JPH04501364A - 子の性の前選択の方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 この発明は、***を、ＤＮＡ含有量における差異に基づいてＸとＸ染色体を担持 する***に分別することにより、子の性を前選別する方法に関する。

従来技術の記述 動物の性は家畜類の生産者にとっては重要である。

酪農家は、殆どの雄の子ウシを利用しないので、雌ウシだけを生産するための性 別にした***の使用は、効率の低い生産をもっと効果的なものにするであろう。

ブタの生産者は、もし彼らが酸ブタだけを市場に出すことができるならば、ブタ をより効果的に生産するであろう。とうい・のは、雌の方が雄より速く成長する からである。

肉牛とヒツジの種類では、雄の方が雌より早い速度で成長するので、雄の方が肉 の生産には好ましい。

これに加えて、雄または雌を特定することが可能であることは、遺伝的改善の要 する時間を短縮するに違いない。というのは、望ましい特性は、一方の親または 他方の親に頻繁に随伴するからである。ウシの子の性の計画は、限定された基礎 手順に立って既に実施されている。

この手順は、雌ウシから胎児を取り出し、それらの潜在的性を同定し、そして望 ましい性だけの胎児を再移植することからなる。しかし、***を人工受精に使用 する前に、雄を産出するそして雌を産出する群に分別することができたならば、 胎児移植による生産される子の全体的価値を高めることができるであろう。

全ての生物は、対の染色体の一組をもっており、この染色体は生命を維持しそし て新しい生命を生み出すののにも必要な遺伝子物質の全てを担っている。

一対以外の全染色体は、常染色体と呼ばれ、皮膚、毛髪および眼の色、成体の大 きさそして身体の特徴のような全身の全特徴のための遺伝子を担っている。残り の一対を性遺伝子と呼ぶ。それらは性を特定する遺伝子物質を担っている。一つ の性染色体をＸ１他をＹと呼ぶ。

雄からの***または雌からの卵は、常道転子の各対の一方を持つ；これに加えて 、哺乳動物では卵は常にＸ染色体を含有し、一方***は常にＸまたはＸ染色体の いずれかを持つ。

***と卵が一体になりそして***がＸ染色体を担っていると、子は雄（ＸＹ）で ある；しかじ、もし***が卵と一体になる時にＸ染色体を担うと、その結果であ る子は雌（ＸＸ）である。

今までに既知であり、そして科学的に明瞭であると証明されている、ＸとＹ*** の間の確立されたそして測定できる差異は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）含有量 におけるそれらの差異である。Ｘ染色体はＸ染色体より、より大きくそして僅か により多いＤＮＡを含有する。Ｘ担持***とＸ担持***の間の全ＤＮＡの差異は 、雄ブタでは３．４％、雄ウシでは３．８％、そして雄ヒツジでは４．２％であ る。

***細胞におけるＤＮＡの含有量は、殆どの正常体細胞におけるのと同じように 、安定し、ている。従って、各々の***のＤＮＡ含有量は追跡できて、Ｘ担持精 子とＸ担持***を識別するのに使用できる。

全ての哺乳動物の性遺伝子におけるＤＮＡ量における差異は科学的にしか明瞭に されていないので、Ｘ担持***とＸ担持***の間の測定可能な差異、染色体の構 成［マルジ、　Ｊ、Ｒｅｐｒｏｄ、Ｆｅｒｔｉｌｅ、　５７：３１９（１９７９ ）］および／またはＤＮＡ量の測定［ビンケル他（１）、５ｃｉｅｎｃｅ　２１ ８：９０４（１９８２）　；ピンケル他（２）、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　３：１（ １９８２）；ジョンソンとピンケル、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　７：２６８（１９８ ６）；　ジョンソン他（１）、Ｇａｍ、　Ｒｅｓ、１６：　１（１９８７）；ジ ョンソン他（２）、Ｇａｍ。

Ｒｅｓ、　１７：　２０３（１９８７）コだけが、***群の性生産の能力を決定 するための繁殖以外に証明できる手段である。文献には、性別にしたと主張して いる多（の物理的、生化学的、および機能的方法が記述されている［アマンとセ イデル、ｒＰｒｏｃｐｅｃｔ　ｆｏｒ　Ｓｅｘｉｎｇ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｓ ｐｅｒｍ　Ｊ　。

Ｃｏ１ｏｒａｄｏ　Ａｓ５ｏｃ、Ｕｎｉｖ、　Ｐｒｅｓｓ、　Ｂｏｕｌｄｅｒ（ ！９８２）　コ　；　これらの方法の若干は、相対的なりＮＡ含有量のために試 験されている［ピンケル他、、Ｊ、　Ａｎｉｍ、　Ｓｃｉ、　６０：１３０３（ １９８５）ジョンソン（１）、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ　２９：２６５（ １９８８）　］　。

しかし、管理した試験では、子の性比に実際に影響することが証明されなかった 。

前の研究では、ＸおよびＸ染色体を担う***の間のＤＮＡ含有量における差異を 繰り返し測定し、***の試料の***の性比を予測できることを示している［ジョ ンンとピンケル、上記を参照；ジョンソン他（１）、上記を参照；ジョンソン他 （２）、上記参照；ジョンソン（１）、上記を参照；ジョンソン（２）、　Ｃｙ ｔｏｍｅｔｒｙ、　５ｕｐｐ１．２：６６（ＡｂｓｔｒａｃｔＸ１９８８）］　 。

ＤＮＡ含有量に基づいたＸとＹ***の分別による証明できる分離をハタネズミ［ ビンケル他（１）、上記を参照；ジョンソン、ｒ”Ｂｅ１ｔｓｖｉｌｌｅ　Ｓｙ ｍｐｏｓｉａ　ｉｎ　ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅａｅａｒｃｈ　Ｘ、”　Ｐ 、Ｃ，Ａｕｇｕｓｔｉｎｅ、　Ｈ，Ｄ、　Ｄａｎｆｏｒｔｈ、　＆、Ｍ、Ｒ。

Ｂａｋｓｔ（ｅｄｓ、）　Ｍａｒｔｉｎｕｓ　Ｎ１ｊｈｏｆｆ、　Ｂｏｓｔｏｎ 、　Ｊ中、　１２１−１３４頁（１９８６）］およびチンチラ（ｃｈｉｎｃｈｉ ｌｌａ）　［ジョンソン他（１）、上記を参照］については実施しである。しか し、調製の手順がＤＮＡの生存能力に損傷を及ぼす。若干数の哺乳動物（雄ウシ 、雄ブタ、雄ヒツジ、ハタネズミ、チンチラ）種からの***核を分別して、９２ ないし９９％の範囲の純度でＸおよびＹ担持染色体群に分別することは実施され た［ジョンソンおよびクラーク、Ｇａｍ、　Ｒｅｓ。

２１：　３３５　（１９８８）］　。

核の解縮合（ｄｅｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）と生殖核の発達は、分別したＸま たはＹを担う雄ウシ、雄ブタ、または雄ヒツジの***［ジョンソンとクラーク、 上記を参照］で微注入したハムスター卵中で示された。

哺乳動物の***を、ＤＮＡ含有量に基づいてＸとＹの染色体分画に分別する方法 を提供するのが本発明の目的である。

分別した***細胞の生存能力を維持しなから哺乳動物のＤＮＡを染色する方法を 教示するのが、本発明の別の目的である。***の生存能力を維持しながら細胞分 別装置において使用するのに適した保護液体（ｓｈｅａｔｈ　ｆｌｕｉｄ）を提 供するのが本発明の別の目的である。

***の生存能力を維持する能力のある採集液体を提供するのが本発明の別の目的 である。

本発明の別の目的と利点はこれに続（説明から容易に明瞭になるであろう。

発明の詳細な説明 私は、分離法をここに示した；即ち無傷の、生存能力のあるＸとＹ染色体を担っ ているウサギ、ブタの***群の相対的なりＮＡ含有量に基づ（流動分別；雌体中 に分別した***の外科的種付け；そしてそれに続く、分別した***群の相対的Ｄ ＮＡ含有量に基づく予測と一致している表現型−性比を持つ性別した子の分娩に よる方法である。

流動細胞計測計は、予め蛍光染料で処理した***がレーザー線中を通過する時に 放つ蛍光線の量を測定する。

この染料はＤＮＡに結合している。蛍光線は光学レンズにより一緒に集められる ；信号は光増幅管に伝送され、増幅され、そしてコンピューターにより解析され る。

Ｘ染色体はＹ染色体より多くのＤＮＡを含有しているので、雌型***（Ｘ）は雄 型（Ｙ）***より多くの染料を取込みそしてより多くの蛍光線を放つ。

ＤＮＡにおけるＸとＹの間の検出されるべき差異は小さいので、***は単層にな ってレーザー光線中を通過しなければならず、そのレーザー光線が個々の***の ＤＮＡ含有量を計測する。

直角流動細胞計測法では、励起源（レーザー光線）を横切っている狭い通路中を 、蛍光色素で染色した単一の細胞のけん濁液を流させなければならない。単一の 細胞は光線中を通過し、光学的検出器が発射した光線を集め、光線を電気信号に 変換し、そして電気信号はマルチチャンネル分析計により分析される。データは 、座標として細胞の数と蛍光を使用して、多重または単一パラメ−ター−ヒスト グラムとして表示される。

直角流動細胞系を使用してＸ−およびＹ−担持***のＤＮＡを弁別するためには 、斜角に付けた試料注入先端部と前方に位置付けた２番目の蛍光検出器が要求さ れる［ジョンソンとビンケル、上記参照］。この報告はここでは参考文献を包含 する。改良系では、それがレーザー光線を通過する時に平卵状の***の頭部の方 向を制御することができる。方向付けしてない***を、電子ゲーティングによっ て除外することは精度をあげる。典型的には、レーザー光線中を通過する時に、 ***核（尾部がない）の８０％が適当に方向付けされる。

改良したＥｐｉｃｓ　Ｖ　流動細胞計測器／細胞分別器において流動力は、平卵 状の哺乳動物の***の核がそれらが斜角に付けた注入器の先端部を通過する時に 、標本流の平面中に核を方向付けるように強制する。蛍光信号は、***核の先端 面と平面から、９ｏと０度の光学検出器の各々により同時に集められる。分別の ために、試料流は超音波変換器により一様の微滴に分断される。適当な蛍光強度 を持つ単一の***を含有する微滴は荷電され、静電気的に採集容器に偏向される 。次いで、採取した***の核は卵生への微注入に使用される。***は尾部を持っ ていないので、通常の種付けには使用できない。

***の核が高度に凝縮され平板の形状であり、それが化学量論的な染色を困難に しそして染色した核が高い反射率を持つ原因になるので、流動細胞計測器と細胞 分別器を使用する、哺乳動物の***のＤＮＡ含有量の精確な測定は困難である。

これらの要因は、蛍光の放出が***核の端または薄い平面から完全に行われるこ とに寄与する。殆どの流動細胞計数器兼分別器では、試料流れの方向はレーザー 光線の進行方向と蛍光検出の光学軸に対して直角である。その結果として、蛍光 測定は、***の蛍光を励起しそし、て***の頭部に対して垂直である軸上で測定 する時に最も精確である［ピンケル他（２）、上記を参照コ。試料の比較的低い 流速で、流体力は無尾***を方向付けるのに使用され、その結果ＤＮＡ含有量は レーザー光線の正面を通過する***の６０ないし８０％の上で精確に測定できる 。この研究で使用される改善したＥｐｉｃｓ　Ｖ　系は、秒当り５０ないし１５ ０の***の速度で、殆どの種からの無尾の***の含有量を測定できる［ジョンソ ンとピンケル、上記を参照］。

無傷（無尾）の***は、生存能力があろうとなかろうと、無尾の***程には効果 的には方向付けできない［ジョンソン（２）、上記を参照］。しかし、９０度の 検出器は０度で測定されるべき適当に方向付けした無傷の***の群落を選別する のに使用できる。流体力学的方向付けは試みられていないので、試料流速は非常 に高くなり得て、これは無傷の***のたった１５ないし２０％のみが適当な方向 でレーザー光線を通過することを若干は補償する。

この発明では、全流量は秒当り約２５００個の無傷***である。

無傷のＸ−とＹ−担持***分画は、仕込んだ***の群から、秒当り、各々の型の ８０−９０個の***の速度で同時に分別される。

分別工程の間と種付けに先立つが分別後の貯蔵の間における無傷の***の高い生 存能力を維持することは勿論非常に大切なことである。

***の生存能力を維持することに包含される因子の中で、保護液体（ｓｈｅａｔ ｈ　ｆｌｕｉｄ）を染色しそして液体を採集する方法は特に重要であることが見 出された。

無毒性のＤＮＡ染料を選択しなければならない。好ましい染料は、ヘシスト（Ｈ ｏｅｓｃｈｓｔ）のビスベンズイミド（ｂｉｓｂｅｎｚｉｍｉｄｅ）　Ｈ８３３ ４２蛍光色素（ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ）　［カルバイオケムーポーリング社 （Ｃａｌｂｉｏｅｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｃｏ、）＋Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃ ＡＩである。我々の知る範囲では、この蛍光色素は、***に対して無毒性のただ 一つのＤＮＡ結合性の染料である。フルオロクロムの濃度は毒性を避けるために 最少にしなければならないが、しかし***を均一に染色し、ＸとＹ***のＤＮＡ における小さい差異を最少の変動で検出するのに充分でなければならない。適当 な濃度は、５μｇ　／　ｍ　１であることが見出されたが、これは４ないし６μ ｇ　／　ｍ　１で変動してよい。

***は染色がおこるのに充分な温度と時間で、そして生存能力を保持するのに充 分な緩い条件で、染料と共に保温しなければならない。３５℃で１時間にわたり 保温することは最も効果的であろう。保温時間は温度に従って調節されなければ ならず；それは３０℃には１．５時間、３９℃には１時間である。

細胞を分別するのに使用する保護液体（ｓｈｅａｔｈ　ｆｌｕｉｄ）は電導性か つ等張性でなければならない。ＬＯｍＭ燐酸塩食塩水は必要な電導性を付与し、 そして０．１％のウシ血清アルブミンは、代謝のためのタンパク質支持と***の ための粘度を与えることにより***の生存能力を高めるために添加される。保護 液体（ｓｈｅａｔｈ　ｆｌｕｉｄ）には、糖分と過剰の塩分があってはならない 。

分別において起こる***の希釈は細胞の生存能力を減少せしめる傾向がある。こ の問題を解決するために、***を、ｐＨを調節し界面活性剤を添加することによ り改質した試験用卵黄増量剤［グラハム他、Ｊ、　Ｄａｉｒｙ　Ｓｅｔ。

５５：　３７２（１９７２）　］中に採集しなければならない。増量剤の詳細は 実施例１に示した界面活性剤は、卵子への受精前の一連の変化（ｅａｐａｃｉａ ｔｉｏｎ）を促進すると信じられている。

ＤＮＡ含有量を確定し、外科的に種付けしたＸまたはＹ分別した***分画の子の 性を予測するために、分別した***の滴を超音波にかけて尾部を除き、染色し、 そして核はＸとＹ***の比率を予測するためにＤＮＡ含有量を再分析する。

下記の詳細の記述は、本発明の実施例としてウサギの***の分別を利用している が、殆どの哺乳動物の***はこれらの手順に従って効果的に分別できてもよいと 期待される。

この技術の熟練者は、僅かな改変は本発明の精神と範囲から垂線することなしに この手順の範囲の中でされてよいことを理解するであろう。

ウサギの***は採取され、希釈され、そして蛍光色素染料で染色される。***を 改変したＢｐｉｃｓ　Ｖ　流動細胞計測計／細胞分別器中で分別する。

分別した後、***をウサギの子宮内に外科的に種付けする。分別した無傷の*** での雌の外科的種付けにより得られた結果を表１に提示した。種付は後４０時間 の卵の回収は、染色した分別***、並びに染色してない非分別***がｉｎ　ｖｉ ｔｒｏでウサギの卵を受精（ｆｅｒｔｉｌｉｚｉｎｇ）させる能力があることを 示している。

種付けは、表現型の性に対する子の予測された性の比較値を決定するためにも行 われた。表［１のデータが示しているように、分離した無傷の***のＤＮＡ分析 に基づ（表現型の性の予測性は非常に高かった。種付けのために使用される分別 したＹ群の再分析は、***の８１％がＹを担っていることを示した。これらの種 付けからの子の性比は予測比と同様である。これらの値は、理論的な５０　：　 ５０の性比とは有意（Ｐ＜、００３）に異なる。

種付けに使用した分別したＸ担持***群の再分析は、８６％がＸ担持の、そして １４％がＸ担持の***であることを示した。これらの種付は物からの子の表現型 性は９４％が雌性であり、この値は理論値５０：５０（Ｐ＜、０００３）から異 なっていた。

種付けを、種付は直前に再併合した分別ＸとＹ群（再併合したＸとＹ群）で行っ た。仮定は、再併合した試料におけるＸとＹの比率は同等（５０：５０）である というもであった。種付けから得られた表現型の性は５７％が雌であり４３％が 雄であって（表ＩＩ）　、これは理論的な性比（５０：５０）からは有意（Ｐ＝ 、４０）に異ならなかった。

分別したＸ担持または分別したＸ担持***で種付けした雌の出産した雌の表現型 性比は、未処理の***から期待された理論的（５０：５０）の性比とは異なる（ ＸについてはＰ＜、０００２そしてＹについてはｐ＜、００１）。

胎児の死亡率は、分別した無傷の***で種付けした雌の場合には顕著である。合 理的に高い受精（ｆｅｒｔｉｌｆｚａ−ｔｉｏｎ）率（表■）では、８０％近く の出産率とこの年代と種の鱈から一腹約６匹の大きさを期待しただろう。しかし 、３件の処理群を通じての出産率は平均２８％であって、−腹平均３．９匹の大 きさであった。胎児死亡率が明らかに高いことの原因は、ＤＮＡに結合した蛍光 色素および／またはＤＮＡに結合した蛍光色素を励起するレーザー光線の影響に よると考えられる。

以前の研究は、ハムスター卵生に微注入した分別したハタネズミの***核は、精 子生殖核に発達する間に染色体の分解を示している［リバス他、Ｍｕｔ、　Ｒｅ ｓ、　１８２：　２６５（１９８７）］　、これらの***は超音波処理され、染 色され、分別され、そして微注入されていて、この研究で利用される染色と分別 よりも幾分か厳しい処理なのであろう。

私は、ＤＮＡはＸ−およびＹ−担持***の間の区分標識として使用できるので、 分別したＸ−およびＹ−担持***群からの子の性を精確に予測するのに使用でき ること：そして流動分別が、子の出産のために適当な生存能力のあるＸ−および Ｙ−担持***群を分別するのに効果的な方法であることを示した。

下記の実施例は、本発明を更に説明することだけを意図したものであり、請求の 範囲によって定義されている発明の範囲を限定することを意図するものではない 。

実施例１ ***は、人工膝を使用して、混合種の成熟雄から採取した。***の濃度は赤血球 計測器により分析した。***を、ＴｒｉＳ緩衝液、　ｐＨ６，９で希釈して、１ ０　ｘ　１０＠／ｍｌになるようにした。Ｂｉｓｂｅｎｚｉｍｉｄｅ　Ｈ３３３ ４２蛍光色素を５μｇ　／　ｍ　１の濃度で添加した。試料を３５℃で１時間保 温した。無傷の***を、改変したＥｐｉｃｓ　Ｖ　流動細胞計測計／細胞分別器 りで分別した。染色した無傷の***は、２０００ｍＷで操作する　５−ワット　 ９０−５イノヴｙ　（［ｎｎｏｖａ）アルゴン−イオンレーザ−の紫外線（３６ １および３６４　ｎｍ）中で励起した。データを２５６−ヒストグラムとして集 めた。

保護液体（ｓｈｅａｔｈ　ｆｌｕｉｄ）は、０．１％のウシ血清アルブミン（Ｂ ＳＡ）を含有する１０ｍＭ燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）であった。***を試験用 卵黄増量剤中に分別した。

増量剤の組成は、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−メチル−２−アミノエタン スルホン酸、２．１６ｇ；トリスヒドロキシメチルアミノエタン、０．５１ｇ； デキストロース、０．１ｇ；ストレプトマイシン硫酸塩、０．３１ｇ、ペニシリ ンＧ、０．０８ｇ；卵黄、１２．５ｍ　１　；　Ｂｑｕｅｘ　ＳＴＭ（Ｎｏｖａ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ａｌｅｓ、５ｃｉｔｕａｔｏ、ＭＡ）。

０．５％；および蒸留水、５０ｍ１であった。この混合物を遠心分離し、上澄液 だけを使用した。分別した***を１時間にわたり室温で保温することにより濃縮 した。

その後、より薄めた部分を除き、残りを１ないし４時間後に種付けのために使用 した。

実施例２ 成熟したニューシーラント・ホワイトの雌に、注射１０時間後に***を誘発する と期待されるヒト・コリオニック・ゴナドトロピン（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ　ｇｏ ｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）（ＨＯＧ）の１５０国際単位を注射した。ＨＯＧで処理 した７時間後に、アセプロマシンを含有するケタミン塩酸塩による注射により外 科的に準備しモしてハロタンと酸素雰囲気で麻酔した。子宮を中央線切開により 露出し、そして分別したまたは未分別の***の１００μｍを、２１−規格（２１ −ｇａｕｇｅ）針を通して各々子宮の嘱戦管の前方先端部の内部に入れる。ウサ ギの面倒を見るに当たっては、標準管理法を採用した。これらの雌を種付け４０ 時間後に殺した；子宮を洗浄して回収した卵を評価した。回収した受精（ｆｅｒ ｔｉＨｚｅｄ）卵を桑実胚として分類した。これらの実験の結果を表１に示す。

実施例３ 表ＩＩは、子宮ＩＪ賊管の先端中への種付けの結果二子を生んだ雌の数と予測し た性と比較した子の表現型の性の数を示す。子の予測した性は、ＤＮＡの相対的 含有量を定量するために分別した無傷の***の再分析に基づいた。　再分析のた めには、分別した***を１０秒間超音波処理し、そして１５，０００ｇで遠心分 離し、上澄液を捨て、そしてペレットを９μＭのビスベンズイミドＨ３３３４２ 中に再けん濁した。子の表現型の性は出産直後に決め、そして１０週令になった 時に確認した。再併合したＸとＹは、種付けの直前に、分別してあったＸとＹの ***群を再併合したものである。

実施例４ 実施例１．２および３の方法を使用して、生存能力のあるブタの***を、生存能 力のあるＸとＹの染色体担持群に分別する。外科的に種付けした雄ブタ***から の２腹　（１８匹のブタ）は、Ｘ−分別した***からは８８％の雌、そしてＹ− 分別した***からは６７％の雄を産出した。

前出の詳細な記述は、説明の方法により主に与えられ、そして改変と変形は本発 明の精神と範囲から垂線することなしにその中でなされたものと理解される。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成３年１１月８日

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物の子の性を前選択する方法であって；ａ）雄の哺乳動物から***を 採集し； ｂ）生存細胞中のＤＮＡを選択的に染色する能力のある蛍光染料でもって該*** を染色し；ｃ）該***を生存能力を支持する保護液体（ｓｈｅａｔｈｆｌｕｉｄ ）で希釈し；ｄ）該染色したＤＮＡのための検出手段と細胞分別手段に、該*** を含有する該保護液体（ｓｈｅａｔｈｆｌｕｉｄ）を通過せしめ； ｅ）該細胞分別手段により、子の所望の性を表現するだろう該***を選別し； ｆ）該選別した***を生存能力を支持する採集液体中に採集し； ｇ）該採集液体中の該分別した***で、該雄の哺乳動物と同種の雌の哺乳動物に 種付けすることを包含する方法。
2. ２．該哺乳動物がウサギである請求項１記載の方法。
3. ３．該哺乳動物がブタである請求項１記載の方法。
4. ４．該染料がビスベンズイミドＨ３３３４２蛍光色素（ｂｉｓｂｅｎｚｉｍｉｄ ｅＨ３３３４２ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｍｅ）である請求項１記載の方法。
5. ５．該保護液体（ｓｈｅａｔｈｆｌｕｉｄ）が、０．１％のウシ血清アルブミン を含有する燐酸塩緩衝食塩水溶液である請求項１記載の方法。
6. ６．該採集液体が改変した試験用卵黄増量剤である請求項１記載の方法。