JPH04501362A - 多数の混合オリゴヌクレオチドプローブを用いたdna塩基配列決定法 - Google Patents
多数の混合オリゴヌクレオチドプローブを用いたdna塩基配列決定法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
多数の混合オリゴヌクレオチドプローブを用いたDNADNA塩基配列を決定し
得ることは、遺伝子の機能やその制御を理解し、分子生物学の基本的技術の多(
を応用していく上で極めて重要である。天然のDNAは、2つの線状ポリマーす
なわちヌクレオチド鎖から成る。各々の鎖は、ホスホジエステル結合によって連
結されたヌクレオシド鎖である。2本の鎖は、当該2本の鎖のヌクレオチドの相
補的な塩基の間での水素結合により互に逆平行方向に固定されている:デオキシ
アデノシン(A)はチミジン(T)と、また、デオキシグアノシン(G)はデオ
キシシチジン(C)と対をつくる。
現在、DNA塩基配列決定には2つの基本的な方法が存在するニジデオキシチェ
ーンターミネーション法、例えば、Sanger (サンガー)ら、な匹、旦8
配封、虱、 Vol、74. pgs、5463−5467(1977)および
化学的切断法、例えばMaxam (マクサム)ら、江匹、胆■、閃回、ジシェ
、 Vol、74. pgs、560−564(1977)である。チェーンタ
ーミネーション法は、幾つかの点で改良され、そして現在使用できる自動DNA
塩基配列決定機械の全ての基礎となっている、例えばSanger (サンガー
)ら、L町すエ 旦(1985); Sm1th et at、Nature、
Vol、 321. pgs、 674−679 (1987); Prob
er(プロパー)ら、 5cience、 Vol、 23B。
Vol、 155.pgs、 51−334 (1987)、およびChurc
h(チャーチ)ら、5cience、 Vol、 240. pgS、185−
188 (1988)。
チェーンターミネーション法及び化学的切断法の両者とも、−組またはそれ以上
の標識されたDNA断片を作成し、その際それぞれの断片は共通の起源を有しか
つ既知の塩基で終結するということが必要である。次いで一組またはそれ以上の
DNA断片は塩基配列の情報を得るために大きさに従って分離されなければなら
ない。両方法とも、DNA断片は高分解能のゲル電気泳動によって分離される。
残念ながらこのステップにより、−回の操作で配列を決定できるDNA鎖の大き
さが著しい制約を受ける。非自動の塩基配列決定法では最適条件下で約500塩
基までのDNA鎖を、そして自動塩基配列決定法では最適条件下で約300塩基
までのDNA鎖を決定すこの制約は、ヒト染色体ゲノムの全てまたは大部分の塩
基配列を決定するといった植物または動物のゲノムの大規模な領域の分子構造解
析を目的とした医学的、科学的そして企業的な多くの重要なプロジェクトを遂行
する。logy (上文にて引用)。
DNA塩基配列決定に加えて核酸ハイブリダイゼーションもまた分子生物学的に
おける多くの技術の中の極めて重要な要素である、例えばHaies(ヘイムス
)ら+ eds。
、“核酸ハイブリダイゼーション:実際のアプローチ”(Nucleic Ac
1d Hybridization: A PracticalApproac
h) (IRLブレス、 Washington、 D、C,、1985)。
特に、ハイブリダイゼーションの技法は、巨大なライブラリーから頻度の低いc
DNAやゲノミッククローンを、混合オリゴヌクレオチドプローブ、例えばWa
llace(ワラス)ら、 Nucleic Ac1ds Re5earch、
Vol、6. pgs。
3543−3557 (1979)を用いて、または異種間のプローブ、例えば
Gray (プレイ)ら、 Proc、 Natl、 Acad、 Sci、、
V。
1.80. pgs、5842−5846 (1983)を用いて選択するのに
用いられてきた。核酸ハイブリダイゼーションはまた、塩基配列間の相同性の程
度を決定するために、例えば、Kafatos(カフ7トス)ら、 Nucle
ic Ac1ds Re5earch、 V。
1、7. pgs、 1541−1552 (1979) 、およびコンセンサ
ス塩基配列を同定するために、例えば、01iphant(オリファン)ら、
Meth、 Enzymol、、 Vol、155. pgs、 568−58
2 (1987)、同様に用いられてきた。これらの応用の全てにおいて暗に示
されていることは、既知のプローブの塩基配列は未知の標的配列についての情報
を含有しているという考えである。この考えを標的の核酸の詳細な塩基配列情報
を得るために利用することは明らかに今まで行なわれなかった。現在のDNA塩
基配列決定法の制約を考慮すると、(1)似た大きさのDNA断片をゲル電気泳
動で分離する必要のなく、(2)−回の操作で非常に長いDNA*の塩基配列を
決定することが可能であり、そして(3)自動化が可能である、別の塩基配列決
定法が開発されれば学会あるいは産業界にとって有利であろう。
発明の開示
本発明はDNAあるいはRNA分子の塩基配列を、複数の混合オリゴヌクレオチ
ドプローブを用いて決定する方法を開発することを目的とする。塩基配列の情報
は、一連のハイブリダイゼーションを行い、塩基配列を決定するべきRNAまた
はDNA中にプローブの配列の相補鎖が各プローブについて何回現れるかを決定
することによって得られる。RNAあるいはDNAの塩基配列はこの情報とプロ
ーブの塩基配列の知識から再構築される。
塩基配列を決定すべき核酸を本明細書において標的配列と呼称する。
本発明に用いられる混合オリゴヌクレオチドプローブは、そのメンバーの塩基配
列が標的配列中のあらかじめ配列決定された長さのサブ塩基配列に相補的な全て
の可能な塩基配列を包含するセットから選ばれる。セットから選ばれた一つまた
は複数のプローブが既知の量の標的配列と結合するように、例えばニトロセルロ
ースフィルターあるいは類似した物質上で、実質的に、完全に相補的なプローブ
のみが標的配列とハイブリダイゼーションできる条件下で一連の各々のハイブリ
ダイゼーションを個別に行う。対をつくらない塩基を含むプローブは実質的に例
えば洗浄により取除かれ、そして標的配列にハイブリダイゼーションしたまま残
った完全に相補的なプローブの量を決定する。
本発明の一実施態様において、1セツトのプローブは4つのサブセットを含む。
4つのサブセットのそれぞれは、プローブの大きさくあらかじめ決定されている
)に関して、4つの塩基のうちの一つについての全ての可能な配列に相当するプ
ローブを含む。例えば、第一のサブセットはGを含む全ての可能な配列に相当す
るプローブを含みうる;第二のサブセットはTを含む全ての可能な配列に相当す
るプローブを含みうる:そしてCおよびAについても同様である。もし、プロー
ブがそれぞれ8塩基の長さを持つならば、アデノシンサブセットに含まれるプロ
ーブの一つは次のように表わされ得る:のうちのどれが占めてもよいことを意味
する。故に上記のプローブはlXlX3X3XIX3X3X1=81の重複度、
又は縮退度を持つことになる。どのサブセットが考慮されているのかが状況から
明らかなときには上記の記述をAAOOAOOA、ここでAはデオキシアデノシ
ンを表しモして0はデオキシアデノシンが不在であることを表す、と単純化する
。
好ましくは、塩基対合の特性からプローブの複数性が減少させられるように塩基
類縁体をオリゴヌクレオチドプローブに用いる。例えば式■に示されたプローブ
では、デオキシイノシン(I)はAおよびCとはほぼ同じくらい強い塩基対を形
成するが、GあるいはTとは弱いまたは不安定な塩基対を形成するのみであるた
め、デオキシイノシンはプローブ中のGとTに置き換えることかで同等であるが
ずっと低い重複度(すなわち、たった16)を持つプローブが次のように書き表
され得る;一般に、4つの天然の塩基のうち2つまたは3つと強い塩基対(すな
わち結合エネルギーにおいてもとの塩基対とほぼ同等の)を形成しそして決った
塩基(下文中で定義される)の相補塩基と弱いまたは不安定な塩基対を組む塩基
類縁体が好まれる。このような塩基類縁体は本明細書中で重複度減少類縁体と呼
ぶ。
全てのプローブが同じ長さであることは必須ではないが、その長さは既知であり
そしてその塩基配列はあらかじめ決定されていることが重要である。一般に、プ
ローブはあらかじめ決められた数の位置で既知の塩基(必ずしも同じ種類である
必要はない)で、例えば式IのAと固定され、そして残りの位置はあらかじめ決
められたセット、例えば式lにおけるようにTSG、およびC1または式■にお
けるように!およびCから任意に選ばれた塩基によって各々占められるであろう
。プローブ中の塩基対が縮退していない位置、すなわち一つの天然の塩基のみを
持つ位置を本明細書中では固定位置と呼ぶ。固定位置を占めている塩基を本明細
書中では固定塩基と呼ぶ。例えば、式1及び■のプローブにおける固定塩基は、
プローブ3′端から位置1. 2. 5および8のデオキシアデノシンである。
一般に本発明におけるセットおよび/またはサブセットは、それぞれ、プローブ
の長さより短いまたはに等しい長さの複数の固定および非固定の位置の各々の順
列の配列と同等の固定および非固定の位置の配列を持つ少なくとも1つのプロー
ブを含む。すなわち、本発明の重要な点は、固定および非固定の位置の複数の組
合せの各々の固定および非固定の位置の全ての可能な順列に対応したサブ塩基配
列(これはプローブ全体の長さまでにおよぶ)を集合的に含むということであり
、その際、その複数の組合せは、ゼロからすべての固定位置を含む組合せを包含
する。例えば、本発明におけるプローブのサブセットの一つを考えてみよう。こ
のサブセットは8量体のプローブからなり、その固定位置はデオキシアデノシン
のみを含みかつその最初の(すなわち最も3′側の)位置が固定されている。式
■および■のプローブはそのようなサブセットの一員である。そのようなサブセ
ットの中には、固定位置を有さない(そのような順列は1つ=AOOOOOOO
)、固定位置1つ(そのような順列は7つ、例えばAOOOAO00) 、固定
位置2つ(そのような順列は21個、例えばAO0AAO00) 、固定位置3
つ(そのような順列は35個、例えばAOOOOAAA) 、固定位置4つ(そ
のような順列は35個、例えばAOAAAAOO) 、固定位置5つ(そのよう
な順列は21個、例えばAAAooAAA) 、固定位置6つ(そのような順列
は7つ、例えばAAAAOAAA)、および固定位置7つ(そのような順列は1
つ:AAAAAAAA)を有するサブ塩基配列に対して固定及び非固定位置の可
能な全ての順列の各々に相当する位置2から8が固定及び非固定位置となってい
るサブ塩基配列を持つ少なくとも一つのプローブが存在する。故にこのサブセッ
トは少なくとも1+7+21+35+35+21 +7+1=128個の要素を
持つ。
標的塩基配列中に一つあるいは複数のあらかじめ決められた既知の塩基配列の領
域が存在すると、標的塩基配列の再構築が容易になる。従って、望ましい実施態
様においては、標的塩基配列はひとつあるいは複数の既知の塩基配列の領域を含
み、その際、これらの領域を本明細書において、既知配列領域と呼ぶ。更に望ま
しくは、標的配列が第1と第2の既知配列領域を含み、その際第−および第二の
既知配列領域は未知の塩基配列を含む標的配列の領域の両端に位置する。この未
知の塩基配列を本明細書において、未知配列領域と呼ぶ。もつとも望ましくは、
第1と第2の既知配列領域は、少な(とも最長のプローブ配列の長さである。
■、プローブの合成と標識
本発明に用いる混合オリゴヌクレオチドプローブは自動DNA合成機、例えば、
アプライドバイオシステム(Foster C1tY、CA) 381 Aまた
は380B型、またはその類似の機器を用いて合成するのが望ましい。例えば、
Wallace (ワラス)ら、 Nucleic Ac1ds Re5ear
ch。
Vol、6. pgs、 3543−3557 (1,979)、および01i
phant (オリファン)ら、 Meth、 Enazymol、、 Vol
、155. pgS 568−582(1987)によって開示されているよう
に、非固定位置で適当なヌクレオチド前駆体の混合物を、伸長中のオリゴヌクレ
オチド鎖と反応させてその位置に異なった塩基を有する複数のオリゴヌクレオチ
ドを同時に合成する。プローブは現在使われているどの化学、例えばフォスファ
ahedron Letters、 Vol、 22.pgs、1859−18
62 (1981);Caruthers(カルセアス)ら、アメリカ合衆国特
許第4,415、723号、同第4.458.066号および同第4.500.
707号:ホスホトリエステル法、 Itakura(イタクラ)、アメリカ合
衆国特許第4.401.796号;またはヒドロテンホスホネート法、例えばF
roehler (フロエラー)ら、 Nucleie Ac1ds Re5e
arch、 Vol、 14. I)gs、 5399−5407 (1986
) ;あるいはそれらの類似の方法を経ても合成され得る。いったん合成された
ら、オリゴヌクレオチドはよく知られている技法、通常HPLCあるいはゲル電
気泳動により標識のために精製される、例えばApplied Biosyst
emsDNA 5ynthesizer Users Bulletin、 l
5sueNo、13−Revised (April 1.1987)。
プローブの長さの選択はこの発明の重要な一面である。(1)標的配列に完全に
相補的なプローブを優先的にハイブリダイズするようにハイブリダイゼーション
条件を操作できるその容易さ、(2)標的配列にハイブリダイズした完全に相補
的なプローブのおおよその総量を区別することができること(例えばプローブが
比較的長くて標的に完全に相補的なプローブ配列が現われる確率が低いならば、
標的に1. 2または3コピーのプローブが存在することを推定するために(例
えば)10.20゜30ピコモルといった範囲のプローブの量を区別する必要が
ある;もし、プローブが比較的短くて標的配列に完全に相補的なプローブ配列が
現われる頻度が高いならば、標的上に11.12.あるいは13コピーのプロー
ブが存在するかどうかを推定するために(例えば)110.120、あるいは1
30ピコモルの範囲内のプローブの量を区別する必要がある;後者の量の全体に
占める比の間の差は小さいため、推定されるコピー数に対する信頼度は低いかも
しれない”); (3)プローブの重複度は有意なコツト値でのハイブリダイゼ
ーションを可能にしているかどうか(より長いプローブはより短いものより重複
度が高く、ハイブリダイゼーションのためのコツト値も高くなる。より短いプロ
ーブについてはその逆が成立つ’); (4)各タイプのプローブを用いて別々
にハイブリダイゼーションを行うことの実用性(上述のようにより長いプローブ
はより大きなプローブのセットを生むことになる);そして(5)塩基配列の再
構築の問題に取り組めること(より短いプローブを用いるとこの様な傾向がでる
のであるが、標的配列上に存在するそれぞれのプローブタイプのコピー数が増え
るほど再構築の問題はより困難になる)を含むいくつかの因子が、与えられた適
用例において長さの選択に影響を与える。7から11塩基の範囲のプローブの大
きさが望ましい。更に望ましくはプローブの大きさは8〜1o塩基までの範囲に
あり、そして最も望ましくはプローブの大きさは8から9塩基の範囲にある。
プローブの多重度あるいは縮退を減少するために縮退減少類縁体をプローブの非
固定位置に使用するのが望ましい。この目的のために多くの合成あるいは天然ヌ
クレオシドおよびヌクレオチドの類縁体が手に入る、例えば5cheit (シ
ャイト)、Nucleotide Analogs (rヌクレオチド類縁体J
) (John Wiley & 5ons、 New York、 198
0)。例えば、縮退減少類縁体には、非固定位置でGおよびTを置換するために
シトシンまたはアデノシンプローブにおいて使用するためのデオキシイノシン、
非固定位置でAおよびTを置換するためにシトシンまたはグアノシンプローブに
おいて使用するための2−アミノプリン、およびTおよびCを置換するためにア
デノシンまたはグアノシンプローブにおいて使用するためのN4−メトキシデオ
キシシチジン、N4−アミノデオキシシチジン、または5−フルオロデオキシシ
ラリジンが含まれる。
オリゴヌクレオチドプローブ中でのデオキシイノシンの使用は、Martin
(7−チン)ら(上皇にて引用) ;5eela(セータ)ら、 Nuclei
c Ac1ds Re5earch、 Vol、 14. pgs、 1825
−1844 (1986); Kawase (カヮセ)ら、 Nucleic
Acids Re5earch、 Vol、 14. pgs、7727−77
37 (1986);0htsuka (オオッカ)ら、 J、Biol、 C
hem、、 Vol、260゜pgs、 2605−2608 (1985);
およびTakahashi(タカハシ)ら、 Proc、 Natl、 Aca
d、 Sci、、 Vol、 82. pgs、 1931−1935(198
5)によって開示されている。自動DNA合成のためのデオキシイノシンホスホ
ラミダイトの前駆体は例えばアプライドバイオシステム(フォスターシティ、カ
リフォルニア)から購入することができる。N4−メトキシシチジンの合成とそ
のオリゴヌクレオチドプローブへの導入は、Anand(アナンド)ら、Nuc
leic Ac1ds Re5earch、 Vol、 15. pgs、 8
167−8176 (1987)によって開示されている。2−アミノプリンの
合成とそのオリゴヌクレオチドプローブへの導入は、Er1tja (エリトヤ
)ら、 Nucleic Ac1ds Re5earch、 Vol、 14.
pgs、 5869−5884(1986)によって開示されている。5−フ
ルオロデオキシウリジンの合成とそのオリゴヌクレオチドプローブへの導入は、
Habener(ハベナー)ら、 Proc、 Natl、 Acad、 Sc
i、、 Vol、85. pgS、 1735−1739 (1988)によっ
て開示されている。そしてN4−アミノデオキシシチジンの調製は、Negis
hi(ネギシ)ら、Nucleic Acods Re5earch。
Vol、 11. pgs、 5223−5233 (1983)によって開示
されている。
本発明においては、ヌクレオシド類縁体もまた、種々の相補的塩基間の結合エネ
ルギーの差を減少させるために用いらる。特に2−アミノアデニンは、プローブ
または標的配列中のチミンを置き換えてA−Tヌクレオシド対とG−Tヌクレオ
シド対の間の結合エネルギーの差を縮めることができる、例えばKirnos
(キルノス)ら(主文中にて引用)、 Chollet (コレット)ら(主文
中にて引アデニンを含むオリゴヌクレオチドの合成方法は、Chollet(コ
レット)ら(主文中にて引用) ;Gaffney(ガフニー)ら、 Tetr
ah封匹ムVo1.40. pgs、 3−13 (1984)、およびCho
llet(:)レット)ら、Chemica 5cripta、Vol、26、
pgs、 37−40 (1986)によって開示されている。同様にして、
2−アミノ−2゛−デオキシアデノシンは、A−T塩基対が生じる位置での結合
エネルギーを増加させるためにデオキシアデノシンを置き換えることができる、
いくつかの実施態様においては、縮過度のより高いプローブを、標的配列につい
て、全体として同じ情報を得ることのできるいくつかの縮退度のより少ないプロ
ーブで置き換えるのが望ましいかもしれない。例えば、9量体プローブAOOO
OOOOOを考えてみる。このプローブは重複度のより少ない3つのプローブA
0000000C,AOOOOOOOGおよびAO000000Tで置き換えら
れ得る。故に、2回余分にハイブリダイゼーションを行うことによってセット中
の最も重複度の高いプローブの重複度を256から128に減少できる(非固定
位置にはデオキシイノシンを使用すると仮定して)。
本発明におけるオリゴヌクレオチドは、プローブを形成するために、直接あるい
は間接に放射性物質、蛍光性物質、高電子密度の物質あるいはその類縁体を付加
するという方法を包含する種々の方法で標識され得る。プローブの中のそれぞれ
の配列が同様の強度のシグナルを産生ずることができ、その結果プローブ数の定
量が可能であることのみが重要である。反応性の高い反応基でオリゴヌクレオチ
ドをその誘導体に変化させ標識を付加する幾つかの方法が摘要可能である、例え
ば、Conolly(コノ131−3139 (1987); Gibson(
ギブジン)ら、Nucleic Ac15、 pgS。4837−4848 (
1987);およびMathews(マクュース)ら、 Anal、 Bioc
hem9. Vol、169. pgs、1−25 (1988))。
ひとつの望ましい実施態様について、本発明におけるオリゴヌクレオチドは標準
的な方法、例えばMaxim (マクサム)およびGi 1bert(ギルバー
ト)、Meth、 Enzymol。
、 Vol、 65. pgS、 499−560 (1980)ニよッテ、s
tPで放射線で標識される。望ましくは0Pで標識された本発明におけるプロー
ブは、約1〜10ng/m1.更に望ましくは約1〜5ng/mlの濃度範囲で
ニトロセルロース、ナイロン、あるいはその類縁体に結合した標的DNAに適用
される。プローブの比活性は約1〜5X10’cpm/mlの範囲内にあること
が望ましい。
■、ハイブリダイゼーション
プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションは、不一致のプローブ配列およ
び非特異的に結合したプローブ配列をプローブ配列と標的配列の間に完全に相補
対を作って形成される2本鎖から分離させることが出来るような方法で行われる
。通常、この分離は洗浄の段階で行われる。望ましくはハイブリダイゼーション
の第1ステツプは洗浄やその他の処理中に標的配列が失われる可能性を最小にす
るために標的配列を固定する。標的配列を固定する方法は、標的の長さ、標的の
複製をつくるのに用いられた方法、およびそれに類することなどいくつかの因子
に依存して選ばれる。望ましくは、標的配列はそれをニトロセルロース、ナイロ
ン−66、またはその類縁体、あるいはミクロスフェア−誘導体のような基質ま
たは固相支持体に連結することによって固定される、例既知量の一本鎖あるいは
二本鎖の標的配列の複製が基質あるいは固相支持体に固定される。本明細書で用
いられる「既知量」とはそれを基にして完全な対を形成するプローブの全体量を
決定し得る量のことを意味する。いくつかの実施態様においてはこれは標的配列
の既知のグラム数またはモル数を意味する。別の実施態様においては、プローブ
の全体量に相当するシグナルが複数個の支持体からのシグナルを比較することに
より、あるいは特別に供給された標準のシグナルを比較することにより識別でき
るように複数個の固相支持体にのせられた同量の標的配列のことを意味すること
もある。好ましくは、固定手段は、標的配列により最大許容量まで荷重され、そ
の結果ハイブリダイゼーション後に最大のシグナルが得られる。標的配列は2本
鎖の形で合成され、変性され、続いて、望ましくはニトロセルロース、ジンスク
リーン、あるいはその類縁体である固相支持体である固体手段に適用されること
ができる。標的配列が2本鎖の形で調製される場合には、好ましくは、そのクロ
ーニングベクターから平滑末端を生じる、ひとつまたは複数のエンドヌクレアー
ゼ、例えばEcoRV、Alu 1.Ba I I切り出される。この場合には
、コーディングすなわちセンスおよび非コーディングすなわちアンチセンスの両
鏡が同時に配列決定される。塩基配列の相補性のために、再構築の問題は一本の
鎖の場合より難しいということはない。
二本鎖の標的配列を調製するのに適したベクターはpUC系のベクターである、
例えばYanisch−Perron (ヤニッシューペロン)ら、 Gene
、 Vol、 33. pgs、 103−119 (1985)。これらのベ
クターはポリリンカーの領域に特異的な制限酵素切断部位を加えることにより容
易に改変される。新しい特異的な制限酵素切断の部位は、切断の後、平滑末端を
残す制限酵素の中から選ばれる。例えば、そのような部位を含んだ化学合成した
断片をpUc18あるいはpUc19のHindlI[とEcoRI切断部位の
間に挿入することができる。これらのベクターにおいて列の前駆体(すなわち未
知配列領域)はすでに存在するポリリンカ一部位、例えばBamHI切断部位に
挿入され得る:ベクターを増幅し、単離することができる;そして標的配列は平
滑末端を生じる制限酵素により切り出され得る。そして未知配列領域と共に切り
出されたポリリンカー領域の断片は、標的配列の既知配列領域となるDNAをニ
トロセルロースフィルターに固定するのに好んで用いられる方法は、本質的には
、Kafatos(カファトス)らによって記述されたものである(下車中にて
引用)。1ミリメーター四方のフィルターあたり約1μgまでの標的配列がのせ
られる。添加に先立ってDNAは望ましくは0.3から0.4Nの水酸化ナトリ
ウム中で約10分間変性され、その後、同容量の冷水で、または随意には冷却し
た2M酢酸アンモニウムで冷やされ、約16μg/mlの濃度にされる。既知量
の変性した標的を、析出した液体の容量を注意深く調節しながらフィルター上に
スポットする。全てのサンプルがスポットされた後(約1.5分)、フィルター
を場合により約o、02〜0.2N水酸化ナトリウムを含む1M酢酸アンモニウ
ム、pH7,8〜9゜0を一滴垂らして、洗浄することも可能である。フィルタ
ーを例えば約200m1の4XSSC(下車中で定義する)で洗浄することもで
きる。フィルターを風乾し、2×デンハルト溶液中(下車中で定義する)で少な
くとも1時間浸とうし、水を切りそして再び風乾し、そして真空中80℃で約2
時間ベークする。
プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションは通常三段階二ブレハイブリダ
イゼーション処理、プローブの添加、および洗浄を含む。プレハイブリダイゼー
ション処理の目的は、プローブの、固定手段および非標的の核酸への非特異的な
結合を減少させることである。これは通常、可能な非特異的な結合部位を、たん
ばく質、例えば血清アルブミン(デンハルト溶液の主要な内容物)のような阻害
物質でブロックすることにより達成される。ニトロセルロースあるいはナイロン
−66(例えばジンスクリーン、ナイトラン、あるいはその類縁体)に固定され
た標的配列の場合、プレハイブリダイゼーション処理は、5〜IOXデンハルト
溶液で、弱い界面活性剤、例えば0.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を
好ましくは含む2〜6XSSCで、約25℃から60”Cの範囲内の温度で15
分から1時間処理することを含み得る。Biochem、Biophys、Re
s、Commun、、 Vol、23. pgS、 641−645 (196
6)に開示されているデンハルト溶液は、lOXの濃度で0.2%のウシ血清ア
ルブミン、0゜2%のポリビニルピロリドン、および0.2%のフィルコールか
らなる。もう一つの、ハイブリダイゼーションの技術には標準的な溶液であるS
SCは、l×の濃度で、pH7,0で0.15Mの塩化ナトリウム、0.015
Mのクエン酸ナトリウムからなる。望ましい処理の時間、温度、そして組成はそ
れぞれの態様によって異なるプローブは、固定されたDNAに対して、プレハイ
ブリダイゼーション溶液、例えば5〜IOXデンハルト溶液と実質的に同等の溶
液中、2〜6XSSCおよび穏やかな界面活性剤、例えば0. 5%SDSで、
約1〜10ng/mlの濃度の範囲で適用されるのが望ましい。更に望ましくは
、プローブの濃度は約1〜5ng/mlの範囲にある。ハイブリダイゼーション
はプローブと標的の間の期待される50%解離温度、T、より10〜20℃低い
温度でなされるのが望ましい。すなわち、全ての完全に相補的なプローブの高い
割合、例えば80〜90%以上が安定な二本鎖を形成する温度が選ばれる。8量
体のプローブでは望ましいハイブリダイゼーションの温度は約10〜18℃の範
囲内にある。ハイブリダイゼーションの時間は望ましくは約3〜16時間の範囲
内である。高度に縮退しているプローブ、例えばOAOOOO00内の特定の配
列の有効濃度は、縮退層の低いプローブ、例えばAAAOAAAAよりかなり低
いため、縮退層の異なるプローブには異なるハイブリダイゼーションの時間が選
ばれ得る。このように、縮退層のより高いプローブが完全に相補的な配列の充分
な結合を達成するためには、より高いCot値(これは通常より長いハイブリダ
イゼーションの時間を意味する)が要求され得る。
望ましくは、全てのプローブに対して、単一のハイブリダイゼーションの時間が
選択され、これはもっとも縮退しているプローブのハイブリダイゼーションのキ
ネティクスによって定められる。オートラジオグラフィーの後、相対的なシグナ
ルを比較するとき、プローブの縮退層か重要となる。より高い縮退層を持つプロ
ーブはより低い縮退層を持つプローブより低いシグナルを与えるだろう。故に、
相対的なシグナルは、同等の縮退層を持つプローブに由来するオートラジオグラ
フの間でのみ比較するべきである。それぞれのプローブのための、または少なく
ともそれぞれの縮退層のクラスのためのポジティブおよびネガティブコントロー
ルを同時に実施することにより、1回の比較が援助される。
非特異的に結合したり、誤って対を形成しているプローブ配列を洗浄によって取
除くことは本発明の重要な側面である。温度および洗浄の時間は、最大量の非特
異的に結合したプローブ配列、および誤って対を形成したプローブ配列を除去し
、一方、同時に標的と完全な相補二本鎖を形成しているプローブ配列の最大数を
維持するように選ばれる。プローブの長さと塩基組成は、適当な洗浄温度を決定
するにあたって2つの重要な因子である。
望ましい範囲内である、7〜11塩基の長さのプローブにおいては、完全に対を
形成しているプローブ配列と誤った対を形成しているプルーブ配列の間の2本鎖
の安定性の違いは極めて大きく、それぞれのT、はおそらく10℃かまたはそれ
以上も異なっている。故に、洗浄温度を調節することにより誤って対を形成した
ものを選択的に除去することは困難ではない。一方、組成の違い、例えばG−C
含量対A−T含量はプローブのT、に広い巾を与えることになり、洗浄温度を低
くすると非特異的に結合したプローブを除去する能力が減少する。従って、洗浄
温度は非特異結合プローブを除去するために最高でなければならないが、比較的
高いA−T含量を持つ完全に対を作ったプローブまでも選択的に除去してしまう
ほど高くはできない。
プローブ結合の配列に特異的な差異を最小にするため、種々の塩基対の結合エネ
ルギーの差を最小にするようにハイブリダイゼーションの条件および/またはヌ
クレオチド類縁体を選択するのが望ましい。そのような最小化は、完全相補対を
形成するプローブを検出し得る感度を増加させるため、望ましい。このような最
小化は、温度が上昇していく際プローブ/標的二本鎖から一末鎖ブロープおよび
一本鎖標的への転移をずっと鋭くするため、感度が増加する、すなわち、プロー
ブ/標的のT、の巾がより狭い。例えばハイブリダイゼーションがテトラアルキ
ルアンモニウム塩の存在下で起こると、G−C対とA−T対の間の結合エネルギ
ーの差が減少する、例えばWood (ウッド)ら、 Proc、 Natl、
Acad、 Sci、、 Vol、 82、 pgs、1585−1588
(i985)。同様に、α−アノメリックヌクレオシド類縁体を使用すると結合
エネルギーが増大ニンの代りに2−アミノアデニンを使用すると結合がよって、
8M体のプローブの洗浄の望ましい手順は、フィルターを0.5%SDSを含む
6XSSC中で約15分間、約lθ〜12℃の温度範囲で3回洗浄し、続いて3
.0MのMe4NCI、50mMのTrfs−HCI (pH8,0)、0.5
%SDSで約10−12℃の温度範囲で1〜2回洗浄し、さらに続いて3.0M
のMe4NCI、50mMのTrfs−HCI (pH8,0)、0.5%SD
S中で、温度範囲約24〜28℃で1.5〜2.5分間洗浄することを含む。9
M体のプローブの場合、手順は実質的には同じであるが最後の洗浄の温度は約2
6〜30℃の範囲内であることが望ましい。ハイブリダイゼーションおよび洗浄
の後、標準的な技法を用いて結合したプローブの定量的な測定がなされ、例えば
放射性標識されたプローブの場合、オートラジオグラフィーまたはシンチレーシ
ョン計測を使用し得る。
■ 塩基配列の再構築
再構築の問題の一般的な性質が第1図の例に示されており、この例では4M体プ
ローブの4つのサブセットが、21量体の塩基配列、CGAATGGAACTA
CCGTAACCTを解析するために用いられている。第1図の左側には、固定
塩基と非固定塩基の次の組合せ:l固定と3非固定、2固定と2非固定、3固定
と1非固定、4固定とO非固定に対して、デオキシアデノシン、デオキシシトシ
ン、デオキシグアノシン、およびチミジンのそれぞれに関して固定及び非固定位
置の全ての可能な順列を持つ4M体プローブのリストが挙げである。すなわち、
リストは、八と非固定位置、Cと非固定位置、Gと非固定位置、そしてTと非固
定位置のそれぞれの全ての可能な順列と同等であるA、C,GおよびTに関して
固定及び非固定の位置の配列を持つ少なくとも1つのプローブを含む。図におい
ては、未知配列の長さに等しい、この例では21の列を持つ2次元のます目の各
行にプローブがひとつある。
60個のプローブを21量体に別々にハイブリダイゼーションを行なって得られ
たデータが「完全相補対」と書かれた列の下に挙げられている。データは、21
量体の4塩基サブ配列と完全な相補性を持っている各プローブタイプの数を示す
。21量体の配列それ自身の下に完全相補対が現われる塩基配列に沿ってプロー
ブが位置付けられている。再構築アルゴリズムの目的は、充分な数のプローブの
位置を決定し標的配列が再構築され得るようにすることである。
再構築の問題は多くの方法で取り組むことが出来る。
この問題はある意味で最適である目的物の順列を発見するということを含むとい
う点において旅行するセールスマンの問題に似ている。その様な組み合わせの問
題については、ある特殊な態様への最良のアプローチを組み立てる上で指針を提
供する広範な文献が存在する、例えば、LaWaler(ラワラー)ら、 ed
s、、“旅行するセールスマ・アンド・サンズ(John Wiley & 5
ons)、 New York、 1985)); Kirkpatrick(
キルクパトリック)、J、5tat、 Phys、、Vol、 34. pg8
.975−986 (1984); He1d (ベルト)およびKarp (
カーブ)、J、Soc、Indust、 Appl、 Mathl、 Vol、
10. pgs、 196−210 (1962);およびLin(リン)およ
びKernighan(カーニンガム)、0per、 Res、、 Vol 2
1゜pgs、 498−516(1973)、再構築の問題に対スル望マシイア
プローチは、標的配列がひとつかそれ以上の既知配列領域を含むことを要求する
。特に、最初の既知配列領域は標的配列の一端に存在しそして2番目の既知配列
領域は標的配列の他端に存在する。2つの既知配列領域の存在により、簡単でか
つ効率のよい再構築アルゴリズムの構築が可能となる。おおざっばに言えば、再
構築の問題は標的配列に相当する互いに重複するプローブ配列の順序を見出す問
題である。既知配列領域は再構築における開始と終点のプローブ配列を定義する
。間に存在する未知配列領域は、残されたプローブ配列からその各々の連続して
選択されるプローブがその前に選ばれたプローブ配列と正しく重複していること
を満たすことにより再構築され得る。第2図はその様なアルゴリズムの流れ図で
ある。これは交互に行われる2つの部分からなり、ハイブリダイゼーションのデ
ータ:(1)既知配列領域のひとつから出発して、正しく重複した固定開始位置
および固定終末位置を持つプローブから候補配列を構築することおよび(2)他
の既知配列領域から出発して、正しく重複した固定終末位置および固定開始位置
を持つプローブから候補配列を構築することより決定された同じセット(本明細
書中ではデータセットと呼ぶ)からプローブを引き出す。「正しく重複した」と
いう言葉はこのセクションの始めに述べられ、そして第1図に記載されている意
味で、重複していることを単に意味している。故に、このアルゴリズムでは固定
開始位置(3°)または固定終末位置(5’)、あるいはその両者を持つプロー
ブのみが再構築に使用される。これらの2つの種類のブローブは本明細書中でF
IPプローブおよびFFPプローブと呼ぶ。
アルゴリズムのために、一番目および2番目の既知配列領域のヌクレオチド配列
によって2種の数のセット(あるいは実行状態に依存した論理変数)が定義され
る。
これらのセットはそれぞれ開始左方レジスターおよび開始右方レジスター2と呼
ぶ。レジスターの大きさは、用いられるプローブの長さに依存する。通常、レジ
スターはL−1個の要素、またはエントリー、ここでLはプローブの長さである
、を持つ。開始右方レジスターから出発して、アルゴリズムは標的配列と完全相
補対を形成する全てのFFPおよびFIPプローブとレジスターのエントリーを
比較する、4゜比較は、選択されたプローブの2番目からL番目の塩基と、右方
レジスターのナンバー(あるいはエントリー)lからL−1との間である。
すなわち位置2の塩基は右方レジスターの位置Iのエントリーと比較され、位置
3の塩基は右方レジスターの位置2のエントリーを比較され、そして以下同様で
ある。
まず、上述のように、レジスターのエントリーは1番目と2番目の既知配列領域
の塩基によって決定される。もし、比較の結果、L−1(mlの位置がそれぞれ
正しく重複するならば、その時レジスターの現在の内容は新しい右方レジスター
に入力されそして続いて新しい右方レジスターのエントリーはひとつ右側の位置
に移される。すなわち、新しい右方レジスターのエントリー1は位置2に移され
、エントリー2が位置3へ、そして以下同様である。エントリーL−1は消去さ
れ、そしてプローブの開始位置に存在する固定塩基(またはそのある代表)が1
番目に入力される。次に、新しい右方レジスターと選択されたプローブが次の比
較のために維持されるために、レジスターおよび、選択されたFIPプローブの
開始固定塩基と正しく重複するFFPプローブが見出されなければならない(も
ちろんFIPプローブが同時にFFPプローブでなければ)8゜その様な選択が
なされると(すなわち4と8)、選択されたプローブはデータセットから除去さ
れる。新しい右方レジスターは、その選択が現在のレジスターに導いた、正しく
重複しているFIPプローブの関連したセット、および正しく重複しているFF
Pプローブの関連したセットとともに保存される。
それぞれの新しい右方レジスターが形成された後、FFPプローブがまず最初に
選択されそしてFFPプローブの位置1−Lが左方レジスターのエントリー!−
Lと比較されること以外、実質的に右方レジスターと同じ方法で既に存在する左
方レジスターを延長することにより、ひとつあるいは複数の左方レジスターが形
成される16および18゜FIP及びFFPプローブは、データセットに残って
いるプローブから選択される。すなわち、以前に右方あるいは左方レジスターを
“延長”するのに選択されたいかなるプローブをも選択することができない。こ
のことは、第一の後の連続的な繰り返しにおいて形成される右方レジスターにつ
いても保持される。これらの比較の結果、対をなす右方及び左方レジスターが形
成され、そしてそれぞれの対には4セツトのプローブが関連している、20:(
i)右方レジスターを延長するために選択されたFIPプローブのセット、(i
i)右方レジスターとFIPプローブに正しく重複するように選択されたFFP
プローブのセット、(i i i)左方レジスターを延長するために選択された
FFPプローブのセット、および(fv)左方レジスターとFFPプローブに正
しく重複するように選択されたFIPプローブのセット。それぞれのステップi
(第2図参照)において、M1+1個のそのような対とそれに関連したセット
が形成される。
プローブとレジスターの位置の間の比較は以下のようになされる。レジスターの
エントリーは常に塩基ASC1G、またはT(あるいはそれらを代表するもの)
である。プローブの位置は常にある塩基によって、またはある塩基のないことに
よって占められる。上述より、プローブは例えばAOAAO00Aという記号で
表わされ得ることを思い出してほしい。0はこの場合C,G、T、またはそれら
の縮過度減少類縁体を表わす。別の言葉で言えば、0は「Aでない」ことを示す
。比較は(レジスターからの)塩基と(比較されているプローブからの)ある塩
基あるいはその塩基以外のものの真実の値を決定することを必要とする。例えば
、レジスターエントリーがAでかつプローブエントリーが「Tではない」ならば
、その時「AでありTではない」の論理的操作は論理的に真である。故に、正し
い重複が存在する。他方、プローブエントリーが「Aでない」ならば、その時「
AでありAではない」の論理的操作は論理的に偽りである。従って、重複は正し
くなくそしてプローブは拒否される。
連続的なステップにおいて、レジスターのml対のそれぞれがそれぞれのデータ
セットのプローブと比較され、その際次々に、M、や、対のレジスターのセット
が生じる。それぞれのステップで、データセットの大きさは2つあるいはそれ以
上のプローブずつ減少され、そしてそれぞれの候補配列は各々l塩基ずつその大
きさを増加される。レジスターが、関連するデータセット内の残っているプロー
ブのそれぞれと比較され、そして正しく重複するプローブが見出されないときは
、レジスターとその関連するセットは消去される6−14゜データセットの全て
のプローブが使われると、アルゴリズムは停止する(すなわち、4つの関連する
セットのひとつに分類される)。ひとつより多い候補配列が形成された場合、あ
るいはデータの統一性を検討することが望まれた場合には、最初の左方レジスタ
ーと固定終末位置及び標的配列と完全な相補性を持つプローブセットで出発して
一連の繰返しの比較の同じ工程が遂行され得る10−16゜この場合、開始左方
レジスターのエントリー1からL−1までがプローブの位置lからL−1までの
それぞれと比較され、そしてj回目の比較の後のひと続きのレジスターR8が現
在のエントリーを左に移動し、そして正しく重複しているプローブの終末固定塩
基を新しいレジスターの位置L−1に入れることによって形成される。上述され
たのと同様方法で:次々と候補配列が形成され、そして以前に形成された配列と
比較される。両方のセットに現われる配列だけが保存される18゜全ての残され
た非固定終末および非固定開始位置プローブが各候補のなかで正しく重複してい
る位置を見出すことを要求することによって更に消去することが可能である20
゜好ましくは、アルゴリズムは平行処理能力を有するコンピューターに入力され
る。例えば、付録Iのアルゴリズムは、パイパーキューブ平行プロセッサ、例え
ば1024ノードNCUBE/len:7ンビユーター(エヌキューブ社(Nc
ube Corp、)、 Beaverlon、Oregon )のそれぞれの
ノードに入力され得る。
上述のアルゴリズムは必ずしも全ての場合に唯一の解答を与えるとは限らない。
一般に実質的にプローブよりも長い高頻度の繰返しの領域(例えばACACAC
AC・・・、GTCGTCGTC・・・またはそれに類するもの)あるいは一定
の領域(例えばAAAAAAA・・・、またはそれに類するもの)は唯一ではな
い解答を与える。例えば、(上のアルゴリズムを用いて)異なるタイプの数塩基
が集って現われるひとつの塩基タイプの長いひと続きの配列を含む標的配列を唯
一に再構築するのは不可能である。故に、もしAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAGCATAAAAAAAAAAAAAAという配列を含む配列を再
構築するのに4量体プローブか用いられた場合、このAの配列の中のGCATの
位置を疑いなく決定することはできない。ある場合には、異なる解答が見出され
るならば、標的配列の一通りに決定されなかった部位を、標準的な方法で配列決
定することにより、正しい配列が識別され得る。
1、33. pgs、 103−119 (1985)により記載され、そして
広く商業的に入手可能、例えばベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(Beth
esda Re5earch Laboratories) (Gaith二本
鎖DNAが得られる。pUc19の大規模分離は、例工ばManiatis (
マニアテス)ら、“分子クローニング・ラボラトリ−(Cold Spring
Harbor Laboratory)、 New York、 (1982
)により開示されている標準的な方法により行われ得る(すなわちアルカリ溶解
に引続き塩化セシウム−エチジウムプロミド勾配中での平衡遠心を行う)。ある
いは、精製されたpUc19は、必要とされる時、例えばBethesda R
e5earch Laboratoriesから商業的に購入される。
1mgのpUc19のDNAを95%エタノールで沈衝液(例えば、50 mM
NaC1,10mM Tris−HCI (pH7,8)、 10 mM M
gC1* 、 10 mM 2−メルカプトエタノール、1100uウシ血清ア
ルブミン)中で、37℃で約2.0時間再度懸濁する。0.5MのEDTA (
pH7,5)を添加することにより反応を停止した後、制限酵素緩衝液をキシレ
ンシアツールと混合しそして8%ポリアクリルアミドゲルに乗せ電気泳動する。
119塩基対の断片を含むバンドを切り出し、そしてDNAをManiatis
(マニアテス)らによって178ページに(主文中にて引用)記載されている
ように溶出する。
断片は、lnglo、2NのNaOH100μlで、10分間再度懸濁され、冷
却され、そして同容積の1OXSSC(1,5M塩化ナトリウムおよび0.15
Mクエン酸ナトリウム)と混合される。この断片溶液の100μmサンプルをス
ロットプロット機器、例えば11個の72ウエルのミニフォールド■微量サンプ
ルろ過マニホールド(シュレイヒャア・アンド・ジュール(Schleiche
r and 5cheull)、 Keene、 NHから入手可能)のウェル
にピペットで注入し、その際それぞれの機器は前にI X5SC中に15〜20
分浸されたGeneScreen膜を保持している。2時間後、溶液は穏やかに
膜を通して吸引され、2xsscで洗浄され、そして乾燥される。乾燥後、膜は
80°Cで2〜4時間ベークされる。プローブを添加する前に膜はプレハイブリ
ダイゼーション混合物で処理される(0.5%SDSを有する10×デンハルト
、60℃で1時間、続いて2XSSCで洗浄)。
ハイブリダイゼーション用のプローブはアプライドバイオシステム社(Appl
ied Biosystems、 Inc、) 380 A型DNA合成機によ
りホスホラミダイト化学により合成される。4 X 196=784の混合オリ
ゴヌクレオチドプルーブが用いられ、その際、8量体配列のそれぞれの種類のプ
ローブは、固定開始位置あるいは固定終末位置のどちらかを有する(付録■参照
)。プローブのシトシン及びアデノシンサブセットの非固定位置はそれぞれデオ
キシアデノシンおよびデオキシイノシンならびにデオキシシトシンおよびデオキ
シイノシンによって満たされる。プローブはMaxum and G11ber
tのT4ポリヌクレオチドキナーゼプロトコール(Meth Enzymol、
、 Vol、 65. pgS、 497−560 (1980))に従ってS
″Pで標識されマニホールドウェルに5×デンハルト、5XSSPEおよび0゜
5%SSDからなる500μlのハイブリダイゼーション混合物中1ng/ml
の濃度で18℃で16時間適用される。ハイブリダイゼーションの後、膜は12
℃で0.5%SDSを含む6XSSCで3回洗浄され、続いて12°Cで3.0
MのMe、NC1,50mMTr i 5−HCI (pH8,0)、0.5%
SDSで2回洗浄し、そして最後に26〜27℃で3.0MMe、NC1,50
mMTris−HCI (pH8,0)、0.5%SDS中で2分洗浄する。洗
浄の後、乾燥された膜はXAR−5フイルム(またはそれと同等なもの)上で2
〜4日間オートラジオグラフされる。現像されたフィルム上の「スロット」は、
LKBウルトロスキャンXL(エッグスェル)レーザーデンシトメーターまたは
それに類似した機器で分析される。
完全に相補性のあるプローブの数は同じ程度の縮退度を持つプローブの相対的な
シグナル強度と比較して決定される。また2本鎖の標的配列が使用されているた
め、再構築アルゴリズムに使用されるプローブ数の値は(固定塩基に関して)各
プローブタイプとその相補鎖に対するシグナルの平均である。塩基配列はプログ
ラムRCON8によりプローブ数のデータから再構築され、そのコード源は付録
に列挙されている。RCON8は、標的配列のそれぞれの末端の8塩基の配列は
既知配列領域であることを仮定している。プログラムは左から右へ3′−5°の
方向で記載された非翻訳の配列を返送する。
実施例I[、9量体プローブを用いたpUCl 9の323塩基対のPvuII
断片の塩基配列決定323塩基対2本鎖DNAはpUc19のpvuII切断に
より得られる2つの断片のひとつである。323塩基対のPvulI断片の調製
、その変性、そしてそのジンスクリーン(GeneScreen)支持体への固
定のため、実施例Iに記載されたものと同じ方法に従う。プレハイブリダイゼー
ション、ハイブリダイゼーションそして洗浄のプロトコールは最後の高温洗浄が
28〜29°Cで行われること以外同じである。
プローブは実施例工に示されたように合成され、そして標識される。1556個
のプローブが使われる。開始あるいは終末の位置に固定塩基を持つ9量体配列の
それぞれについてプローブが調製される(すなわちA、C。
G1及びTプローブについてそれぞれ389個)。実施例工のように、1ooo
oooooとooooooo。
l型のプローブは異なった型の固定塩基を持った3つのプローブで置き換えられ
、例えば0OOOOOOOTはAOOOOOOOT、C00OOOOOT及びG
OOOo 000Tで置き換えられる。
Pvu断片の配列は、特に9量体のプローブデータを適応させる改変された版の
付録Iのプログラムを用いて再構築される。8量体版と同様に、プログラムは標
的配列の両端の9塩基配列は既知配列領域であることを仮定第1図は21量体の
塩基配列が4量体プローブの4つのサブセットによってどのように再構築され得
るかを示すことによって塩基配列再構築の一般的問題について例示している。
第2図は望ましい再構築アルゴリズムを図式的に説明したフローチャートである
。
2 1reg2.pset、pseq811(1,1)冨O
drlnum(ll+++0
cillnum(1)−0
10001i=ii+1
if(tab(rregl(frx−11rpnumlil(pset(jjl
;!L1950 cant工nus
else
do 1900 x−L8
1900 continue
end工f
ksavewkk
1se
do 2300 k=wo+l、w
ndif
skipaml
特表千4−501362 (12)
lsa
wQ■W
call 1eft(ii、wlLjsave、ksave)do 2800i
=1,6
2700 continue
if+ii、eq、1)then
do 6000 kWwo+l、w
6000 r2(k、1)=kk
1se
do 6100 k禦wo+l、w
do 6200 xml、1i−1
6200r2(k、x)”rl(f、x)6100 r2(k*1i)−kk
ndif
1200 continue
lloo continue
rl(k、m)xr2(k、+n)
7100 11、(k、m)=12(k、m)do 7200 m=1,7
7300 drl(k、m1=dr2(k、m)do 7400 m−1,d1
2num(kl)400 dll(k、ml−d12(k、m)drlnum(
k)mdr2num(k)dllnum(k)=d12num(kl7000
continue
if (ii、lt、haltl go七o 10003000 contin
ue
5000 end
dimension dw2(xx、1201rdll(xxt120)*d1
2(xx、120)、drlnum(xxlao 1100 mmxLii−1
do 1500 nun−1,dllnum(f)1700 cant工nue
ndif
skipaml
skipb=1
www+1
d12num(wl=dllnum(f)+1d12(wld12num(wl
)mrr1400 continue
d12num(w1mdllnum+f)12(w+1i)−hh
1000 continue
プローブ 標的配列 完全相補対
FIGURE 1
FIGURE2 第1部
国際調査報告
Claims (11)
- 1.核酸のヌクレオチド配列を決定する方法であって、段階: プローブのセットを提供し、その際、そのセットの中の端プローブは前もって定 められた長さを持ちかつセットの中の各プローブは固定および非固定位置のあら かじめ決定された配列を持ち、この固定位置はひとつあるいはそれ以上のあらか じめ定められた種類のヌクレオチドを含むこと; 核酸にセットのプローブをハイブリダイゼーションすること; 核酸と完全に相補対を形成するセットの中の各プローブのコピー数を決定するこ と;そして核酸と完全に相補対を形成するプローブの前もって決定された配列か ら核酸のヌクレオチド配列を再構築すること を包含する方法。
- 2.上記のセットがプローブの長さに等しいまたはより短い複数の固定および非 固定の位置の各順列の配列と等価の、固定及び非固定の位置の配列を含む少なく ともひとつのプローブを含む、請求項1記載の方法。
- 3.さらに以下の段階: 複数の固相支持体の各々に既知の量の上記核酸を固定すること;そして 上記核酸と完全に相補対形成していない全ての上記プローブが実質上固相支持体 から除去され、そして上記核酸と完全に相補対を形成している上記プローブの全 てが実質上固相支持体上に残るように上記プローブをハイブリダイゼーションし た後固相支持体の各々を洗浄すること を包含する、請求項2記載の方法。
- 4.上記のハイブリダイゼーションの段階が、複数の固相支持体の異なる固相支 持体上の上記核酸に上記セットの各プローブを別々にハイブリダイゼーションさ せることを包含する、請求項3記載の方法。
- 5.上記のプローブの上記のあらかじめ決定された長さが7から11ヌクレオチ ドの範囲にある、請求項4記載の方法。
- 6.上記プローブの上記非固定の位置が少なくとも1つの縮退度減少類縁体によ って占められる、請求項5記載の方法。
- 7.核酸のヌクレオチド配列を決定する方法であって、段階: プローブの第一のセットを提供し、その際、第一のセット中の各プローブは同一 の長さを有し、その長さは7から10ヌクレオチドであり、そして第一のセット 中の各プローブは固定および非固定の塩基のあらかじめ決定された配列を有し、 固定塩基はデオキシアデノシンでありそして非固定の塩基はデオキシシトシン、 デオキシグアノシン、チミジンまたはこれらの縮退度減少類縁体を含み、プロー ブの長さより短いまたはに等しい固定および非固定の塩基の各順列について当該 第一のセットが、このような順列と同等の配列を持つ少なくとも1つのプローブ を含むようにすること; プローブの第二のセットを提供し、その際、第二のセット中の各プローブは同一 の長さを有し、その長さは7から10ヌクレオチドであり、そして第二のセット 中の各プローブは固定および非固定の塩基のあらかじめ決定された配列を有し、 固定塩基はデオキシシトシンでありそして非固定の塩基はデオキシアデノシン、 デオキシグアノシン、チミジンまたはこれらの縮退度減少類縁体を含み、プロー ブの長さより短いまたはに等しい固定および非固定の塩基の各順列について当該 第二のセットが、このような順列と同等の配列を持つ少なくとも1つのプローブ を含むようにすること; プローブの第三のセットを提供し、その際、第三のセット中の各プローブは同一 の長さを有し、その長さは7から10ヌクレオチドであり、そして第三のセット 中の各プローブは固定および非固定の塩基のあらかじめ決定された配列を有し、 固定塩基はデオキシグアノシンでありそして非固定の塩基はデオキシアデノシン 、デオキシシトシン、チミジンまたはこれらの縮退度減少類縁体を含み、プロー ブの長さより短いまたはに等しい固定および非固定の塩基の各順列について当該 第三のセットが、このような順列と同等の配列を持つ少なくとも1つのプローブ を含むようにすること; プローブの第四のセットを提供し、その際、第四のセット中の各プローブは同一 の長さを有し、その長さは7から10ヌクレオチドであり、そして第四のセット 中の各プローブは固定および非固定の塩基のあらかじめ決定された配列を有し、 固定塩基はチミジンでありそして非固定の塩基はデオキシアデノシン、デオキシ シトシン、デオキシグアノシン、またはこれらの縮退度減少類縁体を含み、プロ ーブの長さ固定および非固定の塩基の各順列について当該第四のセットが、この ような順列と同等の配列を持つ少なくとも1つのプローブを含むようにすること : 複数の固相支持体のそれぞれに既知の量の核酸を固定すること: 第一、第二、第三および第四のセットの各プローブを固相支持体に固定した核酸 に個別にハイブリダイゼーションすること; 核酸と完全相補対二量体を形成していない全ての上記プローブは実質上固相支持 体から除去されそして核酸と完全相補対を形成した全ての上記プローブは実質上 固相支持体に残るように、上記プローブをハイブリダイゼーションさせた後、各 固相支持体を洗浄すること;各セット中で核酸と完全相補対と形成する各プロー ブのコピー数を決定すること:そして 核酸の塩基配列を核酸と完全相補対を形成するプローブのあらかじめ決定された 配列から再構築することを包含する方法。
- 8.上記核酸が少なくとも1つの既知配列領域を含む請求項7記載の方法。
- 9.上記第一のセットの上記プローブが8から9ヌクレオチドの長さを有し、上 記第二のセットの上記プローブが8から9ヌクレオチドの長さを有し、上記第三 のセットの上記プローブが8から9ヌクレオチドの長さを有し、そして上記第四 のセットの上記プローブが8から9ヌクレオチドの長さを有する請求項8記載の 方法。
- 10.上記第一のセットの上記縮退度減少類縁体がデオキシイノシン、5−フル オロデオキシウリジン、およびN4−メトキシシトシンを含み、上記第二のセッ トの上記縮退度減少類縁体がデオキシイノシンおよび2−アミノブリンを含み、 そして上記第三のセットの上記縮退度減少類縁体が2−アミノブリンおよびN4 −メトキシシトシンを含む請求項9記載の方法。
- 11.上記洗浄の段階が、上記固相支持体を約2から4モル毎リットルの濃度の 塩化テトラメチルアンモニウムにさらすことを含む、請求項10記載の方法。
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