JPH04504256A - ペプチド、免疫原性のある組成物、それを含むワクチンまたは製剤、哺乳動物にｌｈｒｈに対する免疫性を付与する方法および豚の肉質を向上させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチド、免疫原性のある組成物、それを含むワクチンまたは製剤、哺乳動物に ＬＨＲＨに対する免疫性を付与する方法および豚の肉質を向上させる方法 本発明は、ＬＨＲＨすなわち「黄体形成ホルモン放出ホルモン」であり、また「 ゴナドロフィン（生殖ホルモン）Ｊ　（ＧｎＲＨ）と呼ばれるものに対して有効 なワクチンの実現に適合したペプチドに関するものである。

本発明はさらに、そのようなペプチドをもとにした免疫原性のある組成物ならび にワクチンまたは治癒力のある製剤（ワクチンおよび医薬）に関するものであり 、さらには哺乳動物にＬＨＲＨに対する免疫性を付与する方法ならびに豚の肉質 を向上させる方法において、そのようなワクチンすなわち治癒力のある製剤の使 用に関するものである。

ホルモンＬＨＲＨは、長さが１０個のアミノ酸を有するペプチド（すなわちデカ ペプチド）であり、次式（通常は左側がアミノ基末端アミノ酸であり、右側がカ ルボキシ末端アミノ酸である）に基づくアミノ酸系列を有する小さいペプチドで ある。

ｐＧｌｕ−ＨｉＳ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ −Ｇｌ　ｙ−ＮＨ２ ここで、これらのアミノ酸は三文字コードにしたがって選定されている。または 、次式すなわち＃Ｅ　ＨＷ　Ｓ　Ｙ　Ｇ　Ｌ　ＲＰ　Ｇ＠（ここでアミノ酸は一 文字コードにより選定されており、＃Ｅはピログルタミン酸であり、そしてＧ＠ はグリシンアミドである）にしたがって選定されている。

ＬＨＲＨが蛋白質キャリヤーに結合している場合は、それを哺乳動物にワクチン 接種を施すのに使用することができることは公知である。そのようなワクチン接 種は、ＬＨＲＨの本来の機能にすべて関連した理由のために実行可能なのである 。

視床下部で形成されたＬＨＲＨは、脳下垂体中で性ホルモンＬＨ（すなわち「黄 体形成ホルモン」を制御する。公知のとおり、血液中のＬＨとＦＳＨの量が急激 に減少すると、習慣的に動物の雄では寧丸中でのアンドロゲン（男性ホルモン） および***の生成が抑制され、動物の雌では卵巣中での１０ゲストゲン（黄体ホ ルモン）ならびにエストロゲン（女性ホルモン）の生成および卵胞の成熟が抑制 される。このように、血液中のアンドロゲン、プロゲストゲンおよびエストロゲ ンの量を、去勢や卵巣切除によって得られるレベルに比較できる程度のレベルに まで減少させることは、動物にＬＨＲＨに対する免疫性を付与することによって 、実現できる。獣医学では、１００％有効な免疫付与は、去勢や卵巣切除のよう な急激な外科的措置を行う代わりに、たとえば雄猫や雌猫のような小型の家畜の 不妊化や雄大の攻撃性の処置に対して利用可能であった。ＬＨＲＨに対する免疫 付与の他に考えられる目的としては、犬の発情および肥育した去勢牛の落着きの 無さを防止することが挙げられる９人間の健康管理において、ＬＨＲＨに対する 免疫付与は、前立腺癌や乳癌の処置ならびに必要に応じていくつかの形態の脳下 垂体の悪性腫瘍の処置をする際に行われる。

ＬＨＲＨに対するワクチンのもう１つの使途は、畜産、特に層殺用豚の肥育の分 野である。性的に成熟した雄豚（「去勢しない雄豚」）の肉には、典型的な臭気 いわゆる「雄豚臭」がある、性的に成熟した豚では、畢丸中で脂肪組織に蓄えら れる多くのステロイド類が形成される。これらのステロイド類（Ｃ１９Δ１６ス テロイド顛）は、その肉を加熱した際に形成される不快な尿様の「雄豚臭」の原 因になっている（ブルックスら。

Ｊ、＾ｎｉｍ、ｓｅｉ、、６２　、１２７９　（１９８６）を参照のこと）、こ の不快な臭気のために、性的に成熟した雄豚の肉は、とにがくも消費に適したも のとはほとんど言えない０層殺用雄豚の約１０％は、屠殺時にはすでに性的成熟 をとげているため、このような可能性は養豚産業に多大な損失を必然的にもたら すことになる。この損失のチェックを行うため、全部の雄豚を幼年時に気絶させ ることなしに、去勢させる。このような去勢を動物に対する不親切な見方とみる ということとは別に、去勢はまた発育阻害と完全な動物に劣るような最終的な肉 質（少なくともその完全な動物が雄豚臭を発していないかぎりでは）をもたらす ことになる。

動物に対して加えるべき友好的で、かつ肉質に貢献する方法は、この若い動物に ＬＨＲＨに対する免疫を付与することであり、これによってこの若い動物の脳下 垂体中のＬＨＲＨ濃度が減少する。

このように、脳下壬申のＬＨＲＨ濃度が減少することにより、血液中の生物学的 活性を有するＬＨとＦＳＨが減少することになり、引続いて成長中の動物の畢丸 の発育が阻害され、ステロイド類の生成が減少することになる。ＬＨＲＨに対す るワクチン接種を効果的に行うことにより、屠殺以前の望ましくない雄豚臭の生 成が回避できることになる。

事実実際に動物の雄では、キャリヤー蛋白質に結合したＬＨＲＨによるワクチン 接種を行うことによって、撃丸の発育が遅延するか停止することが可能であるこ とがわかっている。しかしながら、このような結果はＬＨＲＨ自身あるいは［Ｄ −Ｔｒｐ６］ＬＨＲＨ（シャホーら、　Ｒｅｃｕｅｉｌ　ｄｅＭＩ！ｄｉｃｉｎ ｅ　Ｖ！１ｒｉｎａｉｒｅ、　１６１　、１３３−１４５（１９８５）を参照の こと）のようなＬＨＲＨの類似体をもとにした公知のワクチン製剤を使用した場 合には、しばしば変わりうる。たとえば、全くもってワクチン接種にはほとんど 反応しない動物にワクチンの接種をする場合がある。雄豚臭の発生を阻止するた めに若い雄豚にワクチン接種を行う場合、非常に大きい豚の集団でなくてさえも 、雄豚臭がいかなる場合（生後３５週まで）でも発生しない程度にまで、すべて の豚で撃丸の発育を遅延させることが、良好なワクチンに対して要求される。公 知のワクチン製剤は、この要求には合致しない。

このことはまた、米国特許４，６０８，２５１号に記述の免疫原性のあるＬＨＲ Ｈワクチンにも適合する。その中で提案されるワクチンは、（Ｃ）　Ｋ　Ｗ　Ｓ 　Ｙ　Ｇ　Ｌ　ＲＰ　Ｇ＠の式を有するノナペプチドあるいはデカペプチドをも とにしたものであるか、あるいはアミン末端システィンを経ての結合により生成 可能であり、次式 ％式％ を満足させるデカペプチドの二量体をもとにしたものである。この二量体は、単 量体ペプチド類よりも有効性が高いものとは思われない。

国際特許出願　Ｗ○　８８１０５３０８には、５個、６個あるいは７個のアミノ 酸の長さを有するＬＨＲＨの不完全ペプチド、特にアミン末端ｐＧｌｕあるいは カルボキシ末端Ｇ　１　ｙ−ＮＨ２からなるペプチドをもとにしたＬＨＲＨワク チンが提案されている。このような不完全ペプチドの実例としては、（−文字コ ードで示されているが）＃Ｅ　ＨＷ　Ｓ　Ｙ、＃Ｅ　ＨＷ　Ｓ　ＹＧ　、＃Ｅ　 ＨＷ　Ｓ　Ｙ　Ｇ　Ｌ　、ＨＷ　ＳＹ　Ｇ　Ｌ　Ｒ，Ｗ　Ｓ　Ｙ　Ｇ　Ｌ　Ｒ， ＳＹ　Ｇ　Ｌ　ＲＰ　Ｇ＠およびＹＧＬ ＲＰ　Ｇ＠が挙げられる。しかしながら、これらの不完全ペプチドに基づくワク チンはまた、前に述べた欠点を有している。

驚くべきことに、ＬＨＲＨタンデム構造を有するペプチド、すなわち１個の後に もう１個が配列した２個以上のＬＨＲＨ系列から成るペプチドをもとにした場合 、より良好で特により信頼性の高いワクチンが得られることがいまや見出された ものである。

その結果、本発明は最初にタンデム中に２個以上のＬＨＲＨ系列を含有すること を特徴とするペプチドに関するものである。

本発明によれば、好ましくは次の一般式（左側がアミノ末端アミノ酸であり、右 側がカルボキシ末端アミノ酸である）に従うタンデム中に２個以上のＬＨＲＨ系 列を有することを特徴とするペプチドである。

Ｚｌ−Ｇｌｘ−Ｈｉｓ−ＴＲＰＩ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ− Ｐｒｏ　［−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｘ−Ｇ　１　ｎ−Ｈｉ　ｓ　−Ｔｒｐ２−Ｓｅｒ−Ｔ ｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏコ　ｎ−Ｇｕｙ−Ｚ２ ここでアミノ酸は三文字コードで選定されており、ＴｒｐｌとＴ’ｒｐ２はトリ プトファン（Ｔｒｐ）かあるいはホルミル化トリプトファン（Ｎ（インドール） −ホルミル−トリプトファン）であり、ｎは１以上の値の番号であり、Ｘは直接 結合かあるいはアミノ酸ＧｌｙおよびＧｉｎの間にあるスペーサー基であり、Ｚ 　１−Ｇ　１　ｘは１個以上の付加アミノ酸が尾に付いたｐＧｌｕ（ピログルタ ミン酸）かあるいはＧｉｎのいずれがであり、そしてＧｌｙ−２２は１個以上の 追加のアミノ酸が尾に付いたＧ　ｌ　ｙ−ＮＨ２があるいはＧｌｙのいずれかで ある。

この一般式で、Ｘはアミノ酸のグリシンとグルタミンの間の直接結合であっても かまわない、すなわちこれらのアミノ酸が中間に連鎖（通常のペプチド結合を通 じての）がなくて直接相互結合しているのである。事実このことは好ましいこと ではあるが、本発明はよたＬＨＲＨ系列がスペーサーを通じて相互結合している ペプチドから成っている。スペーサー基の性質は１個以上のアミノ酸から、より 短いかあるいは長い炭化水素連鎖および他の化合物の基または分子へと大きく変 化してもかまわない。

上記の一般式で、Ｚｌ−ＧｌｘはｐＧｌｕ（ピログルタミン酸）を表示するのが 好ましいが、また１個以上の追加のアミノ酸から成る尾に結合したＧｉｎを表示 することも可能で、これはたとえばペプチドがキャリヤーの蛋白質に結合するの に使用するためである。

上記の一般式で、Ｇｕｙ−２２はたとえばＧｌｙ−ＮＨ２または１個以上の追加 のアミノ酸がら成る尾に結合したＧｌｙを表示するが、これはたとえばペプチド がキャリヤーの蛋白質に結合するのに使用するためである。好ましくは、Ｇｌｙ −Ｚ２はＧ　］　］ｙ−Ｃｙｓ−ＮＨを表示し、Ｃ末端システィンはペプチドが キャリヤーの蛋白質と結合できるように付加されている。

さらにまた本発明によれば、次の一般式（左側がアミノ末端アミノ酸であり、右 側がカルボキシ末端アミノ酸である）で表示されるタンデム中に２個以上のＬＨ ＲＨ系列を有することを特徴とするペプチドが好ましい。

ｐＧｌｕ−Ｈｉ　５−Ｔｒｐｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ− Ｐｒｏ　［−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌ　ｎ−Ｈｌ　５−Ｔｒｐ２−３ｅｒ　−Ｔｙｒ−Ｇ ｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ］ｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｈ２ ここでアミノ酸は三文字コードで表示され、ＴｒｐｌとＴ　ｒ　ｐ　２はＴｒｐ かあるいはＮ−ホルミル−Ｔｒｐのどちらかであり、そしてｎは１以上の値を有 する番号である。

そのような好ましいペプチドの具体例として、次式（左側がアミノ末端アミノ酸 であり、右側がカルボキシ末端アミノ酸である）で表示されるタンデム中に２個 のＬＨＲＨを有するペプチドが挙げられる。

ｐＧｌ　ｕ−Ｈｉ　ｓ−Ｔｒｐｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ− Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｈｉ　ｓ−Ｔｒｐ２−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅ ｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ２ここでアミノ酸は三文字コードで 選定され、そしてＴｒｐ　１とＴｒｐ２はＴｒｐかあるいはＮ−ホルミル−Ｔｒ ｐのどちらがである。

本発明はさらに、免疫原性のある形態にした本発明によるペプチドから成ること を特徴とする組成物にも基づいている。熟練労働者が周知のように、それ自身で は免疫原性のない物質を免疫原性のある形態に変換するさまざまな方法が存在し ている。最初の可能性としては、本発明のペプチドを適当なキャリヤーの蛋白質 に結合することである。化学結合するためには、ＣあるいはＮ末端を適性に使用 することが可能である。同業者は完全にどの結合形式が望ましいか、そしてどの キャリヤー蛋白質が望ましいかを知っている。これに関連しては、たとえば上記 の米国特許４，６０８゜２５１および国際特許ＷＯ８８１０５３０８を参照され たい１本発明によれば、蛋白質と本発明のペプチドとの免疫原性のある配合体か ら成ることを特徴とする組成物が好ましいものである。もう１つの可能性として は、ペプチドを架橋によりさらに大なる複合体に転換することが、あるいは（よ り大きい）蛋白質の一部として遺伝子組替えＤＮＡ操作によってペプチドを表現 することである。それゆえ本発明はまた、免疫原性のある複合体かあるいは本発 明のペプチドの属する免疫原性のある遺伝子組替え蛋白質から成る組成物に基づ いている。

もちろん本発明はまた、１個以上の免疫補佐剤と組合せた本発明による組成物か ら成ることを特徴とするワクチンすなわち治癒力のある製剤に基づいている。適 当な免疫補佐剤は同業者に公知であり、たとえばＣＦＡ　（完全フロイント補佐 剤）およびＩＦＡ（不完全フロイント補佐剤）から成立っている。

本発明はさらに、哺乳動物にＬＨＲＨに対する免疫性を付与する方法にも関する ものであり、この方法は該哺乳動物に本発明のワクチンかあるいは治癒力のある 製剤によってワクチン接種を行うことを特徴としている。このようなワクチン接 種を行う理由はすでに上記で示されており、人体医学で前立腺癌や乳癌の処置お よびある形態の脳下垂体の悪性腫瘍の処置のための使用、獣医学でのさまざまな 使用、そして牧畜でのあらゆる使用などがその例である。特別の使用が豚の肉質 の改良方法におけるものであり、これは該豚が本発明のようなワクチン製剤でワ クチン接種を受けることを特徴としている。

本発明を次の実用例を参照することによって詳しく説明する。

４１コ 若い雄豚の３グループ（１グループ当たり５頭）に生ｆ＆（０日）ＬＨＲＨのワ クチン接種を行った。このワクチンは、Ｃ末端システィンを通じてキャリヤー蛋 白質ＫＬＨ（！ＩＩ穴笠貝ヘモシアニン）に結合したペプチドから成立つもので あった。

この結合は、ＭＢＳ　（化合物ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシコハ ク酸イミドエステル；ゲイセンら、ＰＮＡＳ、８１．３９９８−４００２　（１ ９８４）を参照のこと）によって行われたものである。

使用したペプチドは次のとおりである。

グループにＬＨＲＨ 式＃Ｅ　ＨＷ　Ｓ　Ｙ　Ｇ　Ｌ　ＲＰ　Ｇ　Ｃ＠グループＵ：［Ｄ−Ｔｒｐ６コ ＬＨＲＨ式＃Ｅ　ＨＷ　Ｓ　Ｙ　［Ｄ−Ｔｒｐｌ　Ｌ　ＲＰ　Ｇ　Ｃ＠グループ ■：タンデムＬＨＲＨ 式＃Ｅ　ＨＷ　Ｓ　Ｙ　Ｇ　Ｌ　ＲＰ　Ｇ　Ｑ　ＨＷ　ＳＹ　Ｇ　Ｌ　ＲＰ　Ｇ 　Ｃ＠ ペプチドは、１ｍｌのＣＦＡ（１ｍｌのＣＦＡ中に１ｍｌのペプチド−ＫＬＨの 溶液）中でＫＬＨ（１ｍｇのペプチドを１ｍｇのＫＬＨに加える）に結合させた 後、乳状にした。このエマルジョンは、０日そしてまた８週間後に筋肉内に注射 した。２回目のワクチン接種の間はＩＦＡを使用した。

対照グループ（グループ■）には、ただキャリヤー蛋白質（ＫＬＨ）と補佐剤に よりワクチン接種を行ったのみであった。

０日、４週間後、８週間後そして１２週間後に、畢丸の大きさを測定した。１７ 〜１８週間後に動物の屠殺を行った。最初のワクチン接種の１２週間後に、豚の 血清中のテストステロン（１１丸ホルモン）含有量の測定を行った。最初のワク チン接種の１３１日後に、豚の華丸と副撃丸の重量モして精嚢と尿道球部の重量 を測定した。４グループの結果は、次のとおりである。ＬＨＲＨによるワクチン 接種後（グループＩ）には、外部からの測定では５頭の動物のうち３頭の華丸が 対照（グループ■）のものより小さかった。この撃丸の小さい３頭のうち２頭の 華丸の大きさが外部からはもはや測定できないほど小さくなっていた。

［Ｄ−Ｔｒｐ６］　ＬＨＲＨのワクチン接種を行った（グループ■）動物のうち で、５頭中２頭の華丸は、対照動物のものよりも明らかに小さく、その１頭では 華丸はもはや測定不可能であった。

タンデムＬＨＲＨによるワクチン接種を行った５頭（グループ■）に関しては、 その毫丸がすべて対照動物のものより小さく、そのうち４頭では毫丸はもはや測 定不可能であった。

血清中のテストステロン含有量の平均値は、それぞれ次のとおりであった。

２．４７　（１，２１）ピコモル／ｍｌ（対照グループ、豚５頭）１．８９　（ ２，２４）ピコモル／ｍｌ（グループＩ、豚５頭）２．７２　（２，２３＞ピコ モル／ｍｌ（グループ■、豚５頭）０．５１　（０，０８＞ピコモル／ｍ１（グ ループ■、豚５頭）華丸と副畢丸の重量の平均値は、それぞれ次のとおりであっ た。

２８５　（５０）ｇ１５５　（１１）ｇ　（対照グループ、豚５頭）１１０　（ １２３）ｇ／２１　（１７）ｇ　（グループＩ、豚５頭）２２１　（８８）ｇ／ ４２　（１２）ｇ　（グループ■、豚４頭）２５　（１１）　ｇ／ｌ　１　（２ ）　ｇ　（グループ■、豚５頭）精嚢と尿道球部の平均値は、それぞれ次のとお りであった。

１３５　（４４）ｇ／１１９　（２４）ｇ　（対照グループ、豚５頭）４０　（ ８０）ｇ／３７　（４８）ｇ　（グループ■、豚５頭）１３７　（７１）ｇ／１ ３５　（５２）ｇ　（グループ■、豚４頭）５　（３）　ｇ／ｌ　５　（５）　 ｇ　（グループ■、豚４頭）括弧内の数値は標準偏差である。

成長の遅延あるいは皐丸の退化でさえも、豚のアンドロゲン生成能力の衰えと関 係づけられるし、また結果的には望ましくない雄豚の臭気の生成とら相関づけち れるから、本発明のタンデムＬＨＲＨワクチンでの処理を行ったグループ■にお いて、意図した完全な保護は実現したが、比較の目的で行ったグループＩとグル ープ■では部分的な保護が認められるに過ぎなかった。

国際調査報告 ｍｌ＠ｆｌｌａｌｌ１Ｍ−＾−−＋＋１．１ｌ−Ｎ−、ＰＣＴ／ＮＬ　９０１０ ００３７国際調査報告

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．タンデム中で２個以上のＬＨＲＨから成ることを特徴とするペプチド。
2. ２．次の一般式（左側にアミノ末端アミノ酸があり、右側にカルボキシ末端アミ ノ酸がある）で表示されるタンデム中に２個以上のＬＨＲＨ系列を有することを 特徴とするペプチド： 【配列があります】 ここでアミノ酸は三文字コードで選定され、Ｔｒｐ１とＴｒｐ２はＴｒｐかある いはＮ−ホルミル−Ｔｒｐのどちらかであり、ｎは１以上の値を有する番号であ り、Ｘは直接結合かあるいはアミノ酸のＧＩｙかＧｌｎの間にあるスペーサー基 のどちらかであり、Ｚ１−Ｇｌｘは１個以上の付加アミノ酸から成る尾に結合し たｐＧｌｕ（ピログルタミン酸）かあるいはＧｌｎのどちらかであり、そしてＧ ｌｙ−Ｚ２は１個以上の付加アミノ酸から成る尾に結合したＧｌｙ−ＮＨ２かあ るいはＧｌｙのどちらかである。
3. ３．次の一般式（左側にアミノ末端アミノ酸があり、右側にカルボキシ末端アミ ノ酸がある）で表示されるタンデム中に２個以上のＬＨＲＨ系列を含有すること を特徴とするペプチド： 【配列があります】 ここでアミノ酸は三文字コードで選定され、Ｔｒｐ１とＴｒｐ２はＴｒｐかある いはＮ−ホルミル−Ｔｒｐのいずれかであり、そしてｎは１以上の値を有する番 号である。
4. ４．次式（左側にアミノ末端アミノ酸があり、右側にカルボキシ末端アミノ酸が ある）で表示されるタンデム中に２個のＬＨＲＨ系列を含有することを特徴とす るペプチド： 【配列があります】 ここでアミノ酸は三文字コードで選定され、そしてＴｒｐ１とＴｒｐ２はＴｒｐ かあるいはＮ−ホルミル−Ｔｒｐのいずれかである。
5. ５．免疫原性のある形態にした特許請求の範囲１〜４のいずれかによるペプチド から成ることを特徴とする組成物。
6. ６．特許請求の範囲１〜４のいずれかによる蛋白質とペプチドの免疫原性のある 配合体から成ることを特徴とする組成物。
7. ７．特許請求の範囲１〜４のいずれかによるペプチドが所属する免疫原性のある 複合体から成ることを特徴とする組成物。
8. ８．特許請求の範囲１〜４のいずれかによるペプチドが所属する免疫原性のある 遺伝子組替え蛋白質から成ることを特徴とする組成物。
9. ９．１個以上の免疫補佐剤と結合する特許請求の範囲５〜８のいずれかによる組 成物から成ることを特徴とするワクチンまたは治癒力のある製剤。
10. １０．哺乳動物に特許請求の範囲９によるワクチン製剤によるワクチン接種を行 うことを特徴とする該哺乳動物にＬＨＲＨに対する免疫性を付与する方法。
11. １１．豚に特許請求の範囲９によるワクチン製剤によるワクチン接種を行うこと を特徴とする該豚の肉質を向上させる方法。