JPH04503456A - セルロースシンターゼオペロンの表現のための方法及び核酸配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

セルロースシン　−ゼオペロンの のための　び　１ 発泗ヱＩ結ｍ 本発明はタンパク質の製造についての組換ＤＮＡ技術の分野に関連する。更に詳 しくは、本発明は細菌セルロースシンターゼオペロン、このオペロンの表現型及 び組換微生物におけるセルロースの製造のためのこのオペロンの利用方法に関す る。 兄１１すＬ最 セルロースは、紙の生産及び傷の手当用品を含む多数の有用な製造のための原料 として期待されている。セルロースは植物及び培養物における種々の微生物、例 えばアセトバクター　（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属のセルロース生産細菌から 得られろる。 アセトバクターの特徴は、グラム陰性、即ち、０．６〜０．８μｍ　Ｘ　１．０ −４μｍの桿状菌である。これらは厳密には好気性、即ち、代謝が発酵性ではな く、呼気性である。これは更−ス鎖又はミクロフィブリルは細胞壁上の細菌表層 部位で合成される。、ｘよ二５ｔ＜クノ一二によるセルロースの生産は、少なく とも１９３０年代から黙然なる研究の課題であった。特に、ヱセトバク　−ジ１ 　ム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｚｙｌｉｎｕｍ）は、完全な細胞におけるセル ロース合成機構の究明の達成のために広く研究されてし）る（Ｓｃｈｒａｍｍ　 ａｎｄ　Ｈｅ５ｔｒｉｎ＋　（１９５４）　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ、　１１：１２３−１２９　）。 アセトバク　−ジｙ　ムにおけるセルロース合成についての酵素経路は研究され ており、そしてグルコースからセルロース迄の全ての経路を含むものと見られる 本質的に４つの酵素的段階が、エヘーニヒンユし九メ、（Ａ、χｙｌｉｎｕｍ） の細胞遊離抽出物において特徴付けられる。これらには、グルコキナーゼによる グルコースのリン酸化（Ｂｅｎｚｉｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、（１９７２）　Ｊ 、　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ、、　１１１：３２５−３３０３　、ホスホグルコムタ ーゼによるグルコース−６−リン酸からグルコース−１−リン酸への異性化（Ｇ ｒｏｍｅｔ、　ｅｔ　ａｌ、、（１９５７）　Ｂｉｏｃｈｅｓ＋、　Ｊ、＋　６ ７：６７９−６８９　；Ｆｒｅｉ−Ｒｏｉｔｍａｎ、Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｆｆｅ ｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏ餉ｕ ｔａｓｅ　ａｎｄ　ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ　ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａ ｓｅ　ｏｆ　Ａｃｅｔｏｂａｃ旦ｆ　Ｍ、　Ｓｃ、論文、ｔｈｅ　Ｈｅｂｒｅｗ 　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、　Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、 　ｌ５ｒａｅｌ　（１９７４））　；　ＵＤＧＰ−ピロホスホリラーゼによるウ リジン５′−ジホスホグルコース（ＵＤＰ−ｇｌｃ）の合成（Ｆｒｅｉ−Ｒｏｉ ｔｍａｎ　（記載）　；　５ｗ１ｓａ、　Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆ　Ｃｅ １ｌｕｌｏｓｅ　ｉｎ　Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘ　ｌ１ｎｕｎ、　Ｐｈ、　 Ｄ、　ｇ！を文：ｔｈｅＨｅｂｒｅｗ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｊｅｒｕ ｓａｌｅ＋＋、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、ｌ５ｒａｅｌ　（１９７８））　、及びセ ルロースシンターゼ反応が挙げられる。 常用のクロマトグラフィー技術を利用するＡ、キシリナム株由来のセルロースシ ンターゼの精製の試みは特に成功していなかったが、しかし最近になってこの酵 素は明らかに精製され（Ｐ、　Ｒｏｓｓ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｂｅｎｚｉｍａｎ　（ １９８９）　ｉｎ　Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄ　Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔ ｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌｕｌｏｓｅ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌｏｓｅ　Ｍａｔｅｒ ｉａｌｓ＋（ｍ）　Ｗｅｉ＋ｓａｒ　ａｎｄ　Ｈｉｇｌｅｒ、　Ｍａｒｃｅｌ　 Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、　ＮＹ、版）、そして精製状態におけるその特性及び 構造が現在研究されている。 同様に、インビトロでのセルロース捕獲及びクロマトグラフィー技術によるセル ロースシンターゼの精製の試みにより、８３キロダルトン（［ｄ）ポリペプチド の部分的精製がもたらされた（Ｌｉｎ　ａｎｄ　Ｂｒｏｗｎ、第１０回セルロー ス会ＩＩ　（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　Ｃ。 ｎｆｅｒｅｎｃｅ）　１９８８年５月２９日−６月２日、要約ＢＧＩ、２７頁） 。 この微生物におけるセルロース合成の生物学的機能は未だ明確でないが、細胞の エネルギーバジエｙ　ト（ｅｎｅｒｇｙ　ｂｕｄｊｅｔ）の少なくとも１０％が 一時的に任意にセルロース生成に提供されるものと考えるなら［Ｗｅｉｎｈｏｕ ｓｅ、　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　ｍｅｔａｂ ｏｌｉｓｍ　ｉｎ　Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘ　１ｉｎｕ＊　Ｐｈ、　Ｄ、　 ｔｈｅｓｉｓ。 Ｔｈｅ　）ｌｅｂｒｅｗ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｊｅｒｕｓａｌｅｓ＋ 、　Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、　ｌ５ｒａｅｌ（１９７７））　、生合成系が複雑な 制御システムにより支配されることは驚くことではない。 唯一のこの経路独特の酵素、セルロースシンターゼは、セルロース形成において 掛かり合う工程−炭素利用に関連する代謝系の行き詰まり一を成し遂げ、それ故 厳格な制御コントロールのための第１の候補に必然的になるであろう。更に、細 胞遊離抽出物において示される通り、ＵＤＰ−ｇｌｃへと導く酵素のレベルはセ ルロースシンターゼの活性と大いに関連し、従ってこれらがセルロース生合成に おける速度制御工程を含んで成る説を強く支持する。 更なるセルロース合成の生化学の完全なる理解は、セルロース生産微生物の培養 物からのセルロースの、更に優れた生産性及び収率を促進せしめうる。培養物に おける細菌細胞の増殖は、初期は指数的に観察できるが、しかしこの細胞は定状 増殖期に入るに従い遅くなる。大多数のセルロースは、細胞の数が最大時の発酵 における後期において生産されるが、しかしながら単位時間当りの一細胞により 作られるセルロースの量（比生産率）は発酵が進むに従って減少する。セルロー スシンターゼ活性は、培養物における細胞が定状増殖期に到達するに従い、反応 速度は抑制されうるものと考えられる。 セルロース生産における１つの改良は、セルロース合成における速度制限段階を 取り除くことでありうり、これにより培養におけるセルロース比生産性において 見られる低下を防げる。 組換ＤＮＡ技術は目的のタンパク質の生産のために、現在日常的に利用されてい る。ところでこのような組換ＤＮＡ技術を利用するためには、所望のタンパク質 、例えばセルロースシンターゼについてコード化する遺伝子を最初に単離しなく てはならない。この仕事は特にコード化タンパク質の一次配列が未知の場合に困 難であり、更にセルロースシンターゼ活性を測定するための既知のアッセイも難 しい。 組換セルロースシンターゼを生産する能力は、セルロース極的には高められた細 菌培養物からのセルロース生産を提供する。 溌ｊ廊と１粒 本発明はセルロース生合成に関連するオペロン、細菌セルロースシンターゼのタ ンパク質についてコード化する、１又は複数の近接に結合し合う遺伝子について のコードであるポリヌクレオチド、セルロースシンターゼの生産のために適する 表現ベクター、これらのベクターにより形質転換された組換宿主細胞、細菌セル ロースシンターゼを生産するだめの方法、及び組換微生物におけるセルロースの 生産を高める方法を提供する。 更に詳しくは、本発明は、図１において示す多シストロン性ヌクレオチド配列に より特徴付けられる、細菌セルロースシンターゼオペロンをコード化する、単離 された、自然のクローン化組換体又は合成のポリヌクレオチドを提供する。この セルロースシンターゼオペロンは長さにおいておよそ９２１７塩基対（ｂｐ）で あり、そして４つの遺伝子（本明細書ではｒＡ、、ｒＢ、、ｒ（、」及びｒｐ、 で表わす）を含んで成る。 本発明は更に、宿主細胞におけるセルロースシンターゼを表現するための方法で あって、この宿主細胞を細菌セルロースシンターゼオペロンと一体化している１ 又は複数の遺伝子を含んで成る組換ＤＮＡ表現型ベクターにより形質転換せしめ （この遺伝子は細菌セルロースシンターゼの表現型のためのコントロール配列と 作動連結している）、そしてこの形質転換細胞をセルロースシンターゼの表現の ために適する条件のちとで培養することを含んで成る方法を提供する。 本発明の表現ベクターの作製は、独立して複製せしめるか、又は異種のプロモー ターをこのアセトバクター染色体に導入するように計画して天然セルロースシン ターゼオペロンプロモーターを置換せしめるかのいづれかにある。 更に、本発明の他の１１様は、組換微生物におけるセルロース生産を高めるため の方法であって、適当な微生物をセルロースシンターゼオペロン由来の少なくと も１種の遺伝子を含んで成るベクターにより形質転換せしめ、そしてこの形質転 換微生物をセルロース生産のために適する条件下で培養せしめることを含んで成 る方法を提供する。前に述べた通り、この染色体セルロースシンターゼプロモー ターは、染色体レベルでセルロースシンターゼオペロンを過剰表現せしめるだめ の異種プロモーターにより置き代われうる。 本発明の更なるＵＳは、セルロースシンターゼオペロンによりコード化される個 々のタンパク質を提供する。単離され人 た組換セルロー伶シンターゼＢタンパク質はウリジン５′−ジホスホグルコース からβ（１−４）　−グルカンポリマーを合成することができ、ここで、遺伝子 Ａによりコード化されるこのタンパク質は、セルロースシンターゼ及びジグアニ レートサイクラーゼ活性の両方を欠損するセルロース陰性ヱ皇−ヒバ！」し二細 胞を補完することができる。 遺伝子Ｃ又はＤのいづれかによりコード化されるタンパク質は、ウリジン５′− ジホスホグルコースからβ（１−４）−グルカンポリマーを合成でき、そしてこ のタンパク質が適当な比率においてセルロースシンターゼオペロンの他の３つの タンパク質と結合した際、インビボで細胞から生成物を分泌せしめることができ る。 更に、ヱ立上五ｍ二における異種遺伝子の表現のための新規の組換ＤＮＡベクタ ーであって、複製を含むプラスミドｐ８２４のフラグメントの機能的二皇上ｅ源 、並びに形質転換、細胞***及び培養に影響を受け易い感受性細胞の中に形質転 換せしめた際に、少なくとも１つの抗生物質に対しての耐性を運び込む１もしく は複数のＤＮＡセグメント。これらのベクターは、細菌宿主細胞、例えば旦、　 Ｄ　’Ｊ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ）におけるＤＮＡのクローニングにおいて利用する ためのシャトルベクターへとすることもできる。 ”（Ｄｆ；ｌ”呪 図１はセルロースシンターゼオペロンの核酸配列及び推定されるアミノ酸配列で ある。このセルロースシンターゼオペロンはその長さにおいておよそ９２１７ｂ ｐであり、４つの遺伝子、Ａで示す２２６１のヌクレオチド配列（ヌクレオチド ３２８−２５８９）、Ｂで示す２４０５のヌクレオチド配列（ヌクレオチド２５ ９４−４９９９）、Ｃで示す３９５６のヌクレオチド配列（ヌクレオチド５００ ５−８９６１　）、及びＤで示す４６７のヌクレオチド配列（ヌクレオチド８９ ６４−９４３１）より成る。本明細が提供する各遺伝子のヌクレオチド配列はシ グナル配列を含みうる。それぞれの遺伝子によりコード化される成熟タンパク質 はプロセッシングを受けることがあり、もしそうならば関連する遺伝子配列はこ こに示したものよりも短いであろう。例えば、精製セルロースシンターゼＢタン パク質の第１アミノ酸に相当するアラニンコドンは二つの上向き矢印の間にある 。 転写開始部位はヌクレオチド２３５のＡの上に位置する下向き矢印により表示し た。遺伝子りの後の下線のヌクレオチド配列は、ステム及びループ（ｓｔｅｍ　 ａｎｄ　１ｏｏｐ）構造の逆方向反復塩基配列を含んで成る転写ターミネータ− 領域を示す。オリゴヌクレオチドＭＫ１７０の配列はヌクレオチド２１９０から ２２１０に示し、ＭＫ１７２の配列はヌクレオチド４５６４から４５８３に示し た。 図２はコスミドベクターｐＫＴ　２３０ｃ　ｏ　ｓ　５の構造を示す。 図３は全長セルロースシンターゼＢ遺伝子を含むＴＲＴｌＢ−１の作成を図示す る。 図４はプラスミドｐ　Ｕ　Ｃ１Ｂ−８２４の制限地図である。 図５はコスミドＴ５Ａ１由来の８．３ＫｂＳｍａＩフラグメント及び７．２Ｋｂ Ｂ　ａ　ｍＨＩフラグメントの制限地図である。 図６はプラスミドｐ　Ｕ　Ｃ１８−８２４Ｆ　Ｓ　６の制限及び機能地図である ；　ｐ　Ｕ　Ｃ１Ｂ−８２４Ｆ　Ｓ　１はセルロールシンターゼ遺伝子を有する Ｓｍａ　Ｉ制限フラグメントの配向が逆向きである以外はｐ　Ｕ　Ｃ１Ｂ−８２ ４Ｆ　Ｓ　６と同一である。 図７はプラスミドｐ　Ｕ　Ｃ１９−８２４の制限及び機能地図である。 図８はプラスミドｐＡＢＣＤの構造を図示する。 図９は、セルロールシンターゼオペロン遺伝子を転写するための異種プロモータ ーを含む表現ベクターの作製を示すフローチャートである。 ｌ泗！」０１１１肌 本明細書記載の発明をより完全に理解するため、以下の詳細な説明を記載する。 Ａ、定１ 本明細書に用いる語「セルロースシンターゼ」は、生体内でのウリジン５′ジホ スホグルコースの細菌セルロースへの生化学的変換、及びその細胞外への分泌に 関与する１又は複数のポリペプチドに関する。セルロースシンターゼの合成に関 連する４つの遺伝子を含む単一の転写ユニットは、図１に示す核酸配列によりコ ード化される。 「セルロースシンターゼ遺伝子」なる語は、セルロースシンターゼオペロンに関 連するポリペプチド生成物をコード化する核酸配列として定義する。この語は、 いづれもの１バクタ一細菌株又は種に限定しない。 本明細書に用いる「セルロースシンターゼオペロン」なる語は、セルロースシン ターゼに関連し、そして細胞外に分泌されるタンパク質生成物のグループをコー ド化するＤＮＡ配列のストレッチに関する。 「セルロースシンターゼ活性」はＵＤＰ−ｇｌｃからセルロース〔β（１−４） −グルカン〕を合成する能力により定義する。この活性は、ＵＤＰ−（”Ｃ）グ ルコースをセルロース（塩基に不溶性）に一体化せしめることにより、インビト ロで測定され、そして１分間当りにセルロースに組込まれるグルコースのｎ５ｏ ｌ（ナノモル）として測定する。 「セルロースシンターゼ比活性」はセルロースに組込まれるｎ　ｍｏｌ　グルコ ース／分／タンパク１１ｍｇとして定義される。 二車上）＜９叉二細胞におけるセルロースシンターゼ比活性は、通常０，２から ０．４のｎｍｏ１ｇｌｃ／分／細胞タンパク質ｏ＋ｇの範囲にある。 本明細書に用いる語「二車上べえＬ二」は微生物の属、そして特にセルロースを 生産する属の構成員に関する。 「適当な微生物」は、セルロースシンターゼオペロンに関連する１又は複数の遺 伝子により形質転換された際に、セルロースを生産可能な微生物に関する。適当 な微生物には、形質転換を行なわないでセルロースを生産可能なそれらの宿主細 胞、又は１もしくは複数の遺伝子の欠損するものであって、その活性がセルロー スシンターゼオペロンの少なくとも１遺伝子により置換されうる宿主細胞を含む 。 「作動連結」は、構成要素の正常な機能が働くことができる並列位置に関する。 それ故、コード化配列のコントロール配列との「作動連結」は、このコード化配 列がこれらの配列のコントロール下で表現されうる形態を意味する。このような コントロールは直接的、即ち、単一プロモーターと連結した単一遺伝子、又は、 多シストロニク転写が単一プロモーターから表現される際のケースのような間接 的なものでありうる。 「コントロール配列」は、ＤＮＡ配列又は特定の宿主生物における作動連結した コード化配列の表現のために必要な配列を称する。原核細胞のために適切なコン トロール配列は、例えばプロモーター、任意的にオペレーター配列、リボソーム 結合部位、転写ターミネータ−１及び未だよく理解されていない可能性のあるそ の他のものも含む、真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエン ハンサ−を利用することが知られる。 「細胞」又はｒ組換宿主細胞」もしくは「宿主細胞」はしばしば相互交換的に用 いられ、そしてこれら全ての呼称はそれらの子孫を含む。それ故、「形質転換体 」又は「形質転換細胞」には、第一処理細胞、及び移し換えの回数を無視したそ れら由来の培養物を含む。全ての子孫はＤＮＡ含有量において正確に同一でない ことがありうることも理解されており、これは誘発性の、又は偶然による突然変 異に富国する。突然変異子孫であって元来の形質転換細胞におけるスクリーンに より同一の機能を有するものは含まれる。異なる呼称を用いレオチド、例えば、 セルロースシンターゼＢ遺伝子由来のＤＮＡは、少なくとも６−２０のヌクレオ チドの配列、より好ましくは少なくとも１５から２０のヌクレオチドの配列であ って、指定のヌクレオチド配列の領域に相当する、即ち、同−又は相補的な配列 を称する。核酸配列との一致は約７０％又はそれ以上、好ましくは少なくとも８ ０％、そしてより好ましくは少なくとも９０％のであろう。 誘導配列の相応又は非相応性は、液相又は固体支持体における標準的なりＮＡハ イブリダイゼーション技術を利用した、適切なる厳重な条件のもとでのハイブリ ダイゼーションにより検出されうる。核酸配列の相補性の検定のためのハイブリ ダイゼーション技術は当業界において知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ 　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　（第２版Ｌ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　ＮＹを 参照のこと）。更に、ハイブリダイゼーションにより形成される二重らせんポリ ヌクレオチドの誤対合は、二重らせんポリヌクレオチドにおける一本鎖配列を特 異的に分解するＳｌのようなヌクレアーゼによる１分解を含む既知の技術により 検定されうる。 誘導されるポリヌクレオチドは、示したヌクレオチド配列から物理的に誘導され る必要はないが、しかし、例えば化学合成、ＤＮＡ複製又は逆転写を含む、ポリ ヌクレオチドが誘導される領域における塩基配列により提供される情報に基づい た任意の方法により作られうる。 同様に、指定配列から「誘導される」ポリペプチド、例えばセルロースシンター ゼＢは、この配列においてコード化されたポリペプチド又はそのタンパク質のア ミノ酸配列と同一の配列を有するポリペプチドを称し、そしてその一部はこの配 列におけるコード化ポリペプチドと免疫学的に同等であるが、又は本明細書に記 載するインビトロもしくはインビボアンセイにおいて対照タンパク質の生物学活 性と同等の活性を示す少なくとも５−１０のアミノ酸、そしてより好ましくは少 は、通常１０未満のアミノ酸による相違、より通常には５未満のアミノ酸による 相違を称する。組換タンパクｆ　’ＡＪ　。 「Ｂ」、「Ｃ」又は「Ｄ」のいづれも、天然タンパク質と実質的に同等の生学的 特性を示した。この生物学的特性には免疫学的特性が含まれ、真のタンパク質に 対して得られる抗体はこの組換タンパク質と交叉反応する。 セルロースシンターゼの生産のために有用なポリペプチドを特徴付けるために本 明細書で用いる語「組換ポリペプチド」は、ゲノミック、ｃＤＮＡ、半合成又は 合成核酸配列により、その起源又は操作によりコード化されたポリペプチドを意 図し、 （１）これらは天然又はライブラリーの形においてそれらが関連するポリヌクレ オチドの全て又は一部に結合するのではなく；そして／又は （２）その天然の形において結合するそれら以外のポリヌクレオチドと結合して いる。 「表現システム」は、作動連結している目的のコード化配列及びコントロール配 列を含むＤＮＡ配列を称し、これらの配列により形質転換された宿主はこのコー ド化タンパク質を生産できる。形質転換を行うため、この表現システムはベクタ ー上に含まれることができ；しかしながら、この関連ＤＮＡは宿主染色体に一体 化せしめることもできる。 「感受性宿主細胞」は、宿主細胞に耐性を授ける遺伝子を含むＤＮＡセグメント なしでは、与えられた抗生物質の存在下において生育できない宿主細胞に関する 。 本明細書に用いる語「ベクター」は核酸を宿主細胞に移し入れるのに適するポリ ヌクレオチドに関する。この語はプラスミド、ミニークロモソーム、ファージ、 むき出しＤＮＡ等を含む。 Ｂ、二股放反■ 細菌セルロースシンターゼオペロンの１又は複数のＤＮＡ配列コード化遺伝子を 得るための以下に示す方法は、単に実例を示す目的であり、それらは典型的に利 用されうるものである。しかしながら、遺伝子が同定できたのなら、その他の当 業界において理解される方法も用いられうる。 セルロースシン　−ゼオベロンに・　るコー二」」Ｊ

【歿至丘取 細菌セルロースシンターゼオペロンをコード化するポリヌクレオチドは、例に記 載した通すヱ−ｔｚｆ−ｔεにＤＮＡライブラリーから得られ、そしてこの遺伝 子を同定するために遺伝的相補性を利用した。 細菌セルロースシンターゼオペロンをコード化するヌクレオチド配列を得るため の方法は、ヱ鬼上にＤＮＡについての通用化を必要とする多数の個々の段階を利 用し、そしてそれは（１）セルロース陰性（Ｃｅｌ）突然変異ヱ皇上バＬＬ二株 の準備及び特徴付け；　（２）クローニングのための適切なベクターの作成：　 （３）７−ｔ＝Ｉ−）＜９Ｌ二ＤＮＡライブラリーの作製；（４）Ｃｅｌ−ヱ皇 上乙Ｕ二突然変異におけるセルロースシンターゼ活性を復帰せしめることができ るＤＮＡ挿入配列の同定及び単離；　（５）配列分析及びセルロースシンターゼ コード化配列の局在の両者のための細菌セルロースシンターゼオペロンをコード 化するヌクレオチド配列の地図化及びサブクローニング；並びに（６）セルロー スシンターゼオペロンの生成物をコード化するＤＮＡのクローニング及び表現を 含む。 クローン化配列の確認は、組換的に生成した細菌セルロースシンターゼのＮ末端 アミノ酸配列と天然のヱ土上に源から精製したものとを比較することにより行わ れる。更に、クローン化ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列を、天然 のヱｉ−ヒゲク３−二源から得られ、且つ精製したタンパク質の一次配列と比較 することがある。 セルロースシンターゼをコード化する遺伝子のクローン化の試みは、Ｂ遺伝子の 同定により最初に導かれる。セルロースシンターゼＢ遺伝子がクローン化及びシ ーケンス化されても、この遺伝子の５′末端の解読は種々の理由により困難であ る。例えば、二車上バＵ二における転写及び翻訳シグナルは特徴付けられていな く、そして、旦、ユニコントロールシグナルについても知られている同様の、又 は類似のコントロールシグナルはアラニン（精製した天然タンパク質のＮ末端残 基）についてのコドンの上流領域において存在していなかった。しかしながら、 この遺伝子上流のオーブンリーディングフレームの接近性は、この遺伝子が多シ ストロン情報の一部であることを推定させる。それ故、この遺伝子の上流及び下 流両者のオーブンリーディングフレームの配列の更なる研究が本明細書に記載通 りに行われた。これらの研究により、シングルプロモーター５′末端に、そして 転写終結領域の３′末端に連結する４つ密接にリンクした遺伝子が同定された。 これらの遺伝子生成物のそれぞれの正確な機能は確認されていないが、相補性の 研究が示すには、セルロースシンターゼ活性において欠損する株は遺伝子Ｂによ り補完されることができ、そしてセルロースシンターゼ及びジグアニレートサイ クラーゼ活性の両者において欠損するこのセルロース陰性突然変異は遺伝子Ａに より補完される。セルロース陰性クラス■突然変異は、遺伝子Ｃ及びＤについて コード化するＤＮＡフラグメントにより補完される。このグループにおける突然 変異はインビトロにおいてセルロースを作り、そしてセルロース生産に必要な全 ての酵素活性を有する。遺伝子りはセルロース合成に関連するタンパク質をコー ド化する。この遺伝子の分解はセルロースの合成を明らかに低める。 遺伝子Ａ、Ｃ及びＤはインビトロでのセルロース合成に必要な調節、構造、膜結 合、又はプロセッシングタンパク質をコード化しうる。それぞれの遺伝子生成物 コード化配列の有用性は、セルロース合成の機構の更なる解明のための研究のた めの大量の各タンパク質の合成を可能にすることにある。 セルロースシン　−ゼの　刑 本発明の１方法により、セルロースシンターゼオペロンをコード化するポリヌク レオチドを、適切なベクターの中でクローン化せしめ、適切な微生物宿主の中に 形質転換せしめ、そしてセルロースシンターゼの表現を可能にする条件のもとで 培養せしめた。他方、このオペロンにおける各遺伝子の配列同定ができたのなら 、各遺伝子はそれぞれクローン化され、そして所望の遺伝子生成物を生産するた めに表現されうる。 セルロースシンターゼオペロン遺伝子生成物をコード化するポリヌクレオチド配 列の転写は、内因性ヱ皇上五ＬＬニプロモーターを用いて行うか、又は択一的に 、一旦一エ１刃−又はＢ−スブ土ユ久（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）由来のものを 含む異種細菌プロモーターにより行われうる。本明細書に記載の多数の異種プロ モーター、例えばｌａｃ、エエｌ及びｔａｃは調節プロモーターであり、そして それ故本発明の方法において細菌セルロースシンターゼオペロンの表現のコント ロールのために有用である。しかしながら、プロモーター、例えば温度感受性リ プレッサー（即ち、３７℃以上では非機能性）により調節されるＰＬプロモータ ーは、多数の一１ｊ−トＺ株において作動せず、なぜならこれらの株は通常３５ °Ｃ又はそれ以下で培養され、そしてこの温度範囲以上では生育しないからであ る。 異種プロモーターの制御は陽性又は陰性コントロール要素のいづれも利用できる 。例えば、異種プロモーターと結合したオペレーターを認識するリプレッサー（ 例えば、１ａｃｌリプレツサー）をコード化する遺伝子を宿主系に導入すること がある。他方、生育培地に存在するトリプトファンのレベルハ、エエＬプロモー ターの制御を提供することができる。 また、セルロースシンターゼオペロンのコントロール表現のための他の手段は、 ｍＲＮＡ転写物を安定化せしめるための異種転写ターミネータ−を利用しうる。 例えば、ｌ−スユンジェネシス　（も−μ捜り罰ｌ堕旦邦ユリ−の結晶タンパク 質から単離された転写ターミネータ−は、Ｅ、コリ及びＢ　スブチリス（Ｂ、　 ５ｕｂｔ月１註における多くのタンパク質の表現レベルを、それらのｍＲＮＡを 安定化せしめることにより増大することが示されている。同様に、このターミネ ータ−又はその他のこのようなターミネータ−は、７−！＝）ｚｌＬ二における セルロースシンターゼオペロンからのｍＲＮＡのレベルを高めるために用いられ うる。高められたｍＲＮＡのレベルは、組換ヱｊ」ｌ立とＬ二株におけるセルロ ース合成を高めるものと予想できる。 得られる作製物は、適切なセルロース生産微生物に挿入せしめ、そして適当な表 現ベクターを用いるか、又はもしプラスミドの不安定性さが問題なら、このプロ モーター遺伝子構造を宿主微生物の染色体の中に直接組入れるかのいづれかでそ れぞれ複製せしめる。このセルロース生産宿主微生物はセルロースシンターゼ陰 性株か、又はセルロースシンターゼ陽性株のいづれかでありうる。前者の例にお いて、１又は複数のセルロースシンターゼオペロン遺伝子は宿主微生物のセルロ ース生産能力を復帰せしめるであろう。後者の例において、組換セルロースシン ターゼオペロンの誘導が組換株のセフ１／　。 −スシンターゼ活性及びセルロース生産の両者を高めることが予想できる。 染色体セルロースシンターゼオペロンプロモーターの異種細菌プロモーターによ る置換は、セルロースシンターゼを過剰表現せしめるために設計するプラスミド システムにおいて複数の利点を有す。染色体プロモーター置換は、プラスミドる 。これはまた、プラスミド選別を支持する抗生物質の必要性を取り除く。最後に 、染色体プロモーター置換はアセトバエ叉二由来のオペロンのコントロールを取 り除き、より強い構成プロモーター、又は制御プロモーターを利用するコントロ ールの提供を可能にする。 本発明の細菌セルロースシンターゼオペロンの遺伝子をコード化するヌクレオチ ド配列は、一旦エエッ」−、ストレプトマイ五（７，ｙ旦μ扛且Ｑ−、ズーグロ エア　３匹れ些紋、青緑藻類及びサルシナベント１キユ１（Ｓａｒｃｉｎａ　ｖ ｅｎｔｒｉｃｕｌｉ）を含む種々の原核細胞系において表現されることができ、 その中でＬ二ユ及び７−ｋ）／ｌＬ二が好ましい。 セルロースシンターゼは細菌由来のため、セルロースシンターゼの表現のために 適するベクターは当業界において知られ、そして酢酸細菌、例えばヱ±上バエ叉 二のだめの宿主−ベクターシステムの発育のためのバイブリドシャトルベクター を含みうる。Ｆｕｋｕｙａ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）　Ａ　ｒｉｃ、Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｗ。 ４９　：　２０８３−２０９３には、選択を可能にする抗生物質遺伝子マーカー を有し、そして旦、２ｉ及びヱ皇上バ之久二において複製の可能な、比較的小さ いサイズの複数のシャトルベクターが記載されている。Ｆｕｋｕｙａ、　ｅｔ　 ａｌ＋　（１９８９）　Ａ　、　Ｅｎｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５５：１７ １−１７６には、旦、ユニ及びヱ−ｆ＝）ｚｌ　一種のためのシャトルベクター 、ｐｍｖ２４であって、β−ガラクトシダーゼを有する融合タンパク質としての クローン配列の翻訳を行うものが記載されている。 本発明はまた、セルロースシンターゼ遺伝子のクローニング及び表現において用 いるための内因性二史上ｆｆｉニベクターを提供する。このＰ８２４と称される ベクターは小さく、そし、て本明細書に記載のｐＫＴ２３０　ｃ　ｏ　ｓ　５コ ンシユゲージぢンベクター上に存在する大きな動員（＋５ｏｂｉｌｉｚａｔｉｏ ｒ＋）ｅＪ域が欠落している。ｐ８２４の小さいサイズは、クローニングベクタ ーとしての操作を容易にする。このベクターにおける挿入ＤＮＡの分析もその小 さいサイズに富国して大いに促進されるであろう。この２８２４ベクターは、１ つのアセトバクター宿主からの遺伝子を別のものに直接的にクローンするのに利 用でき、これにより宿生限定障害、及びＥ、）ＩＪからアセドパＵ二への、ｐＫ Ｔ２３０　ｃ　ｏ　ｓ　５コスミドの接合にわたり起こる一連の再配列／欠損を 最小にする。 内因性プラスミドを直接的な７＋）、＜１−タニニカート）＜１）１＝−移動の ために用いることができ、そして又シャトルヘクターの増殖のためにも用いられ うる。それ故、本発明は又、例えば旦＝孟ユの±１」＝−プロモーター及びぞの 翻訳開始シグナルを利用する所望の配列の直接的な転写及び翻訳を可能にする適 当なコントロール配列を利用して、クローニング及び表現ベクター（上−ユニ及 びアセトバクタ一種のため）の両方を提供する。これらのベクターによる７ｊＱ 上ニス叉二の形質転換は、種々のタイプのクローニング及び表現実験のために有 用な形質転換効率をもたらす。 ｌ上！張Ｊしλｌ収 細胞は機械的又は酵素的手段、例えばフレンチプレス、超音波処理又はリゾチー ム及びＥＤＴＡによる処理により破壊され、その後遠心してセルロースシンター ゼ活性を含むベレットを回収する。 このベレットを再懸濁し、そして遠心して可溶性タンパク質を除去し、そしてこ の集めたベレットを清浄剤、例えばジギトニン又は２０％のグリセロールををす るトリトンｘ−ｉｏ。 により溶解せしめる。任意的に、この所望の活性を限外濾過又は遠心を利用して 濃縮せしめる。 この酵素は、その他の清浄剤溶解タンパク質から分離せしめるためにそれ自体の 不溶性生成物、セルロースを利用して捕獲される。この捕獲酵素はセルロースか ら、精製セルラーゼによるセルロースの分解により回収されうる。 髪皇方広 してほとんどの実施者は特定の条件及び方法の記載する標準的な原料の資料につ いて精通している（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照のこと）。 他に、Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｊ、　Ｍ、　（１９７２）　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　 ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ、　ＮＹは、細菌のコンジェゲーシジン実験のために有用な一般的な方 法を提供する。しかしニア）０−二ど配刀五」」も１１！ 原核細胞は種々の呈−９１株によく代表される。しかしながらその他の微生物株 、例えばバーｙ−ｔｂｘｙ、ｙ＋男、−３ユ旺遁１石−３ｕｂｔｉｌｉｓ）、い ろいろな種の１土九べλ叉二、之五二！ミよ±ス及びストレプトマイシスも利用 されうる。このような原核細胞系において、複製部位及びコントロール配列を有 する、各宿主に適合する種由来のベクターが利用される。例えば、旦、ユニは、 例えばｐＫＴ２３０であってアメリカンタイプカルチャーコレクシジン（ＡＴＣ Ｃ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＯ（ＡＴＣＣ，Ｎｏ、３７２９４）から入手で き、そしてＢａｇｄａｓａｒｉａｎ　ら（１９８１）Ｇｅｎｅ　１６：２３７− ２４７に記載のベクター、又はｐＢＲ３２２の誘導体であってＥ　コニ種由来の 、そしてＢｏｌ　１ｖａｒら（１９７７）Ｇｅｎｅ　２：９５に記載のプラスミ ドを用いて形質転換されうる。 プラスミドｐＫＴ２３０はレプリケーション由来のブロードホストレンジ（ｂｒ ｏｏｄ　ｈｏｓｔ　ｒａｎｇｅ）、レブリケーション由来のＥ　コリ、コンジュ ゲーションに必要な遺伝子及びストレプトマイシン耐性マーカーを有する。プラ スミドｐＢＲ３２２はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子 を含み、それ故目的のベクターの作製において保持されるか破壊されることがで きる付加マーカーを提供する。本明細書で転写開始のためのプロモーターを含む ものと定義する、一般に利用される、任意的にオペレーターを有し、リポソーム 結合部位配列を有する、通常利用される原核細胞コントロール配列には、ベータ ー−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）のような通常利用されるプロモーター、並 びにラクトースＷプロモーターシステム（Ｃｈａｎｇら（１，９７７）　Ｎａｔ ｕｒｅ　１９８：１０５６）、トリプトファン豆■）プロモーターシステム（Ｇ ｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃｔｄｓ、　Ｒｅｓ、　８：４ ０５７）　、ハイブリＦｔａｃプロモーター（Ｄｅ　Ｂｏｅｒら、（１９８３） 　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　塵、五ハ、　ＵＳＡ　８０　：２ｌ−２５）、及び ラムダ誘導ＰＬプロモーター（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１，９８１）Ｎａｔｕｒ ｅ　２９２：１２８）　、更にＮ遺伝子リポソーム結合部位を含み、これはポー タプルコントロー・ルカセットとして有用に作製されている。１９８７年１２月 ８日出願の米国特許４．７１１，８４５号にこのポータプルコントロール配列が 記載され、これはＰＬプロモーターである第１．ＤＮＡ配列を含んで成る。この プロモーターは第２ＤＮＡ配列と作動連結し、この第２ＤＮＡ配列はＮ＊ＢＳ配 列の３′側の６塩基対以内に切断を可能とする少なくとも１つの制限部位を有す る第３のＤＮＡ配列のＮｌｌｌ５上流に対応する。１９８７年５月１９日出願の 米国特許４．６６６．８４８号は細菌セルロースシンターゼを表現するのに有用 な高められた表現能力を有する更なるベクターを開示する。更に有用なのは、本 明細書に参照文献として組入れている１９８６年１０月８日公開の欧州特許公開 １９６．８６４号におけるＣ　ｂ　ａ　ｎ　ｇらにより説明されたアルカリホス ファターゼ並胚Ａ）系である。これらの公開物は有用な表現システムを提供する が、原核細胞に適用できるあらゆる有用なプロモーターシステムが用いられうる 。 アセトバク　−の　へのＤＮＡの Ａ、コンジュゲーション コンジュゲーションは異種のＤＮＡを目的の宿主細胞に移送するために有用な技 術である０本発明において作製したコスミドベクターは旦−ユニから、異なる細 菌宿主、例えばアセトバクターにおける複製のために移送せしめることは容易で ない。このような場合において、ヘルパープラスミド、例えばｐ　ＲＫ２Ｏ１３ （Ｆｉｇｕｒｓｋｉ　ａｎｄ　Ｈｅ１ｉｎｓｋｉ、　（１９７９）　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ｔｌｓＡ　７６：１６４８０１６５２）が、 目的のＤＮＡインサートを含む、コスミドベクターを、提供細胞から受容細胞へ の　７移送においての補助に利用されうる。提供物を受け取った細胞は、形質転 換受容細胞が耐性である抗生物質を含むプレート上において増殖せしめることに より選別せしめた。ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ、前述）は、受容細胞の選別のために 滋養マーカーを利用するコンジュゲーション方法を開示している。他の、大まか なスクリーニングのために適する方法は、例Ｖに詳細に記載する「多スポットコ ンジュゲーション方法」である。 Ｂ、ゑ１転景 用いた宿主細胞に依存して形質転換は、このような細胞に適切な標準的化学的技 術を用いて行うか、又はエレクトロポレーションを用いうる。例えば、Ｃｏｈｅ ｎ、　ｓ、　Ｎ、＋（１９７２）　Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　６９：２１１０に記載の塩化カル シウムを利用するカルシウム処理が、実質的に細胞壁バリアーを含む原核細胞又 はその他の細胞のために用いられる。 特徴付けされていない種の化学的方法の不利な点は、どのプロトコールによる成 功の機会も小さいことであり、それ故、有用なレベルの形質転換を得る条件の最 適化のための実験が必要でありうる。最近、細菌を強力な電場にさらすことが２ ニードモナス及び旦−ユニを含む広範囲の細菌の形質転換に有用であることが示 された。細菌に通用するエレクトロポレーションは１９８３年から利用されてい る（Ｓｈｉｖａｒｏｖａら（１９８３）ム虹ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　２３： ５９５）　、　Ｄｏｗｅｒ　ら（１９８Ｂ）　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄ。 Ｒｅｓ、　１６：６１２７）は、旦、二１におけるエレクトロポレーションの効 率は、化学的手段により得られる最高のレベルよりも・　１０から１００倍であ ることを示している。 ２つの基本的なパラメーターがエレクトロポレーションの効率に影響する。１つ は電場の強さであり、そして他方は電場の強さが衰退する時間（パルス持続時間 ）である、任意的に、細胞は一定の電極距離（ｄ）を有するスペクトロフォトメ ーター型キュベツトにおいて電場（Ｅ）を受ける。それ故、キュベツトに通用さ れる電圧（Ｖ）は電場力を決める（Ｅ＝Ｖ／ｄ　）。 サンプルへの正確な電圧の伝搬は、電荷を最初にコンデンサーに溜めることで行 われる。パルス持続時間、電場の分散は一般に指数式において導かれ、そして衰 退の持続時間は一連のコンデンサー及び並列抵抗の組合せにより決まる。 本明細書に示す通り、本明細書において用いるアセトバクえ二株のだめの最適な 電場の強さは９〜９．５ＫＶＯ間である。 ２５−１００μＦ（シリーズ）対２００−１２００オームを利用するパルス持続 時間（ＲＣ値）の研究は、ヱｉ上亙文叉二株１３０６−２４のためには２５　ｕ 　Ｆ／７５０オーム（＝　１８．７５ｓｓｅｃ）が最適であることを示した。得 られる形質転換のレベル（約１０’の形質転換体／μｇ）は化学処理により得ら れるものよりも約１０”倍高い（Ｆｕｋｕｙａ、ｅｔ　ａｌ、（１９８５）　Ａ 　ｒｉ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、４９：２０９１−２０９７）　。 二車上バＵ二から調製したＤＮＡの形質転換率は、旦一旦ユから調製したＤＮＡ の場合よりも１０”倍高いことも分った。 理論付けしようとは考えないが、この種の障害は非修飾、おそらくは非メチル化 旦−ユＪＤＮＡに基づくエンドヌクレアーゼ宿主制限活性に起因するであろう。 このような抑制障害を低める方法は本明細書に記載していない；しかしながら、 この制限障害は本明細書記載のアセトバクター−アセトバク叉二ベクターを作り 上げることにより回避できる。 アセトバク　−ＤＮＡ−ＤＮＡイン ートＡライブラリーは１」」ソεムＬ二から、ヱ」」二と乞久二細胞由来の核酸 の単離及びサンプルにおけるＲＮＡを分解せしめることにより調製される。この 回収したＤＮＡを適当な制限酵素、例えば５ａｕ３Ａにより部分的に分解せしめ 、そしてこのＤＮＡを例えばスクロース勾配を利用して逐次的にサイズ分画する 。選ばれた大きさの範囲の分子を含む両分をコスミドベクターの中にリゲートせ しめ、その後ラムダファージ粒子の中に便宜的にパンケージせしめる。次にこの ファージ粒子を適当な宿主、例えばＥ、コリに感染せしめるために用いる。挿入 されたＤＮＡの大きさを決定するため、う増殖させ、そしてスクリーンした。 −≦ｌ！上が１主製 目的のコード化配列及びコントロール配列を含む適当なベクターの作製は、当業 界においてよく理解されているリゲーション及び制限酵素技術を利用する。単離 プラスミド、ＤＮＡ配列又は合成オリゴヌクレオチドを切断せしめ、仕立て、レ アーゼにより、当業界において知られる一般的な条件のもとで行われ、その特異 性はこれら商業的に入手できる制限酵素の製造者により明確化されている。Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ。 Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｃａｔａｌｏｇ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ 、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）を参照のこと。一般に、約１μｇのＤＮＡは、約 ２０μｍの緩衝溶液における１ユニツトの酵素により分解される。制限酵素の過 剰はＤＮＡ基質の完全な分解を確実にするために用いられる；しかしながら、部 分的分解であって、ＤＮＡにおける付与された制限酵素のいくつかであって全て でない部位が分解されることを行うことが望ましいことがある。このような部分 分解は制限酵素の濃度を変えること、又は制限分解の実施時間を変えることによ り達成される。約１時間から２時間で、約３７°Ｃでのインキュベーションが有 用であるが、その変更もそしてその後エーテル抽出せしめることがあり、そして この核酸はエタノール沈殿による水性画分から回収される。必要ならば、分解フ ラグメントのサイズ選別を標準技術を利用するポリアクリルアミドゲル又はアガ ロースゲル電気泳動により行うことがある。サイズ選別の一般的な説明は、Ｍｅ ｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚ　５ｏｌｏ　（１９８０）　６５：４９９−５６０；　 Ｌａｗｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８］）Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９： ６１１３−６１１４及びＧｏｅｄｄｅｌ、　ｅｔ　ａｌ−＋　（１９８０）Ｎｕ ｃ、ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　８：４０５に記載されている。制限分解フラグメント はＥ　２ＪＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウ）の大きなフラグメントによる、 ４種のデオキシリボヌクレオキト３リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下において、２０ から２５°Ｃでの約１５から２５分間でのインキュヘーション時間を利用して５ ０ｍＭのトリスｐＨ７，６，５０ｍＭのＮａＣ１，６ｎ＋ＭのＭｇＣｌ、６ｄの ｄＴＴ。 約ＩＵ／μｍのフレノウ及び１００μＭのｄＮＴＰ中における処理によりプラン ト末端にされうる。このフレノウフラグメントは、接着末端の５′側の反対側を 「埋め合わせ」するが、しかし酵素の３′−→５′エキツクヌクレアーゼ活性は 、鋳型領域の非存在下において一本鎖の３′側の突出しを分解せしめる。必要な らば、選択的な修復は、その接着末端の性質により示される制限内において１種 のみの、又は選ばれたｄＮＴＰを供給することにより行われうる。フレノウによ る処理後、この混合物をフェノール／クロロホルムにより抽出せしめ、そしてエ タノール沈殿させる。Ｓ１ヌクレアーゼ又はＢａ１−３１による適当な条件下で の処理は、任意の一本鎖部分の加水分解をもたらす。 法により調製されうる。アニール化の前の又は標識化のための一本鎖のリン酸化 は、過剰の、例えば約１０ユニツトのポリヌクレオチドキナーゼを１ナノモルの 基質に対して、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７，６，１０ｍＭのＭｇ　ＣＩｇ　、　 ５ａ＋Ｈのジチオスレイトール及び１−２ｄのＡＴＰの存在下において用いるこ とにより行われる。もしリン酸化がプローブの標識のためであったら、ＡＴＰは 高い比活性のガンマ−０Ｐを含むであろう。 リゲーションは１５−３０μｌの容量において、以下の標準的な条件及び温度の もとで行われる：　［２０＋ｓＭのトリス−ＨＣｌ、ｐ）１７．５、ＩＯＲＩＭ のＭｇＣ１，１０ｄのＤＴＴ、３３μｇ／ＩｌｌのＢＳＡ、　１０ｍＭ　５０＋ ｓＭのＮａＣｌ、及び４０ｔｔＭのＡＴＰ、０．０１−０．０２（Ｗｅｉｓｓ） 　ユニットのＴ４ＤＮＡリカーゼにより０°Ｃで（「接着末端」のリゲーション のため）、又は１ｍＭのＡＴＰ、０．３−０．６　（Ｗｅｉｓｓ）ユニットの７ ４ＤＮＡリガーゼにより１４′Ｃで（「プラント末端」のりゲーションのため） 。］分子間の「接着末端」のリゲーシジンは通常３３−１００μｇ／＋１の総Ｄ ＮＡ濃度（５−１１００ｎの最終総濃度）で行われる。分子間のプラント末端リ ゲーション（通常１１３０倍の挿入物の過剰モル数を利用する）は１μＭの最終 総濃度で行われる。 「ベクターフラグメン）−Ｊを利用するベクター作製において、このベクターフ ラグメントは５′リン酸を除去し、そしてベクターの再すゲーションを防ぐため 、一般に細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）により処理する。ＢＡＰ分解は ｐＨ８にて、約１５０ｍＭのトリス中で、Ｎａ’及びＭｇ″２の存在下において 、１μｇのベクター当り約１ユニツトのＢＡＰを用い、６０°Ｃで約１時間行わ れる。核酸フラグメントを除去するため、この調製物をフェノール／クロロホル ムにより抽出せしめ、そしてエタノール沈澱させた。他方、再すゲーションは、 不要のフラグメントの更なる制限酵素分解により二重に分解せしめたベクターに おいて防ぐことができる。 −仄Ｗム列１腹 配列の修飾を必要とする、ｃＤＮＡ又はゲラミックＤＮＡ由来のベクターの一部 のため、位ＩＩ特異性プライマーに向けられた突然変異誘発を利用した。この技 術は当業界において現在標準的であり、そして突然変異すべき一本鎖ファージＤ ＮＡと相補するが、ただし目的の突然変異を表わすために一定の不対合のプライ マー合成オリゴヌクレオチドを用いて行う。簡単には、この合成オリゴヌクレオ チドは、ファージＤＮＡと相補の鎖の合成を導くためのプライマーとして用いら れ、そして得られる二本鎖ＤＮＡをファージ支持宿主細菌に形質転換せしめる。 形質転換細菌の培養物をアガーの上において平板培養し、ファージの潜入した単 一細胞由来のプラークを形成せしめる。 理論的には、新しいプラークの５０％は、−末鎖として突然変異の型を有すファ ージを含むであろう：５０％は本来の配列を有すであろう。このプラークをニト ロセルロースフィルターに移し、そしてこの「移されたもの」をキナーゼ処理合 成プライマーと、正確なハイブリダイゼーションを可能にするが、本来の鎖との 不対合がハイブリダイゼーションを妨げるのに十分となる温度でハイブリダイゼ ーションせしめる。プローブとハイブリダイズしたプラークを次に選び、培養し 、そしてそのＤＮＡを回収した。位置特異的突然変異処理の詳細は、記載例にお いて以下、説明する。 作襄上皮耗ｌ 以下に記載する構造において、プラスミドの作製のための正しいリゲーションは 最初の形質転換Ｅ、コリ株ＭＭ２９４、又はリゲーシヲン混合物を有するその他 の適当な宿主により確認する。有用な形質転換体はアンピシリン、テトラサイク リンもしくはその他の抗生物質耐性体により選ばれるか、又はプラスミドの作製 の方法に依存して、当業界に知られるその他のマーカーを利用して選ばれる。こ の形質転換体由来のル（Ｃｍ）増幅（Ｃｌｅｗｅ１１．（１９７２）Ｊ、　Ｂａ ｃｔｅｒｉｏｌ、　１１０：６６７）に従って調製される。この単離ＤＮＡを制 限処理及び／又はＳａｎｇｅｒらの（１９７７）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４：５４６３、更に詳しくはＭｅｓｓｉｎｇ　ら の（１９８］）Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９：３０９に記載の乏云土土 之方法、もしくはＭａｘａｍ　らの（１９８０）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ 戸且匡ｕ−，６５：４９９の方法によりシーケンス化されることにより分析する 。 本明細書に記載の発明をより理解せしめるため、以降の例を記載するが、これは 例示を目的としており、本発明をいかなる手段において限定するためのものでは ない。 Ｌ セルロース　アセ　バク　−　の量 販下の例において、多数の培地を用いた。何らがの記載がない限り、培地は以下 の通りに作られている：Ｒ２０−２培地は次の組成を有する： 成分　最終濃度 バタトーベプトン　５ｇ／ｌ 酵母抽出物　５Ｒノ】 Ｎａ、ＨＰＯａ　５ｇ／ｌ クエン酸　１．１５ｇ／ｌ 炭素源　特定された通り （特定されていない場合、２％のグ ルコース） 最終ｐＨ５，０±０．２ 最少培地Ｒ７０（アセトバクター最少培地、又はｒＡＭＭＪとも称する）は次の 組成を有する： 成分　量１日１！ （ＮＨ，）、Ｓｏ、　２５ ＫＨ，Ｐｏ、　７．３ Ｍｇ５０．　１．０ Ｆ　ｅ　Ｓ　Ｏ，０，０１３ ＣａＣ１ｚ　０．１Ｏ ＮａｚＭｏＯ４０，００１ Ｚ　ｎ　Ｓ　ＯＪｏ、００６ Ｍ　ｎ　Ｓ　０．　０．００６ 何らかの記載がない限り２％又 は４％（Ｗ／Ｖ） Ｒ−７０培地及びその改質品を使用する全て研究のために、次のビタミン混合物 を１００倍希釈でこの最少培地に加えた：遷し也　ビ　ミン′Ａ−Ｌ イノシトール　２００ ニアシン　４０ ピリドキシン　ＨＣＩ　４０ チアミン　ＨＣＩ　４０ Ｃａ　パントテナーテ　４０ リボフラビン　２０ パラ−アミノベンゾン酸　２０ 葉酸　０．２ ビオチン　０．２ Ｒ７０−２培地はＲ７０の改質型である。Ｒ７０−２は次の組成を有（ｍＭ） （ＮＨ，）、Ｓｏ、　２５ ＫＨ，Ｐｏ、　７．３ Ｎａ　クエン酸　４．０ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ　１．０ ＦｅＣ１３０，０１ ＣａＣ１ｚ　０．１Ｏ Ｎ　ａ　ｔ　Ｍ　ｏ　Ｏａ　Ｏ，００１Ｃｕ　Ｓ　０．　０．００１ ＣｏＣ１ｚ　Ｏ，００１ ＮｉＣ］□　０．００１ 底圀　１笠１度 （ＩｌｌＭ） と−戸ミン混合物　１０ｍ１／リッターグルコ−３・７　特定した通り 六然゛　アセトバク　−　の Ｒ７０１００ｍ１＋　２％のグルコース＋２％のトウモロコシの浸したリカー（ ｃｏｒｎ　５ｔｅｅｐ　１ｉｑｕｏｒ）　Ｒ８０４Ｅ　（ＣＳＬ、　ＣｏｒｎＰ ｒｏｄｕｃｔｓ、　ＮＪ）培地を含む３つの組織培養フラスコをアセドパＬＬ二 株１３０６−２１　（ＡＴＣＣＮｏ、５３５２４）（各フラスコに対して１本の 凍結２１バイアル）により感染せしめた。このフラスコを静置して、２３時間、 ３０℃でインキュベートせしめた。 培養物においてヱ皇上べえＬ二細胞により形成された薄膜をビンセントで取り出 し、約１５秒はどかき混ぜ、そして４層の除菌チーズクロスで濾過せしめた。細 胞を、４℃で７５０Ｏｒｐｍ＋０１０分間の遠心により、０．９％のＮａＣｌで ２回洗浄せしめた。この細胞を０．９％のＮ　ａ　Ｃ１２０ｍ１に再＠濁せしめ 、そしてもう一度あらゆる残骸を除去するために４層のチーズクロスで濾過した 。 ９５％から９９．９％の細胞殺傷を及ぼす突然変異誘発性条件を選んだ。この培 養物を３０℃でインキュベートせしめた。突然変異原はエチルメタンスルホネー ト（ＥＭＳ、　Ｓｉｇｗａ＋　Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ＋ＭＯ）であった。このＥＭＳ 濃度を１％から２％（Ｖ／Ｖ）の範囲にし、そしてインキュベーション時間は６ ０分から２１０分の範囲にした。同様の条件を１ｊ」１８と外二株１３０６−３ 及び１３０６−１１に用いた（それぞれのＡＴＣＣＮｏ、　５３２６４及び５３ ２６３）。 Ｃｅ１−ヱ皇上バＵ二株を単離するために２つの方法を用い、それは１）表現を 伴わない突然変異誘発、及び２）表現を伴う突然変異誘発である。 わないＥＭＳ″″然　嫌　か゛の７然゛　アセドパ久叉二銖 １立上に株１３０６−２１をＥＭＳにより処理し、その後、パーセント生存率を 検定するためにＲ２０−２培地上に直接平板培養せしめた。　１３０６−２１の ＥＭＳ突然変異性由来のプレートは、以下の通りに潜在性Ｃｅ１−コロニーにつ いて試験した。 この突然変異誘発培養物を平板培養し、そして７日後に予想されるＣｅ１−コロ ニーを採取した。、Ｃｅ１−突然変異はプレート上で、平らな光沢のあるコロニ ーとして同定することができる（野性型コロニーは荒い、乾いた外観を有する） 。 撹拌せしめた培養Ｃｅ　Ｉ”株はペレットを形成するが、ＣｅＮ’培養物は単一 細胞の懸濁物を生成する。Ｃｅ１−コロニーの頻度は０．０５％から２％の範囲 にあると検定された。 −エ」＝ヒバｊ」萱二株１３０６−３及び１３０６−１１からＣｅ１−株を単離 するための類似の技術が利用され、そして類似の突然変異頻度が観察された。 ”ＥＭＳ−然・　嫌　による？″″然・　アセトバク」 ＥＭＳ処理ヱ土上バｍ二細胞（株１３０６−２１）のサンプル（約０．０５ｍ１ ）をチューブの中（２１、Ｒ２０−２培養液）に感染せしめ、そして突然変異を 表現せしめることを可能とするために静置培養により増殖せしめた。培養サンプ ルを連続希釈し、そしてＲ２０−２プレート上で平板培養せしめた。インキュベ ーション後、前記のプロトコールを利用して潜在性Ｃｅ１−タイプに対するコロ ニーをスクリーンし、そして同程度の突然変異頻度が得られた。Ｃｅ１−株をヱ 丈上ｔ＜９１二株１３０６−３及び１３０６−１１から単離するために類似の技 術を用いた。 ■エ セルロース　アセトバク　−　の　・番セルロースシン　−ゼゞ　の。 Ｃｅ１−アセドパＵ二突然変異株のインビトロセルロースシンターゼ活性測定の ために用いるセルロースシンターゼ測定は、Ａｌｏｎｉ、　ｅｔ　ａｌ、、（１ ９８２）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７９　：　６ ４４Ｂ−６４５２に記載の改良方法であって、ウリジン５′−ジホスホ−１４０ ）−グルコース（ＵＤＰＧ）由来のアルカリ不溶性ポリマー（セルロース）の生 産を測定する方法である。この測定ハーエ」二りとりＪ−二Ｃｅ　Ｉ−突然変異 のスクリーニングのために適正比した。インキュベーション後（１０分、３０° Ｃ）、各反応混合物における未反応混合物を、ＮａＯＨとの加熱（９５°Ｃで１ 時間）及び濾過によりセルロースから分離せしめた。 フィルター上に残った放射性標識（”Ｃ）セルロースを次いでシンチレーション 計測により定量した。 この測定において用いた総タンパク質の量は、セルロースシンターゼの精製状態 に依存する。少なくとも１つの、この測定の直線領域（全ＵＤＰＧ消費量の２０ ％未満）を得るために、２から３の異なるサンプル希釈を測定した。 最終濃度として０．２ｍＭの（’Ｃ）ＵＤＰＧ　（７，５ｃｐａ＋／ｐモル）５ ０ｄのトリス、ｐＨ７，５，１０１のＭｇＣ１□、ＩＩＩＩＭのＥＤＴＡ。 ２ＩＩＩＭのＣａ　Ｃｌ　ｚ　、及びサンプルを含む０．２ｏ＋１の測定混合物 を測定した。サイクリンクジグアノシン１リン酸（ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ）を、いく つかの測定チューブに５μＭとなる迄加えた（ｃ−ｄｉ−ＧＮＰはセルロースシ ンターゼを活性化せしめる）。コントロールは、サンプルの加えられていないチ ューブ及びインキュベーション前に０．５ＭのＮａＯＨ４ｍ１の添加により変性 せしめたサンプルを含むチューブを含む。 一定時間の反応は、酵素を添加し、この混合物を混ぜ、そしてこのチューブを３ ０℃の湯浴に入れることで開始する。以降のチューブは一定の時間間隔で開始さ れた。１０分後、各反応を、チューブを湯浴から取り出し、０．５ＭのＮａＯＨ ４＊１を加え、そして撹拌することにより停止せしめた。全ての反応を停止させ たら、約２０＋ｗｇのセルロースを（”Ｃ）セルロースのためのキャリアーとし て働かさせるために各チューブに加えた。次いでこのチューブを湯浴の中にて９ ５°Ｃで１時間、細胞を分解せしめるために加熱した。 真空マニホールドを用い、各測定チューブの内容物をワットマン（Ｗｈａｔ＋５ ａｎ）　Ｇ　Ｆ　／　Ａフィルターで濾過せしめ、この反応混合物をフィルター に通過せしめることによりセルロース生成物を単離せしめ（あらゆる未反応”　 ＣＬＩＤＰＧを除去した）；この測定チューブを脱イオン水で３回すすぎ、この すすぎ水を流し；フィルターを脱イオン水２０１１で２回洗浄し；次いで０．５ ＭのＨＣｌ　２（１ｗｌ　、そして脱イオン交換水２０蒙ｌ、更にメタノール２ ０１で洗浄した。 セルロース生成物はシンチレーション計測により定量した。 各フィルターを、１０霧ｌのシンチレーション流体（ＮＥＮ　Ａｔｏｍｌｉｇｈ Ｌ　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）を有するシンチレーションバイアルに移し入れ、そ してセルロース生成の定量分析は、（”Ｃ）ＵＤＰＧの塩基性不溶物質への混入 によるシンチレーション計測により測定される。（＋’ｃ）ＵＤＧＰＯ比活性を 得るため、２１の（”Ｃ）ＵＤＧＰ保存液のアリコートを測定した。 この測定のｃｐ−の測定全域は保存液アリコートから決定でき、そして各測定チ ューブから消費された総ＵＤＰＧの割合は、以下の通りに計算される： 消費された総ＬＩＤＰＧの割合＝ （フィルターのｃｐｓ　）　−（）゛ランクのｃｐｓ　）（総計測値）−（ブラ ンクのｃｐｓ　）１分当りに消費されるＵＤＰＧのｎモルは以下の通りに計ズさ れる： ｎモルＵＤＰＧ／分−（消費された全ｔｌＤＰＧの割合）×（４０，０００ｐモ ル）　Ｘ　（１／１０分）活性は１ｍｌのサンプル当り、１分間当りのｎモルに 基づいて示すか、又は１＋＊ｇタンパク質当り、１分間当りのｎモルに基づいて 示した。 ジグアニレートサイクーーゼ　のための゛ジグアニレートサイクラーゼ測定は、 ２又はそれより多くの特定の活性を欠損、例えばセルロースシンターゼ活性＆び ジグアニレートサイクラーゼ活性における欠損するアセトバーダｊ≧：宿主を同 定するために用いた。このｊ酵素ジグアニレートサイクラーゼはグアノシン３リ ン酸／（’Ｇ　Ｔ　Ｐ”）由来の、セルロースシンターゼ活性化物質である・Ｃ −ｄｉ　−ＧＭＰの生産を触媒する。 細胞を増殖せしめ、洗浄せしめ、そして以下に記載のスクリーニング測定のため に超音波処理せしめた。ジグアニレートサイクラーゼ活性は、Ｒｏｓｓ、　ｅｔ 　ａｌ、、（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　３２５：２７９において報告されてい るものと類領のアッセイを用いて測定した。超音波処理細胞（ｌａｇ／アッセイ チュブ）を１ｏ分間、３０℃で、０．２ｓＭ（７）［７／し７ｙ−”Ｐ］　ＧＴ Ｐ、５０μｍＭノドリスＨＣＩ、ｐＨ７，５，１０ｍＭのＭｇＣ１ｚ、１ｍＭの ＥＤＴＡ、５ｍｌのＣａ　Ｃ１ｚ　、２　ｍＭのホスホクレアチン、及び２４ユ ニット／ｍｌのタレアチンホスホキナーゼを含む反応混合物０．１ｍｌにおいて インキュベートした。この反応を１００％（−／ν）のトリクロロ酢酸により停 止させた。沈殿物を除去するために遠心した後、各反応混合物１０−１を薄層ク ロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート（Ｐｏｌｙｇｒａｍ　Ｃｅｌ　３００　Ｐ Ｅ１．　Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｄ、Ｄｕｒｅｎ、Ｗ。 Ｇｅｒｖａｎｙ、　Ｕ、Ｓ、販売元５ｙｂｒｏｎ／Ｂｒ１ｎｋｓａｎ、　Ｗｅｓ ｔｂｕｒｙ＋　ＮＹ）上にスポットした。　こ（７）ＴＬＣプレートを１．５　 Ｍ（７）ＫＨ２Ｐ　Ｏ４、ｐＨ３，６５中に、約２時間展開せしめ、オートラジ オグラフせしめ、そしてＧＴＤ及びサイクリック−ジー〇ＭＰに相当するＴＬＣ プレート上の領域を切り出し、シンチレーション計測器において計数せしめた。 困又斐二三＞ｆヱ二土工 セルロースシンターゼ活性の復帰を観察するため、セルロースシンターゼ陰性で あり、且つジグアニレートサイクラーゼ陽性である株を単離する必要がある。以 下のスクリーニングアッセイは前記のセルロースシンターゼ活性測定を改良した ものであり、そして２つの異なる酵素を包含する突然変異を、ＧＴＰ又はｃ−ｄ ｉ−ＧＭＰの有無においてセルロースシンターゼ活性を比較せしめることにより 検定するために用いられうる。このアッセイは懸濁した、超音波処理細胞による セルロースの生成により測定される。 突然変異ヱ皇上バＵ二株は、超音波処理細胞を複数の条件下で測定することによ り分類する。３つのクラスのアセドパＬ叉二突然変異体が同定された。クラスＩ （セルロースシンターゼ陰性）株はいづれのアッセイ条件のもとでもセルロース を生成しなかった。クラス■（ジグアニレートサイクラーゼ陰性）株はｃ−ｄｉ 　−ＧＭＰの存在下においてセルロースを生成したが、ＧＴＰの存在下において は生成しなかった。 クラス■の突然変異はＧＴＰ又はｃ−ｄｉ　−ＧＭＰのいづれかによる活性化後 、セルロースを生成した。クラス■及びｍにおける突然変異体はセルロースシン ターゼを含み、そしてインビトロで活性を示したが、しかしインビボではわずか 、又は全つくセルロースを生成しなかった。クラス■突然変異体におけるこの欠 損は、生化学的に定義できなかった。 スクリーニングアッセイは以下の条件：１）ヌクレオチド無添加；２）０．４蒙 りのＧＴＰ添加；及び３）５ＭＭのＣ−ｄｉ−ＧＭＰ添加、のちとで行った。 酵素の由来及び用いた緩衝液について除外して、このアッセイ方法及びコントロ ールはセルロースシンターゼ活性測定についての前記と同じである。 ６つの突然変異ヱ」」ニーとＬ１株を単一のスクリーニングにおいて測定した。 全てにつき、セルロースシンターゼ活性及びジグアニレートサイクラーゼ活性の 両者を有するアセトｆｆｌ二株を、アッセイ間の一貫性を監視するために含ませ た。 選別せしめたヱ土上二り叉二株を約２４時間、３０°Ｃで増殖せしめた。生育培 地はＲ７０−２，１％のアンプレックス１００３（Ａｍｂｒ１００３（Ａ；　Ｔ ＹＥ、　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｆｏｏｄｓ＋　Ｍｉｌｉｌｌａｕｋｅｅ、　Ｗｌ ）、４％のフルクトース、０．０１％のＶ／ＶダウコーニングアンチフオームＢ （Ｄｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ａｎｔｉｆｏａｅ　Ｂ）及び５０ａ＋Ｍの３，３− ジメチルグルタル酸（ＤＭＧ）、ｐＨ５，ｏを含む；　１２５ｍ１のバッフルシ ェークフラスコにおいて、２５＋＊ｌの培地を凍結シードバイアルからの細胞に より感染せしめた。細胞を集める前に、Ｒ７０−２＋０．５％のＴＹＥ及びグル コースアガープレートを、夾雑について検定するために画線培養した。このプレ ートを３０°Ｃで約３日インキュベートした。 細胞を集めるに先立ち、集塊を防ぐために０．６　ＭのＥＤＴＡ５ｍ＋］をこの 培地に加えた。この細胞を遠心しく５０００ｒｐｍ、１０分間、ＪＡ２１０−タ ー）、そして上清を捨てた。このペレットを５０＋ｓＭのリン酸カリウム緩衝液 、ｐＨ６，０２０＋＊ｌ　に懸濁せしめ、そして集塊を低めるために５ＭのＮａ Ｃｌ３ｍ１を加えた。 細胞密度は、クレット（Ｋｌｅｔｔ）メーター（１０クレント単位（’ＫＵＪ　 ）　＝約４０−ｇの細胞／ｍｌ）により測定した。この細胞を再度遠心しく　５ 　Ｋｐｐｒａ、１０分、ＪＡ２１０−ター）そしてこの上清液を捨てた。このペ レットを５０−ＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ヒペラジン、Ｎ’−３−プロ パンスルホン酸（ＥＰＰＳ。 Ｓｉｇｍａ）緩衝液、ｐＨ７，５中で２０ｗ＋ｇの細胞／　ｍ　］迄懸濁した。 二の細胞を超音波処理するため、０．５ｍｌの各細胞懸濁物を１．５１のエッペ ラドルフ遠沈管に移し入れた。各チューブをカップソニケータ−（Ｂｒａｎｓｏ ｎ　５ｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　Ｃｏ、、　Ｍｏｄｅｌ　３５０＋Ｐｌａｉｎｖｉ ｅｗ、　ＮＹ）内で、１分間、８０％の衝撃周波数、設定値７で超音波処理した 。アッセイは前述の通り、各アッセイチューブについて５０μｍの超音波処理細 胞懸濁物、５０ｍＭのトリスの代りに５０＋ｓＭのＥＰＰＳ　（ｐＨ９，０）を 含み、１＋ｓＭのＥＤＴＡを使用せず、そして１０ｍＭのＭｇＣｌ２の代りに２ ０ｍＭのＭ　ｇ　Ｃ１ｚを加えたものを用いて行った。各アッセイ条件は二重測 定で行い、そしてこの二重測定結果を平均した。 複数のＣｅ１−株を生化学的に特徴付けた。株１３０６−２４（１３０６−３由 来）は正常なるジグアニレートサイクラーゼ活性を有するが、セルロースシンタ ーゼ活性を欠損することが見い出せた。株１３０６−４２　（１３０６−２１由 来）及びＣ９０−１（１３０６−２１由来）はジグアニレートサイクラーゼ及び セルロースシンターゼ活性の両者を欠損する。これらの株を次の研究のために採 取した。 ■ コスミドベタ　−の　びコンジュゲーション　゛新規のコスミドベクターｐＫＴ ２３０　ｃ　ｏ　ｓ　５を、セルロースシンターゼ遺伝子のクローニングについ ての図２における概略の通りに作製した。このベクターはストレプトマイシン耐 性遺伝子（Ｓｓ）　、ファージラムダのＣＯＳフラグメント及び異種ＤＮＡの挿 入のためのクローニング部位を含む。 ラムダＣＯＳ部位を含む１．８５ＫｂのＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐ　 Ｖ　Ｋ１００（Ｋｎａｕｔ　ａｎｄ　Ｎｅ５ｔｅｒ、（１９Ｂ２）　Ｐｌａｓｍ ｆｄ８：４５−５５）から、制限酵素ＢｇｌＵによる分解から切り出し、そして プラスミドｐＵｃ１９におけるＢａｍＨ１部位においてクローン化せしめた（Ｎ ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｃａｔａｌｏｇ）、この新規のプラス ミドＰ　ＵＣ１９ｃ　ｏ　ｓ　２を制限酵素Ｈｉｎｄｎ［及びＸｍａＩで分解せ しめ、そして１．８５ＫｂのＣＯＳ含有フラグメントを含む）ｆｉｎｄｌｌｌ− Ｘｍａｌフラグメントを、ＸｍａＩ−及びＨｉｎｄｌ［分解プラスミドｐＫＴ２ ３０中でクローン化せしめ、これによりカナマイシン耐性遺伝子を不活性化せし めた。この得られるベクター、コスミドｐＫＴ２３０ｃｏｓ５は一旦一、ユ」− から１（−）２８とＬ二への自己感染ができない。 それ故、ヘルパーブーｙスミドｐ　ＲＫ２Ｏ１３が、ｐ　ＫＴ２３Ｏｃ　。 土５の供与細胞か頓乙１旦払久久二株１３０６−２４の受容細胞への転位移送に 必要である。　ｐＫＴ２３０　ｃ　ｏ　ｓ　５により形質転換せしめたＥ　コリ 株ＭＭ２９４を、１００　ｐ　ｇ　／ｍｌのＳｍを含む、Ｒ２培地（２０，０ｇ のトリプトン、１０．０ｇの酵母抽出物、１０．０　ｇのＮａＣ１，１，０リツ トルの蒸留水、ｐ）１６．９及び２８ノｌのグルコース（Ｒ２−４）　、更に任 意に１５ｇ／Ｉのバタトアガー）中で３７℃で１５０ＫＵのクレット値化増殖せ しめた。動員プラスミドｐ　ＲＫ２Ｏ１３を含む旦−ユニ株ＨＢＩＯＩを、５０ μｇ／ｓ＋ｌのＫｍを含む、Ｒ２−４培地にて３７°Ｃで１５０ＫＵのクレット 値化増殖せしめた。このヱｊ」二進ＬＬ＝受容細胞１３０６−２４をＲ２０−２ 培地中で３０°Ｃで２００ＫＵのクレット値化増殖せしめた。各供与細胞１■ｌ を動員し、そして２＋ｎｌの受容細胞を混合し、そして０゜２ミクロンのゲルマ ン（Ｇｅｌｍａｎ）ディスポーザブルフィルター（Ｇｅｌｍａｎ、　Ａｎｎ　Ａ ｒｂｏｒ、　Ｍｌ）で濾過せしめ、抗生物質を伴う１０５ｇ１のＲ２培地で、２ 回洗浄せしめた。このフィルターをＲ２−４培地を含むアガープレート上にて平 板培養した。このプレートを３０℃で３時間インキュベートし、交配を行った。 この３つの株間の交配後、このコンジュゲーション混合物を０．９％の塩化ナト リウム２−１中に再懸濁せしめた。この溶液０．１ｍ１を、５０μｇ／ｍｌのＳ ｍ及び２０μｇ／＋＋ｅｌのＣｍを含むＲ２０−２培地アガープレート上で平板 培養せしめた。このプレートを３０°Ｃで５日間インキュベートした。ヱ」」ソ εｌＬ二株はもとから２０μｇ／ｍｌのＣｍに耐性であるが、旦−ユ見株はそれ に対して感光性である。それ故、供与プラスミドを受け入れた７（−）／＜？Ｌ ニコロニーのみがこれらの選択プレート上で生育した。その後の制限分析は、コ スミドＰＫＴ２３０ｃｏｓ５がヱ！二株１３０６−２４におけるいかなる転位も 行なわれなかったことを示した。 猷 アセトバク　−ＤＮＡ−イブ−！−の ラムダファージは長さにおいて３８から５２ＫｂのＤＮＡを、もしＣＯＳ部位が その両端に存在するならばパッケージするであろう。ベクターｐＫＴ２３０　ｃ 　ｏ　ｓ　５は比較的小さいため（１３，５Ｋｂ）、大量のヱｉ工二Ｕ二ＤＮＡ （２Ｂから３７Ｋｂ）をラムダファージ粒子の中に挿入し、パッケージできる。 アセドパＵ二のゲノムサイズが一旦エエユＪ−のそれと等しいと考えるなら、７ ００から１０００クローンのみが完全な遺伝子バンクを得るために必要であると 考えられる。ＤＮＡバンクはアセドパｍ株１３０６−３から、以下の通りに作製 される。 約２６ｙａｇの核酸がＲ２０−２アガープレート上の二車上バｌえ二１３０６− ３菌叢から単離された。この核酸をＲＮａ　ｓ　ｅＡ及びＲＮａｓｅＴｌにより 処理し、このサンプルにおけるＲＮＡを分解せしめた。総量５６０μｇのＤＮＡ が回収された。このＤＮＡを制限酵素５ａｕ３Ａの４つの異なる酵素濃度で部分 分解せしめた。このＤＮＡを１０−４０％のスクロースグラジェントに基づいて 、サイズにより分画せしめた。２７−３８Ｋｂの間の最も多量のＤＮＡ分子を含 む両分を選んだ（約２μｇのＤＮＡ）。 約１μｇのこのＤＮＡを、ＢａｍＨＩ分解、且つ脱リン酸せしめたｐＫＴ２３０ 　ｃ　ｏ　ｓ　５の中にリゲートせしめ、そしてこのリゲーション分解物をラム ダファージ粒子の中にパッケージせしめた０次いでのファージ粒子をＥ、コリ株 に８０２ｒｅｃＡ−を感染せしめるために用いた。６つのランダム旦、ユ１単離 物から単離したコスミドＤＮＡを挿入ＤＮＡフラグメントのサイズの測定に用い た。この６つのクローンは平均サイズ２８Ｋｂを有する、８から４０Ｋｂに範囲 するＤＮＡ挿入物を有していた。約２０００のクローンを採取し、それぞれをマ イクロタイター皿にて増殖せしめ、そしてその後のスクリーニングのために保存 せしめた。このバンクをｐ　ＫＴ２３０　ｃ　。 五呈 セルロース　セ　バク　−　にお番るセルロースシンーゼ　′　せしめるクロー ン　ＤＮＡの−び皿 セルロースシンターゼ活性の復帰についての遺伝子的相補アッセイを、Ｃｅ１− ヱ土上バえＬ二突然変異体におけるセルロースシンターゼ活性を復帰できるコス ミドＤＮＡの単離のために用いた。 コンシュ°−シッン　のアセ　バク　−゛　−バンクのス久エニ三ヱｌ 遺伝子バンクｐ　ＫＴ２３０　ｃ　ｏ　ｓ　５　：　１３０６−３Ａ　２からの コスミド（例■に記載通りに得られたもの）を、以下に詳細の多スポットコンジ ュゲーション方法における動員プラスミドｐ　ＲＫ　２０１３を用いるスクリー ニングのために受容突然変異ヱ丸上ｆｆｌ二株１３０６−２４の中に移し入れた 。 二車上バＵ二株１３０６−２４をＲ２０−２培地中で、３０℃で振騰させながら 約２８時間、１００−１５０ＫＵのり一レット値となるまで増殖せしめた。旦− ユニＨＢ　１０１／　ｐ　ＲＴ　２０１３をＲ２−４培地及び５０μｇ／＋ｗｌ のカナマイシン（Ｋ−）中で、３７℃で振騰させながら、１００−１５０ＫＩＪ のクレット値となるまで増殖せしめた。 イクロタイタートレーから、１００μｌのＲ２−４培地及び５０μ／請ｌのＳｍ を含むマイクロタイター皿の中に感染せしめ、そして振騰せずに約１８時間、３ ７℃でインキュづ一卜せしめた。 この旦、ユ４　ＨＢ　１０１　／　ｐ　ＲＫ２Ｏ１３培養物を遠心し、Ｋｍを除 去せしめるために当容量の０．９％の生理食塩水で洗浄し、再度遠心し、そして 生理食塩水でもとの容量の１／１０における再懸濁により濃縮した。１０μｌ容 量のこの濃縮旦−ユニＨＢ　１０１　／　ｐ　ＲＫ２Ｏ１３を、旦−ユニに８０ ２　ｒ　ｅ　ｃ　Ａ−ｐ　ＫＴ２３０ｃ　ｏ　ｓ　５　：　１３０６−３−Ａ　 ２の１８時間培養物１００　ｕ　１を含む各マイクロタイターウェルに添加した 。１０μｍ容量の、この混合したＨ　Ｂ　１０１　／　Ｐ　ＲＫ２Ｏ１３及びに ８０２　ｒ　ｅ　ｃ　Ａ−ｐ　ＫＴ２３０ｃ　ｏ　ｓ　５　：　１３０６−３− Ａ　２培養物を、８チヤンネルピペツトを用いて乾燥した１５０ｇ＋＋ｗのＲ２ −４プレート上に、マイクロタイタープレートウェルのパターンと一致する方向 においてスポットし、従って各トランスコンシュガントが旦一旦ユコスミドバン クにおけるそのもとの位置にトレースできるようにした。このスポットが乾燥し たなら、更に１０μｌの各混合培養物をもとのスポット上に載せ、そして乾燥せ しめた。これを繰り返し、５０μｌの各混合培養物が載るようにした。このヱ皇 上二又叉二１３０６−２４培養物を遠心し、そしてもとの容量の１／１０の０． ９％の生理食塩水に再懸濁せしめた。この濃縮培養物１０μｍを、８チヤンネル ピペツトにより、Ｒ２−４プレート上のＨＢ　１０１　／　ｐ　ＲＫ２Ｏ１３及 びＥ、コリに８０２　ｒ　ｅ　ｃ　Ａ−ｐ　ＫＴ２３０　ｃ　ｏ　ｓ　５　：　 １３０６−３Ａ　２スポツトのそれぞれに載せた。このスポットを乾燥せしめ、 次いでこのコンジュゲーション混合物をＲ２−４プレート上で３０°Ｃで３時間 インキュベートせしめた。 どのトランスコンシュガントがセルロースを生成するかを検定するため、各交配 混合物を除菌つまようじにより交配プレートから取り出し、そして１３　Ｘ　１ ００ｓ＋−チューブ中の０．５％のＴＹＥ、３％のグルコース、２５−ＭのＤＭ Ｇ、２０μｇ／ｍｌのＣｍ及び５０μｇ／閣１のＳｍを含むＲ７０−２２諺ｌの 中に直接感染せしめた（「試験管選択スクリーニング」）、抗生物質Ｃｍは旦− ユｌ供与体及び補助親株の生育を阻害する。抗生物質Ｓｍはコスミドを受け入れ ていないヱ］」コシｌ−二株１３０６−２４の生育を阻害する。これらのチュー ブを３０℃でインキュベートし、そして７〜１４日目に月末の形成について検査 した。 この方法はトランスコンシュガントが生成したセルロースの識別を可能にした。 コスミド転移のために前述した多スポットコンジュゲーション方法及びセルロー ス生成のための試験管選別スクリーンを利用しながら、バンクｐ　ＫＴ２３０　 ｃ　ｏ　ｓ　５　：　１３０６−３Ａ　２　ｄｉ来の４８７個のコスミドをアセ トバクターセルロースシンターゼ突然変異１３０６−２４との交配において用い た。これらのコンジュケーション中、３８６個が有用なコスミド転移を示した。 この交配混合物のうちの３つは直立試験管スクリーン開始後、３０°Ｃで１４日 間のインキュベーションにより薄膜を形成した。 これら３つのコスミド供与培養物をＴｌ９Ｇ９．Ｔ２ＯＡ１及びＴ２０Ｂ６と命 名した。 これらのコンジュゲーション混合物を直接平板培養した際、Ｃｅ　ｌ”表現型を 示すトランスコンシュガントコロニーは現れなかった。コンジュゲーション混合 物を直立試験管に感染せしめることでセルロースの生成が検出された場合のみが 観察された。後の研究において、Ｃｅｌ’活性の復帰は組換に富国し、真の相補 によってではないことが観察された。このことは、単に平板培養に転るよりも、 試験管選別を利用するスクリーンについての必要性を意味しうる。 フィル　−六　におしるセルロースシン　−ゼ２　の′　の鐘認 コスミド７１９Ｇ　９　、　Ｔ２０Ａ　Ｉ及び７２０Ｂ６であって、その１３０ ６−２４　）ランスコンシュガントが前述の試験管選別スクリーンにおいて薄膜 を生成したものを、例■における方法に従う、ヱ文上バえ１二１３０６−２４　 （受容体）、Ｅ、コリＨＢＩＯＩｐ　Ｋ　Ｔ２Ｏ１３（ヘルパープラスミド株） 、並びにＥ、コリｐＫＴ２０３　ｃ　ｏ　ｓ　５　：　１３０６−３Ａ２　７１ ９Ｇ　９．−７２０Ａ　１及び−７２Ｂ６（供与株）による、フィルターコンジ ュゲーション方法により行われる転移において更に試験した。 １００μｍの交配混合物を試験管選別スクリーンのために感染せしめた。これら のコンジュゲーションについてのコンジュゲーション頻度を、交配混合物の連続 希釈を、２０μｇ／ｍｌのＣｍ及び４０　ｕ　ｇ　／ｍｌのＳｍを含むＲ２０− ２プレート上におけるコンジェゲーション後、直接平板培養することにより検定 した。陰性コントロールとしてベクターｐＫＴ２３０　ｃ　ｏ　ｓ　５をこれら のコンジュゲーションと平行して１３０６−２４に移し入れ、平板培養し、そし て試験管に感染せしめた。これら１３０６−２４　ｐＫＴ２３０　ｃ　ｏ　ｓ　 ５　）ランスコンシュガントは直立試験管スクリーンにおいて薄膜を形成せず、 そして直立試験管におけるＣｅ１−成育及び薄膜形成間の区別のためのコントロ ールとして働く、先に同定した３つのコスミドのうち、コスミドｐ　ＫＴ２３０ 　ｃ　ｏ　ｓ　５１３０６−３Ａ２　７１９Ｇ９のみが陽性の結果、即ち、直立 試験管スクリーンにおけるＣｅ１−から、Ｃｅｌ”の転換株１３０６−２４を示 した。コスミドＴｌ９Ｇ９のコンジュゲーシッンの頻度は受容細胞当り７．　Ｏ Ｘ　１０−”であった。 ■立 ｐ　ＫＴ２３０　ｃ　ｏ　ｓ　５　Ｔ１９Ｃ，９を有するｌ−ユニとアセトバク ター１３０６−２４とのコンジュゲーションをフィルター上で行った。１００μ ｌのコンジュゲーション混合物を前述の通り、試験管選別スクリーンのために感 染せしめた。７日後、試験管において薄膜が形成され、そしてこれを０．９％の ＮａＣｌ２５ｍ１にて、ブレンダーによりかき混ぜた。得られた懸濁物を、単一 コロニーのために２０μｇ／ｍｌのＣｍ及び４０μｇ／＋ａｌのＳｍを含むＲ２ ０−２プレート上で画線培養した。Ｃｅｌ“コロニーを採取し、そして１３０６ −２４　Ｔ１９Ｇ　９　＃１０６と表示した。 １３０６−２４　Ｔｌ９Ｇ　９　＃１０６から単離したコスミドは、長さにおい て１６．６Ｋｂであった。Ｔ１９Ｇ　９　＃１０６を有するＥ、コリ株に８０２ ｒｅｃＡ−を受容体として利用した場合、ヱ皇上、Ｒ９１＝トランスコンシュガ ントは試験管選別スクリーンにおける試験管の１００％においてＣｅビ表現型を 示した。それ故、１６．６Ｋｂのコスミドは１３０６−２４のＣｅ１−突然変異 におけるセルロースシンターゼ活性を復帰できる。制限分板は、Ｔｌ９Ｇ９＃１ ０６はＴ１９Ｇ９の欠落生成物であることを示した。インタクト遺伝子をクロー ン化後のヌクレオチド配列分析は、コス：：　）’Ｔｌ９Ｇ　９　＃１０６が不 完全セルロースシンターゼ遺伝子伝子を有し、ここでその欠落部位はその遺伝子 コード化領域における固有ＢａｍＨ１部位から１４２ｂｐ　３　’に位置するこ とを確証せしめた。 サザンハイブリダイゼーションにおいて、コスミド７１９Ｇ９由来の１．８Ｋｂ のＢａｍＨＩ−３ｍａ　Ｉ７ラグメントはオリゴプローブＭＫ１７２　（この配 列は図１におけるヌクレオチド４５６４から４５８２に広がる）と強くハイブリ ダイズした。セルロースシンターゼの分子量が１２０Ｋｄより大きくないなら、 １．８ＫｂのＢａｍＨＩ　−３ｍａ　Ｔフラグメントはこの遺伝子の３′末端を 含まないであろう。この説を確認するため、全長セルロースシンターゼ遺伝子を 有するプラスミドを以下の通り、三種のリゲーションにおいて作製した。 コスミドベクターｐＫＴ２３０　ｃ　ｏ　ｓ　５を第１にＢａｍＨＩで分解し、 そしてその末端を４種の全てのデオキシリボヌクレオチド３リン酸の存在下にお いてフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素により修復せしめた。このＤＮＡを更にＨｉ ｎｄｌＩ［により分解せしめた。セルロースシンターゼ遺伝子の３′末端を含む Ｔｌ９Ｇ９由来の３．５ＫｂのＢａｍＨｌ　−３ｍａ　Ｉフラグメント及びセル ロースシンターゼ遺伝子の５′末端を有するＴ１９Ｇ９＃１０６由来のり、Ｌ！ ｌＬｄ　ＩＩＩ　−Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩフラグメントを、ＴＲＴ１８−１を作製す るためにＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ修復ベクターｐＫＴ２３０　ｃ　ｏ　ｓ　 ５の中にリゲートせしめた。このＴＰＴｌＢ−１についての作製は図３に示す。 會［ セルロース　トーンコンシュガントにおけるインビトロでのセルロースシン　− ゼ“１ ７−ｋ　）／−とＬニゲノミツクＤＮＡの３ＫｔｌＪＩ域（コスミドＴｌ９Ｇ　 ９　＃１０６　）はヱ皇上バｍ株１３０６−２４にＣｅ　ｌ’表現型を復帰でき る（例■）。本例はトランスコンシュガントヱ皇上べ久久二株１３０６−２４に おけるセルロースシンターゼ活性の復帰を詳細する。利用したアッセイは例■に おけるスクリーニングアッセイとして記載したものである。 ヱ」」二立乙工二株１３０６−３（Ｃｅｌ”　）より成るコントロール及び株１ ０３６−２４　（Ｃｅｌ−）のそれぞれはベクターｐＫＴ２３０ｃｏｓ５を有す る。ＣｅＭ株１３０６−２４　Ｔｌ９Ｇ　９　＃１０６（「トランスコンシュガ ント」）はベクターｐＫＴ２３０ｃｏｓ５における二車上１ニゲノミツクＤＮＡ の３にｂのフラグメントを有する。この細胞を５抛ｇ／ＩのＳｍ及び２０−ｇ／ ｌのＣｍを加えた例■における記載に従って生育せしめた、細胞を集め、セルロ ースから分離し、洗浄し、濃縮し、そして前述の通り超音波処理した。インビト ロでのセルロースシンターゼ活性を測定し、そしてピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）　 （ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ＋　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）より開発さ れたＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質測定を超音波処理細胞調製物のタンパ ク質濃度の測定のために用いた。株は２ｍｇ細胞／ｍｌの濃度で測定された。ま た、株１３０６−２４　ｐ　ＫＴ２３０　ｃ　ｏ　ｓ　５及び１３０６−２４Ｔ １９Ｇ　９　＃１０６を有効濃度効果の検定のため、５ｍｇ細胞／１で測定した 。 表１に示す通り、株１３０６−２４　ｐ　ＫＴ２３０　ｃ　ｏ　ｓ　５及びトラ ンスコンシュガント１３０６−２４のセルロースシンターゼ活性は、この測定で の細胞濃度に影響されなかった。１３０６−３　ｐ　Ｋ　Ｔ２３０ｃｏｓ５の活 性は株１３０６−２１の活性（図示せず）と類催していた。それ故、ベクターｐ ＫＴ２３０　ｃ　ｏ　ｓ　５はセルロースシンターゼ活性を及ぼさないものと思 われた。株１３０６−２４はｃ−ｄｉ−ＧＭＰによる活性化に基づく低レベルの セルロースシンターゼ活性を示した。これはほとんどのクラスＩ　（セルロース シンターゼ陰性）アセトバクター突然変異体についての事実であった。セルロー スシンターゼ活性における突然変異はインビトロで幾分漏出ぎみであるが、細胞 はインビボでは非常に少量のセルロースを生成した（フラスコ振騰において）。 この３Ｋｂの挿入物は株１３０６〜２４のセルロースシンターゼ活性を、測定チ ューブにおける５ｍｇ細胞／　ｍ　Ｉにて大まかに１０倍（０，４から４．ｉｎ モル／分ｍｇ）上昇させた。このことはセルロース陽性表現型の出現と関連する 。トランスコンシュガント株１３０６−２４は、セルロース陽性株１３０６−３ と同等のＣ−ｄｉ　−ＧＭＰを刺激活性を有していた。 適当なコントロールを利用した別な実験におけるＴＲＴ１８−１について結果は 、このプラスミドがＣｅ１−表現型からＣｅ　］”への転換を可能にし、そして 第２にインビトロアッセイにおいて、この酵素活性は、表１に示す通り、３Ｋｂ のＴ１９Ｇ　９　＃１０６ヱ土上バＬ叉二ＤＮＡ挿入物を有するｐＫＴ２３０ｃ ｏｓ５ベクターについて観察できた活性と対照的であった。 糞よ Ｃｅ１−からＣｅ　Ｉ”　への株１３０６−２４の転換：インビトロセルロース シンターゼ活性の回収率測定における細胞濃度　セルロースシンターゼ（消費Ｕ ＤＰＧのｎモル） １３０６−３ｐＫＴ２３０並■　２　０　４．１１３０６−２４ｐＫ７２３匹匹 ５２　０．２０．６１３０６−２４＋１ｎｓｅｒｔ’　２　０．２　３．９１３ ０６−２４＋ｐＫＴ２３０皿　５　０．１　０．４１３０６−２４＋１ｎｓｅｒ ｔ’　５　０．１　４１１　３ＫｂのＴ１９Ｇ　９　＃１０６７−４！　）ソ立 とＬ二株ＤＮＡ挿入物を有するｐＫＴ２３０　ｃ　ｏ　ｓ　５ ■ユ セルロースシン　−ゼＢ゛　−のヌクレオチド　１本例において、コスミドＴ１ ９Ｇ　９　＃１０６上にあるセルロースシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列の 決定のため、本発明のクローン化セルロースシンターゼＢ遺伝子の制限地図をサ グクローニング方法を説明するために用いた。 コスミドＴ１９Ｇ　９　＃１０６におけるセルロースシンターゼ遺伝子を有する クローン化挿入ＤＮＡを制限酵素を用いて物理的に地図化した。この地図情報を 次に、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ旦ル虹ユ１０１：２０−７８　（１９８３）に おいてＭｅｓｓｉｎｇの記載する方法に従うシーケシング分析のため、ヱ鬼上へ り叉二ＤＮＡ挿入物をＭ１３ＲＦ　ＤＮＡにサブクローンせしめるために用いた 。制限フラグメントのヌクレオチド配列は、Ｉｎｎ１ｓ他の（１９８８）Ｐｒ匹 ニル態Ｉ　Ａｃａム」ｊエユ針８５：９４３６−９４４０に記載の、工１ｌＤＮ Ａポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐ、　Ｅｓｅｒｙｖｉｌｌｅ、　ＣＡ）を 用いた鎖停止方法により決定した。 ■ ″炊・　アセトバク　−　１３０６−２４にお番るセルロースシン　−ゼ゛　− −びセルロースシン　−ゼ２　の′セルロースシンターゼがプラスミドＴ　Ｐ　 Ｔ１８−１から表現されているかを調べるため、三つの異なるフレームシフト突 然変異をセルロースシンターゼ遺伝子コード化領域に導入せしめた。この突然変 異遺伝子をプラスミドＴＲＴ１Ｂ−１に導入せしめ、次いでそれぞれヱ鬼上バ玄 り二株１３０６−２４に移し入れた。 三種の突然変異体をセルロースシンターゼのコード化領域の中に、以下の通りに 導入せしめた：Ｂｇｌｌｌリンカー配列をヌクレオチド位２３１１３でのＥｃｏ ＲＶ部位及びヌクレオチド位置３９５４でのＳｔｕ１部位に導入せしめた。この ＥｃｏＲ■挿入はフレームシフト突然変異と同様に停止コドンＴＧＡを作り出す 。４５６４の位置のＳｔｕ　１部位に導入した８ｇｌｎリンカ−はフレームシフ ト突然変異を作り出す。第三の突然変異をヌクレオチド位置１８９９のＢａｍＨ １部位に導入し、そしてこれはフレノウによるＢａｍＨＩ部位の埋め合わせによ り作られる。 これらのプラスミドのＤＮＡは制限分解により分析され、ＤＮＡシーケシングに より評価される。各突然変異遺伝子をクラスＩ突然変異株１３０６−２４とコン ジュゲートせしめた。プレートからの単一コロニーを直立試験管に移し、そして これらのコンジュゲーシヨンの結果を表２に示す。薄膜を形成する能力は、コン シュゲージロン混合物、又は選別プレートからのコロニーにより直接感染された チューブにおいて表記した。全ての突然変異遺伝子は１３０６−２４において存 在するＣｅ１−突然変異の転換を可能とし、こ９ことは突然変異の転換はプラス ミドと染色体の間の組換を介して起こることを推論させる。 この結果より、染色体及びプラスミドシンターゼ遺伝子が遺伝子の機能的なコピ ーを形成するために組織したことが考えられる。おそらく、転写及び翻訳シグナ ルが染色体コピーにより提供されたのであろう、定性的に述べると、全てのチュ ーブにおいて形成された薄膜のサイズは同程度であり、全てのトランスコンシュ ガントにおける表現型のレベルが同等であると考えられる。 中で、氷の上に２−２０時間置き、その後その沈澱物を２０，０００ｘｇで４５ 分間、０−４℃で沈降下せしめた。 この上清液を除去し、そして等容量の蒸留水を加えた。等容量の、２度蒸留した 、トリス平衡化フェノール（ｐＨ８，０）を加え、そしてこのチューブを２０℃ で、５０００Ｘ　ｇでの１５分間の遠心の前に、３−４分間にゆっくりとひっく り返し続けた。 水相をパスツールピペットを用いて慎重に取り出し、この容量の２〜３倍の容量 のポリプロピレンチューブに移し入れた。 次に、３ＭのＮａ０Ａｃｌ／１０容量及び無水ＥｔＯＨ２−３倍容量を加え、よ く撹拌し、このチューブを一２０°Ｃで一夜放置した。上清を遠心（２０，００ ０Ｘ　ｇ、３０分間、０℃）で集め、そしてベレットを５　１０ｍ１の冷７０％ ＥｔＯＨで洗浄し、その後ペレットを回収するために２０，０ＯＯＸ　ｇで１０ 分間再遠心せしめた。このベレットを５０−１００　μｌのＴ　Ｅ　（１００ｅ ｅＭのトリス、１ｓＭのＥＤＴＡ）に溶解した。プラスミドＤＮＡをエチジウム ブロマイド−ＣｓＣ１密度遠心により精製した。 このプラスミドを物理的に地図化するため、ＣｓＣ１１ｉ製ＤＮＡを以下の制限 酵素：ＨｉｎｄＩ［Ｉ、ＥｃｏＲＩ。 ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、５ａｃｌ、ＰｖｒＩＩにより分解せしめた。試験した酵 素の中で、５ａｃＩのみこのプラスミドを直鎖化できた。 ５ａｃＩ分解プラスミドをＥ、コリにおけるクローニングのために５ａｃＩ分解 プラスミドｐ　Ｕ　Ｃ１Ｂ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉ。 Ｊａｂｓ）にリゲートせしめた。このシャトルベクターをｐＵＣ１８−８２４と 表示する。ｐ　Ｕ　Ｃ１，８−８２４の物理的地図化のため、このプラスミドを 種々の制限エンドヌクレアーゼにより分解せしめた。ｐ　Ｕ　Ｃ１８−８２４の 制限地図を図４に示す。 ｌ上 エレクトロトーンスフォーメーション シャトルベクターｐ　Ｕ　Ｃ１Ｂ−８２４を二皇上バＬ久二株に移すことができ ることを示すため、ｐ　Ｕ　Ｃ１Ｂ−８２４プラスミドＤＮＡを、Ｃｌｅｗｅｉ １．　ｅｔ　ａｌ、、　（１９７２）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１１０： ６６７に従て、ｐ　Ｕ　Ｃ１Ｂ−８２４を有す旦一旦ユ宿主株ＤＣ９Ｂから調製 した。ヱ−４＝）／＜？　−株１３０６−２１及び１３０６−２４をＤｏｓｖｅ ｒ、　ｅｔ　ａｌ−＋（１９８８）　（前述）に記載に従って洗浄せしめた。細 菌培養物の形質転換のためにデザインされたエレクトロポレーション装置を、− ア」Ｌ上ヱ立久」−：エレクトロボレーションのために用いた。本例において用 いられた装置は哺乳類用設計エレクトロポレーション装置の改良品であるが、商 業的な装置、例えばバイオランドシーンパルサー装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｇｅｎ ｅ−Ｐｕｌｓｅｒ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ）　（１２０Ｖ、　５０／６０Ｈｚ）を 、同等の形質転換率を得るために代用できる。エレクトロポレーションのパラメ ータはプラスミドｐ　Ｋ　Ｔ２３０　、ｃ　ｏ　ｓ　５　Ｔ１９Ｇ　９　＃１０ ６を以下に従って最適化する二株１３０６−２１及び１３０６−２４のために９ ．０キロボルト（ＫＶ）及び９．５ＫＶの電場がそれぞれ必要である。２５マイ クロフアラデー／７５０オーム（＝１８．７５　ｍ秒）のパルス持続時間（ＲＣ 値）が最適であることが分った。　３０″Ｃで更に５日間のインキュベーション に基づき、１マイクログラムのＤＮＡ当り１０４個より多い形質転換体が、１０ ０マイクログラム／ｍｌのアンピシリンを含むＲ２０−２プレート上で得られた 。 ｐ　Ｕ　Ｃ１８−８２４プラスミドＤＮＡが４つの１よ」二進とＬ二候補から単 離され、そしてＥ　コリ及びヱ皇上ｆｆｌ二に形質転換せしめた。シャトルベク ターは、アセトバクター中での、増殖後安定であり、なぜなら、制限分析は（４ つの総クローン）全てのポリリンカ一部位の存在及び見わけられる欠損の非存在 性を示したからである。 １−エ セルロースシン　−ゼＢ゛　−１・　Ｕ　Ｃ１８−８２４の　１セルロースシン ターゼＢ遺伝子はプラスミドＴＰＴ１８−１から単離でき、その作製は例■に教 示され、又は他方、この遺伝子のヌクレオチド配列が本明細書にて提供されてい るため、この全長遺伝子は化学的手段により直接合成するか、もしくはプライマ ーを用い、作製された遺伝子バンクから得ることができる０例えば、ブライマー オリゴヌクレオチドＭＫ１７０（ＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＣＡ ）が作製した遺伝子バンクから１７６０個の固有培養物をつり出すために用いら れ、そして６つのクローンを更なる特徴付けのために単離せしめた。これら３つ のクローンから単離した３つのコスミドを、Ｔ５Ａ１゜ＴｌＣ２及びＴ５Ｄ２と 命名する。 前記の単離コスミドの制限及びサザン分析は、それら全てが８Ｋｂより大きいセ ルロースシンターゼＢ遺伝子のＤＮＡ配列５′及びセルロースシンターゼＢタン パク質生成物についての全体をコード化する配列を有することを示した。プロー ブとしてのプライマーＭＫ１７０によるコスミドＤＮＡのサザン分析により、Ｔ ５Ａ１由来の７．２ＫｂのＢａｍＨＩフラグメントはセルロースシンターゼＢ遺 伝子のほとんどの配列、及びこの遺伝子の５′のすぐ隣りに更なる配列を有すこ とが示された。それ故、７．２ＫｂのＢａｍＨＩフラグメントをヌクレオチド配 列分析のため、プラスミドｐＵｃ１８及びｐＢＲ３２２にサブクローン化せしめ た。７．２ＫｂのＢａｍＨＩフラグメントの制限地図を図５において示す。この 図に示す約８．３ＫｂのＳｍａ　Ｉフラグメントはインタクトの全長セルロース シンターゼＢ遺伝子を含む。この遺伝子は、下記のクローニングベクターｐ　Ｕ 　Ｃ１Ｂ−８２４による作製において用いるため、プラスミドＴ５Ａ１から単離 せしめた。更にサザン分析が示すには、染色体におけるセルロースシンターゼＢ 遺伝子座の構造はコスミドＴ５Ａ１のそれと同一であることである；それ故、こ のコスミドにおける二車上バＵ二配列は更に再配列されていない。 セルロースシンターゼＢ遺伝子及び約３Ｋｂの上流配列（図５における制限地図 参照のこと）を有する、８．３ＫｂのＳｍａ−ン化せしめた。反対方向の８．３ ＫｂのＳｍａ　Ｉ制限フラグメントを有する得られたプラスミドを、それぞれｐ 　Ｕ　Ｃ１Ｂ−８２４ＦＳ−１とｐ　Ｕ　Ｃ１Ｂ−８２４Ｆ　Ｓ−６と命名した 。ＦＳ−６の制限地図を図６に示した。このようなプラスミドを１３０６−２４ 　（セルロースシンターゼ欠損株）　、１３０６−４２及びＣ９０−１（両方と もジグアニレートサイクラーゼ及びセルロースシンターゼ活性を欠損する）に形 質転換せしめる際、この形質転換体はプレート上にＣｅｌ”コロニー表現型を示 した。それ故、初期の実験において観察できた「組換現象」とは反対に、８．３ Ｋｂのヱ皇」ヱ８し４二ＤＮＡ挿入物によりコード化されたタンパク質は突然変 異体が有するセルロースシンターゼ突然変異を直接相補できるものと結論づけら れる。 インビトロアッセイはプラスミドｐ　Ｕ　Ｃ１８−８２４Ｆ　Ｓ　−１及びｐ　 Ｕ　Ｃ１８−８２４Ｆ　Ｓ−６のセルロースシンターゼ陰性突然変異株１３０６ −２４へのセルロースシンターゼ活性の復帰の能力を確証せしめた。形質転換体 及びコントロール株のインビトロセルロースシンターゼアッセイは例■における 記載に従って行った。表３に示す通り、この形質転換体、１３０６−２４　ｐ　 Ｕ　Ｃ１Ｂ−８２５ＦＳ−１及び１３０６−２４　ｐ　Ｕ　Ｃ１８−８２４Ｆ　 Ｓ−６は、もとのＣｅ　］”親株、１３０６−３のセルロースシンターゼ比活性 よりも高い比活性を示した（それぞれ１．３倍及び１．８倍）。 紅 Ｃｅ１−からＣｅｌ”への株１３０６−２４の転換：インビトロセルロースシン ターゼ活性の回収率セルロースシンターゼ活性 一床一　−れたｎモル［］ＤＰＧ　−ｍ　ンパクｃ−ｄｉ−ＧＭＰ無　＋ｃ−ｄ ｉ−ＧＭＰ１３０６−３　０．０４　２．０５ １３０６−２４　０．０６　０．０７ １３０６−２４　ｐＵｃ１８−８２４　０．０６　０．１０１３０６−２４　ｐ Ｕｃ１８−８２４　ＦＳ−１０，１０２，５９１３０６−２４ｐＵｃ１８−８２ ４　ＦＳ−６０，１０３，７１五ｘｍ プラスミドｐ　Ｕ　ＣＣ１９（Ｎｅ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を制限 酵素５ａｃＩにより分解せしめた。この直鎖プラスミドを５ａｃＩ−制限された アセトバクタープラスミド８２４とリゲートせしめた。得られたプラスミドをｐ 　Ｕ　Ｃ１９−８２４と命名した。 ８．３ＫｂのＳｍａ　Ｉフラグメント由来のセルロースシンターゼ遺伝子をＨｉ ｎｄｌ［Ｉ−３ｍａＩフラグメント（即ち、４．９Ｋｂ）として、ｐＵｃ１９プ ラスミドのリンカ−領域におけるＨｉｎｄｎＩ−Ｓｍａ　１部位にクローン化し く図８を参照のこと）、従ってその転写方向はｌａｃプロモーターと同一である 。 Ｉａｃプロモーターは構成プロモーターのため、ｌａｃ遺伝子生成物の不存在に おけるセルロースシンターゼの表現はヱ皇上バ久叉二において調節不能となるで あろう。このプラスミドをｐＡＬｌと表示する。 ｐＡＬｌをヱ皇上バＬ叉二株１３０６−２４の形質転換のために用い、そしてそ れはプレート上にてＣｅｌ”表現型としてもたらされるセルロースシンターゼ欠 落表現型を相補することアセトバクター染色体からの図５に示す７．２ＫｂのＢ ａｍＨ１制限フラグメントは、セルロースシンターゼＢ遺伝子の上流に更なる４ 、６Ｋｂのヌクレオチド配列を有するものとして同定された。この領域が、セル ロースの生合成において含まれる遺伝子を含むかを調べるため、セルロースシン ターゼＢ遺伝子の上流のヌクレオチド配列を以下の通り検定した。 ７．２ＫｂのＢａｍＨＩフラグメントをｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１部位中で部位 −ン化せしめた。ｐＢＲ３２２組換プラスミド由来の７．２ＫｂのＢａｍＨＴフ ラグメントの、２．３ＫｂのＳａ！■フラグメント、０．９Ｋｂの基１上■フラ グメント及び３．２ＫｂのＢ　ａ　ｍ　ＨＩ　−旦ｌ±ＩＩフラグメントを、ブ ルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　Ｋ　Ｓ ベクターの５ａｃＩＩ又はＢａｍＨ１部位のそれぞれにサブクローン化せしめた 。これら３つのサブクローン及びｐＢＲ３２２組換プラスミドであってＢａｍＨ Ｉフラグメント全体を有するものを次にＣｓＣ］密度勾配により精製し、そして ヌクレオチド配列分析のためのジデオキシチェーンターミネーション方法におけ る鋳型として用いた。このジデオキシチェーンターミネーション方法は、前述の 通り、ただし伸長反応においてフレノウフラグメントの代りにシークエナーゼ（ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）を用いた。 セルロースシンターゼオペロンのヌクレオチド配列は、図１に示す。ヌクレオチ ド２５９４のＡＴＧコドンがセルロースシンターゼＢ遺伝子の開始コドンと考え ると、セルロースシンターゼＢ遺伝子のコード化領域ヌクレオチド配列はヌクレ オチド２５９４から４９９９迄広がる。成熟タンパク質はヌクレオチド２６６６ のアラニンコドンから開始するため（例ＸｒＶ参照のこと）、このセルロースシ ンターゼは２４のアミノ酸の誘導配列を有するものと理解される。この誘導ペプ チドの推定アミノ酸配列は、種々の細菌由来の分泌物及び膜タンパク質が有する 誘導タンパク質と機能的に類似する。それ故、セルロースシンターゼＢ遺伝子に よりコード化されるセルロースシンターゼタ１、ＲＮＡの単離：ヱ±上バＬ叉二 １３０６−２１を、２０℃ｇ／ｍ１のＣｍ及び０．１％（Ｖ／Ｖ）のセルラーゼ （Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を含むＲ７０−２培地において、３０℃で振騰させながら 対数増殖の後期迄（０，０，６００ｎｍ＝０．７）増殖せしめた。次にこれらの 細胞を６．００Ｏｒｐｍで１０分間、４℃での遠心により集め、そして１ｍＭの ＥＤＴＡ及び１％のＳＤＳを含むＮａ０ＡＣ，ｐＨ６，０の緩衝液２５ｓ＋１に 再懸濁せしめた。等容量のフェノール／クロロホルム溶液をこの細胞懸濁物に加 え、そしてこの混合物を１５秒間超音波処理せしめた。１０分間の６０℃でのイ ンキュベーション後、この混合物を遠心せしめ、そして次に水性相をフェノール ／クロロホルムにより更に２回抽出せしめた。抽出後、このＲＮＡをイソプロパ ツール及びＮａ０Ａｃにより一７０℃で一夜沈殿せしめた。このＲＮＡを遠心に より集め、１００％のエタノールで洗浄し、そして乾燥せしめ、ＤＥＰＣ処理蒸 留水１２０μｌに再懸濁せしめた。このＲＮＡ溶液におけるＤＮＡを分解せしめ るため、Ｄ　Ｎ　ａ　ｓ　ｅ　Ｉ　（Ｓｉｇｍａ）を１０ｇｇ／ｍｌとなる迄加 え、そしてこの混合物を室温で２０分間インキュベートせしめた。この分解処理 混合物を等容量のフェノール／クロロホルムにより２回抽出せしめた。次に水性 相のＮａ０Ａｃ濃度を０．３　Ｍに調整し、そしてＲＮＡを等容量のイソブロパ ノ−ルにより沈殿せしめた。この精製ＲＮＡを８０％のエタノールにより洗浄し 、乾燥し、そしてＤＥＰＣ処理蒸留水４０μｌに再懸濁せしめた。 ２、プライマー伸長：オリゴデオキシリボヌクレオチドＧＥ１３（５’　−ＴＧ ＣＧＧＣＧＡＴＡＡＧＴＧＣＡＣＡ−３’　）をガンマ−”Ｐ　ＡＴＰ及びＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼにより標識せしめた。一体化されなかったヌクレオチ ドをエタノール沈殿により除去せしめた。この標識オリゴデオキシリボヌクレオ チドを０．３ＭのＮａ０Ａｃ溶液１００μｍに再懸濁せしめた。このプライマー の比活性は約４　Ｘ　１０’ｃｐｍ／　２モルであった。標識プライマー（０， ０２及び０．２ｐモル）は、プライマー伸長分析のために用いた。 この標識プライマーを５０μｇＲＮＡと混合した。この混合核酸をエタノールで 沈殿せしめ、その後５０ｍＭのＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　。 ｐＨ７，５，ｌ＋＋＋ＭのＥＤＴＡ及び３００ｍＭのＮａＣ１を含む、ハイブリ ダイゼーション緩衝液３０μ】に再懸濁せしめた。 ハイブリダイゼーション反応は３０°Ｃで１０分間行った。ハイブリダイゼーシ ョン後、この混合物をＡＭＶ逆転写酵素により処理した。この反応を４２°Ｃで ９０分間行い、次いで０．５ＭのＥＤＴＡｌ　ｕ　１及びＲＮａ　ｓ　ｅ　１　 ｕ　ｌ　（１＋ｇ／ｍｌ）を加えることにより停止せしめた。３７°Ｃでの３０ 分間のインキュベーション後、この混合物をフェノール／クロロホルムにより抽 出せしめた。ｃＤＮＡを沈殿せしめ、乾燥し、そしてＩＩＩＩＭのＥＤＴＡを含 むｌ０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０３，ｃｚｌに再懸濁せしめた。ホルム アミド４μｍをこのｃＤＮＡ懸濁物に加え、そしてこの混合物を３分間煮沸せし め、ＤＮＡシーケシングゲル上に載せた。 このプライマー伸長分析は、転写開始部位が、セルロースシンターゼオペロンに おける第１の遺伝子の５′領域に位置することを示した。このオペロンの転写開 始部位を、図１におけるヌクレオチド２３５の上に位置する下向矢印で示した。 Ｃ，−ＣびＤのクローニング ｐＡＢＣＤの構造を図８に概略した。このプラスミドの構造において、ＰＦ５− ６の１．８ＸｂのＢａｍＨ１フラグメントはＴ　ＲＴｌ１−４由来の５．５Ｋｂ のＢａｍＨＩフラグメントに置き代っている。ＰＦ５−６の１．８ＫｂのＢａｍ ＨＩフラグメントはセルロースシンターゼＢ遺伝子の３′側の４２６のｂｐ及び Ｃ遺伝子約１．４Ｋｂを有していた。この置換５．５ＫｂのフラグメントはＣ遺 伝子全体及び更なる３′配列を含んでいた。ＴＲＴ１１−４に載っているこの５ ．５Ｋｂフラグメントは本来７１９Ｇ９から単離されるものであり、そしてＴＲ Ｔｌｌ−４を作製するために５．５ｔＫｂのＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＵ ｃ１８のＢａｍＨＩ部位にクローン化せしめた。 １５マイクログラムのＴＲＴｌｌ−４ＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＢａｍ ＨＩにより、３７°Ｃで１時間完全に分解せしめた。この分解ＤＮＡを０．８％ のＧＴＧアガロースゲル上に流した。この５．５ＫｂのＢａｍＨＩフラグメント をゲルから切り出し、電気溶離せしめてエタノールにより沈殿させ、そして少量 のＲ２０に再懸濁せしめた。 ℃で】時間完全に分解せしめ、セルロースシンターゼオペロンの５′領域を含む １．８　ＫｂのＤＮＡを１２．６Ｋｂのベクターフラグメントから遊離せしめた 。この分解物を０．８％のアガロースゲル上に流し、そしてｐ　Ｕ　Ｃ１８：８ ２４ベクタ一配列、セルロースシンターゼプロモーター、Ａ遺伝子、及びＢ遺伝 子の５′領域を含む１２．６Ｋｂのフラグメントをゲルから切り出し、そして電 気溶離せしめた。この精製ＤＮＡをウシアルカリホスファターゼにより処理し、 その後ＴＲＴｌｌ−４から単離した５、５ＫｂのＢａｍＨＴフラグメントとリゲ ートせしめた。 リゲーションは、５．５Ｋｂの挿入物の１２．６ＸｂのベクターＤＮＡに対する モル比を１０＝１で、標準条件のもとで行った。このリゲーション混合物を旦− ユｆｉ　ＤＧＩＯＩコンピテント細胞を形質転換させるために用いた。この形質 転換混合物を、５０μｇ／ｍＪのアンピシリンを有するＲ２−４プレート上に平 板培養し、そして３７°Ｃで一夜インキュベートせしめた。３６個のアンピシリ ン耐性形質転換体がこれらのプレートから採取され、そしてそれらを５０μｇ／ ｍｌのアンピシリンを含むＲ２培地にて、３７°Ｃで振謄させながら約６時間培 養せしめた。アルカリ溶解ミニスクリーンＤＮＡをこれらの３６の形質転換体か ら単離せしめた。このＤＮＡをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＳｍａ　Ｉに よる制限分解により分析した。この単離物のうちの６個はこの５．５Ｋｂのフラ グメントの挿入を示したが、その６個のうちの２個のみがＢ遺伝子オープンリー ディングフレームを復帰せしめる正しい配向におけるこの５．５Ｋｂフラグメン トを示した。これらの単離物をｐＡＢｃＤ＃１及び＃３２と称し、図８において プラスミド地図に関連する制限パターンを示した。 プラスミドを含む培養物を精製プラスミドＤＮＡを調製及び単離するために用い た。１０μｇのｐＡＢｃＤ＃ｌＤＮＡを、標準のエレクトロポレーション条件の もとで、１３０６−３細胞４０μｌを形質転換させるために用いた。１ａｌｌの Ｒ２０−２培地をこの形質転換混合物に加え、そしてこの細胞を１００ｕ１００ ｕ＋のアンピシリンを含むＲ２０−２プレー上に平板培養した。３０°Ｃでの７ 日間のインキュベーション後、５４７個のアンピシリン耐性コロニーがプレート 上に見られた。３７６個のコロニー（約６９％）は非常に先のとがったＣｅｌ” コロニー表現型を示し、１７１個のコロニー（約３１％）は平らな、ややいぼ状 ではあるがＣｅ　ｌ”表現型であるものを示した。各タイプのコロニー４個を、 アンピシリンを１００μｇ／−１で有するＲ　２０−２上に、３０゛Ｃで４日間 画線培養せしめた。４日後、８プレート全ての上のコロニータイプは区別できな かった。わずかにとがったコロニーの画線培養物からの１つのコロニーを、０． ５％のＴＹＥ、３％のグルコース、　２５ｍＭのＤＭＧ、０．１％のセルロース 及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを有するＲ　７０−２　２５＋Ｉｌｌに移し 、３０℃で２４時間、振謄しながらインキュベートした。２４時間後、グリセロ ールをこの培養物に全容量の１５％になる迄加え、そして１．５ｍｌのアリコー トを一７０°Ｃの保存のために凍結した。この保存品を１３０６−３　ｐ　Ａ　 Ｂ　ＣＤと称する。 Ｄ、セルロースシン　−ゼオベロンの配置　び　゛告セルロースシンターゼオペ ロンのシーケンス化のために、チェーンターミネーション方法を用いた。オペロ ンを有する二本鎖ＤＮＡをＤＮＡ鋳型として用いた。ｐＡＢＣＤ由来の領域のヌ クレオチド配列を図に示す、セルロースシンターゼオペロンは長さにおいて９２ １７ｂｐであり、４つの遺伝子より構成される。遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、そ れぞれの長さが２．２６２ｂｐ、　２．４０６ｂｐ、　３．９５７ｂｐ及び４６ ８ｂｐである。遺伝子生成物により決定される分子量及びその推定機能は以下の 通りである。 」」４五 注」Ｖ肚　−アヨ慮−乙ｊ峡３曳１Ｅ　分ｊ−！　半うＡ、　７５４　８４にｂ 　生体外セルロース合成；生体内活性におけるングア ニレートサイクラーゼ及び セルロースシンターゼ ８　８０２　８５Ｋｂ　生体外セルロース合成：生体内活性におけるセル口 −スシンターゼ Ｃ１３１９１４１Ｋｂ　生体外におけるセルロース合成 り　１５６　１７Ｋｂ　生体外におけるセルロース合成 り遺伝子の３′未満のＤＮＡ配列のコンピュータ分析は、安定なステム及びルー プ構造を形成する能力を有する領域を示した。図１における下線領域に示す通り 、この領域はＤ遺伝子のターミネーションコドンの２６ｂｐ３’側に位置し、そ してオペロンの転写終結領域に相当する。 ■Ｘｙ におしる　、セルロース　びセルロース２之ヱニ亙這立 Ａ　１３０６−２１　ＵＣｌ３−８２４　ＡＢＣＤによる　穴この研究において 、１３０６−２１　ｐ　Ａ　Ｂ　ＣＤにおけるセルロースシンターゼ活性の過剰 表現を振騰フラスコ実験において試験した。１３０６−２１　ｐ　Ａ　Ｂ　ＣＤ の構造は１３０６−３　ｐ　Ａ　Ｂ　ＣＤの構造と類似していた（例ＸＩＶを参 照のこと）。この実験の全ての段階のための培養培地は、１０μＭのｌ”ｅｃｌ ｘ、１％のＴＹＥ、２５ｍＭのＤＭＧ及び４％のグルコース（１３０６−２１） 又は４％のフルクトース（１３０６−３）を有するＲ　７０−２であった。シー ド培地は０．１％のセルラーゼを含んだ。培養物を含むプラスミドを増殖するた め、アンピシリンを５０μｇ／■ｌ迄培地に加えた。培地を１２５ｍ１のパンフ ルフラスコの中に、フラスコ当り２５ｍ１づつ分配した。株１３０６−２１．１ ３０６−２１　ｐ　Ｕ　Ｃ１Ｂ−８２４（宿主細胞にシャトルベクターを加えた もの）　、１３０６−２１ｐＵｃ１８−８２４　ｐＡＢＣＤ　（正常−一親株と 同様の表現型）、及び１３０６−２１　ｐＵｃ１８−８２４　ｐＡＢＣＤ　（尖 頂状−一プレート上でその増殖は増大し、そして親株よりもより尖っている）を それぞれ試験した。各培養物を、滅菌生理食塩水を用いて０．７２　ｇ　／　Ｌ に調整した（濁度１．８０Ｄ、Ｉ。）。試験フラスコを０．２ｍｌのシード培養 物で感染せしめた（感染、２％（Ｖ／Ｖ））。 各棟につき６つのフラスコを感染せしめ、そして３０℃、１２５ｒｐｍ、２イン チ振騰範囲でインキュベートした。フラスコを１．２及び５日後に回収した。細 胞質量及びセルロース測定のため、 二重測定フラスコを各時点で回収した。更に、５日目のフラスコからの培養物を 、プレート上における抗生物質耐性の観察（バッチテスト）によりプラスミド保 持力について検査した。各棟につき、３０のコロニーを試験した。 セルロース生成及び細胞濃度を測定するため、各サンプルのフラスコ内容物を１ ００ｍ１のビーカーに移し入れた。次いでこの懸濁物、大チクマー（Ｔｅｋｍａ ｒ）プローブにより、その最大出力の５０％で１分間解離せしめた。その後、こ の懸濁物を５、　ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠心せしめた。上清液を捨て、そして このペレットを１５１の生理食塩水溶液に再懸濁せしめ、そして時折撹拌しなが ら１５分間インキキュートした。このサンプルを再度遠心し、そして上記の洗浄 工程を繰り返した。 第２の洗浄工程からのペレットを０．　Ｉ　ＮのＮ　ａ　ＯＨ１５ｎ＋１に再懸 濁せしめ、そしてゆっくりとした撹拌を伴って６０分間、６０°Ｃでインキュベ ートした。この懸濁物を遠心し、このＮａＯＨ上清液を細胞濃度の分析のために 用い、そしてこのペレットをセルロース濃度分析のために用いた。 ペレットは１５＋＋］の脱イオン水に再懸濁せしめ、そして時折撹拌しながら室 温で１５分間放置した。次いでこのサンプルを遠心し、そして上記の洗浄工程を 総計３回繰り返した。最終の遠心工程の後、このセルロース沈殿物をバキューム オーブン内で６０℃、−夜乾燥させ、その後秤量した。 上清はＭＣＩにより中和しく０．５ｍｌのサンプルに約０．０５ｍ１のＨＣＩ） 、そしてタンパク質濃度をローリ−（ｌｏｗｒい方法により測定した。 細胞濃度＝タンパク質濃度Ｘ１．５４ 細胞増殖及びセルロース生産は表４に要約した。 表土 １日　１．７８　±０．００６　０．５１　±０．０３　３．５２２日　４．５ ８　±０．３２　１．１６　±０．０２　３．９５５日　６．９９　±０．１６ 　２．９２　±０．１５　２．４０１３０６−２１　ＵＣｌＢ−８２４ １日　０．９１　±０．０１　０．１４　±０．０６　６．５４２日　３．５９ 　±０．２１　０．９２　±０．０８　３．９１５日　６．８９　±０．０１　 ３．０７　±０．０６　２．２４１３０６−２１　ＡＢＣＤ（２１１ １日　１．１６　±０．１２　０．１４　±０．０４　８．４２２日　４．７８ 　±０．０５　０．７２　±０．０４　６．６５５日　７．５９　±０．０７　 ２．５９　±０．０４　２．９３１３０６−２１　八ＢＣＤ（声 １日　１．０６　±０．０６　０．１４　±０．０１　７．４１２日　４．４０ 　±０．２８　０．７６　±０．０５　５．８２５日　７．２８　±０．１０　 ２．８１　±０．０１　２．５９１日　１．８７　±、１７　１３８　±、１１ 　１．３６±６０１２日　２．６７　±、２１　２．１１　±−１１１，２７± 、０４５日　３．０２　±、８１　２．８２　±、１９　０．９６±９０９１３ ０６−３　０Ｃ１８−８２４ １日　１．５６　±、０１　１．２６　±、１１　１．２４±、１０２日　２． ３９　±、０４　２．２５　±、４２　１．０８±、１８５日　３８８８　±、 ０１　３．７０　±、１７　１．０５±、０５邦甜江り躬ｌ引 １日　２．９２　±、１１　１．２０　±、０４　２．４４±、１８２日　３． ９０　±、０１　２．４５　±、０３　１．５９±、０１５日　３．６６　±、 １３　２．９７　±、０７　１．２４±、０８セルロースの細胞に対する比はセ ルロース比生産効率についての表示である。増殖の最初の２日間におけるｐＡＢ ＣＤ１３０６−２１株においてのセルロースの細胞に対する比は、コントロール １３０６−２１株のそれよりも明らかに高かった。このｐＡＢＣＤ　（尖頂株） はｐＡＢＣＢ　（正常）株よりもより多くのセルロースを生成するようであった 。両組換株は、コントロール株よりもより多くのセルロースをその増殖末期に生 成した。 アンピシリンマーカーを有する株において、５日間の培養物のプラスミド安定度 は１００％を示した。このマーカーの復帰率は、プラスミドにおけるセルロース シンターゼ遺伝子に起こりうる再配列の程度を示すものではない。５日目の株は 、１及び２日目と同じ速度でセルロースを生成していない可能性がある。この説 を支持する確証は５日目のものの平板培養１　からのコロニー表現型において見 られる。ＰＡＢＣＤの尖頂１　株は異常なコロニーをこれらのプレート上に示さ なかった。 ３　、　１３０６−３ｐＵＣ１８−８２４ＡＢＣＤによるセルロース生産は、１ ３０６−３及び１３０６−３　ｐ　Ｕ　Ｃ１９−８２４コントロ一ル株よりも高 かった。 〕　このことは、セルロースシンターゼのインビトロ活性におけ３　る増大に関 連する（下記参照）。この２つの株の細胞増殖は５　類似していた。結果的に１ ３０６−３　ｐ　Ｕ　０１８−８２４　ｐ　Ａ　Ｂ　ＣＤによるセルロースの細 胞に対する比は１３０６−３単独のそれよりも明（らかに高かった。 （セルロースシン　−ゼ゛′ １３０６−３　２．３　０．７　０．３１３０６−３ρυＣ１８−８２４１，２ ０，６０，３１３０６−３ｐＵｃｌＢ−８２４ＰＡＢＣＤ　３．５　２．３　０ ．３この組換株１３０６−２１　ｐ　Ａ　Ｂ　ＣＤは、細胞増殖及びセルロース 生産についてチェマツプ（Ｃｈｅ＋＊ａｐ）発酵器においても試験した。フラス コにおける観察と比べ、この株の状態は親株のものと類似していた。組換株の不 安定性は高められたセルロース生産性がないことに富国すると考えられている。 染色体セルロースシンターゼオペロン遺伝子の過剰表現は、組換株の不安定性を 低下させるであろう。 Ｂ、ＵＣｌ３−８２４　ＦＳ６　ＡＢの７ｐＵｃ１８−８２４　ＦＳ６　（セル ロースシンターゼプロモーター並びに遺伝子Ａ及びＢを有す）を有する１３０６ 　３　（Ｃｅｌ”　）の１５個の単離体をセルロースシンターゼ活性の過剰表現 ついてのスクリーンのために用いた。この細胞を集め、洗浄し、懸濁し、そして 破壊し、そして標準のインビトロセルロースシンターゼアッセイを例■における 記載の通りに実施した。 １５個の単離体全では、インビトロセルロースシンターゼ活性を、コントロール 株（１３０６−３ｐＵＣ１８：８２４）のそれよりも明らかに過剰に表わした。 その活性は、コントロール株よりも１．５〜２．４倍高い範囲にあった。１５株 のうちの２株（＃　３０２及び＃　３０３）のスクリーンは指数期及び定常期に て試験した。 条件は例ｘｖにおける記載と［Ｊするが、ただしグルコースをフルクトースに代 えた。表５において示す通り、２日目にコントロール株１３０６−３及び１３０ ６−３　ｐ　Ｕ　Ｃ１８−８２４の活性は、時間経過にわたる活性の低下を伴い 、１日目の３０％及び４０％を保持した。２日目の単離体＃３０２及び＃３０３ は１日目の活性の４５％及び５０％迄低下し、これも時間の経過にわたる活性の 低下を伴った。しかしながら、この後者の株は両方とも１３０６−３の１日目の 活性よりも約２倍高く、そして２日目では約３倍の活性を示した。 紅 セルロースシン　−ゼ′ １３０６−３　５．５　１．７　０．５１３０６−３　ｐＵｃｌＢ−８２４５， ９２，４０，３１３０６−３ｐＬｌｃ１８−８２４　ＦＳ６３０２　１２．５　 ５．６　０．９１３０６−３　ｐＵｃｌＢ−８２４ＦＳ６３０３　１１．０　５ ．４　１．３これらの組換株におけるセルロース生成は親株について見られたも のと類似していた。 セルロースシンターゼ活性は、崩壊されたセルロースシンターゼＢ遺伝子を有す る株においても抑制されていることが観察された。この遺伝子は、セルロースシ ンターゼＢ遺伝子の内在するＢａｍＨ１部位での、ストレプトマイシン耐性遺伝 子をコード化する１、　Ｉ　ＫｂのＢａｍＨＩフラグメントの挿入を介して崩壊 される。ストレプトマイシン耐性遺伝子の挿入は、セルロースシンターゼＢ遺伝 子をその５′末端付近で妨害せしめる。 五ｘ豆 仇　プロモーターの六 ヱ皇上バｌ叉二は非常に効率的な組換系であるが、自律ＤＮＡの大きなセグメン トを有する任意のプラスミドによる不安定性の問題を引き起こしうるちのを有す ることが示された。 この潜在的な問題を解決するため、このオペロンは異種のコントロール要素を利 用することにより、染色体セルロースシンターゼオペロンの転写を行うために染 色体レベルで過剰表現されうる。異種プロモーターを含むプラスミドｐＴａｃ２ ５−１．　ｐ　Ｌ　ａ　ｃ２１−７の作成及びそれらの作製のために用いる中間 ベクターを以下に記載し、そして図９において図解した。 Ａ、ＭＰＩＩ：　Ｐｃ　ｓ　：　ＬＦＯＩの１５マイクログラムのｐＦｓ−ＩＤ ＮＡをＨｉｎｄｌ［［により分解し、セルロースシンターゼオペロンプロモータ ーを有する２、５Ｋｂのフラグメントが遊離した。この分解物を０．８％のＧＴ Ｇ　アガロースゲル上に流し、プロモーターを有するこの２．５Ｋｂのフラグメ ントをゲルから切り出し、電気溶離し、そして予めＨｉｎｄｌ［［により分解せ しめた二本鎖Ｍ１３ＭＰファージＤＮＡとりゲートせしめた。このリゲーション 混合物ヲ旦、ユニ株Ｄ０９８を形質転換せしめるために用いた。この形質転換細 胞を旦−ユｉＪＭ１０３の菌叢を有するＲ１７−３プレート上にまき、そして３ ７°Ｃで一夜インキユベートした。１１個の得られたファージプラークを採取し 、Ｒ２−６培地（５，０ｇのトリプトン、５．０ｇの酵母抽出物、５．０ｇのＮ ａＣ１及び］、ＯＬの蒸留水、１）Ｈ６，９）により１：１００に希釈した対数 増殖期ＪＭ１０３３ｍｌに感染せしめた。この培養物を３７°Ｃで６時間インキ ュベートし、そしてエッペラドルフチューブにおいて沈殿下せしめた。遊離のフ ァージを含むこの上滑液を４°Ｃで保存し、その間にミニスクリーンＤＮＡをこ の細胞ベレットからアルカリ溶解方法により調製した。このミニスクリーンＤＮ Ａを酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍ及び旦且上■による制限分解により分析した。１つの クローンを選び出し、これをＭｐＨ：Ｐｃｓと称した。このクローンから上清液 をＪＭ１０３に感染せしめるために用いた。ＪＭ１０３　ＭｐＨ：　Ｐｃ　ｓの 培養物１５ｍ１を６時間増殖せしめ、沈殿下せしめ、そして一本領ファージＤＮ Ａをこの上滑液から単離せしめた。 このファージＤＮＡ　ＭｐＨ：　Ｐｃ　ｓを、セルロースシンターゼオペロンプ ロモーター配列の両側から１２ｂｐにある酵素Ｓｓ　ｔ　Ｉ、Ｓｍａ　Ｉ、及び ＢａｍＨＩのための制限部位配列を含むオリゴヌクレオチドＬ　ＦＯＩ（５’　 −ＧＡＡＴＡＴＡＴＡＡＧＧＧＡＧＣＴＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＧＴＴＴ ＴＡＣＣ−３’　）により突然変異せしめた。１ピコモルの一末鎖ファージＤＮ Ａ　ＭｐＨ：Ｐｃｓを１０ｇモルのＬＦＯＩと共に６８°Ｃで５分間インキュベ ートし、その後プロモーター配列と共に３０分間３７°Ｃでアニール化せしめた 。このアニール化分子を次に、完全な二本鎖ＤＮＡを形成せしめるためにｄＮＴ Ｄを０．５ｎ＋Ｍ迄、及びＤＮＡポリメラーゼ１のフレノウフラグメントを０． ２５ユニット／μｌ迄加えることにより伸長せしめた。この伸長は４°Ｃで３０ 分間、その後の３７°Ｃでの１時間によって処理した；次にそれらを６８℃で１ ０分間加熱し、そしてこの混合物をＪＭ１０３コンビ−テント細胞の形質転換の ために用いた。 この形質転換混合物をＪＭ１０３菌叢細胞と共に、３ｍｌのＲ１７（１０，０ｇ のＮ−Ｚアミン、タイプＡ、５．０ｇのＮａＣｌ、ＤＭＦ２．０ｍｌ巾のＸ−ｇ ａｌ　０．０４ｇ）、１０ＭＭのＭ　ｇ　ＣＩ　ｚ、０．７％の特級アガロース を有するＲ２−４プレート上で平板培養せしめた。ファージプラークをこれらの プレートからニトロセルロースフイタ−上に移し、そしてこのプレートは４°Ｃ で保存した。このフィルターを８０°Ｃで２時間焼き、そしてＩＰ標識オリゴヌ クレオチドプローブＬＦＯ２とハイブリダイズせしめた。ＬＰ０１は、突然変異 のために用いられるオリゴヌクレオチドＬＦＯＩの配列の部分集合を含み、その ３つの制限部位配列はセルロースシンターゼプロモーター配列の両側のわずか２ ｂｐにある。ＬＰ０１の配列は５’　−ＧＧＧＡＧＣＴＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡ Ｃ−３’である。ハイブリダイゼーションは５８°Ｃで行った。 このフィルターを５８°Ｃで、５倍量の５ＳＣ１２倍量のＳＳＣ及び０．１％の ＳＤＳを含む２倍量のＳＳＣで逐次５分間洗浄せしめた。コダック（Ｋｏｄａｋ ）Ｘ−ＯＭＡＴ　ＡＲフィルムをフィルター上に６０時間さらした。６０時間後 、現像フィルム上に、プレート上に未だ存在する転移せしめたプラークに相当す る暗いスポットが現れた。フィルム上のこの暗いスポットに相当する１６個のプ ラークを単離し、そしてＲＦ　ＤＮＡを酵素Ｈｉｎｄｎｌ、ＢａｍＨＩ、及び５ ｓｔＩによる制限分解により分析した。ＭｐＨ：　Ｐ　ｃ　ｓ　：　ＬＦＯＩは 図９に示す地図に相当する。ＭｐＨ：　Ｐｃｓ　：　ＬＦＯＩにおける導入制限 部位は異種プロモーターの置換のためにある。側方の領域は、。 プラスミドとアセトバクター染色体間の遺伝子交換における相同性組換のための 部位として働く。 培養物ＭｐＨ：　Ｐｃ　ｓ　：　ＬＦＯＩからのファージ上漬物はプラークから 精製されたものであり、再度適切な制限パターンについて検査せしめ、次いで感 染及び二本鎖塩化セシウム勾配精製ＤＮＡのために用いた。 Ｂ、ＡＣＹＣ１８４：　Ｐ　ｃ　ｓの　１２０マイクログラムのＭｐＨ：　Ｐ　 ｃ　ｓ　：　Ｌ　ＦＯＩＤＮＡを２００ユニツトのＨｉｎｄ−１１により分解し 、そしてセルロースシンターゼプロモーター領域を含む２．５Ｋｂのフラグメン トをゲル精製し、透析袋の中で０．１倍量のＴＥＡにて１００ボルト、２時間電 気溶離せしめた。このＤＮＡ及び緩衝液をこの袋から取り出し、フェノール／ク ロロホルムにより抽出せしめ、エタノール中の酢酸ナトリウムで沈殿せしめ、ト リス−ＥＤＴＡ緩衝液にて再懸濁せしめた。このフラグメントをＨｉｎｄＩ［［ 分解Ｐ　Ａ　ＣＹ１８４（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）と、１０ ：１の挿入物のベクターに対する比で、２ｍＭのＡＴＰ濃度にて１６°Ｃで一夜 、リゲートせしめた。このリゲーション混合物をＭＭ２９４コンピーテント細胞 に形質転換せしめ、そして２０ｇｇ／ａ＋ｌのＣｍを含むＲ２−４プレート上で 平板培養せしめた。このプレートを３７°Ｃで一夜インキユベートし、そして１ ５，０００個以上のＣｍ”コロニーが出現した。Ｐｓｃフラグメントの挿入によ る、ｐＡｃＹｃ１８４のテトラサイクリン耐性遺伝子の不活性化についての試験 のため、これらのコロニーのうちの６６個を５０ｇｇ／＊１のアンピシリンを有 するＲ２−４プレート及び１５ｇｇ１０＋１のテトラサイクリンＲ２−４プレー ト上に貼付し、そして３７°Ｃで一夜インキユベートした。６６のＣｍ”　Ａｍ ｐ”コロニーの内の６個はパッチテストに基づきテトラサイクリンに対する耐性 を示した。ミニブレプＤＮＡをこの６つのコロニーから単離し、ＨｉｎｄＩ［［ により分解し、そして０．８％のアガロースゲル上で分析した。３つのプスミド は１つの２．５ＫｂのＨｉｎｄＤＩ挿入物を示し、その他の３つは３又はそれよ り多くの挿入物を示した。このプラスミドをｐＡｃＹ０１８４と称する：Ｐｓｃ は単一の２．５ＫｂのＨｉｎｄＩ［［挿入物を示した。塩化セシウム臭化エチジ ウム勾配精製ＤＮＡをこのプラスミドを含む培養物から単離した。 ｐＡｃＹｃ１８４　：Ｐｃａ　ＤＮＡ　４０ｕｇを、４ユニツトのＢａｍＨＩに より部分分解し、そしてゲル精製した。２つのＢａｍＨＩ部位の１つが切断され た直鎖状のプラスミド分子を含む約６．ＩＫｂのフラグメントを単離し、その後 ５ｓｔｌにより完全に分解せしめた。このフラグメントをゲル精製し、そして６ ．ＬＫｂのＢａｍＨＩ−３ｓ　ｔ　１７ラグメントをゲルから切り出し、０．１ 容量のＴＥＡ中で電気溶離せしめ、ソイノール／クロロホルムにより抽出せしめ 、エタノールにおける酢酸ナトリウムにより沈殿せしめ、そしてトリス−ＥＤＴ Ａ緩衝液にて再懸濁せしめた。 Ｃ，Ｓｓｔ１ｇ亡の　ＢＲ３２２への １０マイクログラムのｐＢＲ３２２ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＡ　Ｉ　ｗ Ｎ　Ｉにより完全に分解せしめ、そしてその末端はプラント状にした。ニューイ ングランドバイオラブ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）からの５ｓｔ Ｉ　（Ｓａｃｌ）リンカ−オリゴヌクレオチドを、標準条件下でプラント未満ｐ ＢＲ３２２切断フラグメントのためにＴ４リガーゼによりリゲートせしめた。こ のリゲーション混合物を５ユニツトの５ｓｔｌにより直接分解せしめ、ゲル精製 し、その後標準条件下でそれ自身をＴ４ＤＮＡリガーゼによりリゲートせしめた 。このリゲーション混合物を、アンピシリン耐性についての選択性を有するＭＭ ２９４コンピーテント細胞を形質転換せしめるために用いた。１つの培養物、Ｍ Ｍ２９４　ｐＡＬＦ２０は、５ｓｔｌにより直鎖状となり、且つ長さにおいて約 ４．４ＫｂのＤＮＡを提供した。このプラスミドを次にｌａｃ及びｔａｃプロモ ーターを適用させるために用いた。 Ｄ、第１ゴヌクレオチドのアニール ｔａｃ及び１ａｃＵＶ５プロモーターを形成するためのオリゴヌクレオチドを合 成した。各オリゴヌクレオチドは、一端にＥｃ　ｏＲＩ半分部位の一本鎖及び他 端にＨｉｎｄｎｌ半分部位の一本鎖を有する一本鎖のプロモーターについての配 列を含む。この合成ヌクレオチドをＨ，Ｏに、１００Ｐモル／μｍの濃度迄懸濁 せしめた。２００２モルの各オリゴヌクレオチドを９ユニツトのポリヌクレオチ ドキナーゼにより、１ｓＭのＡＴＰを含む反応液２０μｍ中で、３７°Ｃで３０ 分間処理した。 キナーゼ処理せしめたら、このオリゴヌクレオチドの組を一緒に混合せしめ、次 いで任意的に二次構造を対合しないように６８°Ｃで１５分間加熱せしめた０次 いでこのオリゴヌクレオチドを３７°Ｃの冷却により共にアニール化し、そして ３０分間インキュベートした。３０分後、このオリゴヌクレオチドを以下の通り に単離せしめたｐＡＬＦ２０ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄｌｌＩフラグメントとのリゲ ーション反応に含ませた。 Ｅ、ごｊｐ≧」因几袈 ２０μｇのプラスミドｐＡＬＦ２０を１００ユニツトのＥｃｏＲＩ及び１００ｊ −１−７トのＨｉｎｄＩＩＩにより、３７°Ｃで１．５時間分解せしめた。この 反応物を０．８％のＣＴＧアガロースゲル上に流し、そして直鎖ＤＮＡに相当す る約４．４　Ｋｂのフラグメントをゲルから切り出した。このフラグメントを０ ．１容量ＴＥＡ緩衝液の中で、透析袋において１００ボルトで１．５時間電気溶 解せしめた。このＤＮＡ及び緩衝液を袋から取り出し、フェノール及びクロロホ ルムにより抽出せしめ、次いでエタノールにおける酢酸ナトリウムにより沈殿せ しめた。このＤＮＡをスピードバク（ｓｐｅｅｄ　ｖａｃ）内で乾燥し、そして Ｒ２０に再懸濁せしめた。 Ｆ、ユヱニ之１１ アニール化オリゴヌクレオチドの各組を、ＨｉｎｄＩ［Ｉ／Ｅｃ　ｏＲＴ分解ｐ ＡＬＦ２０ＤＮＡと、３：１の挿入物のベクターに対する比により、１６°Ｃで ３．５時間、０．１ｍＭのＡＴＰを含む反応においてリゲートせしめた。コント ロールとして、ベクターＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　／　Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍ分解ｐＡＬＦ ２０を同条件下でそれ自身にリゲートせしめた。各リゲーション混合物のアリコ ートを、リガーゼを加える前、且つ３．５時間のリゲーション後に取り出した。 これらのアリコートを０．８％のアガロースゲル上に流し、そして１６°Ｃで３ ．５時間後の分子量において明らかなる増大が見られ、十分なるリゲーションが 示された。 Ｇ−彫ｊ■Ｌ換 各リゲーション混合物を、ＤＣＩＯＩコンビ−テント細胞に形質転換せしめ、そ して１５μｇ／ｍｌのテトラサイタリンを含むＲ２−４プレート上で平板培養せ しめた。リゲートされたベクターによる形質転換は６つのテトラサイクリン耐性 コロニーを提供した。ｐＡＬＦ２０：　１　ａ　ｃＵＶ５は３０のテトラサイク リン耐性コロニーを提供し、ＰＡＬＦ２０：　ｔ　ａ　ｃは９９個提供した。塩 化セシウム臭化エチジウム勾配精製ＤＮＡをｐＬａｃ１９．ｐＬａｃ２０及びｐ Ｌａｃ２１と命名したｐＡＬＦ２０：１ａｃＵＶ５形賞転換体重賞転換つのクロ ーン、並びにｐＴａｃ２４及びｐＴａｃ２５と命名したｐＡＬＦ２０：　ｔ　ａ 　ｃ形質転換体由来の２つのクローンから調製した。これらのプラスミドを、ア ニール化オリゴヌクレオチド挿入物の存在の検定のためにシーケンス化せしめた 。 ｐＬａｃ２１：誤まりなしで１ａｃＵＶ５配列を含んだ。 ｐＴａｃ２５：プロモーターの−４７の位置でのＧとＡの１塩基の誤まりを有す るｔａｃプロモーター配列を含んだ。 組立の続きのためにプラスミドｐＴａｃ２５及びｐＬａｃ２１を選んだ。各プラ スミド１０μｇを５ｓｔｌ及びその後ＢａｍＨＩにより完全に分解せしめた。異 種プロモーター（ｔａｃ又は１ａｃ）に結合するアンピシリン耐性遺伝子を含む 約１゜５Ｋｂのフラグメントをゲルから切り出し、０．１容量のＴＥＡ中で電気 溶離せしめ、フェノール／クロロホルムにより抽出せしめ、エタノール中におけ る酢酸ナトリウムにより沈殿せしめ、そしてトリス−ＥＤＴＡ緩衝液に再懸濁せ しめた。 Ｒ３−九ゲ辷」仁ＬＺ 約６．７８ａｍＨ１部分的Ｓ　ｓ　ｔ　Ｉ　ｐＡＣＹ−Ｃ１８４：　ＰＣＳベク ターフラグメント（セクションＢにおいて単離）をｐＬａｃ２１及びｐＴａｃ２ ５由来のＢａｍＨＩ／５ｓｔｌアンピシリン耐性異種プロモーターフラグメント と、７：１の挿入物二ベクターの比、そして１６℃で２４時間にて０．２ａｉＭ のＡＴＰ濃度による、２つの別々のリゲーション反応においてリゲートせしめた 。これらの２つのリゲーシッン混合物をＤＧＩＯＩコンピーテント細胞を形質転 換せしめるために用いた。この形質転換は、ｐＡｃＹｃ１８４　：　Ｐ　ｃ　ｓ 　：　Ｌａ　ｃ２１については７８６個のアンピシリン耐性形質転換体を、−そ してｐＡＣＹＣ１８４：Ｐｃｓ　：Ｔａｃ２５からは８０３のアンピシリン耐性 形質転換体を作り出した。各形質転換体からの９個のコロニーからの培養物を５ ０μｇ／ｍｌのアンピシリンを有するＲ２において増殖せしめた。アルカリ溶解 ミニブレブＤＮＡをこれらの培養物から単離し、そして酵素ＢａｍＨＩ、Ｈｉｎ ｄｎ［、及び５ｓｔＩによる制限分解により分析した。図９におけるＰＬａ　ｃ ２Ｌ７及びｐＴａｃ２５−１と表示するプラスミドについての制限地図に相当す るＤＮＡが同定された。これらのプラスミドを保存１３０６−２１エレクトロコ ンビ−テント細胞の形質転換のために用いた。得られる株を、これらの株の染色 体形態の評価のためにサザンプロット分析にかけ、その後セルロースシンターゼ 活性及びセルロース生成の増大レベルのための発酵実験に用いた。 これらの２株を、非形質転換株１３０６−２１　と共に、標準プロトコールを利 用して試験した。これらの株を、細胞増殖、セルロース生成及びインビトロセル ロース活性について、二重測定において、１，２及び５日にわたり試験した。１ ２５ｍ１のバッフルフラスコにシード培地を含む２％のセルロースを接種せしめ た。１０μＭのＦｅＣ１＊、２５ｍＭのＤＭＧ、１％のＴＹＥ及び３％のグルコ ースを有するＲ７０−２を含む標準フラスコ培地を用いた。 酵素アッセイのための培養物を集め、この細胞をチーズクロスで濾過し、そして この細胞を前記のプロトコールを利用して洗浄せしめた。このペレットを、その サンプルを集めるに従って凍結せしめた。この細胞を超音波処理せしめ、その後 セルロースシンターゼ活性、セルロースの生成及び細胞増殖についてアッセイし た。 本実験の結果は、セルロースシンターゼオペロンのアセトバクター染色体プロモ ーターがＥ　コリプロモーターと交換されることができ、そしてインビトロセル ロースシンターゼ活性及びセルロース生成が得られ続けられうることを示す。 ｔａｃプロモーター構造のインビトロセルロース比活性は野性型細胞と発酵にわ たり、日数の経過した培養物の活性、並びに２及び５日経過培養物の活性におけ る低下の両者において類似し、そしてｌａｃプロモーター構造の活性は野性株の それよりも低かった。その活性は初日と２日日の間でも低下した。 ｔａｃプロモーター構造の細胞増殖及びセルロース生産はコントロールのそれら と実験上同一であった。このｌａｃプロモーター構造はセルロース生産において はコントロールに比べ明らかに低く、しかし細胞増殖においては低くなかった。 このデーターにより、ｌａｃプロモーター株におけるセルロース生産はセルロー スシンターゼの生体内活性により制限されるものと考えられる。 それ故、本明細書に示す通り、種々の強さのプロモーターは異なる酵素活性及び セルロースの、細胞に対する比の発生を提するであろう。 五Ｘユ セルロースシン　−ゼＤ゛　−の・ 本実験の目的は、セルロースシンターゼオペロンＤ　遺伝子の機能の研究のため の１３０６−２１誘導株の作製である。本明細書で作成するこの株は、野性型タ ンパク質のＣ末端の１６．５％を欠落する、遺伝子り由来のポリペプチドを生成 できる。完全遺伝子りの除去される二次構造物も作製した。これらの株を、セル ロース生成に関連するそれらの表現型について試験した。 Ａ、　゛　−ＣびＢを４・３．７Ｋｂのフラグメントの　ＡＣＹＣ１８４へのク ローンヒ ２０μｇのｐＡｃＹｃ１８４　ＤＮＡを、全容量３００μｍの２００ユニツトの ＥｃｏＲＶ及び２００ユニツトのＢａｍＨＩにより、３７°Ｃで２時間分解せし めた。このＤＮＡを１４ユニツトの仔牛小腸アルカリホスファターゼにより、３ ７°Ｃで３０分間処理し、次いで１％のＧＴＧアガロースゲルに流した。約４Ｋ ｂのＥｃｏＲＴ／ＢａｍＨＩフラグメントをこのゲルから切り出し、０．１容量 の少量のＴＥＡ中にて１００ボルトで１時間電気溶離せしめ、フェノール及びク ロロホルムで抽出せしめ、エタノール中で酢酸ナトリウムにより沈殿せしめそし て１０μｍのトリスＥＤＴＡ緩衝液に再懸濁せしめた。 ５０ｕｇのｐＢＲ３２２：５．５Ｔ１９Ｇ９ＤＮＡをＳｍａ　Ｉにより完全に分 解せしめ、完全に直鎖となったかを検査し、その後ＢａｍＨＩにより分解せしめ た。（ＴＲＴＩＩ−４由来の５．５ＫｂのＢａｗｌ　Ｉ　フラグメント（例ＸＴ Ｖ、Ｃ）をｐＢＲ３２２のハ畦■部位にクローン化せしめ、ｐＢＲ３２２：　５ ．５　Ｔｌ９Ｇ９を作成した。）この分解ＤＮＡを０．１％のＧＴＧアガロース ゲル上に流し、遺伝子Ｃの３′部分及び遺伝子りを含む約３．７Ｋｂのフラグメ ント（図１のヌクレオチド６３４１−１０１６４　）をこのゲルから切り出し、 そして０．１容量の少量のＴＥＡ中にて１００ボルトで１時間電気溶離せしめた 。このＤＮＡを次にフェノール／クロロホルム抽出せしめ、エタノール中にて酢 酸ナトリウムにより沈殿せしめ、そして１０μｍのトリス−ＥＤＴＡに再懸濁せ しめた。　約２９ｇ当量のｐＡｃＹｃ１８４　ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメ ントを約２５ｕｇ当量の３．７ＫｂのＢａｍＨ１／ＳｍａＩフラグメントと、約 ３：１の挿入物：ベクターの比で、２０μｍ容量における２ユニツトのＴ４ＤＮ Ａリガーゼにより、１６°Ｃで３．５時間、１００μＭのＡＴＰ濃度にてリゲー トせしめた。このＡＴＰ濃度をその後１ｍＭ迄上昇させ、そしてこのリゲーショ ン混合物を１６℃で１夜インキユベートせしめた。 このリゲーシジン混合物を、標準の条件下でＭＭ２９４コンビ−テント細胞を形 質転換させるために用いた。この形質転換細胞は、２０μｇ／ｒａｌのＣｍを含 むＲ２−４プレート上で選別され、そして３７℃で一夜インキュベートせしめた 。Ｃｍ”形溶解ミニスクリーンＤＮＡの調製のために採取した。クローンｐＡｃ Ｙｃ１８４　：３．１は、遺伝子Ｃの３′末端及び遺伝子り全てを含む３．７Ｋ ｂのＳｍａ　Ｉ−ＢａｍＨＩ挿入物を有し、オペロンの終点にステムとループ終 結構造を含むことが示された。ｐＡｃＹｃ１８４　：　３．７についての塩化セ シウム臭化エチジウム勾配精製ＤＮＡが単離された。 Ｂ、−り配置の ２０％ｇのｐＡｃＹｃ１８４　：　３．７ＤＮＡをＥｃｏＲＶにより完全に分解 せしめ、フェノール／クロロホルムによす抽出せしめ、沈殿せしめ、その後２０ μｌのトリス−ＥＤＴＡに再懸濁せしめた。５！ｇのｐＢＲ３２２ＤＮＡをＰｃ 　ｏＲＩ及び八］ｗＮＩにより完全に分解せしめた。このＤＮＡを沈殿せしめ、 その接着末端をフレノウによる、４種のｄＮＴＰ全ての存在下において埋めた。 この埋められたＤＮＡを１％のＧＴＧアガロースゲル上に流し、１．５ＫｂのＡ ｍｐ”フラグメントをこのゲルから切り出し、０．１容量のＴＥＡにて電気溶離 せしめ、フェノール／クロロホルム抽出し、沈殿させ、そして５μｌのトリス− ＥＤＴＡ緩衝液に再懸濁せしめた。 ５％ｇ当量のｐ　Ｂ　Ｒ３２２Ａｍ　ｐ”フラグメントＤＮＡを１％ｇ当量のｐ ＡｃＹｃ１８４　：３．７ＥｃｏＲＩ分解ＤＮＡと、約９；ｌの挿入物二ヘクタ ーの比で、標準リゲーションの条件下でリゲートせしめた。このリゲーション混 合物を標準条件下でＭＭ２９４コンピーテント細胞を形質転換せしめるために用 いた。この形質転換体をＲ２−４Ａｍｐ５０プレートにて平板培養し、３７°Ｃ で１夜インキユベートせしめた。Ａｍｐ”コロニーが得られ、そして培養せしめ た。細胞を各培養物から集め、そしてアルカリ溶解ミニブレプＤＮＡを培養物か ら単離せしめた。ｐＤＩ−２と命名するこの培養物のうちの１つを１３０６−２ １の形質転換のために選んだ。ｐＤＩ−２は遺伝子りを妨害するｐＡｃＹｃ１８ ４　：３．１のＥｃｏＲＶ部位において挿入された、ｐＢＲ３２２由来のＡｍｐ 耐性フラグメントを含む。塩化セシウム臭化エチジウム勾配ｐＤＩ−２ＤＮＡを 調製した。この分解物を２１のＨｉＯにより、セントリコン３０　（Ｃｅｎｔｒ ｉｃｏｎ　３０）（Ａｍｉｃｏｎ）において５．００Ｏｒｐｍによる遠心により 洗浄せしめた。次にこのＤＮＡをスピードバク内で乾ｉし、そして４μｌのＨ， Ｏに再懸濁せしめた。４０μｍのエレクトロコンピーテント１３０６−２１細胞 をこの分解ＤＮＡに加え、そしてこれらの細胞を標準条件下でエレクトロポレー トした。 １ｍｌのＲ２０−２をこのエレクトロボレート処理細胞に加え、そしてこの混合 物を直ちにＲ２Ｒ２０−２Ａ　１００１００Ｃ上で平板培養した。 ３０°Ｃで４日のインキュベーション後、約１００．０００個のＡｍｐＨコロニ ーがプレート上に現れた。これらの形質転換体は弱いセルロース生産体として現 れた。類似の結果が、セルロースシンターゼＤ遺伝子全体の欠落する形質転換体 について観察された。これらの発見は、セルロースシンターゼＤ遺伝子がセルロ ース合成において機能することを示す。 夛υ（唄 セルロースシン　−ゼの　１！ 株１３０６−２７を１００抛１のバッフルフラスコにおける４０ｈ＋１の４％フ ルクトース、１％の酵母抽出物、０．５％のバタトペブトン、０．３％のＮａＨ ，ＰＯａ培地、ｐ）１５．０において２４時間増殖せしめた。生育培地を緩衝液 （５０ｍＭのに２ＨＰＯ，、ｐ）１６．０）による２回の洗浄により除去した。 約１４ｇの乾燥細胞が得られた。 史惣Ｎ 細胞を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びＴＭＥ緩衝液（２０％０ＰＥＧ 　（Ｗ／ν））の存在下においてフレンチプレス中で破壊せしめた。この破壊細 胞を遠心しく１２．０００ｘ　ｇ、１０分間）、そしてこのペレットを同じ容量 のＴＭＥ緩衝液に再懸濁せしめた。この懸濁物をホモジナイズしくボッターエレ ベジェムホモジナイザー（Ｐｏｔｔｅｒ　Ｅｌｅｖｅｈｊｅｍ　ｈｏｍｏｇｅｎ ｉｚｅｒ）　、そしてこの懸濁物を遠心せしめた（１２．０００Ｘ　ｇ、１０分 間）。得られたペレットはセルロースシンターゼ活性を含んでいた。このサンプ ル（Ｐ−ＰＥＧ）をＴＭＥ緩衝液に、５０ｍｇ細胞／　Ｉｌｌに相当する濃度迄 懸濁せしめ、そして液体窒素にて凍結し、−８０″Ｃで保存した。 上ユ１嶌≦ｃ匹理 Ｐ−ＰＥＧを遠心しく１２，０ＯＯＸ　ｇ、１０分間）そしてそのペレットを０ ．１Ｍのトリス、ｐＨ８，３，２０％のスクロース中に、乾燥重量１０ｇの細胞 ／＋＋＋Ｉ迄懸濁せしめた。１容量％の８１１ｇ／ｍｌのトリプシン（Ｓｉｇｍ ａ）を加え、そしてこの調製物をゆっくり撹拌しながら１時間、４°Ｃにてイン キュベートせしめた。 １容量％のトリプシンインヒビターを加え、そしてこの調製物を氷上に１５分間 インキュベートせしめた。遠心（１００，０００ｇ、３０分間）後、ペレット（ ＴＴ−Ｐ−ＰＥＧ）を−８０℃で保存した。 皿 ＴＭＥ緩衝液中の１０％のジギトニン（ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ；　５ｅｒｖａ。 Ｗｅｓｔｂｕｒｙ＋　ＮＹ）を湯浴にて５−１０分間加熱することにより調製し 、そしてこの調製物を４°Ｃに冷却した。このＴＴ−Ｐ−ＰＥＧペレットを２％ のジギトニンを含むＴＭＥｉｌ街液に、もとの１／１０の容量迄懸濁せしめた。 この懸濁物をＭＳＥモデル１４０超音波音波器いて４°Ｃで２分間超音波処理し た。超音波処理は、断続冷却を伴って３０秒の超音波パルスにおいて、３０ｍ１ に分配して行った。この懸濁物を振騰し、そしてゆっくりと９０分間撹拌し、そ の後２００　、０００　ｇで６０分間遠心せしめた。 この上清液はもとのセルロースシンターゼ活性の約５０％を含んだ。前記の通り 凍結及び保存した際、活性は数カ月保持された。 １１（社）ｉ繍 この溶解酵素をアミコンコーン（Ａｍｉｃｏｎ　ｃｏｎｅｓ）（フィルターＬＯ ＯＫ）を用いて５−７倍濃縮し、１０−１６酵素ユニット／ｍｌ　（ユニット＝ １ナノモル／分）の活性にした。この濃縮酵素を４°Ｃで一夜保存するか、又は 前述と同様に保存した。 、−〇〇 コント０７　（Ｃｏｎｔｒｏｎ）　Ｔ　Ｓ　Ｔ　−２８（スウィンギングパケッ ト）ローターの６つの４０＋＋１の遠沈管それぞれの底に、グリセロール含有ク ッション（１２−１３％のグリセロール、１ｎＭのＵＤＰＧ及び１５Ｍモルのｃ −ｄｉ−ＧＭＰ）を含むＴＭＥ覆衝液（ｐＨ８，５））２６１に加え、そして１ ０−１の反応混合物（５０■１の溶解酵素、６゜２５ミ！Ｊモル（７）ト’Ｊス ーＨＣ１１ｓ衝液、ｐＨ９，６，３４０μモルノＣａＣ１ｚ、１ミリモルのＭ　 ｇ　Ｃ１ｚ　、０−６９モルのＣ−ｄｉ−ＧＭＰ及び６０ＭモルのＵＤＧＰ　（ 最終容量６１ｍ１　）をゆっくりその上に載せた。この管を１５分間、３０°Ｃ でインキュベートし、次いで氷上に２．５時間置き、そして最後にＴＳＴ−２８ コントロンローター中で３０分間、２０．００Ｏｒｐｓ＋で遠心した。 （この遠心機は３−４分間において３５０ｒｐｍ減速するように設定しである。 ）この上清液を慎重にデカントした。このベレットを１５ｍ１のＴＭＨに手動ホ モジナイザーにより混合し、そして懸濁させた。この最終ベレットを５ｍｌのＴ ＭＨに懸濁せしめた。この得られる酵素は凍結及び前記の通りに保存した場合、 数週間安定である。得られた酵素の活性の回収率は約４５％であった。 ５ＤＳ−ＰＡＧＥに　づくタンパク　の＼−もとのセルロースシンターゼ活性の １２−１．５％を含む得られた酵素をラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）サンプル緩衝 液（ＤＴＴを含む）に溶解し、そして１０％アクリルアミドスラブゲルにおける ５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ペプチドバンドはクマジープルー染色により識別化 し、そして切り出した。４つの主なバンド、ハンドＡ　９０−９５Ｘｄ、ハンド Ｂ　６５−６８Ｋｄ、バンドＣ５８−６０Ｋｄ及びバンドＤ　５４−５６Ｋｄが 観察できた。このゲルスライスを保存のため、１０％の酢酸を含むプラスチック 袋に閉入した。 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ　−ルスーイスか°の　ンバク　のタンパク質をＨｕｎｋａｐ ｉｌｉｅｒ他（ル匹担＋ｄｓユＬ旦μ刃吠お」Ｌ−１９８３、９１：　２２７− ２４７）からの改良方法を利用し、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルスライスから電気溶離 によって分離せしめた。この方法は低めの最終ＳＤＳ濃度をもたらすように改良 した。この改良は： １）浸透緩衝液（０，０５ＭのＮＨ４ＨＣＯ，における２％の５ＯＳ）に対する 溶出緩衝液（０，０５ＭのＮＨ４ＨＣＯ３における０、　１％の５ＯＳ）の置換 ；及び２）装置における溶出緩衝液（０，０５ＭのＮＨ，１ｌＣＯ。 における０、１％の５ＯＳ）を透析緩衝液（０，０１ＭのＮＨＪＣＯ３における ０、０２％の５ＤＳ）により交換する際、慎重にサンプルの阻害を回避しながら サンプルセル内のほとんどの緩衝液も交換される。 五Ｘ入 セルロースシン　−ゼＵ　か゛　れるボ１ペプチドンパク　のＮ　ｔアミノ　配 ｌ アセトバクター株１３０６−２７から精製される９０−９５Ｋｄタンパク質の最 初の１８個のアミノ酸及び６５−６８Ｋｄタンパク質の最初の１６個のアミノ酸 を、アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌ　ｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ）モデル ４７０Ａプロティンシーケンサ−における自動化エドマン分解により、この製造 者により供給される試薬及びプロトコールを利用してシーケンス化せしめた。こ の９０−９５Ｋｄタンパク質の１８個のアミノ酸は、前述の通りに得られるセル ロースシンターゼのＤＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列と一致した。この一 致は、図１において示されるアラニン残基から始まる。精製後に得られるアミノ 末端は本質的なインビボＮ末端でないことがあるが、しかしこのアラニンの後に 続くリジンでのタンパク質分解を反映しうる。クローン化遺伝子の予想配列は８ ３Ｋｄのタンパク質についてコード化する。Ｎ−末端の近くの初期アミノ酸に対 するいくつかの更なるピークが存在し、おそらく夾雑物に由来するであろう。 ６５−６８Ｋｄタンパク質に対して得られる配列の質は９０−９５Ｋｄタンパク 質に対して得られるものほど優ねていなかったが、しかし６５−６８ＫｄＮ−末 端配列と図１において予想される配列からのアミノ酸（カッコで示す）の間はよ く一致しうる。それ故、６５−６８Ｋｄタンパク質は９０−９５Ｋｄのタンパク 質のタンパク質分解フラグメントであると考えられる。 以下の培養物はアメリカンタイプカルチャーコレクション、（ＡＴＣＣ）Ｒｏｃ ｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ、　ＵＳＡにて、特許手続の目的のための微生物の寄託の 国際認定に基づくブタベスト条約の下で、そしてそれに基づく条件（ブタベスト 条約）のもとで寄託されており、それ故、これらはブタベスト条約に従って保管 され、入手できる。このような株の入手は全ての政府のもとでのその特許法によ る権利に基づく違背における発明の実施として制限されていない。 この寄託培養物は以下のＡＴＣＣ寄託番号が付与されている。この培養物は本出 願の出願人であり、以下のＣＭＣＣ寄託番号を受けたシータスコーポレーション （Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、　ＣＡ。 ｔｌｓＡ）のマスターカルチャーコレクション（ＣＭＣＣ）に保存されている。 賠−」シー實ＣＭＣＣＮａ　ＡＴＣＣＮｌｌヱ−ｈ）パｊ」ｌ：　１３０６−２ ４　ｐＵｃｌＢ−８２４ＦＳ６　３５３８　６７９２５Ｅ、コリ　ＤＧＩＯＩ　 ｐＵｃｌＢ−８２４ＦＳ６　３５８１　６７９２６１］」二進２に１株　１３０ ６−３　１９０９　５３２６４１−ｔ＝）ｚεとＬ１株　１３０６−１１　２１ ４５　５３２６３ヱ−１−）／ε７に１株　１３０６−２１　２６１８　５３５ ２４上−ｒ丈　ＤＧ９８　１９６５　３９７６８上工≦Ｌ去　ＤＧＩＯＩ　ｐＵ ｃｌＢ−８２４ｐＡＢＣｏ　６８２６４本発明はいくつかの特定態様により実例 化されているが、これらは本発明の範囲を限定するものでない。 ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　Ｑ　ロ　ロ　ロ　ロ〜　０　ロ　小　ロ　Ｆ＋　ψ　 の　！　ｉ　〜。　。　。　。　５／２０゜　。　。　。　。　。 ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、　４ 手続補正書 平成４年３月　１３日

Claims (56)

【特許請求の範囲】
1. １．細菌セルロースシンターゼオペロンをコード化する、単離された、天然のク ローン化組換又は合成のポリヌクレオチド配列。
2. ２．アセトバクターのゲノム由来の請求項１記載のポリヌクレオチド。
3. ３．４つの連なる遺伝子（ここで図１の参照により、第１の遺伝子は実質的にヌ クレオチド３２８から２５８９に相当し、第２の遺伝子は実質的にヌクレオチド ２５９４から４９９９に相当し、第３の遺伝子は実質的にヌクレオチド５００５ から８６９１に相当し、第４の遺伝子は実質的にヌクレオチド８９６４から９４ ３１に相当する）を含んで成る請求項１に記載のポリヌクレオチド。
4. ４．前記のオペロンの第１の遺伝子と隣り合い、且つ上流に位置するプロモータ ーをコード化するＤＮＡ配列を更に含んで成る、請求項１記載のポリヌクレオチ ド。
5. ５．前記のプロモーターがアセトバクターに対して内因性である、請求項４に記 載のポリヌクレオチド。
6. ６．前記の内因性プロモーターがセルロースシンターゼオペロンに由来する、請 求項５に記載のポリヌクレオチド。
7. ７．前記のプロモーターが異種の細菌プロモーターである、請求項４に記載のポ リヌクレオチド。
8. ８．前記の異種のプロモーターが、ｔａｃ及びｌａｃを含んで成るグループから 選ばれる、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
9. ９．転写ターミネーターをコード化するＤＮＡ配列を更に含んで成る、請求項１ に記載のポリヌクレオチド。
10. １０．前記の転写ターミネーターが前記第４遺伝子の停止コドンの３′側の約２ ６塩基対以内に位置する、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
11. １１．表現型のためのコントロール配列と作動連結する、請求項１に記載のポリ ヌクレオチド。
12. １２．前記のコントロール配列が細菌に由来する、請求項１１に記載のポリヌク レオチド。
13. １３．前記の細菌が、アセトバクター及びエシェリヒアより成るグループから選 ばれる、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
14. １４．請求項１１に記載のポリヌクレオチドにより形質転換される組換宿主細胞 。
15. １５．前記の細胞が細菌細胞である、請求項１４に記載の形質転換された組換宿 主細胞。
16. １６．前記の細胞がＥ．コリ又はアセトバクター細胞である、請求項１５に記載 の形質転換された組換宿主細胞。
17. １７．図１において示す通り、セルロースシンターゼＡについてのヌクレオチド 配列に実質的に相当する、単離された、天然のクローン化組換又は合成のポリヌ クレオチド。
18. １８．図１において示す通り、ヌクレオチド３２８から２５８９に実質的に相当 する請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
19. １９．図１において示す通り、セルロースシンターゼＢについてのヌクレオチド 配列に実質的に相当する、単離された、天然のクローン化組換又は合成のポリヌ クレオチド。
20. ２０．図１において示す通り、ヌクレオチド２５９４から４９９９に実質的に相 当する、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
21. ２１．図１において示す通り、セルロースシンターゼＣについてのヌクレオチド 配列に実質的に相当する、単離された、天然のクローン化組換又は合成のポリヌ クレオチド。
22. ２２．図１において示す通り、ヌクレオチド５００５から８９６１に実質的に相 当する、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
23. ２３．図１において示す通り、セルロースシンターゼＤについてのヌクレオチド 配列に実質的に相当する、単離された、天然のクローン化組換又は合成のポリヌ クレオチド。
24. ２４．図１において示す通り、ヌクレオチド８９６４から９４３１に実質に相当 する、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
25. ２５．表現型のためのコントロール配列と作動連結している、請求項１７に記載 のポリヌクレオチド。
26. ２６．表現型のためのコントロール配列と作動連結している、請求項１９に記載 のポリヌクレオチド。
27. ２７．表現型のためのコントロール配列と作動連結している、請求項２１に記載 のポリヌクレオチド。
28. ２８．表現型のためのコントロール配列と作動連結している、請求項２３に記載 のポリヌクレオチド。
29. ２９．請求項２５に記載のポリヌクレオチドにより形質転換された組換宿主細胞 。
30. ３０．請求項２６に記載のポリヌクレオチドにより形質転換された組換宿主細胞 。
31. ３１．請求項２７に記載のポリヌクレオチドにより形質転換された組換宿主細胞 。
32. ３２．請求項２８に記載のポリヌクレオチドにより形質転換された組換宿主細胞 。
33. ３３．細菌セルロースシンターゼを生成するための方法であって、請求項１４に 記載の形質転換された細胞を細菌セルロースシンターゼの表現のために適切な条 件のもとで培養し、そして該培養物から表現される細菌セルロースシンターゼを 回収することを含んで成る方法。
34. ３４．細菌セルロースシンターゼを生成するための方法であって、請求項３０に 記載の形質転換された細胞を細菌セルロースシンターゼの表現のために適切な条 件のもとで培養し、そして該培養物から表現される細菌セルロースシンターゼを 回収することを含んで成る方法。
35. ３５．前記のポリヌクレオチドが、図１において示すヌクレオチド２５９４から ４９９９に相当する配列を有する、請求項３４に記載の方法。
36. ３６．およそ８５キロダルトンの分子量を有し、ウリジン５′−ジホスホグルコ ースよりβ（１−４）−グルカンポリマーを合成可能な、単離された組換タンパ ク質（ここで該タンパク質は、図１において示すセルロースシンターゼＢについ て提供したアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する）。
37. ３７．およそ８４キロダルトンの分子量を有し、その天然環境に関連するタンパ ク質を実質的に有さない、セルロースシンターゼ及びジグアニレートサイクラー ゼ活性の両者に欠損するセルロース陰性アセトバクター細胞の補完できうる、単 離れたタンパク質（ここで該タンパク質は、図１において示すセルロースシンタ ーゼＡについて提供したアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するも のとして更に特徴付けられる）。
38. ３８．およそ１４１キロダルトンの分子量を有し、その天然環境に関連するタン パク質を実質的に有さず、前記セルロースシンターゼオペロンの残りの３種のタ ンパク質と適切な割合において組合さる際にインビボにおいてウリジン５′−ジ ホスホグルコースからβ（１−４）グルカンポリマーを合成、且つ分泌せしめる ことができる、単離されたタンパク質（該タンパク質は図１において示すセルロ ースシンターゼＣについて提供したアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 を有するものとして更に特徴付けられる）。
39. ３９．およそ１７キロダルトンの分子量を有し、その天然環境に関連するタンパ ク質を実質的に有さず、前記セルロースシンターゼオペロンの残りの３種のタン パク質と適切な割合において組合さる際にインビボにおいてウリジン５′−ジホ スホグルコースからβ（１−４）グルカンポリマーを合成、且つ分泌せしめるこ とができる、単離されたタンパク質（該タンパク質は図１において示すセルロー スシンターゼＤについて提供したアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を 有するものとして更に特徴付けられる）。
40. ４０．組換微生物におけるセルロース生成を高めための方法であって、以下の段 階； ａ）適当な微生物を、セルロースシンターゼオペロン由来の少なくとも１種の遺 伝子を含んで成るベクターにより形質転換せしめ、 ｂ）該形質転換微生物をセルロースの生成のために適する条件のもとで培養せし めること、 を含んで成る方法。
41. ４１．前記の遺伝子がセルロースシンターゼオペロンによりコード化される４種 の遺伝子を含んで成る、請求項４１に記載の方法。
42. ４２．前記のポリヌクレオチドが前記のセルロースシンターゼオペロンの表現型 のためのコントロール配列と作動連結している、請求項４０に記載の方法。
43. ４３．前記のコントロール配列が異種プロモーターを含んで成る、請求項４２に 記載の方法。
44. ４４．前記の異種プロモーターが調節プロモーターである、請求項４３に記載の 方法。
45. ４５．前記の調節プロモーターがｌａｃ及びｔａｃプロモーターより成るグルー プから選ばれる、請求項４４に記載の方法。
46. ４６．前記の調節プロモーターがｌａｃプロモーターであり、そして前記の組換 微生物がｌａｃＩ遺伝子生成物をコード化するポリヌクレオチドを更に含んで成 る、請求項４５に記載の方法。
47. ４７．請求項４２に記載の方法であって、前記宿主細胞が細菌細胞である方法。
48. ４８．請求項４７に記載の方法であって、前記細菌細胞がアセトバクター細胞で ある方法。
49. ４９．前記のアセトバクター細胞がセルロースシンターゼ陰性表現型を有する、 請求項４８に記載の方法。
50. ５０．前記のアセトバクター細胞がセルロースシンターゼ陽性表現型を有する、 請求項４８に記載の処理方法。
51. ５１．以下のもの； ａ）プラスミドｐ８２４のレプリケーション含有フラグメント機能性アセトバク ター起源、並びに ｂ）形質転換、細胞***及び培養に影響を受け易い感受性宿主細胞の中に形質転 換せしめた際に少なくとも一種の抗生物質に対しての耐性を運び込む１又は複数 のＤＮＡセグメント、を含んで成る組換ＤＮＡベクター。
52. ５２．Ｅ．コリプラスミドの機能性レプリコンを更に含んで成る、請求項５１に 記載の組換ＤＮＡベクター。
53. ５３．表現型のためのコントロール配列と作動連結している細菌セルロースシン ターゼオペロンをコード化する核酸配列を更に含んで成る、請求項５１に記載の 組換ＤＮＡベクター。
54. ５４．前記のベクターが、ｐＵＣ１８−８２４ＦＳ１又はｐＵＣ１８−８２４Ｆ Ｓ６である、請求項５３に記載の組換ＤＮＡベクター。
55. ５５．請求項５１に記載の組換ＤＮＡベクターにより形質転換された組換細菌宿 主細胞。
56. ５６．前記の宿主細胞がアセトバクター又はエシェリヒア種である、請求項５５ に記載の組換細菌宿主細胞。