JPH04503968A - 磁気応答性螢光ポリマー粒子及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 磁気応答性螢光ポリマー粒子及びその利用光里坐立立 本発明は、磁気応答性螢光ポリマー粒子に関する。

主尻坐宜景 本発明は、１９８７年１０月２６日に提出された米国出願番号第１１３２９４号 の一部継続である。

イムノアッセイ、アフィニティー精製等のような多（の生物学的技術においては 、遊離の両分から結合した両分を分離する必要がある。磁性粒子が所望の分離を 促進するために使用されてきた。

磁性粒子は、種々の工程を用いて種々の粒子状の磁性体から作られており、様々 な特徴を有する。例えば、イケダ等の米国特許第４５８２６２２号にはゼラチン 、水溶性多糖類、リン酸ナトリウム及び強磁性体物質よりなる磁性粒子が開示さ れており、米国特許第４６２８０３７号及び第４５５４０８８号にはポリマー性 シランの被膜に囲まれた磁性金属酸化物コアよりなる磁性粒子が開示されており 、米国特許第４４５２７７３号には水溶性多糖類又は官能基を有するその誘導体 で被覆された強磁性酸化鉄（Ｆｅ３ｏ４）のコアを有する離散コロイドサイズの 粒子が開示されており、そしてＭａｎｓｆｉｅｌｄの米国特許第４２９７３３７ 号には粒子状担体としての磁性ガラス又は結晶含有材料が開示されている。

主恩■Ａ！ 本発明は、磁気応答性螢光ポリマー粒子（以下、磁性螢光粒子という）を、形状 および組成に間りなく直径で約１乃至１１００ｐの平均サイズを有する螢光ポリ マー性粒子から製造する新規の方法を提供する。本発明の螢光磁性粒子は、平均 サイズ約１μｍ以下の磁気応答性金属酸化物（以下、金属酸化物という）を先ず 製造し、次いで螢光ポリマー性コア粒子を金属酸化物を含有するポリマー層で被 覆することによって調製することができる。これらの螢光磁性粒子の表面は、所 望の表面特性を与えるために、ポリマー又は官能基を有するポリマーよりなる別 の層で更に被覆することができる。

これらの螢光磁性粒子のスペクトル特性は、単一の螢光染料又は数種の螢光染料 の組合せになる、種々の螢光染料を組み込んだコア粒子を使用することにより変 化させることができる。別に、本発明の螢光磁性粒子は、七ツマ−に可溶で且つ 非螢光ポリマー性コア粒子、金属酸化物及びモノマーの存在下にて重合条件に耐 えることができる単一の螢光染料又は数種の染料の組合せになる、種々の螢光染 料を組み込むことによって調製することができる。

本発明により製造される螢光磁性粒子はサイズにおいて単分散性であり、粗い表 面を有し、そして５％乃至５０％、好ましくは１０％乃至２５％の磁性金属酸化 物含量を有する。これらの螢光磁性粒子の螢光強度は、金属酸化物による陰影を 変化させるために磁性金属酸化物含量を変えることにより、及び／又は螢光ポリ マーコア粒子に組み込む螢光染料の量を変えることにより、調整することができ る。

これらの特徴を有する粒子は、イムノアッセイ及び広範な種類の生物医学的用途 に有用であることが見い出されている。これらの螢光磁性粒子は、抗原、抗体、 酵素又はＤＮＡ／ＲＮＡのような生物学的材料の受動的又は共有結合による結合 に使用することができ、また種々のタイプのイムノアッセイ、ＤＮＡ／ＲＮＡハ イブリダイゼーションアッセイ、アフィニティー精製、細胞分離２食作用及び他 の生物医学的用途のための固相として使用することができる。生物学的材料を結 合した又は結合していないこれらの螢光磁性粒子は、ウェル中に正しい数の粒子 が放出されていることを確認するための、及びアッセイ中における粒子の損失を チェックするためのマーカーとして働かせるために、種々のアッセイ用の非磁性 粒子に対して種々の比率で組み込むことができる。

旦力五登肌立 本発明の目的は次の通りである。

直ちに入手し得るポリマー粒子より磁気応答性螢光ポリマー粒子を容易に製造す る方法を開発すること。

中等度の沈降と速い磁気分離を有する磁気応答性螢光ポリマー粒子の製造方法を 開発すること。

生物学的材料を受動的吸着又は共有結合により結合させるための種々の表面電荷 と官能基を有する磁気応答性螢光ポリマー粒子の製造方法を開発すること。

これらの磁気応答性螢光ポリマー粒子を用いた医学的、生物学的、診断的及び産 業的用途を開発すること。

本発明の利点は次のものを含む。

約１乃至１００μｍのサイズの広範な種類の螢光ポリマーコア粒子を容易に磁気 応答性粒子に変えることができる。

用途に応じて金属酸化物の含量を変化させることができる。

共有結合のために表面を誘導体化して種々の官能基を導入することができる。

得られるポリマーに種々の表面特性を与えるために、種々のモノマーを最終的な 被覆に用いることができる。

架橋された又は架橋されていない磁気応答性螢光ポリマー粒子のいずれをも製造 することができる。

単分散性の磁気応答性螢光ポリマー粒子を製造することができる本発明の螢光磁 性粒子は、先ず約１μｍ以下の平均サイズの金属酸化物を製造することにより調 製することができる。金属酸化物は、２価又は３価の金属塩の混合物、好ましく は第１鉄及び第２鉄の硫酸塩又は塩化物と水酸化ナトリウム溶液との混合物を加 熱し沈澱させることにより製造する。金属酸化物の所望のサイズ及び磁気特性を 得るためには、２価の金属塩の３価の金属塩に対するモル比は０．５乃至２．０ ．好ましくは０．５乃至１．０の範囲で変化させることができる。２価の金属塩 の３価の金属塩に対するモル比が金属酸化物のサイズに影響することが観察され ている。すなわち、２“価の金属塩の３価の金属塩に対するモル比が小さい程、 金属酸化物のサイズは小さくなる。２価の金属塩の３価の金属塩に対するモル比 はまた得られる磁性粒子の色にも影響する。すなわち、モル比が小さい程得られ る磁性粒子の褐色がかった色は明るくなる。好ましくは、金属酸化物は超常磁性 又は常磁性であるが、強磁性金属酸化物もまた使用することができる。ただしこ の場合は洗浄の際磁気分離の代わりに遠心が用いられる。

他の２価の遷移金属塩１例えばマンガン、マグネシウム、コバルト２ニツケル、 亜鉛及び銅の塩で第１鉄塩を置き換えてもよい。

金属酸化物が沈澱した後、上澄のｐＨが中性となるまで、２５０×ｇの遠心で数 回それを洗浄する。金属酸化物を脱イオン水に再懸濁し、高速で機械的に攪拌し て金属酸化物結晶の凝集物を破砕する。更に２５０Ｘｇで遠沈しても金属酸化物 の全部がペレット状になってしまうことはない。小さいサイズの金属酸化物結晶 を含有する上澄を集め、ペレットは脱イオン水に再懸濁する。この操作を少なく とも３回又は大部分の金属酸化物が２５０Ｘｇではもはやペレット状にならなく なる迄繰り返す。この方法で得られる金属酸化物のサイズは通常２．０μｍ未満 である。大きい結晶を除くための１１００Ｘの低速遠心により、サイズが０．８ μｍ未満となる。

平均サイズ１．０μｍ以下の金属酸化物をモノマーと混合し、開始剤の存在下に １乃至１００μｍのサイズの螢光ポリマーコア粒子、好ましくはポリスチレン粒 子上に被覆する。少量の乳化剤の添加は粒子が膠着するのを防止する助けとなろ う。次いで螢光磁性粒子を、金属酸化物の脱落を防止するために、ポリマー、好 ましくはポリスチレンの保護層で被覆する。官能基を有する螢光磁性粒子を望む 場合には、生物学的材料を共有結合により結合させるだめのカルボキシル基、ア ミノ基又はヒドロキシル基のような官能基を付与するため、官能基を有するポリ マーよりなる別の層で磁性粒子を更に被覆することができる。

本発明に従って調製される螢光磁性粒子は図１に示すことができる。ここにおい て１は螢光コア粒子を表し、２は金Ｓ酸化物／ポリマー被覆を表し、３は保護ポ リマー被覆を表しそして４は官能基を有するポリマー被覆を表す。図２は、本発 明に従って調製される磁性粒子の０．０８乃至０．１μｍの切片の透過型電子顕 微鏡写真を示す。図３は、本発明に従って調製される６、８μｍの磁性粒子の走 査型電子顕微鏡写真を示す。図３ａは、１０００倍２図３ｂは５０００倍の拡大 である。

本発明において有用な螢光ポリマー性コア粒子は、小さい粒子の分散系として得 ることのできるものであって七ツマ−を吸収しそれによって該コア粒子表面上へ の金属酸化物とモノマーとの混合物の被覆を生ずることのできるものであれば、 いかなるポリマーよりなるものでもよい。コア粒子はいかなるサイズ及び形状で もよいが、好ましくは１乃至１００μｍのサイズであり球形の形状になるもので ある。単分散性コア粒子を使用するときは、得られる磁性粒子もまたサイズにお いて単分散性となろう。コア粒子は、ジビニルベンゼン等の架橋剤を用い又は用 いない乳化重合、懸濁重合又は他の重合手段によって得ることができる。コア粒 子を調製するのに使用することができるモノマーには例えば、スチレン、メグク リル酸メチル、ビニルトルエン等がある。千ツマ−の混合物もまた使用すること ができる。螢光コア粒子は、当業者に知られている種々の技術を用いて螢光染料 をコア粒子に組み込むことによって得ることができる。磁性金属酸化物による被 覆又は保護被覆に使用されるモノマーは、螢光コア粒子と同じタイプのものであ ってもなくてもよい。金属酸化物による被覆に使用するモノマーの螢光コア粒子 に対する重量比は、所望の金属酸化物／ポリマー層の厚さに応じて０．１乃至１ ２、好ましくは０．２乃至６とすることができる。第１鉄塩及び第２鉄塩の混合 物から調製される金属酸化物を被覆に使用する場合には、螢光コア粒子に対しモ ノマーを重量比約０．１乃至０．５にて使用するのが好ましい。しかしながら、 マンガン（２価）塩及び第２鉄塩の混合物から調製される金属酸化物を被覆に使 用する場合には、コア粒子に対するモノマー重量比は０．１乃至１２とすること ができる。結果として、通常の有機溶媒には不活性な架橋された螢光磁性粒子を める場合には、マンガン（２価）塩及び第２鉄塩の混合物から調製される金属酸 化物を、２％乃至１０％、好ましくは８％乃至１０％の重量比で架橋剤を含有し 、コア粒子に対するモノマー重量比が３乃至１２．好ましくは４乃至６であり、 螢光染料に対する七ツマー重量比が０．１乃至１０であるモノマーとともに使用 するのが好ましい。金属酸化物／ポリマー被覆の際にコア粒子に対し一層低いモ ノマー重量比（すなわち０．１乃至０．５）を使用する場合には、螢光磁性粒子 表面上に金属酸化物を一層固く付着させるためにポリマー被覆による保護層で、 得られる螢光磁性粒子を保護被覆するのが好ましい。しかしながら、コア粒子に 対し高い七ツマー比（すなわち３乃至１２）を使用する場合には、保護ポリマー による被覆は不要である。重合温度は５５゛Ｃ乃至９０℃、好ましくは５５“Ｃ 乃至６５°Ｃでよい。重合開始剤は、過硫酸カリウム等のような水溶性のもので も、過酸化ベンゾイル等のような水に不溶性のものでもよい。照射、イオン化等 の他の重合開始手段もまた使用することができる。意外なことに、被覆にマンガ ン（２価）塩及び第２鉄塩の混合物より調製される金属酸化物を使用した場合に は、何ら乳化剤を使用することなく螢光磁性粒子を製造できることが見出された 。しかしながら、被覆に第１鉄塩と第２鉄塩との混合物より調製された金属酸化 物を使用した場合には、ドデシル硫酸ナトリウム、Ａｅｒｏｓｏｌ　２２．Ｔｗ ｅｅｎ　２０又はＮｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０（ＮＰ　４０）のような乳化剤の少 量が金属酸化物／ポリマー被覆の間の粒子の過剰な凝集を防止するのに有用であ ることが見出された。同じ能力を有する他の乳化剤もまた使用することができる 。金属酸化物／ポリマー被覆の間種々の量の金属酸化物を使用することにより、 磁性金属酸化物の含量を５％乃至５０％。

好ましくは１０％乃至２５％の範囲で変化させることができる。金属酸化物の含 量を高めるために、金属酸化物／ポリマー多重被覆を行うこともできる。所望の 特性を有する磁性粒子が得られる限り、重合に通常使用される他の成分を加えて もよい。金属酸化物／ポリマー被覆のための成分は、金属酸化物／ポリマー被覆 工程の最初に全部一度に加えてもよく、又は段階的に加えてもよい。第１鉄塩と 第２鉄塩との混合物より製した金属酸化物を使用する場合には、成分を段階的に 加えるのが好ましい。成分は真空下又はアルゴン等の不活性ガス下において、機 械的攪拌、ゆすることその他の攪拌手段により混合することができる。官能基は 、金属酸化物／ポリマー被覆の間モノマーと官能基を有するモノマーとの混合物 を用いることによって又は官能基を有する七ツマ−の薄層で磁性粒子を最後に再 ”被覆することによって螢光磁性粒子の表面上に組み込むことができる。使用す る官能基を有するモノマーは、次のものの−又は混合物から選ぶことができる： 　メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸２−アミノエチル、メタク リル酸トリメチルアンモニウムメチルメトサルフェート、メタクリル酸ジメチル アミノエチル。

メタクリル酸、ウンデシレン酸、メチルプロペンスルホン酸、ウンデシレンアル コール、オレイルアミン、メタクリル酸グリシジル。

アクロレイン、グルタルアルデヒド等。磁性螢光粒子はまた、金属酸化物／ポリ マー被覆又は保護被覆に使用したのとは異なるポリマーの層で再被覆してそのポ リマーの表面特性を帯びさせることもできる。

、の１ 螢光イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、細胞 分離、酵素固定化及びアフィニティー精製等の種々の用途のための固相としての 種々の螢光磁性粒子の使用は、次の論文に例示するように、文献にて検討されて いる：　Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ。

Ｍａｒｃｈ　１９８２，１７２−１７９　（１９Ｂ２）；Ｐｏｕｒｆａｒｚａｎ ｅｈ、Ｔｈｅ　Ｌｉｇａｎｄ　Ｑｎａｒｔｅｒｌｙ、５（１）：４１−４７　（ １９８２）；Ｈａｌｉｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｕｎｎｉｌｌ、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃ ｒｏｂｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２：２−１０　（１９８０）；Ｍｏ５ｂａｃ ｈ　ａｎｄ　Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２７０：２５９−２６１　（１ ９７７）；Ｇｕｅｓｄｏｒ＋　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃ１１ｎｉｃ ａｌ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６１　（１）、２３−２７　（１９７８）、い（ つかの利用についてはまた、酵素固定化について米国特許第４１５２２１０号及 び第４３４３９０１号に、細胞分離につし）で米国特許第３９７０５１８号、第 ４２３０６８５号及び第４２６７２３４３号に、イムノアッセイについて米国特 許第４５５４０８８号、第４６２８０３７号及び第３９３３９９７号に夫々開示 されている。

ある用途には有用であるが他の用途には有用でない磁性粒子もある。例えば、米 国特許第４５５４０８８号及び第４６２８０３７号に開示されている磁性粒子は 、通常ポリマー性シランの被覆に囲まれた超常磁性金属酸化物コアよりなるが、 その大きな表面積と緩慢な沈澱速度のためイムノアッセイとアフィニティー精製 には有用であるが、骨髄洗浄のような細胞分離への利用には通さない。これら２ つの特許に開示された磁性粒子はサイズが小さいため、細胞懸濁液から全ての磁 性粒子を効果的に除去することは非常に困難である。更に、小さい磁性粒子はど 正常な細胞への非特異的結合がずっと高くなる。骨髄細胞の精製のための磁性粒 子の使用においては、磁性粒子はヒツジ抗マウスＩｇＧのような抗体で被覆され 、骨髄は癌細胞の表面抗原に対する数種のモノクローナル抗体の混合物で処理さ れる。磁性粒子は癌細胞にのみ結合し、強力な磁場を通過させることにより癌細 胞を正常細胞から分離することができる。洗浄された細胞は次いで患者に戻され る。

本発明の方法を用いることにより、広範な種類の生物医学的な利用のために、磁 性粒子のサイズ、表面積、金属酸化物１量及び表面特性を最適にすることができ る。本発明により製造される磁性粒子は、エンザイムイムノアツセイ、螢光イム ノアツセイ、ラジオイムノアッセイ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイフ゛リタ゛イゼーショ ンア・ンセイその他の診断用途のための固相として使用することができる。イム ノアッセイは、サンドインチアッセイや競合的結合ア・ンセイ等の当業者に明ら かな種々の形態で行うことができる。ＤＮＡ／ＲＮＡＡイフ゛リダイゼーション もまた、固相ノλイブリダイゼーション又しよ液相ノｈイブリダイゼーション等 の種々の形態で行うことができる。固相ハイブリダイゼーションの形態では、Ｄ ＮＡ又はＲＮＡプローフ゛（キャッチャ−プローブ）は磁性粒子に最初に固定化 される。固定イヒされたキャッチャ−プローブは、サンプル（サンプルＤＮＡ） からの相補的Ｄ　Ｎ　Ａ　ｔＪｆとハイブリッド化するのに使用される。最後に 、螢光性、放射性又は酵素トレーサーで標識されＤＮＡサンプルの別の部分とハ イブリッド化することのできる別のプローブ（シグナルプローブ）がシグナル発 生に使用される。液相ハイブリダイゼーション形態においては、キャッチャ−プ ローブとシグナルプローブは最初に液相でサンプルＤＮＡとハイブリッド化され 、次いで磁性粒子に固定化される。

代わりに、アッセイの感度を高めるために、シグナルプローブを１個又は数個の ビオチン基で標識することもでき、その場合ビオチン基を螢光性、放射性又は酵 素トレーサーでｔＨｌしたアビジンと結合させることにより、シグナルが検出さ れる。

イムノアッセイ及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションアッセイは、生物学 的サンプル中の薬物、ホルモン、抗体、ペプチド。

ＤＡＮ、ＲＮＡ、核酸、ウィルス抗原及び炭水化物等の広範な種類の物質を測定 するのに使用することができる。

本発明によって製造される磁性粒子もまた、アフィニティー精製、細胞分離、酵 素固定その他の生物医学的用途に使用することができる。細胞分離においては、 磁性粒子は、免疫反応又は非免疫反応による望まない細胞の除去（ネガティブ選 別）のため又は望む細胞の濃縮（ポジティブ選別）のために使用される。この原 理は、骨髄から癌細胞を除去（骨髄洗浄）し、組織培養のためにポジティブ又は ネガティブ選別によって細胞集団を精製し及び種々の細胞イムノアッセイを行う のに使用することができる。アフィニティー精製においては、磁性粒子は、抗体 、抗原、酵素、阻害剤、コファクター、１本鎖ＤＮＡ、結合タンパク、ハプテン 及び炭水化物等の広範な種類の生物学的材料の精製に、ポリアクリルアミドゲル 、セファロースゲル又は他のセルロースビーズのような慣用の固相に代えて使用 される。アフィニティー精製に類似の他の用途においては、磁性粒子は、抗血清 又は臨床サンプルから望ましくないタンパク質成分を交差吸着して除去するのに 使用することができる。酵素固定化においては、酵素活性を保持し固定化酵素の 再使用を可能にするよう、種々の結合手段によって磁性粒子上に酵素が固定化さ れる。固定化酵素を担持した磁性粒子は、炭水化物、アミノ酸及びタンパク質等 の広範な種類の材料を製造するための固定化酵素システムに通常使用されるガラ スピーズ、制御された多孔性ガラス、シリカゲル及びセルロースビーズ等の他の 固相に代えて使用することができる。

生物学的材料を担持した又は担持しないこれらの螢光磁性粒子は、正しい数の粒 子がウェル中に放出されていることを確認するため及びアッセイ中の粒子の損失 をチェックするためのマーカーとして役立てるために、実施例４２及び４３に述 べた種々のアッセイのための非磁性粒子に対し種々の比率で組み込むことができ る。

゛　これらの利用はいずれも、磁性粒子の大部分に共通な分離容易性８速い反応 速度及び大きな表面積によって効率化される。以下の実施例は本発明の多能性と 利点とを更に説明するために提供するものであり、その詳細を制限的に解釈して はならない。本発明の精神と範囲から逸脱することなく種々の均等物、変更物及 び修飾物の実施をなし得ることは明らかであり、そのような均等の具体例は本発 明に含められることが意図されているからである。

ヒ　のｉ　の−白・　法 スｌ］Ｌ−１ 機械的攪拌機、冷却器、温度計、滴下ロート及び加熱マントルを備えた三つ口丸 底フラスコに、４００ｄの脱イオン水中に０．３６℃ｍｏｌの硫酸第１鉄及び０ ．３６９ｍｏｌの硫酸第２鉄（Ｆｅ”／　Ｆ　ｅ　””比−１）の混合物を加え た。混合物を攪拌しつつ８５乃至９０°Ｃに加熱し、８５０ｄの６Ｎ水酸化ナト リウムを９０分かけて滴下して加えた。混合物を８５乃至９０℃にて更に１時間 攪拌し、室温まで冷却した。金属酸化物の沈澱を２５０Ｘｇにて１０分間遠心し た。透明な上澄を傾斜して捨てベレットを９００−の脱イオン水中に機械的攪拌 機を用いて再懸濁させた。この洗浄工程を６回又は上澄のｐＨが殆ど中性となる まで繰り返した。上澄を傾斜して捨て、２００ｄの脱イオン水に再懸濁させた。

２５０Ｘｇで更に遠心しても金属酸化物の沈澱の全てがペレットになることはな い。小さいサイズの金属酸化物結晶を含む上澄を集め、ベレットは２００ｉの脱 イオン水に再懸濁させた。この工程は少なくとも３回又は金属酸化物の殆どが２ ５０Ｘｇではもはやペレットを生じなくなるまで繰り返した。この方法で得られ る金属酸化物は通常２．０μｍ未満のサイズを有する。金属酸化物の懸濁液を合 わせ１１００Ｘで１０分間遠心した。上澄を回収し、０．８μｍ未満のサイズの 磁性金属酸化物の８．６％ｗ　／　ｖ懸濁液８００−を得た。

裏座１ ４００ｍの脱イオン水中０．２３５ｍｏｌの硫酸第１鉄、０．２９７ｍｏｌの硫 酸第２鉄（Ｆ　ｅ　”／　Ｆ　ｅ　””比＝０．７９）及び４８０Ｗ１の６Ｎ水 酸化ナトリウムを使用して磁性金属酸化物の２．８６％ｗ　／　ｖ懸濁液２００ ０ｄを得た以外は、実施例１の記載と同一の手順に従った。

叉蓋勇−１ ４００−の脱イオン水中０．１７８ｍｏｌの硫酸第１鉄、０．２９８ｍｏｌの硫 酸第２鉄（Ｆ　ｅ　”／　Ｆ　ｅ　””比＝０．５９）及び５２０ｄの６Ｎ水酸 化ナトリウムを使用して磁性金属酸化物の２．９８％ｗ　／　ｖ懸濁液１５００ ｄを得た以外は、実施例１の記載と同一手順に従った。

１隻五−土 ４００ｄの脱イオン水中０．１５ｍｏｌの硫酸第１鉄、０．２７６ｍｏ　Ｉの硫 酸第２鉄（Ｆ　ｅ”／Ｆ　ｅ””比＝０．５４）及び５２０ＩＩＩｌの６Ｎ水酸 化ナトリウムを使用して磁性金属酸化物の６．８８％ｗ　／　ｖ懸濁液７００ｄ を得た以外は、実施例１の記載と同一手順２２５ｍの脱イオン水中０．１１６ｍ ｏｌの硫酸ブンガン、０゜１４６ｍｏｌの硫酸第２鉄（Ｍ　ｎ”−／　Ｆ　ｅ　 ””比＝０．７９）及び２４０ｄの６Ｎ水酸化ナトリウムを使用して磁性金属酸 化物の１゜８％ｗ　／　ｖ懸濁液１７００Ｉ１１を得た以外は、実施例１の記載 と同一手順に従った。

６００ｄの脱イオン水、６ｄのスチレン及び、実施例１の記載に従って調製した ８、６％ｗ／ｖの磁性金属酸化物８０ｄの混合物を密封された瓶に加えた。瓶を 吸引して約５Ｑｒｐｍで５５°Ｃのオーブン９１時間回転した。混合物に１２ｇ の過硫酸カリウム及び５％ｗ　／　ｖの４．０μｍポリスチレン粒子８５０ｄを 加えた。瓶を再び密封し、吸引して１時間回転し、そして２％のドデシル硫酸ナ トリウム５０Ｍ１を加えた。更に５時間経過後、混合物に６ｍのスチレン及び１ ０ｇの過硫酸カリウムを加えた。混合物を更に１５時間回転し、２層にしたチー ズクロスで濾過し、磁気的に分離して上澄が透明になるまで脱イオン水で数回洗 浄した。得られた磁性粒子を脱イオン水に再懸濁させて１．６１！とし、約１１ ％の磁性金属酸化物含量を有し４．３μｍの平均サイズを有する２、５％ｗ／ｖ ！ＱＳ液を得た。

ス［ 実施例６の記載に従って調製した２、５％ｗ／ｖの磁性粒子１゜６！を、１ｇの ドデシル硫酸ナトリウム、１０ｇの過硫酸カリウム及び、４ｄのメタノール中に ０．９８−のウンデシレン酸とｏ、。

２ｄのジビニルベンゼンとを含有する溶液を加えることによりカルボキシル化し た。混合物をぞ封した瓶中に加え、吸引して約６Ｏｒｐｍで５５℃のオーブン中 ５時間回転した。得られたカルボキシル磁性粒子を磁気的に分離し、上澄が透明 になる迄脱イオン水で数回洗浄し、た。カルボキシル磁性粒子を脱イオン水に再 懸濁させて６８０ｄとし、約１１％の磁性金属酸化物含量を有し４１．３μｍの 平均サイスを有する５、８％ｗ　／　ｖ懸濁液を得た。

支１− ６００ｄの脱イオン水、、６ｄのスチレン及び、実施例１の記載に従って調製り 、た８、６％ｗ　／　ｖの磁性金属酸化物８０ｄを密封した瓶中に加えた。瓶を 吸引して約６０ｒｐｍで５５°Ｃのオーブン中１時間回転した。混合物に１２ｇ の過硫酸カリウム及び４．７８％Ｗ／Ｖの６．１８ｍポリスチレン粒子８５０ｄ を加えた。瓶を再び密封し、吸引して５時間回転し、そして６Ｉｄ、のスチレン 及び１０ｇの過硫酸カリウムを加えた。混合物を更に１５時間回転し、２層にし たチーズクロスで濾過し、磁気的に分離しそして上澄が透明になるまで脱イオン 水で数回洗浄した。得られた磁性粒子を１．　５１！、の脱イオン水に再懸濁さ せ、１ｇのドデシル硫酸ナトリウム、Ｌｏｇの過硫酸カリウム及び、４Ｍ１のメ タノール中に０．９８ｄのウンデシレン酸と０．０２ｍのジビニルベンゼンとを 含有する溶液を加えることによりカルボキシル化した。混合物を密封した瓶中に 加え、吸引して約６Ｏｒｐｍで５５°Ｃのオーブン中５時間回転した。得られた カルボキシル磁性粒子を磁気的に分離して上澄が透明になる迄脱イオン水で数回 洗浄した。カルボキシル磁性粒子を脱イオン水に再懸濁させて８００＋ｄとし、 約１１．６％の磁性金属酸化物含量を有し６．８μｍの平均サイズを有する４、 ３％懸濁液を、得た。

１差■−ユ ６００−の脱イオン水、６ｄのスチレン及び、実施例１の記載に従って調製した ８、６％ｗ　／　ｖの磁性金属酸化物６０ｄを含む混合物を三つ日丸底フラスコ に加え、アルゴン雰囲気下６７℃にて１時間攪拌した。混合物に１２ｇの過硫酸 カリウム及び５％ｗ　／　ｖの２．７μｍポリスチレン粒子４７０ｄを加えた。

混合物を６７°Ｃにて１時間攪拌し、２％のドデシル硫酸ナトリウム３０ｄを加 えた。アルゴン雰囲気下６７°Ｃにて更に５時間攪拌した後、混合物に６ｄのス チレン及び６ｇの過硫酸カリウムを加えた。混合物をアルゴン雰囲気下６７°Ｃ にて更に１５時間攪拌し、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気的に分離しそ して上澄が透明になるまで脱イオン水で数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イ オン水に再懸濁させて９００Ｉｄとし、０．６ｇのドデシル硫酸ナトリウム、１ ０ｇ・の過硫酸カリウム及び、２．４ｄのメタノール中に０．５９８ｄのウンデ シレン酸と０．０１２ｄのジビニルベンゼンとを含有する溶液を加えることによ りカルボキシル化した。混合物を密封した瓶中に加え、吸引して約６０ｒｐｍで ５５℃のオーブン中５時間回転した。得られたカルボキシル磁性粒子を磁気的に 分離しそして上澄が透明になるまで脱イオン水で数回洗浄した。カルボキシル磁 性粒子を再懸濁させて５００ｄとし、約１４％の磁性金属酸化物含量を有し４． ０μｍの平均サイズを有する６、５％ｗ　／　ｖの懸濁液を得た。

実１■−上度 ６００ｄの脱イオン水、６ｍｌのスチレン及び、実施例１の記載に従って調製し た８、６％ｗ　／　ｖの磁性金属酸化物６０Ｍ１を含む混合物を密封した瓶に加 えた。瓶を吸引して約６０ｒｐｍで５５°Ｃのオーブン中１時間回転した。混合 物に１２ｇの過硫酸カリウム及び５％ｗ　／　ｖの２．７８ｍポリスチレン粒子 ４７０Ｊｄを加えた。瓶を再び密封し、吸引して１時間回転しそして２％のドデ シル硫酸ナトリウム３０ｍを加えた。更に５時間経過の後、６−のスチレン及び １０ｇの過硫酸カリウムを混合物に加えた。混合物を更に１５時間回転し、２層 にしたチーズクロスで濾過し、磁気的に分離し、上澄が透明になる迄脱イオン水 で数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イオン水に懸濁させて５００ｄとし、約 １４％の磁性金属酸化物含量を有し４．０μｍの平均サイズを存する６、８％ｗ ／ｖの懸濁液を得た。

実施±−土土 １８０ｄの脱イオン水、２ｄのスチレン及び、実施例１の記載に従って調製した ８、６％ｗ　／　ｖの磁性金属酸化物２０ｄを含む混合物を密封した瓶中に加え た。瓶を吸引して約６Ｏｒｐｍで５５℃のオーブン中１時間回転した。混合物に ４ｇの過硫酸カリウム及び、実施例１０の記載に従って調製した６、８％ｗ／ｖ の磁性粒子（３，０μｍ、金属酸化物含量１４％）１６０ｄを加えた。瓶を再び 密封し、吸引して１時間回転しそして２％のドデシル硫酸ナトリウム１０ｄを加 えた。更に５時間の後、２ｄのスチレン及び２ｇの過硫酸カリウムを混合物に加 えた。混合物を更に１５時間回転し、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気的 に分離しそして上澄が透明になる迄脱イオン水で数回洗浄した。得られた磁性粒 子を脱イオン水に懸濁して１６０ｄとし、約１９％の金属酸化物含量を有し４． ２μｍの平均サイズを有する７、７８％ｗ　／　ｖの懸濁液を得た。

１隻斑−土ｌ ９０ｄの脱イオン水、ｌｄのスチレン及び、実施例゛１の記載に従って調製した ８、６％ｗ　／　ｖの磁性金属酸化物ｌＯ−を含有する混合物を、密封した瓶中 に加えた。瓶を吸引して約６０ｒｐｍで５５°Ｃのオーブン中１時間回転した。

混合物に１ｇの過硫酸カリウム及び、実施例１１の記載に従って調製した７、７ ８％ｗ　／　ｖの磁性粒子（３，２μｍ、金属酸化物含量１９％）８０ｄを加え た。瓶を再び密封し、吸引して４時間回転し、２％のドデシル硫酸す１−リウム ５Ｒ１を加えた。更に５時間経過の後、Ｉｄのスチレン及び１ｇの過硫酸カリウ ムを混合物に加えた。混合物を更に１５時間回転し、２層にしたチーズクロスで 濾過し、磁気的に分離しそして上澄が透明になる迄脱イオン水で数回洗浄した。

得られた磁性粒子を脱イオン水に再懸濁させて１６０ｄとし、約２３％の金属酸 化物含量を有し４．５μｍの平均サイズを有する４゜５％の懸濁液を得た。

実ｆｌ−ユ」ユ ４００ｒｘｌの脱イオン水、１．９２−のスチレン、０．０８ｄのジビニルベン ゼン、４ｇの過硫酸カリウム、２０ｇの２［）Ｏ〜４００メツシュの４％ジビニ ルベンゼン架橋ポリスチレンビーズ及び、実施例１に従って調製した８、６％ｗ 　／　ｖの磁性金属酸化物１０ｄを含有する混合物を密封された瓶中に加えた。

瓶を吸引して約６Ｏｒｐｍで５５°Ｃのオーブン中１５時間回転した。混合物を 沈澱させ上澄を傾斜して捨てた。得られた磁性ビーズを２００ｄの脱イオン水に 再懸濁させ再度沈澱させた。上澄が透明になる迄数回この工程を繰り返した。得 られた磁性ビーズを２００７の脱イオン水に再懸濁させ、０．１ｇのドデシル硫 酸ナトリウム、２．０ｇの過硫酸カリウム、０．４８ａｆのスチレン及び０．０ ２ｄのジビニルベンゼンを加えた。瓶を再び密封し、吸引して約６Ｏｒｐｍで５ ５°Ｃのオーブン９１時間回転しそして、０．４−のメタノール中に０．０９８ ．ｗｊ２のウンデシレン酸と０．００２ｄのジビニルベンゼンとを含有する溶液 を加えた。混合物を更に４時間回転し、前述のように重力により沈降させること によって洗浄した。水を濾過により除去しカルボキシル磁性ビーズを乾燥して２ ００〜４００メツシユのカルボキシル磁性ビーズ２０ｇを得た。

１藷■−１土 １００ｍ１の脱イオン水、０．５−のスチレン、２ｇの過硫酸カリウム、５％ｗ 　／　ｖの４．０層ｍポリスチレン粒子７５．ｄ及び、実、雄側４の記載に従っ て調製した６、８８％ｗ　／　ｖの磁性金属酸化物１Ｏｄを含有する混合物を密 封した瓶中に加えた。瓶を吸引して約６Ｑｒｐｍで５５°Ｃのオーブン中１５時 間回転した。混合物を、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気的に分離しそし て上澄が透明になる迄脱イオン水で数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イオン 水に再懸濁させて］、５０ａｆとし、約１４％の金属酸化物含量を有し４．３μ ｍの平均サイズを有する２、５％ｗ　／　ｖ懸濁液を得た。

１隻例−土旦 実施例４の記載に従って調製した６、８８％ｗ　／　ｖの磁性金属酸化物２０ｄ を使用して約１８％の金属酸化物含量を有し４．３μｍの平均サイズを有する２ 、５％ｗ　／　ｖの懸濁液１６０ｄを得た以外は、実施例１４の記載と同じ手順 に従った。

災旅±−上旦 ２０００ｉｄ、の脱イオン水、１３−のスチレン及び、実施例３の記載に従って 調製した２、９８％ｗ　／　ｖの磁性金属酸化物５５０ｄを含有する混合物を密 封した瓶中に加えた。瓶を吸引して約６Ｏｒｐｍで５５°Ｃのオーブン９１時間 回転した。混合物に２０ｇの過硫酸カリウム及び１０％Ｗ　／　Ｖの３．０μｍ ポリスチレン粒子９５０ｄを加えた。瓶を再び密封し、吸引して約６０ｒｐｍで １時間回転しそして２％のドデシル硫酸ナトリウム６０ｄを加えた。更に５時間 の経過の後、８戚のスチレン及び１０ｇの過硫酸カリウムを混合物に加えた。混 合物を更に１５時間回転し、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気的に分離し そして上澄が透明になるまで脱イオン水で数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱 イオン水に再懸濁して３０００Ｒ１とし、約１２％の磁性金属酸化物含量を有し ３．２μｍの平均サイズを有する３、３８％ｗ　／　ｖの懸濁液を得た。

スＩＩＬＬ 実施例１６の記載に従って調製した磁性粒子（３，２μｍ、３゜３８％ｗ　／　 ｖ　、金属酸化物含量１２％）１５０ＨＩｌ、２ｄ！の１％　ＮＰ４０，０．５ −のメタクリル酸メチル又はスチレン、１ｇの過硫酸カリウム及び、官能基を有 するモノマーであるメチル硫酸メタクリル酸トリメチルアンモニウムエチル（４ ０％水溶液）を含有する混合物を密封した瓶中に加えた。瓶を約６Ｏｒｐｍで５ ５°Ｃのオーブン９４時間回転した。混合物を、２層にしたチー・ズクロスで濾 過し、磁気的に分離しそして上澄が透明になる迄脱イオン水で数回洗浄した。得 られた磁性粒子を脱イオン水中に再懸濁させて２００戚とし２１表面上にトリメ チルアンモニウム官能基を有する磁性粒子の２．５％ｗ　／　ｖ懸濁液を得た。

災施班−上主 官能基を有するモノマーであるメタクリル酸２−アミノエチル１ｄを使用して表 面上にアミノ基を有する磁性粒子の２．５％ｗ　／　ｖ懸濁液２００ｄを得た以 外は、実施例１７に記載されたと同じ手順に従った。

裏座±−上度 官能基を有するモノマーであるメタクリル酸２−ヒドロキシエチル１−を使用し て表面上にヒドロキシル基を有する磁性粒子の２゜５％ｗ　／　ｖ懸濁液２００ 雄を得た以外は、実施例１７に記載されたと同じ手順に従った。

実上土−１■ モノマーとして１−ビニル−２−ピロリジノン１ｍｉ！を使用して表面上にポリ ビニルピロリジノンを有する磁性粒子の２．５％ｗ　／　ｖ懸濁液２００ｄを得 た以外は、実施例１７の記載と同じ手順に従った。

スＪＪ江−λ」− 官能基を有するモノマーであるメチルプロペンスルホン酸】ｇを使用して表面上 にスルホン酸基を有する磁性粒子の２．５％ｗ　／　ｖ懸濁液２００ｄを得た以 外は、実施例１７の記載と同じ手順に従った。

亥１」　２２ 官能基を有するモノマーであるメタクリル酸ジメチルアミノエチル１戚を使用し て表面上にジメチルアミノ基を有する磁性粒子の２．５％ｗ　／　ｖ懸濁液２０ 　Ｄ　ｔｔｔｉを得た以外は、実施例１７の記載と同じ手順に従った。

裏座撚−Ｉニ ア、０％ｗ　／　ｖの２，１１μｍポリスチレン粒子２０−５実施例５の記載に 従って調製した１、８％ｗ／ｖの金属酸イビ物１００ｄ。

５０ｍの脱イオン水及び、１．５ａｒ１のスチレン中に０．１５ｇの過酸化ベン ゾイルを含む溶液を含有する混合物を密封した瓶に加えた、瓶を吸引して約６０ ｒｐｍで５５°Ｃのオーブン中１５時間回転した。混合物を、２層にしたチーズ クロスで濾過し、磁気的に分離しそして上澄が透明になる迄脱イオン水で数回洗 浄した。得られた磁性粒子を脱イオン水に再懸濁させて２００−とじ、約１６． ８％の金属酸化物含量を有し３．６μｍの平均サイズを有する５、０％Ｗ／Ｖの 懸濁液を得た。

５の記載に従って調製した１、８％ｗ　／　ｖの金属酸化物１００ｄ。

５０ｄの脱イオン水及び、６．７５ｄのスチレン中に０．１５ｇの過酸化ベンゾ イルと０．７５ｄのジビニルベンゼンとを含む溶液を含有する混合物を密封した 瓶中に加えた。瓶を吸引して約６０ｒｐｍで５５°Ｃのオーブン中１５時間回転 した。混合物を、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気的に分離しそして上澄 が透明になる迄脱イオン水で数回洗浄した。得られた架橋磁性粒子を脱イオン水 に再懸濁させて２００ｄとし、約１６．８％の金属酸化物含量を有し３．６μｍ の平均サイズを有する５、０％ｗ　／　ｖの懸濁液を得た。

こうして調製した架橋磁性粒子はサイズが均一であり通常の有機溶媒例えば、ア セトン、アセトニトリル及びジメチルホルムアミド等に対して不活性であること が判明した。

裏座■−主１ ７．０％ｗ　／　ｖの２．１１８ｍポリスチレン粒子２０ｄ、実施例５の記載に 従って調製した１、８％ｗ　／　ｖの金属酸化物１５０ｄ及び、６．７５’−の スチレン中に０．１５ｇの過酸化ベンゾイルと０．７５戚のジビニルベンゼンと を含む溶液を含有する混合物を密封された瓶中に加えた。瓶を吸引して約６０ｒ ｐｍで５５°Ｃのオーブン中１５時間回転した。混合物を、２層にしたチーズク ロスで濾過し、磁気的に分離しそして上澄が透明になる迄脱イオン水で数回洗浄 した。得られた架橋磁性粒子を脱イオン水に再懸濁させて２００ｄとし、約２３ ％の金属酸化物含量を有し４．０μｍの平均サイズを有する５、４％ｗ　／　ｖ の懸濁液を得た。こうして調製した架橋磁性粒子はサイズが均一で通常の有機溶 媒例えば、アセトン、アセ１−二トリル及びジメチルホルムアミド等に対して不 活性であることが判明した。

９．１６％ｗ／ｖの３．２μｍポリスチレン粒子１５ｄ、実施例５の記載に従っ て調製した１、８％ｗ　／　ｖの金属酸化物１００１ｉ。

５５Ｍ１の脱イオン水及び、６．７５１１ｄｌのスチレン中に０．１５ｇの過酸 化ベンゾイルと０．７５ｄのジビニルベンゼンとを含むｉ液を含有する混合物を 密封した瓶中に加えた。瓶を吸引して約６Ｏｒｐｍで５５℃のオーブン中１５時 間回転した。混合物を、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気的に分離しそし て上澄が透明になるまで脱イオン水で数回洗浄した。得られた架橋磁性粒子を脱 イオン水に再懸濁して２００ａｉとし、約１６．８％の金属酸化物含量を有し５ ．５μｍの平均サイズを有する４、７％ｗ　／　ｖの懸濁液を得た。

こうして調製した架橋磁性粒子はサイズが均一で通常の有機溶媒例えばアセトン 、アセトニトリル及びジメチルホルムアミド等に対し不活性であることが判明し た。

の記載に従って調製した１、８％ｗ／ｖの金属酸化物１００Ｊｄ、４０Ｉｄの脱 イオン水及び、６．７５−のスチレン中に０．１５ｇの過酸化ベンゾイルと０． ７５ａｄのジビニルベンゼンとを含む溶液を含有する混合物を密封した瓶中に加 えた。瓶を吸引して約６Ｏｒｐｍで５５°Ｃのオーブン中１５時間回転した。混 合物を、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気的に分離しそして上澄が透明に なるまで脱イオン水で数回洗浄した。得られた架橋磁性粒子を脱イオン水に再懸 濁して２００ｄとし、約１６．９％の金属酸化物含量を有し６．７μｍの平均サ イズを有する４、５％ｗ　／　ｖの懸濁液を得た。こうして調製された架橋磁性 粒子はサイズが均一で通常の溶媒例えば、アセトン、アセトニトリル及びジメチ ルホルムアミド等に対して不活性であることが判明した。

１１斑−２８ ７，０％ｗ　／　ｖの２．１１４ｍポリスチレン粒子２０Ｉ！！１．実施例５の 記載に従って調製した１、８％ｗ／ｖの金属酸化物１００ａｄ。

５０−の脱イオン水及び、６ｄのスチレン中に０．１５ｇの過酸化ベンゾイルと ０．７５ｍのランデシレニルアルコールと０．７５ｊｌｌｅのジビニルベンゼン とを含む溶液を含有する混合物を密封した瓶中に加えた。瓶を吸引して約６０ｒ ｐｍで５５°Ｃのオーブン中１５時間回転した。混合物を、２層にしたチーズク ロスで濾過し、磁気的に分離しそして上澄が透明になる迄脱イオン水で数回洗浄 した。得られた架橋ヒドロキシル磁性粒子を濾過し乾燥して約１６．８％の金属 酸化物含量を有し３．９μｍの平均サイズを有する９ｇの粉末を得た。こうして 調製された架橋ヒドロキシル磁性粒子はサイズが均一で通常の溶媒例えば、アセ トン、アセトニトリル及びジメチルホルムアミド等に対し不活性であることが判 明した。

１　への　・　Ｓの　Ａ ’　２９ ８０ＩＩｉの瓶中に、実施例１７の記載に従って調製した４、３μｍの５．０％ ｗ　／　ｖカルボキシル磁性粒子３０ｄを加えた。粒子を磁気的に分離し５０ｄ のリン酸緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ５，５）に再懸濁させた。粒子懸濁液に２０■ のウシ血清アルブミン及び１００■の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ ロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加えた。混合物を室温にて２時間回転しそ して磁気的に分離した。粒子を８０ｄのリン酸緩衝液で１回洗い、そしてリン酸 緩衝食塩水（０，１Ｍ、ＰＩ（７，０）に再懸濁させて７５ｄとし、２．０％Ｗ 　／　ｖの懸濁液を得た。

ウシ血清アルブミンを受動的吸着により磁性粒子に結合させるためにはＥＤＣを 使用しないこと以外は同じ手順に従った。

１隻±−主１ ４ｄのバイアル中に、実施例７の記載に従って調製した４、３μｍの５．０％ｗ 　／　ｖカルボキシル磁性粒子１ｄを加えた０粒子を磁気的に分離し２ｄのリン 酸緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ５，５）で１回洗いそして２ｄの同緩衝液で再懸濁さ せた。粒子懸濁液に、１．４■／−のヤギ（Ｇ　ｔ、　）抗マウス（Ｍｓ）Ｉｇ Ｇ　−１４０ｄ及び１０■の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル） カルボジイミドを加えた。バイアルを室温にて２時間回転した。粒子を磁気的に 分離し、２ｄのリン酸緩衝液で１回洗いそして２Ｍ１）リン酸緩衝食塩水（０， １Ｍ、ＰＨ７，０）で再懸濁させて２ｄとし２．５％Ｗ　／　Ｖのヤギ抗マウス ＩｇＧ被覆磁性粒子を得た。モノクローナルな又はポリクローナルな他の種類の 抗体もまた同じ手順によってカルボキシル磁性粒子に結合させることができる。

ヤギ抗マウスＩｇＧその他の種類の抗体を受動的吸着によって磁性粒子に結合さ せるためには、ＥＤＣを使用しないこと以外は同じ手順に従った。

実Ｕ ４ｄのバイアル中に、実施例２９の記載に従って調製したウシ血清アルブミン被 覆磁性粒子（４，３層ｍ、２％ｗ／ｖ）２．５ｄを加えた。粒子を磁気的に分離 し、２ｄのリン酸緩衝液（０，ＬＭ。

ｐ）（５，５）に再懸濁させて２−とした。混合物に１０μ！のマウス抗Ｂ赤血 球表面抗原（２０■／ｄ）及び１■の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ ロピル）カルボジイミドを加えた。混合物を室温にて２時間回転した。粒子を磁 気的に分離し、リン酸緩衝液で１回洗いそして２ｉのリン酸緩衝食塩水（０，１ Ｍ、ｐＨ７，０）に再懸濁させ、２．５％ｗ　／　ｖの懸濁液を得た。

１星五−盈Ｉ ４０μｌのマウス抗Ａ赤血球表面抗原（５■／ｍｅ）を使用して２．５％ｗ　／ 　ｖの懸濁液２ｄを得た以外は、実施例３１の記載と同じ手順に従った。

ｔ　いた　゛　Ｊ・Ｉ 裏庭班−主主 Ａとラベルした５ｍｍＸ６５ｍｍの試験管中に、実施例３２の記載に従って調製 した２、５％ｗ　／　ｖのマウス抗Ａ被覆磁性粒子２５μｌを加えた。Ｂとラベ ルした別の試験管中には、実施例３１の記載に従って調製した２、５％ｗ　／　 ｖのマウス抗Ｂ被覆磁性粒子２５μ！を加えた。双方の試験管に、パンク赤血球 を等張緩衝食塩水で１対１００に希釈して調製した１％バンク赤血球５０μ！を 加えた。指で数回軽くたたいて試験管を振り磁石の上に置いた。結果は以下に要 約した通りであった。

（以下余白） 血液型 Ａ　Ｂ　ＯＡＢ 試験管　Ａ　＋−−十 試験管　Ｂ−＋−＋ ここに士は陽性反応を示す。すなわち、赤血球は対応する抗体を被覆した磁性粒 子によって凝集し、その結果磁気分離後は試験管の上澄は透明であった。他方、 陰性反応の上澄は、赤血球と抗体被覆磁性粒子との間での凝集がないため、磁気 分離後も濁ったままである１　いたイムノア・・セイ ！［土 ２ｄの微量遠心管中に、６％Ｗ　／　Ｖの３μｍカルボキシル磁性粒子１ａｔｌ ！を加えた。粒子を１１００Ｏｒｐで３分間遠心した。上澄を吸引し、粒子を酢 酸緩衝液中で５乃至１１００ｕ／ｄの組み換えＨＢｃＡｇ　ｌｄとともに振り混 ぜることによって再懸濁させた。管を室温にて２時間回転させそして前記のよう に遠心した。上澄を吸４１シ、粒子を、酢酸緩衝液と２乃至１０％の正常動物血 清とを含む再被覆溶液ｌｌ１１に再懸濁させた。管を室温にて２乃至１６時間回 転させそして前記のように遠心した。上澄を吸引し、遠心と再懸濁とによりＩＩ ＩＪ／、の等張緩衝食塩水（ＴＢＳ）で３回洗浄した。最後に、粒子をｌｄのＩ ＢＳで再懸濁させ２乃至８°Ｃにて貯蔵した。

１施！−１１ ９６ウエルのミクロ滴定板の最初の２列に、実施例３４の記載に従って調製した ０、２５％ｗ　／　ｖのＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）被覆磁性粒子２０μ２ を加えた。サンプルの調製は、ＨＢｃＡｇ陽性血清を陰性血漿で種々に希釈し、 更に各サンプルを標本希釈緩衝液（ＳＤＢ）で１：１００に希釈することにより 行った。ＳＤＢは、リン酸緩衝液、タンパク質安定化剤、界面活性剤、及び抗菌 剤を含有するものであった。粒子を含有するウェルに、各最終のサンプル希釈液 ５０μ２を加えた。３７°Ｃで３０分間インキュベーションの後、粒子を磁気分 離機で２分間分離し、塩類と界面活性剤とを含有する洗浄用緩衝液２００ｕＥで ３回洗浄した。粒子を含む各ウェルに、塩類、タンパク質安定化剤、グリセロー ル、界面活性剤及び抗菌剤を含有する希釈液中のヤギ抗ヒ）　Ｉ　ｇＧ−Ｂ−Ｄ ガラクトシダーゼ結合体（０，５ｄｇ＃り５０μ！を加えた。３７°Ｃで１５分 間のインキュベーションの後、粒子を分離し上記のようにして３回洗浄し、３０ μβのＩＢｓに再懸濁させた。粒子を黒いミクロ滴定板（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）の 最初の２列に移した。粒子を含む各ウェルに、４−メチルウンベリフェリル−Ｂ −ガラクトピラノシド（ＭＵＧ、Ｓｉｇｍａ）を含有する溶液１００ｕＡを加え た。板を３７°Ｃにてインキュベートし、螢光強度を、励起側３６５　ｎｍ及び 螢光側４５０ｎｍのフィルターを備えた螢光濃度分析機（ＦＣＡ。

Ｐａｎｄｅｘ）を用い５分間隔で１０倍利得にセットして測定した。５分間隔で の螢光強度の増大を任意に定めた螢光単位（ＡＦＵ）にて記録し表１に示した。

ｃ以下余白） 表　１ １　：　１００　２２６８７ １　：　１０００　５９３３ １：５０００　１５１６ １　：ａｏｏｏ　８３５ １　：　１００００　６３９ １：１５０００　．４９５ １　：　２００００　４２７ １　：２５０００　３０７ マウス抗ＨＢｓＡｇのカルボキシル磁性粒子への結合は実施例３０と同様であっ た。

黒の９６ウエルのミクロ滴定板（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）のウェルに、０．２５％ｗ 　／　ｖの３．２Ｍｍ７ウス抗ＨＢｓＡｇ被覆カルボキシル磁性粒子２０ｔｔ１ ．を２列に加えた。磁性粒子を含むウェルに、種々の量のＨＢｓＡｇを含有する 無処理血漿又はＨＢｓＡｇ陰性血漿１００ｔＩｆｆｉを加えた。３７℃にて３０ 分間インキュベージジンした後、磁気分離機により粒子を２分間分離し、塩類と 界面活性剤とを含有する洗浄用緩衝液１００μ！で１回洗った。粒子を含む各ウ ェルに、塩類、タンパク質安定化剤、グリセロール、界面活性剤及び抗菌剤を含 有する希釈液中のマウス抗ＨＢｓＡｇ−Ｂ−ガラタトシダーゼ結合体２０μ２を 加えた。３７°Ｃにて１５分間インキュベーションの後、粒子を分離し上記のよ うにして５回洗浄した。粒子を含む各ウェルに、４−メチルウンベリフェリル− Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵＧ、Ｓ　ｉ　ｇｍａ）を含有する溶液５０μ Ｅを加えた。板を３７℃でインキュベートし、螢光強度を、励起側３６５１　ｍ 及び螢光側４５０ｎｍのフィルターを備えた螢光濃度分析機（ＦＣＡ、ｐａｎｄ ｅｘ）により５分間隔で１０倍利得に設定して測定した。５分間隔での螢光強度 の増大を任意に定めた螢光単位（ＡＦＵ）にて記録し、表■に示した。

１．０　１１４９ ０．５　４５５ ０．２５　２１８ ０．１２５　１１８ 陰性　１４ ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　ＩＢ／Ｈ−９細胞（Ｇａ　Ｉ　Ｉ　ｏ株）からのＨＴＶ−１ 抗原を、実施例３４の記載と同様の手順により３．６μｍのカルボキシル磁性粒 子に結合させた。

９６ウエルのミクロ滴定板のウェルに、０．２５％Ｗ　／　ＶのＨＩＶ被覆磁性 粒子２０μβを２列に加えた。粒子を含むウェルに、リン酸緩衝液、タンパク質 安定化剤、界面活性剤及び抗菌剤を含有する標本希釈緩衝液（ＳＤＢ）に１　： 　１００に希釈した陽性、境界及び陰性の各標本５０μ２を加えた。３７°Ｃに て３０分間のインキュベーションの後、磁気分離機により２分間粒子を分離しそ して塩類と界面活性剤とを含有する洗浄用緩衝液１００μ！で３回洗浄した。粒 子を含む各ウェルに、塩類、タンパク質安定化剤、グリセロール、界面活性剤お よび抗菌剤を含有する希釈液中のヤギ抗ヒト−Ｂ−ガラクトシダーゼ（約０．５ μｇ／ｄ）結合体５０μｌを加えた。３７°Ｃにて１５分間インキュベーション した後、上記のようにして粒子を４回洗浄した。粒子を黒のミクロ滴定板（Ｄｙ ｎａｔｅｃｈ）に移した。粒子を含む各ウェルに、４−メチルウンベリフェリル −Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵＧ、Ｓ　ｉ　ｇｍａ）を含有する溶液１０ ０μ２を加えた。板を３７°Ｃにてインキュベートし、螢光強度を、励起側３６ ５ｎｍ及び螢光側４５０ｎｍのフィルターを備えた螢光濃度分析機（ＦＣＡ、Ｐ ａｎｄｅｘ）を用いて５分間隔で２５倍利得に設定して測定した。５分間隔での 螢光強度の増大を任意に定めた螢光単位（ＡＦＵ）にて記録し表■に示、した。

表■ 抗ＨＩＶ　ＡＦＵ（５分） 標本　２個のウェルの平均値 陽性対照　９４６２ 境界標本　５２７ 陰性対照　８６ 実施例７の記載に従って調製した４、３μｍのカルボキシル磁性粒子を、リン酸 緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７，７）で洗浄し超音波処理し、７０％エタノールで １０分間滅菌し、ＰＢＳで３回洗浄し、０゜５■／ｄのアフィニティ精製ヒツジ 抗マウスイムノグロブリン抗体（ＳＡＭ）とともに３．３■抗体７１００■粒子 の比率で４°Ｃにて４８時間インキュベートした。使用前に、抗体被覆磁性粒子 をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に所望の濃度に再懸濁させた。

ヒト組織培養ｃＡＬＬａ陽性ＮＡＬＭ−１６白血病細胞をＰＢＳで洗い懸濁させ た。一部は抗体による処理をしなかった（−ＭｏＡｂ）。他の部分を２つの抗Ｃ Ｄｌ０モノクローナル抗体及び１つの抗ＣＤ９モノクローナル抗体で４℃にて３ ０分間処理しく＋Ｍ　ｏ　Ａｂ）、ＰＢＳで洗い、ＰＢＳにて３．５Ｘ１０ｂ個 ／ｄに調整した、一方には抗体処理細胞（＋ＭｏＡｂ）を含み他方には無処理細 胞（−ＭｏＡｂ）を含む２本の試験管に、ＳＡＭ被Ｎｆｌｉ性粒子を開始時の細 胞に対する粒子の比率が４５となるように加えた。管を４°Ｃにて３０分間回転 した。粒子を磁気分離機で分離した。上澄を回収し遠心して残存細胞を回収した 。ベレ７）を１００μｒのトリバンブルーに再懸濁させて全細胞数を数えた。結 果を表■に示した。

表■ 粒子／細胞比　＋／−ＭｏＡｂ細胞　回収細胞　消耗％０　＋７．６２Ｘ１０’ 　０　（対照）４５　＋　２．８９ｘ１０’　９６．２４５　７．３３Ｘ］、０ ’　４．６ ！ｌＬ３ユ ５７６戚の脱イオン水、９ｄのスチレン及び、実施例１の記載に従って調製した ３、０％ｗ／ｖの磁性金属酸化物２８８ａｆを含有する混合物を密封した瓶に加 えた。瓶を吸引して約６Ｏｒｐｍで６５±４℃のオーブン中１時間回転した。混 合物に、１８ｇの過硫酸カリウム及び５％ｗ　／　ｖの４．０μｍ螢光ナイル赤 ポリスチレン粒子７１２ｄを加えた。瓶を再び密封し、吸引して１時間回転し、 そして２．０％のドデシル硫酸ナトリウム４５ｍを加えた。更に５時間経過の後 、９ｄのスチレン及び９ｇの過硫酸カリウムを混合物に加えた。混合物を更に１ ５時間回転し、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気的に分離し、そして上澄 が透明になるまで脱イオン水で数回洗浄した。得られた螢光磁性粒子を脱イオン 水に懸濁して１５８０−とじ、約１１．０％の磁性金属酸化物含量を有し４．４ μｍの平均サイズを有する３、０％ｗ　／　ｖ懸濁液を得た。

丈施斑−↓■ 実施例３９の記載に従って調製した３、０％ｗ　／　ｖの螢光ナイル赤磁性粒子 １．５８０４２を、１．．２３ｇのドデシル硫゛酸ナトリウム、１７．５０ｇの 過硫酸カリウム及び、４．８ｄのメタノール中に１．２−のウンデシレン酸と０ ．０２４−のジビニルベンゼンとを含有する溶液の添加によりカルボキシル化し た。混合物を密封した瓶に加え、吸引して約６０　ｒ　ｐ　ｍで５５〜６５°Ｃ のオーブン中５時間回転した。得られた螢光ナイル赤カルボキシル磁性粒子を磁 気的に分離し、そして上澄が透明になるまで脱イオン水で数回洗浄し２だ。螢光 ナイル赤カルボキシル磁性粒子を脱イオン水に懸濁させて８５０ｄとし約１１． ０％の磁性金属酸化物含量を存し４．４μｍの平均サイズを有する５、０％ｗ　 ／　ｖ懸濁液を得た。

丈廉鋏−４１− １１．２８％ｗ　／　ｖの２．２４μｍポリスチレン粒子１２．４ｍ、実施例５ の記載に従って調製した２、７８％ｗ　／　ｖの金属酸化物６５ｄ、７５ｍの脱 イオン水及び、６．７５ｍのスチレン中に０゜１８ｇの過酸化ベンゾイルと７■ のナイル赤と０．７５ｄのジビニルベンゼンとを含む溶液を含有する混合物を密 封した瓶に加えた。

瓶を吸引して約６Ｏｒｐｍで６０〜７０°Ｃのオーブン巾約１５時間回転した。

混合物を、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気的に分離し、そして上澄が透 明になるまで脱イオン水で数回洗浄した。

得られた螢光架橋磁性粒子を脱イオン水に懸濁させて１７０ｄとし、約１６．５ ％ｗ　／　ｖの金属酸化物含量を有し４．　０層ｍの平均サイズを有する５、４ ％ｗ　／　ｖの懸濁液を得た。

ｌ施±−土ｌ 螢光及び無螢光カルボキシル磁性粒子（はぼ同じ金属酸化物含量を有する）への ヤギ抗ＨＢｓＡｇの結合は実施例３０と同様であった。

黒の９６ウエルのミクロ滴定板（Ｐａｎｄｅｘ（登録商標）〕のウウニに、４． ０μｍの、ヤギ抗ＨＢｓＡｇを被覆した螢光及び無螢光カルボキシル磁性粒子の 完全な混合物（比率１：１）、濃度０、】２５％ｗ　／　ｖ　、の２０μｌを加 えた。磁性粒子を含むウェルに、種々の量のＨＢｓＡｇを含む無処理血漿又はＨ ＢｓＡｇ陰性血漿の１００μｌを加えた。３７°Ｃにて３０分間インキュベーシ ョンした後、粒子を磁気分離機により分離し１００μ２の洗浄用緩衝液で２回洗 浄した。粒子を含む各ウェルに希釈緩衝液中のマウス抗ＨＢｓＡｇとＢ−ガラク トシダーゼとの結合体２０μＥを加えた。３７℃で１５分間のインキュベーショ ンの後、粒子を分離し上記のよう慨螢光カルボキシル拵性粒子を同時にア、・７ セイ乙こおいて使用ｔ７たＤＩにして６回洗浄した。粒子を含むウェルに、４− メチルウンベリフェリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭｔＪＧ、Ｓｉｇｍａ ）を含有する溶液５０μｌを加えた。板を３７°Ｃでインキュベートし、螢光強 度を、励起側５２５ｎｍ及び螢光側５８０ｎｍのフィルター（チャンネルＣ１対 照チャンネル）を備えた螢光濃度分析機（ＦＣＡ、Ｐａｎｄｅｘ　（登録商標） 〕を用い、８分間隔で２５倍利得に設定して測定した。チャンネルＣの螢光強度 を任意に定めた螢光単位（ＡＦＵ）で記録し表（１）に示した。結果は、螢光磁 性粒子が空のウェルを検出し、また平均螢光強度に満たないウェルをも表示して いることを示している。これはピペット操作の誤りかアッセイ中の粒子の損失に よるものである。

１２空　４８３２−４９００　４８６７＊１７ウエルの平均ＡＦＵ　３１４８０ に対しけ１個のウェルのＡＦＵが１９４５８であることは、当該ウェルの粒子の 損失又はアンセイ当初に少ない数の粒子しか放出されなかったことを示す。

菅１１１璽＾　４ 外は、実施例４２の記載と同じ手順に従った。螢光強度はチャンネｌ　厘シー　 − ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３ａ ＦＩＧ、　３ｂ 要　余り　書 本発明は、磁気応答性の金属酸化物を含有するポリマー層で均一に被覆されたポ リマーコア粒子よりなる、磁気応答性の螢光ポリマー粒子を製造するための新規 の方法を提供する。１乃至１００μｍの範囲のサイズの広範な種類のポリマー粒 子をコア粒子として使用して磁気応答性ポリマー粒子に変化させることができる 。これらの磁気応答性ポリマー粒子の表面は、官能基を有する別のポリマー層で 更に被覆することができる。これらの磁気応答性螢光ポリマー粒子は、抗原、抗 体、酵素又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド等の生物学的材料を受動的又は共有結 合により結合させるのに使用することができ、種々のタイプのイムノアッセイ、 ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド化ブローブアンセイ、アフィニティー精製、細胞分 離その他の医学的２診断的及び産業上の用途のための固相として使用することが できる。

国際調査報告

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．均一なサイズ分布と磁性含量とを有する単分散性の螢光磁性粒子であって、 （ａ）モノマーを吸着し得る内側螢光コアポリマー粒子と磁気応答性金属酸化物 及びポリマーの組合せとからなり、該ポリマーは前記内側コアポリマー粒子に吸 着され得るモノマーよりなるものであり、 （ｂ）前記金属酸化物及びポリマーの組合せは前記内側コア粒子を均一に被覆し ており、そして、 （ｃ）前記磁性粒子が、均一なサイズ分布と均一な磁性含量とを有し溶液中で単 分散性のものであることを特徴とする粒子。
2. ２．該螢光コア被覆粒子が螢光染料を組み込んだポリスチレン又は架橋ポリスチ レンよりなるものである、請求項１に記載の粒子。
3. ３．前記磁性応答性金属酸化物及びポリマーの組合せに係るポリマーが、ポリス チレン，架橋ポリスチレン又は官能基を有するポリスチレンよりなる群より選ば れるものである、請求項１に記載の粒子。
4. ４．均一サイズ分布と磁性含量とを有する単分散性の螢光磁性粒子であって、 （ａ）モノマーを吸着し得る内側螢光コアポリマー粒子と磁気応答性金属酸化物 及びポリマーの組合せとからなり、該ポリマーは前記内側コアポリマー粒子に吸 着され得るモノマーよりなるものであり、 （ｂ）前記金属酸化物及びポリマーの組合せは前記内側コア粒子を均一に被覆し ており、 （ｃ）前記磁気応答性金属酸化物及びポリマーの組合せを被覆する外側ポリマー を有し、そして （ｄ）前記磁性粒子が、均一なサイズ分布と均一な磁性含量とを有し溶液中で単 分散性のものであることを特徴とする粒子。
5. ５．前記螢光コアポリマー粒子が螢光染料を組み込んだポリスチレン，架橋ポリ スチレン又は官能基を有するポリスチレンよりなるものである、請求項４に記載 の粒子。
6. ６．前記磁気応答性金属酸化物及びポリマーの組合せに係るポリマーが、ポリス チレン，架橋ポリスチレン又は官能基を有するポリスチレンよりなる群より選ば れるものである、請求項４に記載の粒子。
7. ７．均一なサイズ分布と磁性含量とを有する単分散性の螢光磁性粒子であって、 （ａ）モノマーを吸着し得る内側螢光コアポリマー粒子と磁気応答性金属酸化物 及びポリマーの組合せとからなり、該ポリマーは前記内側コアポリマー粒子に吸 着され得るモノマーよりなるものであり、 （ｂ）前記金属酸化物及びポリマーの組合せは前記内側コア粒子を均一に被覆し ており、 （ｃ）前記磁気応答性金属酸化物及びポリマーの組合せを被覆する外側ポリマー を有し、 （ｄ）前記外側ポリマー被覆を覆う官能基を有するポリマー層を有し、そして、 （ｅ）前記磁性粒子が、均一なサイズ分布と均一な磁性含量とを有し溶液中で単 分散性のものであることを特徴とする粒子。
8. ８．前記螢光コアポリマー粒子が、螢光染料を組み込んだポリスチレン又は架橋 ポリスチレンよりなるものである、請求項７に記載の粒子。
9. ９．前記官能基を有するポリマーが、生物学的材料と結合するためのカルボキシ ル，アミノ又はヒドロキシル官能基を提供する物質群より選ばれるものである、 請求項７に記載の粒子。
10. １０．均一なサイズ分布と磁性含量とを有する単分散性の螢光磁性粒子であって 、 （ａ）モノマーを吸着し得る内側螢光コアポリマー粒子と磁気応答性金属酸化物 及びポリマーの組合せとからなり、該ポリマーは前記内側コアポリマー粒子に吸 着され得るモノマーよりなるものであり、 （ｂ）前記金属酸化物とポリマーとの組合せは前記内側コア粒子を均一に被覆し ており、そして、 （ｃ）前記金属酸化物及びポリマーの組合せを覆う官能基を有するポリマーの層 を有し、前記磁性粒子が均一なサイズ分布と均一な磁性含量を有し溶液中で単分 散性のものであることを特徴とする粒子。
11. １１．前記螢光コアポリマー粒子が螢光染料を組み込んだポリスチレン又は架橋 ポリスチレンよりなるものである、請求項１０に記載の粒子。
12. １２．均一なサイズ分布と磁性含量とを有する単分散性の螢光磁性粒子であって 、 （ａ）モノマーを吸着し得る内側螢光コアポリマー粒子と、（ｂ）磁気応答性金 属酸化物及びポリマーの組合せとからなり、該ポリマーは前記内側コアポリマー 粒子に吸着され得るモノマーよりなるものであって１の螢光染料又は螢光染料の 組合せを含有しており、 （ｃ）前記金属酸化物及びポリマーの組合せは前記内側コア粒子を均一に被覆し ており、 （ｄ）前記磁性粒子が、均一なサイズ分布と均一な磁性含量とを有し溶液中で単 分散性のものであることを特徴とする粒子。
13. １３．均一なサイズ分布と磁性含量とを有する単分散性の螢光磁性粒子の製造方 法であって、 （ａ）螢光コアポリマー粒子を磁気応答性金属酸化物及びポリマーの組合せで均 一に被覆することよりなり、（ｂ）前記ポリマーが前記内側コアポリマー粒子に 吸着され得るモノマーよりなるものであることを特徴とする方法。
14. １４．前記磁気応答性金属酸化物が、超常磁性、常磁性又は強磁性金属酸化物よ りなる群より選ばれるものである、請求項１３に記載の方法。
15. １５．前記磁気応答性金属酸化物及びポリマーの組合せに係るポリマーが、ポリ スチレン，架橋ポリスチレン又は官能基を有するポリスチレンよりなる群より選 ばれるものである、請求項１３に記載の方法。
16. １６．均一なサイズ分布と磁性含量とを有する単分散性の螢光磁性粒子の製造方 法であって、 （ａ）螢光コアポリマー粒子を、磁気応答性金属酸化物と、前記内側コアポリマ ー粒子に吸着し得るモノマーよりなり且つ１の螢光染料又は螢光染料の組合せを 含有するポリマーとの組合せで均一に被覆し、そして、 （ｂ）前記磁気応答性金属酸化物とポリマーとの組合せをポリマーで被覆するこ とよりなる方法。
17. １７．前記外側のポリマー被覆が、ポリスチレン，架構ポリスチレン又は官能基 を有するポリスチレンよりなる群より選ばれるものである、請求項１６に記載の 方法。
18. １８．均一なサイズ分布と磁性含量とを有する単分散性の螢光磁性粒子の製造方 法であって、 （ａ）螢光コアポリマー粒子を、磁気応答性金属酸化物と、前記内側コアポリマ ー粒子に吸着し得るモノマーよりなるポリマーとの組合せで均一に被覆し、そし て、 （ｂ）前記磁気応答性金属酸化物とポリマーとの組合せをポリマーで被覆するこ とよりなる方法。
19. １９．分析物の存在又は濃度を測定するための方法であって、（ａ）螢光磁性粒 子であって、該螢光磁性粒子に担持された前記分析物に特異的なリガンドを有す るものを、液体標本と接触させて懸濁液を形成し、 （ｂ）十分な量の分析物が前記特異的リガンドと反応するまで前記懸濁液をイン キュベートし、 （ｃ）前記磁性粒子を前記懸濁液から分離し、（ｄ）前記分析物に特異的な第２ の標識されたリガンドを前記の分離した磁性粒子に加え、 （ｅ）十分な量の分析物が、前記分析物に特異的な前記第２の標識されたリガン ドと反応するまで該懸濁液をインキュベートし（ｆ）前記磁性粒子を前記懸濁液 から分離し、（ｇ）前記磁性粒子上の複合体形成を前記標識により検出又は測定 し、そして〜 （ｈ）標識されたリガンドの測定量と対照サンプルの分析物の測定量とを関係づ けることよりなり、前記螢光磁性粒子が前記工程の間存在する粒子の数をモニタ ーするために用いられるものである方法。
20. ２０．前記螢光材料が、ナイル赤，クマリン６，クマリン４，ローダミンＢ，ナ イル青，オキサジン７２５，オキサジン７５０又はこれらの螢光材料の１又は２ 以上の混合物よりなる群より選ばれるものである、請求項１９に記載の方法。
21. ２１．前記粒子の数が、前記粒子を前記液体標本に接触させるに先立ち螢光粒子 の螢光強度を測定することにより、及び前記螢光磁性粒子に結合した標識された リガンドの量を測定した後に螢光粒子の螢光強度を測定することにより、モニタ ーされるものである、請求項１９に記載の方法。
22. ２２．核酸標的分子中の特定の核酸配列の存在又は濃度を測定するための方法で あって、 （ａ）螢光磁性粒子であって該螢光磁性粒子に担持された前記標的分子の前記核 酸配列に相補的な核酸を有するものを、液体標本と接触させて懸濁液を形成し、 （ｂ）ハイブリッド化条件下にハイブリッド化を起こさせるに十分な時間前記懸 濁液をインキュベートし、（ｃ）前記螢光磁性粒子を前記懸濁液から分離し、（ ｄ）前記標的分子の前記核酸配列に相補的な第２の標識された核酸配列を加え、 （ｅ）ハイブリッド化条件下にハイブリッド化を起こさせるに十分な時間前記懸 濁液をインキュベートし、（ｆ）前記螢光磁性粒子を前記懸濁液から分離し、そ して、（ｇ）前記磁性粒子上の複合体の形成を前記標識により測定することより なり、前記螢光磁性粒子が前記工程の間存在する粒子の数をモニターするために 用いられるものである方法。
23. ２３．前記粒子の数が、前記粒子を前記液体標本に接触させるに先立ち螢光粒子 の螢光強度を測定することにより、及び前記螢光磁性粒子に結合した標識された リガンドの量を測定した後に螢光粒子の螢光強度を測定することにより、モニタ ーされるものである、請求項２２に記載の方法。
24. ２４．核酸標的分子中の特定の核酸配列の存在又は濃度を測定するための方法で あって、 （ａ）均一なサイズ分布と磁性含量とを有する単分散性の螢光磁性粒子であって 、 （ｉ）モノマーを吸着し得る内側コアポリマー粒子と磁気応答性金属酸化物及び ポリマーの組合せとからなり、該ポリマーが前記内側コアポリマー粒子に吸着さ れ得るモノマーよりなり且つ１の螢光染料又は螢光染料の組合せを含有するもの である粒子であり、 （ｂ）前記金属酸化物及びポリマーの組合せは前記内側コア粒子を均一に被覆す るものであり、 （ｃ）前記磁性粒子は、均一なサイズ分布と均一な磁性含量を有し溶液中で単分 散性のものであり、そして、（ｄ）前記螢光磁性粒子に担持された前記標的分子 の前記核酸配列に相補的な核酸を有するものを、 液体標本と接触させて懸濁液を形成することよりなる方法。