JPH04503456A - セルロースシンターゼオペロンの表現のための方法及び核酸配列 - Google Patents
セルロースシンターゼオペロンの表現のための方法及び核酸配列Info
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- JPH04503456A JPH04503456A JP2-506168A JP50616890A JPH04503456A JP H04503456 A JPH04503456 A JP H04503456A JP 50616890 A JP50616890 A JP 50616890A JP H04503456 A JPH04503456 A JP H04503456A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
セルロースシン −ゼオペロンの
のための び 1
発泗ヱI結m
本発明はタンパク質の製造についての組換DNA技術の分野に関連する。更に詳
しくは、本発明は細菌セルロースシンターゼオペロン、このオペロンの表現型及
び組換微生物におけるセルロースの製造のためのこのオペロンの利用方法に関す
る。
兄11すL最
セルロースは、紙の生産及び傷の手当用品を含む多数の有用な製造のための原料
として期待されている。セルロースは植物及び培養物における種々の微生物、例
えばアセトバクター (Acetobacter)属のセルロース生産細菌から
得られろる。
アセトバクターの特徴は、グラム陰性、即ち、0.6〜0.8μm X 1.0
−4μmの桿状菌である。これらは厳密には好気性、即ち、代謝が発酵性ではな
く、呼気性である。これは更−ス鎖又はミクロフィブリルは細胞壁上の細菌表層
部位で合成される。、xよ二5t<クノ一二によるセルロースの生産は、少なく
とも1930年代から黙然なる研究の課題であった。特に、ヱセトバク −ジ1
ム(Acetobacter zylinum)は、完全な細胞におけるセル
ロース合成機構の究明の達成のために広く研究されてし)る(Schramm
and He5trin+ (1954) J、 Gen、 Microbio
l、 11:123−129 )。
アセトバク −ジy ムにおけるセルロース合成についての酵素経路は研究され
ており、そしてグルコースからセルロース迄の全ての経路を含むものと見られる
本質的に4つの酵素的段階が、エヘーニヒンユし九メ、(A、χylinum)
の細胞遊離抽出物において特徴付けられる。これらには、グルコキナーゼによる
グルコースのリン酸化(Benziman、 et al、、(1972) J
、 Bacterial、、 111:325−3303 、ホスホグルコムタ
ーゼによるグルコース−6−リン酸からグルコース−1−リン酸への異性化(G
romet、 et al、、(1957) Bioches+、 J、+ 6
7:679−689 ;Frei−Roitman、Factors affe
cting the activity of phosphogluco餉u
tase and UDP−glucose pyrophosphoryla
se of Acetobac旦f M、 Sc、論文、the Hebrew
University of Jerusalem、 Jerusalem、
l5rael (1974)) ; UDGP−ピロホスホリラーゼによるウ
リジン5′−ジホスホグルコース(UDP−glc)の合成(Frei−Roi
tman (記載) ; 5w1sa、 Biosynthesisof Ce
1lulose in Acetobacter x l1nun、 Ph、
D、 g!を文:theHebrew University of Jeru
sale++、Jerusalem、l5rael (1978)) 、及びセ
ルロースシンターゼ反応が挙げられる。
常用のクロマトグラフィー技術を利用するA、キシリナム株由来のセルロースシ
ンターゼの精製の試みは特に成功していなかったが、しかし最近になってこの酵
素は明らかに精製され(P、 Ross and M、 Benziman (
1989) in Biosynthesisand Biodegradat
ion of Ce1lulose and Ce1lulose Mater
ials+(m) Wei+sar and Higler、 Marcel
Dekker、 Inc、 NY、版)、そして精製状態におけるその特性及び
構造が現在研究されている。
同様に、インビトロでのセルロース捕獲及びクロマトグラフィー技術によるセル
ロースシンターゼの精製の試みにより、83キロダルトン([d)ポリペプチド
の部分的精製がもたらされた(Lin and Brown、第10回セルロー
ス会II (Cellulose C。
nference) 1988年5月29日−6月2日、要約BGI、27頁)
。
この微生物におけるセルロース合成の生物学的機能は未だ明確でないが、細胞の
エネルギーバジエy ト(energy budjet)の少なくとも10%が
一時的に任意にセルロース生成に提供されるものと考えるなら[Weinhou
se、 Regulation of Carbohydrate metab
olism in Acetobacter x 1inu* Ph、 D、
thesis。
The )lebrew University of Jerusales+
、 Jerusalem、 l5rael(1977)) 、生合成系が複雑な
制御システムにより支配されることは驚くことではない。
唯一のこの経路独特の酵素、セルロースシンターゼは、セルロース形成において
掛かり合う工程−炭素利用に関連する代謝系の行き詰まり一を成し遂げ、それ故
厳格な制御コントロールのための第1の候補に必然的になるであろう。更に、細
胞遊離抽出物において示される通り、UDP−glcへと導く酵素のレベルはセ
ルロースシンターゼの活性と大いに関連し、従ってこれらがセルロース生合成に
おける速度制御工程を含んで成る説を強く支持する。
更なるセルロース合成の生化学の完全なる理解は、セルロース生産微生物の培養
物からのセルロースの、更に優れた生産性及び収率を促進せしめうる。培養物に
おける細菌細胞の増殖は、初期は指数的に観察できるが、しかしこの細胞は定状
増殖期に入るに従い遅くなる。大多数のセルロースは、細胞の数が最大時の発酵
における後期において生産されるが、しかしながら単位時間当りの一細胞により
作られるセルロースの量(比生産率)は発酵が進むに従って減少する。セルロー
スシンターゼ活性は、培養物における細胞が定状増殖期に到達するに従い、反応
速度は抑制されうるものと考えられる。
セルロース生産における1つの改良は、セルロース合成における速度制限段階を
取り除くことでありうり、これにより培養におけるセルロース比生産性において
見られる低下を防げる。
組換DNA技術は目的のタンパク質の生産のために、現在日常的に利用されてい
る。ところでこのような組換DNA技術を利用するためには、所望のタンパク質
、例えばセルロースシンターゼについてコード化する遺伝子を最初に単離しなく
てはならない。この仕事は特にコード化タンパク質の一次配列が未知の場合に困
難であり、更にセルロースシンターゼ活性を測定するための既知のアッセイも難
しい。
組換セルロースシンターゼを生産する能力は、セルロース極的には高められた細
菌培養物からのセルロース生産を提供する。
溌j廊と1粒
本発明はセルロース生合成に関連するオペロン、細菌セルロースシンターゼのタ
ンパク質についてコード化する、1又は複数の近接に結合し合う遺伝子について
のコードであるポリヌクレオチド、セルロースシンターゼの生産のために適する
表現ベクター、これらのベクターにより形質転換された組換宿主細胞、細菌セル
ロースシンターゼを生産するだめの方法、及び組換微生物におけるセルロースの
生産を高める方法を提供する。
更に詳しくは、本発明は、図1において示す多シストロン性ヌクレオチド配列に
より特徴付けられる、細菌セルロースシンターゼオペロンをコード化する、単離
された、自然のクローン化組換体又は合成のポリヌクレオチドを提供する。この
セルロースシンターゼオペロンは長さにおいておよそ9217塩基対(bp)で
あり、そして4つの遺伝子(本明細書ではrA、、rB、、r(、」及びrp、
で表わす)を含んで成る。
本発明は更に、宿主細胞におけるセルロースシンターゼを表現するための方法で
あって、この宿主細胞を細菌セルロースシンターゼオペロンと一体化している1
又は複数の遺伝子を含んで成る組換DNA表現型ベクターにより形質転換せしめ
(この遺伝子は細菌セルロースシンターゼの表現型のためのコントロール配列と
作動連結している)、そしてこの形質転換細胞をセルロースシンターゼの表現の
ために適する条件のちとで培養することを含んで成る方法を提供する。
本発明の表現ベクターの作製は、独立して複製せしめるか、又は異種のプロモー
ターをこのアセトバクター染色体に導入するように計画して天然セルロースシン
ターゼオペロンプロモーターを置換せしめるかのいづれかにある。
更に、本発明の他の11様は、組換微生物におけるセルロース生産を高めるため
の方法であって、適当な微生物をセルロースシンターゼオペロン由来の少なくと
も1種の遺伝子を含んで成るベクターにより形質転換せしめ、そしてこの形質転
換微生物をセルロース生産のために適する条件下で培養せしめることを含んで成
る方法を提供する。前に述べた通り、この染色体セルロースシンターゼプロモー
ターは、染色体レベルでセルロースシンターゼオペロンを過剰表現せしめるだめ
の異種プロモーターにより置き代われうる。
本発明の更なるUSは、セルロースシンターゼオペロンによりコード化される個
々のタンパク質を提供する。単離され人
た組換セルロー伶シンターゼBタンパク質はウリジン5′−ジホスホグルコース
からβ(1−4) −グルカンポリマーを合成することができ、ここで、遺伝子
Aによりコード化されるこのタンパク質は、セルロースシンターゼ及びジグアニ
レートサイクラーゼ活性の両方を欠損するセルロース陰性ヱ皇−ヒバ!」し二細
胞を補完することができる。
遺伝子C又はDのいづれかによりコード化されるタンパク質は、ウリジン5′−
ジホスホグルコースからβ(1−4)−グルカンポリマーを合成でき、そしてこ
のタンパク質が適当な比率においてセルロースシンターゼオペロンの他の3つの
タンパク質と結合した際、インビボで細胞から生成物を分泌せしめることができ
る。
更に、ヱ立上五m二における異種遺伝子の表現のための新規の組換DNAベクタ
ーであって、複製を含むプラスミドp824のフラグメントの機能的二皇上e源
、並びに形質転換、細胞***及び培養に影響を受け易い感受性細胞の中に形質転
換せしめた際に、少なくとも1つの抗生物質に対しての耐性を運び込む1もしく
は複数のDNAセグメント。これらのベクターは、細菌宿主細胞、例えば旦、
D ’J (E、 coli)におけるDNAのクローニングにおいて利用する
ためのシャトルベクターへとすることもできる。
”(Df;l”呪
図1はセルロースシンターゼオペロンの核酸配列及び推定されるアミノ酸配列で
ある。このセルロースシンターゼオペロンはその長さにおいておよそ9217b
pであり、4つの遺伝子、Aで示す2261のヌクレオチド配列(ヌクレオチド
328−2589)、Bで示す2405のヌクレオチド配列(ヌクレオチド25
94−4999)、Cで示す3956のヌクレオチド配列(ヌクレオチド500
5−8961 )、及びDで示す467のヌクレオチド配列(ヌクレオチド89
64−9431)より成る。本明細が提供する各遺伝子のヌクレオチド配列はシ
グナル配列を含みうる。それぞれの遺伝子によりコード化される成熟タンパク質
はプロセッシングを受けることがあり、もしそうならば関連する遺伝子配列はこ
こに示したものよりも短いであろう。例えば、精製セルロースシンターゼBタン
パク質の第1アミノ酸に相当するアラニンコドンは二つの上向き矢印の間にある
。
転写開始部位はヌクレオチド235のAの上に位置する下向き矢印により表示し
た。遺伝子りの後の下線のヌクレオチド配列は、ステム及びループ(stem
and 1oop)構造の逆方向反復塩基配列を含んで成る転写ターミネータ−
領域を示す。オリゴヌクレオチドMK170の配列はヌクレオチド2190から
2210に示し、MK172の配列はヌクレオチド4564から4583に示し
た。
図2はコスミドベクターpKT 230c o s 5の構造を示す。
図3は全長セルロースシンターゼB遺伝子を含むTRTlB−1の作成を図示す
る。
図4はプラスミドp U C1B−824の制限地図である。
図5はコスミドT5A1由来の8.3KbSmaIフラグメント及び7.2Kb
B a mHIフラグメントの制限地図である。
図6はプラスミドp U C18−824F S 6の制限及び機能地図である
; p U C1B−824F S 1はセルロールシンターゼ遺伝子を有する
Sma I制限フラグメントの配向が逆向きである以外はp U C1B−82
4F S 6と同一である。
図7はプラスミドp U C19−824の制限及び機能地図である。
図8はプラスミドpABCDの構造を図示する。
図9は、セルロールシンターゼオペロン遺伝子を転写するための異種プロモータ
ーを含む表現ベクターの作製を示すフローチャートである。
l泗!」0111肌
本明細書記載の発明をより完全に理解するため、以下の詳細な説明を記載する。
A、定1
本明細書に用いる語「セルロースシンターゼ」は、生体内でのウリジン5′ジホ
スホグルコースの細菌セルロースへの生化学的変換、及びその細胞外への分泌に
関与する1又は複数のポリペプチドに関する。セルロースシンターゼの合成に関
連する4つの遺伝子を含む単一の転写ユニットは、図1に示す核酸配列によりコ
ード化される。
「セルロースシンターゼ遺伝子」なる語は、セルロースシンターゼオペロンに関
連するポリペプチド生成物をコード化する核酸配列として定義する。この語は、
いづれもの1バクタ一細菌株又は種に限定しない。
本明細書に用いる「セルロースシンターゼオペロン」なる語は、セルロースシン
ターゼに関連し、そして細胞外に分泌されるタンパク質生成物のグループをコー
ド化するDNA配列のストレッチに関する。
「セルロースシンターゼ活性」はUDP−glcからセルロース〔β(1−4)
−グルカン〕を合成する能力により定義する。この活性は、UDP−(”C)グ
ルコースをセルロース(塩基に不溶性)に一体化せしめることにより、インビト
ロで測定され、そして1分間当りにセルロースに組込まれるグルコースのn5o
l(ナノモル)として測定する。
「セルロースシンターゼ比活性」はセルロースに組込まれるn mol グルコ
ース/分/タンパク11mgとして定義される。
二車上)<9叉二細胞におけるセルロースシンターゼ比活性は、通常0,2から
0.4のnmo1glc/分/細胞タンパク質o+gの範囲にある。
本明細書に用いる語「二車上べえL二」は微生物の属、そして特にセルロースを
生産する属の構成員に関する。
「適当な微生物」は、セルロースシンターゼオペロンに関連する1又は複数の遺
伝子により形質転換された際に、セルロースを生産可能な微生物に関する。適当
な微生物には、形質転換を行なわないでセルロースを生産可能なそれらの宿主細
胞、又は1もしくは複数の遺伝子の欠損するものであって、その活性がセルロー
スシンターゼオペロンの少なくとも1遺伝子により置換されうる宿主細胞を含む
。
「作動連結」は、構成要素の正常な機能が働くことができる並列位置に関する。
それ故、コード化配列のコントロール配列との「作動連結」は、このコード化配
列がこれらの配列のコントロール下で表現されうる形態を意味する。このような
コントロールは直接的、即ち、単一プロモーターと連結した単一遺伝子、又は、
多シストロニク転写が単一プロモーターから表現される際のケースのような間接
的なものでありうる。
「コントロール配列」は、DNA配列又は特定の宿主生物における作動連結した
コード化配列の表現のために必要な配列を称する。原核細胞のために適切なコン
トロール配列は、例えばプロモーター、任意的にオペレーター配列、リボソーム
結合部位、転写ターミネータ−1及び未だよく理解されていない可能性のあるそ
の他のものも含む、真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエン
ハンサ−を利用することが知られる。
「細胞」又はr組換宿主細胞」もしくは「宿主細胞」はしばしば相互交換的に用
いられ、そしてこれら全ての呼称はそれらの子孫を含む。それ故、「形質転換体
」又は「形質転換細胞」には、第一処理細胞、及び移し換えの回数を無視したそ
れら由来の培養物を含む。全ての子孫はDNA含有量において正確に同一でない
ことがありうることも理解されており、これは誘発性の、又は偶然による突然変
異に富国する。突然変異子孫であって元来の形質転換細胞におけるスクリーンに
より同一の機能を有するものは含まれる。異なる呼称を用いレオチド、例えば、
セルロースシンターゼB遺伝子由来のDNAは、少なくとも6−20のヌクレオ
チドの配列、より好ましくは少なくとも15から20のヌクレオチドの配列であ
って、指定のヌクレオチド配列の領域に相当する、即ち、同−又は相補的な配列
を称する。核酸配列との一致は約70%又はそれ以上、好ましくは少なくとも8
0%、そしてより好ましくは少なくとも90%のであろう。
誘導配列の相応又は非相応性は、液相又は固体支持体における標準的なりNAハ
イブリダイゼーション技術を利用した、適切なる厳重な条件のもとでのハイブリ
ダイゼーションにより検出されうる。核酸配列の相補性の検定のためのハイブリ
ダイゼーション技術は当業界において知られている(例えば、Sambrook
et al、 (1989) Mo1ecular Cloning : A
LaboratoryManual (第2版L Co1d Spring
Harbor Press、 Co1d SpringHarbor、 NYを
参照のこと)。更に、ハイブリダイゼーションにより形成される二重らせんポリ
ヌクレオチドの誤対合は、二重らせんポリヌクレオチドにおける一本鎖配列を特
異的に分解するSlのようなヌクレアーゼによる1分解を含む既知の技術により
検定されうる。
誘導されるポリヌクレオチドは、示したヌクレオチド配列から物理的に誘導され
る必要はないが、しかし、例えば化学合成、DNA複製又は逆転写を含む、ポリ
ヌクレオチドが誘導される領域における塩基配列により提供される情報に基づい
た任意の方法により作られうる。
同様に、指定配列から「誘導される」ポリペプチド、例えばセルロースシンター
ゼBは、この配列においてコード化されたポリペプチド又はそのタンパク質のア
ミノ酸配列と同一の配列を有するポリペプチドを称し、そしてその一部はこの配
列におけるコード化ポリペプチドと免疫学的に同等であるが、又は本明細書に記
載するインビトロもしくはインビボアンセイにおいて対照タンパク質の生物学活
性と同等の活性を示す少なくとも5−10のアミノ酸、そしてより好ましくは少
は、通常10未満のアミノ酸による相違、より通常には5未満のアミノ酸による
相違を称する。組換タンパクf ’AJ 。
「B」、「C」又は「D」のいづれも、天然タンパク質と実質的に同等の生学的
特性を示した。この生物学的特性には免疫学的特性が含まれ、真のタンパク質に
対して得られる抗体はこの組換タンパク質と交叉反応する。
セルロースシンターゼの生産のために有用なポリペプチドを特徴付けるために本
明細書で用いる語「組換ポリペプチド」は、ゲノミック、cDNA、半合成又は
合成核酸配列により、その起源又は操作によりコード化されたポリペプチドを意
図し、
(1)これらは天然又はライブラリーの形においてそれらが関連するポリヌクレ
オチドの全て又は一部に結合するのではなく;そして/又は
(2)その天然の形において結合するそれら以外のポリヌクレオチドと結合して
いる。
「表現システム」は、作動連結している目的のコード化配列及びコントロール配
列を含むDNA配列を称し、これらの配列により形質転換された宿主はこのコー
ド化タンパク質を生産できる。形質転換を行うため、この表現システムはベクタ
ー上に含まれることができ;しかしながら、この関連DNAは宿主染色体に一体
化せしめることもできる。
「感受性宿主細胞」は、宿主細胞に耐性を授ける遺伝子を含むDNAセグメント
なしでは、与えられた抗生物質の存在下において生育できない宿主細胞に関する
。
本明細書に用いる語「ベクター」は核酸を宿主細胞に移し入れるのに適するポリ
ヌクレオチドに関する。この語はプラスミド、ミニークロモソーム、ファージ、
むき出しDNA等を含む。
B、二股放反■
細菌セルロースシンターゼオペロンの1又は複数のDNA配列コード化遺伝子を
得るための以下に示す方法は、単に実例を示す目的であり、それらは典型的に利
用されうるものである。しかしながら、遺伝子が同定できたのなら、その他の当
業界において理解される方法も用いられうる。
セルロースシン −ゼオベロンに・ るコー二」」J
【歿至丘取
細菌セルロースシンターゼオペロンをコード化するポリヌクレオチドは、例に記
載した通すヱ−tzf−tεにDNAライブラリーから得られ、そしてこの遺伝
子を同定するために遺伝的相補性を利用した。
細菌セルロースシンターゼオペロンをコード化するヌクレオチド配列を得るため
の方法は、ヱ鬼上にDNAについての通用化を必要とする多数の個々の段階を利
用し、そしてそれは(1)セルロース陰性(Cel)突然変異ヱ皇上バLL二株
の準備及び特徴付け; (2)クローニングのための適切なベクターの作成:
(3)7−t=I−)<9L二DNAライブラリーの作製;(4)Cel−ヱ皇
上乙U二突然変異におけるセルロースシンターゼ活性を復帰せしめることができ
るDNA挿入配列の同定及び単離; (5)配列分析及びセルロースシンターゼ
コード化配列の局在の両者のための細菌セルロースシンターゼオペロンをコード
化するヌクレオチド配列の地図化及びサブクローニング;並びに(6)セルロー
スシンターゼオペロンの生成物をコード化するDNAのクローニング及び表現を
含む。
クローン化配列の確認は、組換的に生成した細菌セルロースシンターゼのN末端
アミノ酸配列と天然のヱ土上に源から精製したものとを比較することにより行わ
れる。更に、クローン化ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列を、天然
のヱi−ヒゲク3−二源から得られ、且つ精製したタンパク質の一次配列と比較
することがある。
セルロースシンターゼをコード化する遺伝子のクローン化の試みは、B遺伝子の
同定により最初に導かれる。セルロースシンターゼB遺伝子がクローン化及びシ
ーケンス化されても、この遺伝子の5′末端の解読は種々の理由により困難であ
る。例えば、二車上バU二における転写及び翻訳シグナルは特徴付けられていな
く、そして、旦、ユニコントロールシグナルについても知られている同様の、又
は類似のコントロールシグナルはアラニン(精製した天然タンパク質のN末端残
基)についてのコドンの上流領域において存在していなかった。しかしながら、
この遺伝子上流のオーブンリーディングフレームの接近性は、この遺伝子が多シ
ストロン情報の一部であることを推定させる。それ故、この遺伝子の上流及び下
流両者のオーブンリーディングフレームの配列の更なる研究が本明細書に記載通
りに行われた。これらの研究により、シングルプロモーター5′末端に、そして
転写終結領域の3′末端に連結する4つ密接にリンクした遺伝子が同定された。
これらの遺伝子生成物のそれぞれの正確な機能は確認されていないが、相補性の
研究が示すには、セルロースシンターゼ活性において欠損する株は遺伝子Bによ
り補完されることができ、そしてセルロースシンターゼ及びジグアニレートサイ
クラーゼ活性の両者において欠損するこのセルロース陰性突然変異は遺伝子Aに
より補完される。セルロース陰性クラス■突然変異は、遺伝子C及びDについて
コード化するDNAフラグメントにより補完される。このグループにおける突然
変異はインビトロにおいてセルロースを作り、そしてセルロース生産に必要な全
ての酵素活性を有する。遺伝子りはセルロース合成に関連するタンパク質をコー
ド化する。この遺伝子の分解はセルロースの合成を明らかに低める。
遺伝子A、C及びDはインビトロでのセルロース合成に必要な調節、構造、膜結
合、又はプロセッシングタンパク質をコード化しうる。それぞれの遺伝子生成物
コード化配列の有用性は、セルロース合成の機構の更なる解明のための研究のた
めの大量の各タンパク質の合成を可能にすることにある。
セルロースシン −ゼの 刑
本発明の1方法により、セルロースシンターゼオペロンをコード化するポリヌク
レオチドを、適切なベクターの中でクローン化せしめ、適切な微生物宿主の中に
形質転換せしめ、そしてセルロースシンターゼの表現を可能にする条件のもとで
培養せしめた。他方、このオペロンにおける各遺伝子の配列同定ができたのなら
、各遺伝子はそれぞれクローン化され、そして所望の遺伝子生成物を生産するた
めに表現されうる。
セルロースシンターゼオペロン遺伝子生成物をコード化するポリヌクレオチド配
列の転写は、内因性ヱ皇上五LLニプロモーターを用いて行うか、又は択一的に
、一旦一エ1刃−又はB−スブ土ユ久(B、 5ubtilis)由来のものを
含む異種細菌プロモーターにより行われうる。本明細書に記載の多数の異種プロ
モーター、例えばlac、エエl及びtacは調節プロモーターであり、そして
それ故本発明の方法において細菌セルロースシンターゼオペロンの表現のコント
ロールのために有用である。しかしながら、プロモーター、例えば温度感受性リ
プレッサー(即ち、37℃以上では非機能性)により調節されるPLプロモータ
ーは、多数の一1j−トZ株において作動せず、なぜならこれらの株は通常35
°C又はそれ以下で培養され、そしてこの温度範囲以上では生育しないからであ
る。
異種プロモーターの制御は陽性又は陰性コントロール要素のいづれも利用できる
。例えば、異種プロモーターと結合したオペレーターを認識するリプレッサー(
例えば、1aclリプレツサー)をコード化する遺伝子を宿主系に導入すること
がある。他方、生育培地に存在するトリプトファンのレベルハ、エエLプロモー
ターの制御を提供することができる。
また、セルロースシンターゼオペロンのコントロール表現のための他の手段は、
mRNA転写物を安定化せしめるための異種転写ターミネータ−を利用しうる。
例えば、l−スユンジェネシス (も−μ捜り罰l堕旦邦ユリ−の結晶タンパク
質から単離された転写ターミネータ−は、E、コリ及びB スブチリス(B、
5ubt月1註における多くのタンパク質の表現レベルを、それらのmRNAを
安定化せしめることにより増大することが示されている。同様に、このターミネ
ータ−又はその他のこのようなターミネータ−は、7−!=)zlL二における
セルロースシンターゼオペロンからのmRNAのレベルを高めるために用いられ
うる。高められたmRNAのレベルは、組換ヱj」l立とL二株におけるセルロ
ース合成を高めるものと予想できる。
得られる作製物は、適切なセルロース生産微生物に挿入せしめ、そして適当な表
現ベクターを用いるか、又はもしプラスミドの不安定性さが問題なら、このプロ
モーター遺伝子構造を宿主微生物の染色体の中に直接組入れるかのいづれかでそ
れぞれ複製せしめる。このセルロース生産宿主微生物はセルロースシンターゼ陰
性株か、又はセルロースシンターゼ陽性株のいづれかでありうる。前者の例にお
いて、1又は複数のセルロースシンターゼオペロン遺伝子は宿主微生物のセルロ
ース生産能力を復帰せしめるであろう。後者の例において、組換セルロースシン
ターゼオペロンの誘導が組換株のセフ1/ 。
−スシンターゼ活性及びセルロース生産の両者を高めることが予想できる。
染色体セルロースシンターゼオペロンプロモーターの異種細菌プロモーターによ
る置換は、セルロースシンターゼを過剰表現せしめるために設計するプラスミド
システムにおいて複数の利点を有す。染色体プロモーター置換は、プラスミドる
。これはまた、プラスミド選別を支持する抗生物質の必要性を取り除く。最後に
、染色体プロモーター置換はアセトバエ叉二由来のオペロンのコントロールを取
り除き、より強い構成プロモーター、又は制御プロモーターを利用するコントロ
ールの提供を可能にする。
本発明の細菌セルロースシンターゼオペロンの遺伝子をコード化するヌクレオチ
ド配列は、一旦エエッ」−、ストレプトマイ五(7,y旦μ扛且Q−、ズーグロ
エア 3匹れ些紋、青緑藻類及びサルシナベント1キユ1(Sarcina v
entriculi)を含む種々の原核細胞系において表現されることができ、
その中でL二ユ及び7−k)/lL二が好ましい。
セルロースシンターゼは細菌由来のため、セルロースシンターゼの表現のために
適するベクターは当業界において知られ、そして酢酸細菌、例えばヱ±上バエ叉
二のだめの宿主−ベクターシステムの発育のためのバイブリドシャトルベクター
を含みうる。Fukuya、 et al、(1985) A ric、Bio
l、 Chew。
49 : 2083−2093には、選択を可能にする抗生物質遺伝子マーカー
を有し、そして旦、2i及びヱ皇上バ之久二において複製の可能な、比較的小さ
いサイズの複数のシャトルベクターが記載されている。Fukuya、 et
al+ (1989) A 、 Env、 Microbiol、 55:17
1−176には、旦、ユニ及びヱ−f=)zl 一種のためのシャトルベクター
、pmv24であって、β−ガラクトシダーゼを有する融合タンパク質としての
クローン配列の翻訳を行うものが記載されている。
本発明はまた、セルロースシンターゼ遺伝子のクローニング及び表現において用
いるための内因性二史上ffiニベクターを提供する。このP824と称される
ベクターは小さく、そし、て本明細書に記載のpKT230 c o s 5コ
ンシユゲージぢンベクター上に存在する大きな動員(+5obilizatio
r+)eJ域が欠落している。p824の小さいサイズは、クローニングベクタ
ーとしての操作を容易にする。このベクターにおける挿入DNAの分析もその小
さいサイズに富国して大いに促進されるであろう。この2824ベクターは、1
つのアセトバクター宿主からの遺伝子を別のものに直接的にクローンするのに利
用でき、これにより宿生限定障害、及びE、)IJからアセドパU二への、pK
T230 c o s 5コスミドの接合にわたり起こる一連の再配列/欠損を
最小にする。
内因性プラスミドを直接的な7+)、<1−タニニカート)<1)1=−移動の
ために用いることができ、そして又シャトルヘクターの増殖のためにも用いられ
うる。それ故、本発明は又、例えば旦=孟ユの±1」=−プロモーター及びぞの
翻訳開始シグナルを利用する所望の配列の直接的な転写及び翻訳を可能にする適
当なコントロール配列を利用して、クローニング及び表現ベクター(上−ユニ及
びアセトバクタ一種のため)の両方を提供する。これらのベクターによる7jQ
上ニス叉二の形質転換は、種々のタイプのクローニング及び表現実験のために有
用な形質転換効率をもたらす。
l上!張Jしλl収
細胞は機械的又は酵素的手段、例えばフレンチプレス、超音波処理又はリゾチー
ム及びEDTAによる処理により破壊され、その後遠心してセルロースシンター
ゼ活性を含むベレットを回収する。
このベレットを再懸濁し、そして遠心して可溶性タンパク質を除去し、そしてこ
の集めたベレットを清浄剤、例えばジギトニン又は20%のグリセロールををす
るトリトンx−io。
により溶解せしめる。任意的に、この所望の活性を限外濾過又は遠心を利用して
濃縮せしめる。
この酵素は、その他の清浄剤溶解タンパク質から分離せしめるためにそれ自体の
不溶性生成物、セルロースを利用して捕獲される。この捕獲酵素はセルロースか
ら、精製セルラーゼによるセルロースの分解により回収されうる。
髪皇方広
してほとんどの実施者は特定の条件及び方法の記載する標準的な原料の資料につ
いて精通している(例えば、Sambrookら(1989)を参照のこと)。
他に、Miller、 J、 M、 (1972) Experiments
in Mo1ecularGenetics、 Co1d Spring Ha
rbor、 NYは、細菌のコンジェゲーシジン実験のために有用な一般的な方
法を提供する。しかしニア)0−二ど配刀五」」も11!
原核細胞は種々の呈−91株によく代表される。しかしながらその他の微生物株
、例えばバーy−tbxy、y+男、−3ユ旺遁1石−3ubtilis)、い
ろいろな種の1土九べλ叉二、之五二!ミよ±ス及びストレプトマイシスも利用
されうる。このような原核細胞系において、複製部位及びコントロール配列を有
する、各宿主に適合する種由来のベクターが利用される。例えば、旦、ユニは、
例えばpKT230であってアメリカンタイプカルチャーコレクシジン(ATC
C)、Rockville、 MO(ATCC,No、37294)から入手で
き、そしてBagdasarian ら(1981)Gene 16:237−
247に記載のベクター、又はpBR322の誘導体であってE コニ種由来の
、そしてBol 1varら(1977)Gene 2:95に記載のプラスミ
ドを用いて形質転換されうる。
プラスミドpKT230はレプリケーション由来のブロードホストレンジ(br
ood host range)、レブリケーション由来のE コリ、コンジュ
ゲーションに必要な遺伝子及びストレプトマイシン耐性マーカーを有する。プラ
スミドpBR322はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子
を含み、それ故目的のベクターの作製において保持されるか破壊されることがで
きる付加マーカーを提供する。本明細書で転写開始のためのプロモーターを含む
ものと定義する、一般に利用される、任意的にオペレーターを有し、リポソーム
結合部位配列を有する、通常利用される原核細胞コントロール配列には、ベータ
ー−ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)のような通常利用されるプロモーター、並
びにラクトースWプロモーターシステム(Changら(1,977) Nat
ure 198:1056)、トリプトファン豆■)プロモーターシステム(G
oeddelら(1980)Nueleic Actds、 Res、 8:4
057) 、ハイブリFtacプロモーター(De Boerら、(1983)
Proc、 Natl、 塵、五ハ、 USA 80 :2l−25)、及び
ラムダ誘導PLプロモーター(Shimatakeら(1,981)Natur
e 292:128) 、更にN遺伝子リポソーム結合部位を含み、これはポー
タプルコントロー・ルカセットとして有用に作製されている。1987年12月
8日出願の米国特許4.711,845号にこのポータプルコントロール配列が
記載され、これはPLプロモーターである第1.DNA配列を含んで成る。この
プロモーターは第2DNA配列と作動連結し、この第2DNA配列はN*BS配
列の3′側の6塩基対以内に切断を可能とする少なくとも1つの制限部位を有す
る第3のDNA配列のNlll5上流に対応する。1987年5月19日出願の
米国特許4.666.848号は細菌セルロースシンターゼを表現するのに有用
な高められた表現能力を有する更なるベクターを開示する。更に有用なのは、本
明細書に参照文献として組入れている1986年10月8日公開の欧州特許公開
196.864号におけるC b a n gらにより説明されたアルカリホス
ファターゼ並胚A)系である。これらの公開物は有用な表現システムを提供する
が、原核細胞に適用できるあらゆる有用なプロモーターシステムが用いられうる
。
アセトバク −の へのDNAの
A、コンジュゲーション
コンジュゲーションは異種のDNAを目的の宿主細胞に移送するために有用な技
術である0本発明において作製したコスミドベクターは旦−ユニから、異なる細
菌宿主、例えばアセトバクターにおける複製のために移送せしめることは容易で
ない。このような場合において、ヘルパープラスミド、例えばp RK2O13
(Figurski and He1inski、 (1979) Proc、
Natl、 Acad、Sci tlsA 76:164801652)が、
目的のDNAインサートを含む、コスミドベクターを、提供細胞から受容細胞へ
の 7移送においての補助に利用されうる。提供物を受け取った細胞は、形質転
換受容細胞が耐性である抗生物質を含むプレート上において増殖せしめることに
より選別せしめた。ミラー(Miller、前述)は、受容細胞の選別のために
滋養マーカーを利用するコンジュゲーション方法を開示している。他の、大まか
なスクリーニングのために適する方法は、例Vに詳細に記載する「多スポットコ
ンジュゲーション方法」である。
B、ゑ1転景
用いた宿主細胞に依存して形質転換は、このような細胞に適切な標準的化学的技
術を用いて行うか、又はエレクトロポレーションを用いうる。例えば、Cohe
n、 s、 N、+(1972) Proc。
Natl、 Acad、 Sci、 USA 69:2110に記載の塩化カル
シウムを利用するカルシウム処理が、実質的に細胞壁バリアーを含む原核細胞又
はその他の細胞のために用いられる。
特徴付けされていない種の化学的方法の不利な点は、どのプロトコールによる成
功の機会も小さいことであり、それ故、有用なレベルの形質転換を得る条件の最
適化のための実験が必要でありうる。最近、細菌を強力な電場にさらすことが2
ニードモナス及び旦−ユニを含む広範囲の細菌の形質転換に有用であることが示
された。細菌に通用するエレクトロポレーションは1983年から利用されてい
る(Shivarovaら(1983)ム虹n、 Microbial 23:
595) 、 Dower ら(198B) Nuc、 Ac1d。
Res、 16:6127)は、旦、二1におけるエレクトロポレーションの効
率は、化学的手段により得られる最高のレベルよりも・ 10から100倍であ
ることを示している。
2つの基本的なパラメーターがエレクトロポレーションの効率に影響する。1つ
は電場の強さであり、そして他方は電場の強さが衰退する時間(パルス持続時間
)である、任意的に、細胞は一定の電極距離(d)を有するスペクトロフォトメ
ーター型キュベツトにおいて電場(E)を受ける。それ故、キュベツトに通用さ
れる電圧(V)は電場力を決める(E=V/d )。
サンプルへの正確な電圧の伝搬は、電荷を最初にコンデンサーに溜めることで行
われる。パルス持続時間、電場の分散は一般に指数式において導かれ、そして衰
退の持続時間は一連のコンデンサー及び並列抵抗の組合せにより決まる。
本明細書に示す通り、本明細書において用いるアセトバクえ二株のだめの最適な
電場の強さは9〜9.5KVO間である。
25−100μF(シリーズ)対200−1200オームを利用するパルス持続
時間(RC値)の研究は、ヱi上亙文叉二株1306−24のためには25 u
F/750オーム(= 18.75ssec)が最適であることを示した。得
られる形質転換のレベル(約10’の形質転換体/μg)は化学処理により得ら
れるものよりも約10”倍高い(Fukuya、et al、(1985) A
ri、Biol、Chew、49:2091−2097) 。
二車上バU二から調製したDNAの形質転換率は、旦一旦ユから調製したDNA
の場合よりも10”倍高いことも分った。
理論付けしようとは考えないが、この種の障害は非修飾、おそらくは非メチル化
旦−ユJDNAに基づくエンドヌクレアーゼ宿主制限活性に起因するであろう。
このような抑制障害を低める方法は本明細書に記載していない;しかしながら、
この制限障害は本明細書記載のアセトバクター−アセトバク叉二ベクターを作り
上げることにより回避できる。
アセトバク −DNA−DNAイン
ートAライブラリーは1」」ソεムL二から、ヱ」」二と乞久二細胞由来の核酸
の単離及びサンプルにおけるRNAを分解せしめることにより調製される。この
回収したDNAを適当な制限酵素、例えば5au3Aにより部分的に分解せしめ
、そしてこのDNAを例えばスクロース勾配を利用して逐次的にサイズ分画する
。選ばれた大きさの範囲の分子を含む両分をコスミドベクターの中にリゲートせ
しめ、その後ラムダファージ粒子の中に便宜的にパンケージせしめる。次にこの
ファージ粒子を適当な宿主、例えばE、コリに感染せしめるために用いる。挿入
されたDNAの大きさを決定するため、う増殖させ、そしてスクリーンした。
−≦l!上が1主製
目的のコード化配列及びコントロール配列を含む適当なベクターの作製は、当業
界においてよく理解されているリゲーション及び制限酵素技術を利用する。単離
プラスミド、DNA配列又は合成オリゴヌクレオチドを切断せしめ、仕立て、レ
アーゼにより、当業界において知られる一般的な条件のもとで行われ、その特異
性はこれら商業的に入手できる制限酵素の製造者により明確化されている。Ne
w England Biolabs。
Product Catalog (New England Biolabs
、 Beverly、 MA)を参照のこと。一般に、約1μgのDNAは、約
20μmの緩衝溶液における1ユニツトの酵素により分解される。制限酵素の過
剰はDNA基質の完全な分解を確実にするために用いられる;しかしながら、部
分的分解であって、DNAにおける付与された制限酵素のいくつかであって全て
でない部位が分解されることを行うことが望ましいことがある。このような部分
分解は制限酵素の濃度を変えること、又は制限分解の実施時間を変えることによ
り達成される。約1時間から2時間で、約37°Cでのインキュベーションが有
用であるが、その変更もそしてその後エーテル抽出せしめることがあり、そして
この核酸はエタノール沈殿による水性画分から回収される。必要ならば、分解フ
ラグメントのサイズ選別を標準技術を利用するポリアクリルアミドゲル又はアガ
ロースゲル電気泳動により行うことがある。サイズ選別の一般的な説明は、Me
thodsin Enz 5olo (1980) 65:499−560;
Lawn et al、 (198])Nuc、 Ac1ds Res、 9:
6113−6114及びGoeddel、 et al−+ (1980)Nu
c、cids Res、 8:405に記載されている。制限分解フラグメント
はE 2JDNAポリメラーゼI (フレノウ)の大きなフラグメントによる、
4種のデオキシリボヌクレオキト3リン酸(dNTP)の存在下において、20
から25°Cでの約15から25分間でのインキュヘーション時間を利用して5
0mMのトリスpH7,6,50mMのNaC1,6n+MのMgCl、6dの
dTT。
約IU/μmのフレノウ及び100μMのdNTP中における処理によりプラン
ト末端にされうる。このフレノウフラグメントは、接着末端の5′側の反対側を
「埋め合わせ」するが、しかし酵素の3′−→5′エキツクヌクレアーゼ活性は
、鋳型領域の非存在下において一本鎖の3′側の突出しを分解せしめる。必要な
らば、選択的な修復は、その接着末端の性質により示される制限内において1種
のみの、又は選ばれたdNTPを供給することにより行われうる。フレノウによ
る処理後、この混合物をフェノール/クロロホルムにより抽出せしめ、そしてエ
タノール沈殿させる。S1ヌクレアーゼ又はBa1−31による適当な条件下で
の処理は、任意の一本鎖部分の加水分解をもたらす。
法により調製されうる。アニール化の前の又は標識化のための一本鎖のリン酸化
は、過剰の、例えば約10ユニツトのポリヌクレオチドキナーゼを1ナノモルの
基質に対して、50mMのトリス、pH7,6,10mMのMg CIg 、
5a+Hのジチオスレイトール及び1−2dのATPの存在下において用いるこ
とにより行われる。もしリン酸化がプローブの標識のためであったら、ATPは
高い比活性のガンマ−0Pを含むであろう。
リゲーションは15−30μlの容量において、以下の標準的な条件及び温度の
もとで行われる: [20+sMのトリス−HCl、p)17.5、IORIM
のMgC1,10dのDTT、33μg/IllのBSA、 10mM 50+
sMのNaCl、及び40ttMのATP、0.01−0.02(Weiss)
ユニットのT4DNAリカーゼにより0°Cで(「接着末端」のリゲーション
のため)、又は1mMのATP、0.3−0.6 (Weiss)ユニットの7
4DNAリガーゼにより14′Cで(「プラント末端」のりゲーションのため)
。]分子間の「接着末端」のリゲーシジンは通常33−100μg/+1の総D
NA濃度(5−1100nの最終総濃度)で行われる。分子間のプラント末端リ
ゲーション(通常1130倍の挿入物の過剰モル数を利用する)は1μMの最終
総濃度で行われる。
「ベクターフラグメン)−Jを利用するベクター作製において、このベクターフ
ラグメントは5′リン酸を除去し、そしてベクターの再すゲーションを防ぐため
、一般に細菌アルカリホスファターゼ(BAP)により処理する。BAP分解は
pH8にて、約150mMのトリス中で、Na’及びMg″2の存在下において
、1μgのベクター当り約1ユニツトのBAPを用い、60°Cで約1時間行わ
れる。核酸フラグメントを除去するため、この調製物をフェノール/クロロホル
ムにより抽出せしめ、そしてエタノール沈澱させた。他方、再すゲーションは、
不要のフラグメントの更なる制限酵素分解により二重に分解せしめたベクターに
おいて防ぐことができる。
−仄Wム列1腹
配列の修飾を必要とする、cDNA又はゲラミックDNA由来のベクターの一部
のため、位II特異性プライマーに向けられた突然変異誘発を利用した。この技
術は当業界において現在標準的であり、そして突然変異すべき一本鎖ファージD
NAと相補するが、ただし目的の突然変異を表わすために一定の不対合のプライ
マー合成オリゴヌクレオチドを用いて行う。簡単には、この合成オリゴヌクレオ
チドは、ファージDNAと相補の鎖の合成を導くためのプライマーとして用いら
れ、そして得られる二本鎖DNAをファージ支持宿主細菌に形質転換せしめる。
形質転換細菌の培養物をアガーの上において平板培養し、ファージの潜入した単
一細胞由来のプラークを形成せしめる。
理論的には、新しいプラークの50%は、−末鎖として突然変異の型を有すファ
ージを含むであろう:50%は本来の配列を有すであろう。このプラークをニト
ロセルロースフィルターに移し、そしてこの「移されたもの」をキナーゼ処理合
成プライマーと、正確なハイブリダイゼーションを可能にするが、本来の鎖との
不対合がハイブリダイゼーションを妨げるのに十分となる温度でハイブリダイゼ
ーションせしめる。プローブとハイブリダイズしたプラークを次に選び、培養し
、そしてそのDNAを回収した。位置特異的突然変異処理の詳細は、記載例にお
いて以下、説明する。
作襄上皮耗l
以下に記載する構造において、プラスミドの作製のための正しいリゲーションは
最初の形質転換E、コリ株MM294、又はリゲーシヲン混合物を有するその他
の適当な宿主により確認する。有用な形質転換体はアンピシリン、テトラサイク
リンもしくはその他の抗生物質耐性体により選ばれるか、又はプラスミドの作製
の方法に依存して、当業界に知られるその他のマーカーを利用して選ばれる。こ
の形質転換体由来のル(Cm)増幅(Clewe11.(1972)J、 Ba
cteriol、 110:667)に従って調製される。この単離DNAを制
限処理及び/又はSangerらの(1977)Proc、 Natl、 Ac
ad、 Sci、 USA 74:5463、更に詳しくはMessing ら
の(198])Nuc、 Ac1ds Res、 9:309に記載の乏云土土
之方法、もしくはMaxam らの(1980)Methods in Enz
戸且匡u−,65:499の方法によりシーケンス化されることにより分析する
。
本明細書に記載の発明をより理解せしめるため、以降の例を記載するが、これは
例示を目的としており、本発明をいかなる手段において限定するためのものでは
ない。
L
セルロース アセ バク − の量
販下の例において、多数の培地を用いた。何らがの記載がない限り、培地は以下
の通りに作られている:R20−2培地は次の組成を有する:
成分 最終濃度
バタトーベプトン 5g/l
酵母抽出物 5Rノ】
Na、HPOa 5g/l
クエン酸 1.15g/l
炭素源 特定された通り
(特定されていない場合、2%のグ
ルコース)
最終pH5,0±0.2
最少培地R70(アセトバクター最少培地、又はrAMMJとも称する)は次の
組成を有する:
成分 量1日1!
(NH,)、So、 25
KH,Po、 7.3
Mg50. 1.0
F e S O,0,013
CaC1z 0.1O
NazMoO40,001
Z n S OJo、006
M n S 0. 0.006
何らかの記載がない限り2%又
は4%(W/V)
R−70培地及びその改質品を使用する全て研究のために、次のビタミン混合物
を100倍希釈でこの最少培地に加えた:遷し也 ビ ミン′A−L
イノシトール 200
ニアシン 40
ピリドキシン HCI 40
チアミン HCI 40
Ca パントテナーテ 40
リボフラビン 20
パラ−アミノベンゾン酸 20
葉酸 0.2
ビオチン 0.2
R70−2培地はR70の改質型である。R70−2は次の組成を有(mM)
(NH,)、So、 25
KH,Po、 7.3
Na クエン酸 4.0
M g S Oa 1.0
FeC130,01
CaC1z 0.1O
N a t M o Oa O,001Cu S 0. 0.001
CoC1z O,001
NiC]□ 0.001
底圀 1笠1度
(IllM)
と−戸ミン混合物 10m1/リッターグルコ−3・7 特定した通り
六然゛ アセトバク − の
R70100m1+ 2%のグルコース+2%のトウモロコシの浸したリカー(
corn 5teep 1iquor) R804E (CSL、 CornP
roducts、 NJ)培地を含む3つの組織培養フラスコをアセドパLL二
株1306−21 (ATCCNo、53524)(各フラスコに対して1本の
凍結21バイアル)により感染せしめた。このフラスコを静置して、23時間、
30℃でインキュベートせしめた。
培養物においてヱ皇上べえL二細胞により形成された薄膜をビンセントで取り出
し、約15秒はどかき混ぜ、そして4層の除菌チーズクロスで濾過せしめた。細
胞を、4℃で750Orpm+010分間の遠心により、0.9%のNaClで
2回洗浄せしめた。この細胞を0.9%のN a C120m1に再@濁せしめ
、そしてもう一度あらゆる残骸を除去するために4層のチーズクロスで濾過した
。
95%から99.9%の細胞殺傷を及ぼす突然変異誘発性条件を選んだ。この培
養物を30℃でインキュベートせしめた。突然変異原はエチルメタンスルホネー
ト(EMS、 Sigwa+ St Louis+MO)であった。このEMS
濃度を1%から2%(V/V)の範囲にし、そしてインキュベーション時間は6
0分から210分の範囲にした。同様の条件を1j」18と外二株1306−3
及び1306−11に用いた(それぞれのATCCNo、 53264及び53
263)。
Ce1−ヱ皇上バU二株を単離するために2つの方法を用い、それは1)表現を
伴わない突然変異誘発、及び2)表現を伴う突然変異誘発である。
わないEMS″″然 嫌 か゛の7然゛ アセドパ久叉二銖
1立上に株1306−21をEMSにより処理し、その後、パーセント生存率を
検定するためにR20−2培地上に直接平板培養せしめた。 1306−21の
EMS突然変異性由来のプレートは、以下の通りに潜在性Ce1−コロニーにつ
いて試験した。
この突然変異誘発培養物を平板培養し、そして7日後に予想されるCe1−コロ
ニーを採取した。、Ce1−突然変異はプレート上で、平らな光沢のあるコロニ
ーとして同定することができる(野性型コロニーは荒い、乾いた外観を有する)
。
撹拌せしめた培養Ce I”株はペレットを形成するが、CeN’培養物は単一
細胞の懸濁物を生成する。Ce1−コロニーの頻度は0.05%から2%の範囲
にあると検定された。
−エ」=ヒバj」萱二株1306−3及び1306−11からCe1−株を単離
するための類似の技術が利用され、そして類似の突然変異頻度が観察された。
”EMS−然・ 嫌 による?″″然・ アセトバク」
EMS処理ヱ土上バm二細胞(株1306−21)のサンプル(約0.05m1
)をチューブの中(21、R20−2培養液)に感染せしめ、そして突然変異を
表現せしめることを可能とするために静置培養により増殖せしめた。培養サンプ
ルを連続希釈し、そしてR20−2プレート上で平板培養せしめた。インキュベ
ーション後、前記のプロトコールを利用して潜在性Ce1−タイプに対するコロ
ニーをスクリーンし、そして同程度の突然変異頻度が得られた。Ce1−株をヱ
丈上t<91二株1306−3及び1306−11から単離するために類似の技
術を用いた。
■エ
セルロース アセトバク − の ・番セルロースシン −ゼゞ の。
Ce1−アセドパU二突然変異株のインビトロセルロースシンターゼ活性測定の
ために用いるセルロースシンターゼ測定は、Aloni、 et al、、(1
982) Proc、 Natl、八cad、 Sci、 USA79 : 6
44B−6452に記載の改良方法であって、ウリジン5′−ジホスホ−140
)−グルコース(UDPG)由来のアルカリ不溶性ポリマー(セルロース)の生
産を測定する方法である。この測定ハーエ」二りとりJ−二Ce I−突然変異
のスクリーニングのために適正比した。インキュベーション後(10分、30°
C)、各反応混合物における未反応混合物を、NaOHとの加熱(95°Cで1
時間)及び濾過によりセルロースから分離せしめた。
フィルター上に残った放射性標識(”C)セルロースを次いでシンチレーション
計測により定量した。
この測定において用いた総タンパク質の量は、セルロースシンターゼの精製状態
に依存する。少なくとも1つの、この測定の直線領域(全UDPG消費量の20
%未満)を得るために、2から3の異なるサンプル希釈を測定した。
最終濃度として0.2mMの(’C)UDPG (7,5cpa+/pモル)5
0dのトリス、pH7,5,101のMgC1□、IIIIMのEDTA。
2IIIMのCa Cl z 、及びサンプルを含む0.2o+1の測定混合物
を測定した。サイクリンクジグアノシン1リン酸(c−di−GMP)を、いく
つかの測定チューブに5μMとなる迄加えた(c−di−GNPはセルロースシ
ンターゼを活性化せしめる)。コントロールは、サンプルの加えられていないチ
ューブ及びインキュベーション前に0.5MのNaOH4m1の添加により変性
せしめたサンプルを含むチューブを含む。
一定時間の反応は、酵素を添加し、この混合物を混ぜ、そしてこのチューブを3
0℃の湯浴に入れることで開始する。以降のチューブは一定の時間間隔で開始さ
れた。10分後、各反応を、チューブを湯浴から取り出し、0.5MのNaOH
4*1を加え、そして撹拌することにより停止せしめた。全ての反応を停止させ
たら、約20+wgのセルロースを(”C)セルロースのためのキャリアーとし
て働かさせるために各チューブに加えた。次いでこのチューブを湯浴の中にて9
5°Cで1時間、細胞を分解せしめるために加熱した。
真空マニホールドを用い、各測定チューブの内容物をワットマン(What+5
an) G F / Aフィルターで濾過せしめ、この反応混合物をフィルター
に通過せしめることによりセルロース生成物を単離せしめ(あらゆる未反応”
CLIDPGを除去した);この測定チューブを脱イオン水で3回すすぎ、この
すすぎ水を流し;フィルターを脱イオン水2011で2回洗浄し;次いで0.5
MのHCl 2(1wl 、そして脱イオン交換水20蒙l、更にメタノール2
01で洗浄した。
セルロース生成物はシンチレーション計測により定量した。
各フィルターを、10霧lのシンチレーション流体(NEN Atomligh
L Boston、 MA)を有するシンチレーションバイアルに移し入れ、そ
してセルロース生成の定量分析は、(”C)UDPGの塩基性不溶物質への混入
によるシンチレーション計測により測定される。(+’c)UDGPO比活性を
得るため、21の(”C)UDGP保存液のアリコートを測定した。
この測定のcp−の測定全域は保存液アリコートから決定でき、そして各測定チ
ューブから消費された総UDPGの割合は、以下の通りに計算される:
消費された総LIDPGの割合=
(フィルターのcps ) −()゛ランクのcps )(総計測値)−(ブラ
ンクのcps )1分当りに消費されるUDPGのnモルは以下の通りに計ズさ
れる:
nモルUDPG/分−(消費された全tlDPGの割合)×(40,000pモ
ル) X (1/10分)活性は1mlのサンプル当り、1分間当りのnモルに
基づいて示すか、又は1+*gタンパク質当り、1分間当りのnモルに基づいて
示した。
ジグアニレートサイクーーゼ のための゛ジグアニレートサイクラーゼ測定は、
2又はそれより多くの特定の活性を欠損、例えばセルロースシンターゼ活性&び
ジグアニレートサイクラーゼ活性における欠損するアセトバーダj≧:宿主を同
定するために用いた。このj酵素ジグアニレートサイクラーゼはグアノシン3リ
ン酸/(’G T P”)由来の、セルロースシンターゼ活性化物質である・C
−di −GMPの生産を触媒する。
細胞を増殖せしめ、洗浄せしめ、そして以下に記載のスクリーニング測定のため
に超音波処理せしめた。ジグアニレートサイクラーゼ活性は、Ross、 et
al、、(1987) Nature 325:279において報告されてい
るものと類領のアッセイを用いて測定した。超音波処理細胞(lag/アッセイ
チュブ)を1o分間、30℃で、0.2sM(7)[7/し7y−”P] GT
P、50μmMノドリスHCI、pH7,5,10mMのMgC1z、1mMの
EDTA、5mlのCa C1z 、2 mMのホスホクレアチン、及び24ユ
ニット/mlのタレアチンホスホキナーゼを含む反応混合物0.1mlにおいて
インキュベートした。この反応を100%(−/ν)のトリクロロ酢酸により停
止させた。沈殿物を除去するために遠心した後、各反応混合物10−1を薄層ク
ロマトグラフィー(TLC)プレート(Polygram Cel 300 P
E1. Macherey−Naged、Duren、W。
Gervany、 U、S、販売元5ybron/Br1nksan、 Wes
tbury+ NY)上にスポットした。 こ(7)TLCプレートを1.5
M(7)KH2P O4、pH3,65中に、約2時間展開せしめ、オートラジ
オグラフせしめ、そしてGTD及びサイクリック−ジー〇MPに相当するTLC
プレート上の領域を切り出し、シンチレーション計測器において計数せしめた。
困又斐二三>fヱ二土工
セルロースシンターゼ活性の復帰を観察するため、セルロースシンターゼ陰性で
あり、且つジグアニレートサイクラーゼ陽性である株を単離する必要がある。以
下のスクリーニングアッセイは前記のセルロースシンターゼ活性測定を改良した
ものであり、そして2つの異なる酵素を包含する突然変異を、GTP又はc−d
i−GMPの有無においてセルロースシンターゼ活性を比較せしめることにより
検定するために用いられうる。このアッセイは懸濁した、超音波処理細胞による
セルロースの生成により測定される。
突然変異ヱ皇上バU二株は、超音波処理細胞を複数の条件下で測定することによ
り分類する。3つのクラスのアセドパL叉二突然変異体が同定された。クラスI
(セルロースシンターゼ陰性)株はいづれのアッセイ条件のもとでもセルロース
を生成しなかった。クラス■(ジグアニレートサイクラーゼ陰性)株はc−di
−GMPの存在下においてセルロースを生成したが、GTPの存在下において
は生成しなかった。
クラス■の突然変異はGTP又はc−di −GMPのいづれかによる活性化後
、セルロースを生成した。クラス■及びmにおける突然変異体はセルロースシン
ターゼを含み、そしてインビトロで活性を示したが、しかしインビボではわずか
、又は全つくセルロースを生成しなかった。クラス■突然変異体におけるこの欠
損は、生化学的に定義できなかった。
スクリーニングアッセイは以下の条件:1)ヌクレオチド無添加;2)0.4蒙
りのGTP添加;及び3)5MMのC−di−GMP添加、のちとで行った。
酵素の由来及び用いた緩衝液について除外して、このアッセイ方法及びコントロ
ールはセルロースシンターゼ活性測定についての前記と同じである。
6つの突然変異ヱ」」ニーとL1株を単一のスクリーニングにおいて測定した。
全てにつき、セルロースシンターゼ活性及びジグアニレートサイクラーゼ活性の
両者を有するアセトffl二株を、アッセイ間の一貫性を監視するために含ませ
た。
選別せしめたヱ土上二り叉二株を約24時間、30°Cで増殖せしめた。生育培
地はR70−2,1%のアンプレックス1003(Ambr1003(A; T
YE、 Universal Foods+ Milillaukee、 Wl
)、4%のフルクトース、0.01%のV/VダウコーニングアンチフオームB
(Dow Corning Antifoae B)及び50a+Mの3,3−
ジメチルグルタル酸(DMG)、pH5,oを含む; 125m1のバッフルシ
ェークフラスコにおいて、25+*lの培地を凍結シードバイアルからの細胞に
より感染せしめた。細胞を集める前に、R70−2+0.5%のTYE及びグル
コースアガープレートを、夾雑について検定するために画線培養した。このプレ
ートを30°Cで約3日インキュベートした。
細胞を集めるに先立ち、集塊を防ぐために0.6 MのEDTA5m+]をこの
培地に加えた。この細胞を遠心しく5000rpm、10分間、JA210−タ
ー)、そして上清を捨てた。このペレットを50+sMのリン酸カリウム緩衝液
、pH6,020+*l に懸濁せしめ、そして集塊を低めるために5MのNa
Cl3m1を加えた。
細胞密度は、クレット(Klett)メーター(10クレント単位(’KUJ
) =約40−gの細胞/ml)により測定した。この細胞を再度遠心しく 5
Kppra、10分、JA210−ター)そしてこの上清液を捨てた。このペ
レットを50−MのN−(2−ヒドロキシエチル)ヒペラジン、N’−3−プロ
パンスルホン酸(EPPS。
Sigma)緩衝液、pH7,5中で20w+gの細胞/ m ]迄懸濁した。
二の細胞を超音波処理するため、0.5mlの各細胞懸濁物を1.51のエッペ
ラドルフ遠沈管に移し入れた。各チューブをカップソニケータ−(Branso
n 5onic Power Co、、 Model 350+Plainvi
ew、 NY)内で、1分間、80%の衝撃周波数、設定値7で超音波処理した
。アッセイは前述の通り、各アッセイチューブについて50μmの超音波処理細
胞懸濁物、50mMのトリスの代りに50+sMのEPPS (pH9,0)を
含み、1+sMのEDTAを使用せず、そして10mMのMgCl2の代りに2
0mMのM g C1zを加えたものを用いて行った。各アッセイ条件は二重測
定で行い、そしてこの二重測定結果を平均した。
複数のCe1−株を生化学的に特徴付けた。株1306−24(1306−3由
来)は正常なるジグアニレートサイクラーゼ活性を有するが、セルロースシンタ
ーゼ活性を欠損することが見い出せた。株1306−42 (1306−21由
来)及びC90−1(1306−21由来)はジグアニレートサイクラーゼ及び
セルロースシンターゼ活性の両者を欠損する。これらの株を次の研究のために採
取した。
■
コスミドベタ −の びコンジュゲーション ゛新規のコスミドベクターpKT
230 c o s 5を、セルロースシンターゼ遺伝子のクローニングについ
ての図2における概略の通りに作製した。このベクターはストレプトマイシン耐
性遺伝子(Ss) 、ファージラムダのCOSフラグメント及び異種DNAの挿
入のためのクローニング部位を含む。
ラムダCOS部位を含む1.85KbのDNAフラグメントを、プラスミドp
V K100(Knaut and Ne5ter、(19B2) Plasm
fd8:45−55)から、制限酵素BglUによる分解から切り出し、そして
プラスミドpUc19におけるBamH1部位においてクローン化せしめた(N
ew England Biolabs Catalog)、この新規のプラス
ミドP UC19c o s 2を制限酵素Hindn[及びXmaIで分解せ
しめ、そして1.85KbのCOS含有フラグメントを含む)findlll−
Xmalフラグメントを、XmaI−及びHindl[分解プラスミドpKT2
30中でクローン化せしめ、これによりカナマイシン耐性遺伝子を不活性化せし
めた。この得られるベクター、コスミドpKT230cos5は一旦一、ユ」−
から1(−)28とL二への自己感染ができない。
それ故、ヘルパーブーyスミドp RK2O13が、p KT23Oc 。
土5の供与細胞か頓乙1旦払久久二株1306−24の受容細胞への転位移送に
必要である。 pKT230 c o s 5により形質転換せしめたE コリ
株MM294を、100 p g /mlのSmを含む、R2培地(20,0g
のトリプトン、10.0gの酵母抽出物、10.0 gのNaC1,1,0リツ
トルの蒸留水、p)16.9及び28ノlのグルコース(R2−4) 、更に任
意に15g/Iのバタトアガー)中で37℃で150KUのクレット値化増殖せ
しめた。動員プラスミドp RK2O13を含む旦−ユニ株HBIOIを、50
μg/s+lのKmを含む、R2−4培地にて37°Cで150KUのクレット
値化増殖せしめた。このヱj」二進LL=受容細胞1306−24をR20−2
培地中で30°Cで200KUのクレット値化増殖せしめた。各供与細胞1■l
を動員し、そして2+nlの受容細胞を混合し、そして0゜2ミクロンのゲルマ
ン(Gelman)ディスポーザブルフィルター(Gelman、 Ann A
rbor、 Ml)で濾過せしめ、抗生物質を伴う105g1のR2培地で、2
回洗浄せしめた。このフィルターをR2−4培地を含むアガープレート上にて平
板培養した。このプレートを30℃で3時間インキュベートし、交配を行った。
この3つの株間の交配後、このコンジュゲーション混合物を0.9%の塩化ナト
リウム2−1中に再懸濁せしめた。この溶液0.1m1を、50μg/mlのS
m及び20μg/++elのCmを含むR20−2培地アガープレート上で平板
培養せしめた。このプレートを30°Cで5日間インキュベートした。ヱ」」ソ
εlL二株はもとから20μg/mlのCmに耐性であるが、旦−ユ見株はそれ
に対して感光性である。それ故、供与プラスミドを受け入れた7(−)/<?L
ニコロニーのみがこれらの選択プレート上で生育した。その後の制限分析は、コ
スミドPKT230cos5がヱ!二株1306−24におけるいかなる転位も
行なわれなかったことを示した。
猷
アセトバク −DNA−イブ−!−の
ラムダファージは長さにおいて38から52KbのDNAを、もしCOS部位が
その両端に存在するならばパッケージするであろう。ベクターpKT230 c
o s 5は比較的小さいため(13,5Kb)、大量のヱi工二U二DNA
(2Bから37Kb)をラムダファージ粒子の中に挿入し、パッケージできる。
アセドパU二のゲノムサイズが一旦エエユJ−のそれと等しいと考えるなら、7
00から1000クローンのみが完全な遺伝子バンクを得るために必要であると
考えられる。DNAバンクはアセドパm株1306−3から、以下の通りに作製
される。
約26yagの核酸がR20−2アガープレート上の二車上バlえ二1306−
3菌叢から単離された。この核酸をRNa s eA及びRNaseTlにより
処理し、このサンプルにおけるRNAを分解せしめた。総量560μgのDNA
が回収された。このDNAを制限酵素5au3Aの4つの異なる酵素濃度で部分
分解せしめた。このDNAを10−40%のスクロースグラジェントに基づいて
、サイズにより分画せしめた。27−38Kbの間の最も多量のDNA分子を含
む両分を選んだ(約2μgのDNA)。
約1μgのこのDNAを、BamHI分解、且つ脱リン酸せしめたpKT230
c o s 5の中にリゲートせしめ、そしてこのリゲーション分解物をラム
ダファージ粒子の中にパッケージせしめた0次いでのファージ粒子をE、コリ株
に802recA−を感染せしめるために用いた。6つのランダム旦、ユ1単離
物から単離したコスミドDNAを挿入DNAフラグメントのサイズの測定に用い
た。この6つのクローンは平均サイズ28Kbを有する、8から40Kbに範囲
するDNA挿入物を有していた。約2000のクローンを採取し、それぞれをマ
イクロタイター皿にて増殖せしめ、そしてその後のスクリーニングのために保存
せしめた。このバンクをp KT230 c 。
五呈
セルロース セ バク − にお番るセルロースシンーゼ ′ せしめるクロー
ン DNAの−び皿
セルロースシンターゼ活性の復帰についての遺伝子的相補アッセイを、Ce1−
ヱ土上バえL二突然変異体におけるセルロースシンターゼ活性を復帰できるコス
ミドDNAの単離のために用いた。
コンシュ°−シッン のアセ バク −゛ −バンクのス久エニ三ヱl
遺伝子バンクp KT230 c o s 5 : 1306−3A 2からの
コスミド(例■に記載通りに得られたもの)を、以下に詳細の多スポットコンジ
ュゲーション方法における動員プラスミドp RK 2013を用いるスクリー
ニングのために受容突然変異ヱ丸上ffl二株1306−24の中に移し入れた
。
二車上バU二株1306−24をR20−2培地中で、30℃で振騰させながら
約28時間、100−150KUのり一レット値となるまで増殖せしめた。旦−
ユニHB 101/ p RT 2013をR2−4培地及び50μg/+wl
のカナマイシン(K−)中で、37℃で振騰させながら、100−150KIJ
のクレット値となるまで増殖せしめた。
イクロタイタートレーから、100μlのR2−4培地及び50μ/請lのSm
を含むマイクロタイター皿の中に感染せしめ、そして振騰せずに約18時間、3
7℃でインキュづ一卜せしめた。
この旦、ユ4 HB 101 / p RK2O13培養物を遠心し、Kmを除
去せしめるために当容量の0.9%の生理食塩水で洗浄し、再度遠心し、そして
生理食塩水でもとの容量の1/10における再懸濁により濃縮した。10μl容
量のこの濃縮旦−ユニHB 101 / p RK2O13を、旦−ユニに80
2 r e c A−p KT230c o s 5 : 1306−3−A
2の18時間培養物100 u 1を含む各マイクロタイターウェルに添加した
。10μm容量の、この混合したH B 101 / P RK2O13及びに
802 r e c A−p KT230c o s 5 : 1306−3−
A 2培養物を、8チヤンネルピペツトを用いて乾燥した150g++wのR2
−4プレート上に、マイクロタイタープレートウェルのパターンと一致する方向
においてスポットし、従って各トランスコンシュガントが旦一旦ユコスミドバン
クにおけるそのもとの位置にトレースできるようにした。このスポットが乾燥し
たなら、更に10μlの各混合培養物をもとのスポット上に載せ、そして乾燥せ
しめた。これを繰り返し、50μlの各混合培養物が載るようにした。このヱ皇
上二又叉二1306−24培養物を遠心し、そしてもとの容量の1/10の0.
9%の生理食塩水に再懸濁せしめた。この濃縮培養物10μmを、8チヤンネル
ピペツトにより、R2−4プレート上のHB 101 / p RK2O13及
びE、コリに802 r e c A−p KT230 c o s 5 :
1306−3A 2スポツトのそれぞれに載せた。このスポットを乾燥せしめ、
次いでこのコンジュゲーション混合物をR2−4プレート上で30°Cで3時間
インキュベートせしめた。
どのトランスコンシュガントがセルロースを生成するかを検定するため、各交配
混合物を除菌つまようじにより交配プレートから取り出し、そして13 X 1
00s+−チューブ中の0.5%のTYE、3%のグルコース、25−MのDM
G、20μg/mlのCm及び50μg/閣1のSmを含むR70−22諺lの
中に直接感染せしめた(「試験管選択スクリーニング」)、抗生物質Cmは旦−
ユl供与体及び補助親株の生育を阻害する。抗生物質Smはコスミドを受け入れ
ていないヱ]」コシl−二株1306−24の生育を阻害する。これらのチュー
ブを30℃でインキュベートし、そして7〜14日目に月末の形成について検査
した。
この方法はトランスコンシュガントが生成したセルロースの識別を可能にした。
コスミド転移のために前述した多スポットコンジュゲーション方法及びセルロー
ス生成のための試験管選別スクリーンを利用しながら、バンクp KT230
c o s 5 : 1306−3A 2 di来の487個のコスミドをアセ
トバクターセルロースシンターゼ突然変異1306−24との交配において用い
た。これらのコンジュケーション中、386個が有用なコスミド転移を示した。
この交配混合物のうちの3つは直立試験管スクリーン開始後、30°Cで14日
間のインキュベーションにより薄膜を形成した。
これら3つのコスミド供与培養物をTl9G9.T2OA1及びT20B6と命
名した。
これらのコンジュゲーション混合物を直接平板培養した際、Ce l”表現型を
示すトランスコンシュガントコロニーは現れなかった。コンジュゲーション混合
物を直立試験管に感染せしめることでセルロースの生成が検出された場合のみが
観察された。後の研究において、Cel’活性の復帰は組換に富国し、真の相補
によってではないことが観察された。このことは、単に平板培養に転るよりも、
試験管選別を利用するスクリーンについての必要性を意味しうる。
フィル −六 におしるセルロースシン −ゼ2 の′ の鐘認
コスミド719G 9 、 T20A I及び720B6であって、その130
6−24 )ランスコンシュガントが前述の試験管選別スクリーンにおいて薄膜
を生成したものを、例■における方法に従う、ヱ文上バえ1二1306−24
(受容体)、E、コリHBIOIp K T2O13(ヘルパープラスミド株)
、並びにE、コリpKT203 c o s 5 : 1306−3A2 71
9G 9.−720A 1及び−72B6(供与株)による、フィルターコンジ
ュゲーション方法により行われる転移において更に試験した。
100μmの交配混合物を試験管選別スクリーンのために感染せしめた。これら
のコンジュゲーションについてのコンジュゲーション頻度を、交配混合物の連続
希釈を、20μg/mlのCm及び40 u g /mlのSmを含むR20−
2プレート上におけるコンジェゲーション後、直接平板培養することにより検定
した。陰性コントロールとしてベクターpKT230 c o s 5をこれら
のコンジュゲーションと平行して1306−24に移し入れ、平板培養し、そし
て試験管に感染せしめた。これら1306−24 pKT230 c o s
5 )ランスコンシュガントは直立試験管スクリーンにおいて薄膜を形成せず、
そして直立試験管におけるCe1−成育及び薄膜形成間の区別のためのコントロ
ールとして働く、先に同定した3つのコスミドのうち、コスミドp KT230
c o s 51306−3A2 719G9のみが陽性の結果、即ち、直立
試験管スクリーンにおけるCe1−から、Cel”の転換株1306−24を示
した。コスミドTl9G9のコンジュゲーシッンの頻度は受容細胞当り7. O
X 10−”であった。
■立
p KT230 c o s 5 T19C,9を有するl−ユニとアセトバク
ター1306−24とのコンジュゲーションをフィルター上で行った。100μ
lのコンジュゲーション混合物を前述の通り、試験管選別スクリーンのために感
染せしめた。7日後、試験管において薄膜が形成され、そしてこれを0.9%の
NaCl25m1にて、ブレンダーによりかき混ぜた。得られた懸濁物を、単一
コロニーのために20μg/mlのCm及び40μg/+alのSmを含むR2
0−2プレート上で画線培養した。Cel“コロニーを採取し、そして1306
−24 T19G 9 #106と表示した。
1306−24 Tl9G 9 #106から単離したコスミドは、長さにおい
て16.6Kbであった。T19G 9 #106を有するE、コリ株に802
recA−を受容体として利用した場合、ヱ皇上、R91=トランスコンシュガ
ントは試験管選別スクリーンにおける試験管の100%においてCeビ表現型を
示した。それ故、16.6Kbのコスミドは1306−24のCe1−突然変異
におけるセルロースシンターゼ活性を復帰できる。制限分板は、Tl9G9#1
06はT19G9の欠落生成物であることを示した。インタクト遺伝子をクロー
ン化後のヌクレオチド配列分析は、コス:: )’Tl9G 9 #106が不
完全セルロースシンターゼ遺伝子伝子を有し、ここでその欠落部位はその遺伝子
コード化領域における固有BamH1部位から142bp 3 ’に位置するこ
とを確証せしめた。
サザンハイブリダイゼーションにおいて、コスミド719G9由来の1.8Kb
のBamHI−3ma I7ラグメントはオリゴプローブMK172 (この配
列は図1におけるヌクレオチド4564から4582に広がる)と強くハイブリ
ダイズした。セルロースシンターゼの分子量が120Kdより大きくないなら、
1.8KbのBamHI −3ma Tフラグメントはこの遺伝子の3′末端を
含まないであろう。この説を確認するため、全長セルロースシンターゼ遺伝子を
有するプラスミドを以下の通り、三種のリゲーションにおいて作製した。
コスミドベクターpKT230 c o s 5を第1にBamHIで分解し、
そしてその末端を4種の全てのデオキシリボヌクレオチド3リン酸の存在下にお
いてフレノウ(Klenow)酵素により修復せしめた。このDNAを更にHi
ndlI[により分解せしめた。セルロースシンターゼ遺伝子の3′末端を含む
Tl9G9由来の3.5KbのBamHl −3ma Iフラグメント及びセル
ロースシンターゼ遺伝子の5′末端を有するT19G9#106由来のり、L!
lLd III −B a m HIフラグメントを、TRT18−1を作製す
るためにHindIII−BamHI修復ベクターpKT230 c o s
5の中にリゲートせしめた。このTPTlB−1についての作製は図3に示す。
會[
セルロース トーンコンシュガントにおけるインビトロでのセルロースシン −
ゼ“1
7−k )/−とLニゲノミツクDNAの3KtlJI域(コスミドTl9G
9 #106 )はヱ皇上バm株1306−24にCe l’表現型を復帰でき
る(例■)。本例はトランスコンシュガントヱ皇上べ久久二株1306−24に
おけるセルロースシンターゼ活性の復帰を詳細する。利用したアッセイは例■に
おけるスクリーニングアッセイとして記載したものである。
ヱ」」二立乙工二株1306−3(Cel” )より成るコントロール及び株1
036−24 (Cel−)のそれぞれはベクターpKT230cos5を有す
る。CeM株1306−24 Tl9G 9 #106(「トランスコンシュガ
ント」)はベクターpKT230cos5における二車上1ニゲノミツクDNA
の3にbのフラグメントを有する。この細胞を5抛g/IのSm及び20−g/
lのCmを加えた例■における記載に従って生育せしめた、細胞を集め、セルロ
ースから分離し、洗浄し、濃縮し、そして前述の通り超音波処理した。インビト
ロでのセルロースシンターゼ活性を測定し、そしてピアース(Pierce)
(ChemicalCompany+ Rockford、 IL)より開発さ
れたBCA(ビシンコニン酸)タンパク質測定を超音波処理細胞調製物のタンパ
ク質濃度の測定のために用いた。株は2mg細胞/mlの濃度で測定された。ま
た、株1306−24 p KT230 c o s 5及び1306−24T
19G 9 #106を有効濃度効果の検定のため、5mg細胞/1で測定した
。
表1に示す通り、株1306−24 p KT230 c o s 5及びトラ
ンスコンシュガント1306−24のセルロースシンターゼ活性は、この測定で
の細胞濃度に影響されなかった。1306−3 p K T230cos5の活
性は株1306−21の活性(図示せず)と類催していた。それ故、ベクターp
KT230 c o s 5はセルロースシンターゼ活性を及ぼさないものと思
われた。株1306−24はc−di−GMPによる活性化に基づく低レベルの
セルロースシンターゼ活性を示した。これはほとんどのクラスI (セルロース
シンターゼ陰性)アセトバクター突然変異体についての事実であった。セルロー
スシンターゼ活性における突然変異はインビトロで幾分漏出ぎみであるが、細胞
はインビボでは非常に少量のセルロースを生成した(フラスコ振騰において)。
この3Kbの挿入物は株1306〜24のセルロースシンターゼ活性を、測定チ
ューブにおける5mg細胞/ m Iにて大まかに10倍(0,4から4.in
モル/分mg)上昇させた。このことはセルロース陽性表現型の出現と関連する
。トランスコンシュガント株1306−24は、セルロース陽性株1306−3
と同等のC−di −GMPを刺激活性を有していた。
適当なコントロールを利用した別な実験におけるTRT18−1について結果は
、このプラスミドがCe1−表現型からCe ]”への転換を可能にし、そして
第2にインビトロアッセイにおいて、この酵素活性は、表1に示す通り、3Kb
のT19G 9 #106ヱ土上バL叉二DNA挿入物を有するpKT230c
os5ベクターについて観察できた活性と対照的であった。
糞よ
Ce1−からCe I” への株1306−24の転換:インビトロセルロース
シンターゼ活性の回収率測定における細胞濃度 セルロースシンターゼ(消費U
DPGのnモル)
1306−3pKT230並■ 2 0 4.11306−24pK723匹匹
52 0.20.61306−24+1nsert’ 2 0.2 3.913
06−24+pKT230皿 5 0.1 0.41306−24+1nser
t’ 5 0.1 411 3KbのT19G 9 #1067−4! )ソ立
とL二株DNA挿入物を有するpKT230 c o s 5
■ユ
セルロースシン −ゼB゛ −のヌクレオチド 1本例において、コスミドT1
9G 9 #106上にあるセルロースシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列の
決定のため、本発明のクローン化セルロースシンターゼB遺伝子の制限地図をサ
グクローニング方法を説明するために用いた。
コスミドT19G 9 #106におけるセルロースシンターゼ遺伝子を有する
クローン化挿入DNAを制限酵素を用いて物理的に地図化した。この地図情報を
次に、Methods in E旦ル虹ユ101:20−78 (1983)に
おいてMessingの記載する方法に従うシーケシング分析のため、ヱ鬼上へ
り叉二DNA挿入物をM13RF DNAにサブクローンせしめるために用いた
。制限フラグメントのヌクレオチド配列は、Inn1s他の(1988)Pr匹
ニル態I Acaム」jエユ針85:9436−9440に記載の、工1lDN
Aポリメラーゼ(Cetus Corp、 Eseryville、 CA)を
用いた鎖停止方法により決定した。
■
″炊・ アセトバク − 1306−24にお番るセルロースシン −ゼ゛ −
−びセルロースシン −ゼ2 の′セルロースシンターゼがプラスミドT P
T18−1から表現されているかを調べるため、三つの異なるフレームシフト突
然変異をセルロースシンターゼ遺伝子コード化領域に導入せしめた。この突然変
異遺伝子をプラスミドTRT1B−1に導入せしめ、次いでそれぞれヱ鬼上バ玄
り二株1306−24に移し入れた。
三種の突然変異体をセルロースシンターゼのコード化領域の中に、以下の通りに
導入せしめた:Bglllリンカー配列をヌクレオチド位23113でのEco
RV部位及びヌクレオチド位置3954でのStu1部位に導入せしめた。この
EcoR■挿入はフレームシフト突然変異と同様に停止コドンTGAを作り出す
。4564の位置のStu 1部位に導入した8glnリンカ−はフレームシフ
ト突然変異を作り出す。第三の突然変異をヌクレオチド位置1899のBamH
1部位に導入し、そしてこれはフレノウによるBamHI部位の埋め合わせによ
り作られる。
これらのプラスミドのDNAは制限分解により分析され、DNAシーケシングに
より評価される。各突然変異遺伝子をクラスI突然変異株1306−24とコン
ジュゲートせしめた。プレートからの単一コロニーを直立試験管に移し、そして
これらのコンジュゲーシヨンの結果を表2に示す。薄膜を形成する能力は、コン
シュゲージロン混合物、又は選別プレートからのコロニーにより直接感染された
チューブにおいて表記した。全ての突然変異遺伝子は1306−24において存
在するCe1−突然変異の転換を可能とし、こ9ことは突然変異の転換はプラス
ミドと染色体の間の組換を介して起こることを推論させる。
この結果より、染色体及びプラスミドシンターゼ遺伝子が遺伝子の機能的なコピ
ーを形成するために組織したことが考えられる。おそらく、転写及び翻訳シグナ
ルが染色体コピーにより提供されたのであろう、定性的に述べると、全てのチュ
ーブにおいて形成された薄膜のサイズは同程度であり、全てのトランスコンシュ
ガントにおける表現型のレベルが同等であると考えられる。
中で、氷の上に2−20時間置き、その後その沈澱物を20,000xgで45
分間、0−4℃で沈降下せしめた。
この上清液を除去し、そして等容量の蒸留水を加えた。等容量の、2度蒸留した
、トリス平衡化フェノール(pH8,0)を加え、そしてこのチューブを20℃
で、5000X gでの15分間の遠心の前に、3−4分間にゆっくりとひっく
り返し続けた。
水相をパスツールピペットを用いて慎重に取り出し、この容量の2〜3倍の容量
のポリプロピレンチューブに移し入れた。
次に、3MのNa0Acl/10容量及び無水EtOH2−3倍容量を加え、よ
く撹拌し、このチューブを一20°Cで一夜放置した。上清を遠心(20,00
0X g、30分間、0℃)で集め、そしてベレットを5 10m1の冷70%
EtOHで洗浄し、その後ペレットを回収するために20,0OOX gで10
分間再遠心せしめた。このベレットを50−100 μlのT E (100e
eMのトリス、1sMのEDTA)に溶解した。プラスミドDNAをエチジウム
ブロマイド−CsC1密度遠心により精製した。
このプラスミドを物理的に地図化するため、CsC11i製DNAを以下の制限
酵素:HindI[I、EcoRI。
PstI、BamHI、5acl、PvrIIにより分解せしめた。試験した酵
素の中で、5acIのみこのプラスミドを直鎖化できた。
5acI分解プラスミドをE、コリにおけるクローニングのために5acI分解
プラスミドp U C1B(New England Bi。
Jabs)にリゲートせしめた。このシャトルベクターをpUC18−824と
表示する。p U C1,8−824の物理的地図化のため、このプラスミドを
種々の制限エンドヌクレアーゼにより分解せしめた。p U C18−824の
制限地図を図4に示す。
l上
エレクトロトーンスフォーメーション
シャトルベクターp U C1B−824を二皇上バL久二株に移すことができ
ることを示すため、p U C1B−824プラスミドDNAを、Clewei
1. et al、、 (1972) J、 Bacteriol、 110:
667に従て、p U C1B−824を有す旦一旦ユ宿主株DC9Bから調製
した。ヱ−4=)/<? −株1306−21及び1306−24をDosve
r、 et al−+(1988) (前述)に記載に従って洗浄せしめた。細
菌培養物の形質転換のためにデザインされたエレクトロポレーション装置を、−
ア」L上ヱ立久」−:エレクトロボレーションのために用いた。本例において用
いられた装置は哺乳類用設計エレクトロポレーション装置の改良品であるが、商
業的な装置、例えばバイオランドシーンパルサー装置(Bio−Rad Gen
e−Pulser Apparatus) (120V、 50/60Hz)を
、同等の形質転換率を得るために代用できる。エレクトロポレーションのパラメ
ータはプラスミドp K T230 、c o s 5 T19G 9 #10
6を以下に従って最適化する二株1306−21及び1306−24のために9
.0キロボルト(KV)及び9.5KVの電場がそれぞれ必要である。25マイ
クロフアラデー/750オーム(=18.75 m秒)のパルス持続時間(RC
値)が最適であることが分った。 30″Cで更に5日間のインキュベーション
に基づき、1マイクログラムのDNA当り104個より多い形質転換体が、10
0マイクログラム/mlのアンピシリンを含むR20−2プレート上で得られた
。
p U C18−824プラスミドDNAが4つの1よ」二進とL二候補から単
離され、そしてE コリ及びヱ皇上ffl二に形質転換せしめた。シャトルベク
ターは、アセトバクター中での、増殖後安定であり、なぜなら、制限分析は(4
つの総クローン)全てのポリリンカ一部位の存在及び見わけられる欠損の非存在
性を示したからである。
1−エ
セルロースシン −ゼB゛ −1・ U C18−824の 1セルロースシン
ターゼB遺伝子はプラスミドTPT18−1から単離でき、その作製は例■に教
示され、又は他方、この遺伝子のヌクレオチド配列が本明細書にて提供されてい
るため、この全長遺伝子は化学的手段により直接合成するか、もしくはプライマ
ーを用い、作製された遺伝子バンクから得ることができる0例えば、ブライマー
オリゴヌクレオチドMK170(TGCCCTGGCCAGATGTCAGCA
)が作製した遺伝子バンクから1760個の固有培養物をつり出すために用いら
れ、そして6つのクローンを更なる特徴付けのために単離せしめた。これら3つ
のクローンから単離した3つのコスミドを、T5A1゜TlC2及びT5D2と
命名する。
前記の単離コスミドの制限及びサザン分析は、それら全てが8Kbより大きいセ
ルロースシンターゼB遺伝子のDNA配列5′及びセルロースシンターゼBタン
パク質生成物についての全体をコード化する配列を有することを示した。プロー
ブとしてのプライマーMK170によるコスミドDNAのサザン分析により、T
5A1由来の7.2KbのBamHIフラグメントはセルロースシンターゼB遺
伝子のほとんどの配列、及びこの遺伝子の5′のすぐ隣りに更なる配列を有すこ
とが示された。それ故、7.2KbのBamHIフラグメントをヌクレオチド配
列分析のため、プラスミドpUc18及びpBR322にサブクローン化せしめ
た。7.2KbのBamHIフラグメントの制限地図を図5において示す。この
図に示す約8.3KbのSma Iフラグメントはインタクトの全長セルロース
シンターゼB遺伝子を含む。この遺伝子は、下記のクローニングベクターp U
C1B−824による作製において用いるため、プラスミドT5A1から単離
せしめた。更にサザン分析が示すには、染色体におけるセルロースシンターゼB
遺伝子座の構造はコスミドT5A1のそれと同一であることである;それ故、こ
のコスミドにおける二車上バU二配列は更に再配列されていない。
セルロースシンターゼB遺伝子及び約3Kbの上流配列(図5における制限地図
参照のこと)を有する、8.3KbのSma−ン化せしめた。反対方向の8.3
KbのSma I制限フラグメントを有する得られたプラスミドを、それぞれp
U C1B−824FS−1とp U C1B−824F S−6と命名した
。FS−6の制限地図を図6に示した。このようなプラスミドを1306−24
(セルロースシンターゼ欠損株) 、1306−42及びC90−1(両方と
もジグアニレートサイクラーゼ及びセルロースシンターゼ活性を欠損する)に形
質転換せしめる際、この形質転換体はプレート上にCel”コロニー表現型を示
した。それ故、初期の実験において観察できた「組換現象」とは反対に、8.3
Kbのヱ皇」ヱ8し4二DNA挿入物によりコード化されたタンパク質は突然変
異体が有するセルロースシンターゼ突然変異を直接相補できるものと結論づけら
れる。
インビトロアッセイはプラスミドp U C18−824F S −1及びp
U C18−824F S−6のセルロースシンターゼ陰性突然変異株1306
−24へのセルロースシンターゼ活性の復帰の能力を確証せしめた。形質転換体
及びコントロール株のインビトロセルロースシンターゼアッセイは例■における
記載に従って行った。表3に示す通り、この形質転換体、1306−24 p
U C1B−825FS−1及び1306−24 p U C18−824F
S−6は、もとのCe ]”親株、1306−3のセルロースシンターゼ比活性
よりも高い比活性を示した(それぞれ1.3倍及び1.8倍)。
紅
Ce1−からCel”への株1306−24の転換:インビトロセルロースシン
ターゼ活性の回収率セルロースシンターゼ活性
一床一 −れたnモル[]DPG −m ンパクc−di−GMP無 +c−d
i−GMP1306−3 0.04 2.05
1306−24 0.06 0.07
1306−24 pUc18−824 0.06 0.101306−24 p
Uc18−824 FS−10,102,591306−24pUc18−82
4 FS−60,103,71五xm
プラスミドp U CC19(Ne England Biolabs)を制限
酵素5acIにより分解せしめた。この直鎖プラスミドを5acI−制限された
アセトバクタープラスミド824とリゲートせしめた。得られたプラスミドをp
U C19−824と命名した。
8.3KbのSma Iフラグメント由来のセルロースシンターゼ遺伝子をHi
ndl[I−3maIフラグメント(即ち、4.9Kb)として、pUc19プ
ラスミドのリンカ−領域におけるHindnI−Sma 1部位にクローン化し
く図8を参照のこと)、従ってその転写方向はlacプロモーターと同一である
。
Iacプロモーターは構成プロモーターのため、lac遺伝子生成物の不存在に
おけるセルロースシンターゼの表現はヱ皇上バ久叉二において調節不能となるで
あろう。このプラスミドをpALlと表示する。
pALlをヱ皇上バL叉二株1306−24の形質転換のために用い、そしてそ
れはプレート上にてCel”表現型としてもたらされるセルロースシンターゼ欠
落表現型を相補することアセトバクター染色体からの図5に示す7.2KbのB
amH1制限フラグメントは、セルロースシンターゼB遺伝子の上流に更なる4
、6Kbのヌクレオチド配列を有するものとして同定された。この領域が、セル
ロースの生合成において含まれる遺伝子を含むかを調べるため、セルロースシン
ターゼB遺伝子の上流のヌクレオチド配列を以下の通り検定した。
7.2KbのBamHIフラグメントをpBR322のBamH1部位中で部位
−ン化せしめた。pBR322組換プラスミド由来の7.2KbのBamHTフ
ラグメントの、2.3KbのSa!■フラグメント、0.9Kbの基1上■フラ
グメント及び3.2KbのB a m HI −旦l±IIフラグメントを、ブ
ルースクリプト(Bluescript) (Stratagene) K S
ベクターの5acII又はBamH1部位のそれぞれにサブクローン化せしめた
。これら3つのサブクローン及びpBR322組換プラスミドであってBamH
Iフラグメント全体を有するものを次にCsC]密度勾配により精製し、そして
ヌクレオチド配列分析のためのジデオキシチェーンターミネーション方法におけ
る鋳型として用いた。このジデオキシチェーンターミネーション方法は、前述の
通り、ただし伸長反応においてフレノウフラグメントの代りにシークエナーゼ(
Sequenase)を用いた。
セルロースシンターゼオペロンのヌクレオチド配列は、図1に示す。ヌクレオチ
ド2594のATGコドンがセルロースシンターゼB遺伝子の開始コドンと考え
ると、セルロースシンターゼB遺伝子のコード化領域ヌクレオチド配列はヌクレ
オチド2594から4999迄広がる。成熟タンパク質はヌクレオチド2666
のアラニンコドンから開始するため(例XrV参照のこと)、このセルロースシ
ンターゼは24のアミノ酸の誘導配列を有するものと理解される。この誘導ペプ
チドの推定アミノ酸配列は、種々の細菌由来の分泌物及び膜タンパク質が有する
誘導タンパク質と機能的に類似する。それ故、セルロースシンターゼB遺伝子に
よりコード化されるセルロースシンターゼタ1、RNAの単離:ヱ±上バL叉二
1306−21を、20℃g/m1のCm及び0.1%(V/V)のセルラーゼ
(Genencor)を含むR70−2培地において、30℃で振騰させながら
対数増殖の後期迄(0,0,600nm=0.7)増殖せしめた。次にこれらの
細胞を6.00Orpmで10分間、4℃での遠心により集め、そして1mMの
EDTA及び1%のSDSを含むNa0AC,pH6,0の緩衝液25s+1に
再懸濁せしめた。等容量のフェノール/クロロホルム溶液をこの細胞懸濁物に加
え、そしてこの混合物を15秒間超音波処理せしめた。10分間の60℃でのイ
ンキュベーション後、この混合物を遠心せしめ、そして次に水性相をフェノール
/クロロホルムにより更に2回抽出せしめた。抽出後、このRNAをイソプロパ
ツール及びNa0Acにより一70℃で一夜沈殿せしめた。このRNAを遠心に
より集め、100%のエタノールで洗浄し、そして乾燥せしめ、DEPC処理蒸
留水120μlに再懸濁せしめた。このRNA溶液におけるDNAを分解せしめ
るため、D N a s e I (Sigma)を10gg/mlとなる迄加
え、そしてこの混合物を室温で20分間インキュベートせしめた。この分解処理
混合物を等容量のフェノール/クロロホルムにより2回抽出せしめた。次に水性
相のNa0Ac濃度を0.3 Mに調整し、そしてRNAを等容量のイソブロパ
ノ−ルにより沈殿せしめた。この精製RNAを80%のエタノールにより洗浄し
、乾燥し、そしてDEPC処理蒸留水40μlに再懸濁せしめた。
2、プライマー伸長:オリゴデオキシリボヌクレオチドGE13(5’ −TG
CGGCGATAAGTGCACA−3’ )をガンマ−”P ATP及びT4
ポリヌクレオチドキナーゼにより標識せしめた。一体化されなかったヌクレオチ
ドをエタノール沈殿により除去せしめた。この標識オリゴデオキシリボヌクレオ
チドを0.3MのNa0Ac溶液100μmに再懸濁せしめた。このプライマー
の比活性は約4 X 10’cpm/ 2モルであった。標識プライマー(0,
02及び0.2pモル)は、プライマー伸長分析のために用いた。
この標識プライマーを50μgRNAと混合した。この混合核酸をエタノールで
沈殿せしめ、その後50mMのHE P E S 。
pH7,5,l+++MのEDTA及び300mMのNaC1を含む、ハイブリ
ダイゼーション緩衝液30μ】に再懸濁せしめた。
ハイブリダイゼーション反応は30°Cで10分間行った。ハイブリダイゼーシ
ョン後、この混合物をAMV逆転写酵素により処理した。この反応を42°Cで
90分間行い、次いで0.5MのEDTAl u 1及びRNa s e 1
u l (1+g/ml)を加えることにより停止せしめた。37°Cでの30
分間のインキュベーション後、この混合物をフェノール/クロロホルムにより抽
出せしめた。cDNAを沈殿せしめ、乾燥し、そしてIIIIMのEDTAを含
むl0mMのトリス−HCl、pH8,03,czlに再懸濁せしめた。ホルム
アミド4μmをこのcDNA懸濁物に加え、そしてこの混合物を3分間煮沸せし
め、DNAシーケシングゲル上に載せた。
このプライマー伸長分析は、転写開始部位が、セルロースシンターゼオペロンに
おける第1の遺伝子の5′領域に位置することを示した。このオペロンの転写開
始部位を、図1におけるヌクレオチド235の上に位置する下向矢印で示した。
C,−CびDのクローニング
pABCDの構造を図8に概略した。このプラスミドの構造において、PF5−
6の1.8XbのBamH1フラグメントはT RTl1−4由来の5.5Kb
のBamHIフラグメントに置き代っている。PF5−6の1.8KbのBam
HIフラグメントはセルロースシンターゼB遺伝子の3′側の426のbp及び
C遺伝子約1.4Kbを有していた。この置換5.5KbのフラグメントはC遺
伝子全体及び更なる3′配列を含んでいた。TRT11−4に載っているこの5
.5Kbフラグメントは本来719G9から単離されるものであり、そしてTR
Tll−4を作製するために5.5tKbのBamHIフラグメントとしてpU
c18のBamHI部位にクローン化せしめた。
15マイクログラムのTRTll−4DNAを、制限エンドヌクレアーゼBam
HIにより、37°Cで1時間完全に分解せしめた。この分解DNAを0.8%
のGTGアガロースゲル上に流した。この5.5KbのBamHIフラグメント
をゲルから切り出し、電気溶離せしめてエタノールにより沈殿させ、そして少量
のR20に再懸濁せしめた。
℃で】時間完全に分解せしめ、セルロースシンターゼオペロンの5′領域を含む
1.8 KbのDNAを12.6Kbのベクターフラグメントから遊離せしめた
。この分解物を0.8%のアガロースゲル上に流し、そしてp U C18:8
24ベクタ一配列、セルロースシンターゼプロモーター、A遺伝子、及びB遺伝
子の5′領域を含む12.6Kbのフラグメントをゲルから切り出し、そして電
気溶離せしめた。この精製DNAをウシアルカリホスファターゼにより処理し、
その後TRTll−4から単離した5、5KbのBamHTフラグメントとリゲ
ートせしめた。
リゲーションは、5.5Kbの挿入物の12.6XbのベクターDNAに対する
モル比を10=1で、標準条件のもとで行った。このリゲーション混合物を旦−
ユfi DGIOIコンピテント細胞を形質転換させるために用いた。この形質
転換混合物を、50μg/mJのアンピシリンを有するR2−4プレート上に平
板培養し、そして37°Cで一夜インキュベートせしめた。36個のアンピシリ
ン耐性形質転換体がこれらのプレートから採取され、そしてそれらを50μg/
mlのアンピシリンを含むR2培地にて、37°Cで振謄させながら約6時間培
養せしめた。アルカリ溶解ミニスクリーンDNAをこれらの36の形質転換体か
ら単離せしめた。このDNAをエンドヌクレアーゼBamHI及びSma Iに
よる制限分解により分析した。この単離物のうちの6個はこの5.5Kbのフラ
グメントの挿入を示したが、その6個のうちの2個のみがB遺伝子オープンリー
ディングフレームを復帰せしめる正しい配向におけるこの5.5Kbフラグメン
トを示した。これらの単離物をpABcD#1及び#32と称し、図8において
プラスミド地図に関連する制限パターンを示した。
プラスミドを含む培養物を精製プラスミドDNAを調製及び単離するために用い
た。10μgのpABcD#lDNAを、標準のエレクトロポレーション条件の
もとで、1306−3細胞40μlを形質転換させるために用いた。1allの
R20−2培地をこの形質転換混合物に加え、そしてこの細胞を100u100
u+のアンピシリンを含むR20−2プレー上に平板培養した。30°Cでの7
日間のインキュベーション後、547個のアンピシリン耐性コロニーがプレート
上に見られた。376個のコロニー(約69%)は非常に先のとがったCel”
コロニー表現型を示し、171個のコロニー(約31%)は平らな、ややいぼ状
ではあるがCe l”表現型であるものを示した。各タイプのコロニー4個を、
アンピシリンを100μg/−1で有するR 20−2上に、30゛Cで4日間
画線培養せしめた。4日後、8プレート全ての上のコロニータイプは区別できな
かった。わずかにとがったコロニーの画線培養物からの1つのコロニーを、0.
5%のTYE、3%のグルコース、 25mMのDMG、0.1%のセルロース
及び50μg/mlのアンピシリンを有するR 70−2 25+Illに移し
、30℃で24時間、振謄しながらインキュベートした。24時間後、グリセロ
ールをこの培養物に全容量の15%になる迄加え、そして1.5mlのアリコー
トを一70°Cの保存のために凍結した。この保存品を1306−3 p A
B CDと称する。
D、セルロースシン −ゼオベロンの配置 び ゛告セルロースシンターゼオペ
ロンのシーケンス化のために、チェーンターミネーション方法を用いた。オペロ
ンを有する二本鎖DNAをDNA鋳型として用いた。pABCD由来の領域のヌ
クレオチド配列を図に示す、セルロースシンターゼオペロンは長さにおいて92
17bpであり、4つの遺伝子より構成される。遺伝子A、B、C及びDは、そ
れぞれの長さが2.262bp、 2.406bp、 3.957bp及び46
8bpである。遺伝子生成物により決定される分子量及びその推定機能は以下の
通りである。
」」4五
注」V肚 −アヨ慮−乙j峡3曳1E 分j−! 半うA、 754 84にb
生体外セルロース合成;生体内活性におけるングア
ニレートサイクラーゼ及び
セルロースシンターゼ
8 802 85Kb 生体外セルロース合成:生体内活性におけるセル口
−スシンターゼ
C1319141Kb 生体外におけるセルロース合成
り 156 17Kb 生体外におけるセルロース合成
り遺伝子の3′未満のDNA配列のコンピュータ分析は、安定なステム及びルー
プ構造を形成する能力を有する領域を示した。図1における下線領域に示す通り
、この領域はD遺伝子のターミネーションコドンの26bp3’側に位置し、そ
してオペロンの転写終結領域に相当する。
■Xy
におしる 、セルロース びセルロース2之ヱニ亙這立
A 1306−21 UCl3−824 ABCDによる 穴この研究において
、1306−21 p A B CDにおけるセルロースシンターゼ活性の過剰
表現を振騰フラスコ実験において試験した。1306−21 p A B CD
の構造は1306−3 p A B CDの構造と類似していた(例XIVを参
照のこと)。この実験の全ての段階のための培養培地は、10μMのl”ecl
x、1%のTYE、25mMのDMG及び4%のグルコース(1306−21)
又は4%のフルクトース(1306−3)を有するR 70−2であった。シー
ド培地は0.1%のセルラーゼを含んだ。培養物を含むプラスミドを増殖するた
め、アンピシリンを50μg/■l迄培地に加えた。培地を125m1のパンフ
ルフラスコの中に、フラスコ当り25m1づつ分配した。株1306−21.1
306−21 p U C1B−824(宿主細胞にシャトルベクターを加えた
もの) 、1306−21pUc18−824 pABCD (正常−一親株と
同様の表現型)、及び1306−21 pUc18−824 pABCD (尖
頂状−一プレート上でその増殖は増大し、そして親株よりもより尖っている)を
それぞれ試験した。各培養物を、滅菌生理食塩水を用いて0.72 g / L
に調整した(濁度1.80D、I。)。試験フラスコを0.2mlのシード培養
物で感染せしめた(感染、2%(V/V))。
各棟につき6つのフラスコを感染せしめ、そして30℃、125rpm、2イン
チ振騰範囲でインキュベートした。フラスコを1.2及び5日後に回収した。細
胞質量及びセルロース測定のため、
二重測定フラスコを各時点で回収した。更に、5日目のフラスコからの培養物を
、プレート上における抗生物質耐性の観察(バッチテスト)によりプラスミド保
持力について検査した。各棟につき、30のコロニーを試験した。
セルロース生成及び細胞濃度を測定するため、各サンプルのフラスコ内容物を1
00m1のビーカーに移し入れた。次いでこの懸濁物、大チクマー(Tekma
r)プローブにより、その最大出力の50%で1分間解離せしめた。その後、こ
の懸濁物を5、 OOOrpmで10分間遠心せしめた。上清液を捨て、そして
このペレットを151の生理食塩水溶液に再懸濁せしめ、そして時折撹拌しなが
ら15分間インキキュートした。このサンプルを再度遠心し、そして上記の洗浄
工程を繰り返した。
第2の洗浄工程からのペレットを0. I NのN a OH15n+1に再懸
濁せしめ、そしてゆっくりとした撹拌を伴って60分間、60°Cでインキュベ
ートした。この懸濁物を遠心し、このNaOH上清液を細胞濃度の分析のために
用い、そしてこのペレットをセルロース濃度分析のために用いた。
ペレットは15++]の脱イオン水に再懸濁せしめ、そして時折撹拌しながら室
温で15分間放置した。次いでこのサンプルを遠心し、そして上記の洗浄工程を
総計3回繰り返した。最終の遠心工程の後、このセルロース沈殿物をバキューム
オーブン内で60℃、−夜乾燥させ、その後秤量した。
上清はMCIにより中和しく0.5mlのサンプルに約0.05m1のHCI)
、そしてタンパク質濃度をローリ−(lowrい方法により測定した。
細胞濃度=タンパク質濃度X1.54
細胞増殖及びセルロース生産は表4に要約した。
表土
1日 1.78 ±0.006 0.51 ±0.03 3.522日 4.5
8 ±0.32 1.16 ±0.02 3.955日 6.99 ±0.16
2.92 ±0.15 2.401306−21 UClB−824
1日 0.91 ±0.01 0.14 ±0.06 6.542日 3.59
±0.21 0.92 ±0.08 3.915日 6.89 ±0.01
3.07 ±0.06 2.241306−21 ABCD(211
1日 1.16 ±0.12 0.14 ±0.04 8.422日 4.78
±0.05 0.72 ±0.04 6.655日 7.59 ±0.07
2.59 ±0.04 2.931306−21 八BCD(声
1日 1.06 ±0.06 0.14 ±0.01 7.412日 4.40
±0.28 0.76 ±0.05 5.825日 7.28 ±0.10
2.81 ±0.01 2.591日 1.87 ±、17 138 ±、11
1.36±6012日 2.67 ±、21 2.11 ±−111,27±
、045日 3.02 ±、81 2.82 ±、19 0.96±90913
06−3 0C18−824
1日 1.56 ±、01 1.26 ±、11 1.24±、102日 2.
39 ±、04 2.25 ±、42 1.08±、185日 3888 ±、
01 3.70 ±、17 1.05±、05邦甜江り躬l引
1日 2.92 ±、11 1.20 ±、04 2.44±、182日 3.
90 ±、01 2.45 ±、03 1.59±、015日 3.66 ±、
13 2.97 ±、07 1.24±、08セルロースの細胞に対する比はセ
ルロース比生産効率についての表示である。増殖の最初の2日間におけるpAB
CD1306−21株においてのセルロースの細胞に対する比は、コントロール
1306−21株のそれよりも明らかに高かった。このpABCD (尖頂株)
はpABCB (正常)株よりもより多くのセルロースを生成するようであった
。両組換株は、コントロール株よりもより多くのセルロースをその増殖末期に生
成した。
アンピシリンマーカーを有する株において、5日間の培養物のプラスミド安定度
は100%を示した。このマーカーの復帰率は、プラスミドにおけるセルロース
シンターゼ遺伝子に起こりうる再配列の程度を示すものではない。5日目の株は
、1及び2日目と同じ速度でセルロースを生成していない可能性がある。この説
を支持する確証は5日目のものの平板培養1 からのコロニー表現型において見
られる。PABCDの尖頂1 株は異常なコロニーをこれらのプレート上に示さ
なかった。
3 、 1306−3pUC18−824ABCDによるセルロース生産は、1
306−3及び1306−3 p U C19−824コントロ一ル株よりも高
かった。
〕 このことは、セルロースシンターゼのインビトロ活性におけ3 る増大に関
連する(下記参照)。この2つの株の細胞増殖は5 類似していた。結果的に1
306−3 p U 018−824 p A B CDによるセルロースの細
胞に対する比は1306−3単独のそれよりも明(らかに高かった。
(セルロースシン −ゼ゛′
1306−3 2.3 0.7 0.31306−3ρυC18−8241,2
0,60,31306−3pUclB−824PABCD 3.5 2.3 0
.3この組換株1306−21 p A B CDは、細胞増殖及びセルロース
生産についてチェマツプ(Che+*ap)発酵器においても試験した。フラス
コにおける観察と比べ、この株の状態は親株のものと類似していた。組換株の不
安定性は高められたセルロース生産性がないことに富国すると考えられている。
染色体セルロースシンターゼオペロン遺伝子の過剰表現は、組換株の不安定性を
低下させるであろう。
B、UCl3−824 FS6 ABの7pUc18−824 FS6 (セル
ロースシンターゼプロモーター並びに遺伝子A及びBを有す)を有する1306
3 (Cel” )の15個の単離体をセルロースシンターゼ活性の過剰表現
ついてのスクリーンのために用いた。この細胞を集め、洗浄し、懸濁し、そして
破壊し、そして標準のインビトロセルロースシンターゼアッセイを例■における
記載の通りに実施した。
15個の単離体全では、インビトロセルロースシンターゼ活性を、コントロール
株(1306−3pUC18:824)のそれよりも明らかに過剰に表わした。
その活性は、コントロール株よりも1.5〜2.4倍高い範囲にあった。15株
のうちの2株(# 302及び# 303)のスクリーンは指数期及び定常期に
て試験した。
条件は例xvにおける記載と[Jするが、ただしグルコースをフルクトースに代
えた。表5において示す通り、2日目にコントロール株1306−3及び130
6−3 p U C18−824の活性は、時間経過にわたる活性の低下を伴い
、1日目の30%及び40%を保持した。2日目の単離体#302及び#303
は1日目の活性の45%及び50%迄低下し、これも時間の経過にわたる活性の
低下を伴った。しかしながら、この後者の株は両方とも1306−3の1日目の
活性よりも約2倍高く、そして2日目では約3倍の活性を示した。
紅
セルロースシン −ゼ′
1306−3 5.5 1.7 0.51306−3 pUclB−8245,
92,40,31306−3pLlc18−824 FS6302 12.5
5.6 0.91306−3 pUclB−824FS6303 11.0 5
.4 1.3これらの組換株におけるセルロース生成は親株について見られたも
のと類似していた。
セルロースシンターゼ活性は、崩壊されたセルロースシンターゼB遺伝子を有す
る株においても抑制されていることが観察された。この遺伝子は、セルロースシ
ンターゼB遺伝子の内在するBamH1部位での、ストレプトマイシン耐性遺伝
子をコード化する1、 I KbのBamHIフラグメントの挿入を介して崩壊
される。ストレプトマイシン耐性遺伝子の挿入は、セルロースシンターゼB遺伝
子をその5′末端付近で妨害せしめる。
五x豆
仇 プロモーターの六
ヱ皇上バl叉二は非常に効率的な組換系であるが、自律DNAの大きなセグメン
トを有する任意のプラスミドによる不安定性の問題を引き起こしうるちのを有す
ることが示された。
この潜在的な問題を解決するため、このオペロンは異種のコントロール要素を利
用することにより、染色体セルロースシンターゼオペロンの転写を行うために染
色体レベルで過剰表現されうる。異種プロモーターを含むプラスミドpTac2
5−1. p L a c21−7の作成及びそれらの作製のために用いる中間
ベクターを以下に記載し、そして図9において図解した。
A、MPII: Pc s : LFOIの15マイクログラムのpFs−ID
NAをHindl[[により分解し、セルロースシンターゼオペロンプロモータ
ーを有する2、5Kbのフラグメントが遊離した。この分解物を0.8%のGT
G アガロースゲル上に流し、プロモーターを有するこの2.5Kbのフラグメ
ントをゲルから切り出し、電気溶離し、そして予めHindl[[により分解せ
しめた二本鎖M13MPファージDNAとりゲートせしめた。このリゲーション
混合物ヲ旦、ユニ株D098を形質転換せしめるために用いた。この形質転換細
胞を旦−ユiJM103の菌叢を有するR17−3プレート上にまき、そして3
7°Cで一夜インキユベートした。11個の得られたファージプラークを採取し
、R2−6培地(5,0gのトリプトン、5.0gの酵母抽出物、5.0gのN
aC1及び]、OLの蒸留水、1)H6,9)により1:100に希釈した対数
増殖期JM1033mlに感染せしめた。この培養物を37°Cで6時間インキ
ュベートし、そしてエッペラドルフチューブにおいて沈殿下せしめた。遊離のフ
ァージを含むこの上滑液を4°Cで保存し、その間にミニスクリーンDNAをこ
の細胞ベレットからアルカリ溶解方法により調製した。このミニスクリーンDN
Aを酵素Hi n d m及び旦且上■による制限分解により分析した。1つの
クローンを選び出し、これをMpH:Pcsと称した。このクローンから上清液
をJM103に感染せしめるために用いた。JM103 MpH: Pc sの
培養物15m1を6時間増殖せしめ、沈殿下せしめ、そして一本領ファージDN
Aをこの上滑液から単離せしめた。
このファージDNA MpH: Pc sを、セルロースシンターゼオペロンプ
ロモーター配列の両側から12bpにある酵素Ss t I、Sma I、及び
BamHIのための制限部位配列を含むオリゴヌクレオチドL FOI(5’
−GAATATATAAGGGAGCTCCCGGGATCCACCTGTTT
TACC−3’ )により突然変異せしめた。1ピコモルの一末鎖ファージDN
A MpH:Pcsを10gモルのLFOIと共に68°Cで5分間インキュベ
ートし、その後プロモーター配列と共に30分間37°Cでアニール化せしめた
。このアニール化分子を次に、完全な二本鎖DNAを形成せしめるためにdNT
Dを0.5n+M迄、及びDNAポリメラーゼ1のフレノウフラグメントを0.
25ユニット/μl迄加えることにより伸長せしめた。この伸長は4°Cで30
分間、その後の37°Cでの1時間によって処理した;次にそれらを68℃で1
0分間加熱し、そしてこの混合物をJM103コンビ−テント細胞の形質転換の
ために用いた。
この形質転換混合物をJM103菌叢細胞と共に、3mlのR17(10,0g
のN−Zアミン、タイプA、5.0gのNaCl、DMF2.0ml巾のX−g
al 0.04g)、10MMのM g CI z、0.7%の特級アガロース
を有するR2−4プレート上で平板培養せしめた。ファージプラークをこれらの
プレートからニトロセルロースフイタ−上に移し、そしてこのプレートは4°C
で保存した。このフィルターを80°Cで2時間焼き、そしてIP標識オリゴヌ
クレオチドプローブLFO2とハイブリダイズせしめた。LP01は、突然変異
のために用いられるオリゴヌクレオチドLFOIの配列の部分集合を含み、その
3つの制限部位配列はセルロースシンターゼプロモーター配列の両側のわずか2
bpにある。LP01の配列は5’ −GGGAGCTCCCGGGATCCA
C−3’である。ハイブリダイゼーションは58°Cで行った。
このフィルターを58°Cで、5倍量の5SC12倍量のSSC及び0.1%の
SDSを含む2倍量のSSCで逐次5分間洗浄せしめた。コダック(Kodak
)X−OMAT ARフィルムをフィルター上に60時間さらした。60時間後
、現像フィルム上に、プレート上に未だ存在する転移せしめたプラークに相当す
る暗いスポットが現れた。フィルム上のこの暗いスポットに相当する16個のプ
ラークを単離し、そしてRF DNAを酵素Hindnl、BamHI、及び5
stIによる制限分解により分析した。MpH: P c s : LFOIは
図9に示す地図に相当する。MpH: Pcs : LFOIにおける導入制限
部位は異種プロモーターの置換のためにある。側方の領域は、。
プラスミドとアセトバクター染色体間の遺伝子交換における相同性組換のための
部位として働く。
培養物MpH: Pc s : LFOIからのファージ上漬物はプラークから
精製されたものであり、再度適切な制限パターンについて検査せしめ、次いで感
染及び二本鎖塩化セシウム勾配精製DNAのために用いた。
B、ACYC184: P c sの 120マイクログラムのMpH: P
c s : L FOIDNAを200ユニツトのHind−11により分解し
、そしてセルロースシンターゼプロモーター領域を含む2.5Kbのフラグメン
トをゲル精製し、透析袋の中で0.1倍量のTEAにて100ボルト、2時間電
気溶離せしめた。このDNA及び緩衝液をこの袋から取り出し、フェノール/ク
ロロホルムにより抽出せしめ、エタノール中の酢酸ナトリウムで沈殿せしめ、ト
リス−EDTA緩衝液にて再懸濁せしめた。このフラグメントをHindI[[
分解P A CY184(New England Biolabs)と、10
:1の挿入物のベクターに対する比で、2mMのATP濃度にて16°Cで一夜
、リゲートせしめた。このリゲーション混合物をMM294コンピーテント細胞
に形質転換せしめ、そして20gg/a+lのCmを含むR2−4プレート上で
平板培養せしめた。このプレートを37°Cで一夜インキユベートし、そして1
5,000個以上のCm”コロニーが出現した。Pscフラグメントの挿入によ
る、pAcYc184のテトラサイクリン耐性遺伝子の不活性化についての試験
のため、これらのコロニーのうちの66個を50gg/*1のアンピシリンを有
するR2−4プレート及び15gg10+1のテトラサイクリンR2−4プレー
ト上に貼付し、そして37°Cで一夜インキユベートした。66のCm” Am
p”コロニーの内の6個はパッチテストに基づきテトラサイクリンに対する耐性
を示した。ミニブレプDNAをこの6つのコロニーから単離し、HindI[[
により分解し、そして0.8%のアガロースゲル上で分析した。3つのプスミド
は1つの2.5KbのHindDI挿入物を示し、その他の3つは3又はそれよ
り多くの挿入物を示した。このプラスミドをpAcY0184と称する:Psc
は単一の2.5KbのHindI[[挿入物を示した。塩化セシウム臭化エチジ
ウム勾配精製DNAをこのプラスミドを含む培養物から単離した。
pAcYc184 :Pca DNA 40ugを、4ユニツトのBamHIに
より部分分解し、そしてゲル精製した。2つのBamHI部位の1つが切断され
た直鎖状のプラスミド分子を含む約6.IKbのフラグメントを単離し、その後
5stlにより完全に分解せしめた。このフラグメントをゲル精製し、そして6
.LKbのBamHI−3s t 17ラグメントをゲルから切り出し、0.1
容量のTEA中で電気溶離せしめ、ソイノール/クロロホルムにより抽出せしめ
、エタノールにおける酢酸ナトリウムにより沈殿せしめ、そしてトリス−EDT
A緩衝液にて再懸濁せしめた。
C,Sst1g亡の BR322への
10マイクログラムのpBR322DNAを制限エンドヌクレアーゼA I w
N Iにより完全に分解せしめ、そしてその末端はプラント状にした。ニューイ
ングランドバイオラブ(NewEngland Biolabs)からの5st
I (Sacl)リンカ−オリゴヌクレオチドを、標準条件下でプラント未満p
BR322切断フラグメントのためにT4リガーゼによりリゲートせしめた。こ
のリゲーション混合物を5ユニツトの5stlにより直接分解せしめ、ゲル精製
し、その後標準条件下でそれ自身をT4DNAリガーゼによりリゲートせしめた
。このリゲーション混合物を、アンピシリン耐性についての選択性を有するMM
294コンピーテント細胞を形質転換せしめるために用いた。1つの培養物、M
M294 pALF20は、5stlにより直鎖状となり、且つ長さにおいて約
4.4KbのDNAを提供した。このプラスミドを次にlac及びtacプロモ
ーターを適用させるために用いた。
D、第1ゴヌクレオチドのアニール
tac及び1acUV5プロモーターを形成するためのオリゴヌクレオチドを合
成した。各オリゴヌクレオチドは、一端にEc oRI半分部位の一本鎖及び他
端にHindnl半分部位の一本鎖を有する一本鎖のプロモーターについての配
列を含む。この合成ヌクレオチドをH,Oに、100Pモル/μmの濃度迄懸濁
せしめた。2002モルの各オリゴヌクレオチドを9ユニツトのポリヌクレオチ
ドキナーゼにより、1sMのATPを含む反応液20μm中で、37°Cで30
分間処理した。
キナーゼ処理せしめたら、このオリゴヌクレオチドの組を一緒に混合せしめ、次
いで任意的に二次構造を対合しないように68°Cで15分間加熱せしめた0次
いでこのオリゴヌクレオチドを37°Cの冷却により共にアニール化し、そして
30分間インキュベートした。30分後、このオリゴヌクレオチドを以下の通り
に単離せしめたpALF20EcoRI/HindllIフラグメントとのリゲ
ーション反応に含ませた。
E、ごjp≧」因几袈
20μgのプラスミドpALF20を100ユニツトのEcoRI及び100j
−1−7トのHindIIIにより、37°Cで1.5時間分解せしめた。この
反応物を0.8%のCTGアガロースゲル上に流し、そして直鎖DNAに相当す
る約4.4 Kbのフラグメントをゲルから切り出した。このフラグメントを0
.1容量TEA緩衝液の中で、透析袋において100ボルトで1.5時間電気溶
解せしめた。このDNA及び緩衝液を袋から取り出し、フェノール及びクロロホ
ルムにより抽出せしめ、次いでエタノールにおける酢酸ナトリウムにより沈殿せ
しめた。このDNAをスピードバク(speed vac)内で乾燥し、そして
R20に再懸濁せしめた。
F、ユヱニ之11
アニール化オリゴヌクレオチドの各組を、HindI[I/Ec oRT分解p
ALF20DNAと、3:1の挿入物のベクターに対する比により、16°Cで
3.5時間、0.1mMのATPを含む反応においてリゲートせしめた。コント
ロールとして、ベクターE c o RI / Hi n d m分解pALF
20を同条件下でそれ自身にリゲートせしめた。各リゲーション混合物のアリコ
ートを、リガーゼを加える前、且つ3.5時間のリゲーション後に取り出した。
これらのアリコートを0.8%のアガロースゲル上に流し、そして16°Cで3
.5時間後の分子量において明らかなる増大が見られ、十分なるリゲーションが
示された。
G−彫j■L換
各リゲーション混合物を、DCIOIコンビ−テント細胞に形質転換せしめ、そ
して15μg/mlのテトラサイタリンを含むR2−4プレート上で平板培養せ
しめた。リゲートされたベクターによる形質転換は6つのテトラサイクリン耐性
コロニーを提供した。pALF20: 1 a cUV5は30のテトラサイク
リン耐性コロニーを提供し、PALF20: t a cは99個提供した。塩
化セシウム臭化エチジウム勾配精製DNAをpLac19.pLac20及びp
Lac21と命名したpALF20:1acUV5形賞転換体重賞転換つのクロ
ーン、並びにpTac24及びpTac25と命名したpALF20: t a
c形質転換体由来の2つのクローンから調製した。これらのプラスミドを、ア
ニール化オリゴヌクレオチド挿入物の存在の検定のためにシーケンス化せしめた
。
pLac21:誤まりなしで1acUV5配列を含んだ。
pTac25:プロモーターの−47の位置でのGとAの1塩基の誤まりを有す
るtacプロモーター配列を含んだ。
組立の続きのためにプラスミドpTac25及びpLac21を選んだ。各プラ
スミド10μgを5stl及びその後BamHIにより完全に分解せしめた。異
種プロモーター(tac又は1ac)に結合するアンピシリン耐性遺伝子を含む
約1゜5Kbのフラグメントをゲルから切り出し、0.1容量のTEA中で電気
溶離せしめ、フェノール/クロロホルムにより抽出せしめ、エタノール中におけ
る酢酸ナトリウムにより沈殿せしめ、そしてトリス−EDTA緩衝液に再懸濁せ
しめた。
R3−九ゲ辷」仁LZ
約6.78amH1部分的S s t I pACY−C184: PCSベク
ターフラグメント(セクションBにおいて単離)をpLac21及びpTac2
5由来のBamHI/5stlアンピシリン耐性異種プロモーターフラグメント
と、7:1の挿入物二ベクターの比、そして16℃で24時間にて0.2aiM
のATP濃度による、2つの別々のリゲーション反応においてリゲートせしめた
。これらの2つのリゲーシッン混合物をDGIOIコンピーテント細胞を形質転
換せしめるために用いた。この形質転換は、pAcYc184 : P c s
: La c21については786個のアンピシリン耐性形質転換体を、−そ
してpACYC184:Pcs :Tac25からは803のアンピシリン耐性
形質転換体を作り出した。各形質転換体からの9個のコロニーからの培養物を5
0μg/mlのアンピシリンを有するR2において増殖せしめた。アルカリ溶解
ミニブレブDNAをこれらの培養物から単離し、そして酵素BamHI、Hin
dn[、及び5stIによる制限分解により分析した。図9におけるPLa c
2L7及びpTac25−1と表示するプラスミドについての制限地図に相当す
るDNAが同定された。これらのプラスミドを保存1306−21エレクトロコ
ンビ−テント細胞の形質転換のために用いた。得られる株を、これらの株の染色
体形態の評価のためにサザンプロット分析にかけ、その後セルロースシンターゼ
活性及びセルロース生成の増大レベルのための発酵実験に用いた。
これらの2株を、非形質転換株1306−21 と共に、標準プロトコールを利
用して試験した。これらの株を、細胞増殖、セルロース生成及びインビトロセル
ロース活性について、二重測定において、1,2及び5日にわたり試験した。1
25m1のバッフルフラスコにシード培地を含む2%のセルロースを接種せしめ
た。10μMのFeC1*、25mMのDMG、1%のTYE及び3%のグルコ
ースを有するR70−2を含む標準フラスコ培地を用いた。
酵素アッセイのための培養物を集め、この細胞をチーズクロスで濾過し、そして
この細胞を前記のプロトコールを利用して洗浄せしめた。このペレットを、その
サンプルを集めるに従って凍結せしめた。この細胞を超音波処理せしめ、その後
セルロースシンターゼ活性、セルロースの生成及び細胞増殖についてアッセイし
た。
本実験の結果は、セルロースシンターゼオペロンのアセトバクター染色体プロモ
ーターがE コリプロモーターと交換されることができ、そしてインビトロセル
ロースシンターゼ活性及びセルロース生成が得られ続けられうることを示す。
tacプロモーター構造のインビトロセルロース比活性は野性型細胞と発酵にわ
たり、日数の経過した培養物の活性、並びに2及び5日経過培養物の活性におけ
る低下の両者において類似し、そしてlacプロモーター構造の活性は野性株の
それよりも低かった。その活性は初日と2日日の間でも低下した。
tacプロモーター構造の細胞増殖及びセルロース生産はコントロールのそれら
と実験上同一であった。このlacプロモーター構造はセルロース生産において
はコントロールに比べ明らかに低く、しかし細胞増殖においては低くなかった。
このデーターにより、lacプロモーター株におけるセルロース生産はセルロー
スシンターゼの生体内活性により制限されるものと考えられる。
それ故、本明細書に示す通り、種々の強さのプロモーターは異なる酵素活性及び
セルロースの、細胞に対する比の発生を提するであろう。
五Xユ
セルロースシン −ゼD゛ −の・
本実験の目的は、セルロースシンターゼオペロンD 遺伝子の機能の研究のため
の1306−21誘導株の作製である。本明細書で作成するこの株は、野性型タ
ンパク質のC末端の16.5%を欠落する、遺伝子り由来のポリペプチドを生成
できる。完全遺伝子りの除去される二次構造物も作製した。これらの株を、セル
ロース生成に関連するそれらの表現型について試験した。
A、 ゛ −CびBを4・3.7Kbのフラグメントの ACYC184へのク
ローンヒ
20μgのpAcYc184 DNAを、全容量300μmの200ユニツトの
EcoRV及び200ユニツトのBamHIにより、37°Cで2時間分解せし
めた。このDNAを14ユニツトの仔牛小腸アルカリホスファターゼにより、3
7°Cで30分間処理し、次いで1%のGTGアガロースゲルに流した。約4K
bのEcoRT/BamHIフラグメントをこのゲルから切り出し、0.1容量
の少量のTEA中にて100ボルトで1時間電気溶離せしめ、フェノール及びク
ロロホルムで抽出せしめ、エタノール中で酢酸ナトリウムにより沈殿せしめそし
て10μmのトリスEDTA緩衝液に再懸濁せしめた。
50ugのpBR322:5.5T19G9DNAをSma Iにより完全に分
解せしめ、完全に直鎖となったかを検査し、その後BamHIにより分解せしめ
た。(TRTII−4由来の5.5KbのBawl I フラグメント(例XT
V、C)をpBR322のハ畦■部位にクローン化せしめ、pBR322: 5
.5 Tl9G9を作成した。)この分解DNAを0.1%のGTGアガロース
ゲル上に流し、遺伝子Cの3′部分及び遺伝子りを含む約3.7Kbのフラグメ
ント(図1のヌクレオチド6341−10164 )をこのゲルから切り出し、
そして0.1容量の少量のTEA中にて100ボルトで1時間電気溶離せしめた
。このDNAを次にフェノール/クロロホルム抽出せしめ、エタノール中にて酢
酸ナトリウムにより沈殿せしめ、そして10μmのトリス−EDTAに再懸濁せ
しめた。 約29g当量のpAcYc184 BamHI/EcoRIフラグメ
ントを約25ug当量の3.7KbのBamH1/SmaIフラグメントと、約
3:1の挿入物:ベクターの比で、20μm容量における2ユニツトのT4DN
Aリガーゼにより、16°Cで3.5時間、100μMのATP濃度にてリゲー
トせしめた。このATP濃度をその後1mM迄上昇させ、そしてこのリゲーショ
ン混合物を16℃で1夜インキユベートせしめた。
このリゲーシジン混合物を、標準の条件下でMM294コンビ−テント細胞を形
質転換させるために用いた。この形質転換細胞は、20μg/ralのCmを含
むR2−4プレート上で選別され、そして37℃で一夜インキュベートせしめた
。Cm”形溶解ミニスクリーンDNAの調製のために採取した。クローンpAc
Yc184 :3.1は、遺伝子Cの3′末端及び遺伝子り全てを含む3.7K
bのSma I−BamHI挿入物を有し、オペロンの終点にステムとループ終
結構造を含むことが示された。pAcYc184 : 3.7についての塩化セ
シウム臭化エチジウム勾配精製DNAが単離された。
B、−り配置の
20%gのpAcYc184 : 3.7DNAをEcoRVにより完全に分解
せしめ、フェノール/クロロホルムによす抽出せしめ、沈殿せしめ、その後20
μlのトリス−EDTAに再懸濁せしめた。5!gのpBR322DNAをPc
oRI及び八]wNIにより完全に分解せしめた。このDNAを沈殿せしめ、
その接着末端をフレノウによる、4種のdNTP全ての存在下において埋めた。
この埋められたDNAを1%のGTGアガロースゲル上に流し、1.5KbのA
mp”フラグメントをこのゲルから切り出し、0.1容量のTEAにて電気溶離
せしめ、フェノール/クロロホルム抽出し、沈殿させ、そして5μlのトリス−
EDTA緩衝液に再懸濁せしめた。
5%g当量のp B R322Am p”フラグメントDNAを1%g当量のp
AcYc184 :3.7EcoRI分解DNAと、約9;lの挿入物二ヘクタ
ーの比で、標準リゲーションの条件下でリゲートせしめた。このリゲーション混
合物を標準条件下でMM294コンピーテント細胞を形質転換せしめるために用
いた。この形質転換体をR2−4Amp50プレートにて平板培養し、37°C
で1夜インキユベートせしめた。Amp”コロニーが得られ、そして培養せしめ
た。細胞を各培養物から集め、そしてアルカリ溶解ミニブレプDNAを培養物か
ら単離せしめた。pDI−2と命名するこの培養物のうちの1つを1306−2
1の形質転換のために選んだ。pDI−2は遺伝子りを妨害するpAcYc18
4 :3.1のEcoRV部位において挿入された、pBR322由来のAmp
耐性フラグメントを含む。塩化セシウム臭化エチジウム勾配pDI−2DNAを
調製した。この分解物を21のHiOにより、セントリコン30 (Centr
icon 30)(Amicon)において5.00Orpmによる遠心により
洗浄せしめた。次にこのDNAをスピードバク内で乾iし、そして4μlのH,
Oに再懸濁せしめた。40μmのエレクトロコンピーテント1306−21細胞
をこの分解DNAに加え、そしてこれらの細胞を標準条件下でエレクトロポレー
トした。
1mlのR20−2をこのエレクトロボレート処理細胞に加え、そしてこの混合
物を直ちにR2R20−2A 100100C上で平板培養した。
30°Cで4日のインキュベーション後、約100.000個のAmpHコロニ
ーがプレート上に現れた。これらの形質転換体は弱いセルロース生産体として現
れた。類似の結果が、セルロースシンターゼD遺伝子全体の欠落する形質転換体
について観察された。これらの発見は、セルロースシンターゼD遺伝子がセルロ
ース合成において機能することを示す。
夛υ(唄
セルロースシン −ゼの 1!
株1306−27を100抛1のバッフルフラスコにおける40h+1の4%フ
ルクトース、1%の酵母抽出物、0.5%のバタトペブトン、0.3%のNaH
,POa培地、p)15.0において24時間増殖せしめた。生育培地を緩衝液
(50mMのに2HPO,、p)16.0)による2回の洗浄により除去した。
約14gの乾燥細胞が得られた。
史惣N
細胞を、ポリエチレングリコール(PEG)及びTME緩衝液(20%0PEG
(W/ν))の存在下においてフレンチプレス中で破壊せしめた。この破壊細
胞を遠心しく12.000x g、10分間)、そしてこのペレットを同じ容量
のTME緩衝液に再懸濁せしめた。この懸濁物をホモジナイズしくボッターエレ
ベジェムホモジナイザー(Potter Elevehjem homogen
izer) 、そしてこの懸濁物を遠心せしめた(12.000X g、10分
間)。得られたペレットはセルロースシンターゼ活性を含んでいた。このサンプ
ル(P−PEG)をTME緩衝液に、50mg細胞/ Illに相当する濃度迄
懸濁せしめ、そして液体窒素にて凍結し、−80″Cで保存した。
上ユ1嶌≦c匹理
P−PEGを遠心しく12,0OOX g、10分間)そしてそのペレットを0
.1Mのトリス、pH8,3,20%のスクロース中に、乾燥重量10gの細胞
/+++I迄懸濁せしめた。1容量%の811g/mlのトリプシン(Sigm
a)を加え、そしてこの調製物をゆっくり撹拌しながら1時間、4°Cにてイン
キュベートせしめた。
1容量%のトリプシンインヒビターを加え、そしてこの調製物を氷上に15分間
インキュベートせしめた。遠心(100,000g、30分間)後、ペレット(
TT−P−PEG)を−80℃で保存した。
皿
TME緩衝液中の10%のジギトニン(digitonin; 5erva。
Westbury+ NY)を湯浴にて5−10分間加熱することにより調製し
、そしてこの調製物を4°Cに冷却した。このTT−P−PEGペレットを2%
のジギトニンを含むTMEil街液に、もとの1/10の容量迄懸濁せしめた。
この懸濁物をMSEモデル140超音波音波器いて4°Cで2分間超音波処理し
た。超音波処理は、断続冷却を伴って30秒の超音波パルスにおいて、30m1
に分配して行った。この懸濁物を振騰し、そしてゆっくりと90分間撹拌し、そ
の後200 、000 gで60分間遠心せしめた。
この上清液はもとのセルロースシンターゼ活性の約50%を含んだ。前記の通り
凍結及び保存した際、活性は数カ月保持された。
11(社)i繍
この溶解酵素をアミコンコーン(Amicon cones)(フィルターLO
OK)を用いて5−7倍濃縮し、10−16酵素ユニット/ml (ユニット=
1ナノモル/分)の活性にした。この濃縮酵素を4°Cで一夜保存するか、又は
前述と同様に保存した。
、−〇〇
コント07 (Contron) T S T −28(スウィンギングパケッ
ト)ローターの6つの40++1の遠沈管それぞれの底に、グリセロール含有ク
ッション(12−13%のグリセロール、1nMのUDPG及び15Mモルのc
−di−GMP)を含むTME覆衝液(pH8,5))261に加え、そして1
0−1の反応混合物(50■1の溶解酵素、6゜25ミ!Jモル(7)ト’Jス
ーHC11s衝液、pH9,6,340μモルノCaC1z、1ミリモルのM
g C1z 、0−69モルのC−di−GMP及び60MモルのUDGP (
最終容量61m1 )をゆっくりその上に載せた。この管を15分間、30°C
でインキュベートし、次いで氷上に2.5時間置き、そして最後にTST−28
コントロンローター中で30分間、20.00Orps+で遠心した。
(この遠心機は3−4分間において350rpm減速するように設定しである。
)この上清液を慎重にデカントした。このベレットを15m1のTMHに手動ホ
モジナイザーにより混合し、そして懸濁させた。この最終ベレットを5mlのT
MHに懸濁せしめた。この得られる酵素は凍結及び前記の通りに保存した場合、
数週間安定である。得られた酵素の活性の回収率は約45%であった。
5DS−PAGEに づくタンパク の\−もとのセルロースシンターゼ活性の
12−1.5%を含む得られた酵素をラエムリ(Laemmli)サンプル緩衝
液(DTTを含む)に溶解し、そして10%アクリルアミドスラブゲルにおける
5DS−PAGEにかけた。ペプチドバンドはクマジープルー染色により識別化
し、そして切り出した。4つの主なバンド、ハンドA 90−95Xd、ハンド
B 65−68Kd、バンドC58−60Kd及びバンドD 54−56Kdが
観察できた。このゲルスライスを保存のため、10%の酢酸を含むプラスチック
袋に閉入した。
5DS−PAGE −ルスーイスか°の ンバク のタンパク質をHunkap
ilier他(ル匹担+dsユL旦μ刃吠お」L−1983、91: 227−
247)からの改良方法を利用し、5DS−PAGEゲルスライスから電気溶離
によって分離せしめた。この方法は低めの最終SDS濃度をもたらすように改良
した。この改良は:
1)浸透緩衝液(0,05MのNH4HCO,における2%の5OS)に対する
溶出緩衝液(0,05MのNH4HCO3における0、 1%の5OS)の置換
;及び2)装置における溶出緩衝液(0,05MのNH,1lCO。
における0、1%の5OS)を透析緩衝液(0,01MのNHJCO3における
0、02%の5DS)により交換する際、慎重にサンプルの阻害を回避しながら
サンプルセル内のほとんどの緩衝液も交換される。
五X入
セルロースシン −ゼU か゛ れるボ1ペプチドンパク のN tアミノ 配
l
アセトバクター株1306−27から精製される90−95Kdタンパク質の最
初の18個のアミノ酸及び65−68Kdタンパク質の最初の16個のアミノ酸
を、アプライドバイオシステム(Appl iedBiosystem)モデル
470Aプロティンシーケンサ−における自動化エドマン分解により、この製造
者により供給される試薬及びプロトコールを利用してシーケンス化せしめた。こ
の90−95Kdタンパク質の18個のアミノ酸は、前述の通りに得られるセル
ロースシンターゼのDNA配列から予想されるアミノ酸配列と一致した。この一
致は、図1において示されるアラニン残基から始まる。精製後に得られるアミノ
末端は本質的なインビボN末端でないことがあるが、しかしこのアラニンの後に
続くリジンでのタンパク質分解を反映しうる。クローン化遺伝子の予想配列は8
3Kdのタンパク質についてコード化する。N−末端の近くの初期アミノ酸に対
するいくつかの更なるピークが存在し、おそらく夾雑物に由来するであろう。
65−68Kdタンパク質に対して得られる配列の質は90−95Kdタンパク
質に対して得られるものほど優ねていなかったが、しかし65−68KdN−末
端配列と図1において予想される配列からのアミノ酸(カッコで示す)の間はよ
く一致しうる。それ故、65−68Kdタンパク質は90−95Kdのタンパク
質のタンパク質分解フラグメントであると考えられる。
以下の培養物はアメリカンタイプカルチャーコレクション、(ATCC)Roc
kville、 MD、 USAにて、特許手続の目的のための微生物の寄託の
国際認定に基づくブタベスト条約の下で、そしてそれに基づく条件(ブタベスト
条約)のもとで寄託されており、それ故、これらはブタベスト条約に従って保管
され、入手できる。このような株の入手は全ての政府のもとでのその特許法によ
る権利に基づく違背における発明の実施として制限されていない。
この寄託培養物は以下のATCC寄託番号が付与されている。この培養物は本出
願の出願人であり、以下のCMCC寄託番号を受けたシータスコーポレーション
(Emeryville、 CA。
tlsA)のマスターカルチャーコレクション(CMCC)に保存されている。
賠−」シー實CMCCNa ATCCNllヱ−h)パj」l: 1306−2
4 pUclB−824FS6 3538 67925E、コリ DGIOI
pUclB−824FS6 3581 679261]」二進2に1株 130
6−3 1909 532641−t=)zεとL1株 1306−11 21
45 53263ヱ−1−)/ε7に1株 1306−21 2618 535
24上−r丈 DG98 1965 39768上工≦L去 DGIOI pU
clB−824pABCo 68264本発明はいくつかの特定態様により実例
化されているが、これらは本発明の範囲を限定するものでない。
ロ ロ ロ ロ ロ ロ Q ロ ロ ロ ロ〜 0 ロ 小 ロ F+ ψ
の ! i 〜。 。 。 。 5/20゜ 。 。 。 。 。
FIG、 3
FIG、 4
手続補正書
平成4年3月 13日
Claims (56)
- 1.細菌セルロースシンターゼオペロンをコード化する、単離された、天然のク ローン化組換又は合成のポリヌクレオチド配列。
- 2.アセトバクターのゲノム由来の請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 3.4つの連なる遺伝子(ここで図1の参照により、第1の遺伝子は実質的にヌ クレオチド328から2589に相当し、第2の遺伝子は実質的にヌクレオチド 2594から4999に相当し、第3の遺伝子は実質的にヌクレオチド5005 から8691に相当し、第4の遺伝子は実質的にヌクレオチド8964から94 31に相当する)を含んで成る請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 4.前記のオペロンの第1の遺伝子と隣り合い、且つ上流に位置するプロモータ ーをコード化するDNA配列を更に含んで成る、請求項1記載のポリヌクレオチ ド。
- 5.前記のプロモーターがアセトバクターに対して内因性である、請求項4に記 載のポリヌクレオチド。
- 6.前記の内因性プロモーターがセルロースシンターゼオペロンに由来する、請 求項5に記載のポリヌクレオチド。
- 7.前記のプロモーターが異種の細菌プロモーターである、請求項4に記載のポ リヌクレオチド。
- 8.前記の異種のプロモーターが、tac及びlacを含んで成るグループから 選ばれる、請求項7に記載のポリヌクレオチド。
- 9.転写ターミネーターをコード化するDNA配列を更に含んで成る、請求項1 に記載のポリヌクレオチド。
- 10.前記の転写ターミネーターが前記第4遺伝子の停止コドンの3′側の約2 6塩基対以内に位置する、請求項9に記載のポリヌクレオチド。
- 11.表現型のためのコントロール配列と作動連結する、請求項1に記載のポリ ヌクレオチド。
- 12.前記のコントロール配列が細菌に由来する、請求項11に記載のポリヌク レオチド。
- 13.前記の細菌が、アセトバクター及びエシェリヒアより成るグループから選 ばれる、請求項12に記載のポリヌクレオチド。
- 14.請求項11に記載のポリヌクレオチドにより形質転換される組換宿主細胞 。
- 15.前記の細胞が細菌細胞である、請求項14に記載の形質転換された組換宿 主細胞。
- 16.前記の細胞がE.コリ又はアセトバクター細胞である、請求項15に記載 の形質転換された組換宿主細胞。
- 17.図1において示す通り、セルロースシンターゼAについてのヌクレオチド 配列に実質的に相当する、単離された、天然のクローン化組換又は合成のポリヌ クレオチド。
- 18.図1において示す通り、ヌクレオチド328から2589に実質的に相当 する請求項17に記載のポリヌクレオチド。
- 19.図1において示す通り、セルロースシンターゼBについてのヌクレオチド 配列に実質的に相当する、単離された、天然のクローン化組換又は合成のポリヌ クレオチド。
- 20.図1において示す通り、ヌクレオチド2594から4999に実質的に相 当する、請求項19に記載のポリヌクレオチド。
- 21.図1において示す通り、セルロースシンターゼCについてのヌクレオチド 配列に実質的に相当する、単離された、天然のクローン化組換又は合成のポリヌ クレオチド。
- 22.図1において示す通り、ヌクレオチド5005から8961に実質的に相 当する、請求項21に記載のポリヌクレオチド。
- 23.図1において示す通り、セルロースシンターゼDについてのヌクレオチド 配列に実質的に相当する、単離された、天然のクローン化組換又は合成のポリヌ クレオチド。
- 24.図1において示す通り、ヌクレオチド8964から9431に実質に相当 する、請求項23に記載のポリヌクレオチド。
- 25.表現型のためのコントロール配列と作動連結している、請求項17に記載 のポリヌクレオチド。
- 26.表現型のためのコントロール配列と作動連結している、請求項19に記載 のポリヌクレオチド。
- 27.表現型のためのコントロール配列と作動連結している、請求項21に記載 のポリヌクレオチド。
- 28.表現型のためのコントロール配列と作動連結している、請求項23に記載 のポリヌクレオチド。
- 29.請求項25に記載のポリヌクレオチドにより形質転換された組換宿主細胞 。
- 30.請求項26に記載のポリヌクレオチドにより形質転換された組換宿主細胞 。
- 31.請求項27に記載のポリヌクレオチドにより形質転換された組換宿主細胞 。
- 32.請求項28に記載のポリヌクレオチドにより形質転換された組換宿主細胞 。
- 33.細菌セルロースシンターゼを生成するための方法であって、請求項14に 記載の形質転換された細胞を細菌セルロースシンターゼの表現のために適切な条 件のもとで培養し、そして該培養物から表現される細菌セルロースシンターゼを 回収することを含んで成る方法。
- 34.細菌セルロースシンターゼを生成するための方法であって、請求項30に 記載の形質転換された細胞を細菌セルロースシンターゼの表現のために適切な条 件のもとで培養し、そして該培養物から表現される細菌セルロースシンターゼを 回収することを含んで成る方法。
- 35.前記のポリヌクレオチドが、図1において示すヌクレオチド2594から 4999に相当する配列を有する、請求項34に記載の方法。
- 36.およそ85キロダルトンの分子量を有し、ウリジン5′−ジホスホグルコ ースよりβ(1−4)−グルカンポリマーを合成可能な、単離された組換タンパ ク質(ここで該タンパク質は、図1において示すセルロースシンターゼBについ て提供したアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する)。
- 37.およそ84キロダルトンの分子量を有し、その天然環境に関連するタンパ ク質を実質的に有さない、セルロースシンターゼ及びジグアニレートサイクラー ゼ活性の両者に欠損するセルロース陰性アセトバクター細胞の補完できうる、単 離れたタンパク質(ここで該タンパク質は、図1において示すセルロースシンタ ーゼAについて提供したアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するも のとして更に特徴付けられる)。
- 38.およそ141キロダルトンの分子量を有し、その天然環境に関連するタン パク質を実質的に有さず、前記セルロースシンターゼオペロンの残りの3種のタ ンパク質と適切な割合において組合さる際にインビボにおいてウリジン5′−ジ ホスホグルコースからβ(1−4)グルカンポリマーを合成、且つ分泌せしめる ことができる、単離されたタンパク質(該タンパク質は図1において示すセルロ ースシンターゼCについて提供したアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 を有するものとして更に特徴付けられる)。
- 39.およそ17キロダルトンの分子量を有し、その天然環境に関連するタンパ ク質を実質的に有さず、前記セルロースシンターゼオペロンの残りの3種のタン パク質と適切な割合において組合さる際にインビボにおいてウリジン5′−ジホ スホグルコースからβ(1−4)グルカンポリマーを合成、且つ分泌せしめるこ とができる、単離されたタンパク質(該タンパク質は図1において示すセルロー スシンターゼDについて提供したアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を 有するものとして更に特徴付けられる)。
- 40.組換微生物におけるセルロース生成を高めための方法であって、以下の段 階; a)適当な微生物を、セルロースシンターゼオペロン由来の少なくとも1種の遺 伝子を含んで成るベクターにより形質転換せしめ、 b)該形質転換微生物をセルロースの生成のために適する条件のもとで培養せし めること、 を含んで成る方法。
- 41.前記の遺伝子がセルロースシンターゼオペロンによりコード化される4種 の遺伝子を含んで成る、請求項41に記載の方法。
- 42.前記のポリヌクレオチドが前記のセルロースシンターゼオペロンの表現型 のためのコントロール配列と作動連結している、請求項40に記載の方法。
- 43.前記のコントロール配列が異種プロモーターを含んで成る、請求項42に 記載の方法。
- 44.前記の異種プロモーターが調節プロモーターである、請求項43に記載の 方法。
- 45.前記の調節プロモーターがlac及びtacプロモーターより成るグルー プから選ばれる、請求項44に記載の方法。
- 46.前記の調節プロモーターがlacプロモーターであり、そして前記の組換 微生物がlacI遺伝子生成物をコード化するポリヌクレオチドを更に含んで成 る、請求項45に記載の方法。
- 47.請求項42に記載の方法であって、前記宿主細胞が細菌細胞である方法。
- 48.請求項47に記載の方法であって、前記細菌細胞がアセトバクター細胞で ある方法。
- 49.前記のアセトバクター細胞がセルロースシンターゼ陰性表現型を有する、 請求項48に記載の方法。
- 50.前記のアセトバクター細胞がセルロースシンターゼ陽性表現型を有する、 請求項48に記載の処理方法。
- 51.以下のもの; a)プラスミドp824のレプリケーション含有フラグメント機能性アセトバク ター起源、並びに b)形質転換、細胞***及び培養に影響を受け易い感受性宿主細胞の中に形質転 換せしめた際に少なくとも一種の抗生物質に対しての耐性を運び込む1又は複数 のDNAセグメント、を含んで成る組換DNAベクター。
- 52.E.コリプラスミドの機能性レプリコンを更に含んで成る、請求項51に 記載の組換DNAベクター。
- 53.表現型のためのコントロール配列と作動連結している細菌セルロースシン ターゼオペロンをコード化する核酸配列を更に含んで成る、請求項51に記載の 組換DNAベクター。
- 54.前記のベクターが、pUC18−824FS1又はpUC18−824F S6である、請求項53に記載の組換DNAベクター。
- 55.請求項51に記載の組換DNAベクターにより形質転換された組換細菌宿 主細胞。
- 56.前記の宿主細胞がアセトバクター又はエシェリヒア種である、請求項55 に記載の組換細菌宿主細胞。
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PCT/US1990/001811 WO1990012098A2 (en) | 1989-04-12 | 1990-04-04 | Methods and nucleic acid sequences for the expression of the cellulose synthase operon |
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Publication Number | Publication Date |
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JPH04503456A true JPH04503456A (ja) | 1992-06-25 |
JPH0773500B1 JPH0773500B1 (ja) | 1995-08-09 |
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