JPH04504858A - 肝臓特異性インシュリン類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 肝臓特異性インシュリン類似体 発明の背景 本発明は新規なインシュリン類似体およびその糖尿病治療用の医薬組成物におけ る使用に関する。

インシュリンはを椎動物の成長および物質交代を調整する上で重要な役割を果た すホルモンである。インシュリンが無くなると物質交代がひどく混乱し、多セの 細胞がグルコースおよびアミノ酸を正常に使用できなくなる。グルコースを代謝 できなくなると、人間では糖尿病、つまり炭水化物、脂肪およびタンパク質代謝 の異常を来す複雑な慢性物質交代異常を起こす。その最も顕著な臨床的形態では 、糖尿病の特徴はインシュリンまたはインシュリン活性の絶対的または相対的な 不足、およびそれに伴う糖尿、ケトン尿症、成長停止および陰性窒素平衡である 。これらの条件は最終的に、脂肪酸の過剰酸化による急性物質交代性酸性症によ る死、またはケトン体の発生に必要な十分な脂質貯蔵が不足するための衰弱につ ながる。衰弱は、著しい弱体化、極度の体重低下、および長期間のひどい食物不 足から生じる物質交代の低下を特徴とする状態と定義される。上−ランドの図解 医学辞典、第２５版参照。

１９２０年代におけるインシュリンの発見および精製、およびその糖尿病との関 連により、この病気に対処する手段が与えられた。例えばブリス、インシュリン の発見（１９８３）、シカゴ大学出版、シカゴ、イリノイ州、参照。今日、糖尿 病患者に対するインシュリン投与は、この病気を克服するための第一の治療手段 である。

インシュリンは、約６０００ダルトンのポリペプチドであり、ＡおよびＢと呼ば れる２つの短いペプチド鎖が不変ジスルフィドブリッジにより互いに結合してで きている。研究されているほとんどすべてのインシュリンにおいて、２１アミノ 酸長のＡ鎖は、内部ジスルフィドブリッジをも含んでいる。Ｂ鎖は３０アミノ酸 の長さである。多くの成熟核タンパク質と同様に、インシュリンは前駆物質の形 で合成され、それが合成後に処理されて熟成した２ポリペプチド鎖の活性ホルモ ンになる。

インシュリンの直接の前駆物質は、ＢおよびＡ鎖が隣接する塩基性残基の対によ り、Ｃペプチドと呼ばれる約３０アミノ酸の結合ペプチドに結合して構成される 単鎖ポリペプチドである、プロインシュリンである。プロインシュリン分子中の ３個のペプチドの順序は、ＮＨ２−８鎖−＾ｒｇ−Ａｒｇ−Ｃ−ペプチドーＬｙ ｓ−Ａｒｇ−Ａ鎖−〇〇ＯＨである。しかし、インシュリン５ＲＮＡのの翻訳生 成物は、細胞膜を通して運ばれる、または細胞膜中に挿入されるタンパク質の性 格を持つ、ＮＨ２末端に２４アミノ酸の疎水性の大きなシグナルペプチドを含む プロインシュリンであるプレプロインシュリンである。

プレプロインシュリンは、すい臓中に分布したランゲルハンス島内にあるすい臓 ベータ細胞中で合成される。シグナルペプチドの除去は粗内質細網内で起こり、 その結果生じる完全に折れ曲がった酸化されたプロインシュリンがゴルジ体に運 ばれ、分泌顆粒に組み合わされる。折れ曲がったプロインシュリンはジスルフィ ド結合により安定化される。分泌顆粒が熟成する間に、折れ曲がったプロインシ ュリン分子は対になった塩基性残基のところで特異性プロテアーゼにより開裂さ れ、インシュリンとＣ−ペプチドが解放される。

上記の様に、糖尿病の治療では、糖尿病患者に調整量のインシュリンを投与する 。その様に投与されるインシュリンは、大部分が動物、主としてウシおよびブタ のすい臓から得られている。ウシおよびブタのインシュリンはヒトのインシュリ ンと同様にだいたい同じ効力でホルモンの恒常性を維持するが、これらのインシ ュリンは異タンパク質であるために、免疫学的応答を引き出すことがあり、その 有用性が低下する。最近では、組換えＤＮＡ技術により生じたヒトインシュリン が治療用品に加えられている。組換えＤＮＡまたは他の技術により生じたヒトイ ンシュリンを使用することにより、動物インシュリンの使用に見られる様な免疫 学的な問題は生じないと思われる。天然のヒトインシュリンが得られても、この ホルモンを糖尿病患者に投与することにより、正常な物質交代が常に十分に維持 されるわけではない。したがって、より活性の優れた別のインシュリンまたは他 の糖尿病治療手段がめられている。

米国特許０７４．５５８号は、天然のヒトインシュリンよりも活性の強い超活性 ヒトインシュリン、［■０−アスパラギン酸−８１ヒトインシュリンを開示して いる。特に、［ｌＯ−アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリンは、天然インシュ リンよりも４〜５倍強力であることが確認されている。米国特許２７３．９５７ 号および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８８１０２２８９は他の超活性インシュリン類似 体、デス−ペンタペプチド（８２Ｂ−８３０）−［ＡｓｐＢＩＯ、ｙ、Ｂ２５− α−カルボキサミド］ヒトインシュリン、（８２６−８３０）−［ＧｌｕＢｌ’ 　、ＴｙｒＢ２”　−ａ−カルボキサミド］ヒトインシュリン、および他の式デ ス（８２Ｂ−８３０）−［：Ｘ”’　、ＴｙｒＢ２５−α−カルボキサミド］ヒ トインシュリン（式中、ＸはＢ鎖の位置１０で置換した残基である）のインシュ リン類似体を開示している。これらのインシュリン類似体は天然のヒトインシュ リンの１１〜２０倍の効力を有する。上記のインシュリン類似体はすべて天然ヒ トインシュリンのＡおよびＢ鎖に沿ってアミノ酸置換しており、これがその化合 物の効力を高め、あるいはその化合物の他の特性を変化させている。

天然インシュリンおよび公知のインシュリン類似体の、現在のインシュリン配送 経路はどれも正常なすい臓からのインシュリン分泌を真似てはいない。通常、イ ンシュリンは内臓静脈循環系に入り、そのために肝臓は、末梢組織がさらされる 濃度よりも高い濃度にさらされる。標準のインシュリン皮下投与で、プラズマグ ルコース濃度は正常化できるが、グルコースの循環使用、およびタンパク質と脂 質の生産および利用は正常化されないことがある。その上、末梢の脈管組織は通 常より高いインシュリン濃度にさらされる。これらの物質交代異常性の長期的効 果は認められるが、末梢の過インシュリン症がアテローム性動脈硬化症の重大な 危険因子になり得るという明白な証拠がある。

肝臓特異性インシュリン類似体、つまり脂肪組織におけるよりも肝臓においてよ り活性の高いインシュリン類似体には、現在行われているインシュリン治療に対 して幾つかの利点がある。その様な類似体を使用することにより、末梢皮下投与 の際に好ましい肝臓における吸収を行うことができ、それによって肝臓と末梢組 織との間の物質交代平衡により近付けることができる。インシュリンの腹腔内注 射によりこのパターンを真似る試みがなされているが、この技術には、腹腔内に 到達するのが困難であり、腹膜炎を起こす危険性がある、という潜在的な欠点が ある。肝臓特異性インシュリンは、これらの危険性なしに腹腔内インシュリン注 射と同じ効果を発揮する。

発明の概要 新規なインシュリン類似体が合成され、肝臓特異性であることが分かった。これ らのインシュリン類似体は、ＡおよびＢ鎖において一つ以上のアミノ酸を置換し ている。特に、トリプトファンまたは他の大きな疎水性残基をインシュリンポリ ペプチドのＡ１４およびＡ１９位置で置換し、本発明で特許請求する肝臓特異性 インシュリンを調製する。トリプトファンまたは他の大きな疎水性残基をＡ１３ 　、Ａ１５およびＢｌＢ位置で挿入しても肝臓特異性インシュリン類似体が得ら れると考えられる。

また、本発明は、本発明に係わるインシュリン類似体の治療上有効な量を医薬品 に使用できる担体と共に含む、糖尿病治療を必要とする糖尿病患者を治療するた めの医薬組成物にも関する。

さらに、本発明は、インシュリン治療を必要とする糖尿病患者に、本発明に係わ るヒトインシュリン類似体の治療上有効な量を医薬品に使用できる担体と共に投 与することからなる、糖尿病の治療方法にも関する。

図面の簡単な説明 図１は、セレックスーＥカラム（２００−３５０ｍｌ流出液）からの粗製ヒツジ ［Ｔｒｐ１４１Ａ鎖Ｓ−スルホン酸塩の溶離を示すクロマトグラムである。

図２Ａは、ＣＭ−セルロースカラムからの、初期クロマトグラフィー分離におけ る、ヒツジＢ鎖Ｓ−スルホン酸塩とヒツジ［Ｔｒｐ１４１ＡｔＪ［Ｓ−スルホン 酸塩との混合物の溶離を示すクロマトグラムである。

図２Ｂは、図２Ａに示すピークにおける物質の再クロマトグラフィーを示す、逆 相ＨＰＬＣクロマトグラムである（１４０−１８０１流出液）。

図３は、天然インシュリンおよび［Ｔｒｐ１４−Ａ］インシュリンによる、ラッ トの脂肪細胞における脂肪形成の刺激を比較したグラフである。

図４は、グルコース分泌の抑制が天然インシュリンまたは［Ｔｒｐ’−＾］イン シュリンの機能として決定される、ＰＡＯ細胞におけるブドウ糖新生の抑制を比 較するグラフである。

発明の説明 本発明は、アミノ酸＾１〜Ａ２ＬからなるＡ鐘およびアミノ酸８１〜Ｂ３０から なるＢ鎖を有し、Ａ１４アミノ酸が、トリプトファン、ナフチルアラニン　Ｎ７ −ダンシル−ａｌ　γ−ジアミノ酪酸、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、 および他の疎水性アミノ酸からなるグループから選択されたアミノ酸残基により 置換されたインシュリン類似体に関する。

また、本発明は、アミノ酸Ａｌ−Ａ２１からなるＡ鎖およびアミノ酸Ｂ１〜Ｂ３ ０からなるＢ鎖を有し、トリプトファン、ナフチルアラニン　Ｎ７−ダンシル− ａｌ　γ−ジアミノ酪酸、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、および他の疎 水性アミノ酸からなるグループから選択されたアミノ酸残基が、Ａ１３アミノ酸 、Ａ１４アミノ酸、Ａ１５アミノ酸、Ａ１９アミノ酸、８１Ｂアミノ酸、および それらの組合わせからなるグループから選択されたアミノ酸に置換したインシュ リン類似体にも関する。

さらに、本発明は、式 を有するインシュリン類似体、［Ｔｒｐ’−Ａｌインシュリンに関する。

用語インシュリン類似体とは、ヒト（および他の種族の）インシュリンの基本と なるＡおよびＢ鎖構造を有し、天然インシュリンに存在するのと同じ位置で半シ スティン残基のすべてを含むタンパク質のことである。したがって、インシュリ ン類似体は天然インシュリンのジスルフィドブリッジ配置を維持している。有用 なインシュリン類似体は、分子の一方または両方の鎖における一つ以上のアミノ 酸の区別されるが、インシュリン効力の少なくともある部分はデル、Ａｄｖ、　 Ｐｒｏｔ、　Ｃｈｅｒｓ、（１９７２）、第２６巻、３３０−３８２頁参照。

本発明のインシュリン類似体は、Ａ１４およびＡ１９位置で天然のアミノ酸をト リプトファンで置き換えている点で天然インシュリンとは異なり、脂肪組繊にお けるよりも肝臓細胞において高い効力を有することが分かった。また、ナフチル アラニン、Ｎ　−ダンシ５ルーａ１　γ−ジアミノ酪酸、ロイシン、バリン、フ ェニルアラニン、および他の疎水性アミノ酸を、Ａ１３　、Ａｌ５およびＢ１６ 位置で天然のアミノ酸と置き換えたことにより天然インシュリンとは異なるイン シュリン類似体も、脂肪組織におけるよりも肝臓細胞において高い効力を有する と考えられる。

これらのインシュリンの最も重要な特性は、その肝臓特異性であり、それによっ て脂肪組織または抹消組織におけるよりも肝臓においてより活性が高い。例えば 、脂肪組織において、［Ｔｒｐ’−Ａｌインシュリンは天然インシュリンの約６ ０％の効力を示す（脂肪形成評価分析）のに体し、肝臓においては天然インシュ リンの９０％の活性（ブドウ糖新生の抑制に関して）を示す。注意すべきは、イ ンシュリンは抹消組織（すなわち脂肪組織）でグルコースの利用を刺激インシュ リン分子内の＾１４アミノ酸残基を他の大きな残基、例えばナフチルアラニンお よびＮ　−ダンシル−ａｌ　γ−ジアミノ酪酸、または他の疎水性アミノ酸残基 、例えばロイシン、バリンまたはフェニルアラニンで置換することにより、やは り肝臓特異性インシュリン類似体が得られると考えられる。

さらに、トリプトファンまたは他の大きな残基、例えばナフチルアラニンおよび Ｎ　−ダンシル−ａｌ　γ−ジアミノ酪酸、または他の疎水性アミノ酸残基、例 えばロイシン、バリンまたはフェニルアラニンで、インシュリンポリペプチドの Ａ１３　、Ａ１５またはＢＩＢ位置で単一アミノ酸挿入しても、またはインシュ リン分子のＡ１４−Ａ１５　、Ａ１３−Ａｌ４　、Ａ１４−Ａ１９およびＡ１４ −ＢｌＢ位置でアミノ酸を二重挿入しても肝臓特異性インシュリンが得られると 考えられる。さらに、ここに参考として含める、出願者の以前の出願、米国出願 第０７４．５５８および２７３．９５７号により、上記のインシュリン類似体の Ｂ鎖部分はＢＩＯおよびＢ２５位置で変性することができる。これらの置換によ り、肝臓特異性と考えられる超活性インシュリンが得られる。

特許請求するインシュリン類似体は、当業者には公知の各種の技術により製造す ることができる。例えば、インシュリン類似体の成分ＡおよびＢ鎖は、固相ペプ チド合成技術および溶液技術、例えば断片縮合を始めとする公知のペプチド合成 のいずれかにより合成できる。例えば、ペプチド合成技術の考察に関しては、エ リクソンおよびメリフィールド、タンパク質（１９７Ｇ）、第２巻、第３章、ア カデミツクプレス、ニューヨーク、ブレイクら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（１９８３）、８０巻、１５５Ｂ−１５５９頁参照。特許 請求するインシュリン類似体の幾つかは、無傷のすい臓性または組換えインシュ リンの還元または酸化性スルフィトリシスに続いて分離されるヒトまたはヒツジ Ｂ鎖を、ペプチド合成技術または組換えＤＮＡ法により調製した変性Ａ鎖と組み 合わせることにより調製できる。

天然アミノ酸をいずれかの位置で置き換えたインシュリンのＡまたはＢ鎖を製造 するための組換えＤＮＡ法には、その様なＡまたはＢ鎖のアミノ酸配列をコード 化する試験管内合成されたＤＮＡのクローニングおよび発現が含まれるが、これ らに限定するものではない。あるいは、ヒトインシュリンＡまたはＢ鎖を発現す る生物、例えば微生物を、試験管内の部位特異的変異誘導の技術のいずれかによ り誘発して変性鎖を作ることができる。例えば、スミス、Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　（１９８５）　、１９＠、４２３−４６３頁、ホトス タインら、サイエンス（１９１１５）、２２９巻、１１９３−１２０１頁参照。

一般に、変性Ａ鎖を有するインシュリンを調製するには、公知の技術により得ら れるヒツジインシュリンＢ鎖を、いずれかの好適な技術により調製した変性Ａ鎖 と組み合わせる。Ｂおよび変性Ａ鎖は好ましくはその安定化されたＳ−スルホン 化した形であり、次いでそれを公知の方法により組換え、無傷の活性インシュリ ン類似体を形成する。公知の組換え技術は、カツォヤニス所有の米国特許第３． ４２０，８１０号およびチャンスら所有の米国特許第４．４２１．８８５号に開 示されている。米国特許第４，４２１．８８５号は、Ｓ−スルホン化したＡ鎖と Ｓ−スルホン化したＢ鎖を、水性媒体中で、ジチオトレイトールまたはシスティ ンの様なチオール還元剤の存在下で結合させる、インシュリンを形成するための 一段階方法を開示している。組換えの条件は、（１）ｐＨ約１０，５、（２）総 タンパク質濃度約０．１〜５ｏ■ｇ／ｍｌ、および（３）混合物中に存在するＡ およびＢ鎖の総Ｓ−スルホン酸塩中に存在する各−５−ＳＯ３基あたり約０．４ 〜２．５３Ｈ基を生じる濃度のチオール還元剤を含む。酸素源を与えてインシュ リンＳ−８結合を形成させる環境中で、反応を約０〜５℃の温度に維持すること によりインシュリン類似体が形成される。

組換え反応が完了したら、インシュリン類似体を分離し、当業者には公知の各種 の技術により、純度および活性を評価分析する。インシュリンおよびインシュリ ン類似体を精製するための一般的に使用される技術は、高性能液体クロマトグラ フィー（ＨＰＬＣ）、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーの様なりロ マトグラフィー技術である。生成物の純度は、とりわけ、ＨＰＬＣ，ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動、アミノ酸分析およびアミノ酸配列測定を含む各種の技術 により測定できる。

一般に、インシュリン類似体はある程度の残留インシュ特表千４−５０４８５８ 　（５） リン活性を維持しているが、その様な類似体の効力は天然インシュリンのほんの 一部に過ぎない。ＵＳＰ標準におけるヒト、ウシおよびブタインシュリンの効力 は１ｇタンパク質あたり約２５−２６１０　（国際単位）である。インシュリン 効力を測定するための標準評価分析には、とりわけ、（１）インシュリンの相対 的効力が、細胞膜上に存在するインシュリン受容体、例えばラットの肝臓プラズ マ薄膜部分、分離したラットの脂肪細胞または分離したラットの肝臓細胞に特異 的に結合した１２５Ｉ−インシュリンの５０％を置き換えるのに必要なインシュ リン類似体に対するインシュリンの比率として定義されるインシュリン放射性受 容体評価分析、（２）相対的インシュリン効力が、［３−３Ｈ］グルコースの有 機抽出性物質（例えば脂質）への最大転換の５０％を達成するのに必要なインシ ュリン類似体に対するインシュリンの比率として定義される、例えばラットの脂 肪細胞で行う脂肪形成評価分析、（３）インシュリン類似体の相対的効力が、グ ルコース−１イ１４Ｃ］の［１４ＣＯ２］への最大転換の５０％を達成するため のインシュリン類似体に対するインシュリンの比率として定義されるグルコース 酸化評価分析、（４）インシュリンまたはインシュリン類似体が、特異的抗イン シュリン抗体に結合する際に１２５１−インシュリンと競合する効率を測定する ことにより、インシュリン類似体の免疫遺伝性を決定できるインシュリン放射性 免疫評価分析、（５）媒体へのグルコース分泌の抑制をインシュリンまたはイン シュリン類似体の濃度の関数として測定する、十分に分化したヘパトーマ細胞系 統（ＰＡＯ）の融合単層上で行うブドウ糖新生の抑制であり、類似体の相対的効 力は、最大グルコース生産の半分を抑制するのに必要なインシュリン対類似体の 濃度の比率として定義される、および（６）特異的インシュリン受容体を有する ことが分かっている、培養したリンパ細胞の様な細胞へのインシュリンまたはイ ンシュリン類似体の結合を測定する他の評価分析がある。

本発明のインシュリン類似体は、糖尿病患者に投与するための医薬組成物に配合 することもできる。この医薬組成物は、糖尿病患者におけるホルモンの恒常性達 成を促進するのに有効な量の本発明のインシュリン類似体を、医薬に使用できる 担体と共に含む。糖尿病治療用のすべてのインシュリン製剤と同様に、個々の患 者におけるホルモンの恒常性を達成するための、有効成分の適切な治療のための 量を決定する必要がある。考慮すべき要因としては、糖尿病の病状および組成物 の投与経路がある。最終的には、糖尿病患者を治療している医師がこの医薬組成 物の量および投与経°路を決定する。天然インシュリンは、一般に１日に体重１ キログラムあたり約０．０２〜約５単位のヒトインシュリン活性を与える投与量 で、黴者に与えられる。例えば、米国特許第４，６５２．５４７号参照。

本発明に係わるインシュリン類似体の治療上有効な量を含む医薬組成物は、イン シュリン治療を必要とする糖尿病患者に非経口的に投与することができる。好ま しくは、この組成物は筋肉内、皮下または静脈内投与する。また、この組成物は 鼻に噴霧して患者に投与することもできる。あるいは、長期間の恒常性調整には 、この組成物を埋め込みポンプに配合して患者に投与することもできる。長期間 にわたって調整量の薬剤を患者に与える、その様な埋め込み装置はこの技術では 公知である。組成物は、さらに医薬品に使用できる、患者に有害であってはなら ない担体を含むことができる。また、担体は、組成物の活性成分、すなわち［Ｔ ｒｐ１４−ＡＩインシュリンまたは他のインシュリン類似体に有害な影響を与え てはならない。有効成分として治療上有効な量の本発明に係わるインシュリン類 似体を含む医薬組成物のための好適な担体および他の添加剤は、インシュリン含 有組成物を提供する米国特許第４．８５２，５４７号に記載されている。

一例として、［Ｔｒｐ”−＾］インシュリンの合成は、Ｓ〜スルホン化ヒツジＢ 鎖と、ヒツジインシュリンの［Ｔｒｐ’Ｆ　Ａ鎖（下記ＸＸ）のＳ−スルホン化 形態との相互作用により達成された。カツォヤニスら、バイオケミストリー、６ ：２６３５−２６４２　（１９６７）およびチャンスら、Ｐｅｐｔ、　Ｐｒｏｃ 、＾ｍ、　Ｐｅｐｔ、　Ｓｙｍｐ、　７ｔｈ　、　７２１−７２８（１９８１） に記載される方法に従った。Ａ鎖類似体の合成は、重要な工程として、それぞれ のＡ鎖の完全なアミノ酸配列を含む、保護されたヘンエイコサペプチド（下記Ｘ ｌりの構築を含む。保護されたヘンエイコサベブチドの構築には、メリフィール ドら、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ。

論、または断片縮合法を使用した。後者の方法による合成では、Ｃ−末端ペプチ ド（配列Ａ１７−Ａ２１．を隣接するペプチド（配列Ａ１２−ＡｌＢ）に結合さ せてＣ−末端デカペプチド（配列Ａ１２−Ａ２１）を調製した。この後者の化合 物を隣接するトリペプチド（配列Ａ９−Ａ１１）と結合させてＣ−末端トリデカ ペプチド（配列Ａ９−　Ａ２１　＞を調製し、これを今度は隣接するテトラペプ チド（配列Ａ５−Ａ８）と結合させテＣ−末端へブタデカペプチド（配列Ａ”　 −Ａ２１）　ヲ調製した。最後の結合工程では、Ｃ−末端へブタデカペプチドと Ｎ−末端テトラペプチドを結合させて保護されたヘンエイコサペプチド（下記Ｘ ｌｌまたはＸＩＸ）を得た。各種アミノ酸の二次官能基を保護するために通常の 閉塞基を使用した（すなわちＳｅｒ　、　Ｇｌｕ　、　ＡｓｎおよびＴｙｒに対 してＢｚｌ　ｓおよびＣｙｓに対してＰＭＢ）が、Ｔｒｐのインドール官能基だ けはフジイら、Ｃｈｅｗ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、　（Ｊａｐａｎ）３２． ２８６０−２６６５　（１９＆４）にしたがってＭｔｓで保護した。保護された ヘンエイコサペプチドから閉塞基を、ヤジマおよびフジイ、Ｊ、　ＡＩ、Ｃｈｅ ＩＩ。

Ｓｏｃ、、　１０３．５８８７−５８７１（１９８１）およびフジイら、よ呈に したがって１−クレゾールおよびＥＤＴを含むＴＥＡ中の１トリフルオロメタン スルホン酸−チオアニソールにより、最近オされた修正を使用して、あるいはタ ムら、Ｊ、　Ａｊ　Ｃｈｅ■、Ｓｏｃ、、　１０５．８４４２−６４５５　（１ ９８３）にしたがって低／高フッ化水素法および得られた還元生成物のスルフィ トリシスにより除去し、Ｓ−スルホン化鎖類似体ｘｘを得た。

本発明を下記の実施例により説明するが、これらの実施例は本発明を限定するも のではない。

実施例］。

ヒツジ［：Ｔｒｐ１４−ＡＩインシュリンの合成■・Ｌｅｕ・ＯＭｅの溶液に、 ＤＭＰ（５０ｍｌ）中１．１ＪｇのＨＣＩを９．１１のＴＥＡと共に加え、続い て１７．８　ｇのＢｏｃ−Ｇｌｎ　−０Ｎｐを加えた。２４時間後、この混合物 を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して少量にし、５００　ｍｌのＡｃ０Ｅｔおよび １００１の水で希釈した。有機層をＩＮのＮＨ４ＯＨ，水、０，５ＮのＨＣＩお よび水で洗浄し、除湿し、乾燥濃縮した。残留物をエーテル−石油エーテルで粉 末化し、酢酸エチル−エーテルから結晶化させた。

重量１３．７　ｇ（７６，８％）、融点１２６℃、［α］　、　”’−３５，３ ゜（ｅ　Ｉ、メタノール）。

分析”１７Ｈ３ＬＮ３０Ｂ　’ 計算値：　Ｃ５４，７，Ｈ８，３７，Ｎ　１１．３実測値：　Ｃ５５，０，Ｈ８ ，２８；　Ｎ　１１．３Ｚ（ＯＭｅ）−Ｔｒｐ（Ｍｔｓ）−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ　− ＯＭｅ　（Ｉｆ）化合物＋（３，７３ｇ）のＴＦＡ−アニソール（８ｍｌ−２ｍ ｌ）溶液を室温で１．５時間保管し、減圧下で濃縮乾燥させた。残留物をエーテ ル−石油エーテル（１：２、Ｖ／Ｖ）の混合物で粉末化し、ＫＯＨ上で減圧乾燥 させた。この物質を２．８１のＴＥＡを含む２０１のＤＭＦに溶解した溶液を０ ℃に冷却し、フジイらによるＺ（ＯＭｅ）−Ｔｒｌ）−（Ｍｔｓ）−ＮＨＮＨ２ からオガワら、１４ａの方法にしたがって調製した６、２１　ｇのアジドに加え た。この反応には、ＤＭＰ（２０ｍｌ）、ＤＭＦ（３，５ｍｌ）中６４　Ｎ　Ｈ ＣＩ　、硝酸ｔｅｒｔ−ブチル（１，５ｍｌ）およびＴＥＡ（３，１ｍｌ）を使 用した。４℃で４０時間後、この混合物をＡｃ０Ｅｔ（８００ｍｌ）および飽和 ＮａＣＩ（１００１）で希釈した。有機層を１０％クエン酸および飽和ＮａＣ１ で洗浄し、除湿し、濃縮乾燥させた。残留物をエーテルで粉末化し、エタノール から結晶化させた。

重量３．８　ｇ（４５％）、融点１０−１７３℃、［α］　、−４１，４’（ｃ 　ｌ、ＤＭＰ　’）。

分析”４ＬＨ５１Ｎ５０１０Ｓ： 計算値、　ＣＢ１．１．　Ｈ６，４；　Ｎ　８．７実測値：　Ｃｅｔ、ｏ；　Ｈ ｅ、５：　Ｎ　１１．５ＢｏＣ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｍｔｓ）−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ　 ・ＯＭｅ　（ＩＩＩ）化合物１１（２，０ｇ’）のＴＦＡ−アニソール−ＥＤＴ （１０ｍｌ−１ｍｌ−０，３ｍｌ）溶液を０℃で３０分間、室温で３０分間保管 し、次いで化合物１１の合成で記載した様に処理した。得られたＨ（Ｘ−脱保護 ベブチド塩をＴＥＡ（０，８ｍｌ）を含み０℃に冷却したＤＭＦ（３５ｍｌ）に 溶解した溶液に１．７　ｇのＨｏｅ−Ｌｅｕ　・ＯＮｐを加えた。室温で２４時 間後、混合物を６００１のＡｃ０Ｅｔで希釈し、ＩＮのＮＨ４０１（、飽和Ｎａ Ｃ１，０，５ＮのＨＣＩおよび飽和ＮａＣ１で順次洗浄し、除湿し、濃縮して少 量にした。析出した生成物を集め、ＡｅＯＥｔから再結晶させた。

重量１．５１　ｇ（７１％）、融点１８８−１９０℃、［α］　Ｄ−２０，６″ （ｃ　ｌ、ＤＭＦ　）。

分析”４３Ｈ６２Ｎ６０１０Ｓ： 計算値：Ｃ６０，４；　Ｈ７，３，Ｎ　９．８実測値：　Ｃ６０，１，Ｈ７，５ ，Ｎ　９．８４ＭのＭＳＡ加水分解後のアミノ酸分析の結果はＧ　ｌ　ｕ　ｔ、 。Ｌｅｕ化合物＋１１（４，４６ｇ）のＴＰＡ−アニソール−ＥＤＴ（１５ｍｌ −１，２ｍ１−０．８　ｍｌ）による脱閉塞および得られたＮ　−脱保護ペプチ ド塩の分離を、化合物ＩＩＩの合成で記載した様にして行なった。この物質のＴ ＥＡ（１，１−１）を含むＤＭＦ（８０ｍｌ）溶液に２．０７　ｇのＢｏｃ−８ ｅｔ（Ｂｚｌ）　・ＯＨを０℃で加え、続いて１．８５　ｇのＮ、Ｎ’−ジシク ロへキシルカルボジイミドおよび１．０８　ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾ ールを加えた。室温で２４時間後、尿素副生成物を濾別し、濾液を６００１のＡ ｅＯＥｔで希釈し、１００１のＮａＣｌで飽和させた。有機層を通常通り洗浄、 除湿および少量に濃縮した。析出した生成物を集め、酢酸エチル−エーテルから 再析出させた。

（ｃ　ｌ、ＤＭＰ　）。

分析”　５３Ｈ７３Ｎ７０１２”” 計算値：　Ｃ６１，７：　Ｈ７，１；　Ｎ　９．５実測値＋　ＣＢＬ、４．　Ｈ ７，２，Ｎ　９．３４ＭのＭＳ＾加水分解後のアミノ酸分析の結果はＳｅ　ｒ　 １．。Ｇｌｕｌ、ＯＬｅｕ、ｏＴｒｉ）０．７であったＯＤＭＦ（３５ｍｌ）お よびヒドラジン水和物（１，０ｍｌ）を含むエタノール（１０ｍｌ）の混合物に 溶解した化合物１ｖの溶液を室温で２４時間保存し、２００１の５０％水性エタ ノールで希釈した。

析出した生成物を集め、メタノール−水から再析出させた。

重量４．８　ｇ（９４％）、融点２０３−２０５℃、［α］　２５−８．１°（ ｃ　Ｉ、ＤＭＳＯ）。

分析”５２Ｈ７３Ｎ９０１１Ｓ’ 計算値：　Ｃ８０，５，Ｈ７，１；　Ｎ　１２．２実測値：　Ｃ６０，９，Ｈγ 、４；　Ｎ　１２．０４ＭのＭＳＡ加水分解物は５ｅｒＯ，ｇ　Ｇｌｕｌ、ｏＬ ｅｕ２．ｏ　Ｔｒｐｇ４製した７、３９　ｇのＢｏｃ−Ｃｙｓ（ＰＭＢ）−Ａｓ ｎ　拳０ＢｚｌのＴＦＡ−アニソール（１５１ｍ１−３　ｍｌ）溶液を０℃で３ ０分間および室温で１．５時間保存し、次いで減圧下で濃縮した。残留物をエー テルおよび石油エーテル（１：１　ｖ／ｖ）の混合物で粉末化し、ＫＯＨ上減圧 下で乾燥させた。この物質の、ＴＥＡ（２，３ｍｌ）を含み０℃に冷却したＤＭ Ｆ（ＧＯｍりの溶液に、７ｇのＢｏｅ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）　・ＯＮｐを加えた。

室温で２４時間後、この混合物を６００１のＡｃ０Ｅｔおよび１００１の１Ｎの ＮＨ４ＯＨで希釈した。有機層を洗浄（ＩＮのＮＨ４ＯＨ，０，５ＮのＨＣＩお よび水）し、除湿し、少量に濃縮した。析出した生成物を集め、Ａｃ０Ｅｔから 再結晶させた。

重量８．７　ｇ（８４％）、融点１７４−１７５℃、［α］　、−１８，６゜（ ｃ　ｌ、ＤＭＰ　）。

分析：Ｃ４３Ｈ５ＯＮ４０９Ｓ： 計算値：　Ｃ６４，８，Ｈ８，３０Ｎ　７．０実測値：　Ｃ６４，０，Ｈ６，３ ５Ｎ　７．０Ｂｏｃ−＾ｓｎ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｃｙｓ（ＰＭＢ）−Ａｓｎ　 ・０Ｂｚｌ　（Ｖｌり８．２　ｇ　（７）化合物Ｖｌ’ｆｌ−ＴＦＡ−７ニア　 −ル（２２ａ＋１−２．２　ｍｌ＞　テ上記の様に閉塞した。残留物をエーテル で粉末化し、沈殿したＮ（Ｚ−脱保護ベブチド塩を濾別し、Ｋｏｌ（上で減圧下 で乾燥させた。この生成物の、ＴＥＡ（１，８ｍｌ）を含み０℃に冷却したＤＭ Ｐ（５０ｍｌ）の溶液に、３．９ｇのＢｏｃ−Ａｓｎ　・ＯＮｐを加えた。室温 で２４時間後、反応混合物を２００１のメタノールで希釈し、沈殿した生成物を 濾別し、洗浄（ＩＮのＮＨ４０Ｈ５０，５ＮのＨＣＩおよび水）し、除湿し、Ｄ ＭＰ−メタノールから再結晶させた。

重量８　ｇ（６４％）、融点２３７−２３８℃、［α］　、−３７，４’（ｃ　 Ｉ、ＤＭＰ　）。

分析”４７Ｈ５６Ｎ８０１１Ｓ’ 計算値：　Ｃ６１，８，Ｈ６，１８Ｎ　９．２実測値：　Ｃａｔ、ｅ；　Ｈ８， ３０Ｎ　９．１Ｂｏａ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｃｙ ｓ（ＰＭＢ）−Ａｓｎ　・０Ｂｚｌ（Ｖｌｌｌ） 化合物Ｖｌｌ（５，５ｇ）の脱閉塞およびＮ　−脱保護ペプチド塩の分離を、化 合物Ｖｌ＋の合成で記載した様にして行なった。この生成物の、ＴＥＡ（０，８ ５ｉｆ）を含み０℃に冷却したＤＭＦ″（５０ｍｌ）の溶液に、３．３ｇのＢｏ ａ−Ｇｌｕ−（ＯＢｚ１戸ＯＮｐ　（サンドリンら、Ｈｅ１ｖ、　Ｃｈｉｎ、　 Ａｃｔａ、　４６：　１６３７−１８８９（１９６３）の方法により調製した） を加えた。この反応混合物を化合物ＶＩ＋の合成における様に処理した。

重量５．６　ｇ（８１％）、融点２０６−２０７℃、［αコＤ−４１．４゜（ｃ 　ｌ、ＤＭＰ　）。

分析”５９”６９Ｎ７°１４Ｓ０ 計算値＋　ＣＢ２．８．　Ｈ６，１４，Ｎ　８．７実測値、　ＣＢ２．３．　Ｈ ５，９４，Ｎ　８．５６ＮのＨＣＩ加水分解におけるアミノ酸比；　Ａｓｐ　１ ．８　Ｇｌｕ　ｔ、。

Ｔｙｒ　Ｃｙｓ（ＰＭＢ）は測定されなかった。

１．０゜ Ｂｏｃ−８ｅｔ　（Ｂｚ　１）−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ　（Ｍｔ　ｓ　）　−Ｇ　ｌ　 ｎ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉ　ｕ　（ＯＢｚ　ｌ　）　−Ａｓｎ−Ｔ凾■ （Ｂｚｌ）−Ｃｙｓ（ＰＭＢ）−Ａｓｎ　・ＯＢｚｌ　（ＩＸ）化合物Ｖｌｌ＋ （２，３ｇ）の脱閉塞およびＮ（Ｚ−脱保護ペプチド塩の分離を、化合物Ｖｌｉ の合成で記載した様にして行なった。この生成物の、ＴＥＡ（０，４２ｍｌ）を 含み０℃に冷却したＤＭＦ（３５ｍｌ）の溶液に、２．９８　ｇの、化合物Ｖか ら調製したアジド（オガワら、上記による）を加えた。この反応には、ＤＩＰ（ ２０１）、ＤＭＰ（０，９２ｍｌ）中８．３　Ｎ　ＨＣＩ　、亜硝酸ｔｅｒｔ− ブチル（０，４２ｍｌ）およびＴＥＡ（０，９８ｍｌ）を使用した。４℃で４８ 時間後、反応混合物をＡｃ０Ｅｔ（２０ｍｌ）および５％クエン酸（１００１） で希釈し、沈殿した生成物を濾別し、水およびメタノールで洗浄し、ＤＭＦ−メ タノールから再結晶化させた。

重量１．５５　ｇ（３８％）、融点２４５−２４６℃、［αコＤ−１５．７’（ ｃ　Ｉ、　ＤＭＳＯ）。

分析”　１０６　Ｈ１３１Ｎ１４０２３Ｓ２　°２Ｈ２０：計算値：　Ｃ６１， ５：　Ｈ６，６，Ｎ　９．５実測値：　Ｃ８１，４；　Ｈ６，５，Ｎ　９．７６ ＮのＨＣＩ加水分解におけるアミノ酸比：Ａｓｐ　２．ＯＳｅｒ　ｏ、９Ｇｌｕ 　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　ＴｒｐおよびＣｙｓ　（ＰＭＢ）は測定さ２、Ｌ　２．１　 １．０゜ れなかった。

Ｂｏｃ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｖａ　Ｉ　−Ｃｙｓ　（ＰＭＢ）　−８ｅｔ　（Ｂｚ　Ｉ 　）　−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ　（Ｍｔ　ｓ　）　−Ｇ　ｌ　ｎ−kｅｕ− Ｇ　Ｉ　ｕ　（ＯＢｚ　Ｉ　）−＾ｓｎ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｃｙｓ（ＰＭＢ） −Ａｓｎ　・０Ｂｚｌ　（Ｘ）化合物ＩＸ（０，９５ｇ）ノＴＦＡ−アニソール −ＥＤＴ（５ｍｌ−０，１１ｍｌ−０，０８ｍｌ）溶液を０℃で３０分間、室温 で１．５時間保存した。

過剰のＴＦＡを減圧下で蒸発させて除去し、残留物をエーテルで粉末化した。形 成された沈殿物を濾別し、Ｋｏｌ上で減圧下で乾燥させた。この生成物の、ＴＥ Ａ（０，０９ｍｌ）を含むＤＭＦ（２５ｍｌ）の溶液に、オガワら、↓呈により 、Ｂｏａ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（ＰＭＢ）−ＮＨＮＨ２から調製した０ 、８２　ｇのアジドを加えた。この反応には、ＤＭＰ（１０ｍｌ）、ＤＭＦ（０ ，５１ｇｅｔ）中８．３　ＮＨＣＩ　、亜硝酸ｔｅｒｔ−ブチル（０，２４ｍり およびＴＥＡ（０，４９ｍｌ）を使用した。４℃で４８時間後、反応混合物をＡ ｃ０Ｅｔ（２０ｍｌ）および５％クエン酸（６０ｍｌ）で希釈し、沈殿した生成 物を集め、ＤＨ！′−メタノールから再結晶化させた。

重量０．９３　ｇ（８２％）、融点２６７−２ｆｉ８℃、［αコＤ−＋７．４” （ｃ　ｌ、ＤＭＳＯ）。

分析”　１２４　Ｈ１５Ｂ　Ｎ１７０２７Ｓ３　°３Ｈ２０：計算値：　Ｃ８０ ，４，Ｈｅ、ｅ；　Ｎ　９．７実測値：　Ｃ６０，３，Ｈ６，４，Ｎ　９．９６ ＮのＨＣＩ加水分解におけるアミノ酸比：　ＡＳｐｔ、９Ｓ１３ｒ　ｇ、９Ｇｌ ｕ　２．ＯＧｌｙ　１．Ｏｖａｔ　１．ＯＬｅｕ　２．Ｌ　Ｔｙｒ　Ｏ，９ｏ　 ＴｒｐおよびＣｙｓ　（ＰＭＢ）は測定されなかった。

Ｂｏｃ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｃｙｓ　（ＰＭＢ）　−Ｃｙｓ　（ＰＭＢ）　−Ａ　Ｉ　 ａ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｖａ　１−Ｃｙｓ　（ＰＭＢ）　−９ｅｔ（Ｂｚ　ｌ　）−Ｌ ｅｕ−Ｔｒｐ　（Ｍｔｓ　）−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ　ｕ　（ＯＢｚ　ｌ 　）−Ａｓｎ−Ｔｙｒ　（Ｂｚ　ｌ　）@− Ｃｙｓ（ＰＭＢ）−Ａｓｎ・ＯＢｚ！　（ＸＩ）化合物Ｘ（０，ｌｉ２　ｇ）　 ノＴＦＡ−７二７−ルーＥＤＴ（５ａｔ−０，５ｍｌ−０，１ｍｌ）による脱閉 塞およびＮ（Ｘ−脱保護ベブチド塩の分離を上記の様にして行なった。この生成 物の、ＴＥＡ（０，１ｍｌ）を含むＤＭＦ（４０ｍｌ）の溶液に、オガワら、上 星により、Ｂｏｃ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｃｙｓ　（ＰＭＢ）　−Ｃｙｓ　（ＰＭＢ）− Ａ　ｌ　ａ−ＮＨＮＨ２から調製した１、０６ｇのアジドを加えた。この反応に は、ＤＭＰ（２０ｉｆ）、Ｄ）ＩＦ（０，４３１＋）中８．３　Ｎ　ＨＣＩ　、 亜硝酸ｔｅｒｔ−ブチル（０，２１１１）およびＴＥＡ（０，４２ｍｌ）を使用 した。４℃で４８時間後、反応混合物を２００　ｍｌのメタノールで希釈し、沈 殿したヘプタデカペプチド誘導体を集め、ＤＭＰ−メタノールから再結晶化させ た。

重量０．８５　ｇ、融点〉２７０℃、［α］　２５−２１．４°（ｃ　ｌ、ＤＭ ＳＯ）。

８ＮのＨＣＩ加水分解におけるアミノ酸比：　Ａｓｐ　２．ａ　Ｓｅｒ　Ｏ，９ Ｇｌｕ　３．Ｉ　Ｇｌｙ　１．ＯＡｌａ　１．２　Ｖａｔ　Ｏ，９Ｌｅｕ　１． ９　Ｔｙｒ　ｏ４　。ＴｒｐおよびＣｙｓ　（ＰＭＢ）は測定されなかった。

ｚ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ　ｔ）−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ（ＰＭＢ ）−Ｃｙｓ（ＰＭＢ）−Ａｌａ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｖ’ａ　ｌ　−Ｃｙｓ　（ＰＭＢ ）−３ｅｒ　（Ｂｚ　ｌ　）　−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ　（Ｍｔｓ）　−Ｇ　ｌ　ｎ− Ｌｅｕ−Ｇ　hｕ （ＯＢｚｌ）−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｃｙｓ（ＰＭＢ）−Ａｓｎ−ＯＢｚ ｌ　（Ｘｌｌ）化合物ＸＩ（０，６ｇ）　ノＴＦＡ−７ニソールーＥＤＴ（８ｇ ｌ−０，８ｍｌ−０，１ｍｌ）による脱閉塞および得られた生成物の分離を上記 の様にして行なった。この生成物の、ＴＥＡ（０，０６ｍｌ）を含むＤＭＦ（４ ０ｍｌ）の溶液に、ｚ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｖａｔ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ　ｔ）−ＮＨ ＮＨ２（力゛ソオヤニスら、Ｊ、　Ａｓ、　Ｃｈｅｔ　Ｓｏｃ、、　８ｇ：５８ ２２−５６２５（１９８Ｂ）の方法により調製）から調製した０、４９　ｇのア ジドを加えた。この反応には、ＤＭＦ（２０ｍｌ）、ＤＭＰ（０，２５ｍｌ）中 ６．３ＮＨＣＩ、亜硝酸ｔｅｒｔ−ブチル（０，Ｈｍｌ）およびＴＥＡ（０，３ ｍｌ）を使用した。４℃で４８時間後、反応混合物をメタノール（２００ｍｌ） で希釈し、沈殿した、保護されたヘンエイコサペプチドを集め、ＤＮＦ−メタノ ールから再結晶化させた。

重量０．５３　ｇ（７８％）、融点〉２７０℃、６ＮのＨＣＩ加水分解における アミノ酸比；　ＡＳＩ）　２．ｏＳｅｒ　ｏ、９Ｇｌｕ　４．ＯＧｌｙ　２．Ｉ ＡｌａＣｙｓ　（ＰＭＢ）は測定されなかった。

Ｂ、　Ｓ−スルホン化［Ｔｒｐ１４１　Ａ鎖（ＸＸ）ノ合成保護されたヘンエイ コサペプチドＸ１ｌ（２００ｍｇ）を、チオアニソール（０，６Ｂ　ｉｔ）　、 催−クレゾール（０，５９ｍｌ）およびＥＤＴ（０，４７ｉｆ）を含むＴＥＡ（ ４，３ｍｌ）中ＩＭのトリフルオロメタンスルホン酸で０℃で２時間処理した。

次いでこの溶液を一１０℃に冷却し、強く攪拌しながら濃ＮＨ４０Ｈ（５ｉｆ） を含む８Ｍの塩化グアニジンを滴下して加えた。この工程中、混合物の温度は５ ℃未満に維持した。得られた混合物（ｐ）Ｉ約５）をエーテル（各５０１）で３ 回抽出し、ＮＨ４ＯＨでｐＨ８，９に調節した水層に１．２ｇの亜硫酸ナトリウ ムおよび０．６ｇの凸子オン酸ナトリウムを加えた。混合物を室温で３．５時間 攪拌し、５ｐｅＣｔｒａｐＯｒ薄膜チユーブＮ０９３の中に入れ、蒸留水を４回 交換して（各４リツトル）４℃で２４時間透析した。

透析液の凍結乾燥により、粗製Ｓ−スルホン化鎖類似体が得られたので、これを ６１の０．０１５ＭのＮＨ４ＨＣＯ３に溶解し、０゜０１５ＭのＮ）Ｉ４ＨＣＯ ３で平衡化し、溶離するセフアゾ・ノクスＧ−１５カラム（４，２ｘ４５　ｃ＋ ｓ）上でクロマトグラフィーにかけた。

ｌ５ＣＯ分光光度計で観察して主要ピークに相当する溶離液を凍結乾燥し、ヒツ ジインシュリン［Ｔｒｐ１４］Ａ！ｌｌ５−スルホン酸塩を白色粉末として得た 二重量１３０．５１ｇｏ精製するために、この物質（７１，３ｇｇ）を［１，ｉ ）Ｉのトリス−）ＩＣ＋緩衝液（ｐＨ７，０，３ｍｌ）に溶解し、同じ緩衝液で 平衡化したセレ・ンクスーＥカラム（１，２ｘ４３　ｃ＋ｇ）にかけた。カラム の溶離はトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，０）およびチューら、バイオケミスト リー、２６．６９６Ｂ−６９７１（１９８７）に記載されている直線ＮａＣｌ勾 配で行なった。ｌ５ＣＯ分光光度計および導電性メーター（ラジオメーター、コ ペンハーゲン）で観察したクロマトグラフィーパターンを図１に示す。主要ピー クに相当する溶出液（２３０−３６０１）を集め、上記の様に透析し、凍結乾燥 させた二重量３５．４１ｇ　。

合成鎖類似体のアミノ酸分析は、シンプソンら、」、ＢＬ。

１、Ｃｈｅｉｌ、　２５１．１９３８−１９４０（１９７Ｂ）の方法における様 に、一方は６ＮのＨＣＩを使用し、他方は４ＭのＭＳＡ（Ｔｒｐ測定用）を使用 する２種の酸水解物で行なった。モル比で表したアミノ酸組成物は理論的に予想 した値と一致していた。合成鎖類似体のアミノペプチダーゼＭによる消化および 消化物のアミノ酸分析により、予想されたモル比が得られた。合成物質は酵素に より完全に消化され、合成工程で構成アミノ酸の立体化学的純度が保存されたこ とを示している。

Ｃ，ヒツジ［Ｔｒｐ’−ＡＵインシュリンの合成および分離ヒツジ［Ｔｒｐ’− ＾１インシュリンの合成を、チャンスら、上記、の方法により、ジチオトレイト ールの存在下で、Ｓ−スルホン化［Ｔｒｐ１４コヒツジＡ鎖（ＸＸ）と、Ｓ−ス ルホン化ヒツジ（ウシと同じ）Ｂ鎖との相互作用により行なった。ヒツジＢ鎖Ｓ −スルホン酸塩（１０Ｂ）（カツォヤニスら、バイオケよびジチオトレイトール （６，８３ｍｇ）を０．１Ｍのグリシン緩衝液（ｐＨ１Ｏ，５、Ｂ　ｍｌ）に加 えた溶液を４℃で２４時間攪拌し、カツォヤニスら、バイオケミストリー、６． ２８５Ｂ−２６６８（１９６７）により記載されている様にして処理した。この 組み合わせ混合物からのインシュリン類似体の分離および精製は、ＣＭ−セルロ ースカラム（０，９ｘ２４　ｃ■）上で、酢酸塩緩衝液（Ｎａ”　、０．０２４ Ｍ、ｐＨ３，３）およびカツォヤニスら、上記、に記載される指数ＮａＣｌ勾配 により行なった。ｌ５ＣＯ分光光度計および導電性メーター（ラジオメーター、 コペ、ンハーゲン）により観察して得られた溶離パターンを図２Ａに示す。

カツォヤニスら、１２、により、塩酸塩としてピクリン酸塩により、溶離液（１ ４５−１７５ｍｌ）から１．３　Ｂの［Ｔｒｐ１４−Ａｌインシュリンを分離し た。この物質の最終的な精製は、ＬＫＢ液体クロマトグラフィー機構に接続した ＶｙｄａｃＲ２１＋１　ＴＰカラム（０，４５ｘ２５　ｃ＋ｅ）上で逆相ＨＰＬ Ｃにより行なった。クロマトグラフィーは、０．５■ｌ／ｗｉｎの流量で０゜１ ％ＴＦＡ中２−プロパツールの１０−５０％直線勾配で６０分間かけて行なった （図２Ｂ）。

主要ピークの溶出液を凍結乾燥することにより、高純度のヒツジ［Ｔｒｐ’−Ａ ｌインシュリンが得られた。

この合成物質の６ＮのＨＣＩ加水分解後のアミノ酸分析により、モル比で表した 組成は理論値と良く一致していた。

ｆｔＩ表平４−５０４８５８　（９） ２３：１４０５−１４１３（１９８４）に記載されている物質および分析方法を 使用した。受容体結合研究用の１２５．−インシュリンおよび脂肪形成用［３− ３Ｈ１はデュポンＮＥＮリサーチプロダクツから入手した。酢酸セルロース薄膜 フィルター、０，２μ■孔径は、サルトリウスの製品を使用した。ガラス繊維フ ィルター、ＧＦＣ型はホワットマンから入手した。コラゲナーゼ、ＩＩ型粗製は ワーシントンから入手した。シンチレーション液フィルトロン−ＸＲ、ハイドロ フルオアＲおよびソルシント−ＯＲはナショナルディアグノスティクスの製品で ある。結晶ウシインシュリンはシグマから、無脂肪酸ウシ血清アルブミンはベー リンガーーマンハイムバイオケミカルスから入手した。

Ａ、インシュリン受容体結合評価分析 ［Ｔｒｐ’−Ａｌインシュリンの、インシュリン受容体に対する１２５１−イン シュリンの特異的結合を抑制する能力は、プラズマ薄膜を強化したラット肝臓部 分、分離したラットの脂肪細胞、および分離したラットの肝臓細胞で試験した。

最初の２つの方法はパークら、バイオケミストリー、１９：４５４７−４５５６ （１９８０）により行なった。

大まかに言うと、３重の０．２　ｍｌ培養液は、Ｉ−インシュリン、３ｘｌＯ” 　Ｍ、標識を付けていないインシュリン、または実施例１で調製した［Ｔｒｐ１ ４−Ａｌインシュリン、および０．６％部分Ｖウシ血清アルブミンを含む、ｐＨ ７，４の０．１Ｍリン酸ナトリウム中のプラズマ薄膜（２０−４０μｌのタンパ ク質）を含む。２４℃で４５分間培養した後、これらの混合物を、２．０１の氷 冷した、０．Ｌ％部分Ｖウシ血清アルブミンを含むｐＨ７，４の０．１Ｍリン酸 ナトリウムで希釈し、直ちに酢酸セルロースフィルターを通して濾過した。フィ ルターを氷冷した緩衝液で２回洗浄し、乾燥させ、次いで放射能をフィルトロン −ｘＲを使用してシンチレーション計数器中で測定した。相対的効力は、受容体 標本に対する１２５１−インシュリンの特異的結合を５０％抑制するのに必要な 、［Ｔｒｐ’−Ａｌインシュリンに対する標識を付けていないインシュリンの濃 度比としてめた。この評価分析で、［Ｔｒｐ１４−Ａｌインシュリンは天然ホル モンの約６０％の効力を示した。

Ｂ、脂肪形成評価分析 これらの評価分析は、ウシインシュリンと比較したインシュリン類似体の、　［ ３−３Ｈ］グルコースを脂質に変換する能力を測定する。

脂肪細胞は、体重２００−３００　ｇの雄のラットから得た副翠丸および腎周囲 の脂肪パッドをり、ＯＢ／ｍｌのコラゲナーゼで３７℃で６０分間培養し、続い てガーゼを通して濾過し、次いで目の細かい絹で濾過して調製した。細胞を臨床 遠心分離機中で浮遊により２回洗浄してから分散物を使用した。

培養媒体は、推奨されたカルシウムの半分、０．５　ｍＭのグルコース、および ３％の無脂肪酸ウシ血清アルブミン、を含むクレブスリンガ−重炭酸塩および気 相として９５％０２−５％ＣＯ２を使用した。３種類の脂肪形成培養は、１．（ ｌ　ａｌｌの脂肪細胞分散物（２０−４０ｍｇ乾燥重量細胞）およびウシインシ ュリンまたは実施例１で調製した［Ｔｒｐ’−Ａｌインシュリンを含む。細胞を ３７℃で４５分間前培養した後、［３−３Ｈｌグルコースを加えた。培養を６０ 分間続け、０．２　ｍｌの５Ｎ−Ｈ２ＳＯ４および脂質を抽出するための０．２ １のコーンオイルを加えて停止させた。試料は１０１のソルシント−ＯＲで、室 温で３０分間抽出した後、シンチレーション計数器中で放射能を計数した。これ らの条件下では、［３−３Ｈ］グルコースはシンチレーションフルオアを含む有 機相に抽出されず、本質的に計数されなかった。脂肪形成のゼロおよび１００％ 刺激は、それぞれ、９．ｌｘｌＯ−１０Ｍインシュリン（５，５ｎｇ／ｍｌ）が 存在しない、および存在する状態で観察した放射能として決定した。相対的効力 は、脂肪形成の最大刺激の５０％をもたらすのに必要な、［Ｔｒｐ１４−Ａｌイ ンシュリンに対するインシュリンの濃度比としてめた。

図３は、分離したラットの脂肪細胞における、実施例１で調製した［Ｔｒｐ”− Ａｌインシュリン（−ム一）およびウシインシュリン（−・−）による　［３− ３旧グルコースの有機抽出性物質（すなわち脂質）への刺激を示す。最大値のパ ーセントを表す刺激は、働筋濃度の関数としてプロットした。このデータは、４ 回行なった代表的な評価分析における３重測定の平均を表す。

両インシュリンに対して、脂肪形成の同じ最大刺激が観察され、半最大刺激は約 ２倍の働筋濃度により得られた。

したがって、脂肪形成における合成インシュリンの効力（天然ホルモンと比較し て約６０％）は、脂肪細胞を使用する受容体結合評価分析におけるその挙動を反 映している。

Ｃ，ブドウ糖新生の抑制 この評価分析は、十分に分化したヘパトーマ細胞系統の融合単層について行なっ た（ラウリスら、エンドクリノロジーｆｉｌｌ：２５１９−２５２４（１９８８ ）　）が、その際、グルコース生産を市販のグルコースオキシダーゼキット（シ グマ　キットＮｏ、５１０−＾、シグマテクニカルブレティン５１０．１９８３ ）で監視した。媒体へのグルコース分泌の抑制は、インシュリンまたはインシュ リン類似体の濃度の関数としてめ、類似体の相対的効力はグルコース生産の半最 大抑制を行なうのに必要な、類似体に対するインシュリンの濃度比としてめた。

細胞培養およびグルコース生産はラウリスら、上記に記載される様にして行なっ た。

図４は、最大値のパーセントとして表し、インシュリン（−・−）および［Ｔｒ ｐ１４−＾］インシュリン（−ム−）濃度の関数として表した、ＰＡＯ細胞にお けるブドウ糖新生の抑制を示す。

両インシュリンに対して、ブドウ糖新生の同じ最大抑制が観察され、半最大抑制 はほぼ同濃度の働筋により得られた。

ブドウ糖新生の抑制における合成インシュリンの効力は、天然ホルモンに対して 約９０％と計算される。

廿−一　（□紬。）−ｍ− ００ＡＴ　２８０　ｎｍ ＦＩＧ、　２Ａ ＦＩＧ、　２８ 分 補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の７第１項）

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．アミノ酸Ａ１〜Ａ２１からなるＡ鎖およびアミノ酸Ｂ１〜Ｂ３０からなるＢ 鎖を有し、Ａ１４アミノ酸が、トリプトファン、ナフチルアラニン、Ｎγ−ダン シル−ａ，γ−ジアミノ酪酸、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、および他 の疎水性アミノ酸からなるグループから選択されたアミノ酸残基により置換され たインシュリン類似体。
2. ２．アミノ酸Ａ１〜Ａ２１からなるＡ鎖およびアミノ酸Ｂ１〜Ｂ３０からなるＢ 鎖を有し、トリプトファンがＡ鎖中で、Ａ１３アミノ酸、Ａ１４アミノ酸、Ａ１ ５アミノ酸、Ａ１９アミノ酸、Ｂ１６アミノ酸、およびそれらの組合わせからな るグループから選択されたアミノ酸に置換したインシュリン類似体。
3. ３．Ｂ１０アミノ酸がアスパラギン酸であることを特徴とする請求項１または２ のインシュリン類似体。
4. ４．Ｂ２５〜Ｂ３０アミノ酸がチロシン（ＮＨ２）で置換されていることを特徴 とする請求項３のインシュリン類似体。
5. ５．式 【配列があります】 を有するインシュリン類似体
6. ６．糖尿病治療を必要とする患者における糖尿病を治療するための医薬組成物で あって、治療上有効な量の請求項１〜５のインシュリン類似体を、医薬品に使用 できる担体と共に含むことを特徴とする医薬組成物。
7. ７．筋肉内投与用の請求項６の医薬組成物。
8. ８．皮下投与用の請求項６の医薬組成物。
9. ９．静脈内投与用の請求項６の医薬組成物。
10. １０．埋め込みポンプにより投与するための請求項６の医薬組成物。
11. １１．経鼻噴霧により投与するための請求項６の医薬組成物。
12. １２．糖尿病治療を必要とする患者における糖尿病を治療するための方法であっ て、治療上有効な量の請求項１〜５のインシュリン類似体を、医薬品に使用でき る担体と共にその患者に投与することを特徴とする方法。
13. １３．インシュリン類似体を筋肉内投与することを特徴とする請求項１２の方法 。
14. １４．インシュリン類似体を皮下投与することを特徴とする請求項１２の方法。
15. １５．インシュリン類似体を静脈内投与することを特徴とする請求項１２の方法 。
16. １６．インシュリン類似体を埋め込みポンプにより投与することを特徴とする請 求項１２の方法。