JPH04505249A - Non-melanocytic eukaryotic cells constitutively expressing biologically active human tyrosinase and uses thereof - Google Patents

Non-melanocytic eukaryotic cells constitutively expressing biologically active human tyrosinase and uses thereof

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JPH04505249A
JPH04505249A JP2507117A JP50711790A JPH04505249A JP H04505249 A JPH04505249 A JP H04505249A JP 2507117 A JP2507117 A JP 2507117A JP 50711790 A JP50711790 A JP 50711790A JP H04505249 A JPH04505249 A JP H04505249A
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tyrosinase
cell
human tyrosinase
melanocytic
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ブーチヤード・ブリジツト
フーグトン，アラン・エヌ
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スローン―ケツテリング・インステイテユート・フオー・キヤンサー・リサーチ
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    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 生　的に′　ｔヒトチロシナーゼを構成同に　現するＪトメーノ　イト　び　の ４酊」Ｊ 本出願明細書を通し、種々の文献力（力）つこ内Ｇこアラビア数字で示して参照 されてし）る。これらの文献の詳細番よ、本明細書の説明文の終わりＧこ請求の 範囲Ｇこ先立ちケ１挙しである。本明細書に記載すると共心こ特許請求する本発 明の時点での当業者には公知の当業界の現状とより完全Ｇこ説明するために、か かる文献の開示内容番よそのまま参照（こより本明細書の一部を構成するものと する。[Detailed description of the invention] J tomenoids that biologically express human tyrosinase at the same time 4 drunkenness”J Throughout this application, reference will be made to various references indicated by Arabic numerals. be done) Details of these documents can be found at the end of the description of this specification. Range G is the first one. As described herein, the present invention claimed as a concentric patent In order to more fully describe the state of the art as of the time known to those skilled in the art, Please refer to the disclosure content number of such document (which shall constitute a part of this specification). do.

メラノサイト及びメラノサイト系の細胞番よ、それらのメラニン色素を合成する 能力によって区５５’ｌされる。メラニン産生は主として、酵素チロシナーゼ（ モノフェノール、３゜４−ジヒドロキシフェニルアラニン：酸素オキシドレダク ターゼ、ＥＣ１，１４，１８，１）によって調節される。。Melanocytes and melanocyte-type cells synthesize their melanin pigment. It is divided by ability. Melanin production is primarily caused by the enzyme tyrosinase ( Monophenol, 3゜4-dihydroxyphenylalanine: oxygen oxidreduc EC1,14,18,1). .

メラニン合成は原則として、オルガ才・うと特定されるメラノソームにおいて生 じる。即ち、メラニン合成＆よ一般（こメラノソーム含有メラニン細胞Ｇこ限定 される。Melanin synthesis is, in principle, produced in melanosomes, which are identified as organoleptics. Jiru. That is, melanin synthesis & general (melanosome-containing melanocytes G only) be done.

本出願明細書は、ヒトチロシナーゼをコードするｃＤＮの配列が、Ｋｗｏｎら（ １，３５，３７＞によって記載されたＰｍｅｌ　３４　ｃＤＮＡ配列と相同であ るプローブを使用することにより行われる。更に、マウス線維芽細胞中でのこの 新規のヒトチロシナーゼｃＤＮＡクローンのトランスフェクション及び発現は、 通常はメラニンを合成しない細胞型において色素沈着を誘導した。The present application discloses that the sequence of the cDNA encoding human tyrosinase is derived from Kwon et al. 1, 35, 37> and the Pmel 34 cDNA sequence described by This is done by using a probe. Furthermore, this effect in mouse fibroblasts Transfection and expression of a novel human tyrosinase cDNA clone It induced pigmentation in cell types that do not normally synthesize melanin.

トランスフェクトされた線維芽細胞中でのチロシナーゼ活性のレベルは、高度に 色素沈着したヒトメラノーマ細胞系におけるチロシナーゼレベルと等価であった 。これらのチロシナーゼ陽性線維芽細胞系は、メラニン合成がメラノソームを含 有しない細胞においても行われ得ることを示している。結果として、本出願人ら は、チロシナーゼ合成の調節、輸送及び過程を研究するツールを得たのである。The level of tyrosinase activity in transfected fibroblasts is highly was equivalent to tyrosinase levels in pigmented human melanoma cell lines. . These tyrosinase-positive fibroblast cell lines show that melanin synthesis involves melanosomes. This shows that it can be carried out even in cells that do not have this. As a result, applicants now have the tools to study the regulation, transport, and process of tyrosinase synthesis.

免肌二ｌ碧 本発明は、生物学的に活性なヒトチロシナーゼを構成的に発現する非メラノサイ ト真核細胞を提供する６本発明は更に、細胞がメラニンを産生ずるような条件下 で生物学的に活性なヒトチロシナーゼを発現するような細胞をも提供する。Menhada 2l Aoi The present invention provides non-melanocytes that constitutively express biologically active human tyrosinase. The present invention further provides eukaryotic cells under conditions such that the cells produce melanin. Also provided are cells that express biologically active human tyrosinase.

更に本発明は、生物学的に活性なヒトチロシナーゼ及びメラニンを生産する方法 をも提供する。Furthermore, the present invention provides a method for producing biologically active human tyrosinase and melanin. We also provide

Ｉｎ立ｉ呈１１」 区１．ＥＥＴＹ−１ｃＤＮＡのヌクレオチド及び断定アミノ酸配列。ヌクレオチ ド配列は５゛から３′の方向で番号を付しである。推定シグナルペプチドの残基 は負の番号で示してあり、切断部位は縦の矢印で示しである。終結部位（Ｔ　Ａ 　Ａ　）及びポリアデニル化シグナルく８６９〜８７５）には下線を引いである 。潜在的なグルコシル化部位は破線で示しである。"In standing 11" Ward 1. Nucleotide and defined amino acid sequence of EETY-1 cDNA. Nucleochi The code array is numbered in the 5' to 3' direction. Putative signal peptide residues are indicated by negative numbers, and the cleavage site is indicated by a vertical arrow. Termination site (TA A) and polyadenylation signals 869-875) are underlined. . Potential glycosylation sites are indicated by dashed lines.

区又、チロシナーゼを発現する２つの着色メラノーマ細胞系とＢ細胞リンパ腫細 胞系ＤａｕｄＬ由来のポリ（Ａ゛）選別ＲＮＡのノザンプロット分析（４μｇ／ レーン）。プロットを、ｐＢＢＴＹ−１の３２ｐ標識挿入体でハイブリダイズし た。レーン：　１）ＳＫ−ＭＥＬ−２３メラノーマ；２）ＳＫ−ＭＥＬ−１９メ ラノーマ及び３）Ｄａｕｄｉ。Two pigmented melanoma cell lines and B-cell lymphoma cells expressing tyrosinase Northern plot analysis of poly(A゛)-selected RNA from cell line DaudL (4 μg/ lane). Plots were hybridized with the 32p labeled insert of pBBTY-1. Ta. Lane: 1) SK-MEL-23 melanoma; 2) SK-MEL-19 melanoma Ranoma and 3) Daudi.

区ユ、センスＢＢＴＹ−１（ＬｐｃＴＹＲ細胞系）、アンチセンスＢ　ＢＴＹ　 −１（Ｌ　ｐ　ｃ　ＴＹＷ細胞系）またはｐＵｃ１８プラスミド（Ｌｐｃ細胞系 ）を用いてトランスフェクトしたし９２つ細胞の細胞ペレット。ＬｐｃＴＹＲ及 びＬｐＣＴＹＷ細胞系は、発現ベクターｐｃＥＸＶＢ中にセンスまたはアンチセ ンスで挿入したＢＢＴＹ−１を用いてトランスフェクトした。Ｌ　Ｐ　Ｇ　Ｔ　 Ｙ　Ｒ−１及びＬｐｃＴＹＲ−２はＬｐｃＴＹＲのサブクローンである。１）Ｌ ｐｃ細胞ペレット（非着色）；　２）ＬｐｃＴＹＷ（非着色）；３）ＬｐｃＴＹ Ｒ−１（着色）及び４）ＬｐｃＴＹＲ−２（着色）。Gu Yu, sense BBTY-1 (LpcTYR cell line), antisense B BTY -1 (Lpc TYW cell line) or pUc18 plasmid (Lpc cell line) Cell pellets of 92 cells transfected with ). LpcTYR and and LpCTYW cell lines contain either sense or antisense cells in the expression vector pcEXVB. The cells were transfected using BBTY-1 inserted at the same time. L　P　G　T YR-1 and LpcTYR-2 are subclones of LpcTYR. 1)L PC cell pellet (non-pigmented); 2) LpcTYW (non-pigmented); 3) LpcTY R-1 (colored) and 4) LpcTYR-2 (colored).

区Ａ、培養液中のＬｐｃＴＹＲ細胞。視野の中央にある細胞巣は大きな着色細胞 質顆粒を含んでいる。拡大率３２０倍。Section A, LpcTYR cells in culture medium. The cell nest in the center of the field of view is a large colored cell. Contains quality granules. 320x magnification.

区５．ＬｐｃＴＹＲ細胞の断片の透過型電子票微鏡写真。Ward 5. Transmission electronic micrograph of a fragment of an LpcTYR cell.

Ａ）電子密集物質を含む細胞質膜結合小胞を矢印で示しである。１目盛りは１μ ｍを表わす。拡大率８，４００倍。A) Cytoplasmic membrane-bound vesicles containing electron-dense material are indicated by arrows. 1 scale is 1μ represents m. 8,400x magnification.

Ｂ）色素を細胞質膜結合小胞のより拡大した視野。１目盛りは１μｍを表わす。B) A more magnified view of dye-bound cytoplasmic membrane vesicles. One scale represents 1 μm.

拡大率１６，８００倍。Magnification rate: 16,800x.

ｌ５．１）ＳＫ−ＭＥＬ−１９メラノーマ；　２）Ｌｐｃ細胞（ｐＵｃ１８プラ スミドでトランスフェクトしたもの）；　３）ＬｐｃＴＹＲ−１細胞（ＢＢＴＹ −１センス構築体でトランスフェクトしたもの）；　４）ＬｐＣＴＹＲ−２細胞 （ＢＢＴＹ−１センス構築体でトランスフェクトしたもの）：及び５）ＬｐＣＴ ＹＷ細胞（ＢＢＴＹ−１アンチセンス構築体でトランスフェクトしたもの）由来 の細胞抽出物におけるチロシナーゼ活性の発現、チロシンヒドロキシラーゼ活性 をｃｐｍ　’Ｈ２０／分／ｍｇタンパク質〔口棒〕またはｃｐｍ　コＨ２０／分 １５Ｘ１０’細胞〔口棒〕で表したもの。l5.1) SK-MEL-19 melanoma; 2) Lpc cells (pUc18 plasma 3) LpcTYR-1 cells (BBTY -1 sense construct transfected); 4) LpCTYR-2 cells (transfected with BBTY-1 sense construct): and 5) LpCT From YW cells (transfected with BBTY-1 antisense construct) Expression of tyrosinase activity, tyrosine hydroxylase activity in cell extracts of cpm H20/min/mg protein [mouth stick] or cpm H20/min Represented by 15 x 10' cells.

区ユ、３５Ｓ−メチオニン代謝標識したＳＫ−ＭＥＬ−１９メラノーマ細胞、Ｂ ＢＴＹ−１を発現するＬＰＣＴＹＲ−２細胞、及びＬ９２９細胞由来の溶解物の 免疫沈降。レーン：１）ｍＡｂ　ＴＡ９９；２＞ｍＡｂ　２Ｇ１０；３）対照ウ サギ血清：及び４）ウサギ抗チロシナーゼ抗血清、ＳＫ−ＭＥＬ−１９（ＴＡ９ ９．２Ｇ１０及び抗チロシンを用いた場合）及びＬｐＣＴＹＲ−２細胞く抗チロ シナーゼを用いた場合）中で７５ｋＤ断片が検出された。分子量基準：ミオシン Ｍ鎖（２００ｋＤ）、ホスホリラーゼ（９６ｋＤ）；ウシ血清アルブミン（６８ ｋＤ）；及びオボアルブミン（４３ｋＤ）。Gu Yu, 35S-methionine metabolically labeled SK-MEL-19 melanoma cells, B Lysates from LPCTYR-2 cells expressing BTY-1 and L929 cells Immunoprecipitation. Lanes: 1) mAb TA99; 2>mAb 2G10; 3) Control Heron serum: and 4) Rabbit anti-tyrosinase antiserum, SK-MEL-19 (TA9 9.2G10 and anti-tyrosine) and LpCTYR-2 cells A 75 kD fragment was detected in the 10-ml (using C. sinase). Molecular weight standard: myosin M chain (200kD), phosphorylase (96kD); bovine serum albumin (68 kD); and ovalbumin (43kD).

■、Ａ）ＢＢＴＹ−１を発現するＬｐｃＴＹＲ−２、及びＢ）ＳＫ−ＭＥＬ−１ ９メラノーマ細胞による抗層発現に対する間接蛍光抗体アッセイ。ｍＡｂ　ＴＡ ９９（抗ｇｐ７５）Δ：ｍＡｂ　ＣＦ２１（抗メラノソーム抗原）・１ｍＡｂ　 Ｈｌｏｏ−５Ｒ２８（抗Ｈ−２”）○：及びｍＡｂ　ＡＪ２（抗インテグリン； 陽性対照）ム。■, A) LpcTYR-2 expressing BBTY-1, and B) SK-MEL-1 Indirect fluorescent antibody assay for antilayer expression by 9 melanoma cells. mAb TA 99 (anti-gp75)Δ: mAb CF21 (anti-melanosome antigen) 1 mAb Hloo-5R28 (anti-H-2”)○: and mAb AJ2 (anti-integrin; positive control).

１旦ゑ■１ 本発明は、生物学的に活性なヒトチロシナーゼを構成的に発現する非メラノサイ ト真核細胞を提供する。１danゑ■１ The present invention provides non-melanocytes that constitutively express biologically active human tyrosinase. provide eukaryotic cells.

本明細書中で使用される“生物学的に活性なヒトチロシナーゼ”とは、天然ヒト チロシナーゼの（１）アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列及 び（２）生物学的活性を有するポリペプチドを意味する。As used herein, "biologically active human tyrosinase" refers to naturally occurring human tyrosinase. (1) Amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence of tyrosinase; and (2) a polypeptide that has biological activity.

更に、本明細書中で使用される“非メラノサイト真核細胞”とは、メラノサイト 、即ちポリマー性メラニン色素の産生に関与するオルガネラの不在を特徴とする 真核細胞を意味する。このような細胞の１つの例はＩｔ！！芽細胞である。Furthermore, as used herein, "non-melanocytic eukaryotic cells" refer to melanocytes. , i.e. characterized by the absence of organelles involved in the production of polymeric melanin pigments means eukaryotic cell. One example of such a cell is It! ! It is a blast cell.

原則として、限定的ではないが、哺乳動物の細胞（例えばヒトの線維芽細胞）、 他の動物（例えばヒツジ、ブタ、マウス、ウシまたはトリ）の細胞、昆虫の細胞 または酵母細胞を含む任意の真核ｌ１ｌＩ胞が本発明の実施に有用である。In principle, but not exclusively, mammalian cells (e.g. human fibroblasts), Cells of other animals (e.g. sheep, pigs, mice, cows or birds), insect cells or any eukaryotic 111 cells, including yeast cells, are useful in the practice of the present invention.

有効な非メラノサイト真核細胞としては、生物学的に活性なヒトチロシナーゼを コードするＤＮＡが天然には存在せず、その中にかかるＤＮＡが導入された真核 細胞を挙げることができる。かかるＤＮＡを導入する方法は、ＤＮＡが発現され て生物学的に活性なヒトチロシナーゼが産生されるような条件下でそれを行なう 方法（４３）が当業者には公知である。Effective non-melanocytic eukaryotic cells contain biologically active human tyrosinase. A eukaryote in which the coding DNA does not exist naturally and into which such DNA has been introduced. Examples include cells. The method for introducing such DNA is that the DNA is expressed. do so under conditions such that biologically active human tyrosinase is produced. Method (43) is known to those skilled in the art.

本発明の１つの実施態様においては、ヒトチロシナーゼをコードするＤＮＡを、 関与する真核細胞型において発現するのに適した発現ベクター上に担持させる６ 例えば、哺乳動物細胞に対しては発現ベクターはレトロウィルスとすることがで き、昆虫細胞に対しては発現ベクターはバキュロウィルスとすることができる。In one embodiment of the present invention, DNA encoding human tyrosinase is carried on an expression vector suitable for expression in the eukaryotic cell type of interest6 For example, for mammalian cells the expression vector can be a retrovirus. For insect cells, the expression vector can be a baculovirus.

生物学的に活性なヒトチロシナーゼをコードする任意の核酸を本発明に使用する こともできる。１つのこのようなりＮＡは、図１に示したヌクレオチド５８から ヌクレオチド１５９３に広がる配列（ＢＢＴＹ−１）を有するＤＮＡである。Any nucleic acid encoding biologically active human tyrosinase finds use in the present invention You can also do that. One such NA is from nucleotide 58 shown in Figure 1. This is a DNA with a sequence (BBTY-1) spanning nucleotide 1593.

発現ベクターを構築する方法は当分野においては公知である（４３）。かかる方 法を使用し、生物学的に活性なヒトチロシナーゼをコードするＤＮＡを、適当な 調節物質配列の制御下の適当な発現ベクター中に挿入する。次いで得られたベク ターを、当分野においては公知の方法（４３）を再度使用し、生物学的に活性な ヒトチロシナーゼを構成的に発現する非メラノサイト真核細胞を得るのに適した 条件下で適当な真核細胞中に導入する。Methods for constructing expression vectors are known in the art (43). Those who need it Using a method, DNA encoding biologically active human tyrosinase is isolated from a suitable into a suitable expression vector under the control of regulatory sequences. Then the obtained vector The tar was purified again using methods known in the art (43) to determine the biologically active Suitable for obtaining non-melanocytic eukaryotic cells constitutively expressing human tyrosinase into appropriate eukaryotic cells under conditions.

例えば、非メラノサイト真核細胞は、マウスまたはヒトの線維芽細胞のような哺 乳動物の細胞とすることができ、レトロウィルス発現ベクター、例えばＳＶ４０ の上流領域のプロモーター及びエンハンサ−配列と、ヒトチロシナーゼをコード するＤＮＡの直ぐ上流にある開始コドンと、ヒトチロシナーゼをコードするＤＮ Ａの直ぐ下流にある終結コドンとを含む発現ベクターを含むことができる。For example, non-melanocytic eukaryotic cells include mammalian cells such as mouse or human fibroblasts. can be mammalian cells, and retroviral expression vectors, such as SV40 The promoter and enhancer sequences of the upstream region of The start codon immediately upstream of the DNA that encodes human tyrosinase and the DNA that encodes human tyrosinase. and a termination codon immediately downstream of A.

或いは、非メラノサイト真核細胞は昆虫細胞とすることができ、バキュロウィル ス発現ベクター、例えば、ポリヒドリンプロモーターの発現制御下に生物学的に 活性なヒトチロシナーゼをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを含むことがで きる。Alternatively, the non-melanocytic eukaryotic cell can be an insect cell, and the baculovirus expression vector, e.g., biologically under the expression control of a polyhydrin promoter. can contain an expression vector containing DNA encoding active human tyrosinase. Wear.

更に別の態様としては、非メラノサイト真核細胞は酵母細胞とすることができ、 発現プラスミド、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼイソ酵素Ｉ（ＡＤＨＴ） 、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、抑制酸性ホスファター ゼ（ＰＨ０５）プロモーター及びα因子１０モーターのごとき適当なプロモータ ー（及びシグナル配列）の発現制御下に生物学的に活性なヒトチロシナーゼをコ ードするＤＮＡを含む発現プラスミドを含むことができる。In yet another embodiment, the non-melanocytic eukaryotic cell can be a yeast cell; Expression plasmids, e.g. alcohol dehydrogenase isoenzyme I (ADHT) , phosphoglycerol kinase (PGK) promoter, repressible acid phosphater (PH05) promoter and a suitable promoter such as the alpha factor 10 motor. biologically active human tyrosinase under the expression control of the protein (and signal sequence). can include an expression plasmid containing DNA encoding the expression.

本発明の好ましい実施態様においては、生物学的に活性なヒトチロシナーゼを構 成的に産生ずる非メラノサイト真核細胞はメラニンを産生ずる。In a preferred embodiment of the invention, biologically active human tyrosinase is Non-melanocytic eukaryotic cells produce melanin.

更に本発明は、生物学的に活性なヒトチロシナーゼを生産する方法であって、− 上述の細胞を、細胞が生物学的に活性なヒトチロシナーゼを発現するような条件 下に培養し、このように発現されたヒトチロシナーゼを回収することからなる方 法をも提供する。Furthermore, the present invention provides a method for producing biologically active human tyrosinase, comprising: The cells described above were subjected to conditions such that the cells express biologically active human tyrosinase. A method consisting of culturing the human tyrosinase expressed in this way and recovering the human tyrosinase expressed in this way It also provides law.

細胞を培養する条件及び生物学的に活性なヒトチロシナーゼを回収する条件は当 分野においては公知であり、真核細胞、（もしあれば）発現ベクターなどの特性 に応じて変化する。The conditions for culturing cells and for recovering biologically active human tyrosinase are Characteristics of eukaryotic cells, expression vectors (if any), etc. that are known in the art; It changes depending on.

更に本発明は、生物学的に活性なヒトチロシナーゼを生産する方法であって、上 述の細胞を、細胞が生物学的に活性なヒトチロシナーゼを発現するような条件下 に培養し、このように発現されたヒトチロシナーゼを回収することからなる方法 をも提供する。Furthermore, the present invention provides a method for producing biologically active human tyrosinase, comprising: The cells described above were incubated under conditions such that the cells express biologically active human tyrosinase. and recovering the human tyrosinase thus expressed. We also provide

更に本発明は、メラニンを生産する方法であって、真核細胞を、細胞が生物学的 に活性なヒトチロシナーゼを発現し、このように発現されたチロシナーゼがメラ ニンの産生を触媒するような条件下に培養し、このように産生されたメラニンを 回収することからなる方法をも提供する。Furthermore, the present invention provides a method for producing melanin in which eukaryotic cells are The tyrosinase expressed in this way is expressed in the melanoma. The melanin produced in this way is cultured under conditions that catalyze the production of melanin. A method is also provided comprising collecting.

以下、実験の詳細のセクションにおいて本発明を説明する。このセクションは本 発明の理解を助けるためのものであって、後述する請求の範囲に記載される本発 明を全く制限するものではなく、またそう解釈されるべきではない。The invention is described below in the experimental details section. This section is This is intended to assist in understanding the invention, and is intended to assist in understanding the invention. in no way limit the scope of the invention, nor should it be construed as such.

メラノーマ細胞系は前述のように確立した（２）。トランスフェクションの実験 にはＴＫ−Ｌ９２９細胞（マウス線維芽細胞）（３）を使用した。細胞系は、イ ーグル最少必須培地に２ＩＩＭのグルタミンと、０．１ｍＭの非必須アミノ酸と 、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと、０．１Ｂ／ｍｌのストレプトマイシンと、１ ０％のウシ胎児血清とを加えた培地（完全培地）中に維持した。細胞をトリプシ ン（１ｍｇ／ｍｌ　）及びＥＤＴ＾（０，２Ｂ／ｍｌ）と共に通した。総ての培 養物を規則的に検査してマイコプラズマの存在を調べ、汚染された培養物を廃棄 した。Melanoma cell lines were established as previously described (2). Transfection experiments TK-L929 cells (mouse fibroblasts) (3) were used. The cell line is - Glu minimal essential medium with 2IIM glutamine and 0.1mM non-essential amino acids. , 100 U/ml penicillin, 0.1 B/ml streptomycin, 1 They were maintained in medium supplemented with 0% fetal bovine serum (complete medium). trypsy the cells (1 mg/ml) and EDT^ (0.2 B/ml). all cultivation Regularly test feed for the presence of mycoplasma and discard contaminated cultures did.

ｍ旌鷹 細胞ペレットをカルノフスキー固定液で一晩固定し、ＰＢＳで１時間濯ぎ、次い で１％四酸化オスミウム−ＰＢＳｊ容液で１時間にわたり後固定した。細胞ペレ ・ントをグレートイ寸キ（ｇｒａｄｅｄ　）エチルアルコール及び酸化プロピレ ンで８次脱水し、Ｍａｒａｇｌａｓ−Ｄ、Ｅ、８．７３２エポキシ樹脂（ＤＯＷ 　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、、Ｍｉｄｌａｎｄ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）で包埋した。m jung hawk Cell pellets were fixed with Karnofsky's fixative overnight, rinsed with PBS for 1 hour, and then The cells were post-fixed in 1% osmium tetroxide-PBSj for 1 hour. cell pele ・Graded ethyl alcohol and propylene oxide Maraglas-D, E, 8.732 epoxy resin (DOW Chemical Co., Midland, Michigan).

配向のためζこ、厚さ１μｍのセクションをホウ酸塩緩衝１％トルイジンブル− で染色した。薄いセクションを酢酸ウラニル及びクエン酸ｉＱで順次染色し、Ｐ ｈ１ｌｉｐｓ　４１０　ＬＳ電子麗微鏡で検査した。For orientation, 1 μm thick sections were coated with borate-buffered 1% toluidine blue. It was stained with Thin sections were sequentially stained with uranyl acetate and iQ citrate, and P Inspection was performed using a h1lips 410 LS electronic microscope.

ｃＤＮ＾−イブ−１−びスクリーニングｃＤＮ＾ライブラリーを、ヒト有色性（ ｍｅｌａｎｏｔｉｃ）メラノーマ細胞系ＳＫ−ＭＥＬ４’ｌｌ　（２）から製造 したポリ（＾＋）選択ｍＲＮ＾（４）を３１１ｇ用いて形成した。完全な長さの ｃＤＮ八を合成し、フレノウ酵素を用いてプラントエンド化し、尾部（こＥｃｏ ＲＩリンカ−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ、、Ｂｅｖｅ ｒｌｙ、Ｈ八）　（５）を付けた。次いでこのｃＤＮ＾を旧ｔｒｏｇｅｌ＾ｃａ 　３４（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅ＋＊１ｃａｌｓ、Ｐｉｓｃａｔａ ｗａｙ、ＮＪ）　（６）でサイズフラクションにかけた。８００ｂｐより大きい ｃＤＮ＾分子を用いてラムダファージベクターｇｔｌｏ　（７）中３ｘｌＯ’の 組換え体のライグラｌノーを構築した。スクリーニングには、ヒトチロシナーゼ 基づ（５０塩基オリゴヌクレオチドプローブ（５０−ｍｅｒ、下に示す）を使用 した： 、、、、、、、、、、、１０．、　、、、、、．２０．、、、、、、．３０．、 、、、、　、．４０．、、　、　、、、．５０゜５會ＧＴＴＣＴＴＡＧＡＧＧＡ ＧＡＣＡＣＡＧＧＣ”コ（’ＣＴＡＧＧＧＪ−≦ＦｉＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＧＧ λＧＧＴＣＴＧＧＡ３　’前記オリゴヌクレオチドは＾ｐｐｌｉｅｃｉ　Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍ　ＤＮ＾シンセサイザー、モデル３１０＾（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍ、　ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、Ｃ＾）で合成した。このプローブを ガンマ”Ｐ−八ＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（４）で末端標１１（ｅ ｎｄ−１ａｂｅｌｅｄ）　した。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイ ゼーションをそれぞれ、６ｘＮＥＴ（１ｘＮＥＴは０．１５ＭＮａＣ１，１ｍＭ 　ＥＤＴ＾及び１５１１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐｉ（８）　、０．１％ＳＤＳ及び ５　ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（０，１％ＢＳ＾、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ　４０ ０．０．１％ポリビニルピロリドン）及び１００μｇ／１１の変性サケ***１） Ｎ＾中で４時間及び１８時間にわたり４８℃で行った。２つ組のフィルターを６ ｘＮＥＴ、０，１％ＳＤＳで室温で洗浄し、その後５５℃及び６０℃でストリン ジェント洗浄した０次いでこれらのフィルターを一７０℃で４時間オートラジオ グラフィーにかけた。The cDN^-ib-1- and screening cDN^ libraries were converted into human chromogenic ( melanotic) produced from melanoma cell line SK-MEL4'll (2) was formed using 311 g of poly(^+) selected mRN^(4). full length Synthesize cDN8, convert it to plant-end using Flenow enzyme, and make the tail (Eco RI linker (New England Biolabs, Inc., Beve rly, H8) (5) was added. Next, convert this cDN^ to the old trogel^ca 34 (PharmaciaFine Che+*1 cals, Piscata way, NJ) (6) for size fractionation. greater than 800bp of 3xlO' in the lambda phage vector gtlo (7) using cDN^ molecules. A recombinant Lygra lino was constructed. For screening, human tyrosinase (using a 50-base oligonucleotide probe (50-mer, shown below) did: , , , , , , , , 10. , , , , , . 20. ,,,,,,. 30. , ,,,,,,. 40. ,,,,,,,. 50°5 meeting GTTCTTAGAGGA GACACAGGC"ko('CTAGGGJ-≦FiAATGGCCAGCGG λGGTCTGGA3'The oligonucleotide is ^pplieci Bio system DN^Synthesizer, model 310^(^pplied Bi ossystem, Foster City, C^). This probe Gamma” P-8 TP and T4 polynucleotide kinase (4) with end mark 11 (e nd-labeled). Prehybridization and hybridization 6xNET (1xNET is 0.15M NaCl, 1mM EDT^ and 1511M Tris-HCl, pi(8), 0.1% SDS and 5 x Denhardt solution (0.1% BS^, 0.1% Ficoll 40 0.0.1% polyvinylpyrrolidone) and 100 μg/11 modified salmon sperm 1) It was carried out at 48° C. for 4 and 18 hours in N^. 6 sets of 2 filters xNET, washed with 0.1% SDS at room temperature, then strung at 55°C and 60°C. Gent-washed filters were then autoradiated at -70°C for 4 hours. I applied it to the graph.

■部１進１ プラーク精製ファージＤＮＡをＥｃｏＲＩで制限し、ｃＤＮ＾挿入物をプラスミ ドベクターｐｃ０１８（８）中にサブクローンした。■Part 1 1 Plaque-purified phage DNA was restricted with EcoRI and cDNA inserts were added to plasmids. subcloned into vector pc018(8).

その後、エキソヌクレアーゼ［１／ヤエナリヌクレアーゼ（９）での消化によっ て得た組換えプラスミド及び欠失サブクローンを、ジデオキシヌクレオチド原終 結方法（１ｏ）で配列決定した。Afterwards, it was digested with exonuclease [1/Japanese nuclease (9)]. The recombinant plasmid and deletion subclone obtained by The sequence was determined using the ligation method (1o).

ノー　ンブロ・・ト ポリ（＾＋）−ｍＲＮ＾（４□）を、Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ膜（Ｄ ｕｐｏｎｔ。No bro... Poly(^+)-mRN^(4□) was coated with Gene 5clean Plus film (D upont.

Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍ＾）のトランスフ ァージた１％ホルムアルデヒド変性アガロースゲル（４）でフラクションに分け 、３２ｐ標識したｃＤＮ＾プローブにハイブリダイズした。’：）４１Ｌｙター を２ｘＳＳＣ（１ｘｓｓｃハ０．１５８　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナト リウム、ｐ［１７）　及び１ＸＳＤＳ中室温で２回洗浄し、次いでストリンジェ ント洗浄を５５℃、１　ｘ　５ＳＣ１１％ＳＤＳ及ヒ６５°Ｃ１０，１ｘＳＳＣ １１％　ＳＤＳテ各／Ｚ　１５分間行ツタ。New England Nuclear, Boston, M^) transfer Divided into fractions using a 1% formaldehyde-denatured agarose gel (4). , hybridized to a 32p-labeled cDN^ probe. ':)41Lyter 2xSSC (1xSSC) 0.158 NaCl, 0.015M sodium citrate Rium, p[17) and washed twice at room temperature in 1X SDS, then stringer Wash at 55°C, 1x 5SC 11% SDS and 65°C 10, 1x SSC. 11% SDS Te each/Z 15 minute row ivy.

トランスフェクションの ｃＤＮＡ挿入物を、発現ベク９−　ｐｃＥＸＶ−３、即ちＳＶ４０初期領域プロ モーター及びエンハンサ−配列（１１）のＭＩＩＪ下でｃＤＮＡを発現させる発 現ベクターのＥｃｏＲＩ部位にサブクローンした。ｃＤＮＡ挿入物を反対の向き （５’　−３’又は３′−５°）で含む発現プラスミドが形成された。互いに逆 の向きを有する（ｓｅｎｓｅ　ａｎｄ　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｏｒｉｅｎｔｅｄ ）プラスミドをそれぞれｐｃＴＹＲ及びｐｃＴＹ−と名付けた。Ｌ９２９細胞を 下記の組合わせで、リン酸カルシウム沈澱方法（１２）により同時トラン〉　ス フェクションにかけた＋（１）ｐｃ０１８、ｐＳＶＺ臣プラスミド及びＬ９２９ 細胞由来の高分子量キャリヤーＯＮ＾を用いるトランスフェクション；　（２） 　ｐｃＴＹＲ，ｐＳＶ２　ｎｅｏプラスミド及びＬ９２９細胞由来の高分子量キ ャリヤーＤＮＡを用いるトランスフェクション；又は（３）　ｐｃＴＹＲ，ｐＳ Ｖ２　ｎｅｏプラスミド及びＬ９２９細胞由来の高分子量キャリヤーＤＨへを用 いるトランスフェクション。of transfection The cDNA insert was inserted into the expression vector 9-pcEXV-3, SV40 early region protein. Expression of cDNA under MIIJ of motor and enhancer sequences (11) It was subcloned into the EcoRI site of the current vector. Reverse the cDNA insert (5'-3' or 3'-5°) expression plasmids were formed. opposite of each other sense and antisense oriented ) The plasmids were named pcTYR and pcTY-, respectively. L929 cells Simultaneous trans-transfer using the calcium phosphate precipitation method (12) in the following combination: (1) pc018, pSVZ gene plasmid and L929 Transfection using cell-derived high molecular weight carrier ON^; (2) pcTYR, pSV2 neo plasmid and high molecular weight kit derived from L929 cells Transfection using carrier DNA; or (3) pcTYR, pS V2 neo plasmid and L929 cell-derived high molecular weight carrier DH transfection.

トランスフェクションした細胞（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ　）の選択は、Ｉｍ ｇ／ｍｌの抗生物質Ｇ４１８（Ｓｉｇｖａ　Ｃｈｅａ＋１ｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ 、Ｌｏｕｉｓ。Selection of transfectant cells was performed using Im g/ml of antibiotic G418 (Sigva Chea+1 cal Co, St , Louis.

ＭＯ）でトランスフェクションしてから３日目に開始した。MO) was started on day 3 after transfection.

Ｇ４１８を含む完全培地を３日毎に交換し、１０〜１４日目に発日月たコロニー をクローニングリングを用いて単離し且つ増殖させた。トランスフェクションし た細胞系がマウス由来であることを、ト１００−５Ｒ２８を用いる陽性抗マウス Ｉｇ混合血球吸着アッセイと、）Ｉ−２ＫＫ（マウスＭＨＣクラスＩ抗原）に対 するモノクローナル抗体（１３）と、実質的に総てのしトメラノーマ細胞を認識 するがＬ９２９細胞は認識しないｍＡｂＭ３６８　（１４）又は＾Ｊ２（１５） に対する反応性の欠如とによって確認した。Complete medium containing G418 was replaced every 3 days, and colonies that appeared on days 10 to 14 were isolated and propagated using cloning rings. transfection The mouse cell line was confirmed to be of mouse origin by positive anti-mouse testing using To100-5R28. Ig mixed hemocyte adsorption assay and ) I-2KK (mouse MHC class I antigen) A monoclonal antibody (13) that recognizes virtually all melanoma cells. However, mAb M368 (14) or ^J2 (15) does not recognize L929 cells. This was confirmed by the lack of reactivity to

血′　：ン　びアッセイ ＣＦ２１　（ＩＦＩＧｌ　）及びＴ＾９９　（Ｉｇ（：２ａ　）は、ヒトメラノ ソームにおける別個の抗原を認識する前述のｍＡｂである（１６）。Blood: and assay CF21 (IFIGl) and T^99 (Ig(:2a)) are human melanosomes. (16), a previously described mAb that recognizes distinct antigens in somesomes.

モノクローナル抗体２に１０　（ＩｇＧ２ａ）は色素を有する有色性細胞の７５ ｋＤ細胞内糖タンパク質を認識する（１７）。ｍＡｂＡＪ２　（ＩｇＧ１　＞は ヒトＶＬΔ／インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ　）分子（１５，１８）のベータ サブユニットを認識する。ウサギ抗チロシナーゼ抗血清は精製マウスチロシナー ゼ（１つ）での免疫によって発生させた。チロシナーゼは、ＤＥＡＥイオン交換 クロマトグラフィーを行い次いでポリアクリルアミドゲル電気泳動を逐次断続的 に行うことによって精製した。Monoclonal antibody 2 to 10 (IgG2a) is a pigmented cell with 75 kD intracellular glycoprotein (17). mAbAJ2 (IgG1> is Beta of human VLΔ/integrin molecules (15, 18) Recognize subunits. Rabbit anti-tyrosinase antiserum is purified mouse tyrosinase was generated by immunization with (one). Tyrosinase is DEAE ion exchange Chromatography followed by polyacrylamide gel electrophoresis intermittently It was purified by

抗マウスイムノグロブリン血球吸着アッセイ及び間接的イムノフルオレサンス検 査は説明通りに行った（１２０）。Anti-mouse immunoglobulin hemocyte adsorption assay and indirect immunofluorescence test The examination was performed as described (120).

Ｌ交孟身 細胞を、２％透析ＦＢＳを含むメチオニン無含有完全培地中で１６時間にわたり ）５Ｓ−メチオニン（ＴＣＮ　Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ。L cross body Cells were grown in methionine-free complete medium containing 2% dialyzed FBS for 16 hours. ) 5S-Methionine (TCN Radiochemicals.

Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）で標識し、５０−トリス、５ｍＭ　ＥＤＴΔ、０５％ＮＰ ４０．１ｍＭ　ＰＭＳＦ中で溶解しな、溶解物を５ｕｇ／ｍｌのプロティンＡセ ファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）により４℃ で３０分ロインキュベートすることによって２回予清澄化処理（ｐｒｅｅｌｅａ ｒｅｃｌ）　した９細胞溶解物を抗体と共にインキュベートし次いでプロティン Ａセファロースを加えることにより免疫沈降を行った。免疫沈降物を十分に洗浄 し、還元条件下でＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２１）により分子 サイズ分析にかけた。Irvine, CA), 50-Tris, 5mM EDTΔ, 05% NP Do not lyse in 40.1mM PMSF. 4°C with phallose (Pharmacia Fine Chemicals) Preclarification was performed twice by incubating for 30 min at 9 cell lysates were incubated with antibody and then protein Immunoprecipitation was performed by adding A Sepharose. Thoroughly wash the immunoprecipitate The molecules were then analyzed by SDS/polyacrylamide gel electrophoresis (21) under reducing conditions. Submitted for size analysis.

ロシナーゼゞ　びメラニン 細胞をＰＩ３５．１％ＮＰ４０．　ｐＨ６，８中に溶解し、遠心分離にかけて透 明な上清を得た。ｐＯｍ６ｒａｎｔｚの方法（２２）を改変したものを用いてチ ロシンヒドロキシラーゼ活性をアッセイした。反応混合物はＰＢＳ中１１Ｃｉ／ ｍｌ’Ｈ−チロシン（５４，２Ｃｉ／ｍＭｏ１）と、１％ＮＰ４０と、０．１ｍ Ｍ　Ｌ−チロシンと、　０．１＋＊Ｍ　Ｌ−ＤＯＰＡとを含んでいた。反応は、 ３７℃で１時間生起させ、０２ｍ１のチャーコール懸濁液（０，ＩＮクエン酸中 １０Ｏｎ＋ｇ／＋＊Ｉ　）を加えることによって停止させた。水上に３０分おい た後、試料を遠心分離にかけ、１つのアリコートをＢｅｃｋｍａｎ　ＬＳ　９０ ００シンチレーシヨンカウンターで計数した。アッセイは総て２組ずつ行った。Rosinase and melanin Cells were grown in PI35.1%NP40. Dissolve in pH 6, 8 and centrifuge to clear A clear supernatant was obtained. Test using a modified version of pOm6rantz's method (22). Rosine hydroxylase activity was assayed. The reaction mixture was 11Ci/ ml'H-tyrosine (54,2Ci/mMo1), 1% NP40, 0.1 m It contained M L-tyrosine and 0.1+*M L-DOPA. The reaction is Incubate for 1 hour at 37°C and add 0.2 ml of charcoal suspension (0.01 in citric acid). It was stopped by adding 10On+g/+*I). Stay on the water for 30 minutes After the sample was centrifuged, one aliquot was placed in a Beckman LS 90 Counting was performed using a 00 scintillation counter. All assays were performed in duplicate.

対照はヒト腎臓癌細胞系５Ｋ−ＲＣ−７由来の細胞溶解物中で測定された３■２ ０放出物（ｒｅｌｅａｓｅ）と＋　ＰＢＳ、１％ＮＰ４０中反応混合物とだけを 含んでいた。特異的￥ロシナーゼ活性は次のように計算した：［（テスト細胞溶 解物による’Ｈ２０放出物）−（ＰＢＳ中の対照反応混合物による３Ｈ２０放出 物）　。Ｐｒｏｔａｉｎ　Ａｓ５ａｙ　Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ。Controls were determined in cell lysates from the human kidney cancer cell line 5K-RC-7. 0 release and + reaction mixture in PBS, 1% NP40. It contained. Specific ¥rosinase activity was calculated as follows: [(Test cell lysate 'H20 release by lysate) - (3H20 release by control reaction mixture in PBS) thing) . Protein As5ay Kit (Bio-Rad Labora tories.

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃ＾）を用いてＢｒａｄｆｏｒの染料結合法によりタンパク 質濃度を測定した６メラニンのアッセイでは、３ｘｌＯ６の細胞を０．５ｍｌ　 Ｐｒｏｔｏｓｏｌ　（ＮＥＮ、ＤｕＰｏｎｔ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍ＾）に溶解し、 氷上に２時間維持した。吸収ベースラインをＰｒｏｔｏｓｏｌを用いて確立し、 細胞抽出物の吸収スペクトルを３２０〜４５０ｎｍで測定して、Ｐｒｏｔｏｓｏ 　ｌ中１００μｇ／ｎｌのメラニン対照と比較した。Proteins were conjugated by Bradfor's dye-binding method using For the assay of 6 melanin, which measured the quality concentration, 0.5 ml of 3xlO6 cells Dissolved in Protosol (NEN, DuPont, Boston, M^), Keep on ice for 2 hours. Establishing an absorption baseline using Protosol; Absorption spectra of cell extracts were measured at 320-450 nm and Protoso compared to a melanin control of 100 μg/nl in l.

■ ｃＤＮＡクローンＢＢＴＹ−１の゛　び着色（有色）ヒトメラノーマ細胞系ＳＫ −ＭＥＬ−１９（材料及び方法の項参照）に由来するλｇｔｌｏライブラリーか らｃＤＮＡクローンを単離した。１０５個の組換ＣＤＮＡクローンをスクリーニ ングし、４個の反応性クローンをプラーク精製した。４個のｃＤＮＡインサート をプラスミドベクターｐＵｃ１８にサブクローニングし、クローンをｐＢＢＴＹ −１，−２、−３及び−４と命名した。各々２ｋｂのｃＤＮＡインサートを含む ２個のクローンｐＢＢＴＹ−１及びｐＢＢＴＹ−２は、相互に同一であり且っＫ ｗｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１）により報告されている（Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＨｐａＩ 　Ｉ、ＭｓｐＩ、ＮｃｏＩ４　ＰｖｕＩ　Ｉ及びＴａｑ　Ｉで消化した）Ｐｍｅ 　ｌ　３４の制限地図と同一の制限地図を有していた。クローンｐＢＢＴＹ−３ 及びｐＢＢＴＹ−４のｃＤＮＡインサートは夫々１．７ｋｂ及び１．８ｂｋであ った。ｐＢＢＴＹ−３の制限地図は９６０位＜ＰｖｕＴｒ＃Ｉ＠部位）の下流で ｐＢＢＴＹ−１及びｐＢＢＴＹ−２の制限地図と相違していた。その後、ｐＢＢ ＴＹ−１を配列分析し、これを使用して更に実験した。■ cDNA clone BBTY-1 and colored human melanoma cell line SK -λgtlo library derived from MEL-19 (see Materials and Methods) cDNA clones were isolated. Screened 105 recombinant cDNA clones and four reactive clones were plaque purified. 4 cDNA inserts was subcloned into plasmid vector pUc18, and the clone was called pBBTY. They were named -1, -2, -3 and -4. Each contains a 2kb cDNA insert. The two clones pBBTY-1 and pBBTY-2 are identical to each other and K reported by Won et al. (1) (Bgl I I-Hpa I I, MspI, NcoI4 (digested with PvuI I and Taq I) Pme It had the same restriction map as 34. Clone pBBTY-3 and pBBTY-4 cDNA inserts are 1.7 kb and 1.8 bk, respectively. It was. The restriction map of pBBTY-3 is downstream of position 960<PvuTr#I@site). The restriction maps were different from those of pBBTY-1 and pBBTY-2. Then pBB TY-1 was sequenced and used for further experiments.

ＢＢＴＹ−１のヌクレオチド配列（図１）は、６０，３７ｋＤの誘導分子量を有 する５３１アミノ酸＜ａａ）ポリペプチドをコードすることが可能な１５９３個 の残基からなる単一のオーブンリーディングフレームを含んでいた。The nucleotide sequence of BBTY-1 (Figure 1) has a derived molecular weight of 60,37 kD. 531 amino acids < aa) 1593 amino acids capable of encoding a polypeptide It contained a single open reading frame consisting of residues.

１９ａａのリーダーペプチドを一１９位〜−１位に割り当てた（２３）。処理済 みコアタンパク質は５８．１１８ｋＤの分子量を有することが予想された。７個 の潜在的Ｎ−グリコジル化シグナル（Ａｓｎ−Ｘ−３ｅｒ／Ｔｈｒ）が６９．９ ４．１４４．２１３．２７３．３２０及び３５４位に予想された。Ｋｙｔｅ−Ｄ ｏｏｌｉｔｔｌｅ　（２４＞の方法に従う疎水性プロットによると、ａａ４６０ 位と４８０位との間の高疎水性領域の内側にトランスメンブラン領域が予想され た８非定型ポリアデニル化シグナルＡＡＴＴＡＡＡ（２５）を含む３１８塩基３ °非コード領域があった。ＢＢＴＹ−１のヌクレオチド及びａａ配列はＰｍｅ　 １３４　ｃＤＮＡの配列（１）とほぼ同一であった。但し、ＢＢＴＹ−１はＰｍ ｅ　ｌ　３４には存在しない潜在的開始コドンを含む付加的な上流５′配列を含 んでいた（塩基１〜７）。ＢＢＴＹ−１の予想アミノ酸配列には２５〜２８．１ ６２．２９１．３５６〜３６１．３８５．４７８及び５０３〜５１２位にも変異 があった。ＢＢＴＹ−１によりコードされる処理済みタンパク質の予想分子サイ ズはＰｍｅ１３４　（６２，１６ｋＤ）から予想される処理済みタンパク質より も小さかった。この配列分析によると、ＢＢＴＹ−１は完全コード領域を含む全 長ｃＤＮＡクローンの候補であった。A 19 aa leader peptide was assigned to positions -19 to -1 (23). Processed The core protein was predicted to have a molecular weight of 58.118 kD. 7 pieces The potential N-glycosylation signal (Asn-X-3er/Thr) of 69.9 It was predicted to be 4.144.213.273.320 and 354th place. Kyte-D According to the hydrophobicity plot according to the method of oolittle (24), aa460 A transmembrane region is predicted to exist inside the highly hydrophobic region between positions 480 and 480. 318 bases 3 containing 8 atypical polyadenylation signals AATTAAA (25) °There was a non-coding region. The nucleotide and aa sequence of BBTY-1 is Pme The sequence was almost identical to 134 cDNA sequence (1). However, BBTY-1 is Pm Contains additional upstream 5' sequences including a potential start codon not present in e134. (bases 1 to 7). The predicted amino acid sequence of BBTY-1 includes 25-28.1 Also mutated at positions 62.291.356-361.385.478 and 503-512 was there. Predicted molecular size of processed protein encoded by BBTY-1 is from the processed protein predicted from Pme134 (62,16kD). It was also small. According to this sequence analysis, BBTY-1 contains the entire sequence, including the complete coding region. It was a candidate for a long cDNA clone.

ヒトメーノーマ　におけるＢＢＴＹ−１のＢＢＴＹ−１ｃＤＮＡを使用してチロ シナーゼ活性を発現するとして知られているメラノーマ細胞系及び千ロシナーゼ 陰性メラノーマを含むメラノーマ細胞系の集団のノーザンプロット分析でｍＲＮ Ａ転写産物を検出した。検出された最大転写産物は２．４ｋｂであったが、４． ７ｋｂに弱いシグナルが認められた（図２）。ポリ（Ａ゛）−選択ＲＮＡを使用 するノーザンプロット分析によると、３つのメラノーマ群が観察された。即ち（ ａ）チロシナーゼ活性を発現する９個の着色メラノーマにｍＲＮＡが検出された 。（ｂ）５個の非着色チロシナーゼ陰性メラノーマにｍＲＮＡは検出されなかっ た。（Ｃ）３個の非着色チロシナーゼ陰性メラノーマにｍＲＮＡが検出された。Using BBTY-1 cDNA of BBTY-1 in human menoma Melanoma cell lines known to express sinase activity and 1,000 rosinase Northern blot analysis of a population of melanoma cell lines containing negative melanoma A transcript was detected. The largest transcript detected was 2.4 kb, but 4. A weak signal was observed at 7kb (Fig. 2). Using poly(A゛)-selected RNA According to Northern blot analysis, three melanoma groups were observed. That is, ( a) mRNA was detected in 9 pigmented melanomas expressing tyrosinase activity . (b) No mRNA detected in 5 non-pigmented tyrosinase-negative melanomas. Ta. (C) mRNA was detected in three non-pigmented tyrosinase-negative melanomas.

ｍＲＮＡシグナルが検出された群（ｃ）及び（ａ＞の強度はほとんど又は全く差 がなかった。Ｂ細胞リンパ腫細胞系Ｄａｕｄｉ又はＴ細胞白血病ｍ胞系ＨＵＴ− ７８からのｍＲＮＡに転写産物は検出されなかった。There is little or no difference in intensity between groups (c) and (a> where mRNA signals were detected) There was no. B-cell lymphoma cell line Daudi or T-cell leukemia cell line HUT- No transcript was detected in mRNA from 78.

発現ベクターｐｃＥＸＶ−３（１１）を使用してＢＢＴＹ〜１をＬ９２つマウス 繊維芽細胞にトランスフェクトした。ｐｃＴＹＲ（センス配向）でトランスフェ クトしたＬ９２９細胞をＬｐｃＴＹＲと命名した。ｐｃＴＹＷ　（アンチセンス 配向）でトランスフェクトした対照細胞をＬｐｃＴＹＷと命名し、プラスミドｐ Ｕｃ１８でトランスフェクトした対照細胞をＬｐＣと命名した。ＬｐｃＴＹＲ細 胞に色素を含んでいたが、ＬｐｃＴＹＷ、ＬｐＣ又はトランスフェクトしなかっ たＬ９２９，５ｉｌｌ胞に着色は検出されながった１図３に示すように、Ｌｐｃ ＴＹＷ及びＬｐＣ培養物Ｃ非着色ペレットと対照的に、ＬｐｃＴＹＲクローンの 細胞ペレットは濃茶色であった。Expression vector pcEXV-3 (11) was used to generate BBTY~1 in L92 mice. transfected into fibroblasts. Transfection with pcTYR (sense orientation) The isolated L929 cells were named LpcTYR. pcTYW (antisense Control cells transfected with plasmid p Control cells transfected with Uc18 were named LpC. LpcTYR thin cells contained pigment but were not transfected with LpcTYW, LpC or No coloration was detected in L929.5ill cells. As shown in Figure 3, Lpc In contrast to the unpigmented pellets of TYW and LpC cultures, the LpcTYR clone The cell pellet was dark brown.

培養物を集密状態で回収すると、ＬｐｃＴＹＲの細胞ペレットは更に濃く着色さ れていた。ＬｐｃＴＹＲクローンは連続培養で５力月以上にわたって色素を生成 し続けた。When cultures are harvested at confluence, the LpcTYR cell pellet becomes more intensely colored. It was LpcTYR clone produces pigment for over 5 months in continuous culture I continued to do so.

ＬｐｃＴＹＲ中の色素がメラニンの特徴を有することを確認するために、Ｌｐｃ ＴＹＲ及び対照Ｌ９２９細胞がらの細胞抽出物の吸収スペクトルを着色メラノー マ細胞系ＳＫ−ＭＥＬ−１９の抽出物及び精製メラニンの吸収スペクトルに比較 した。ＬｐｃＴＹＲ及びＳＫ−ＭＥＬ−１９抽出物とメラニンは３６０ｎｍから ＞　４５０　ｎ　ｍまでの広い吸収帯を含む同様の吸収パターンを有しており、 この吸収パターンはＬ９２９細胞抽出物では観察されなかった。ＬｐｃＴＹＲ及 びＳＫ−ＭＥＬ−１９の抽出物とメラニン標準Ｃによる吸収パターンはメラニン について従来報告されてぃり　る吸収スペクトル（２６）と同様であった。To confirm that the pigment in LpcTYR has the characteristics of melanin, LpcTYR Absorption spectra of cell extracts from TYR and control L929 cells with colored melanoids. Comparison with the absorption spectra of extract and purified melanin of mama cell line SK-MEL-19 did. LpcTYR and SK-MEL-19 extracts and melanin from 360 nm It has a similar absorption pattern including a broad absorption band up to >450 nm, This absorption pattern was not observed with L929 cell extracts. LpcTYR and The absorption pattern of SK-MEL-19 extract and melanin standard C is that of melanin. The absorption spectrum was similar to that previously reported (26).

は　光学票微鏡検査（図４）によると、ＬｐｃＴＹＲ培養物ス　培養物体を通し て濃い細胞質含有分を含む細胞の小クラスタ一つ　が観察され、これらの細胞の クラスターは常に副次的な培り　養集団を含んでいた。According to optical chart microscopy (Fig. 4), LpcTYR cultures One small cluster of cells with dense cytoplasmic content was observed; Clusters always included subculture populations.

包　組織培地中に浮遊し、恐らくメラニン副生物の細胞増殖抑制又は細胞毒性効 果に関連すると思われる黒い円形の細ｑ　胞が検出されることがあり、これらの 細胞の数は培養が集′　密に達するに従って増加した。Float in the tissue culture medium, probably due to the cytostatic or cytotoxic effects of melanin byproducts. Black circular cells that are thought to be related to fruits may be detected, and these The number of cells increased as the culture reached confluency.

透過型電子ａ微鏡検査の結果、対照ＬｐＣ細胞はそうで１　なかったが、Ｌｐｃ ＴＹＲ細胞はメラニンに一致する電子）　密度の高い物質を含む細胞質膜に結合 した小胞を有することが判明した。ＬｐｃＴＹＲ，Ｉｌ［ｌ胞又はＬｐｃ細胞の 内側にメラノソーム構造成分の形跡はなかった。As a result of transmission electron a microscopy, control LpC cells were not 1, but Lpc TYR cells bind to cytoplasmic membranes containing dense substances (electrons that correspond to melanin) It was found that the vesicles contained LpcTYR, Il [of Lpc cells or Lpc cells] There was no evidence of melanosomal structural components inside.

ＢＢＴＹ−１を　るＬ９２９　にお（ロシ′−二重亙Ａ玉 ＢＢＴＹ−１産物がヒトチロシナーゼであることを確認するために、ＬｐｃＴＹ Ｒ，ＬｐｃＴＹＷ及びＬｐＣのサブクローンのタンパク質抽出物でチロシンヒド ロキシラーゼ活性を測定した。Ｌ　ｐ　ｃ　Ｔ　Ｙ　Ｒの２つのサブクローンで あるＬｐｃＴＹＲ−１及びＬｐｃＴＹＲ−２からの細胞抽出物は着色ヒトメラノ ーマ細胞系ＳＫ−ＭＥＬ−１９でのレベルと同等のチロシナーゼ活性レベルを発 現した（図６）。L929 with BBTY-1 (Rosi'-double A ball) To confirm that the BBTY-1 product is human tyrosinase, LpcTY Tyrosine hydroxide in protein extracts of R, LpcTYW and LpC subclones. Roxylase activity was measured. Two subclones of LpcTYR Cell extracts from certain LpcTYR-1 and LpcTYR-2 cells are pigmented human melanosomes. produced a level of tyrosinase activity equivalent to that in the cell line SK-MEL-19. (Figure 6).

これに対して、ＬｐｃＴＹＷ及びＬｐＣの抽出物は検出可能なチロシナーゼ活性 を含んでいなかった。In contrast, extracts of LpcTYW and LpC have no detectable tyrosinase activity. did not contain.

Ｌ　ｃＴＹＲ’　にお（るメーノソーム　の　のＬｐｃＴＹＲ−２、ＳＫ−ＭＥ Ｌ−１９メラノーマ細胞及び対照し９２９細胞を３５８メチオニンで代謝標識し 、細胞抽出物をウサギ抗チロシナーゼ抗血清又はｍＡｂ　ＴＡ９９（メラノソー ム抗原ｇｐ７５の検出試薬）で免疫沈降させた。更に、同様に着色メラノーマ細 胞により発現される１１Ｉ胞内７５ｋＤ抗原に対するｍＡｂ　２Ｇ１０　（１７ ）を試験した。抗チロシナーゼ抗血清はＬｐｃＴＹＲ−２細胞中に７５ｋＤタン パク質を検出し、ＳＫ−ＭＥＬ−１，９メラノ一マ則胞中に同一サイズのタンパ ク質を検出した（図７）　。ＬｐｃＴＹＲ−２及びＳＫ−ＭＥＬ−１９Ｍ胞にお けるチロシナーゼの分子サイズはグリコジル化チロシナーゼのサイズに対応する 。１９２９Ｍ！Ａ胞には相反して約７５ｋＤに非常に弱いバンドが抗チロシナー ゼ抗血清で検出された。Ｌ９２９細胞にチロシナーゼ活性又はチロシナーゼ転写 産物は検出されず、Ｌ９２９細胞からの***解物はＬｐｃＴＹＲ−２からのチロ シナーゼの免疫沈降を妨げなかったので、これはポリクローナル血清とＬ９２９ 細胞中の非チロシナーゼ分子の交差反応を表すと考えられる。LpcTYR-2, SK-ME of menosome in LcTYR' L-19 melanoma cells and control 929 cells were metabolically labeled with 358 methionine. , cell extracts were combined with rabbit anti-tyrosinase antiserum or mAb TA99 (melanosomes). immunoprecipitation using a detection reagent for the mucin antigen gp75). Furthermore, similarly colored melanoma mAb 2G10 (17 ) was tested. Anti-tyrosinase antiserum produced a 75kD protein in LpcTYR-2 cells. Proteins were detected and proteins of the same size were detected in SK-MEL-1,9 melanoma regulation cells. texture was detected (Figure 7). in LpcTYR-2 and SK-MEL-19M cells. The molecular size of tyrosinase that is used for glycosylation corresponds to that of glycosylated tyrosinase. . 1929M! On the contrary, a very weak band at approximately 75 kD in the A follicle is anti-tyrosiner. Detected with antiserum. Tyrosinase activity or tyrosinase transcription in L929 cells No product was detected, and cold lysates from L929 cells showed tyrolysis from LpcTYR-2. This was compared with polyclonal serum and L929, as it did not interfere with the immunoprecipitation of synase. It is thought to represent a cross-reactivity of non-tyrosinase molecules in the cell.

ＬｐｃＴＹＲ−２抽出物ではｍＡｂ　ＴＡ９９又はｍＡｂ　２Ｇ１０は両者とも メラノーマＳＫ−ＭＥＬ−１９溶解物からの広い７５ｋＤバンドを沈降させたが 、これらの抗体のどちらでも特異的バンドは検出されなかった。これらの結果は 免疫蛍光アッセイにより確認された。ｍＡｂＴＡ９９も２Ｇ１０もＬｐｃＴＹＲ 細胞を染色しなかったが、いずれもＳＫ−ＭＥＬ−１９細胞と反応した（図８） 。In LpcTYR-2 extract, mAb TA99 or mAb 2G10 were both Although a broad 75 kD band from melanoma SK-MEL-19 lysate was precipitated , no specific bands were detected with either of these antibodies. These results are Confirmed by immunofluorescence assay. Both mAbTA99 and 2G10 are LpcTYR. Although cells were not stained, both reacted with SK-MEL-19 cells (Figure 8) .

更に、未知の分子サイズのメラノソーム抗原に対するｍＡｂ　ＣＦ２１はＬｐｃ ＴＹＲと反応しなかったが、ＳＫ−ＭＥＬ−１９を染色した（図８）。従って、 ｍＡｂ　ＴＡ９９、ＣＦ２１及び２Ｇ１０はＢＢＴＹ−１ｃＤＮＡクローンによ りコードされるチロシナーゼと異なる抗原を認識すると考えられる。Furthermore, mAb CF21 against a melanosomal antigen of unknown molecular size is Lpc Although it did not react with TYR, it stained SK-MEL-19 (Fig. 8). Therefore, mAbs TA99, CF21 and 2G10 were derived from the BBTY-1 cDNA clone. It is thought that it recognizes a different antigen than the tyrosinase encoded by

１μ チロシナーゼはモノフェノールの仝−ヒドロキシル化及び９−ジフェノールから ９−キノンへの酸化を触媒する。1μ Tyrosinase converts monophenol from dihydroxylation and 9-diphenol. Catalyzes the oxidation to 9-quinone.

メラノサイト細胞においてチロシナーゼはチロシンをジヒドロキシフェニルアラ ニン（ＤＯＰＡ）に、ＤＯＰＡをドーパキノンに酵素的に転化し、メラニンとし て知られる色素の複合混合物の自発形成を誘導する（２７）。この経路のその後 の段階は十分に特徴付けられていす、触媒因子及び阻害因子双方の多数の他の因 子がメラニン合成を調節し、形成されたメラニン種に影響し得ることが示唆され ている（２８．２９）。色素発現の複雑さは更にマウスの遺伝研究により強調さ れており、５０以上の遺伝子座がコートの色に影響することが認められている。In melanocyte cells, tyrosinase converts tyrosine into dihydroxyphenylara It enzymatically converts DOPA to dopaquinone and produces melanin. (27). After this route Although the step is not well characterized, numerous other factors, both catalytic and inhibitory factors, are involved. It has been suggested that the offspring may regulate melanin synthesis and influence the melanin species formed. (28.29). The complexity of pigment expression is further highlighted by genetic studies in mice. More than 50 genetic loci are known to influence coat color.

従って、はとんど未同定の多数の遺伝子産物がメラニン形成に役割を果たし得る と予想される。Therefore, a large number of largely unidentified gene products may play a role in melanogenesis. It is expected to be.

注目すべきことに、トランスフェクトしたし９２つ繊維芽細胞は安定的にチロシ ナーゼ活性を発現したばかりでなく、メラニンを産生及びパッケージすることが 可能であった。メラニン前駆体は細胞毒性であり、メラノサイト細胞は恐らくメ ラノソームの内側に位置し、毒性中間体の作用から保護するメカニズムを含むこ とが推定された。メラニン前駆体はトランスフェクトしたし９２つ細胞中で細胞 毒性であり、実質的量の色素を産生ずる細胞は次の観察に基づき、死滅すると判 断された。（１）トランスフェクトした細胞のサブ集団のみが着色小胞を含んで いた。（２）トランスフェクトする培養物の上清中に浮遊する濃く着色した非生 存可能細胞が観察された。（３）トランスフェクトした細胞を凍結保存し、その 後融解すると、最初は着色細胞が検出されなかったが、場合によっては培養物に 再現した。Remarkably, transfected 92 fibroblasts were stably tyrosylated. In addition to expressing enzyme activity, it is also capable of producing and packaging melanin. It was possible. Melanin precursors are cytotoxic and melanocyte cells are probably It is located inside the lanosome and contains mechanisms that protect it from the action of toxic intermediates. It was estimated that Melanin precursors were transfected into 92 cells. Cells that are toxic and produce substantial amounts of pigment are determined to die based on the following observations: It was cut off. (1) Only a subpopulation of transfected cells contains colored vesicles. there was. (2) A darkly colored abiotic substance floating in the supernatant of the culture to be transfected. Viable cells were observed. (3) Cryopreserve the transfected cells and After thawing, initially no pigmented cells were detected, but in some cases the cultures Reproduced.

トランスフェクトされたＬ９２９細胞中のヒトチロシナーゼの合成及びプロセッ シングに関しては詳細には分析されていなかった。ヒトチロシナーゼは、ヒトの メラノサイト細胞中で発現される完全にプロセッシングされたチロシナーゼに等 しいサイズの形態にグリコジル化されると考えられる。ヒトチロシナーゼは、Ｌ ９２９中のゴルジ装置によってプロセッシングされ、トランスゴルジ（ｔｒａｎ ｓＧｏｌｇｉ）に運搬されるかまたはトランスゴルジから発生する小胞中に保有 されると推測できる。これらの小胞の性質及び目的（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ） は解明されていない。これらの小胞はメラノソームの前駆体であろうが、メラノ ソームの形成は別の特殊遺伝子の産生物に依存するのであろうという推測に注目 すべきである。Synthesis and processing of human tyrosinase in transfected L929 cells Thing was not analyzed in detail. Human tyrosinase is human fully processed tyrosinase expressed in melanocytic cells. It is thought that the protein is glycosylated to a new size form. Human tyrosinase is L 929 is processed by the Golgi apparatus in the trans-Golgi (trans-Golgi). sGolgi) or carried in vesicles generated from the trans-Golgi It can be assumed that it will be done. Nature and destination of these vesicles has not been elucidated. These vesicles may be precursors of melanosomes; Note the speculation that somesome formation may depend on the products of another specialized gene. Should.

チロシナーゼの発現及び調節は多くの研究の対象となってきたが、チロシナーゼ をコードする遺伝子を形態的に同定することは容易ではなかった（３１参照）。Although the expression and regulation of tyrosinase has been the subject of many studies, tyrosinase It was not easy to morphologically identify the gene encoding this (see 31).

遠縁にあたる２つの異なる遺伝子がマウスチロシナーゼの候補として提示された 。その根拠は、メラノサイト細胞中でこれらの遺伝子のｍＲＮＡが検出されたこ と、及び、そのタンパク質産生物がチロシナーゼに対する抗体との反応性を有し ていたことに基づいていた（３２．３３）。しかしながら、双方の遺伝子につい て、チロシナーゼ活性を有する産生物を直接コードすることは証明されなかった 。推定チロシナーゼｃＤＮＡクローンの産生物を検出するために使用された抗体 が、チロシナーゼと同時に精製された（ｃｏ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）別の遺伝子と 反応したのであろうと考えられる。この状況は、Ｍｕｌｌｅｒ他によるマウスの チロシナーゼ遺伝子の同定によって解明された。彼等は、トランスフェクション アッセイ（３４）において、チロシナーゼ活性の過渡的発現をコードするｃＤＮ Ａクローンｐｍｃ　ｔｙｒ＋を単離した。トランスフェクトされた細胞中では色 素の合成が全く行なわれないことが報告された。その理由は恐らく、アッセイを トランスフェクション後まもなく行なったため、受容細胞が異なる細胞であった ため（無色性メラノーマ及び乳癌細胞系）、または、チロシナーゼ活性のレベル がＢＢＴＹ−１でトランスフェクトされたマウス繊維芽細胞中のレベルよりもは るかに低いように見えるため、などであろう。Two distantly related genes have been proposed as candidates for mouse tyrosinase. . The basis for this is that the mRNA of these genes was detected in melanocyte cells. and the protein product thereof is reactive with antibodies against tyrosinase. (32.33). However, for both genes However, it was not demonstrated that it directly encodes a product with tyrosinase activity. . Antibodies used to detect the products of putative tyrosinase cDNA clones is co-purified with another gene, tyrosinase. It is thought that it was a reaction. This situation is similar to the mouse study by Muller et al. This was elucidated by the identification of the tyrosinase gene. They are transfection In assays (34), cDNAs encoding transient expression of tyrosinase activity A clone pmc tyr+ was isolated. Color in transfected cells It was reported that no elementary synthesis took place. The reason is probably that the assay This was done shortly after transfection, so the recipient cells were different cells. (colorless melanoma and breast cancer cell lines) or the level of tyrosinase activity levels in mouse fibroblasts transfected with BBTY-1. This may be because it appears to be much lower.

Ｐｍｅｌ　３４と命名されたヒトチロシナーゼ遺伝子の候補は、Ｋ　ｗ　ｏ　ｎ 他によって発表されたものである（１）。The human tyrosinase gene candidate named Pmel34 is Kw o n It was published by others (1).

Ｋ　ｗ　ｏ　ｎとその共同研究者等は最近にも、Ｐｍｅｌ　３４を用いて単離し たマウスｃＤＮＡ、即ちＭＴＹ８１１Ｃを発表した。ＭＴＹ８１１Ｃによってコ ードされる遺伝子産生物は、Ｐｍｅｌ　３４によってコードされるタンパク質に ８１％相同であると予測された。ヒトＰｍｅｌ　３４及びマウスＭＴＹ８１１Ｃ は、マウスｐｍｃｔｙｒｌ遺伝子と等価のヒト遺伝子であり、実際、ｐｍｃｔｙ ｒｌクローンは、マウスミエローマ細胞に由来のｃＤＮＡライブラリーをＰｍｅ ｌ　３４　ｃＤＮＡでスクリーニングすることによっても単離された。Ｐｍｅｌ 　３４　ｃＤＮＡクローンは、ハムスターチロシナーゼに感作したポリクローナ ル抗血清によってｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって検出 された。Ｐｍｅｌ　３４は、チロシナーゼ構造遺伝子またはチロシナーゼ発現調 節遺伝子の推定部位であるマウスのｃ−ａｌｂｉｎｏ座に存在することが判明し た。ＢＢＴＹ−１及びＰｍｅｌ　３４のヌクレオチド及び予想ａａ配列は、ＢＢ ＴＹ−１がＰｍｅｌ　３４には存在しない開始コドンを有していることを除いて は極めて類似している。更に、ヌクレオチド及び予想ａａ配列には軽微な違いが ある。これらの違いのうちには、遺伝的多型性または体細胞突然変異（ｃＤＮＡ の単離に使用された細胞型の起源、即ちＢＢＴＹ−１のメラノーマ細胞及びＰｍ ｅｌ　３４のメラノサイトに関連する）を示すものもあると考えられる。ＢＢＴ Ｙ−１とＰｍｅｌ　３４との配列に明確な違いがある場合、ＢＢＴＹ−１の配列 はマウスｐｍ　、ｃ　ｔ　ｙ　ｒ　１チロシナ一ゼ配列に極めて想似しているか または同じである（例えばアミノ酸３５６〜３６１及び３８５）ことに注目する 必要がある。K.W.O.N. and his collaborators have also recently isolated Pmel34. announced the mouse cDNA, namely MTY811C. Coated by MTY811C The encoded gene product is a protein encoded by Pmel34. It was predicted to be 81% homologous. Human Pmel 34 and mouse MTY811C is the human equivalent of the mouse pmctyrl gene, and in fact, pmcty The rl clone is a cDNA library derived from mouse myeloma cells. It was also isolated by screening with l34 cDNA. Pmel 34 The cDNA clone is a polyclonal clone sensitized to hamster tyrosinase. Detection by screening cDNA libraries with antiserum It was done. Pmel 34 is a tyrosinase structural gene or a tyrosinase expression regulator. It was found that it exists in the mouse c-albino locus, which is the predicted site of the node gene. Ta. The nucleotide and predicted aa sequences of BBTY-1 and Pmel34 are BBTY-1 and Pmel34. Except that TY-1 has a start codon that is not present in Pmel34. are very similar. Additionally, there are minor differences in the nucleotide and predicted aa sequences. be. Some of these differences may include genetic polymorphisms or somatic mutations (cDNA The origin of the cell types used for isolation, namely BBTY-1 melanoma cells and Pm It is thought that there are some that show el34 (related to melanocytes). BBT If there is a clear difference between the sequences of Y-1 and Pmel 34, the sequence of BBTY-1 Is it very similar to the mouse pm, ctyr, 1 tyrosinase sequence? or note that they are the same (e.g. amino acids 356-361 and 385) There is a need.

チロシナーゼ遺伝子の多数の転写物（ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ）がマウスミエローマ細胞中で検出されていた（３６）。残りの転写物は、恐ら くはエキソンスキッピングまたは内部スプライス部位の選択によって内部配列の 欠失に導く代替スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ） によって生成される。multiple transcripts of the tyrosinase gene ) was detected in mouse myeloma cells (36). The remaining transcripts are probably or alter internal sequences by exon skipping or selection of internal splice sites. Alternative splicing leading to deletions generated by.

これらの代替転写物は、発現されたときに活性チロシナーゼをコードしていない ことが判明した（３４．３６）。ＢＢＴＹ−１ｃＤＮＡは、マウスｐｍｃｔｙｒ １転写物に対応するヒト転写物である。単離された別のｃＤＮＡクローンＢＢＴ Ｙ−３は、３°制限地図がＢＢＴＹ−１とは異なっており、恐らくは、ヒトチロ シナーゼ遺伝子の代替転写物に対応する。These alternative transcripts do not encode active tyrosinase when expressed It turned out that (34.36). BBTY-1 cDNA is mouse pmctyr 1 transcript. Another isolated cDNA clone BBT Y-3 has a 3° restriction map that is different from BBTY-1, and is probably a human chiropod. Corresponds to an alternative transcript of the synthase gene.

ｍＡｂ　２Ｇ１０．ＴＡ９９及びＣＦ２１によって認識されたメラノソーム／細 胞質抗原に対するチロシナーゼの関係に関して研究者等は、ｍＡｂ　２Ｇ１０が チロシナーゼ活性を免疫欠失させ（３７）、従って恐らくはチロシナーゼ活性を 有する分子を認識すると示唆した。しかしながら、ｍＡｂ　２Ｇ１０は、ＢＢＴ Ｙ−１によってコードされたヒトチロシナーゼと反応せず、このことは、ｍＡｂ ２Ｇ１０が、ＢＢＴＹ−１の遺伝子産生物とは異なる分子を認識することを示唆 する。ＴＡ９９　ｍＡｂは、酸性の７５ｋＤ糖タンパク質を認識しく３８）、Ｔ Ａ９９によって認識される抗原は、メラノソーム中での発現、その分子サイズ及 び電荷に基づいてチロシナーゼの候補であると考えられる。ｍＡｂ　ＴＡ９９及 びＣＦ２１がＬ９２９）ランスフェクタントと反応しなかったという知見は、こ れらの抗体がＢＢＴＹ−１ヒトチロシナ一ゼ分子によってコードされる決定基を 認識しない証拠である。別のデータは、ｍＡｂ　ＴＡ９９がチロシナーゼを認識 しないこと、即ち、（１）ｍＡｂ　ＴＡ９９がメラノーマ細胞抽出物からチロシ ナーゼ活性を沈降させないこと（３９，４０）、（２）ＴＡ９９抗原ｇｐ７５は 通常はチロシナーゼ活性と同時発現されるが、チロシナーゼ活性を発現しないｇ Ｐ７５陽性メラノーマ細胞系の例もいくつかあること、（３）メラノサイト系統 のチロシナーゼ及びｇｐ７５の発現が別々に調節されていること（２０）を示唆 する。mAb 2G10. Melanosomes/cells recognized by TA99 and CF21 Regarding the relationship of tyrosinase to cytoplasmic antigens, researchers found that mAb 2G10 immunodepleted of tyrosinase activity (37) and thus probably inhibits tyrosinase activity. suggested that it recognizes molecules with However, mAb 2G10 did not react with human tyrosinase encoded by Y-1, indicating that the mAb Suggests that 2G10 recognizes a molecule different from the gene product of BBTY-1 do. TA99 mAb recognizes the acidic 75kD glycoprotein38), and T The antigen recognized by A99 depends on its expression in melanosomes, its molecular size and It is considered to be a candidate for tyrosinase based on its charge and charge. mAb TA99 and The finding that L929 and CF21 did not react with the transfectant These antibodies target determinants encoded by the BBTY-1 human tyrosinase molecule. This is proof that they don't recognize it. Other data show that mAb TA99 recognizes tyrosinase. (1) mAb TA99 is not isolated from melanoma cell extract. (2) TA99 antigen gp75 does not precipitate enzyme activity (39,40); Usually co-expressed with tyrosinase activity, but g that does not express tyrosinase activity There are several examples of P75-positive melanoma cell lines; (3) melanocyte lineage; tyrosinase and gp75 expression are separately regulated (20). do.

メラノソーム抗原と反応するモノクローナル抗体の特異性を解明することは、こ れらの分子の認識に役立つ特性を選び出すために重要である。Ｊ　ｉｍｅｎｅｚ 他による最近の報告には、ＢＢＴＹ−１及びＰｍｅｌ　３４に遠縁にあたる第２ 遺伝子（３３）が、マウスのｂ（ｂｒｏｗｎ）座に存在しく４１　＞　、チロシ ナーゼ活性を有する遺伝子産生物をコードすることが示唆されている（４２）。Elucidating the specificity of monoclonal antibodies that react with melanosomal antigens is It is important to select properties that are useful for recognition of these molecules. J imenez Recent reports by others include a second species distantly related to BBTY-1 and Pmel34. Gene (33) is present at the mouse b (brown) locus41>, It has been suggested that it encodes a gene product with enzyme activity (42).

従って、チロシナーゼが、別の遺伝子及び該遺伝子の代替転写物を含む類縁分子 の系統に所属することが次第に明らかになってきた（３２〜３４，３６，４１． ４２）。Therefore, if tyrosinase is associated with another gene and related molecules, including alternative transcripts of that gene, It has gradually become clear that they belong to the lineage (32-34, 36, 41. 42).

Ｌ反力 メラノサイト系統の細胞の票著な特徴は、メラニン色素の合成を触媒するメラノ ソーム酵素チロシナーゼの発現である。ＢＢＴＹ−１と命名されたチロシナーゼ ｃＤＮＡクローンを、有色性のＴＡ９９陽性／ＣＦ　２１陽性メラノーマ細胞系 ＳＫ−ＭＥＬ−１９から構築したライブラリーから単離した。マウス上９２９線 維芽細胞中のＢＢＴＹ−１の発現は、活性チロシナーゼを合成及び発現させるが 、意外にも、メラニンの安定な産生も導く。メラニンは、合成され、トランスフ ェクト線維芽細胞の細胞質中の膜結合小胞内に保有される。ＢＢＴＹ−１は、９ 個の有色性のチロシナーゼ陽性メラノーマ細胞系の全部から２．４ｋｂのｍＲＮ Ａ転写物を検出した。同じサイズのチロシナーゼ転写物′は、無色性のチロシナ ーゼ陰性メラノーマ細胞系のサブセット（の８つのうちの３つ）から検出された 。これは、チロシナーゼ活性の調節には転写後の事象が重要であることを示唆す る。モノクローナル抗体ＴＡ９９及びＣＦ２１によって認識され、メラノソーム 内部に特異的に局在し、チロシナーゼ活性と同時に発現される２つのメラノサイ ト抗原は、ヒトチロシナーゼを発現するトランスフェクトされたマウスの線維芽 細胞と反応しなかった。これは、これらの抗原決定基が、ＢＢＴＹ−１によって コードされるチロシナーゼ分子とは異なるものであるという結論を支持する。L reaction force A distinctive feature of cells of the melanocyte lineage is the melanocytes that catalyze the synthesis of melanin pigment. Expression of the somal enzyme tyrosinase. Tyrosinase named BBTY-1 The cDNA clone was transferred to a colored TA99-positive/CF21-positive melanoma cell line. It was isolated from a library constructed from SK-MEL-19. 929 line on mouse Expression of BBTY-1 in fibroblasts allows synthesis and expression of active tyrosinase. , surprisingly also leads to stable production of melanin. Melanin is synthesized and transformed is retained within membrane-bound vesicles in the cytoplasm of infected fibroblasts. BBTY-1 is 9 2.4 kb mRNA from all pigmented tyrosinase-positive melanoma cell lines. A transcript was detected. A tyrosinase transcript of the same size is a colorless tyrosinase transcript. Detected in a subset (3 out of 8) of -ase-negative melanoma cell lines . This suggests that post-transcriptional events are important in regulating tyrosinase activity. Ru. Recognized by monoclonal antibodies TA99 and CF21, melanosomes Two melanocytes are specifically localized inside and are simultaneously expressed with tyrosinase activity. The antigen was expressed in transfected mouse fibroblasts expressing human tyrosinase. Did not react with cells. This is because these antigenic determinants are expressed by BBTY-1. This supports the conclusion that the encoded tyrosinase molecule is distinct.

下記の文献は明細書中に引用されたものである：Ｌ　Ｋｗｏｎ、Ｂ、Ｓ、、＠ｔ 　ａｌ、、（１９８））　工５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓ＠ｑｕａｎｃ＊　ｏ ｆｃＤＮＡ　ｃｌｏｎ＠ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　ｔｙｒｏｇｉｎａｓａ　ｔｈａｔ 　ｍａｐｓｉ　ａｔ廿１＠　！ｌｌ０ｕｌｉ＠ｃ−ａｌｂｉｎｏ　１ｏｃｕｓ、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、入ｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔｒｓｘ　３１４：　７４７３゜２、 　Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、入、Ｎ、、ａｔ　ａｌ、　（１９８２）　５ｕｒｆａｃａ 　ａｎｔｉｇａｎｓ　ｏｆｉａａｌａｎｏｃｙｔａｓ　ａｎｄ　ｍ＠ｌａｎｏｍ ａ：　ｍａｒｋ＠ｒｓ　ｏｆ　ｍ＋ｅｌａｎｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍａｌａｎｏｍａ　５ｕｂｓａｔｓ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍａｄ、 １５１：１７５５゜ ３、　Ｋｉｔ、Ｓ、、＠ｔ　ａｌ、（）９６３）　Ｄａｌｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔ ｈｙｍｉｄｉｎａ　ｋｉｎａｓａａｃｔｉｖｉｔｙ　ｆｒｏｍ　Ｌ　ｃａｌｌｓ 　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｔｏ　ｂｒｏｍｏｄａｏｘｙｕｒｉｄｉｎａ。The following documents are cited in the specification: L Kwon, B, S, @t al,, (198)) engineering 5olation and s@quant*o fcDNA clone@for human tyroginasa that mapsi at 廿1@! ll0uli@c-albino 1ocus, Proc, Natl, input cad, Sci, trsx 314: 7473°2, Houghton, N., atal, (1982) 5urfaca 　antigans　ofiaalanocytas　and m@lanom a: mark@rs of m+elanocytedifferentia tion and malanoma 5 ubsats, J, Exp, Mad, 151:1755° 3, Kit, S, @t al, ()963) Dation of t hymidina kinasaactivity from L calls Resistant to bromodaoxyuridina.

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工ｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｇ＠ｎａ　Ｔ＠ｃｈｎｏｌｏｇｙ。Engineering to G@na T@chnology.

４４、Ｓｍ１ｔｈ、ａｔ　ａｌ、、υ、５．　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｕｍｂｅｒ　４ ，７４５，０５１．　ｉｓｓｕｅｄＭａｙ　ｌフ、１９１１１ｇ。44, Sm1th, at al,, υ, 5. Patent Number 4 , 745,051. Issued May 19111g.

図１ 図ＩＢ 図ＩＣ Ａｓｐ　ＧＩｕ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ｔｙ　Ｔｒｐ　Ａ ｓｐ　ＴｒｐＱＡＴＧｌｎＡＡＣＴｒＣＡＣＴ　ＡＴｒ　ＣＣＡＴＡＴ　ＴＧＧ ＱＡＣＴＧＧＰｈ＠　Ｐｈｅ　Ｓｉｒ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　ＩＩ＠　Ｖａ ｌ　Ｃｙｓ　！ミｏｒ　Ａｒｇｒｒｃ　ｍｃ　丁ＣＣＴＣＴ　丁ＧＧ　ＣＡＧ　 Ａ丁Ｔ　ＣＴＣＴＧＴ　ＡＧＣＣＱＡＬａｕ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　ＣＪｙ　Ｔｈｒ 　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　ＡｒｇＴｒＡ　ＴＧＣＡＡＴ　Ｇ ＧＡＡＣＧＣＣＣＧＡＧＧＧＡＣＣＴＴｒＡ　ＣＧＧｋｇ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａ ｒｇ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｓｉｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　ＶａｌＡＧＡＡＣＣ ＣＣＡＡＧＧＣＴＣＣＣＣＴＣＴ　ＴＣＡ　ＧＣＴＱＡＴ　ＧＴ＾図ＩＤ Ｖａｌ　ＴｙｒＰｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　１ｌｅＧＴ ｒ　ＴＡＴ　ＣＣＡＱＡＡ　ＧＣＣＡＡＴ　ＧＣＡＣＣＣに汀ｌｉｅ　Ｐｒｏ　 Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　ＧＩＹ　Ａ！ＩＰ　ＰｈｅＡＴＡ　ＣＣＡ　 ＣＴＧ　ＴＡＣＡＧＡ　ＡＡＴ　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＴｒＣ図ＩＥ ４４２　Ｂａｒ　Ｐｈ＠Ｇｌｎ　ＡＩｐＴｙｒ　１ｍ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ 　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ１３８１　ＴＣＴ　ｍ　ＣＡＡ　ＱＡＣＴＡＣＡＴｒ　ＡＡＧ ＴＣＣＴＡＴ　ＴｒＧ　ＱＡＡＧｌｎ　Ａｌａ　ｔａｒ’　Ａｒｇ　ｋ　Ｔｒｐ 　ｔａｒ　Ｔｒｐ　ＬＪＩＪＣＡＡ　ＧＣＧＡＧＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧＴ（Ｊｋ 　ＴＧＧ　ＣＴＣ４ａ２　Ｌａｕ　Ｇｔｙ　Ａｌｍ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　 Ｇｔｙ　んａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ１４４１　σ汀ＱＧＧＧＣＧＧＣＧＡＴ ＧＧＴＡ　ＧＧＧＧＣＣＧＴＣＣＴＣＡＣＴ４ａ２Ｌａｕ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｈ ｌｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｅ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ１５０１　Ｃ ＴＧ　ＴＧＴ　ＣＧＴ　ＣＡＣＡＡＧ　ＡＧＡＡＡＧ　ＣＡＧＣＴｒ　ＣＣＴ　 ＱＡＡＧｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌ＠ｕ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｌ ｙｓＧＡＡ　ＡＡＧ　ＣＡＧＣＣＡＣＴＣＣＴＣＡＴＧ　ＱＡＧＡＡＡ１８６５ 　ＧＴＧＡＡＴｒＡＡＡＧＴＧＣＴＣＴＴＡＴｒＴｒＡＡＡＡＡＡ図２ 図４ 図５（Ａ） 図６ ３Ｈ，Ｏｃｐｍ／ｍ１ｎ 図７ 納＾「×１０３　＄に−ＭＥＬ　１９　ＬｐｃＴＹＲ−２Ｌ　ｃｅｌ１ｇ図８（ Ａ） 賃九課崖 ０　＋１　＋２ 図８（Ｂ） 蛍光強度 ０　＋１　＋２　＋３ 国際調査報告Figure 1 Figure IB Figure IC Asp GIu Asn Phe Thr lie Pro Ty Trp A sp　TrpQATGlnAACTrCACT　ATr　CCATAT　TGG QACTGGPh@　Phe　Sir　Ser　Trp　Gln　II@　Va l　Cys　! Mi or Argrrc mc Ding CCTCT Ding GG CAG AT CTCTGT AGCCQALau Cys Asn CJy Thr Pro Glu Gly Pro Lau ArgTrA TGCAAT G GAACGCCCGAGGGACCTTrA CGGkg Thr Pro A rg Lau Pro Sir Ser Ala Asp ValAGAACC CCAAGGCTCCCCTCT TCA GCTQAT GT^Figure ID Val TyrPro Glu Ala Asn Ala Pro 1leGT r　TAT　CCAQAA　GCCAAT　GCACCC　Pro　 Leu Tyr Arg Asn GIY A! IP PheATA CCA CTG TACAGA AAT GGT GAT TrC diagram IE 442　Bar　Ph@Gln　AIpTyr　1m　Lys　Ser　Tyr Leu Glu1381 TCT m CAA QACTACATr AAG TCCTAT TrG QAAGln Ala tar’ Arg k Trp tar Trp LJIJCAA GCGAGTCGGATCTGGT (Jk TGG CTC4a2 Lau Gty Alm Ala Met Val Gty　na　Val　Leu　Thr1441　σ汀QGGGCGGCGAT GGTA　GGGGCCGTCCTCACT4a2Lau　Cys　Arg　H ls Lys Arg Lye Gln Leu Pro Glu1501C TG TGT CGT CACAAG AGAAAG CAGCTr CCT QAAGlu Lys Gln Pro Leu L@u Met Glu L ysGAA AAG CAGCCACTCCTCCATG QAGAAA1865 　GTGAATrAAAGTGCTCTTTATrTrAAAAAAFigure 2 Figure 4 Figure 5(A) Figure 6 3H, Ocpm/m1n Figure 7 ＾＾”×103＄＄-MEL 19 LpcTYR-2L cel1gFigure 8( A) 9th grade cliff 0 +1 +2 Figure 8(B) Fluorescence intensity 0 +1 +2 +3 international search report

Claims (11)

【特許請求の範囲】[Claims] １．生物学的に活性なヒトチロシナーゼを構成的に発現する非メラノサイト真核 細胞。1. Non-melanocytic eukaryotes that constitutively express biologically active human tyrosinase cell. ２．生物学的に活性なヒトチロシナーゼが、ヒトチロシナーゼをコードするＤＮ Ａを含む発現ベクターから発現されることを特徴とする請求項１に記載の非メラ ノサイト真核細胞。2. Biologically active human tyrosinase is a DN encoding human tyrosinase. A. nocyte eukaryotic cell. ３．真核細胞が酵母細胞であることを特徴とする請求項１に記載の非メラノサイ ト真核細胞。3. 2. The non-melanocytic cell according to claim 1, wherein the eukaryotic cell is a yeast cell. eukaryotic cells. ４．真核細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする請求項１に記載の非メラノサ イト真核細胞。4. The non-melanosa according to claim 1, characterized in that the eukaryotic cell is a mammalian cell. eukaryotic cells. ５．真核細胞が昆虫細胞であることを特徴とする請求項１に記載の非メラノサイ ト真核細胞。5. 2. The non-melanocytic cell according to claim 1, wherein the eukaryotic cell is an insect cell. eukaryotic cells. ６．ヒトチロシナーゼをコードするＤＮＡが、図１に示すヌクレオチド５８から ヌクレオチド１５９３までの配列を有するｃＤＮＡであることを特徴とする請求 項２に記載の非メラノサイト真核細胞。6. The DNA encoding human tyrosinase starts from nucleotide 58 shown in Figure 1. A claim characterized in that it is a cDNA having a sequence up to nucleotide 1593. The non-melanocytic eukaryotic cell according to item 2. ７．真核細胞が哺乳類細胞から成り、発現ベクターが更に、ＳＶ４０初期領域プ ロモーター及びエンハンサー配列と、ヒトチロシナーゼをコードするＤＮＡの直 ぐ上流の開始コドンと、ヒトチロシナーゼをコードするＤＮＡの直ぐ下流の終結 シグナルとを含むことを特徴とする請求項２に記載の非メラノサイト真核細胞。7. The eukaryotic cell comprises a mammalian cell, and the expression vector further comprises an SV40 early region protein. The promoter and enhancer sequences and the direct DNA encoding human tyrosinase. a start codon immediately upstream and a termination codon immediately downstream of the DNA encoding human tyrosinase. The non-melanocytic eukaryotic cell according to claim 2, characterized in that it comprises a signal. ８．真核細胞が昆虫細胞から成り、発現ベクターがバキユロウイルスから成るこ とを特徴とする請求項２に記載の非メラノサイト真核細胞。8. The eukaryotic cells consist of insect cells and the expression vector consists of baculovirus. The non-melanocytic eukaryotic cell according to claim 2, characterized in that: ９．メラニンを産生することを特徴とする請求項１に記載の非メラノサイト真核 細胞。9. The non-melanocyte eukaryote according to claim 1, which produces melanin. cell. １０．細胞が生物学的に活性なヒトチロシナーゼを発現する条件下に請求項１に 記載の細胞を培養し、発現されたヒトチロシナーゼを回収することを特徴とする 生物学的に活性なヒトチロシナーゼの産生方法。10. Claim 1 under conditions in which the cells express biologically active human tyrosinase. The method is characterized by culturing the described cells and collecting the expressed human tyrosinase. A method for producing biologically active human tyrosinase. １１．細胞が生物学的に活性なヒトチロシナーゼを発現し且つ発現されたチロシ ナーゼがメラニンの産生を触媒する条件下に請求項１に記載の細胞を培養し、産 生されたメラニンを回収することを特徴とするメラニンの産生方法。11. The cells express biologically active human tyrosinase and the expressed tyrosinase The cell according to claim 1 is cultured under conditions in which the enzyme catalyzes the production of melanin, and A method for producing melanin, which comprises collecting produced melanin.
JP2507117A 1989-04-26 1990-04-26 Non-melanocytic eukaryotic cells constitutively expressing biologically active human tyrosinase and uses thereof Pending JPH04505249A (en)

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