under the control of Contains a polyadenylation signal from the tase gene, resulting in transformation The infected plant cells can be detected by their ability to grow on this antibiotic. Ru. It is due to the vector pRK290. It is also the left side of T-DNA Add unique amHI and Hindn [sites] between the border and the right border. so that any sequence cloned between these two sites is This plasmid will be effectively transferred and integrated into the product DNA. , was constructed as follows. Broad host range plasmid pRK290 ( G., Ditta et al.

（１９８０）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７７　：　 ７３４７〜７３５１）を、制限酵素ＥｃｏＲＩにより切断し、そしてオーバーハ ング末端を、ＤＮＡポリマラーゼ■のフレノウフラグメント及び４個のデオキシ リボヌクレオチドトリホスフェートによりフィルインした。プラスミドｐ　ＡＧ 　Ｓ　１１１　（Ｐ、　ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｅｌｚｅｎなど、　（１９８５）　Ｐ ｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、５　：　１４９〜１５９　）を制限酵素Ｈｉｎ ｄｌ［［およびＥｃｏＲＩにより切断し、そしてオーバーハング末端をＤＮＡポ リマラーゼＩのフレノウフラグメント及び４個のデオキシリボヌクレオチドトリ ホスフェートによりフィルインした。２つの切断されたＤＮＡを連結し、そして それを用いて旦−ユニを形質転換した。ｐＡＧｓｌ　１１からのｎｐｔｎ遺伝子 を含むｐＡＧｓｌ　１１からのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌ［［フラグメントを含む プラスミドを制限酵素分析により同定し、そしてＴ−ＤＮＡの右側及び左側ボー ダー（アグロバクテリウムからのＤＮＡの植物細胞中への移行及び組込みのため に不可欠である）を、ｐ　ＲＫ２９０中のＥｃｏＲ１部位に挿入した。このプラ スミドをｐＪＪ１８８１と命名した。ｐＪＪＩ８８１をＣｏａｌ及びＢａｍＨＩ により切断し、そしてＣ１ａｌ及びＢａｍＨＩにより切断されたＰＢＲ３２２（ 市販されているプラスミド）と連結し、そしてその連結生成物を用いて、呈−ユ ニを形質転換した。ｎｐＬ■遺伝子を担持するｐＪＪ１８８１からのＣ１ａｌ− ＢａｍＨＩフラグメントがｐＢＲ３２２からの小さなＣ１ａＩ−ＢａｍＨＩフラ グメント（Ｃｌａｌ部位の下流にＨｉｎｄｌ［［部位を有する）により置換され た。このプラスミドをｐＪＪ２４３１と命名した。プラスミドｐＬＣ；ＶＮｅｏ ２１０３　（ｖａｎｄｅｎ　Ｅｌｚｅｎなど、、　１９８５　）をＥｃ　ｏＲＩ により切断し、Ｓ１ヌクレアーゼにより処理し、−末鎖ＤＮＡを除去し、そして Ｃ１ａＩリンカ−により連結した。その連結をＣｏａｌにより切断し、そしてプ ラスミドをリンカ−から精製し、次に再連結し、そして旦−ユニを形質転換せし めた。ｐＬＧＶＮｅｏ２１０３中のＥｃｏＲ１部位がＣｌａｌ部位に転換されて いるプラスミドを同定し、そしてこのプラスミドをｐＡＧＳ１０９と命名した。(1980) Proc, Natl, Acad, Sci, USA, 77: 7347-7351) was cut with the restriction enzyme EcoRI and overhauled. The Flenow fragment of DNA polymerase ■ and four deoxy Fill-in was performed with ribonucleotide triphosphate. Plasmid p AG S 111 (P, van den Elzen et al., (1985) P lant Mo1. Biol, 5: 149-159) with restriction enzyme Hin dl [[ and EcoRI and the overhang ends were inserted into the DNA polymer. The Flenow fragment of Limarase I and the four deoxyribonucleotide trinucleotides Fill in with phosphate. join the two cut DNAs, and It was used to transform Dan-Uni. nptn gene from pAGsl 11 EcoRI-Hindl from pAGsl 11 containing [[containing fragment The plasmid was identified by restriction enzyme analysis and the right and left sides of the T-DNA were isolated. (for the transfer and integration of DNA from Agrobacterium into plant cells) ) was inserted into the EcoR1 site in pRK290. This plastic The sumid was named pJJ1881. Coal and BamHI PBR322 ( (commercially available plasmid) and use the ligation product to was transformed. C1al- from pJJ1881 carrying the npL■ gene The BamHI fragment is a small C1aI-BamHI fragment from pBR322. component (which has a Hindl[[ site downstream of the Claal site)] Ta. This plasmid was named pJJ2431. Plasmid pLC; VNeo 2103 (vanden Elzen et al., 1985) as Ec oRI , treated with S1 nuclease to remove -terminal strand DNA, and They were linked by a C1aI linker. The connection is cut by Coal and The lasmid was purified from the linker, then religated, and transformed into Dan-Uni. I met. The EcoR1 site in pLGVNeo2103 was converted to a Claal site. A plasmid was identified and named pAGS109.

ｐＡＧＳ　１０９をＣ１ａＩ及びＨｉｎｄｌにより切断し、そしてＣ１ａｌ及び Ｈｉｎｄｎｌにより切断されているｐＪＪ２３４１に連結した。ｐＪＪ２３４１ に由来する主鎖にｎｐｔｎ遺伝子を含むプラスミドを同定し、そしてｐＪＪ２９ ６４と命名した。ｐＪＪ２９６４の構成は、第８Ｂ図に示される。pAGS 109 was cut with C1aI and Hindl, and C1al and It was ligated to pJJ2341 which had been cut with Hindnl. pJJ2341 identified a plasmid containing the nptn gene in the main chain derived from pJJ29 It was named 64. The construction of pJJ2964 is shown in Figure 8B.

Ｃ１における　゛　−の　のためのブースミドの１底。One base of boothmid for ゛　- in C1.

不凍化遺伝子５ａｆｌｏがＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＣａｂ２２Ｌリーダ ーの下流に配置され、そしてその３′末端でｎ　ＯＳポリアデニル化シグナルを 有するベクターを構成するために、１０μｇのｐＧＭＭ５を制限エンドヌクレア −ゼＮｃｏｌ及びＢａｍＨＩにより消化した。その消化生成物を９％のポリアク リルアミドゲル上で電気泳動にかけ、そして予測される大きさく１２７個の塩基 対）のフラグメントを見出した。このバンドをゲルから切出し、そして電気溶出 した。そのＤＮＡを、１：１のフェノール：ＴＥ（１０＋ａＭのトリス、ｐｏｓ 、ｏ、１ｍＭのＥＤＴＡ）により飽和されたクロロホルムの等体積により１度抽 出し次に０．３ＭのＮａ０ＡＣ１１０μｇの酵母ｔＲＮＡ及び２．５倍体積のエ タノールにより沈殿せしめることにより回収した。精製されたＤＮＡフラグメン トを２０μｍのＴＥ中に再懸濁した。２μｇのＰＣＨＩＴ５０３−２１を、制限 エンドヌクレアーゼＮｃｏｌ及びＢａｍＨＩにより切断し、０．８％のアガロー スゲル上で電気泳動せしめた。ベクター主鎖フラグメントを電気溶出し、そして ２０μｍのＴＨに再懸濁した。５ａｆｌｏ遺伝子を含むＮｃ　ｏ　Ｉ−ＢａｍＨ ＩフラグメントをｐｃＨＩＴ５０３−２１からのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＴ主鎖中に 連結するために、精製されたフラグメント１０ａｌを、２０ａ１のりガーゼ緩衝 液（５０ｍＭのＮａＣ１，１００ｄのトリス、ｐＦＩ７，５．１０ｍＭのＭ　ｇ 　Ｃ１ｚ、１ｍＭのジチオトレイトール、１ｍＭのＡＴＰ、１単位のＴ、ＤＮＡ リガーゼ）の最終体積中において、精製された主鎖工μｍと共に混合し、そして ４℃で一晩インキユベートした。この後、この緩衝液を°“リガーゼ緩衝液”と して言及する。次の日、その連結生成物を用いて、Ｅ、コ成熟部分（すなわちシ グナル配列の切断の後に残るタンパク上での増殖により選択した。形質転換され たコロニーにおける正しいプラスミドの存在を確証するために、ＤＮＡを個々の コロニーから調製し、そして制限エンドヌクレアーゼｘｈｏｒ及び）Ｉｉｎｄｌ ［Ｉにより切断した。予測される大きさのフラグメント（４４７個の塩基対）を 、０．８％のアガロースにおけるゲル電気泳動に従って観察した。正しいプラス ミドをｐ　ＣＨＩＴ−ＡＦＮＢと命名した。Antifreeze gene 5aflo is CaMV35S promoter and Cab22L leader and carries the nOS polyadenylation signal at its 3' end. To construct a vector with -digested with Ncol and BamHI. The digestion products are mixed with 9% polyac Electrophoresed on a lylamide gel and the predicted size of 127 bases found a fragment of This band is excised from the gel and electroelution did. The DNA was purified with 1:1 phenol:TE (10+aM Tris, pos Extracted once with an equal volume of chloroform saturated with Next, add 110 μg of yeast tRNA and 2.5 volumes of 0.3 M Na0AC. It was recovered by precipitation with ethanol. Purified DNA fragment The samples were resuspended in 20 μm TE. 2 μg of PCHIT503-21, restricted Cut with endonucleases Ncol and BamHI and 0.8% agarose Electrophoresis was performed on a gel. Electroelute the vector backbone fragment, and Resuspended in 20 μm TH. Nc　I-BamH containing 5aflo gene I fragment into the NcoI-BamHT backbone from pcHIT503-21. For ligation, purified fragment 10al was placed in 20al glue gauze buffer. solution (50mM NaCl, 100d Tris, pFI7, 5.10mM Mg C1z, 1mM dithiothreitol, 1mM ATP, 1 unit of T, DNA in the final volume of ligase) and mixed with the purified backbone enzyme μm and Incubate overnight at 4°C. After this, this buffer is called “ligase buffer”. and mention it. The next day, the ligation product was used to identify E, the co-matured portion (i.e. Selection was made by growth on the protein remaining after cleavage of the signal sequence. transformed To confirm the presence of the correct plasmid in the cloned colonies, the DNA was isolated from each prepared from colonies and treated with restriction endonucleases xhor and )Iindl [Cut with I. The predicted size fragment (447 base pairs) , observed according to gel electrophoresis in 0.8% agarose. correct plus The medium was named pCHIT-AFNB.

植物細胞から分泌される不凍化タンパク質の形での発現を可能にするために、不 凍化遺伝子を、次のようにして、ｍ菌性キチナーゼ遺伝子ｃｈｉＡに又はタバコ 病因論関連のタンパク質ＰＲ１ｂに正しく読み枠を整合して、まず融合せしめた 。　ｌｏｕｇの９０ＭＭ５を制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩ及びＢａｍＨＩに より消化した。消化生成物を９％のポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ 、そして予測される大きさく１３３個の塩基対）のフラグメントが見出されて、 このバンドをゲルから切り出し、そして電気溶出した。ＤＮＡを、１：１のフェ ノール：ＴＥにより飽和されたクロロホルムの等体積により１度その緩衝液を抽 出し、そして次に、０．３ＭのＮａ０Ａｃ、１０ｕｇの酵母ｔＲＮＡ及び２．５ 倍の体積のエタノールにより沈殿せしめることにより回収した。精製されたＤＮ Ａフラグメントを２０μｌのＴＥに再懸濁した。２μｇのｐｃＨＩＴ５０３−２ １を、制限エンドヌクレアーゼＳｍａｌ及びＢａｍＨＩにより切断し、そして０ ．８％のアガロースゲル上で電気泳動せしめた。この切断は２つのフラグメント を生成した：キチナーゼタンパク質のアＵ虫１．ナー　正１７いプラスミドを、 ｖＣＨＩＴ−ＡＦＳＢと質の部分）のためのコード領域を含むフラグメント、及 び選択可能な耐アンピシリン性マーカー、プラスミド複製のために必要とされる 配列、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ｃａｂ２２Ｌリーダー、Ｃｈ　ｉＡシグナ ル配列のためのコドン（Ｓｍａ１部位で終結する）及びｎｏｓポリアデニル化シ グナル（ＢａｍＨ１部位で開始する）を含むベクターの主鎖。そのベクター主鎖 フラグメントを電気溶出し、そして２０μ】のＴＥに再懸濁した。５ａｆｌｏ遺 伝子を含むＳｍａ　Ｉ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐｃＨＪＴ５０３−２１から のＳｍａＩ−ＢａｍＨＴ主鎖に連結するために、精製されたフラグメン）１０μ ｍを、２０μｍのリガーゼ緩衝液の最終体積中において精製された主ｆ１１μｍ と共に混合し、そして４　’Ｃで一晩インキュベートした。次の日、その連結混 合物を用いて、Ｅ、コリ株ＭＶ１１９３のコンピテント細胞を形質転換し、そし て形質転換体を、７５μｇ／ｌ１１１のアンピシリンを含むＬＢ寒天上での増殖 により選択した。形質転換されたコロニーにおける正しいプラスミドの存在を確 証するために、ＤＮＡを個々のコロニーから調製し、そして制限エンドヌクレア ーゼＸｈ’ｏｌ及びＨｉｎｄｌｌｒにより切断した。予測されるサイズのフラグ メント（５３０個の□塩基対）が、０．８％のアガロースにおけるゲル電気泳動 により観察された。次に、Ｎｃｏｌによる第２の切断を行ない、正しい連結生成 物が回収されたことを確証した。８３個の塩基対の予測されるフラグメントを、 ８％のポリアクリルアミドにおける電気泳動に従つ命名した。To enable expression in the form of antifreeze proteins secreted from plant cells, The freezing gene was added to the m fungal chitinase gene chiA or tobacco as follows. First, we correctly aligned the reading frame with the etiology-related protein PR1b and fused it. . 90MM5 of LOUG to restriction endonucleases SmaI and BamHI More digested. Digestion products were electrophoresed on a 9% polyacrylamide gel. , and a fragment of the predicted size (133 base pairs) was found, This band was excised from the gel and electroeluted. DNA in a 1:1 ratio Extract the buffer once with an equal volume of chloroform saturated with Nor:TE. and then 0.3 M Na0Ac, 10 ug yeast tRNA and 2.5 It was recovered by precipitation with twice the volume of ethanol. purified DN The A fragment was resuspended in 20 μl TE. 2μg pcHIT503-2 1 was cut with restriction endonucleases Smal and BamHI and 0 ．． Electrophoresis was performed on an 8% agarose gel. This cleavage results in two fragments Generated: chitinase protein A. 1. The 17-year-old plasmid, a fragment containing the coding region for vCHIT-AFSB and the quality portion); and selectable ampicillin resistance marker, required for plasmid replication. Sequence, CaMV35S promoter, Cab22L leader, Ch iA signal codon for the polyadenylation sequence (terminating at the Sma1 site) and the nos polyadenylation sequence. Backbone of the vector containing the GNAR (starting at the BamH1 site). its vector backbone The fragments were electroeluted and resuspended in 20 μl of TE. 5aflo legacy The SmaI-BamHI fragment containing the gene was extracted from pcHJT503-21. 10 μl of the purified fragment) for ligation to the SmaI-BamHT backbone of m, purified main f11μm in a final volume of 20μm ligase buffer and incubated overnight at 4'C. The next day, the connection The compound was used to transform competent cells of E. coli strain MV1193 and The transformants were grown on LB agar containing 75 μg/l ampicillin. Selected by. Confirm the presence of the correct plasmid in transformed colonies. To demonstrate, DNA was prepared from individual colonies and restriction endonucleases cleaved with enzyme Xh'ol and Hindllr. Expected size flag (530 □ base pairs) was analyzed by gel electrophoresis in 0.8% agarose. observed by. Next, perform a second cut by Ncol to generate the correct connection. It was confirmed that the item had been recovered. The predicted fragment of 83 base pairs is Named according to electrophoresis in 8% polyacrylamide.

不凍化遺伝子５ａｆｌｏが、タバコＰＲ１ｂ遺伝子からのシグナル配列に整合し て融合され、Ｃａｂ２２Ｌリーダーと共に、及び３′末端でのｎｏｓポリアデニ ル化シグナルと共のＸｈｏｌ及びＨｉｎｄＩ［［（５５１個の塩基対のフラグメ ントを開放する）による切断に従って同定した。所望するプラスミドを、ｐｃＨ ＩＴ−ＡＦＳＳと命名した。The antifreeze gene 5aflo matches the signal sequence from the tobacco PR1b gene. fused with the Cab22L leader and nos polyadenylation at the 3' end. Xhol and HindI [[(551 base pair fragment It was identified according to the cleavage by The desired plasmid was added to pcH It was named IT-AFSS.

プラスミドｐｃＨＩＴ−ＡＰＮＢ、　ｐｃＨＩＴ−ＡＦＳＢ、　ｐｃＨＩＴ−Ａ ＦＳＳ及びｐｃｔｔｒＴ−ＡＦＳＳ２における不凍化遺伝子の配列は、次の通り であり、そしてその配列は、開始ＡＴＣ，からＨｉｎｄＩ［１部位に示される： Ｎｃｏｌ−ＢａｍＨＩにより切断されたｐｃＨＩＴ５０３中へのＮｃ　ｏ　Ｉ− ＢａｍＨＩのクローニングに従っての不凍化遺伝子（ｓａｆｌｏ）。Plasmids pcHIT-APNB, pcHIT-AFSB, pcHIT-A The sequences of the antifreeze genes in FSS and pcttrT-AFSS2 are as follows: and its sequence is shown at the HindI [1 site: Ncol-Nc　I- into pcHIT503 cleaved by BamHI Antifreeze gene (saflo) following cloning of BamHI.

長さ＝１３０ １　ＡＴＧＧＡＣＡＣＴＧ　ＣＴＡＧＣＢＡＴＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴ ＧＣＴＴＴＧＡ　ＣＡＧＣＴＧＣＴＡ＾５１　ＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧ　ＧＣＣＧ ＣＴＡＡＡＣＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡ　ＴＡＡＴＧＣＴＧＣＣＧＣＧＧＣＡＧＣＡ Ｇｌｏｌ　ＣＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＣＧＴＴＡＡＣＡＡ　ＣＡＴＣＣＧＧＡＴＣ ｃｈｉＡシグナル配列に整合して融合される不凍化遺伝子（ｓａｆｌｏ）。length = 130 1 ATGGACACTG CTAGCBATGCCGCCGCGGCCGCT GCTTTGA CAGCTGCTA＾51 CGCCGCCGCG GCCG CTAAAACTGACTGCAGA TAATGCTGCCGCGGCAGCA Glol CAGCAACTGCACGTTAACAACATCCGGATC Antifreeze gene (saflo) fused in alignment to the chiA signal sequence.

長さ＝２２１ １　ＡＴＧＧＣＣＡＡＡＴ　ＴＴＡＡＴＡＡＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧ　ＣＴ ＧＴＴＧＡＴＣＧ　ＧＣＡＧＣＡＣＧＣＴ５１　ＧＴＧＴＴＣＣＧＣＧ　ＧＣＧ ＣＡＧＧＣＣＧ　ＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧ　ＴＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＴＧＣＴＡ ＧＣＧｌｏｌ　ＡＴＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＣ丁　ＴＴＧＡＣＡＧＣ ＴＧ　ＣＴＡＡＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＧＴＴＡ１５１　ＡＡＡＣＴＧＡＣＴ Ｇ　ＣＡＧＡＴＡＡＴＧＣＴＧＣＣＧＣＧＧＣＡ　ＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡ　ＣＴ ＧＣＡＣＧＴＴＡ２０１　ＡＣＡＡＣＡＴＣＣＧ　ＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴ　Ｔｐ ＡＦＳＳ　（位置２１での突然変異を含むＰＲ１ｂシグナル配列を有する）とし てクローン化された不凍化遺伝子（ｓａｆｌｏ）。length = 221 1 ATGGCCAAAT TTAATAAAACCGCTGTTGGCG CT GTTGATCG GCAGCACGCT51 GTGTTCCGCG GCG CAGGCCG　CCGCCCCGGG　TACCATGGACACTGCTA GCGlol ATGCCGCCGCGGCCGCTGC Ding TTGACAGC TG CTAACGCCGCCGCGGCGTTA151 AAAACTGACT G CAGATAATGCTGCCGCGGCAGCAGCAGCAACT GCACGTTA201 ACAACATCCG GATCCAAGCT Tp AFSS (with PR1b signal sequence containing mutation at position 21) The antifreeze gene (saflo) was cloned by

長さ：２４２ １　ＡＴＧＧＧＡＴＴＴＴ　ＴＡＣＴＣＴＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＧＣＣＣＴＣＡ ＴＴＴＴＴＴＣＴＴＧＴＣＴＣＴＡＣ５１ＡＣＴＴＣＴＣＴＴＡ　ＴＴＣＣＴＡ ＡＴＡＡ　ＴＡＴＣＴＣＡＣＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＧＧｌ ｏｌ　ＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡ　ＣＡＣＴＧＣＴＡＧＣＧＡＴＧＣＣＧＣＣＧ　Ｃ ＧＧＣＣＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡＣＡＧＣＴ１５１　ＧＣＴＡＡＣＧＣＣＧ　ＣＣ ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＡＡＣＴＧＡＣＴ　ＧＣＡＧＡＴＡＡＴＧ　ＣＴＧＣＣＧ ＣＧＧＣ２０１ＡＧＣＡＧＣＡＢＣＡ　ＡＣＴＢＣＡＣＧＴＴ　ＡＡＣＡＡＣＡ ＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴｐＡＦＳＳ２としてクローン化された不凍化遺 伝子（ｓａｆｌｏ）。Length: 242 1 ATGGGATTTT TACTCTTTTCACAAATGCCCTCA TTTTTTCTTGTCTCTAC51ACTTCTCTTA TTCCTA ATAA TATCTCACTCTTCTCCATGCCCAAAACCCGGl ol GTACCATGGA CACTGCTAGCGATGCCGCCG C GGCCGCTGCTTTGACAGCT151 GCTAACGCCG CC GCGGCCGCTAAAACTGACT GCAGATAATG CTGCCG CGGC201AGCAGCABCA ACTBCACGTT AACAACA Antifreeze gene cloned as TCCGGATCCAAGCTTpAFSS2 Gene (saflo).

長さ：２４２ １　ＡＴＧＧＧＡＴＴＴＴ　ＴＴＣＴＣ丁Ｔ丁ＴＣＡＣＡＡＡＴＧＣＣＣＴＣＡ ＴＴＴＴＴＴＣＴＴＧＴＣＴＣＴＡＣ５１ＡＣＴＴＣＴＣＴＴＡ　ＴＴＣＣＴＡ ＡＴＡＡ　ＴＡＴＣＴＣＡＣＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＧＧｌ ｏｌ　ＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡ　ＣＡＣＴＧＣＴＡＧＣＧＡＴＧＣＣＧＣＣＧ　Ｃ ＧＧＣＣＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡＣＡＧＣＴ１５１　ＧＣＴＡＡＣＧＣＣＧ　ＣＣ ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＡＡＣＴＧＡＣＴ　ＧＣＡＧＡＴＡＡＴＧ　Ｃ，ＴＧＣＣ ＧＣＧＧＣ２０１ＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡ　ＡＣＴＧＣＡＣＧＴＴ　ＡＡＣＡＡＣ ＡＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣ丁Ｔ上記ＤＮＡ配列の翻訳により生成されるタン パク質の予測されるアミノ酸配列は、次の通りである：ＮｃｏＴ−ＢａｍＨＩに より切断されたｐｃＨＩＴ５０３中へのＮｃｏｌ−ＢａｍＨＩのクローニングに 従っての不凍化遺伝子（ｓａｆｌｏ）。Length: 242 1　ATGGGATTTT　TTCTC ちょうTCTCACAAAATGCCCTCA TTTTTTCTTGTCTCTAC51ACTTCTCTTA TTCCTA ATAA TATCTCACTCTTCTCCATGCCCAAAACCCGGl ol GTACCATGGA CACTGCTAGCGATGCCGCCG C GGCCGCTGCTTTGACAGCT151 GCTAACGCCG CC GCGGCCGCTAAACTGACT GCAGATAATG C, TGCC GCGGC201AGCAGCAGCA ACTGCACGTT AACAAC ATCCGGATCCAAGCDing TTan produced by translation of the above DNA sequence The predicted amino acid sequence of the protein is as follows: NcoT-BamHI For cloning of Ncol-BamHI into pcHIT503 cut by Hence the antifreeze gene (saflo).

Ｉ　ＭＤＴＡＳＤＡＡＡＡ　ＡＡＬＴＡＡＮＡＡＡ　ＡＡＫＬＴＡＤＮＡＡ　Ａ ＡＡＡＡＴＡＩ？”ｃｈｉＡシグナル配列に整合して融合された不凍化遺伝子（ ｓａｆｌｏ）。I MDTASDAAAA AALTAANAAA AAKLTADDNAA A AAAATAI? ``Antifreeze gene fused in alignment with the chiA signal sequence ( saflo).

Ｉ　ＭＡＫＦＮＫＰＬＬＡ　ＬＬＩＧＳＴＬＣＳＡ　ＡＱＡＡＡＰＧＴＭＤ　Ｔ ＡＳＤＡＡＡＡＡＡ　ＬＴＡＡＮＡＡＡＡＡ５１　ＫＬＴＡＤＮＡＡＡＡ　ＡＡ ＡＴＡＲ”ｐＡＦＳＳ　（位置１２での突然変異を含むＰＲ１ｂシグナル配列を 有する）としてクローン化された不凍化遺伝子（ｓａｆｌｏ）。I MAKFNKPLLA LLIGSTLCSA AQAAAPGTMD T ASDAAAAAA LTAAANAAAA51 KLTADNAAAA AA ATAR”pAFSS (PR1b signal sequence containing the mutation at position 12) The antifreeze gene (saflo) was cloned as

Ｉ　ＭＧＦＬＬＦＳＱＭＰ　５ＦＦＬＶＳＴＬＬＬ　ＦＬＩＩＳ）ＩｓｓＨＡ　 ＱＮＰＧＴＭＤＴＡＳ　ＤＡＡＡＡＡＡＬＴＡ５１　ＡＮＡＡＡＡＡＫＬＴ　Ａ ＤＮＡＡＡＡＡＡＡ　ＴＡＩ＋”ＰＡＦＳＳ２としてクローン化された不凍化遺 伝子（ｓａｆｌｏ）。I　MGFLLFSQMP　5FFLVSTLLLL　FLIIS)IssHA　 QNPGTMDTAS DAAAAAAALTA51 ANAAAAAAKLT A Antifreeze gene cloned as DNAAAAAAA TAI+”PAFSS2 Gene (saflo).

Ｉ　ＭＧＦＦＬＦＳＱ？ｌＰ　５ＰＦＬＶＳＴＬＬＬ　ＦＬＩＩＳ）ＩｓｓＨＡ 　ＱＮＰＧＴＭＤＴＡＳ　ＤＡＡＡＡＡＡＬＴＡ５１　Ａ１１ｌ／ｌ／ＩＡＡＡ ＫＩ、Ｔ　ＡＤＮＡＡＡＡＡＡＡ　ＴＡＲ”ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ｃａ 　ｂ　２２　Ｌ　’Ｊ−ダー、ＣｈｉＡ又はＰＲ１ｂシグナル配列（存在するな ら）、不凍化遺伝子及びｎｏｓポリアデニル化シグナルを含む完全な配列を、植 物細胞を形質転換するために使用され得るベクター中に移行した。２０μｇの精 製されたｐｃＨＩＴ−ＡＦＮＢ、　ｐｃＨｒＴ−ＡＦＳＢ。I　MGFFLFSQ? lP　5PFLVSTLL　FLIIS)IssHA QNPGTMDTAS DAAAAAAALTA51 A11l/l/IAAA KI, T ADNAAAAAAA TAR”CaMV35S promoter, Ca b 22 L'J-dar, ChiA or PR1b signal sequence (not present) et al.), the complete sequence containing the antifreeze gene and the nos polyadenylation signal was implanted. The vector was transferred into a vector that can be used to transform cells. 20 μg of sperm pcHIT-AFNB and pcHrT-AFSB produced.

ｐＣ）ＩＩＴ−ＡＦＳＳ又はｐｃＨＩＴ−ＡＦＳＳ２を、ＢｇｌＩＩ及び）（ｉ ｎｄＩＩ［により切断した。Ｂａ］ＩＩは、ＤＮＡ５’　〜ＣａＭＶ３５Ｓプロ モーターの領域において切断し、そしてＨｉｎｄｌ［ＩはＤＡＮ３’〜ｎｏｓポ リアデニル化配列の領域にお化工列断する。pC)IIT-AFSS or pcHIT-AFSS2 with BglII and)(i Cleaved with ndII [. Ba]II is DNA5'~CaMV35S Pro cut in the region of the motor and Hindl[I is the DAN3'~nos point. A chemical sequence is made in the region of the rearenylated sequence.

Ｂｇ　Ｉ　Ｕ−Ｈｉ　ｎｄＩ［［フラグメントを、０．８％のアガロースゲルか らの電気溶出により精製し、フェノール：クロロホルムの１＝１混合液により抽 出し、そして上記のように０．３ＭのＮａ０Ａｃ、酵母ｔＲＮＡ及びエタノール により沈殿せしめた。精製されたフラグメントを、２５μ１ＯＴＥ中に再懸濁し た０次に、個々のフラグメントを、二元ベクターｐＪＪ２９６４中にクローン化 した。１０ｕｇのｐＪＪ２９６４ＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＴ（ Ｉ及びＨｉｎｄＩ［［により切断し、電気溶出により０．８％のアガロースゲル から精製し、フェノール／クロロホルムにより抽出し、そしてエタノールにより 沈殿せしめた。切断されたＤＮＡを２０μｌのＴＥに再懸濁した。不凍化発現力 セントを二元ベクター中に連結するために、精製されたＢａｍＨＩ　−Ｈｉ　ｎ 　ｄｌ［［切断の二元ベクター２μｍを、それぞれ精製されたＢｇｌＩｒ−Ｈｉ ｎｄｌｌｉフラグメント２μｌと共に別々の反応において混合し、そしてその混 合物を４°Ｃで一晩、２０μｍのリガーゼ緩衝液においてインキュベートした。Bg I U-Hi nd I [[Put the fragment into a 0.8% agarose gel It was purified by electroelution of and 0.3 M Na0Ac, yeast tRNA and ethanol as above. It was precipitated by The purified fragment was resuspended in 25 μl OTE. Next, individual fragments were cloned into the binary vector pJJ2964. did. 10 ug of pJJ2964 DNA was digested with restriction endonuclease BamT ( I and HindI [[] and electroelution on a 0.8% agarose gel. purified with phenol/chloroform and extracted with ethanol. It was allowed to precipitate. The cut DNA was resuspended in 20 μl TE. Antifreezing ability To ligate the cent into the binary vector, purified BamHI-Hi n dl[[2 μm of the cleaved binary vector was ndlli fragment in a separate reaction and discard the mixture. The compounds were incubated in 20 μm ligase buffer overnight at 4°C.

次に、その連結を用いて、旦−ユニＨＢＩＯＩのコンピテント細胞を形質転換し 、そして１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地上に置いた。プラス ミドＤＮＡを、これらのプレート上で増殖せしめられたコロニーから調製し、そ して酵素Ｘｈｏｌ及びＨｉｎｄｌ［［により切断した。切断されたプラスミドＤ ＮＡを、正しい大きさのフラグメントの存在について、１％アガロースゲル上で の電気泳動により調べた。予測される大きさのフラグメントが、個々の場合で見 出され、正しい連結生成物が得られたことを確証した。得られたプラスミドを、 ２９６４−ＡＦＮＢ。The ligation was then used to transform competent cells of Dan-UniHBIOI. , and placed on LB medium containing 10 μg/ml tetracycline. plus Mid-DNA was prepared from colonies grown on these plates and and cleaved with the enzymes Xhol and Hindl. Cut plasmid D NA was run on a 1% agarose gel for the presence of correctly sized fragments. was investigated by electrophoresis. Fragments of the expected size are seen in each case. to ensure that the correct ligation product was obtained. The obtained plasmid, 2964-AFNB.

２９６４−ＡＦＳＢ、　２９６４−ＡＦＳＳ及び２９６４−ＡＦＳＳ２と命名し た。これらは、それぞれｐｃＨＩＴ−ＡＳＮＢ、　ｐｃＨＩＴ−ＡＦＳＢ、　ｐ ＣＨＩＴ−ＡＦＳＳ及びｐＣＨＩＴ−ＡＦＳＳ２に由来した。これらの構成の詳 細は、第８Ｃ図に示される。Named 2964-AFSB, 2964-AFSS and 2964-AFSS2. Ta. These are pcHIT-ASNB, pcHIT-AFSB, p were derived from CHIT-AFSS and pCHIT-AFSS2. Details of these configurations Details are shown in Figure 8C.

Ｄ、Ｊｏ　゛−゛ニーブースミドに　る　バコのン植物組織の形質転換の前、ｐ ＪＪ２９６４に由来する二元プラスミドを、トリベアレンタル接合（ｔｒｔｐａ ｒｅｎｔａｌ　ｍａｔｉｎｇ）により工へ−二ｌｌ≦Ｌ乙２≦１７’；１株ＬＢ Ａ４４０４中に導入した。D, Jo゛-゛Before transformation of Baconon plant tissue in kneebooth midge, p The binary plasmid derived from JJ2964 was subjected to avian rental conjugation (trtpa Rental mating) to the factory - 2 ≦ L 2 ≦ 17'; 1 stock LB It was introduced into A4404.

プラスミドｐＡＬ４４０４を有する工へ、漫２ムヱに６互２ノ、ＬＢＡ４４０１ ７）新鮮な培養物を、最少Ａ　（１０，５ｇ（ＤＫｔＰＯ４，４，５ｇＯ）ＫＨ ｔＰＯａ　、　１　ｇ（Ｄ　ＣＮＨａ）ｚｓｏ、、０．５ｇのクエン酸ナトＩＪ ウム−２ＨｚＯ１Ｉ　ＭノＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ，−７Ｈ２Ｏ１１１１，２０％グルコ ース１０ｍ１．水１１まで）における単一のコロニーから２８°Ｃで２４時間、 増殖せしめた。To the plant containing plasmid pAL4404, 6 times 2 times each, LBA4401 7) Add fresh culture to a minimum of A (10,5 g (DKtPO4,4,5 gO) KH tPOa, 1 g (DCNHa) zso, 0.5 g sodium citrate IJ um-2HzO1I MノMgS O, -7H2O1111, 20% gluco space 10m1. from a single colony in water (up to 11) for 24 h at 28 °C. Made it multiply.

プラスミドｐＲＫ２０１３を含む旦、ユ１ＨＢ１０１及び上記のｐＪＪ２９６４ 誘導体を含ｔ；一旦ヨエ１」−ＨＢ　１０１を、Ｌブイヨンにおいて６時間増殖 せしめた。０．５■ｌの八−２ｆ７　’１１７７、培養物を、０．２５ｍ１のＨ ＢＩＯＩ／ｐＲＫ２０１３及び１）（７）ｐＪＪ２９６４誘導体を含む、０．２ ５＊１のＨＢＩＯＩと共に、同じＬＢ寒天プレート上で混合し、そしてそのプレ ートを２８°Ｃで２４時間インキュベートした。Containing plasmid pRK2013, Yu1HB101 and the above pJJ2964 Once containing the derivative, 1'-HB 101 was grown in L broth for 6 hours. I forced it. 0.5 ml of 8-2f7'1177 culture was added to 0.25 ml of H BIOI/pRK2013 and 1) (7) pJJ2964 derivative, 0.2 Mix on the same LB agar plate with 5*1 HBIOI and add the The plates were incubated at 28°C for 24 hours.

個々のプレートからループにより取られた細菌を、ＩＱｌｌの最少Ａに再懸濁し 、そして１００μｇ／ｍｌのりファンピシン及び１００μｇ／ｍｌのテトラサイ クリンを含むＬＢプレート上に１０°、１０−”及び１０−４希釈度でプレート した。２８°Ｃで数日間の増殖の後、個々のコロニーを、１μｇ／ｌａｌのテト ラサイクリンを含む最少Ａプレート上に再画線培養した。Bacteria taken by loop from individual plates were resuspended in IQll min A. , and 100 μg/ml funpicin and 100 μg/ml tetracycline. Plate at 10°, 10-” and 10-4 dilutions on LB plates containing Clin. did. After several days of growth at 28°C, individual colonies were incubated with 1 μg/lal of Tet. Re-streaked onto minimal A plates containing lacycline.

ｉｉ　）　Ｌバユ■星！粒隻。ii) L Bayu ■ Star! Grain ship.

すべての操作は、滅菌条件下で行なわれた。必要な二元プラスミドを含むアゲ１ オバク″″１ウム株の培養物を、最少Ａ培地において２８°Ｃで２４時間増殖せ しめた。葉ディスクを、内径０．５０−のコルク孔あけ機を用いて、滅菌下で増 殖されたＳＲＩ三ユ土１±工二土ｚ　−４（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕ ｓ）植物の葉から押抜いた。アグロバク′″１ウム培養物を、ＭＳ／８５　０． １／１．０　（下記に定義される）に希釈し、５Ｘ　１０　’／ｍｌの最終濃度 にした。ＭＳ／Ｂ５　０．１／１．０を次の通りにして調製した：１６．５ｇの ＮＨ，ＮＯ，，１９ｇのＫＮＯｈ　、３．７　ｇのＭ　ｇ　Ｓ　Ｏａ・７Ｈっ０ ．１．７ｇのＫＨｚＰＯａ　、４．４　ｇのＣａＣ１ｘ’２ＨｚＯを１１当たり 含むＭＳ主要塩の１０倍原液を調製した。１９，８００餉ｇのＭｎ０１ｚ・４Ｈ ｔＯ１６，２００ａ＋ｇのＨｓ　Ｂ　Ｏｓ、８，６２５ｍｇのＺｎ５Ｏａ・７Ｈ ｚＯ１８３０＋ｇのＫｌ、２５０ｍｇのＮａＭ　ｏ　Ｏｇ、２５ｔａｇのＣｕ　 Ｓ　Ｏ−・５　）（ｇｏ、２５ｙａｇのＣｏＣ１，−６Ｈ８０を１１当たりに含 むＭＳマイナー塩の１．０００倍原液を調製した。１００ｍｇのニコチン酸、１ ，０００ｍｇのチアミンＭＣＩ、１００ｍｇのピリドキシンＨＣＩ、１，０００ ■ｇのｍｙｏ−イノシトールを１１当たり含むＢ５ビタミンの１００倍原液を調 製した。３．７３ｇのＮａ、ＥＤＴＡ、２．７８ｇのＦ　ｅ　Ｓ　Ｏ−・７　Ｈ ｚＯを１１当たり含むＭＳ　ＦｅＥＤＴＡの１００倍原液を調製した。ＭＳ／Ｂ ５　０．１／１．０を次のようにして製造した： ＭＳＭＳ主要塩　１０Ｘ　１００ｍ１ ＭＳマイナー塩　１０００Ｘ　１＋ｍ１Ｍ５　ＦｅＥＤＴＡ　１００Ｘ　１０ｍ １Ｂ５　ビタミン　１００Ｘ　１０ｍ１ ＭＥＳ　０．　５９ｇ スクロース　３０ｇ ナフタレン酢酸　０．１８ ６−ベンジルアミノビリン　１．Ｏｍｇ固体ＭＳ／Ｂ５　０．１／１．０のため には、８ｇの寒天が１１当たり添加された。葉ディスクを、エフ０ｚｆ−１クー 左懸濁液中にそれぞれ１秒間、含浸し、そして次に、プレート当たり１０個のデ ィスクを有する同時培養プレート上に配置した。同時培養プレートは、単一の殺 菌されたＷｈａｔｍａｎ　＃１の７ｃ＋ｉのフィルターディスクにより被覆され た固体ＭＳ／Ｂ５　０．ｌ／１．Ｏである０葉ディスクを、ヱ五−３！色乙之ユ Ｌ１脇、と共に２８°Ｃで２日間、同時培養した。その同時培養は、５００μｇ ／ｍｌのセホタキシム（ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ）を含むＭＳ／ＢＳ　０．１／１ ．０中で葉ディスクを培地の１回の交換を伴って洗浄することによって停止され た。次に、ディスクを、５００μｇ／ｍｌのセホタキシムを含む固体ＭＳ／Ｂ５ 　０．１／１．０上に置き、そして２８°Ｃで３日間インキュベートした。次に 、ディスクを選択培地（５００μｇ／ｌｌ１１のセホタキシム及び１００μｇ／ ｍｌのカナマイシンを含むＭＳ／Ｂ５　０．１／１．０）に移した。このディス クを、高い光の影響下で１６時間、及び暗室において８時間、２６℃でこの培地 上で培養せしめた。２〜３週間後、カナマイシン耐性のカルス及び続いて、カナ マイシン耐性の新芽が出現し始める。これらが殺菌された鉗子により取扱われる のに十分な大きさである場合、それらを、選択しないで根用培地（２μＭのイン ドール酪酸を含むＭＳ　０．１／１．Ｏ２但しナフタレン酢酸又は６−ベンジル アミノプリンを含まない）に移し、そして１４日間、根の形成を可能にした０次 にそれらを切り出し、そして１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む根用培地に 移した。この培地上で根を十分に発育した植物はすべて形質転換体であった０次 にそれらを、ナフタレン酢酸又は６−ベンジルアミノビリンを含まない固体ＭＳ ０．１７１．０を含むＭａｇｅｎｔａ箱に移した。All operations were performed under sterile conditions. Age 1 containing the necessary binary plasmids A culture of Obaku ``'' 1um strain was grown for 24 hours at 28°C in minimal A medium. Closed. Leaf discs were expanded under sterile conditions using a cork borer with an internal diameter of 0.50- The cultivated SRI three soils 1 ± two soils -4 (Nicotiana tabacu s) Pressed out from the leaves of plants. Agrobacterium ''' 1um culture was grown at MS/850. Dilute to 1/1.0 (defined below) to a final concentration of 5X 10'/ml I made it. MS/B5 0.1/1.0 was prepared as follows: 16.5 g of NH, NO,, 19g of KNOh, 3.7g of MgS Oa・7H0 ．． 1.7g KHzPOa, 4.4g CaC1x’2HzO per 11 A 10x stock solution of MS major salts was prepared. 19,800g Mn01z・4H tO16,200a+g Hs B Os, 8,625mg Zn5Oa 7H zO1830+g Kl, 250mg NaMoOg, 25tag Cu SO-・5) (go, 25yag of CoC1, -6H80 per 11 A 1.000x stock solution of MS minor salt was prepared. 100mg nicotinic acid, 1 ,000mg Thiamine MCI, 100mg Pyridoxine HCI, 1,000 ■ Prepare a 100x stock solution of B5 vitamin containing 11g of myo-inositol. Manufactured. 3.73g Na, EDTA, 2.78g F e S O-・7H A 100x stock solution of MS FeEDTA containing 11 parts of zO was prepared. MS/B 5 0.1/1.0 was manufactured as follows: MSMS main salt 10X 100ml MS minor salt 1000X 1+m1M5 FeEDTA 100X 10m 1B5 Vitamin 100X 10ml MES 0.　59g Sucrose 30g Naphthalene acetic acid 0.18 6-Benzylaminovirine 1. For Omg solid MS/B5 0.1/1.0 8g of agar was added per 11 minutes. The leaf disc was Immerse in the left suspension for 1 second each and then add 10 pieces per plate. placed on a co-culture plate with discs. Co-culture plates Covered with a sterilized Whatman #1 7c+i filter disc. Solid MS/B5 0. l/1. The 0 leaf disk that is O is E5-3! color oto no yu Co-cultured with L1 flank for 2 days at 28°C. The co-culture was 500 μg MS/BS 0.1/1 containing cefotaxime/ml ．． The leaf discs were stopped by washing with one change of medium in 0. Ta. The discs were then washed with solid MS/B5 containing 500 μg/ml of cefotaxime. 0.1/1.0 and incubated for 3 days at 28°C. next , disks were coated with selective medium (500 μg/l 11 cefotaxime and 100 μg/l MS/B5 0.1/1.0) containing 1 ml of kanamycin. This dis This medium was incubated at 26°C for 16 hours under the influence of high light and for 8 hours in the dark. cultured on the top. After 2-3 weeks, kanamycin-resistant callus and subsequently kanamycin-resistant callus Mycin-resistant shoots begin to appear. These are handled with sterile forceps. If they are large enough for MS containing Dole butyric acid 0.1/1. O2 However, naphthalene acetic acid or 6-benzyl (without aminopurine) and allowed root formation for 14 days. cut them out and place them in root medium containing 100 μg/ml kanamycin. Moved. All plants that fully developed roots on this medium were transformants. of solid MS without naphthaleneacetic acid or 6-benzylaminovirine. Transferred to Magenta box containing 0.171.0.

導入された不凍化遺伝子の発現のレベルについてアッセイするために、ＲＮＡを 、形質転換された植物の葉から抽出し、そしてＲＮアーゼ保護の技法を用いるこ とによって、不凍化ｍＲＮＡの存在についてアッセイした。To assay for the level of expression of the introduced antifreeze gene, the RNA was , extracted from the leaves of transformed plants and using the technique of RNase protection. The presence of unfrozen mRNA was assayed by.

ＲＮＡを、６種のインビトロ成長せしめられたタバコ植物の葉から抽出し、その それぞれは、二元プラスミド２９６４−ＡＦＮＢによるユニークな形質転換出来 事の生成物であった。３〜４ｃｍの長さの２枚の葉を個々の植物から取り、液体 窒素中で凍結せしめ、そしてモーター及び乳鉢を用いて細かな粉末に粉砕した。RNA was extracted from leaves of six in vitro grown tobacco plants and Each has a unique transformation capability with the binary plasmid 2964-AFNB. It was a product of things. Two leaves, 3-4 cm long, are removed from each plant and the liquid It was frozen in nitrogen and ground to a fine powder using a motor and mortar.

その粉末を、５■ｌのフェノール（水により平衡化された）、５１のクロロホル ム及び５＋ＩｌｌのＮＴＥＳ（０，１ＭのＮａＣ］、０．ＯＩＭのトリスＭＣＩ 、ｐＨ７゜５．１ａｉＭのＥＤＴＡ、１％の５ＤＳ）を含むキャップされたポリ プロピレン管に移し、そしてその管を３０秒間撹拌した。The powder was mixed with 5 l of phenol (equilibrated with water), 5 l of chloroform, and 5+Ill of NTES (0.1M NaC), 0.OIM of Tris-MCI 5.1 aiM EDTA, 1% 5DS) at pH 7°. Transferred to a propylene tube and stirred the tube for 30 seconds.

次に、抽出混合物を、３０ｍ１のＣｏｒｅｘ管に移し、そして５ｏｒｖａｌｌ　 ５Ｓ−３４０−ターにより８．ＯＯＯｒｐｍで１０分間撹拌した。上部の水性層 を取り出し、そして抽出を、水性層が透明になり、そして有機層と水性層との間 の界面で沈殿物質が存在しなくなるまで、くり返した。次に水性層を、３ＭのＮ ａ０Ａｃ　（ｐＨ６）０．５＋ａｌを含む３０＋ｉ］の新しいＣｏｒｅｘ管に移 し、そしてエタノール１２．５＋＋＋］を添加した。その管の内容物を混合し、 そして次に、−２０°Ｃに２０分間にねたって２．冷せしめた。次に、その管を ８，０００　ｒｐｍで１５秒間、５ｏｒｖａｌｌ　５Ｓ−３４０−ターを用いて 回転せしめ、核酸をペレット化した。そのベレットを、４ＭのＬｉ０Ａｃ　２． ５ｍｌに再懸濁し、そして４°Ｃで３時間インキュベートした。次に、その管を 、５Ｓ−３４０−ターを用いて、８，０ＯＯｒｐＨで１５分間回転せしめ、ＲＮ Ａをペレット化した。そのベレットを水２．　５＋ａ１４こ再懸濁し、これに３ ＭのＮａ０Ａｃ　（ｐ）１６）２５０μｌ及びエタノール７ｍｌを添加した。そ の管を８，０ＯＯｒｐ＋Ｉｌで１５分間、再び回転せしめ、そしてそのベレット を７０％エタノール５ｍ］により洗浄した。ベレットを真空下で乾燥せしめ、そ して次に水２００μｍに再懸濁した。The extraction mixture was then transferred to a 30 ml Corex tube and 5 orvall 8. By 5S-340-tar. Stirred at OOOrpm for 10 minutes. upper aqueous layer Take out and extract until the aqueous layer becomes clear, and between the organic layer and the aqueous layer The process was repeated until no precipitated material was present at the interface. The aqueous layer was then washed with 3M N a0Ac (pH 6) 0.5 + 30+i containing al) into a new Corex tube. and 12.5+++] of ethanol was added. mix the contents of that tube, Then, leave it at -20°C for 20 minutes. I let it cool down. Next, the tube using a 5orvall 5S-340-tar for 15 seconds at 8,000 rpm. Spin to pellet the nucleic acids. 4M Li0Ac 2. Resuspend in 5 ml and incubate for 3 hours at 4°C. Next, the tube , using a 5S-340-tar, rotated for 15 minutes at 8,00 OrpH, and A was pelletized. Water the beret with 2. Resuspend 5+a14 and add 3 250 μl of NaOAc (p) 16) and 7 ml of ethanol were added. So The tube was spun again for 15 minutes at 8,000 Orp + Il, and the pellet was washed with 5 ml of 70% ethanol. Dry the pellet under vacuum and and then resuspended in 200 μm water.

形質転換された植物から抽出されたＲＮＡにおける予測されるｍＲＮＡの存在を 確立するために、ＲＮアーゼ保護の技法を用いた。この技法においては、予測さ れるｍＲＮＡに対して相補的である短いプローブを、それが′Ｐによりラベルさ れるように合成した。次にそれを、植物ＲＮＡによりハイブリダイズする。ハイ ブリダイゼーションが行なわれた後、ＲＮＡを、−末鎖ＲＮＡに対して特異的な 酵素により消化した。そのプローブに相補的な配列がＲＮＡ調製物に存在する場 合、それらは、プローブと共にアニールし、ＲＮアーゼ消化に耐性であろう二本 鎖ＲＮＡを形成するであろう。次にこれは、ゲル電気泳動及びオートラジオグラ フィーにより検出され得る。The presence of predicted mRNA in RNA extracted from transformed plants To establish this, the technique of RNase protection was used. In this technique, the predicted A short probe that is complementary to the mRNA to be It was synthesized so that It is then hybridized with plant RNA. Yes After hybridization has taken place, the RNA is transformed into a Digested with enzymes. If a sequence complementary to that probe is present in the RNA preparation, If so, they will anneal with the probe and be resistant to RNase digestion. will form stranded RNA. This is then followed by gel electrophoresis and autoradiography. can be detected by fees.

不凍化遺伝子を検出するプローブを製造するために、ＰＧＭＭ５からのＥｃｏＲ Ｉ−Ｈｊｎｄｌｆｆ７ラグメントを、市販のプラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　 （−）中に、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｍ部位でクローン化した。得られたプラス ミドはＢ　Ｓ　（−）Ａ　Ｆとして言及される。ＢＳ（−）ＡＦ　ＤＮＡを精製 し、そして５μｇをＥｃ　ｏＲ１により消化し、それを不凍化遺伝子のＡＴＧの 上流で切断する。その切断されたＤＮＡを、フェノール及びクロロホルムによる 抽出により精製し、そして０．３ＭのＮａ０Ａｃ及びエタノールにより沈殿せし めた。不凍化ｍＲＮＡに相補的な３２ｐ−ラベルされたＲＮＡを、Ｔ３　ＲＮＡ ポリマラーゼを用いて、Ｐｒｏｍｅｇａ　ＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ、からの市販の 本に記載しているようにして、リボプローブ反応を用いることによって合成した 。精製されたラベルプローブを、水２５μ■に再懸濁した。６種の形質転換され た植物のそれぞれからのＲＮＡ　１０ｐｇ及び不凍化遺伝子を含まない異なった 二元ベクターにより形質転換されたタバコ植物からのＲＮＡ　１０ｐｇを、真空 下で乾燥せしめ、そして次に３０μｍのハイブリダイゼーション緩衝液（４０ｎ ＋ＭのＰＩＦＥＳ　（ｐＨ６，７）、０．４ＭのＮａＣ］、１ｍＨのＥＤＴＡ） に再懸濁した。酵母からのｔＲＮＡ　１０ｐｇを含む対照管をまた製造した。プ ローブ１μｍを個々のサンプルに添加した。サンプルを、蒸発を防ぐために３０ μｍの鉱油により被覆し、８５°Ｃで５分間、次に４５℃で１８時間インキュベ ートした。ＲＮＮアーゼ及びＴＩ　ＲＮアーゼによる消化及び変性６％ポリアク リルアミドゲル上への負荷のためのサンプルの調製が、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏ ｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、からの商業的な方法に記載しているようにして行なわれた。EcoR from PGMM5 was used to produce a probe to detect the antifreeze gene. The I-Hjndlff7 fragment was converted into a commercially available plasmid Bluescript. (-), cloned at the EcoRI and Hindm sites. obtained plus Mido is referred to as BS(-)AF. Purify BS(-)AF DNA Then, 5 μg was digested with EcoR1, and it was digested with the antifreeze gene ATG. Cut upstream. The cut DNA was treated with phenol and chloroform. Purified by extraction and precipitated with 0.3M Na0Ac and ethanol. I met. 32p-labeled RNA complementary to the unfrozen mRNA was converted into T3 RNA. Commercially available polymerase from Promega Biotech Inc. Synthesized by using riboprobe reaction as described in the book . The purified labeled probe was resuspended in 25 μl of water. 6 types of transformed 10 pg of RNA from each of the plants 10 pg of RNA from tobacco plants transformed with the binary vector was transferred under vacuum. Let dry under water and then add 30μm hybridization buffer (40n +M PIFES (pH 6,7), 0.4M NaC], 1mH EDTA) resuspended in. A control tube containing 10 pg of tRNA from yeast was also prepared. P A 1 μm lobe was added to each sample. Samples were heated for 30 minutes to prevent evaporation. coated with μm mineral oil and incubated at 85°C for 5 min, then at 45°C for 18 h. I started. RNNase and TI RNase digestion and denatured 6% Polyac Preparation of samples for loading onto lylamide gels was performed using Promega Bio The procedure was carried out as described in the commercial method from Tech Inc.

また、サイズマーカー（ＨｐａＩＩにより切断され、そして３２ｐによりラベル されたｐＢＲ３２２ＤＮＡ）及び元のりボブローブの５００倍希釈が同じゲル上 に負荷された。Additionally, size markers (cleaved by HpaII and labeled by 32p) pBR322 DNA) and a 500-fold dilution of the original Bob lobes on the same gel. was loaded.

電気泳動に従って、ゲルを、１０％酢酸、１０％メタノールに１０分間固定し、 次にＷｈａｔｍａｎフィルター紙Ｎｏ。According to electrophoresis, the gel was fixed in 10% acetic acid, 10% methanol for 10 min, Next, Whatman filter paper no.

１上で乾燥せしめ、そしてオートラジオグラフィー処理した（第９図を参照のこ と）。1 and autoradiographed (see Figure 9). and).

プラスミドｐＣ，ＭＭ５における不凍化遺伝子の配列とプラスミド２９６４−Ａ ＦＮＢにおいてクローン化されるような不凍化遺伝子の配列とを比較することか ら、不凍化遺伝子に対応するｍＲＮＡがトランスゲニック植物において実際、合 成される場合、上記のＲＮアーゼ保護アッセイは１３４個の塩基対の保護された フラグメントを導びくことが予測され得る。この大きさのフラグメントは、個々 の形質転換された植物からのＲＮＡを含むレーンに見出されるが、しかし不凍化 遺伝子を発現しない植物からの対照のレーン又はｔＲＮＡのみを有する対照のレ ーンには見出されなかった。そのハンドの相対的強度は変化し、いづれかの導入 された遺伝子の発現レベルが同じ形質転換実験からの個々の再生された植物間で 変化する既知の事実を示した。この実験の結果は、不凍化タンパク質のための合 成遺伝子が植物中に導入され、そしてこの遺伝子が植物組織において発現される ことを示した。Sequence of antifreeze gene in plasmid pC, MM5 and plasmid 2964-A Is it possible to compare the sequence of the antifreeze gene as cloned in FNB? et al., the mRNA corresponding to the antifreeze gene is actually synthesized in transgenic plants. If the RNase protection assay described above is performed, the 134 base pair protected It can be expected to lead to fragments. Fragments of this size are individually found in lanes containing RNA from transformed plants, but not frozen Control lanes from plants that do not express the gene or control lanes with only tRNA. It was not found in the The relative strength of that hand changes and the introduction of either The expression level of the transduced gene is the same between individual regenerated plants from a transformation experiment. Illustrated known facts that change. The results of this experiment demonstrate that the synthesis for antifreeze proteins is adult gene is introduced into the plant and this gene is expressed in plant tissue It was shown that

ＲＮＡを、インビトロで成長せしめられたタバコ植物の葉から抽出し、そのそれ ぞれはシグナル含有二元プラスミド２９６４−ＡＦＳＢ　（１０個の植物）又は ２９６４−ＡＦＳＳ（１７個の植物）によるユニークな形質転換出来事の生成物 であった。これらの不凍化構造体のいづれかの発現は、合成された不凍化タンパ ク質を、形質転換された植物組織における細胞間空間に向けるであろう。抽出は 、２９６４−ＡＦＮＢ形質転換体について上記に記載されるようにして行なわれ た。形質転換された植物から抽出されたＲＮＡにおけるｍＲＮＡの存在を、ＲＮ アーゼ保護の技法を用いて、及び上記と同じプローブを用いて、上記のようにア ッセイした。ゲルが、上記のように、電気泳動に従って得られた。RNA is extracted from leaves of tobacco plants grown in vitro; Each signal-containing binary plasmid 2964-AFSB (10 plants) or Product of a unique transformation event with 2964-AFSS (17 plants) Met. Expression of any of these antifreeze structures results in the production of synthesized antifreeze proteins. The cells will be directed to the intercellular spaces in the transformed plant tissue. Extraction is , as described above for the 2964-AFNB transformant. Ta. The presence of mRNA in RNA extracted from transformed plants was determined by As described above, using the enzyme protection technique and using the same probe as above. I said yes. A gel was obtained following electrophoresis as described above.

プラスミドｐＧＭＭ５における不凍化遺伝子の配列とプラスミド２９６４−ＡＦ ＮＢ又は２９６４−ＡＦＳＳにおいてクローン化されるような不凍化遺伝子の配 列とを比較することから、不凍化遺伝子に対応するｍ　ＲＮ　Ａがトランスゲニ ンク植物において実際、合成される場合、上記のＲＮアーゼ保護アッセイは１４ １個の塩基対の保護されたフラグメントを導びくことが予測され得る。この大き さのフラグメントは、個々の形質転換された植物からのＲＮＡを含むレーンに見 出されるが、しかし不凍化遺伝子を発現しない植物からの対照のレーン又はｔＲ ＮＡのみを有する対照のレーンには見出されなかった。そのバンドの相対的強度 は変化し、いづれかの導入された遺伝子の発現レベルが同じ形質転換実験からの 個々の再生された植物間で変化する既知の事実を示した。この実験の結果は、不 凍化タンパク質のだめの合成遺伝子（翻訳に基づいて、細胞間空間に、不凍化タ ンパク質及び不凍化活性を生成するためにシグナル配列をコードするＤＮＡを含 む）が植物中に導入され、そしてこの遺伝子が植物組織において発現されること を示した。Antifreeze gene sequence in plasmid pGMM5 and plasmid 2964-AF Antifreeze gene sequences as cloned in NB or 2964-AFSS From the comparison with the column, mRNA corresponding to the antifreeze gene is found in the transgen. If in fact synthesized in the mint plant, the RNase protection assay described above One could predict that it would lead to a one base pair protected fragment. this big fragments are seen in lanes containing RNA from individual transformed plants. Control lanes or tR from plants that are produced but do not express the antifreeze gene. None were found in the control lane with NA only. relative strength of that band changes, and the expression level of any introduced gene from the same transformation experiment. Known facts that vary between individual regenerated plants are presented. The results of this experiment are Synthetic gene for antifreeze proteins (based on translation, produces antifreeze proteins in the intercellular space) Contains DNA encoding a signal sequence to produce protein and antifreeze activity. ) is introduced into a plant, and this gene is expressed in plant tissues. showed that.

Ｆ、　パ　−・　４゛ニープラスミドによるトマトのノ■・ ｉ）アグロバクテリウム　へのニーブースミドの　−。F. Tomato production using plasmid 4. i) Neebusmid to Agrobacterium -.

プラスミド２９６４−ＡＦＮＢ及び２９６４−ＡＦＳＢを上記のようにしてアグ ロバクテリウム中に導入し、そしてトマトを形質転換するために使用された。Plasmids 2964-AFNB and 2964-AFSB were purified as described above. was introduced into Robacterium and used to transform tomatoes.

ｉｉ　）上ヱ上至ゑ亘転奥・ すべての操作は、滅菌条件下で行なわれた。必要な二元プラスミドを含むアゲ１ 才バクテリウム株の培養物を、最少Ａ培地において２８°Ｃで２４時間増殖せし めた。葉ディスクを、内径（１，５ｃｍのコルク孔あけ機を用いて、滅菌下で増 殖されたＢｏｎｎｉｅ　Ｂｅ５ｔトマト植物の葉から押抜いた。ヱグロバタテリ ウム培養物を、ＭＳ／Ｂ５　０．１／１．０（下記に定義される）に希釈し、５ Ｘ１０’／ｍｌの最終濃度にした。ＭＳ／Ｂ５　０．ｌ／］、Ｏを次の通りにし て調製した：１６．５ｇのＮ）１．ＮＯ３，１９ｇのＫＮＯ，，３，７ｇのＭ　 ｇ　Ｓ　Ｏａ・７Ｈ２０，１，７ｇのＫＨ２ＰＯ４，４，４ｇのＣａ　Ｃｌｚ・ ２ＨｚＯを１１当たり含むＭＳ主要塩の１０倍原液を調製した。１９，８００ｍ ｇのＭｎＣ１２・４Ｈ２０，６，２００ｍｇのＨ３Ｂ　Ｏｚ、８，６２５ＢのＺ ｎＳＯ４・７ＨｚＯ１８３０＋ｏｇのＫｌ、２５０ｍｇのＮａＭｏ０ｎ　、２５ ｍｇのＣｕ　Ｓ　Ｏ＝　・５　ＨｚＯ１２５ｍｇ（７）ＣｏＣＩｚ・６ＨｚＯを １１当たりに含むＭＳマイナー塩の１，０００倍原液を調製した。ii. All operations were performed under sterile conditions. Age 1 containing the necessary binary plasmids Cultures of bacterial strains were grown for 24 hours at 28°C in minimal A medium. I met. The leaf discs were expanded under sterile conditions using a cork borer with an internal diameter (1,5 cm). Pressed from leaves of propagated Bonnie Be5t tomato plants. Eglobatateri The sample culture was diluted to MS/B5 0.1/1.0 (defined below) and A final concentration of X10'/ml was made. MS/B5 0. l/], O as follows: Prepared: 16.5g N)1. NO3, 19g of KNO, 3.7g of M g S Oa・7H20, 1,7g KH2PO4, 4,4g Ca Clz・ A 10x stock solution of MS major salt containing 1/1/2 HzO was prepared. 19,800m g of MnC12・4H20, 6,200mg of H3B Oz, 8,625B of Z nSO4・7HzO1830+og Kl, 250mg NaMo0n, 25 mg of Cu S O = ・5 HzO 125 mg (7) CoCIz ・6 HzO A 1,000-fold stock solution of MS minor salt containing 11% was prepared.

ｌＱＯ＋ｗｇのニコチン酸、１．ＯＤＯｍｇのチアミン）（（１，１００ｍｇの ピリドキシンＭＣＩ、１，０００ｍｇのｍｙｏ−イノシトールを１１当たり含む Ｂ５ビタミンの１００倍原液を調製した。３．７３ｇのＮａｚＥＤＴＡ、２．７ ８ｇのＦｅ５Ｏ＝’７ＨｚＯを１１当たり含むＭＳ　ＦｅＥＤＴＡの１００倍原 液を調製した。ＭＳ／Ｂ５　０．１／１．Ｏを次のようにして製造した： 成　分　原　液　量７１ ＭＳ主要塩　１０Ｘ　１００ｍ１ ＭＳマイナー塩　１０００Ｘ　１ｍ１ Ｍ５　ＦｅＥＤＴＡ　１００ｘ　１０ｍｌＢ５　ビタミン　ｔｏｏｘ　１０ａ＋ ］ＭＥＳ　０．５９ｇ グルコース　３０ｇ インドール酢酸　０．０５ｍｇ ゼアチン　１．０ｍｇ 固体ＭＳ／８５　０．１／１．０のためには、８ｇの寒天が１１当たり添加され た。葉ディスクを、ヱヱ（三ヱΣダｊヨＬクー左怠濁液中にそれぞれ５〜１０分 間、含浸し、そして次に、プレート当たり１０個のディスクを有する同時培養プ レート上に配置した。同時培養プレートは、単一の殺菌されたｗｈａｔｍａｎ　 ＃１の７ｃｍのフィルターディスクにより被覆された固体ＭＳ／８５　０．１／ １．０である。葉ディスクを、アグロバクテリウムと共に２４℃で２日間、同時 培養した。lQO+wg nicotinic acid, 1. ODOmg thiamin) ((1,100mg Pyridoxine MCI, contains 1,000 mg myo-inositol per 11 A 100x stock solution of B5 vitamin was prepared. 3.73g NazEDTA, 2.7 MS containing 8g of Fe5O = '7HzO per 100 times the original content of FeEDTA A liquid was prepared. MS/B5 0.1/1. O was prepared as follows: Ingredients Original liquid amount 71 MS main salt 10X 100ml MS minor salt 1000X 1m1 M5 FeEDTA 100x 10mlB5 Vitamin toox 10a+ ]MES 0.59g Glucose 30g Indole acetic acid 0.05mg Zeatin 1.0mg For solid MS/85 0.1/1.0, 8g agar is added per 11 Ta. Place the leaf discs in the slurry solution for 5 to 10 minutes each. and then a co-culture plate with 10 discs per plate. placed on the rate. Co-culture plates contain a single sterilized whatman Solid MS/85 0.1/ coated with #1 7cm filter disc It is 1.0. Leaf discs were incubated simultaneously with Agrobacterium for 2 days at 24°C. Cultured.

その同時培養は、５０ｍｇ／ｍｌのセホタキシム（ｃｅｆｏｔａｘｉｌｌｌｅ） を含むＭＳ／ＢＳ　Ｏ，１，／１．０中で葉ディスクを培地の１回の交換を伴っ て洗浄することによって停止された。次に、ディスクを、５０ｍｇ／ｍｌのセホ タキシムを含む固体ＭＳ／Ｂ５　０．１／１．０上に置き、そして２８℃で３日 間インキュベートした。次に、ディスクを選択培地（５００μｇ／＋ｅｌのカル ベニシリン及び５０ｇｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＭＳ／８５　０．１／１． ０）に移した。このディスクを、高い光の影響下で１６時間、及び暗室において ８時間、２６°Ｃでこの培地上で培養せしめた。２〜３週間後、カナマイシン耐 性のカルス及び続いて、カナマイシン耐性の新芽が出現し始める。新芽を葉ディ スクから切除し、そしてＭＳ／Ｂ５０．１／１．０に類似する（但し、ゼアチン レベルが０．　５ｍｇ／）に減じられている）新芽発育培地に移した。選択４よ 、カルベニシリン（５００ｍｇ／ｌ）及びカナマイシン（１００Ｂ／Ｉ）の包含 により維持された。これらが殺菌された鉗子により取扱われるのに十分な大きさ である場合、それらを、選択しないで根用培地（２μＭのインドール醋酸を含む ＭＳＯ，１／１．Ｏ１但しインドール酢酸又はゼアチンを含まない）に移し、そ して１４日間、根の形成を可能にした。次にそれらを切り出し、そして１００μ ｇ／＋ｍｌのカナマイシンを含む根用培地に移した。この培地上で根を十分に発 育した植物はすべて形質転換体であった。次にそれらを、ナフタレン酢酸又は６ −ベンジルアミノビリンを含まない固体ＭＳ　０゜１／１．Ｏを含むＭａｇｅｎ ｔａ箱に移した。The co-culture was treated with 50 mg/ml cefotaxille. Leaf discs were grown in MS/BS O,1,/1.0 with one change of medium. It was stopped by washing. The discs were then exposed to 50 mg/ml of Place on solid MS/B5 0.1/1.0 containing taxim and for 3 days at 28 °C. Incubated for a while. Next, the discs were placed in selective medium (500 μg/+el). MS/85 0.1/1. containing benicillin and 50 gg/ml kanamycin. 0). This disc was placed under the influence of high light for 16 hours and in a dark room. Cultures were grown on this medium for 8 hours at 26°C. After 2-3 weeks, kanamycin resistance Sexual calli and subsequently kanamycin-resistant shoots begin to appear. Di leaves the sprouts MS/B50.1/1.0 (with the exception of zeatin Level is 0. Transferred to sprout growth medium (reduced to 5 mg/)). Choice 4 , inclusion of carbenicillin (500 mg/l) and kanamycin (100B/I) maintained by. large enough that they can be handled with sterile forceps If the MSO, 1/1. O1 (but does not contain indole acetic acid or zeatin), and then This allowed root formation for 14 days. Then cut them out and 100μ Transferred to root medium containing g/+ml kanamycin. Roots are fully developed on this medium. All the plants grown were transformants. They are then combined with naphthalene acetic acid or 6 - Solid MS without benzylaminovirine 0°1/1. Magen containing O I moved it to a ta box.

導入された不凍化遺伝子の発現のレベルにつし）でアッセイするために、ＲＮＡ を、形質転換された植物の葉から抽出し、そしてＲＮアーゼ保護の技法を用いる ことによって、不凍化ｍＲＮＡの存在についてアッセイした。To assay the level of expression of the introduced antifreeze gene, is extracted from the leaves of the transformed plants and using the technique of RNase protection. The presence of unfrozen mRNA was assayed by.

ＲＮＡを、温室又はＭａｇｅｎｔａ箱で成長せしめられたトマト植物の葉から抽 出した。個々の形質転換体は、二元ブラスミド２９６４−ＡＦＮＢ　（１４個の 植物）又は２９６４−ＡＦＳＢ　（７個の植物）によるユニークな形質転換出来 事の生成物であった。葉組織を個々の植物から取り、液体窒素中で凍結せしめ、 そしてモーター及び乳鉢を用いて細かな粉末に粉砕した。その粉末を、５ｍｌの フェノール（水により平衡化された）、５Ｉ１１ノクロロホルム及び５＋１１１ （７）ＮＴＥＳ　（０゜１ＭのＮａＣ］、０．ＯＩＭのトリスＨＣＩ、ｐＨ７， ５，１１のＥＤＴＡ、１％の５ＤＳ）を含むキャップされたポリプロピレン管に 移し、そしてその管を３０秒間撹拌した。次に、抽出混合物を、３０ｍ１のＣｏ ｒｅｘ管に移し、そして５ｏｒｖａｌｌ　５Ｓ−３４０−ターにより８．ＯＯＯ ｒｐｍで１゜分間撹拌した。上部の水性層を取り出し、そして抽出を、水性層が 透明になり、そして有機層と水性層との間の界面で沈殿物質が存在しなくなるま で、くり返した。次に水性層を、３ＭのＮａ０Ａｃ　（ｐＨ６）０．５ｍｌを含 む３０ｍ１の新しいＣｏｒｅｘ管に移し、そしてエタノール１２．５ｍｌを添加 した。RNA was extracted from leaves of tomato plants grown in greenhouses or Magenta boxes. I put it out. Individual transformants were derived from binary plasmid 2964-AFNB (14 plants) or 2964-AFSB (7 plants). It was a product of things. Leaf tissue is removed from individual plants and frozen in liquid nitrogen; It was then ground into a fine powder using a motor and mortar. 5ml of the powder Phenol (equilibrated with water), 5I11 nochloroform and 5+111 (7) NTES (0°1M NaC), 0.OIM Tris-HCI, pH 7, 5,11 EDTA, 1% 5DS) in a capped polypropylene tube. and the tube was agitated for 30 seconds. The extraction mixture was then combined with 30 ml of Co 8. Transfer to a rex tube and incubate with 5 orvall 5S-340-tar. OOO Stir for 1° at rpm. Take out the upper aqueous layer and perform the extraction until the aqueous layer is until it becomes clear and no precipitated material is present at the interface between the organic and aqueous layers. So I repeated. The aqueous layer was then washed containing 0.5 ml of 3M Na0Ac (pH 6). Transfer to a new 30 ml Corex tube and add 12.5 ml of ethanol. did.

その管の内容物を混合し、そして次に、−２０°Ｃに２０分間にわたって急冷せ しめた。次に、その管を８．ＯＯＯｒｐｍで１５秒間、５ｏｒｖａｌｌ　５Ｓ− ３４０−ターを用いて回転せしめ、核酸をペレット化した。そのペレットを、４ ＭのＬｉ０Ａｃ　２．５ｍｌに再懸濁し、そして４°Ｃで３時間インキュベート した。次に、その管を、ＳＳ〜３４０−ターを用いて、８，０ＯＯｒｐ−で１５ 分間回転せしめ、ＲＮＡをペレット化した。そのペレットを水２．５ｍｌに再懸 濁し、これに３ＭのＮａ０Ａｃ　（ｐ）１６）２５０μ！及びエタノール７ｍｌ を添加した。その管を８．ＯＯＯｒｐｍで１５分間、再び回転せしめ、そしてそ のペレットを７０％エタノール５＋ｍｌにより洗浄した。ペレットを真空下で乾 燥せしめ、そして次に水２００μｌに再懸濁した。Mix the contents of the tube and then rapidly cool to -20°C for 20 minutes. Closed. Next, attach the tube to 8. 5orvall 5S- for 15 seconds at OOOrpm The nucleic acids were pelleted by spinning using a 340-tar. The pellets, 4 Resuspend in 2.5 ml of M Li0Ac and incubate for 3 hours at 4 °C. did. The tube was then run for 15 minutes at 8,000 rpm using an SS~340-tor. Spin for minutes to pellet the RNA. Resuspend the pellet in 2.5 ml of water. Cloudy, add 3M Na0Ac (p) 16) 250μ! and 7 ml of ethanol was added. 8. Rotate again for 15 minutes at OOOrpm and then The pellet was washed with 5+ml of 70% ethanol. Dry the pellet under vacuum. Dry and then resuspend in 200 μl of water.

形質転換された植物から抽出されたＲＮＡにおける予測されるｍ　ＲＮ　Ａの存 在を確立するために、ＲＮアーゼ保護の技法を用いた。この技法においては、予 測されるｍＲＮＡに対して相補的である短いプローブを、それが３２ｐによりラ ベルされるように合成した。次にそれを、植物ＲＮＡによりハイブリダイズする 。ハイブリダイゼーションが行なわれた後、ＲＮＡを、−末鎖ＲＮＡに対して特 異的な酵素により消化した。そのプローブに相補的な配列がＲＮＡｔＩｉｌ製物 に存在する場合、それらは、プローブと共にアニールし、ＲＮアーゼ消化に耐性 であろう二本鎖ＲＮＡを形成するであろう。次にこれは、ゲル電気泳動及びオー トラジオグラフィーにより検出され得る。Predicted presence of mRNA in RNA extracted from transformed plants The technique of RNase protection was used to establish the presence of the virus. In this technique, the A short probe that is complementary to the mRNA to be measured is labeled by 32p. It was synthesized so that it would be belled. Then hybridize it with plant RNA . After hybridization has taken place, the RNA is specifically labeled with respect to the -terminal RNA. Digested with different enzymes. A sequence complementary to the probe is an RNAtIil product. , they anneal with the probe and are resistant to RNase digestion. will form double-stranded RNA. This is then followed by gel electrophoresis and Can be detected by radiography.

不凍化遺伝子を検出するプローブを製造するために、ｐｃＭＭ５からのＥｃｏＲ Ｉ−Ｈ４ｎｄｌｆｆフラグメントを、市販のプラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ ）中に、Ｅｃ　ｏＲ１及びＨｉｎｄＩＩ［部位でクローン化した。得られたプラ スミドはＢ　Ｓ　（−）Ａ　Ｆとして言及される。ＢＳ（−）ＡＦ　ＤＮＡを精 製し、そして５μｇをＥｃｏＲＩにより消化し、それを不凍化遺伝子のＡＴＣの 上流で切断する。その切断されたＤＮＡを、フェノール及びクロロホルムによる 抽出により精製し、そして０．３ＭのＮ　ａ　ＯＡ　ｃ及びエタノールにより沈 殿セしめた。不凍化ｍＲＮＡに相補的な！！ｐ−ラベルされたＲＮＡを、Ｔ３　 ＲＮＡポリマラーゼを用いて、Ｐｒｏｍｅｇａ　ＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ、からの 市販の本に記載しているようにして、リボプローブ反応を用いることによって合 成した。精製されたラベルプローブを、水２５μｌに再懸濁した。６種の形質転 換された植物のそれぞれからのＲＮＡ　１０ｐｇ及び不凍化遺伝子を含まない異 なった二元ベクターにより形質転換されたトマト植物からのＲＮＡ　１０ｐｇを 、真空下で乾燥せしめ、そして次に３０μｍのハイブリダイゼーション緩衝液（ ４０ｍＭのＰＩＦＥＳ　（ｐＨ６，７）、０．４ＭのＮａＣ１，１＋ＭのＥＤＴ Ａ）に再懸濁した。酵母からのｔＲＮＡ　１０ｐｇを含む対照管をまた製造した 。プローブ１μｌを個々のサンプルに添加した。サンプルを、蒸発を防ぐために ３０μｌの鉱油により被覆し、８５°Ｃで５分間、次に４５°Ｃで１８時間イン キュベートした。ＲＮＮアーゼ及びＴＩ　ＲＮアーゼによる消化及び変性６％ポ リアクリルアミドゲル上への負荷のためのサンプルの調製が、Ｐｒｏｍｅｇａ　 Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、からの商業的な方法に記載しているようにして行なわ れた。また、サイズマーカー（ＨｐａｌＩにより切断され、そして３２ｐにより ラベルされたｐＢＲ３２２ＤＮＡ）及び元のりボブローブの５００倍希釈が同じ ゲル上に負荷された。EcoR from pcMM5 was used to produce a probe to detect the antifreeze gene. The I-H4ndlff fragment was converted into a commercially available plasmid Bluescript ( ) was cloned at the EcoR1 and HindII sites. The obtained plastic Sumido is referred to as BS(-)AF. BS(-)AF Preserve DNA 5 μg was digested with EcoRI, and it was digested with the antifreeze gene ATC. Cut upstream. The cut DNA was treated with phenol and chloroform. Purified by extraction and precipitated with 0.3M NaOAc and ethanol. I've set the palace. Complementary to antifreeze mRNA! ! p-labeled RNA, T3 from Promega Biotech Inc. using RNA polymerase. Synthesis is carried out by using the riboprobe reaction as described in commercially available books. accomplished. The purified labeled probe was resuspended in 25 μl of water. 6 types of transformation 10 pg of RNA from each transgenic plant and a mutant containing no antifreeze gene. 10 pg of RNA from tomato plants transformed with the binary vector , dried under vacuum, and then added with 30 μm hybridization buffer ( 40mM PIFES (pH 6,7), 0.4M NaCl, 1+M EDT A). Control tubes containing 10 pg of tRNA from yeast were also prepared. . 1 μl of probe was added to each sample. sample, to prevent evaporation Cover with 30 μl of mineral oil and incubate for 5 minutes at 85°C and then for 18 hours at 45°C. Cubated. RNNase and TI RNase digestion and denaturation of 6% po Preparation of samples for loading onto lyacrylamide gels was performed using Promega Performed as described in the commercial method from Biotech Inc. It was. Also, the size marker (cleaved by HpalI and cleaved by 32p) (labeled pBR322 DNA) and the same 500-fold dilution of the original Bob robe. loaded onto the gel.

電気泳動に従って、ゲルを、１０％酢酸、１０％メタノールに１０分間固定し、 次にＷｈａｔｍａｎフィルター紙Ｎｏ。According to electrophoresis, the gel was fixed in 10% acetic acid, 10% methanol for 10 min, Next, Whatman filter paper no.

１上で乾燥せしめ、そしてオートラジオグラフィー処理した。1 and autoradiographed.

プラスミドｐＧＭＭ５における不凍化遺伝子の配列とプラスミド２９６４−ＡＦ ＮＢ又は２９６４−ＡＦＳＢにおいてクローン化されるような不凍化遺伝子の配 列とを比較することから、不凍化遺伝子に対応するｍＲＮＡがトランスゲニック 植物において実際、合成される場合、上記のＲＮＮアーゼ保護アンビイ、２９６ ４−ＡＦＮＢのために１３４個の塩基対及び２９６４−ＡＦＳＢのために１４個 の塩基対の保護されたフラグメントを導びくことが予測され得る。２９６４−Ａ ＦＮＢ及び２９６４−ＡＦＳＢ植物の両者に関しては、この予測される大きさの フラグメントは、個々の形質転換された植物からのＲＮＡを含むレーンに見出さ れるが、しかし不凍化遺伝子を発現しない植物からの対照のレーン又はｔＲＮＡ のみを有する対照のレーンには見出されなかった。そのバンドの相対的強度は変 化し、いづれかの導入された遺伝子の発現レベルが形質転換実験からの個々の再 生された植物間で変化する既知の事実を示した。この実験の結果は、不凍化タン パク質のための合成遺伝子（２９６４−ＡＦＳＢ植物の場合、翻訳に基づいて、 不凍化タンパク質及び細胞間空間に不凍化活性を生成するためにシグナル配列を コードするＤＮＡを含む）がトマト植物中に導入され得、そしてこの遺伝子が植 物組織に発現されることを示した。Antifreeze gene sequence in plasmid pGMM5 and plasmid 2964-AF Antifreeze gene sequences as cloned in NB or 2964-AFSB From the comparison with the column, it is determined that the mRNA corresponding to the antifreeze gene is transgenic. When actually synthesized in plants, the RNNase protection ambience described above, 296 134 base pairs for 4-AFNB and 14 for 2964-AFSB could be expected to lead to a protected fragment of base pairs of . 2964-A For both FNB and 2964-AFSB plants, this predicted size Fragments found in lanes containing RNA from individual transformed plants control lanes or tRNAs from plants that contain antifreeze but do not express the antifreeze gene. was not found in the control lane with only. The relative strength of that band changes. and the expression levels of any introduced genes are independent of the individual regeneration from the transformation experiment. The known facts that vary between plants are shown. The results of this experiment were Synthetic genes for protein (2964-AFSB plants, based on translation) antifreeze proteins and signal sequences to generate antifreeze activity in the intercellular space. containing the encoding DNA) can be introduced into tomato plants, and this gene can be It was shown that this protein is expressed in human tissues.

例９ニ一連のミニ−プロティンＡ−不凍化融合タンパク質の比較的な再結晶化阻 害活性。Example 9 Comparative recrystallization inhibition of a series of mini-protein A-antifreeze fusion proteins Harmful activity.

これまでの例で論ぜられたプロティンＡに比較して、より小さな融合パートナ− の使用に２つの利点が存在する＝　（ｉ）それは、臭化シアノゲン処理による切 断されないように内部メチオニン残基を欠き、そして（ｉｉ　）その合成は、合 成された不凍化タンパク質１モル当たりより少ない細胞供給Ｓ（たとえばアミノ 酸、ＡＴＰ）を消化する。プラスミドｐＧＭＭ９（例６）を、制限エンドヌクレ アーゼＨｉｎｄｌＩ［により消化し、付着端をＤＮＡポリマラーゼのフレノウフ ラグメント及びｄＮＴＰによるフィルインによりプラント化にし、そしてその得 られたプラント端を再連結した。この操作の目的は、ｐＧＭＭ９におけるプロテ ィンＡをコードする配列の一部を欠失し、そして同じ読み取り枠にその下流及び 上流の配列を配置することであった。所望するプラスミドを、Ｅ、コリ中への形 質転換により単離し、そして予測されるように、それは欠失の点でＮｈｅＴのた めの認識部位を得た。新規のプラスミドｐＬＶｃ１０７は、プロティンＡに関連 するが、しがしより小さく、そしてメチオニン残基を欠く　〔但し、そのＮ−末 端で及び５ａｆｌｏへの融合点（ここで、他の不凍化遺伝子への融合が続いて、 下記のようにして製造される）でを除く〕融合タンパク質をコードした。この融 合タンパク質を、ミニ−プロティンＡ−ｓａｆｌｏとして言及する。その“ミニ −プロティンＡ”部分は、親和性クロマトグラフィー及びウェスターンプロット の後の可視化による精製を可能にする単一の機能的なＩｇＧ結合部位を保持する 。５ａｆ６．５ａｆ４及び５ａｆ５遺伝子のそれらのＨｉｎｄＩ［［部位の使用 による続く挿入を可能にするために、Ｈｉｎｄｌ［［部位が、ｐＵｃｌｌＢから の０−９５ｋｂのＰ　ｓ　ｔ　／　Ａ　ａ　ｔ　ＩＩフラグメントのｐＬＶｃ１ ０７の対応する部位中への置換により、ｐＬＶＣ１’０７中ニ導入サレ、新規ベ クタ　ｐＬＶｃｌｏＢを得た。Ｐ’ＬＶＣ１０８は、ミニ−プロティンＡ遺伝子 と正しく読み枠を１合して融合される５ａｆｌｏの上流セグメントのみを保持す る。Compared to protein A discussed in previous examples, the smaller fusion partner There are two advantages to the use of lacks an internal methionine residue so that it is not cleaved, and (ii) its synthesis is Less cell supply S (e.g. amino acid) per mole of antifreeze protein made digests acid, ATP). Plasmid pGMM9 (Example 6) was transformed into a restriction endonuclease. The sticky ends were digested with DNA polymerase HindlI and the sticky ends were digested with DNA polymerase plant by fill-in with fragments and dNTPs, and the resulting The disconnected plant ends were reconnected. The purpose of this operation was to protect the protein in pGMM9. A portion of the sequence encoding protein A was deleted, and the downstream and The upstream sequence was to be placed. Form the desired plasmid into E. coli. isolated by transformation and, as expected, it lacks NheT at the point of deletion. We obtained the recognition site. Novel plasmid pLVc107 is related to protein A However, it is smaller than Shigashi and lacks a methionine residue [However, its N-terminal at the end and the fusion point to 5aflo (where fusion to other antifreeze genes follows) fusion proteins produced as described below). This fusion The combined protein is referred to as mini-protein A-saflo. That “mini” - Protein A” portion was analyzed by affinity chromatography and Western plotting. Retains a single functional IgG binding site allowing for purification by subsequent visualization . 5af6.5af4 and 5af5 genes using their HindI [[ site To allow subsequent insertion by pLVc1 of the 0-95 kb Pst/Aat II fragment of By substitution into the corresponding site of pLVC1'07, a new vector was introduced into pLVC1'07. pLVcloB was obtained. P'LVC108 is the mini-protein A gene Keep only the upstream segment of 5aflo that is fused with the correct reading frame. Ru.

５ａｆ８へのミニ−プロティンＡの融合を、ｐ　ＧＭＭ　３（例５）からの小さ なＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントのｐＬＶｃ１０７の対応する部位中への置 換により構成し、プラスミドｐＬＶｃ１１０を得た。The fusion of mini-protein A to 5af8 was carried out using the small protein A from pGMM3 (Example 5). Placement of the NcoI/BamHI fragment into the corresponding site of pLVc107. plasmid pLVc110 was obtained.

５ａｆ４及び５ａｆ５へのミニ−プロティンＡの融合を、ｐＬＶＣ８５及びｐＬ ＶＣ８６（例２）からの小さなＮｈｅ１／１（ｊｎｄｌｌＩ部位のｐＬＶｃｌｏ Ｂの対応する部位中への置換により構成し、それぞれプラスミドｐ（１，ＭＭ１ ４及び２０ＭＭ１５を得た。これらの両融合において、元の５ａｆ４及びｓａｆ 、５・遺伝子の上流部分が、ｐＬＶｃ１０８に存在するｓａｆ＋１”０の上流部 分により置換される。構造における唯一の差異は１．ｐＣＭＭ１４及び２０ＭＭ １５において、５ａｆ４及び１ｓ３１イ５が配列ＭＤＴＡＳＤ　（前のＭＡＡＤ ＴＡＳＤと対照−される）から始まることである。５ａｆ４及び５ａｆ５の、こ 〉れら五の変種は、それぞれ５ａｆ４ｂ及びｓａ　ｆ５ｂとして言及される。The fusion of mini-protein A to 5af4 and 5af5 was carried out in pLVC85 and pL The small Nhe1/1 (pLVclo at the jndllI site) from VC86 (Example 2) plasmids p(1, MM1 4 and 20MM15 were obtained. In both of these fusions, the original 5af4 and saf , 5. The upstream part of the gene is the upstream part of saf+1"0 present in pLVc108 Replaced by minutes. The only difference in structure is 1. pCMM14 and 20MM 15, 5af4 and 1s31i5 are array MDTASD (previous MAAD (contrasted with TASD). 5af4 and 5af5, this These five variants are referred to as 5af4b and saf5b, respectively.

ｓａｆ・６へのミニ−プロティンＡの融合は、ｐＧＪ１５１（例４）からの小さ なＮｃｏＩ／Ｈｉｎｄｌｌ［フラグメントのｐＬＶｃｌｏＢの対応する部位中へ の置換により得られ、その結果、プラスミドｐＧＭＭ１３が得られる。Fusion of mini-protein A to saf.6 was performed using a small protein A from pGJ151 (Example 4). into the corresponding site of pLVcloB of the NcoI/Hindll [fragment] , resulting in plasmid pGMM13.

ミニ−プロティンＡ−ｓａｆ融合をコードする一連のプラスミドを用いて、プラ スミドｐ　ＲＩ　Ｔ　ｃ　Ｉ　８５７　（Ｂ、Ｎｆｌｓｓｏｎａｎｄ　Ｌ、Ａｂ ｒａｈｍｓｅｎ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｓｏｌｏｇｙ＋　１９８９ ）を含むＥ。A series of plasmids encoding mini-protein A-saf fusions were used to Sumido p RI Tc I 857 (B, Nflssonand L, Ab rahmsen, Methods in Enzysology+ 1989 ) including E.

２！Ｊ　Ｋ　１２株ＪＣ１０２９１を形質転換した。ｐＲＩＴｃ　１８５７プラ スミドは、融合プラスミドにλプロモーターの感温性レセプターをコードし、４ ２℃での融合タンパク質合成の誘発の前、その株の２８℃での培養を可能にする 。2! JK 12 strain JC10291 was transformed. pRITc 1857 plastic Sumid encodes a temperature-sensitive receptor for the λ promoter in a fusion plasmid, and Allow the strain to grow at 28°C before induction of fusion protein synthesis at 2°C. .

その株を、ｌのＯ９Ｄ、（６００）に達するまで、それぞれ２８°ＣでＬＢ　５ ００ｍ１中において培養した。この点で、温度を、５６℃でのＬＢの同体積を添 加することによって４２°Ｃに上げ、そしてインキユベーシヨンをさらに９０分 間４２°Ｃで続けた。収穫の後、融恰タンパク質を、プロティンＡ−ｓａｆｌｏ （例７）について記載されているようにして、抽出し、そして精製した。The strain was incubated at 28 °C until reaching l O9D, (600), LB 5, respectively. The cells were cultured in 00ml. At this point, the temperature is added to the same volume of LB at 56 °C. the temperature was increased to 42°C by adding The temperature was maintained at 42°C for a while. After harvest, the fused protein is transferred to protein A-saflo. Extracted and purified as described for Example 7.

氷の再結晶化に対する５種の精製されたミニ〜プロテインＡ−ｓａｆ融合タンパ ク質の効果を、例３におけるプロティ：／Ａ−ｓａｆ５に関して測定した。個々 のタンパク質の一連の希釈からのスプラットを試験し、再結晶化を阻害すること に有効的な融合タンパク質のおおよその最少濃度を決定した。Five Purified Mini-Protein A-saf Fusion Proteins for Ice Recrystallization The effect of texture was determined for Proti:/A-saf5 in Example 3. individual testing splats from a series of dilutions of the protein to inhibit recrystallization. We determined the approximate minimum concentration of fusion protein that would be effective.

阻害が、第１表に示されるように観察され、ここで“弱い阻害”及び“強い阻害 ”とは、対照の平均結晶直径がそれぞれ、サンプルの平均結晶直径の２及び５倍 大きかったことを示す。Inhibition was observed as shown in Table 1, where "weak inhibition" and "strong inhibition" ” means that the average crystal diameter of the control is 2 and 5 times the average crystal diameter of the sample, respectively. It shows that it was big.

ミニ−プロティンＡ−ｓａｆ５ｂは、ｓ’ａｆ６，５ａｆ８又は５ａｆｌＯを含 む融合よりも１０〜１００倍より活性的であり、そして５ａｆ４ｂの融合はその 活性において中ぐらいであったことが明らかである。融合タンパク質の不凍化成 分における反復体の数の上昇は、再結晶化の阻害においてその効能を高めること がこれらの結果から明らかである。（最少の活性の融合タンパク質のそれぞれは ３個の反復体を含むが、５ａｆ４を含む融合は４個の反復体を含み、そして５ａ ｆ５を含む最っとも活性的な融合は、５個の反復体を含む、）全体的に、この例 は、不凍化成分を含む種々の細菌的に製造された融合タンパク質が容易に精製さ れ、そしてインビト二で氷の再結晶化を阻害するために利用され得ることを示し た。Mini-protein A-saf5b contains s'af6, 5af8 or 5aflO. the 5af4b fusion is 10-100 times more active than the 5af4b fusion. It is clear that the activity was medium. Antifreeze synthesis of fusion proteins Elevating the number of repeaters in minutes increases its efficacy in inhibiting recrystallization is clear from these results. (Each of the least active fusion proteins is contains 3 repeats, whereas fusions containing 5af4 contain 4 repeats, and 5a The most active fusion containing f5 contains 5 repeats), overall this example Various bacterially produced fusion proteins containing antifreeze components are easily purified. demonstrated that it can be used to inhibit ice recrystallization in vitro. Ta.

第１表、融合タンパク質による再結晶化の阻害。Table 1. Inhibition of recrystallization by fusion proteins.

りＺぺ２賞　Ｊ凹ｌ且／畦　父り且／畦　、艷り五／ｍ１４　ユニを且／１ミニ ープロティンＡ−ｓａｆ６　＋＋　−ＮＴ　ＮＴミニ−プロティンＡ−ｓａｆ８ 　＋＋　＋　ＮＴ　ＮＴミニ−プロティンＡ−ｓａｆｌｏ　＋＋　−−ＮＴミニ −プロティアＡ−ｓａｆ４ｂ　＋＋　＋＋　−−ミニ−プロティンＡ−ｓａｆ５ ｂ　十十　十＋　十　−÷＋＝強い阻害 十　＝弱い阻害 −−阻害は観察されなかった ＮＴ＝試験されなかった 例１０：その対応するミニ−プロティンＡ融合体がら開放される裸の不凍化ペプ チド５ａｆ６，５ａｆ８及び５ａｆ１０の精製及び活性。RiZpe 2nd Prize J dent l and / ridge, father and ridge, 5/m14 uni and/1 mini -Protein A-saf6 ++ -NT NT Mini-Protein A-saf8 ++ + NT NT Mini-Protein A-saflo ++ −-NT Mini -Protea A-saf4b ++ ++ --Mini-Protea A-saf5 b 10 10 + 10 - ÷ + = strong inhibition 10 = weak inhibition --No inhibition observed NT = not tested Example 10: Naked antifreeze peps released from their corresponding mini-protein A fusions Purification and activity of 5af6, 5af8 and 5af10.

ミニ−プロティンＡ−ｓａｆ融合タンパク質の誘発を、上記例９ムこ記載のよう にして行なった。細胞を溶解し、そして融合タンパク質を例６におけるようにし て精製した。臭化シアノゲンによる裸の不凍化ペプチドの開放を、例６における ようにして行なった。切断混合物を、例６に記載しているようにして、１０ｋＤ ａ、及びＢ　ｋＤａカットオフフィルターにより濾過し、そしてｆＡ縮した。そ の濃縮物を、８５％溶液Ａ／１５％溶液Ｂ（Ａ：水中、１％のトリフルオロ酢酸 ；Ｂニアセトニトリル）〜１０％熔液Ａ／９０％溶液Ｂの線状グラジェントによ る？８出による、Ｃ−１８カラム上でのＨＰＬＣクロマトグラフィー処理により 分析した。裸のＳａｆペプチドを、７２％　Ａ／２８％　Ｂ（ＳａｆｌＯ）又は ６２％　Ａ／３８％　Ｂ（Ｓａｆ６及びＳａ　ｆ　８）で溶出する単一ピークと して可視化した。この分析は、裸のＳａｆペプチドが、３　ｋＤａのフィルター 残留物において、７５％の純度よりも高いことを示した。精製された裸のペプチ ドの濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイにより評価し、そして次に１００μｇ／ ｍ１（１００ｐｐ＋ｗ）に調整した。Induction of the mini-protein A-saf fusion protein was performed as described in Example 9 above. I did it. Lyse the cells and make the fusion protein as in Example 6. and purified. The release of the naked antifreeze peptide with cyanogen bromide was carried out in Example 6. This is how I did it. The cleavage mixture was prepared as described in Example 6 at 10 kD. a, and B were filtered through a kDa cut-off filter and fA-condensed. So The concentrate was mixed with 85% solution A/15% solution B (A: 1% trifluoroacetic acid in water). ;B Niacetonitrile) ~ 10% solution A/90% solution B linear gradient Ru? By HPLC chromatography on a C-18 column with analyzed. Naked Saf peptide was added to 72% A/28% B (SaflO) or A single peak eluting at 62% A/38% B (Saf6 and Saf8) and visualized it. In this analysis, the naked Saf peptide was The residue showed a purity of greater than 75%. refined naked pepti The concentration of 100 μg/kg was assessed by BCA protein assay and then 100 μg/ It was adjusted to m1 (100pp+w).

裸の不凍化ペプチド５ａｆ６，５ａｆ８及び５ａｆｌＯの純粋溶液を、例３に詳 細に記載されるスプラントー冷却アッセイを用いて、再結晶化阻害について試験 した。裸の不凍化ペプチドの個々の溶液は、負の対照（Ｓａｆタンパク質が溶解 されている緩衝液に等しい緩衝液から製造されたスプラット）に比較して、この 濃度で再結晶化の強い阻害（例９におけるのと同じ基準による）を示した。Pure solutions of naked antifreeze peptides 5af6, 5af8 and 5aflO were prepared as detailed in Example 3. Tested for recrystallization inhibition using the Spranto cooling assay as described in detail. did. Individual solutions of naked antifreeze peptide were used as a negative control (Saf protein dissolved). This compared to a splat produced from a buffer equal to the buffer being concentration showed strong inhibition of recrystallization (according to the same criteria as in Example 9).

Ｈ１ｌニブＯティンＡ−３ａｆ５融合タンパク質の細胞内発現による酵母の低温 保存。Low temperature production of yeast by intracellular expression of H1l nib Otin A-3af5 fusion protein keep.

プラスミドｐＲＬＭ１０５（例２に記載される）内に含まれる配列をコードする 、プロティンＡ−３ａｆ５コードヌクレオチドを、切り出し、そして次の態様で 酵母異種発現ベクター中に挿入した。プラスミドｐＲＬＭ１０を、プロティンＡ −Ｓａｆ５コードツーを含む一本のＤＮＡフラグメントを製造する条件下で制限 酵素Ｈｉｎｄｍにより処理した。このフラグメントの付着端を、Ｍａｎｉａｔｉ ｓにより記載されるようにして、ｄＮＴＰの酵素的付加によりフィルインし、そ してＢａｍＨＩリンカ−（Ｐｈａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ）に連結した。次に、こ のフラグメントをｐＵｃ１１’８のＢａｍＨＴ部位中に連結し、プラスミドｐＲ ＬＭ１０５４Ｂを得た。プラスミドｐＲＬＭ１０５４Ｂを制限酵素（Ｂｃｌｌ及 びＢａｍＨＩ）により処理し、酵母発現ベクターＹＥｐＲＭｌ中に挿入される、 プロティンＡ−３ａｆ５コ一ド配列を含む約１゜Ｏｋｂｐのフラグメントを開放 した。Encoding sequences contained within plasmid pRLM105 (described in Example 2) , the protein A-3af5 encoding nucleotide is excised, and in the following manner inserted into a yeast heterologous expression vector. Plasmid pRLM10 was transformed into protein A - Restricted under conditions to produce a single DNA fragment containing Saf5 code two Treated with the enzyme Hindm. The attached end of this fragment was attached to Maniati Fill-in by enzymatic addition of dNTPs as described by S. and ligated to a BamHI linker (Pha rma c i a). Next, this was ligated into the BamHT site of pUc11'8 to create plasmid pR LM1054B was obtained. Plasmid pRLM1054B was digested with restriction enzymes (Bcll and and BamHI) and inserted into the yeast expression vector YEpRMl. Release of approximately 1° Okbp fragment containing protein A-3af5 code sequence did.

プラスミドＹＥｐＲＭ１を、プラスミドＹＥｐｌＰ−Ｔ（蝕Ｌ＆　Ｃｅ１ｌ　Ｂ ｉｏｌ、（１９８６）　６　：　１８１２−１８１９及び５ｃｉｅｎｃｅ（１９ ８３）　２１９　：６２０−６２５　）における酵母３−ホスホグリセレートキ ナーゼプロモーターフラグメントから下流のユニークＥｃｏＲ１部位中に合成の 二本鎖オリゴヌクレオチドを挿入することによって構成した。その二本鎖オリゴ ヌクレオチドは、−緒にアニールされ、ＥｃｏＲＩ適合性付着端を有する２１ｂ ｐの二本鎖セグメントをもたらす、配列、 ５　’　ＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣ３’及び５　’ 　ＡＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧ　３　’を有する２種 の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構成された。制限酵素Ｎｃｏｌ、 　Ｂａｎ＋［、ＳｍａＩ及びＮｏｔｌにより認識されるヌクレオチド配列は、そ の二本鎖領域内に存在した。オリゴヌクレオチドはまた、その末端の１つのみが 、ＹＥｐ　Ｉ　ＰＴのＥｃｏＲ１部位中への連結に続いて、ＥｃｏＲＩにより切 断され得るように企画された。ｐＲＬＭ１０５４ＢからのプロティンＡ−３ａｆ ５配列を含むＢｃ　］　Ｉ−ＢａｍＨＴフラグメントを、ＹＥｐＲＭｌのＢａｍ Ｈ１部位中に連結し、ＹＥｐＲＭ３を１ＩＪＬ菰。Plasmid YEpRM1 was transformed into plasmid YEplP-T (eclipse L & Ce1l B iol, (1986) 6: 1812-1819 and 5science (19 83) Yeast 3-phosphoglycerate enzyme in 219:620-625) Synthetic DNA in the unique EcoR1 site downstream from the enzyme promoter fragment. constructed by inserting double-stranded oligonucleotides. The double-stranded oligo The nucleotides are annealed together and have EcoRI compatible cohesive ends. a sequence resulting in a double-stranded segment of p; 5’ AATTCCATGGATCCCGGGCGGCCGC3’ and 5’ 2 types with AATTGCGGCCGCCCGGGATCCATGG 3' was composed of chemically synthesized oligonucleotides. restriction enzyme Ncol, The nucleotide sequence recognized by Ban+[, SmaI and Notl is that was present within the double-stranded region of Oligonucleotides also have only one of their ends , ligation of YEp I PT into the EcoR1 site followed by cleavage with EcoRI. It was designed to be cut off. Protein A-3af from pRLM1054B Bc] I-BamHT fragment containing the Bc5 sequence of YEpRMl Ligate YEpRM3 into 1IJL into the H1 site.

プラスミドＹＥｐＲＭ３を、Ｓｈｅｒｍａｎなど、　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ　１９８６）による崩動」山りヨ≧旺姐」鮭朋り違二１佳眩鼓ｉｎ 　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓに記載されるリチウム処理方法に従って、遺伝 子型皿、　匹剋」（Ｍｏ１．　＆　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　（１９８６）　６　 ：　１８１２−１８１９）を有する酵母株２０Ｂ−１２中に形質転換した。酵母 細胞をＳＤプレート上で増殖し、プラスミドＹＥｐＲＭａ上での酵母ＴＲＰＩ遺 伝子の発現について選択した。プラスミドＤＮＡを、Ｈｏｆｆｏ＋ａｎ　ａｎｄ 　Ｗｉｎｓｔｏｎ　（Ｇｅｎｅ（１９８７）　５７　：　２６７〜２７２）の方 法により、形質転換された酵母から単離し、ＥユＤ　ＴＪ中に再形質転換し、精 製し、そして制限酵素消化により分析した。この分析は、形質転換された酵母内 にプロティンＡ−３ａｆ５コ一ド配列の存在を確証した。Plasmid YEpRM3 was prepared by Sherman et al. (Cold Spring Harbor 1986)'s "Yama Riyo≧Oji" Salmon Ho Riji 21 Kamaiko in Genetics according to the lithium treatment method described in Yeast Genetics. "Children's Plate, One Piece" (Mo1. & Ce1l Biol, (1986) 6 : 1812-1819) into yeast strain 20B-12. yeast Cells were grown on SD plates and the yeast TRPI gene on plasmid YEpRMa was Selected for gene expression. Plasmid DNA was converted into Hoffo+and Winston (Gene (1987) 57: 267-272) The transformed yeast was isolated by the method, retransformed into EyuDTJ, and purified. and analyzed by restriction enzyme digestion. This analysis was performed in transformed yeast. confirmed the existence of a protein A-3af5 cod sequence.

形質転換された酵母細胞を、約２Ｘ１０’個の細胞／ｍｌの濃度にＳＤ培地中で の選択条件下で増殖せしめ、遠心分離により収穫し、そして１１５０体積の水に より洗浄した。細胞ペレットを、２体積の３Ｘ　Ｌａｅｍｍｌｉｉｌ衝液（Ｎａ ｔｕｒｅ（１９７０）　２２７　：　６８０〜６８５）に再懸濁し、そして２ｌ ３体積のガラスピーズ（０，５＋＋ｎの直径）の存在下でミニ−ビーズビータ− （ＢｉｏＳｐｅｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）により１分間、撹拌することによって破 壊した。その破壊された細胞を熱湯槽中に５分間置き、続いてマイクロセントリ フエージにより１分間遠心分離した、上滑液を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル 上で操作し、ニトロセルロースフィルターにトランスプロットし、そして融合タ ンパク質のプロティンＡドメインに対して向けられる抗体を用いてウェスターン プロット分析により試験した。この分析の結果は、プロティンＡ−３ａｆ５遺伝 子を欠く細胞からの抽出物に比較して、プロティンＡ−Ｓａｆ遺伝子を含む酵母 細胞からの抽出物に正しい大きさのユニークなタンパク質バンドの存在を示した 。これは、形質転換された酵母がプロティンＡ−３ａｆ５融合タンパク質を発現 することを示す。Transformed yeast cells were grown in SD medium to a concentration of approximately 2X10' cells/ml. were grown under selected conditions, harvested by centrifugation, and added to 1150 volumes of water. Washed more. The cell pellet was washed with 2 volumes of 3X Laemmliil buffer (Na ture (1970) 227: 680-685) and 2 l Mini-bead beater in the presence of 3 volumes of glass beads (diameter of 0,5++n) (BioSpec Products) by stirring for 1 minute. broke. Place the disrupted cells in a hot water bath for 5 minutes, followed by microcentration. The supernatant synovial fluid, centrifuged for 1 minute using Fage, was transferred to an SDS polyacrylamide gel. transplot onto a nitrocellulose filter, and transfer the fusion sample to a nitrocellulose filter. using antibodies directed against the protein A domain of the protein. Tested by plot analysis. The results of this analysis indicate that protein A-3af5 genetic yeast containing the protein A-Saf gene compared to extracts from cells lacking offspring. demonstrated the presence of a unique protein band of the correct size in extracts from cells . This means that the transformed yeast expresses protein A-3af5 fusion protein. Show that.

形質転換された酵母に発現されるプロティンＡ−５ａｆ５融合タンパク質の再結 晶化阻害活性を試験するために、粗細胞溶解物を、例３に記載されるスプラット アッセイにより試験した。形質転換された酵母細胞を増殖し、収穫し、そして上 記パー）Ｂに記載されるようにして破壊した（但し、３ＸＬａｅｍｍｌｉｌｌ衝 液の代わりに、細胞ペレットを３０１１１Ｍのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０） 、１０＋ｗＭのＥＤＴＡ溶液に再懸濁した。その破壊された細胞からの上滑液を 、スプラット分析のために直接使用した。対照として、プロティンＡ−Ｓａｆ５ 遺伝子（ＹＥｐ　ＲＭ　ｌ　）を欠く酵母細胞を同時に処理し、そしてまた、ス プラットアッセイにより再結晶化阻害について試験した。第１０図は、プロティ ンＡ−３ａｆ５遺伝子を欠く細胞からの抽出物に比較して、プロティンＡ−Ｓａ ｆ５遺伝子を発現する酵母細胞からの抽出物における１時間にわたっての再結晶 化の進行を示す。スライド１０−１は、凍結及び移行後すぐの（５分以内）２つ のスプラットの写真であり、そしてスライド１０−２は約１５分後の同じ２つの スプラットを示し、スライド１０−３は約３０分後の同じスプラットを示し、そ してスライド１Ｏ−４は、１時間後のスプラットを示す。すべてのスライドにお いて、右側のスプラットはプロティンＡ−３ａｆ５遺伝子を発現する酵母細胞か らであり、そして左側のスプラットはプロティンＡ−３ａｆ５遺伝子を欠く酵母 細胞からである。両スプラットは、凍結及び移行後すぐに、ひじょうにＭ４Ｑ１ するように見えるが（スライド１Ｏ−１）、１時間後、プロティンＡ−３ａｆ５ を欠（対照スプラットは、プロティンＡ−３ａｆ５融合タンパク質を含むスプラ ットにおける平均結晶直径の少なくとも５倍である平均結晶直径の有意な上昇を 示した（スライド１Ｏ−４）。Recombination of protein A-5af5 fusion protein expressed in transformed yeast To test crystallization inhibitory activity, crude cell lysates were splatted as described in Example 3. Tested by assay. The transformed yeast cells are grown, harvested, and grown. Per) Destroyed as described in B (However, 3XLaemmlill collision) Instead of the solution, the cell pellet was added to 30111M Tris-HCl (pH 8,0). , resuspended in 10+wM EDTA solution. The synovial fluid from the destroyed cells , which was used directly for splat analysis. As a control, protein A-Saf5 Yeast cells lacking the gene (YEpRMl) were simultaneously treated and also Tested for recrystallization inhibition by Plat assay. Figure 10 shows the proty Protein A-Sa compared to extracts from cells lacking the protein A-3af5 gene. Recrystallization over 1 hour in extracts from yeast cells expressing the f5 gene It shows the progress of transformation. Slide 10-1 is two images immediately after freezing and transfer (within 5 minutes) and slide 10-2 is a photo of the same two splats about 15 minutes later. Slide 10-3 shows the same splat about 30 minutes later and its Slide 1O-4 shows the splat after 1 hour. all slides The splat on the right is a yeast cell expressing the protein A-3af5 gene. and the splat on the left is yeast lacking the protein A-3af5 gene. It's from cells. Both splats were very M4Q1 immediately after freezing and migration. (slide 1O-1), but after 1 hour, protein A-3af5 (control sprats lack sprats containing protein A-3af5 fusion protein) A significant increase in the average crystal diameter that is at least 5 times the average crystal diameter in the (Slide 1O-4).

もう１つの対照は、細胞抽出物内のプロティンＡ−３ａｆ５融合タンパク質の濃 度に顕像する濃度でプロティンＡのみを含む水溶液とプロティンＡ−３ａｆ５を 発現する酵母細胞からの抽出物とを比較するために使用された０例２における場 合のように、プロティンＡは、再結晶化に対して効果を有せなかった。これらの 結果は、形質転換された酵母に発現されるプロティンＡ−３ａｆ５融合タンパク 質が再結晶化阻害において活性的であることを示す。Another control is the concentration of protein A-3af5 fusion protein in cell extracts. An aqueous solution containing only protein A and protein A-3af5 at a concentration that can be visualized at the same time. The case in Example 2 was used to compare extracts from yeast cells expressing As in the case of protein A, protein A had no effect on recrystallization. these The results show that protein A-3af5 fusion protein expressed in transformed yeast This indicates that the protein is active in inhibiting recrystallization.

Ｄ、ブローインＡ−Ｓａｆ５　ム　ンパク　の　のとして゛　れ　そして　７　 れた　の１めに１４２１Ｌ察・ 細胞生存率を、次の方法で決定した。酵母細胞を、選択条件下で液体培地におい て増殖し、凍結−融解の種々の割合にゆだね、そして寒天プレート上で増殖する それらの能力について調べた。対照として、プロティンＡ−３ａｆ５遺伝子を欠 く酵母細胞を同時に処理した。酵母細胞を、ＳＤ培地中において、後期対数期又 は初期定常期に増殖し、遠心分離により０．０２ａ＋１の体積に濃縮し、そして ドライアイス−エタノール槽への含浸により一７０℃に冷却した（９５°Ｃ／分 の速度）。次に、細胞を液体窒素槽に移し、そして−１９６°Ｃに急速に冷却し 、細胞内水の形成を確保した。融解を、０℃〜３７“Ｃの範囲の温度で維持され る水槽への移行により行なった（２６〜６４°Ｃ／分の融解速度に相当する）。D. As blow-in A-Saf5 and 7. 1421L was detected on the first day. Cell viability was determined by the following method. Yeast cells are placed in liquid medium under selective conditions. grown on agar plates, subjected to various freeze-thaw rates, and grown on agar plates. I investigated their abilities. As a control, the protein A-3af5 gene was deleted. Yeast cells were treated at the same time. Yeast cells were grown in SD medium to late log phase or grows in early stationary phase, concentrates by centrifugation to a volume of 0.02a+1, and Cooled to -70°C by impregnation in a dry ice-ethanol bath (95°C/min) speed). Cells were then transferred to a liquid nitrogen bath and rapidly cooled to −196 °C. , ensuring the formation of intracellular water. The melting is maintained at a temperature ranging from 0°C to 37"C. (corresponding to a melting rate of 26-64°C/min).

融解の後、細胞を希釈し、ＹＰＤ寒天上にプレートし、３０″Ｃでの増殖を可能 にし、そして計数した。凍結−融解を生き残る細胞の数を、同一の条件下（但し 、凍結されない）で増殖される細胞の数の％とじて計算した。プロティンＡ−３ ａｆ５遺伝子の細胞内発現の結果としての生存率の上昇を、プロティンＡ−Ｓａ ｆ５遺伝子を欠く生存細胞の数に比較してのプロティンＡ−３ａｆ５遺伝子を含 む生存細胞の数として計算した。After thawing, cells were diluted and plated onto YPD agar and allowed to grow at 30″C. and counted. Calculate the number of cells that survive freeze-thaw under the same conditions (but , not frozen) was calculated as % of the number of cells grown. Protein A-3 Increased survival rate as a result of intracellular expression of the af5 gene was Containing the protein A-3af5 gene compared to the number of viable cells lacking the f5 gene. It was calculated as the number of viable cells.

４回の別々の生存性実験の要約を、第■表に示す。プロティンＡ−３ａｆ５遺伝 子を含む酵母細胞は、プロティンＡ−Ｓａｆ５遺伝子を欠く酵母細胞に比較され る場合、３０％〜２００％の生存率の上昇を示した（また１、３〜３．０倍の上 昇率を示す）。実験４は、ＹＥｐＲＭ３が上記のように２０Ｂ−Ｉ２中に形質転 換される別々の形質転換から単離された株により行なわれた。これらの実験は、 プロティンＡ−３ａｆ５遺伝子の細胞内発現の結果として凍結−融解生存性の有 意な上昇を示す。A summary of four separate viability experiments is shown in Table ■. Protein A-3af5 genetics Yeast cells containing offspring were compared to yeast cells lacking the protein A-Saf5 gene. showed an increase in survival rate of 30% to 200% (also 1, 3 to 3.0 times higher). (indicates the rate of increase). Experiment 4 involved transforming YEpRM3 into 20B-I2 as described above. This was done with strains isolated from separate transformations. These experiments Freeze-thaw survivability as a result of intracellular expression of the protein A-3af5 gene shows a significant increase.

第■表、凍結−融解後の酵母生存性 １．　２６　＋　１３７＋／−１９１０−’１．０９　１５３　２．５２６　７ １＋／−１０１０−３０，４３Ｃ＋１２６＋／−８１０−’ Ｃ１６５＋／−７１０−’ ２、　２６　＋４６１＋／−１２０１０−３０，４２２００３，０２６８７＋／ −２８１０−’　０．１４６４　＋　２４０＋／−７５１０−”２．２０　１５ ３　２．５６４　５５＋／−１１１０−’　０．８７Ｃ＋１０９＋／−９１Ｏ− ５ Ｃ６３＋／−３１０−’ ３、　６４　＋　１４９＋／−１７１０−’５．７３　４６　１．５６４　１０ ６＋／−４１０−’　３．９２４、　２６　＋１３７　１０−”１．７８　７０ 　１．７２６　６７　１０−２１．０５ ４０　＋　２４８　１０−”３．２２　３０　１３４０　１５９　１０−”　２ ．５０ Ｃ＋　７７０　１Ｏ−３ Ｃ−６３６１０−’ 実験１−３志３度行なわれた。Table ■ Yeast viability after freezing-thawing 1. 26 + 137 +/-1910-'1.09 153 2.526 7 1+/-1010-30,43C+126+/-810-' C165+/-710-' 2, 26 +461+/-12010-30,422003,02687+/ -2810-’0.1464+240+/-7510-”2.20 15 3 2.564 55+/-1110-' 0.87C+109+/-91O- 5 C63+/-310-' 3, 64 + 149+/-1710-'5.73 46 1.564 10 6+/-410-' 3.924, 26 +137 10-"1.78 70 1.726 67 10-21.05 40 + 248 10-” 3.22 30 1340 159 10-” 2 ．． 50 C+ 770 1O-3 C-63610-' Experiments 1-3 were conducted three times.

実験４順　２度行なわれた。Experiment 4 was conducted twice.

Ｃ＝対照（凍結されなかった）。C = control (not frozen).

例１２：酵母におけるプロティンＡ−３ａｆ４融合タンパク質の発現。Example 12: Expression of protein A-3af4 fusion protein in yeast.

プラスミドｐＲＬＭ１０５４Ｂ　（例１１に記載される）を用いて、組換え堪能 な細菌宿主、Ｅ、コリＧｍ　１１９　（Ｍａｒｉｎｕｓ。Recombinant production using plasmid pRLM1054B (described in Example 11) A bacterial host, E. coli Gm 119 (Marinus.

Ｍ、Ｇ、、　１９３９．　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、＋　２１＋　１１３　 １３２）を形質転換し、５ａｆ５ヌクレオチドコ一ド配列内に存在する３３ｂｐ のタンデム反復体のインビボ欠失を生成した。５ａｆ５内の反復体の１つの欠失 が５ａｆ４（第６Ｆ図に示される）を生成するであろう。プロティンＡ−３ａｆ ４配列を含むＢｃｌｌ−ＢａｍＨ１フラグメントを、ＹＥｐＲＭｌ　（例１１に 記載される）のＢａｍＨ１部位に連結し、ＹＥｐＲＭ４を得た。プラスミドＹＥ ｐＲＭ４の制限酵素分析は、５ａｆ４ヌクレオチド配列の存在を確証した。M.G., 1939. Ann, Rev, Genet, +21+113 132) and transformed the 33bp present within the 5af5 nucleotide code sequence. generated in vivo deletions of tandem repeats of . Deletion of one repeat within 5af5 would produce 5af4 (shown in Figure 6F). Protein A-3af The Bcll-BamH1 fragment containing 4 sequences was converted into YEpRMl (in Example 11). (as described) into the BamH1 site of YEpRM4. Plasmid YE Restriction enzyme analysis of pRM4 confirmed the presence of the 5af4 nucleotide sequence.

プラスミドＹＥｐＲＭ４を用いて、酵母株２０Ｂ−１２を形質転換し、そして例 １１に記載のようにしてウェスターンプロット分析により試験した。この分析の 結果は、ＹＥｐ　ＲＭ４からの細胞抽出物が、ＹＥｐＲＭ３の細胞抽出物に比較 する場合、正しい大きさのユニークなタンパク質バンドを生成することを示した 。これは、形質転換された酵母がプロティンＡ−Ｓａｆ４融合タンパク質を発現 することを示す。Plasmid YEpRM4 was used to transform yeast strain 20B-12 and Tested by Western plot analysis as described in 11. of this analysis The results show that cell extracts from YEpRM4 compared to cell extracts from YEpRM3. were shown to generate unique protein bands of the correct size when . This means that the transformed yeast expresses the protein A-Saf4 fusion protein. Show that.

Ｃ，ブローインＡ−３ａｆ４’−”むノ　−　れたＹＥｐＲＭ４に発現されるプ ロティンＡ−３ａｆ４融合タンパク質の再結晶化阻害活性を、例３に記載される ようなスプラットアッセイにより決定した。粗細胞溶解物を、例１１に記載され るようにＹＥｐＲＭ４を含む形質転換された酵母から調製した。第１１図は、プ ロティンＡ−３ａｆ４遺伝子を欠く細胞からの抽出物に比較して、プロティンＡ −３ａｆ４遺伝子を発現する酵母細胞からの抽出物における１時間にわたっての 再結晶化の進行を示す。スライド１１−１は、凍結及び移行の後すぐの（５分以 内）２つのスプラットの写真であり、そしてスライド１１−２は約１５分後の同 じ２つのスプラットを示し、スライド１１−３は約３０分後の同しスプラットを 示し、そしてスライド１１−４は、１時間後のスプラットを示す。すべてのスラ イドにおいて、右側のスプラットはプロティンＡ−３ａｆ４遺伝子を発現する酵 母細胞からであり、そして左側のスブラ・ノドはプロティンＡ−３ａｆ４遺伝子 を欠く酵母細胞からである。両スプラントは、凍結及び移行後すぐに、ひじよう に類似するように見えるが（スライド１１−１）、１時間後、プロティンＡ−３ ａｆ４を欠く対照スプラットは、プロティンＡ−Ｓａｆ４融合タンノくり質を含 むスプラットにおける平均結晶直径の少なくとも５４合である平均結晶直径の有 意な上昇を示した。これらの結果しよ、形質転換された酵母に発現されるプロテ ィンＡ−３ａｆ４融合タンパク質が再結晶化阻害において活性的であることを示 す。C, protein expressed in YEpRM4 produced by blow-in A-3af4'- The recrystallization inhibitory activity of lotin A-3af4 fusion protein was determined as described in Example 3. Determined by splat assay. The crude cell lysate was prepared as described in Example 11. was prepared from transformed yeast containing YEpRM4. Figure 11 shows the protein A compared to extracts from cells lacking the protein A-3af4 gene. -1 hour in extracts from yeast cells expressing the 3af4 gene. It shows the progress of recrystallization. Slide 11-1 shows the results immediately after freezing and transfer (less than 5 minutes). Slide 11-2 is the same photo taken about 15 minutes later. Slide 11-3 shows the same splat about 30 minutes later. and slide 11-4 shows the splat after 1 hour. all sura The splat on the right shows the enzyme expressing the protein A-3af4 gene. from the mother cell, and the subra node on the left contains the protein A-3af4 gene. from yeast cells lacking . Immediately after freezing and migration, both splints are removed from the elbow. (slide 11-1), but after 1 hour protein A-3 Control splats lacking af4 contain protein A-Saf4 fusion protein. having an average crystal diameter that is at least 54 times the average crystal diameter in the splat; showed a significant increase. As a result of these, the protein expressed in the transformed yeast The results show that the inA-3af4 fusion protein is active in inhibiting recrystallization. vinegar.

本発明は、理解するために例示的且つ測的にいくらが詳細に記載されて来たが、 特許請求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができることは明らかであろう。Although the present invention has been described in some detail for purposes of illustration and illustrative purposes, It will be obvious that modifications and changes may be made within the scope of the claims.

アミノ酸のための記号 ＩＩ　Ｈｌｓ　ヒスチジン １　１１Ｂ　イソロイシン Ｋ　ＬＹＳ　リシン Ｌ　ＬＥＤ　ロイシン ＴＹＰＥ　Ｉ　ＤＴＡＳＤ　ＡＡＡＡＡ＾ＴＹＰＥ　２　ＬＴＡＡＮ　ＡＫＡＡ ＡＥＴＹＰＥ　３　ＬＴＡＡＮ　ＡＡＡＡ＾＾ＴＹＰＥ　４　ＬＴＡＡＮ　ＡＡ ＾＾＾にＴＹＰＥ５　Ｌ丁ＡＤＮ　＾＾ＡＡＡ＾ＴＹＰＥ　ｌｉ　ＡＴＡＡＴ　 ＡＡＡＡＡ＾ＴＹＰＥ　７　ＡＴＡＡＴ　ＡＡＫＡＡＡコンセンサス　１ＴＡａ ｎ　ＡａａＡＡａＳａｆ３　ＭＡＡ　−ＴＹＰＥ　Ｉ　−ＴＹＰＥ３−ＴＹＰＥ ３−ＡＴＡＡＳａｆＪ　ＭＡＡ−ＴＹＰＥ　ｌ　−ＴＹＰＥ３−　ＴＹＰＥ　３ −　ＴＹＰＥ３−ＡＴＡＡＳａｆ５　ＭＡＡ−ＴＹＰＥＩ−ＴＹＰＥ３−ＴＹＰ Ｅ３−ＴＹＰＥ３−ＴＹＰＥ３−ＡＴＡ＾５ａｆ６　Ｍ　−ＴＹＰＥＩ　−ＴＹ ＰＥ３−　ＴＹＰＥ３−　ＡＴＡＡＳａｆ７　’　Ｍ　−ＴＹＰＥＩ　−ＴＹＰ Ｅ３−　ＴＹＰＥ３−　ＴＹＰＥ３−＾ＴＡ＾５ａｆ８　Ｍ　−ＴＹＰＥＩ　− ＴＹＰＥ３−　ＴＹＰＥ３−　ＡＴＡＲ５ｏｆ９　Ｍ−ＴＹＰＥＩ　−ＴＹＰＥ ３−　ＴＹＰＥ３−　ＴＹＰＥ３−　ＡＩＡＲ５ａｆｌＯＭ　−ＴＹＰＥＩ　− ＴＹＰＥ４−　ＴＹＰＥ５−　ＡＴＡＲＦＩＧ、ｊ。Symbols for amino acids II Hls Histidine 1 11B Isoleucine K LYS Lysine L LED Leucine TYPE I DTASD AAAAAA＾TYPE 2 LTAAN AKAA AETYPE 3 LTAAN AAAA^^TYPE 4 LTAAN AA ^^^ TYPE5 L-ADN ^^AAA^TYPE li ATAAT AAAAAA＾TYPE 7 ATAAT AAKAAA consensus 1TAa n　AaaAAAaSaf3　MAA　-TYPE　I　-TYPE3-TYPE 3-ATAASafJ MAA-TYPE l-TYPE3-TYPE 3 -TYPE3-ATAASaf5 MAA-TYPEI-TYPE3-TYP E3-TYPE3-TYPE3-ATA＾5af6　M　-TYPEI　-TY PE3-TYPE3-ATAASaf7' M-TYPEI-TYP E3- TYPE3- TYPE3-＾TA＾5af8 M　-TYPEI- TYPE3- TYPE3- ATAR5of9 M-TYPEI-TYPE 3- TYPE3- TYPE3- AIAR5aflOM -TYPEI- TYPE4- TYPE5- ATARFIG, j.

５５ｇ−Ｉ　ＮＧＥＴＰ　ＡＯＫ＾＾Ｒｌ５ＴＬＡＡＡＡ　ＡＬＡＡＫＴ Ａ＾０＾＾ＡＫＡＡＡＫ ＾Ａ＾１＾ＡＡＡＡＳＡ ５５３　ＭＮＡＰＡ　ＲＡＡＡＫＴ　ｌ５ＴＡＡＤＡＬ　Ａ＾＾ＫＩ［Ｔ ＡＡＤ＾＾ＡＡＡＡＡ＾ ＦＩＧ　４゜ （タンパク質）への融合　融　合　利　点病原−間達のタンパク質ＰＲＩＢ　双 子葉植物からの分泌。55g-I NGETP AOK^^Rl5TLAAAALAAKT A^0^^AKAAAK ^A^1^AAAASA 553 MNAPA RAAAKT l5TAADAL A^^KI[T AAD^^AAAAAA^ FIG 4゜ (Protein) Fusion Advantage Pathogenesis - Intermediate Protein PRIB Twin Secretion from cotyledonous plants.

α−アミラーゼ　単子葉植物からの分泌。α-Amylase Secreted from monocots.

植物凝集素　植物において標的化する液胞。Phytoagglutinin Targeting vacuole in plants.

ＲｕＢＰＣＡＳＥ　小サブユニット　植物において標的化するクロロプラスト。RuBPCASE small subunit Chloroplast targeting in plants.

ファセリン　種子における蓄積。Phaselin Accumulation in seeds.

アルコールデヒドロゲナーゼ　酵母における発現。Alcohol dehydrogenase expression in yeast.

α−接合因子　酵母からの分泌。α-mating factor secreted from yeast.

ルシフェラーゼ　発光による検出可能性。Luciferase Detectability by luminescence.

図面の簡単な説明 第１図は、アミノ酸の略語を示す。Brief description of the drawing FIG. 1 shows amino acid abbreviations.

第２図は、合成不凍化ポリペプチドのコアーの反復配列の列挙である。FIG. 2 is a listing of the core repeat sequences of synthetic antifreeze polypeptides.

第３図は、特に好ましい不凍化ポリペプチド配列の列挙である。FIG. 3 is a listing of particularly preferred antifreeze polypeptide sequences.

第４図は、特に好ましい不凍化合成遺伝子配列及びそれらの対応するアミノ酸配 列の列挙である。FIG. 4 shows particularly preferred antifreeze synthetic gene sequences and their corresponding amino acid sequences. It is an enumeration of columns.

第５図は、融合ポリペプチド及びそれらの使用の列挙である。FIG. 5 is a list of fusion polypeptides and their uses.

第６図は、Ｓａｆタンパク質及びＳａｆ遺伝子を調製するために使用されるヌク レオチド配列の列挙である。Figure 6 shows the nucleic acids used to prepare the Saf protein and Saf gene. List of leotide sequences.

第７図は、不凍化ポリペプチドの種々の使用のためのスプラットアッセイ写真で ある。Figure 7 is a splat assay photograph for various uses of antifreeze polypeptides. be.

第８図は、植物形質転換のためのプラスミド構造を説明する。Figure 8 illustrates plasmid construction for plant transformation.

第９図は、植物形質転換実験において発現を示すゲルのオートラジオグラフであ る。ＲＮアーゼ保護実験の結果：レーン１ニブローブのみ レーン２：酵母ｔＲＮＡ レーン３：不凍化遺伝子を発現しない形質転換体からのＲＮＡ レーン４　：　３４９９−ＡＰＮＢ形賞転換体＃１からのＲＮＡレーン５　：　 ２９６４−ＡＰＮＢ形賞転換体＃２からのＲＮＡレーン６　：　２９６４−ＡＰ ＮＢ形賞転換体＃３からのＲＮＡレーン７　：　２９６４−ＡＰＮＢ形賞転換体 ＃４からのＲＮＡレーン８　：　２９６４−ｘＰＮＢｉ賞転換体＃５からのＲＮ Ａレーン９　：　２９６４−ＡＰＮＢ形賞転換体＃６からのＲＮＡレーンＩ　Ｑ 　：　ｐＢＲ３２２Ｈｐａ　ｎ分子量マーカー第１０図は、本発明のプロティン −Ａ−Ｓａｆ５融合を発現する酵母の抽出物における再結晶化の進行を示す。Figure 9 is a gel autoradiograph showing expression in a plant transformation experiment. Ru. RNase protection experiment results: lane 1 nibrobe only Lane 2: Yeast tRNA Lane 3: RNA from transformants that do not express antifreeze genes Lane 4: RNA from 3499-APNB transformant #1 Lane 5: RNA lane 6 from 2964-APNB transformant #2: 2964-AP RNA lane 7 from NB type transformant #3: 2964-APNB type transformant RNA from #4 Lane 8: RN from 2964-xPNBi prize transformant #5 A lane 9: RNA lane IQ from 2964-APNB type prize converter #6 : pBR322Hpa n molecular weight marker Figure 10 shows the protein of the present invention. -A- Shows the progress of recrystallization in extracts of yeast expressing the Saf5 fusion.

第１１図は、本発明のプロティン−Ａ−５ａｆ４融合を発現する酵母の抽出物に おける再結晶化の進行を示す。FIG. 11 shows that extracts of yeast expressing the protein-A-5af4 fusion of the present invention This figure shows the progress of recrystallization in the process.

ＦＪＧ、Ｊ。F.J.G., J.

ＤＳオリゴＩ ＤＳオリゴ５ ＦＩＬＪＡ。DS Oligo I DS Oligo 5 FILJA.

ＤＳオリゴ６ ５’　ＧＧＣＣＩ；ＣＴＡＡＡ　ＣＴＧＡＣＴＧＣＡＧ　ＡＴＡＡＴＧＣＴＧＣ ＣＧＣ３゜３°　ＣＧ＾ＴＴＴ　ＧＡＣＴＧＡＣＧＴＣＴ＾ＴＴＡＣＧＡＣＧ　 Ｇ　５’ＤＳオリゴ７ ５°　ＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧ　ＴＣＧＡＣ＾＾ＧＣＧ　ＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧ　 Ｇ＾丁ＴＡＡＧＧＡＴ　ＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＴＴＣＧＣ ＡＡＴＴＧＡＧＣＴＣＣＴＡＡＴＴＣＣＴＡ　ＣＧＡＣＧＴＣＴＡＤＳオリゴ８ ５’　ＡＡ丁ＴＣＣＣＧＧＧ　ＴＣＧＡＣＡＴＴＧＡ　ＡＧＧＴＣＧＣＧＡＣＡ ＣＴＧ　３゜３′’　ＧＧＧＣＣＣＡｔ；ＣＴＧＴＡＡＣＴ　ＴＣＣＡＧＣＧＣ ＴＧ　ＴＧＡＣＧＡＴＣ５゜ｐＵｃ１１９にクローン化されるような不凍化遺伝 子５ａｆ４　（ＩＩ成体はｐＬＶｃ８５である）ＦＩＧ、６Ｄ。DS oligo 6 5' GGCCI; CTAAA CTGACTGCAG ATAAATGCTGC CGC3゜3°　CG＾TTT　GACTGACGTCT＾TTACGACG　 G 5’DS Oligo 7 5° AATTCCATGG TCGAC^^GCG TTAACTCGAG G＾Ding TAAGGAT CCTGCAGATGGTACCAGCTGTTCGC AATTGAGCTCCTAATTCCTA CGACGTCTADS Oligo 8 5’ AA DingTCCCGGGTCGACATTGAAGGTCGCGACA CTG 3゜3''　GGGCCCAt;CTGTAACT　TCCAGCGC Antifreeze gene cloned into TG TGACGATC5゜pUc119 Offspring 5af4 (II adult is pLVc85) FIG, 6D.

ＦＩＧ、ＪＥ。FIG., J.E.

ｐＲＩＴ５にクローン化されるような不凍化遺伝子（ｐＲＬＭ１０４）ｐＲＩＴ ５にクローン化されるような不凍化遺伝子５ａｆ５　（ｐＲＬＭ１０５）ＦＩＧ 、ＪＨ。Antifreeze gene (pRLM104) as cloned into pRIT5 pRIT Antifreeze gene 5af5 (pRLM105) as cloned into 5 FIG. , J.H.

日Ｌ６Ｉ。Day L6I.

ｐＵｃ１１９にクローン化されるような不凍化遺伝子５ａｆ７　（ｐＧＪ１５２ ）ＦＩＧ、ＪＰ。Antifreeze gene 5af7 as cloned into pUc119 (pGJ152 )FIG, JP.

ＳＥＴ　＃ｌ　ＳＡＦ／）＋２０ ５分 １５分 ＦＩＬＴＡ。SET #l SAF/)+20 5 minutes 15 minutes FILTA.

１−３　−５Ａ、　＋５ＡＦ ３０分 １時間 七ット＃２ＳＡＦ／ボプシクル ５分 ３０分 １時間 ｒｔｒ、＝ｒＢ： セット＃３　ＳＡＦ／Ａ！Ｗハートビアーフロートパー５分 １５分 ＦＩＧ　７Ｃ。1-3 -5A, +5AF 30 minutes 1 hour Sevent #2 SAF/Bopsicle 5 minutes 30 minutes 1 hour rtr,=rB: Set #3 SAF/A! W heart beer float par 5 minutes 15 minutes FIG 7C.

”　−５ＡＦ　＋５ＡＦ ）４　−５ＡＦ　ｗＳＭ １時間 ＦＩＧ、ＪＣ： ＮψＩ ５分 １５分 １時間 ＦＩＱ、、ｌＯＢ。”-5AF +5AF )4-5AF wSM 1 hour FIG., JC: NψI 5 minutes 15 minutes 1 hour FIQ,,lOB.

国際調査報先International investigation report destination

Claims (25)

【特許請求の範囲】[Claims] １．氷結晶の成長抑制を示し、そして下記式：（ＮＨ２）Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３（Ｃ ＯＯＨ）〔式中、Ｘは部位特異的切断成分を含んで成り、Ｘ２は配列ＬＴＡＡＮ ＡＡＡＡＡＡに相同の配列を有する少なくとも２つのセグメントを含んで成るポ リペプチドであり、そしてＸ３は、存在するなら、末端アミノ酸配列を含んで成 る〕を有する実質的に純粋なポリペプチド。1. It shows inhibition of ice crystal growth and has the following formula: (NH2)X1-X2-X3(C OOH) [where X comprises a site-specific cleavage moiety and X2 comprises the sequence LTAAN A port comprising at least two segments having a sequence homologous to AAAAAA polypeptide, and X3, if present, comprises a terminal amino acid sequence. A substantially pure polypeptide having a ２．下記式： （ＮＨ２）Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３ （ＣＯＯＨ） 〔式中、Ｘ１は、 ａ）異種融合パートナーポリペプチド及び存在するなら、スペーサーセグメント ； ｂ）実質的理論的分解性アミノ酸又はポリペプチド及び存在するなら、１又は複 数のスペーサーセグメント；ｃ）非アミノ酸成分；又は ｄ）約５〜２０個のアミノ酸を有し、そして配列ＬＴＡＡＮＡＡＡＡＡＡに対し て実質的な相同性を有さないオリゴペプチドセグメントから実質的に成り； Ｘ２は、配列ＬＴＡＡＮＡＡＡＡＡＡに相同の配列を有する少なくとも２種のア ミノ酸セグメントを含んで成り；Ｘ３は、存在するなら、 ａ）任意に付随するスペーサーセグメントを有する融合パートナーアミノ酸配列 ；又は ｂ）約２〜５０個のアミノ酸の末端配列から実質的に成る〕を含んで成る、汚染 性魚化合物を実質的に有さない不凍化ポリペプチド。2. The following formula: (NH2)X1-X2-X3 (COOH) [In the formula, X1 is a) a heterologous fusion partner polypeptide and, if present, a spacer segment ; b) Substantially theoretically degradable amino acids or polypeptides and, if present, one or more a number of spacer segments; c) a non-amino acid component; or d) has about 5-20 amino acids and for the sequence LTAANAAAAAAA consisting essentially of oligopeptide segments having no substantial homology; X2 is at least two species having sequences homologous to the sequence LTAANAAAAAAA. comprises a amino acid segment; X3, if present, a) Fusion partner amino acid sequence with optional accompanying spacer segment ; or b) consisting essentially of a terminal sequence of about 2 to 50 amino acids. An antifreezing polypeptide substantially free of sex compounds. ３．前記Ｘ２が配列ＤＴＡＳＤＡＡＡＡＡＡから実質的に成るアミノ酸セグメン トを含んで成る請求の範囲第１項記載の実質的に純粋なポリペプチド。3. an amino acid segment in which the X2 consists essentially of the sequence DTASDAAAAAA; 2. The substantially pure polypeptide of claim 1, comprising: ４．前記Ｘ１が、 ａ）メチオニン； ｂ）ＭＡＡ；又は ｃ）ＩＥＧＲ を含んで成る請求の範囲第１又は２項記載のポリペプチド。4. Said X1 is a) Methionine; b) MAA; or c) IEGR 3. The polypeptide according to claim 1 or 2, comprising: ５．ＬＴＡＡＮＡＡＡＡＡＡに相同のセグメントが第２図の配列を有する請求の 範囲第１又は２項記載のポリペプチド。5. A claim in which the segment homologous to LTAANAAAAAAA has the sequence shown in FIG. A polypeptide according to scope 1 or 2. ６．前記Ｘ３が、 ｉ）ＡＴＡＡ； ｉｉ）ＡＴＡＲ； ｉｉｉ）ＡＴＡＫ； ｉｖ）ＡＴＡＡＡＡＡＲ；又は ｖ）ＡＴＡＡＡＡＡＫ のカルボキシ末端を有する請求の範囲第１又は２項記載のポリペプチド。6. Said X3 is i) ATAA; ii) ATAR; iii) ATAK; iv) ATAAAAAAR; or v) ATAAAAAAK 3. The polypeptide according to claim 1 or 2, having a carboxy terminus of ７．請求の範囲第１又は２項記載のポリペプチドを含んで成る植物。7. A plant comprising the polypeptide according to claim 1 or 2. ８．ＬＴＡＡＮＡＡＡＡＡＡに相同の配列をそれぞれ有する少なくとも２つのセ グメントを含んで成る不凍化融合ポリペプチド。8. At least two segments each having a sequence homologous to LTAANAAAAAAA an antifreeze fusion polypeptide comprising a component. ９．第４図の配列を含んで成るポリペプチド。9. A polypeptide comprising the sequence of FIG. １０．下記式： （ＮＨ２）Ｘ１−Ｘ２（ＣＯＯＨ） 〔式中、Ｘ１は、アミノ酸アスパーテートを含まないアミノ酸配列を含んで成り ； Ｘ２は、少なくとも３個のタンデムセグメントを含んで成り、ここで個々のセグ メントは、約１１個の長さのアミノ酸であり、そして ａ）すべてのアラニン（但し、Ｄ，Ｅ，Ｋ，Ｎ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ又はしから成る 群から選択された１〜４個の置換アミノ酸を除く）； ｂ）１０個のアラニン（但し、Ｄ，Ｅ，Ｋ，Ｎ，Ｑ，Ｒ，Ｓ又はＴから成る群か ら選択された１〜４個のアミノ酸置換基を除く）；又は ｃ）７個のアラニン又は６個のアラニン及び１個のロイシンのいづれかを含んで 成る〕を有する実質的に純粋なポリペプチド。10. The following formula: (NH2)X1-X2(COOH) [In the formula, X1 comprises an amino acid sequence that does not contain the amino acid aspartate.] ; X2 comprises at least three tandem segments, where the individual segments ment is approximately 11 amino acids in length, and a) All alanines (consisting of D, E, K, N, Q, R, S, T or excluding 1 to 4 substituted amino acids selected from the group); b) 10 alanines (provided that the group consisting of D, E, K, N, Q, R, S or T (excluding 1 to 4 amino acid substituents selected from ); or c) Contains either 7 alanines or 6 alanines and 1 leucine A substantially pure polypeptide comprising: １１．（ａ）アミノ酸配列ＬＴＡＡＮＡＡＡＡＡＡ、又は（ｂ）第４図の配列 に相同のセグメントを含んで成る氷結晶の成長抑制ポリペプチド及び安定剤の混 合物。11. (a) Amino acid sequence LTAANAAAAAAA, or (b) Sequence in Figure 4 A mixture of an ice crystal growth inhibiting polypeptide and a stabilizer comprising a segment homologous to Compound. １２．不凍化ポリペプチド及び食品又は生物学的物質を含んで成る組成物。12. A composition comprising an antifreeze polypeptide and a food or biological substance. １３．前記不凍化ポリペプチドが、 ａ）アミノ酸配列ＬＴＡＡＮＡＡＡＡＡＡ；又はｂ）第４図の配列 に相同のセグメントを含んで成る請求の範囲第１２項記載の組成物。13. The antifreeze polypeptide is a) the amino acid sequence LTAANAAAAAAA; or b) the sequence of Figure 4 13. The composition of claim 12, comprising a segment homologous to . １４．少なくとも約２，０００ドルトンの不凍化ポリペプチドをコードする領域 （該領域は異種プロモーターに操作的に結合される）を含んで成る単離された組 換え核酸を含んで成る組成物。14. A region encoding an antifreeze polypeptide of at least about 2,000 daltons (wherein said region is operably linked to a heterologous promoter) A composition comprising a modified nucleic acid. １５．前記核酸が、第３図の配列を含んで成るタンパク質をコードする請求の範 囲第１４項記載の組成物。15. 3. The claim that the nucleic acid encodes a protein comprising the sequence of FIG. 15. The composition according to item 14. １６．前記核酸が、 ａ〕第４図におけるアミノ酸配列のうち２つの配列を含んで成るアミノ酸配列を コードする核酸配列に相同であり；又は ｂ）第４図のアミノ酸配列をコードする核酸配列に、温度又は塩の緊縮条件下で ハイプリダイズするであろう少なくとも約２０個のヌクレオチドを含んで成る請 求の範囲第１４項記載の組成物。16. The nucleic acid is a] An amino acid sequence containing two of the amino acid sequences in Figure 4. homologous to the encoding nucleic acid sequence; or b) The nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence of FIG. a protein comprising at least about 20 nucleotides that will hybridize; The composition according to claim 14. １７．ａ）アミノ酸配列ＬＴＡＡＮＡＡＡＡＡＡ；又はｂ）第４図の配列 に相同のポリペプチドセグメントを含んで成るタンパク質をコードする組換え核 酸であって、 前記タンパク質がそのタンパク質に天然に関連するシグナル配列に関連しないこ とを特徴とする組換え核酸。17. a) the amino acid sequence LTAANAAAAAAA; or b) the sequence of Figure 4 a recombinant nucleus encoding a protein comprising a polypeptide segment homologous to An acid, that the protein is not associated with a signal sequence naturally associated with the protein; A recombinant nucleic acid characterized by: １８．生物学的物質に対する可能性ある凍結損傷を最少にするための方法であっ て、氷結晶の成長を抑制するのに十分な量の１又は複数の不凍化ポリペプチドを 導入する段階を含んで成る方法。18. A method to minimize possible freezing damage to biological materials. one or more antifreeze polypeptides in an amount sufficient to inhibit ice crystal growth. A method comprising the steps of introducing. １９．前記氷結晶の成長抑制ポリペプチドが、ａ）アミノ酸配列ＬＴＡＡＮＡＡ ＡＡＡＡ；又はｂ）第４図の配列 に相同なアミノ酸セグメントを含んで成る請求の範囲第１８項記載の方法。19. The ice crystal growth inhibiting polypeptide comprises: a) the amino acid sequence LTAANAAA; AAAA; or b) the sequence in Figure 4 19. The method of claim 18, comprising an amino acid segment homologous to. ２０．前記タンパク質が組換え核酸配列の発現により導入される請求の範囲第１ ８項記載の方法。20. Claim 1, wherein said protein is introduced by expression of a recombinant nucleic acid sequence. The method described in Section 8. ２１．予定された生物学的部位に不凍化ポリペプチドを標的決定することができ る融合タンパク質であって、前記タンパク質が標的ポリペプチドセグメントに融 合される不凍化セグメントを含んで成る融合タンパク質。21. Antifreeze polypeptides can be targeted to predetermined biological sites. a fusion protein in which the protein is fused to a target polypeptide segment; A fusion protein comprising antifreeze segments that are combined. ２２．不凍化ポリペプチドをコードする組換え核酸配列を含む細胞又は細胞子孫 のいづれかを含んで成る多細胞生物。22. A cell or cell progeny containing a recombinant nucleic acid sequence encoding an antifreeze polypeptide A multicellular organism that contains any of the following. ２３．不凍化ポリペプチドをコードする異種核酸セグメントを含んで成る酵母細 胞。23. A yeast cell comprising a heterologous nucleic acid segment encoding an antifreeze polypeptide Cell. ２４．前記ポリペプチドが、 ａ）アミノ酸配列ＬＴＡＡＮＡＡＡＡＡＡ；又はｂ）第４図の配列 に相同である請求の範囲第２３項記載の酵母細胞。24. The polypeptide is a) the amino acid sequence LTAANAAAAAAA; or b) the sequence of Figure 4 24. A yeast cell according to claim 23, which is homologous to. ２５．不凍化ポリペプチドセグメント及び少なくとも１つのｌｇＧ結合部位を示 すプロテインＡセグメントを含んで成る融合タンパク質。25. an antifreeze polypeptide segment and at least one IgG binding site; A fusion protein comprising a Protein A segment.