JPH04368398A - ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒトＴＮＦ転換体として
新規なポリペプチドを提供することに係り、ポリペプチ
ド自身、それを含む医薬組成物、その製造方法、その遺
伝子組換えＤＮＡ及びプラスミド、形質転換微生物細胞
などに関する。

【０００２】

【従来の技術】ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）は、１９７５年
にＣａｒｓｗｅｌｌらにより予めＢａｃｉｌｌｕｓ　　
Ｃａｌｍｅｔｔｅ　　Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）に感染さ
れエンドトキシンで処理したマウスの血清中に存在する
ことが見出された生理活性物質であり〔Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　　７２　　３６６６
（１９７５）〕、１９８４年にＰｅｎｎｉｃａらにより
ヒトＴＮＦのｃＤＮＡがクローニングされヒトＴＮＦ蛋
白質の全一次構造（アミノ酸配列）が明らかにされた〔
Ｎａｔｕｒｅ３１２，７２４（１９８４）〕。ＴＮＦは
腫瘍細胞に対する細胞傷害活性、移植腫瘍に対する出血
性壊死、増殖の抑制など特異的な抗腫瘍作用を有するが
、最近では高脂血症、血圧低下、発熱などの副作用も生
じうることが報告されており、薬効、副作用などでより
優れたものを見出すべく研究、開発がなされている。例
えば特開昭６１−４０２２１、同６３−１１９６９２、
特開平１−２７７４８８各号公報では遺伝子操作技術に
よりヒトＴＮＦ蛋白質中の特定のアミノ酸を欠失したり
、他のアミノ酸に置換したりあるいは付加したりしてヒ
トＴＮＦ変換体を提供している。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、十分満
足な薬理作用を有するヒトＴＮＦ変換体は、いまだ得ら
れていない。本発明の目的は、ヒトＴＮＦ又はその変換
体と同様の抗腫瘍作用を有し、一方それらで認められた
癌転移の亢進作用を示さない新規なヒトＴＮＦ転換体、
それらに関連する，ポリペプチドとそれらの製造方法、
プラスミド、微生物細胞など、及び用途を提供すること
にある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明は、配列表の配列番号１で示した１番目のＳｅｒか
ら１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列を
有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換体におい
て、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８番目のＡｓ
ｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する前記変換
体のアミノ酸配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミノ酸
配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１６個のアミ
ノ酸を含むアミノ酸配列により置換されているポリペプ
チドに係る。また本発明は、当該ポリペプチドをコード
するＤＮＡを含む組換えプラスミド、この組換えプラス
ミドにより形質転換された微生物細胞、この微生物細胞
によるポリペプチドの製造方法、医薬組成物、前記アミ
ノ酸配列のＮ末端にメチオニンの結合したポリペプチド
並びに配列表の配列番号１１で示した１番目のＴから４
６５番目のＧまでで表わされる塩基配列を有する腫瘍壊
死因子ポリペプチドのＤＮＡ又はその変異導入ＤＮＡに
おいて、前記配列番号１１の１〜３番目のＴＣＡから２
２〜２４番目のＧＡＣまでの塩基配列あるいはそれらに
対応する前記変異導入ＤＮＡの塩基配列がＡｒｇ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｐのアミノ酸配列を少なくとも１個含み、かつ
３個〜１６個のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードす
る塩基配列により置換されているＤＮＡに関する。

【０００５】本発明者らは、ヒトＴＮＦ又はその変換体
が有するアミノ酸配列の一定のアミノ酸配列領域におい
て、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミノ酸配列を存在せし
めたところ、ヒトＴＮＦ又はその変換体に比し抗腫瘍活
性がほぼ同程度であり、一方ヒトＴＮＦ又はその変換体
が癌の転移を亢進するのに対しほとんど亢進しない新規
ヒトＴＮＦ転換体ポリペプチドが得られることを見出し
、その知見に基いて発明を完成した。

【０００６】配列表の配列番号１で示した１番目のＳｅ
ｒから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配
列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチドとはヒトＴＮＦを
意味する。

【０００７】本発明におけるヒトＴＮＦの変換体とは、
配列表の配列番号１で示したアミノ酸配列において１個
又は２個以上のアミノ酸を適宜付加、欠失、置換の改変
を単独又は複合処理したものであって、ヒトＴＮＦと同
様の抗腫瘍作用を有するものである。したがって、本発
明において、配列番号１の１番目のＳｅｒから８番目の
Ａｓｐまでのアミノ酸配列に対応する前記変換体のアミ
ノ酸配列とは、変換体において前述のアミノ酸配列が改
変されていれば改変後のアミノ酸配列がそれに該当する
。この改変にはアミノ酸の欠失も含まれるので前述の１
番目のＳｅｒから８番目のＡｓｐまでアミノ酸配列が部
分的あるいは全部欠失したものも含まれる。

【０００８】ヒトＴＮＦ変換休としては具体的には例え
ば下記のものが挙げられるが、本発明においてはこれら
以外のものを決して排除するものではない。

【０００９】（１）特開昭６３−１４１９９９号公報に
記載：Ｎ末端に、Ｖａｌ−Ａｒｇを付加し、更に２９Ａ
ｒｇ−３０Ａｒｇを２９Ａｓｎ−３０Ｔｈｒに変換した
もの。 （２）特開昭６３−１１９６９２号公報に記載：（Ａ）
３２Ａｓｎを３２Ｔｙｒ、３２Ｈｉｓ、３２Ａｓｐ又は
３２Ｓｅｒにそれぞれ変換したもの。 （Ｂ）１１５Ｐｒｏを１１５Ｌｅｕ、１１５Ｓｅｒ、１
１５Ａｓｐ又は１１５Ｇｌｙにそれぞれ変換したもの。 （Ｃ）１１７Ｔｙｒを１１７Ｈｉｓに変換したもの。 （３）特開平１−２７７４８８号公報に記載：１Ｓｅｒ
〜８Ａｓｐを欠失し、９ＬｙｓのＮ末端にＡｒｇ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇを付加したもの。 （４）特開平２−１６３０９４号公報に記載：１Ｓｅｒ
〜８Ａｓｐを欠失し、９ＬｙｓのＮ末端にＡｒｇ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇを付加し更に１５４Ａｌａを１５４Ｐｈｅに
変換したもの。 （５）特開平２−１４２４９３号公報に記載：１Ｓｅｒ
〜８Ａｓｐを欠失し、９ＬｙｓのＮ末端にＡｒｇ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇを付加し更に１５４Ａｌａを１５４Ｔｒｐに
変換したもの。 （６）特開昭６３−２７０６９７号公報に記載：１００
Ｇｌｎ〜１０７Ａｌａを欠失したもの。１Ｓｅｒから２
個〜８個のアミノ酸残基を欠失したもの。 （７）特願平２−１９３９３５号明細書に記載：６８Ｐ
ｒｏを６８Ａｓｐ、６８Ｍｅｔ又は６８Ｔｙｒにそれぞ
れ変換したもの。

【００１０】本明細書全般を通じてアミノ酸、ポリペプ
チド、塩基、それらの配列を表わすとき下記のリストの
ものを用いる。

【００１１】 アミノ酸： 　　記号　　　　Ａｌａ　　　　　　Ｃｙｓ　　　　　
　　　Ａｓｐ　　　　　　　　Ｇｌｕ　　意味　　　　
アラニン　　システイン　　アスパラギン酸　　グルタ
ミン酸　　記号　　　　　　Ｐｈｅ　　　　　　　　　
　Ｇｌｙ　　　　　　Ｈｉｓ　　　　　　Ｉｌｅ　　　
　　　Ｌｙｓ　　意味　　　　フェニルアラニン　　グ
リシン　　ヒスチジン　　イソロイシン　　リジン　　
記号　　　　Ｌｅｕ　　　　　　Ｍｅｔ　　　　　　Ａ
ｓｎ　　　　　　Ｐｒｏ　　　　　　Ｇｌｎ　　意味　
　　　ロイシン　　メチオニン　　アスパラギン　　プ
ロリン　　グルタミン　　記号　　　　Ａｒｇ　　　　
　　Ｓｅｒ　　　　Ｔｈｒ　　　　Ｖａｌ　　　　Ｔｒ
ｐ　　意味　　　　アルギニン　　セリン　　スレオニ
ン　　バリン　　トリプトファン　　記号　　　　Ｔｙ
ｒ 　　意味　　　　チロシン 塩基： 　　記号　　　　Ａ又はａ　　Ｃ又はｃ　　Ｇ又はｇ　
　Ｔ又はｔ　　Ｕ　　意味　　　　アデニン　　シトシ
ン　　グアニン　　チミン　　　　ウラシル

【００１２
】また本明細書で使用した略号は次のとおり意味する。 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸　　（Ｄｅｏｘ
ｙ　　ａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸　　（Ｄｅｏｘ
ｙ　　ｇｕａｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸　　（Ｄｅｏｘｙ
　　Ｃｙｔｉｄｉｎｅ　　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
ＴＴＰ：チミジン三リン酸　　（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　
　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ） ＡＴＰ：アデノシン三リン酸　　（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ
　　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ） ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ　　ｄ
ｏｄｅｃｙｌ　　ｓｕｌｆａｔｅ） ＢＰＢ：ブロモフェノールブルー（Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎ
ｏｌ　　Ｂｌｕｅ） ＤＴＴ：ジチオスレイトール　　（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒ
ｅｉｔｏｌ） ＢＳＡ：牛血清アルブミン　　（Ｂｏｖｉｎｅ　　ｓｅ
ｒｕｍ　　ａｌｂｕｍｉｎ） ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニル　　フルオライド
（Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　　Ｆｌ
ｕｏｒｉｄｅ） ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ
ｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　　Ａｃｉｄ）
ＣＰＧ樹脂：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−Ｐｏｒｅ　　Ｇｌ
ａｓｓ樹脂

【００１３】本発明のポリペプチド転換体において、一
定の位置に前記Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミノ酸配列
を少なくとも１個含み、かつ３個〜１６個のアミノ酸を
含むアミノ酸配列は、抗腫瘍活性、癌の転移程度、副作
用、遺伝子組換え技術の適用性などを考慮して適宜決め
られる。前述の３個〜１６個のアミノ酸を含むアミノ酸
配列は、そこに望ましくは３個〜１１個のアミノ酸を含
むアミノ酸配列においてＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミ
ノ酸配列を１個又は２個以上有するものであり、具体的
には配列表の配列番号２〜１０で示したアミノ酸配列が
挙げられるが、なかでも配列番号２、３、５、６及び７
が望ましい。

【００１４】本発明におけるポリペプチド転換体のＡｒ
ｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミノ酸配列を少なくとも１個含
み、かつ３個〜１６個のアミノ酸を含むアミノ酸配列以
外の配列に関しては、配列番号１の９番目のＬｙｓから
１５５番目のＬｅｕまでのヒトＴＮＦのアミノ酸配列あ
るいはその６８番目のＰｒｏが他のアミノ酸望ましくは
Ａｓｐ又はＭｅｔで置換されたアミノ酸配列が望ましい
。

【００１５】配列表の配列番号１１で示した１番目のＴ
から４６５番目のＧまでで表わされる塩基配列を有する
腫瘍壊死因子ポリペプチドのＤＮＡとは、ヒトＴＮＦの
アミノ酸配列をコードするＤＮＡの１形態である。

【００１６】ヒトＴＮＦのアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡの変異導入ＤＮＡとは、配列表の配列番号１１で示
した塩基配列において１組又は２組以上のコドンを適宜
付加、欠失、置換の改変を単独又は複合処理したもので
あって、前述のヒトＴＮＦ変換体のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡである。したがって、その改変は、配列番
号１１で示した１番目のＴから４６５番目のＧまでで表
わされる塩基配列の全域に及ぶので、１番目のＴから２
４番目のＣまでの塩基配列だけでなく、２５番目のＡか
ら４６５番目のＧまでの塩基配列にも及ぶ。

【００１７】次に本発明についてその実施態様を詳しく
記載するが、本発明に係る遺伝子操作技術については多
くの文献により記載されている方法や手段を適宜調整し
ながら適用する。その文献を参考までに以下に列挙する
。

【００１８】Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ｅｔ　　ａｌ，
（１９８２）：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ
，Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ（以下
、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇと略記する）
Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、Ｒ．Ｗｕ　　ｅｔ　　ａｌ，（１９８３）
：Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０
０及び１０１、Ｒ．Ｗｕ　　ｅｔ　　ａｌ，（１９８７
）：Ｍｅｔｈｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，
１５３，１５４及び１５５

【００１９】本発明のポリペ
プチドは種々の方法、手段、機械を用いて製造すること
ができるが、代表的な製造方法を下記する。

【００２０】（１）ヒトＴＮＦ遺伝子の取得ヒトＴＮＦ
遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列は前述のとおり、Ｐ
ｅｎｎｉｃａらにより明らかにされており、その塩基配
列を適宜変更してヒトＴＮＦ遺伝子を配列番号１１のよ
うにデザインする。その際、宿主細胞（大腸菌など）に
適したコドンを選択するのが望ましく、また後述のＤＮ
Ａ断片の連結によるクローン化並びに変換体作製のため
の遺伝子改変が容易に実施できるように適当な位置に適
当な制限酵素切断部位を配置するのが望ましい。もちろ
んヒトＴＮＦ遺伝子の上流には翻訳開始コドン（ＡＴＧ
）を、下流には翻訳終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴ
ＡＧ）をそれぞれ読み取り枠に合致させるように設置す
る必要があり、また翻訳開始コドンの上流並びに翻訳終
止コドンの下流にそれぞれ適当な制限酵素切断部位を設
置してベクターへの適用性、クローン化の簡便性を図る
のが好ましい。

【００２１】ヒトＴＮＦ遺伝子は上鎖・下鎖それぞれに
ついて幾つかのオリゴヌクレオチドに分けて化学合成し
、ブロックごとに順次適切に連結する方法により作製で
きる。例えば配列表の配列番号１１においては、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子のコーディング鎖及び相補する配列を有する
鎖の各鎖を約５０塩基程度ずつ１０本のオリゴヌクレオ
チドに分け、合計２０本化学合成する。

【００２２】その合成方法としてはジエステル法〔Ｈ．
Ｇ．Ｋｈｏｒａｎａ，”ＳｏｍｅＲｅｃｅｎｔ　　Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ｏｆＰｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅｓｔｅｒｓ　　ｏｆ　　
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｊｏｈ
ｎ　　Ｗｉｌｅｙ　　ａｎｄ　　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，
Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ（１９６１）〕、トリエステル法〔
Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ　　ｅｔａｌ，Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８９，４８０１（１９６７）〕及
びホスファイト法〔Ｍ．Ｄ．Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ　　ｅ
ｔ　　ａｌ，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，２１
，７１９（１９８０）〕が挙げられるが、全自動ＤＮＡ
合成機を用いたホスファイト法が操作性などから好んで
用いられる。

【００２３】合成されたオリゴヌクレオチドは例えば逆
相クロマトカラムを用いた高速液体クロマトグラフイー
、ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動などの通常
の精製方法により精製される。その後、オリゴヌクレオ
チドは例えばＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリ
ン酸化し、アニール化した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いて連結する。ここではオリゴヌクレオチドを幾つかの
ブロックに分け、所望のヒトＴＮＦ遺伝子配列が得られ
るように順次連結し、制限酵素で切断又はＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼによる平滑化後、電気泳動等により精製する
。得られたＤＮＡ断片について例えばｐＵＣ８、同９、
同１８、同１９〔Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇｅｔ　　ａｌ，Ｇ
ｅｎｅ，１９，２５９（１９８２）〕のようなプラスミ
ドベクターに組込み、常法によりコンピテントセルを形
質転換してクローン化する。得られたクローンより公知
の方法に従ってプラスミドＤＮＡを抽出精製し、ベクタ
ーに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列が目的の遺伝子配
列を達成したか否かを点検する。達成できたヒトＴＮＦ
遺伝子の各部分について、それぞれを含むプラスミドベ
クターより制限酵素を用いて切り出し、再度前記ベクタ
ーに連結後組込むことにより目的の完全長のヒトＴＮＦ
遺伝子を有するプラスミドベクターを得る。かくして得
られたプラスミドベクターを制限酵素で切断後、ゲル電
気泳動法によって分離精製することにより所望のヒトＴ
ＮＦ遺伝子を得ることができる。

【００２４】一方、前述の方法に対してはＴＮＦを発現
しているヒト細胞由来のｍＲＮＡよりヒトＴＮＦをコー
ドするｃＤＮＡを作製し、そのｃＤＮＡを使用する方法
を適宜組合せてもよい。

【００２５】（２）ヒトＴＮＦ発現ベクターの構築前記
（１）で得られたヒトＴＮＦ遺伝子を適切に発現ベクタ
ーに挿入して、ヒトＴＮＦ発現ベクターを構築する。発
現ベクターは翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の上流に転写プ
ロモーター領域並びに翻訳シグナルであるＳＤ（シャイ
ン・ダルガーノ）配列を有し、翻訳終止コドン（ＴＡＡ
、ＴＧＡ又はＴＡＧ）の下流に転写ターミネーター領域
を有する必要がある。また転写プロモーターとしては、
ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロ
モーター、ＰＬプロモーター、ＰＨ０５プロモーター、
ＡＤＣＩプロモーターなどが使用でき、転写ターミネー
ターとしてはｔｒｐターミネーター、ｒｒｎＢターミネ
ーター、ＡＤＣＩターミネーターなどが使用できる。こ
のような発現ベクターは例えば、ｐＫＫ２２３−３（フ
ァルマシア）、ｐＰＬ−ｌａｍｂｄａ（同左）、ｐＤＲ
７２０（同左）などの市販品の中から容易に入手できる
が、これらを改良して発現性あるいは取扱性をより高度
化したものを使用してもよい。

【００２６】 （３）ヒトＴＮＦ変換体又は同転換体発現ベクターの構
築 ヒトＴＮＦ変換体又は同転換体ポリペプチドをコードす
るＤＮＡの作製方法としては例えば次の方法が挙げられ
る。

【００２７】（Ａ）前記（１）ヒトＴＮＦ遺伝子の取得
で記載した方法に準じて化学的に合成したオリゴヌクレ
オチドを適切に連結することにより作製する。この方法
によればアミノ酸、ポリペプチドなどの置換、付加又は
欠失の改変は自在である。

【００２８】（Ｂ）前記（１）で作製したヒトＴＮＦ遺
伝子を適当な制限酵素で切断し、遺伝子内の特定領域を
除去した後、変異を導入した塩基配列を有する合成オリ
ゴヌクレオチド（例：上下鎖をアニール化して連結した
二本鎖ＤＮＡ断片）又は適当な他の遺伝子を組込む。こ
の方法によっても前記（Ａ）の場合と同様、改変を自在
に行うことができる。

【００２９】（Ｃ）変異を導入した塩基配列を有する合
成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いＤＮＡ鎖
を延長することにより、変異導入を行う〔部異特異的変
異法（Ｔ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ　　ｅｔ　　ａｌ，Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，
３６７（１９８７））〕。この方法は１０塩基対を越え
る比較的長いＤＮＡ鎖の付加及び挿入には適用し難いが
、その他の改変は前記（Ａ）の場合と同様、自在に行う
ことができる。特に任意のアミノ酸を置換することに適
している。

【００３０】本発明では一般に（Ｃ）の部位特異的変異
法及び制限酵素切断部位を利用する（Ｂ）の方法を適宜
組合せて使用するが、以下にその方法について説明する
。

【００３１】■　　部位特異的変異法により変換体又は
転換体ポリペプチドをコードするＤＮＡを作製した後、
発現ベクター内に適切に挿入する。

【００３２】まず部位特異的変異法を行うに当り、鋳型
ＤＮＡを作製する。前記（１）で得られたヒトＴＮＦ遺
伝子を、Ｍｅｓｓｉｎｇら〔Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３，３（１９８７）〕に
よって開発された一本鎖プラスミドＤＮＡ調製用プラス
ミドベクター（ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９など）に連
結し、大腸菌株に導入する。得られた形質転換体の中よ
り目的のプラスミドを有するクローンを選択する。

【００３３】このプラスミドをｄｕｔ−及びｕｎｇ−変
異大腸菌株（ＣＪ２３６株など）に導入し、遺伝子内に
ウラシルを取り込ませ、大腸菌株にＭ１３Ｋ０７などの
変異型ヘルパーファージを感染させて目的の一本鎖プラ
スミドＤＮＡを取得する。

【００３４】一方、本発明に係る変異導入部位及びその
前後の塩基配列を有する約１５〜５０塩基のオリゴヌク
レオチド・プライマーを化学合成する。このプライマー
と前述の工程で得られるウラシル導入一本鎖プラスミド
ＤＮＡとをアニール化した後、例えばＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ及びＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、二本鎖化する
。鋳型であるウラシルを含むＤＮＡ鎖を不活性化し変異
導入頻度を高めるため、二本鎖となったプラスミドをｕ
ｎｇ＋の大腸菌株に導入する。

【００３５】前述のプライマーをプローブとして用いコ
ロニー・ハイブリダイゼーションを行い、目的の変換体
又は転換体ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラ
スミドを有するクローンを、得られた形質転換体中より
選択する。

【００３６】前述で得られるプラスミドから制限酵素切
断処理によりヒトＴＮＦ変換体又は同転換体ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ断片を切り出し、前記（２）の場
合と同様に、発現ベクターに挿入して、目的のヒトＴＮ
Ｆ変換体又は同転換体発現ベクターを構築することがで
きる。

【００３７】■　　適当な制限酵素切断により変異を導
入したい部分を切り出し、変換デザインに従って化学合
成等により作製したＤＮＡ断片で置換することにより変
換体又は転換体ポリペプチドの発現ベクターを構築する
。

【００３８】ヒトＴＮＦのＮ末端近傍のアミノ酸配列を
修飾するには、Ｎ末端近傍に適当な制限酵素切断部位が
存在するのが好ましい。そこで、まず部位特異的変異法
によりヒトＴＮＦのＮ末端近傍に適当な制限酵素切断部
位を導入する。この制限酵素切断部位とその上流に位置
する翻訳開始コドンの前後に設置された制限酵素切断部
位の２種類の切断部位の使用は更に好ましい。

【００３９】一方、本発明に係る変換デザインに従って
前記（１）の場合と同様にして、上鎖及び下鎖に対応す
るオリゴヌクレオチドを化学合成する。もちろん、その
両末端には発現ベクターへの組込みを考慮して上記の制
限酵素切断部位を設置しておく必要がある。このオリゴ
ヌクレオチド（上鎖及び下鎖）を例えばＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼを用いてリン酸化後アニール化すること
により二本鎖ＤＮＡ断片とする。上記の２種類の制限酵
素で切断したヒトＴＮＦの大部分を含む（Ｎ末部分を欠
失）発現用プラスミドベクター内にこの二本鎖ＤＮＡ断
片を例えばＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入連結して、
目的とするＮ末端近傍のアミノ酸配列を修飾したヒトＴ
ＮＦ転換体の発現ベクターを構築することができる。

【００４０】また、変換体又は転換体ポリペプチドをコ
ードする遺伝子内の適当な制限酵素切断部位を利用して
それぞれの発現ベクター間で組換えを行うことにより、
更に新規な変換体又は転換体ポリペプチドの発現ベクタ
ーを構築することができる。

【００４１】発現ベクターを大腸菌株のような宿主細胞
へ導入することについては、例えば塩化カルシウム法に
より作製した大腸菌株のコンピテントセルを用いる公知
の方法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．
Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ｅｔ　　ａｌ，（１９８２）〕に
従って行う。宿主細胞としては大腸菌、枯草菌、酵母な
どの微生物細胞が使用できるが、なかでも大腸菌として
はＪＭ８３、ＪＭ１０３、ＨＢ１０１などのＥ．ｃｏｌ
ｉ　　Ｋ−１２株の変異種が挙げられる。

【００４２】 （４）ヒトＴＮＦ転換体ポリペプチドの取得本発明にお
いては前記（３）で記載の形質転換された微生物細胞を
培養し、目的のヒトＴＮＦ転換体ポリペプチドを培養物
中に産生、蓄積させて分離する。微生物細胞、特に大腸
菌の培養方法としては従来から知られている方法、例え
ば大腸菌が要求する栄養素を含んだ培養液に大腸菌を接
種し、通常３２〜３７℃で約１２〜２４時間振とう又は
かくはんすることにより短時間に大量に培養する方法が
使用できる。培地は例えばＬ培地、Ｍ９培地、Ｍ９ＣＡ
培地など〔前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ
参照〕が使用でき、必要に応じてアンピシリンなどの抗
生物質を添加したり、転写プロモーターの効率を高める
ために培養開始時あるいは培養中にｌａｃプロモーター
及びｔａｃプロモーター使用の際はイソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシド等の薬剤を、ｔｒｐプロモ
ーター使用の際は３−β−インドールアクリル酸等の薬
剤を添加することもできる。

【００４３】本発明のヒトＴＮＦ転換体ポリペプチドは
培養後、通常、微生物細胞の集合体をトリスバッファー
に懸濁させた状態で超音波処理することにより破砕処理
を施し、遠心分離操作を行い菌体残渣を除去することに
より得られる。更に、かくして得られたものは核酸・エ
ンドトキシン除去剤処理、フィルターによるろ過、陰イ
オン交換クロマトグラフィー、その他従来からの蛋白質
の分離精製方法を組合せることにより、一層精製するこ
とができる。

【００４４】本発明のヒトＴＮＦ転換体遺伝子は前述の
方法を適宜適用することにより、直接製造したり、一旦
ヒトＴＮＦ遺伝子を作製後製造したり、あるいはヒトＴ
ＮＦ遺伝子次いでその変換体変異遺伝子を作製後製造し
たりすることができる。

【００４５】本発明のヒトＴＮＦ転換体ポリペプチドは
、ヒトＴＮＦ又はその変換体の持つ抗腫瘍作用と同様の
作用を有し、しかもヒトＴＮＦ又はその変換体に比し同
程度の抗腫瘍活性を示し、一方それらで認められた癌の
転移亢進作用をほとんど示さないことより抗腫瘍剤、医
薬の活性成分として有効である。本発明のヒトＴＮＦ転
換体ポリペプチドとしては、具体的には例えば後述する
Ｆ４１６８、Ｆ４４１５、Ｆ４４１６、Ｆ４４１７、Ｆ
４４１８、Ｆ４４２０、Ｆ４４２１、Ｆ４１１３、Ｆ４
１３７、Ｆ４６０１、Ｆ４６０２などが挙げられ、なか
でもＦ４１６８、Ｆ４４１５、Ｆ４４１７、Ｆ４４１８
、Ｆ４４２０、Ｆ４６０１が望ましく、Ｆ４１６８及び
Ｆ４４１８がより望ましい。その医薬組成物の製剤に当
っては薬理上許容される担体又は希釈剤とともに医薬組
成物に製剤化することができる。本発明の医薬組成物の
剤型としては、外用剤、経口投与剤、注射剤などが挙げ
られ、それぞれの剤型にあった投与方法で投与される。

【００４６】

【実施例】実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子のデザイン）既
に報告されている〔Ｐｅｎｎｉｃａら、前出〕ヒトＴＮ
Ｆ構造遺伝子のアミノ酸配列を基に、ヒトＴＮＦ遺伝子
の塩基配列について遺伝子構築及び変換体作製の便宜上
、配列表の配列番号１１のＤＮＡ塩基配列をデザインし
た。ここでは適当な間隔で制限酵素切断部位を組み込み
、また、その５′末端に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を設
け、更にプラスミドベクターと容易に連結できるように
ＡＴＧの上流に制限酵素ＥｃｏＲＩによる切断部位を、
翻訳終止コドン（ＴＡＡ及びＴＧＡ）の下流には制限酵
素Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩによる切断部位をそれぞれ設けた
。

【００４７】 実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）前記実施例
１でデザインされたＤＮＡは、自動ＤＮＡ合成機（アプ
ライド・バイオシステムズ，モデル３８１Ａ）を用いて
、ホスファイト法にて化学合成した。合成は後述する塩
基配列を有するＵ−１〜１０及びＬ−１〜１０の２０本
のオリゴヌクレオチドに分割して行い、合成されたオリ
ゴヌクレオチドのＣＰＧ樹脂（フナコシ社販売）からの
切り出し及び保護基脱離は、アプライド・バイオシステ
ムズ社のマニュアルに従った。各オリゴヌクレオチドの
分離精製は逆相クロマトカラムを用いたＨＰＬＣ（高速
液体クロマトグラフィー）又は７Ｍウレアを含むポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度１０〜２０％）に
より行った。

【００４８】Ｕ−１〜１０及びＬ−１〜１０の各塩基配
列は以下に示すものである。 Ｕ−１：２７塩基からなり、配列番号１１の１番目のＴ
から１９番目のＡまでの配列を有し、しかも、１番目の
Ｔに対し上流方向に５′−ＡＴＧ−３′更にその上流に
５′−ＡＡＴＴＣ−３′を接続した配列を有する。 Ｕ−２：５０塩基からなり、配列番号１１の２０番目の
Ｇから６９番目のＧまでの配列を有する。 Ｕ−３：４９塩基からなり、配列番号１１の７０番目の
Ｃから１１８番目のＧまでの配列を有する。 Ｕ−４：５０塩基からなり、配列番号１１の１１９番目
のＡから１６８番目のＣまでの配列を有する。 Ｕ−５：５０塩基からなり、配列番号１１の１６９番目
のＴから２１８番目のＴまでの配列を有する。 Ｕ−６：５２塩基からなり、配列番号１１の２１９番目
のＣから２７０番目のＣまでの配列を有する。 Ｕ−７：４８塩基からなり、配列番号１１の２７１番目
のＣから３１８番目のＣまでの配列を有する。 Ｕ−８：４９塩基からなり、配列番号１１の３１９番目
のＧから３６７番目のＣまでの配列を有する。 Ｕ−９：５１塩基からなり、配列番号１１の３６８番目
のＡから４１８番目のＣまでの配列を有する。 Ｕ−１０：５３塩基からなり、配列番号１１の４１９番
目のＴから４６５番目のＧ　　　　　　　　までの配列
を有し、更に下流方向に５′−ＴＡＡＴＧＡ−３′を有
する。

【００４９】Ｌ−１〜１０は、配列番号１１のＤＮＡ鎖
に対応した下鎖（コンプリメンタリー配列鎖）である。 Ｌ−１：２９塩基からなり、配列番号１１の２５番目の
Ａから１番目のＴまでの配列に相補した配列を有し、し
かも１番目のＴに相補するＡの下流方向に５′−ＣＡＴ
Ｇ−３′を接続した配列を有する。 Ｌ−２：５２塩基からなり、配列番号１１の７７番目の
Ｇから２６番目のＡまでの配列に相補した配列を有する
。 Ｌ−３：５０塩基からなり、配列番号１１の１２７番目
のＧから７８番目のＧまでの配列に相補した配列を有す
る。 Ｌ−４：５０塩基からなり、配列番号１１の１７７番目
のＧから１２８番目のＡまでの配列に相補した配列を有
する。 Ｌ−５：４９塩基からなり、配列番号１１の２２６番目
のＣから１７８番目のＧまでの配列に相補した配列を有
する。 Ｌ−６：４９塩基からなり、配列番号１１の２７５番目
のＴから２２７番目のＡまでの配列に相補した配列を有
する。 Ｌ−７：５１塩基からなり、配列番号１１の３２６番目
のＣから２７６番目のＣまでの配列に相補した配列を有
する。 Ｌ−８：４９塩基からなり、配列番号１１の３７５番目
のＧから３２７番目のＣまでの配列に相補した配列を有
する。 Ｌ−９：５１塩基からなり、配列番号１１の４２６番目
のＴから３７６番目のＡまでの配列に相補した配列を有
する。 Ｌ−１０：４９塩基からなり、配列番号１１の４６５番
目のＧから４２７番目のＧまでの配列に相補した配列を
有し、しかも４６５番目のＧに相補するＣの上流方向に
５′−ＴＣＡＴＴＡ−３′更にその上流方向に５′−Ａ
ＧＣＴ−３′を接続した配列を有する。

【００５０】ＨＰＬＣ法については、ヌクレオジル５Ｃ
１８カラム（φ４．６×１５０ｍｍ：ケムコ社販売）を
用いた逆相クロマトグラフィーによって、アセトニトリ
ルを含むトリエチルアミノ酢酸（１００ｍＭ）バッファ
ー（ｐＨ７．０）で溶出することにより分離精製した。 上記溶出は、アセトニトリルの直線濃度勾配を５〜３５
％（３０分）とし、約１５分のピークを回収した。

【００５１】ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に関し
ては、各合成オリゴヌクレオチド試料を電気泳動により
分離し、紫外線シャドウイング法による泳動パターンの
観察結果より目的の大きさのバンド部分を切り出し、そ
のポリアクリルアミドゲル断片を約１〜２ｍｍ３の大き
さに切り刻み、約２ｍｌの溶出バッファー（０．５ＭＮ
Ｈ４ＯＡｃ及び１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）を加え、３７℃で
一晩振とうした。各オリゴヌクレオチドを含む溶出バッ
ファーを回収し、フェノール抽出（５０％フェノール／
５０％クロロホルム溶液使用）、イソブタノール抽出を
行い、エタノール沈殿操作により各オリゴヌクレオチド
の精製試料とした。

【００５２】合成・精製したオリゴヌクレオチドの一部
について、マキサム・ギルバード法〔Ａ．Ｍ．Ｍａｘａ
ｍ　　ｅｔ　　ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５　　４９９（１９８０）〕によ
り、目的の塩基配列を有していることを確認した。

【００５３】以下（実施例３、４、５、６、７、８、９
及び１０）の遺伝子組換えに係わる操作において、制限
酵素及び他の関連酵素の反応条件等は、主にＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ（前出）記載の方法に準じ
た。なお、上記酵素等は主に宝酒造より入手しており、
宝酒造のマニュアルも参考にした。

【００５４】実施例３（合成オリゴヌクレオチドの連結
によるヒトＴＮＦ遺伝子の構築） （１）まず図１に従ってヒトＴＮＦ遺伝子の構築を試み
た。前記実施例２で得られた合成オリゴヌクレオチドを
３つのグループ（Ｕ及びＬ−１〜４、Ｕ及びＬ−５〜７
並びにＵ及びＬ−８〜１０）に分けてクローニングを行
った。すなわち、Ｕ−２、３、４、６、７、９及び１０
並びにＬ−１、２、３、５、６、８及び９の各オリゴヌ
クレオチド（１〜２μｇ）の５′末端を２〜５ユニット
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）を用いて、
それぞれ別々にリン酸化した。リン酸化反応は１０μｌ
の水溶液中（５０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．６、１０
ｍＭ−ｍｇＣｌ２、０．１ｍＭ　　スペルミジン、０．
１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＤＴＴ及び１ｍＭ　　ＡＴＰ
）、３７℃で１時間行い、反応終了後、７０℃で１０分
間処理することによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを
失活させた。新たに、１〜２μｇのＵ−１、５及び８並
びにＬ−４、７及び１０の各オリゴヌクレオチドをそれ
ぞれ別々に含む上記と同組成の水溶液１０μｌを用意し
、それぞれＵ及びＬの同じ番号同士で各オリゴヌクレオ
チド（Ｕ−１〜１０及びＬ−１〜１０）水溶液を混合し
（２０μｌ）、１００℃で５分間煮沸後徐冷することに
よりアニール化した。次に、得られた１０本のアニーリ
ング体（二本鎖ＤＮＡ断片）を、各グループごとに連結
反応のための水溶液（６６ｍＭトリス−ＨＣｌ　　ｐＨ
７．６、６．６ｍＭ　　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　　ＤＴ
Ｔ、１ｍＭ　　ＡＴＰ及び１００　　μｇ／ｍｌ　　Ｂ
ＳＡ）に添加し（総液量１２０〜１６０μｌ）、４０℃
に加温後徐冷によるアニール化の後、７００ユニットの
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、１６℃で１５
時間連結反応を行った。

【００５５】反応終了後、各反応液をポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ゲル濃度６％）により分離し、エチジ
ウムブロマイド染色法による泳動パターンの観察結果よ
り目的の大きさ（１７６ｂｐ、１５０ｂｐ及び１５３ｂ
ｐ）のバンド部分を切り出し、エレクトロ・エリューシ
ョン法により目的とする３本のＤＮＡ断片を回収した。 更に、回収した各試料に対してフェノール抽出（５０％
フェノール／５０％クロロホルム溶液使用）、イソブタ
ノール抽出を行い、エタノール沈殿操作により目的のＤ
ＮＡを精製した。上記方法に準じて、精製した３本の二
本鎖ＤＮＡ断片をそれぞれ別々にその５′末端をＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し、連結反応
のための水溶液中にて混合の後、４０℃の加温によりア
ニール化を行い、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加えて連結した
。エタノール沈殿操作によりこの連結ＤＮＡを回収し、
１ｍＭ　　ＤＴＴ及び１００μｇ／ｍｌＢＳＡを含む５
０μｌのハイ・ソルトバッファー（５０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ　　ｐＨ７．５、１００ｍＭ　　ＮａＣｌ、１０ｍ
Ｍ　　ＭｇＣｌ２）に溶解させ、１５ユニットの制限酵
素ＥｃｏＲ　　Ｉ（宝酒造）及び１５ユニットの制限酵
素Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩ（宝酒造）を添加して、３７℃で
２時間切断反応を行った。反応終了後、上記方法に準じ
て、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度４％）
により目的とするＤＮＡ断片（約４８０ｂｐ）を分離精
製した。

【００５６】一方、プラスミドベクターｐＵＣ９（九州
大学遺伝情報実験施設より分与）の５μｇを、前記の方
法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲ　　Ｉ及びＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）
により約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。先
に精製した約４８０ｂｐのＤＮＡ断片（ヒトＴＮＦ遺伝
子を含む）とこのｐＵＣ９断片を、前記の方法に準じて
、２０μｌの連結反応液中にて混合し、３５０ユニット
のＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、１６℃で３時間連結反
応を行った。塩化カルシウム法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
　Ｃｌｏｎｉｎｇ参照〕により作製したＥ．ｃｏｌｉ　
　Ｋ−１２ＪＭ８３株（九州大学遺伝情報実験施設によ
り分与）のコンピテント　　セルを、上記連結反応液に
より常法に従って形質転換した〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
　ｃｌｏｎｉｎｇ参照〕。

【００５７】得られたアンピシリン耐性クローンより、
公知の方法を用いてプラスミドを調製し、前記の方法に
準じて、制限酵素（ＥｃｏＲ　　Ｉ及びＨｉｎｄ　　Ｉ
ＩＩ）処理後、アガロースゲル電気泳動によりその泳動
パターンを解析することにより、ヒトＴＮＦ遺伝子のｐ
ＵＣ９ベクターへの挿入を調べた。その結果、約２５０
ｂｐの遺伝子の挿入が確認でき、そのクローンについて
挿入された遺伝子の塩基配列をジデオキシ法〔Ｆ．Ｓａ
ｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５（１９８
１）〕により調べたところ、ＥｃｏＲ　　Ｉ部位から下
流に約１３０ｂｐとＨｉｎｄ　　ＩＩＩ部位から上流に
約９０ｂｐの目的とするヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を
有する遺伝子断片であることが確認された。このクロー
ン及びプラスミドをそれぞれｐＵＡ４１／ＪＭ８３及び
ｐＵＡ４１と命名した。

【００５８】（２）引き続き、図２に従ってヒトＴＮＦ
遺伝子の構築を試みた。前記（１）工程でのクローニン
グでヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列において未達成な領域
周辺を２つのグループ（Ｕ及びＬ−３〜６並びにＵ及び
Ｌ−６〜９）に分け、前記（１）工程と同様にして、各
オリゴヌクレオチドをリン酸化し、アニール化した後、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。前記方法に準じて
、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度６％）に
より分離精製し、得られた２本のＤＮＡ断片（２０１ｂ
ｐ及び２００ｂｐ）をそれぞれ別々に１００μｌの６７
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６．７ｍＭ　　Ｍ
ｇＣｌ２、１６．６ｍＭ　　（ＮＨ４）２ＳＯ４、６．
７μＭ　　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　　ＤＴＴ、２００μｇ／
ｍｌＢＳＡ及び各３３０　　μＭデオキシリボヌクレオ
チド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びＴＴ
Ｐ）水溶液にて溶解し、２〜５ユニットのＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼ（宝酒造）を添加し、３７℃で３０分間反応
することによりＤＮＡ断片の両末端を平滑化した。反応
終了後、６８℃で１０分間処理することによりＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼを失活させ、エタノール沈殿により目的
の２本のＤＮＡ断片を回収した。

【００５９】一方、５μｇのｐＵＣ９ベクターを１ｍＭ
　　ＤＴＴ及び１００μｇ／ｍｌ　　ＢＳＡを含む５０
μｌのミディアム・ソルトバッファー（１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭＮａＣｌ及び１０ｍＭ
　　ＭｇＣｌ２）に溶解させ、１５ユニットの制限酵素
ＨｉｎｃＩＩ（宝酒造）を添加し、３７℃で２時間の反
応後、エタノール沈殿により回収した。得られた切断・
開環したｐＵＣ９ベクターに、先に平滑化後回収した２
本のＤＮＡ断片をそれぞれ別々に、前記方法に準じて、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて組込み、Ｅ．ｃｏｌｉ　　
Ｋ−１２ＪＭ８３株を形質転換した。得られたそれぞれ
のクローンについて、前記（１）工程と同様にして、挿
入されたＤＮＡの塩基配列を調べ、目的の塩基配列であ
ることを確認した。これらのクローンをそれぞれｐＵＡ
４２／ＪＭ８３　　及び　　ｐＵＡ４３／ＪＭ８３と命
名し、プラスミドをｐＵＡ４２及びｐＵＡ４３と命名し
た。

【００６０】上記（１）工程で得られたｐＵＡ４１を制
限酵素ＥｃｏＲ　　Ｉ（ハイ・ソルトバッファー）及び
Ｓａｃ　　Ｉ（宝酒造：ロウ・ソルトバッファー）、制
限酵素Ｈａｅ　　ＩＩ（宝酒造）及びＨｉｎｄ　　ＩＩ
Ｉ（ミディアム・ソルトバッファー）で、上記（２）工
程で得られたｐＵＡ４２を制限酵素Ｓａｃ　　Ｉ（ロウ
・ソルトバッファー）及びＨｐａ　　Ｉ（宝酒造：ＫＣ
ｌバッファー）で並びにｐＵＡ４３を制限酵素Ｈｐａ　
　Ｉ及びＨａｅ　　ＩＩ（ＫＣｌバッファー）で、前記
方法に準じて、それぞれ切断した。ロウ・ソルトバッフ
ァー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．５及び１０ｍＭ
　　ＭｇＣｌ２）とハイ・ソルトバッファー又はＫＣｌ
バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ　　ｐＨ８．５、
１００ｍＭ　　ＫＣｌ及び１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２）の
組合せについては、切断反応を２回に分け、反応の間に
エタノール沈殿操作を行うことにより対応した。ｐＵＡ
４１からのＥｃｏＲ　　Ｉ−Ｓａｃ　　Ｉ　　ＤＮＡ断
片（１２７ｂｐ）及びＨａｅ　　ＩＩ−Ｈｉｎｄ　　Ｉ
ＩＩＤＮＡ断片（８０ｂｐ）、ｐＵＡ４２からのＳａｃ
　　Ｉ−ＨｐａＩ　　ＤＮＡ断片（１４７ｂｐ）並びに
ｐＵＡ４３からのＨｐａＩ−Ｈａｅ　　ＩＩＤＮＡ断片
（１２６ｂｐ）を、前記方法に準じて、それぞれポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度６％）により分離
精製した。

【００６１】一方、５μｇのｐＵＣ１９プラスミドベク
ター（九州大学遺伝情報実験施設より分与）を、前記の
方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲ　　Ｉ及びＨｉｎｄ　
　ＩＩＩで切断し、約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により分離精製し
た。 先に精製した４本のＤＮＡ断片を図示（図２）したよう
に順次添加し、前記方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結して行き、最後に上記の精製ｐＵＣ１９ベ
クター（約２．７Ｋｂｐ断片）に組込み、ＪＭ８３株を
形質転換した。この形質転換体に含まれるプラスミドに
ついて、前記方法に準じて、挿入された遺伝子の塩基配
列を調べたところ、目的とする完全長（約４８０ｂｐ）
のヒトＴＮＦ遺伝子を含むプラスミドベクター（約３．
２Ｋｂｐ）を有するクローンであることが確認できた。 このクローンをｐＵＡ４４／ＪＭ８３と命名し、プラス
ミドをｐＵＡ４４と命名した。

【００６２】 実施例４（ヒトＴＮＦ発現ベクターの構築）（１）大腸
菌ｔａｃプロモーターを有する発現ベクターｐＫＫ２２
３−３（ファルマシア社より入手）をより扱いやすくす
る目的で以下の改良を試みた。 （Ａ）発現ベクターを低分子量化する。 （Ｂ）制限酵素ＢａｍＨ　　Ｉの切断部位を唯一とする
。 （Ｃ）ｔａｃプロモーターの方向をアンピシリン耐性遺
伝子の方向と逆向きにする。

【００６３】図３にその方法を図示した。プラスミドベ
クターｐＢＲ３２２（九州大学遺伝情報実験施設より分
与）の５μｇを、実施例３の方法に準じて、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ　　ＩＩＩで切断後、その両末端
をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化した。実施例
３の方法に準じて、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度
１％）により約４．４ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離精製し
、その開環部位に１００ｎｇのノンフォスフォリレーテ
ッド　　リンカーズのＢｇｌ　　ＩＩリンカー（制限酵
素Ｂｇｌ　　ＩＩ切断部位を含む１０ｂｐの二本鎖ＤＮ
Ａ断片：カタログＮｏ．４７２１Ａタカラ・バイオテク
ノロジー・カタログ１９９１　　Ｖｏｌ．１、宝酒造よ
り入手）をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入連結した。 前記実施例３の方法に準じて得た形質転換体の中より、
そのプラスミドについて制限酵素による切断の可否を調
べることにより、目的の制限酵素ＥｃｏＲ　　Ｉ及びＨ
ｉｎｄ　　ＩＩＩ切断部位を欠き、制限酵素Ｂｇｌ　　
ＩＩ切断部位を新生したプラスミドｐＢＲ９３３３（約
４．４Ｋｂｐ）を有するクローンを得た。

【００６４】上記で得たプラスミドｐＢＲ９３３３の５
μｇを、実施例３の方法に準じて、ハイ・ソルトバッフ
ァーに溶解し、制限酵素Ｂｇｌ　　ＩＩ（宝酒造）及び
ＰｖｕＩＩ（宝酒造）で切断し、複製起点を含む約２．
３ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動（ゲル
濃度１％）により分離精製した。一方、発現ベクターｐ
ＫＫ２２３−３（約４．６Ｋｂｐ）の５μｇを上記の場
合と同様、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素
ＢａｍＨ　　Ｉ（宝酒造）及びＳｃａ　　Ｉ（宝酒造）
で切断した。制限酵素ＢａｍＨ　　Ｉによる切断反応は
、添加酵素量を通常の約１／２とし、反応時間を５〜３
０分間とする部分切断により行った。切断処理後、ｔａ
ｃプロモーター及びｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーター等
を含む約１．１ＫｂｐのＤＮＡ断片を上記の場合と同様
、アガロースゲル電気泳動により分離精製した。先に精
製した複製起点を含む約２．３ＫｂｐのＤＮＡ断片に上
記の約１．１ＫｂｐのＤＮＡ断片を前記に準じてＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて挿入連結し、実施例３の方法に準
じて、塩化カルシウム法により作製したＥ．ｃｏｌｉ　
　Ｋ−１２　　ＪＭ１０３株（九州大学遺伝情報実験施
設）のコンピテントセルに導入した。得られた形質転換
体の中より、目的とするｔａｃプロモーター等を含む発
現ベクター（約３．４Ｋｂｐ）を有するクローンを選択
し、この発現ベクターをｐＫＫ１０１と命名した。

【００６５】（２）図４に従って、次の工程を説明する
。前記（１）工程で得た発現ベクターｐＫＫ１０１の５
μｇを、前記方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲ　　Ｉ及
びＨｉｎｄ　　ＩＩＩで切断し、複製起点及び転写調節
領域等を含む約３．４ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロース
ゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により分離精製した。ま
た、前記実施例３で得られたヒトＴＮＦ遺伝子を含むプ
ラスミドｐＵＡ４４（約３．２Ｋｂｐ）を、同様にして
、制限酵素ＥｃｏＲ　　Ｉ及びＨｉｎｄ　　ＩＩＩで切
断し、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４８０ｂｐのＤＮ
Ａ断片をアガロースゲル電気泳動により分離精製した。 このヒトＴＮＦ遺伝子全域を含むＤＮＡ断片を、先に発
現ベクターｐＫＫ１０１より精製した約３．４Ｋｂｐの
ＤＮＡ断片に、前記方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて挿入連結し、前記の方法に準じてＥ．ｃｏｌｉ
　　Ｋ−１２　　ＪＭ１０３株に導入した。得られた形
質転換体の中より目的のヒトＴＮＦ発現ベクター（約３
．９Ｋｂｐ）を有するクローンを選択し、この発現ベク
ターをｐＫＦ４１０２と命名した。

【００６６】実施例５（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクター
ｐＫＦ４１６８の構築） （１）図５に従って説明する。前記実施例３で得られた
プラスミドｐＵＡ４４を、前記方法に準じ、制限酵素Ｅ
ｃｏＲ　　Ｉ及びＨｉｎｄ　　ＩＩＩで切断し、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子（全域を含む約４８０ｂｐ）のＤＮＡ断片を
アガロースゲル電気泳動により分離精製した。一方、Ｍ
ｅｓｓｉｎｇら〔Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ，１５３，３（１９８７）〕によって開発
された一本鎖プラスミドＤＮＡ調製用プラスミドベクタ
ーｐＵＣ１１９（宝酒造より入手）を、同様にして、制
限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ　　ＩＩＩで切断し、Ｉ
Ｇ領域を含む約３．２ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロース
ゲル電気泳動により分離精製した。このＩＧ領域（Ｍ１
３ファージＤＮＡのｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ　　ｒｅｇｉ
ｏｎ）の存在により、プラスミドｐＵＣ１１９は、ヘル
パーファージＭ１３Ｋ０７感染後優先的に一本鎖ＤＮＡ
となりファージ粒子に包み込まれ菌体外に放出される。 上記で精製したヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４８０ｂ
ｐのＤＮＡ断片とＩＧ領域を含む約３．２ＫｂｐのｐＵ
Ｃ１１９断片を前記に準じてＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結し、前記実施例３の方法に準じてＥ．ｃｏｌｉ　
　Ｋ−１２ＪＭ８３株に導入した。得られた形質転換体
の中より、目的のプラスミド（約３．７Ｋｂｐ）を有す
るクローンを選択し、このクローンをｐＵＣ１１９−ｈ
ＴＮＦ／ＪＭ８３と命名し、プラスミドをｐＵＣ１１９
−ｈＴＮＦと命名した。

【００６７】上記で得たプラスミドｐＵＣ１１９−ｈＴ
ＮＦを、そのＤＮＡ内にウラシルを取り込ませ保持する
ために、前記実施例３の方法に準じて、塩化カルシウム
法により作製した大腸菌ＣＪ２３６株（ｄｕｔ−，ｕｎ
ｇ−）のコンピテント　　セルに導入した。ＣＪ２３６
株はデオキシウリジン三リン酸分解酵素遺伝子に欠失変
異（ｄｕｔ−）を持つため競合反応が生じ、チミンの替
わりに一部ウラシルを取り込んだＤＮＡを作ることがで
き、更にｕｎｇ−変異によりウラシルＮ−グリコシラー
ゼが欠損しており、そのウラシルをＤＮＡ中に保持して
おくことができる。このＣＪ２３６株はバイオ・ラドよ
り入手した。上記導入により得られたクローン（ｐＵＣ
１１９−ｈＴＮＦ／ＣＪ２３６）をヘルパーファージＭ
１３Ｋ０７（宝酒造より入手）の感染後、１００μｇ／
ｍｌアンピシリン、７０μｇ／ｍｌカナマイシン及び３
０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む２×ＹＴブロ
ース（１．６％トリプトン、１％酵母エキス及び０．５
％ＮａＣｌｐＨ７．６）にて培養することにより、目的
のウラシルを導入した一本鎖プラスミドＤＮＡ（約３．
７Ｋｂａｓｅｓ）をファージ粒子に包み込んだ形で菌体
外に放出させた。放出させたファージ粒子を培養上清よ
り回収し、一本鎖ファージＤＮＡの調製方法に準じて、
目的の一本鎖プラスミドＤＮＡを調製した。

【００６８】（２）次に図６に従って説明する。コーデ
ィング鎖オリゴヌクレオチドを用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子に対し変異導入を行うために、プライマー４１６８を
デザインした。プライマー４１６８、配列番号１１で示
した１０番目のＣから２１番目のＴまでの塩基配列のう
ち１３〜１５番目の５′−ＡＣＣ−３′が５′−ＧＧＣ
−３′に置換され１６〜１８番目の５′−ＣＣＧ−３′
が５′−ＧＡＴ−３′に置換された１２塩基からなるオ
リゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドの化
学合成及び精製は、前記実施例２の方法に準じて行った
。

【００６９】ヒトＴＮＦ遺伝子への部位特異的変異導入
は、バイオ・ラドのシステム（ＭｕｔａーＧｅｎｅＴＭ
ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ　　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　　ｋ
ｉｔ）に準じて行った。すなわち、上記で作製した約０
．５μｇのプライマーの５′末端を前記方法に準じてＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した一部と
、先に調製したウラシル導入一本鎖プラスミドＤＮＡ（
ｐＵＣ１１９−ｈＴＮＦ）の約２００ｎｇとの間で、１
０μｌのアニーリング・バッファー（２０ｍＭトリス−
ＨＣｌ　　ｐＨ７．４，２ｍＭ　　ＭｇＣｌ２及び５０
ｍＭＮａＣｌ）中にてアニーリング（約７０℃に加温後
徐冷）を行った。アニーリング終了後、１０倍シンセシ
ス・バッファー（５ｍＭ各デオキシリボヌクレオチド三
リン酸など（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びＴＴＰ
）、１０ｍＭ　　ＡＴＰ、１００ｍＭ　　トリス−ＨＣ
ｌ　　ｐＨ７．４、５０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２及び２０ｍ
Ｍ　　ＤＴＴ）を１／１０容量加え、１ユニットのＴ４
ＤＮＡポリメラーゼ及び２〜４ユニットのＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて二本鎖化反応（３７℃、９０分間）を行
った。ＴＥバッファー（１０ｍＭ　　トリス−ＨＣｌ　
　ｐＨ７．５及び１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）を約８容量加え
、凍結することにより反応を停止した。前記実施例３の
方法に準じて、塩化カルシウム法により作製したＥ．ｃ
ｏｌｉ　　Ｋ−１２　　ＴＧｌ　　株（ｕｎｇ＋：アマ
シャム社）のコンピテントセルに、上記反応液を処理し
二本鎖ＤＮＡを導入した。

【００７０】ｕｎｇ＋株にへテロ二本鎖ＤＮＡを導入す
ることにより、鋳型であるウラシルを含むＤＮＡ鎖は不
活性化され複製の対象とならない。（そのため変異の導
入頻度は５０％を上回る高効率なものとなる。）得られ
た形質転換体の中より、変異導入のために使用したプラ
イマーをプローブとしたコロニー・ハイブリダイゼーシ
ョン法を用いて、目的の転換体ＤＮＡを含むプラスミド
（約３．７Ｋｂｐ）を有するクローンを選択した。選択
されたクローンについて、そのプラスミドの変異導入部
位周辺の塩基配列をジデオキシ法〔Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ：
前出〕により調べ、デザイン通りの転換体ＤＮＡに変異
していることを確認した。このプラスミドをｐＵＣ１１
９−Ｆ４１６８と命名した。

【００７１】（３）変異導入により得られた目的のヒト
ＴＮＦ転換体遺伝子を、実施例４のヒトＴＮＦ発現ベク
ターの構築方法に準じて、ｔａｃプロモーターを有する
発現ベクターｐＫＫ１０１に組込みヒトＴＮＦ転換体発
現ベクターを構築した。ヒトＴＮＦ転換体遺伝子（約４
８０ｂｐ）は、上記で得られた約３．７Ｋｂｐのプラス
ミドｐＵＣ１１９−Ｆ４１６８より、前記方法に準じて
、制限酵素ＥｃｏＲ　　Ｉ及びＨｉｎｄ　　ＩＩＩによ
る切断後分離精製した。目的とするヒトＴＮＦ転換体発
現ベクター（ｐＫＦ４１６８）は、ヒトＴＮＦ発現ベク
ター（ｐＫＦ４１０２）と同様、宿主としてＥ．ｃｏｌ
ｉ　　Ｋ−１２ＪＭ１０３株を用いて取得した。上記転
換体発現ベクターは、発現誘導により、以下に示す変換
を有する新規生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産す
る。

【００７２】ベクターｐＫＦ４１６８：配列番号１で示
したアミノ酸配列において、１番目〜８番目のアミノ酸
配列が配列番号２で示したアミノ酸配列で置換されたポ
リペプチドＦ４１６８をコードする。

【００７３】実施例６（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクター
ｐＫＦ４４１５、ｐＫＦ４４１６、ｐＫＦ４４１７及び
ｐＫＦ４４１８の構築） （１）前記実施例５（２）において、プライマー４１６
８の替りにそれぞれプライマー４４１５、同４４１６、
同４４１７又は同４４１８を用いて目的の変異導入ＤＮ
Ａを含むプラスミド（約３．７Ｋｂｐ）を取得した。ジ
デオキシ法によりデザイン通りの変換体ＤＮＡに変異し
ていることを確認し、これらのプラスミドをそれぞれｐ
ＵＣ１１９−Ｆ４４１５、ｐＵＣ１１９−Ｆ４４１６、
ｐＵＣ１１９−Ｆ４４１７又はｐＵＣ１１９−Ｆ４４１
８と命名した。

【００７４】ここで用いたプライマー４４１５、同４４
１６、同４４１７及び同４４１８は以下のオリゴヌクレ
オチドであり、その化学合成及び精製は前記実施例２の
方法に準じて行われた。

【００７５】プライマー４４１５：配列番号１１で示し
た７番目のＴから３０番目のＴまでの塩基配列のうち１
６〜１８番目の５′−ＣＣＧ−３′が５′−ＣＧＴ−３
′に置換され、１９〜２１番目の５′−ＡＧＴ−３′が
５′−ＧＧＴ−３′に置換された２４塩基からなるオリ
ゴヌクレオチドプライマー４４１６：配列番号１１で示
した１番目のＴから１８番目のＧまでの塩基配列のうち
９番目のＴと１０番目のＣとの間に５′−ＣＧＴＧＧＴ
ＧＡＴ−３′を挿入した２７塩基からなるオリゴヌクレ
オチド。プライマー４４１７：配列番号１１で示した１
０番目のＣから２７番目のＧまでの塩基配列のうち１８
番目のＧと１９番目のＡとの間に５′−ＣＧＴＧＧＴＧ
ＡＴ−３′を挿入した２７塩基からなるオリゴヌクレオ
チド。プライマー４４１８：配列番号１１で示した１番
目から９番目まで塩基配列に対し、１番目のＴに対して
その５′側に５′−ＣＧＴＧＧＴＧＡＴ−３′を付加し
、更にその５′側に５′−ＧＡＡＴＴＣＡＴＧ−３′を
付加した２７塩基からなるオリゴヌクレオチド。

【００７６】（２）変異導入により得られた目的のヒト
ＴＮＦ転換体遺伝子を、実施例４のヒトＴＮＦ発現ベク
ターの構築方法に準じて、ｔａｃプロモーターを有する
発現ベクターｐＫＫ１０１に組込みヒトＴＮＦ転換体発
現ベクターを構築した。ヒトＴＮＦ転換体遺伝子（約４
８０ｂｐ）は、上記で得られた約３．７Ｋｂｐのプラス
ミドｐＵＣ１１９−Ｆ４４１５、ｐＵＣ１１９−Ｆ４４
１６、ｐＵＣ１１９−Ｆ４４１７又はｐＵＣ１１９−Ｆ
４４１８より、前記方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲ　
　Ｉ及びＨｉｎｄ　　ＩＩＩによる切断後分離精製した
。目的とするヒトＴＮＦ転換体発現ベクターｐＫＦ４４
１５、ｐＫＦ４４１６、ｐＫＦ４４１７又はｐＫＦ４４
１８は、ヒトＴＮＦ発現ベクター（ｐＫＦ４１０２）と
同様、宿主としてＥ．ｃｏｌｉ　　Ｋ−１２ＪＭ１０３
株を用いて取得した。

【００７７】上記転換体発現ベクターは、発現誘導によ
り、以下に示す変換を有する新規生理活性ポリペプチド
を大腸菌内に生産する。ベクターｐＫＦ４４１５：配列
番号１で示したアミノ酸配列において、１番目〜８番目
のアミノ酸配列が配列番号３で示したアミノ酸配列で置
換されたポリペプチドＦ４４１５をコードする。ベクタ
ーｐＫＦ４４１６：配列番号１で示したアミノ酸配列に
おいて、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番号４で
示したアミノ酸配列で置換されたポリペプチドＦ４４１
６をコードする。ベクターｐＫＦ４４１７：配列番号１
で示したアミノ酸配列において、１番目〜８番目の配列
が配列番号５で示した配列で置換されたポリペプチドＦ
４４１７をコードする。ベクターｐＫＦ４４１８：配列
番号１で示したアミノ酸配列において、１番目〜８番目
の配列が配列番号６で示した配列で置換されたポリペプ
チドＦ４４１８をコードする。

【００７８】実施例７（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクター
ｐＫＦ４４２０の構築） （１）配列番号１１で示した５番目のＣから２０番目の
Ｇまでの１６塩基のうち１３番目のＡがＧに置換された
オリゴヌクレオチドをデザインし、プライマー４１０４
と命名した。このオリゴヌクレオチドの化学合成及び精
製は、前記実施例２の方法に準じて行った。前記実施例
５（２）においてプライマー４１６８の替りにこのプラ
イマー４１０４を用いることにより目的の変換体ＤＮＡ
を含むプラスミド（約３．７Ｋｂｐ）を取得した。変異
導入部位周辺の塩基配列をジデオキシ法により調べ、デ
ザイン通りの変換体ＤＮＡに変異していることを確認し
、このプラスミドをｐＵＣ１１９−Ｆ４１０４と命名し
た。

【００７９】（２）前記実施例５（１）においてｐＵＣ
１１９−ｈＴＮＦの替りにｐＵＣ１１９−Ｆ４１０４を
用いて目的の一本鎖プラスミドＤＮＡを調製した。また
、配列番号１１で示した４６番目のＧから６６番目のＧ
までの２１塩基のうち５６番目のＡがＧに置換されたオ
リゴヌクレオチドをデザインし、プライマー４２２６と
命名した。このオリゴヌクレオチドの化学合成及び精製
は前記実施例２の方法に準じて行った。

【００８０】次に、上記で調製したｐＵＣ１１９−Ｆ４
１０４の一本鎖プラスミドＤＮＡ及びプライマー４２２
６を用いてヒトＴＮＦ変換体遺伝子への部位特異的変異
導入を前記実施例５（２）の方法に準じて行い、目的の
変換体ＤＮＡを含むプラスミド（約３．７Ｋｂｐ）を取
得した。ジデオキシ法によりデザイン通りの変換体ＤＮ
Ａに変異していることを確認し、このプラスミドをｐＵ
Ｃ１１９−Ｆ４２２６と命名した。

【００８１】（３）前記実施例７（２）で得られた制限
酵素ＸｈｏＩ切断部位を２箇所に有するプラスミドｐＵ
Ｃ１１９−Ｆ４２２６を用いて、その生成した制限酵素
ＸｈｏＩ切断部位のＮ末端側に化学合成オリゴヌクレオ
チド（アニーリングにより二本鎖化したもの）を連結す
ることにより、Ｎ末置換型転換体ポリペプチド（Ｆ４４
２０と命名）の発現ベクター（ｐＫＦ４４２０と命名）
を構築した。その構築方法を図７に従って説明する。

【００８２】プラスミドｐＵＣ１１９−Ｆ４２２６（約
３．７Ｋｂｐ）の５μｇを、前記実施例３の方法に準じ
て、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素Ｘｈｏ
　　Ｉ（宝酒造）及びＨｉｎｄ　　ＩＩＩで切断し、Ｎ
末部分を欠失したＦ４２２６遺伝子を含む約４２０ｂｐ
のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％
）により分離精製した。また、Ｆ４２２６のＮ末部分に
置換する目的でデザインしたオリゴペプチドをコードす
るオリゴヌクレオチドの上鎖（Ｕ−４４２０）及び下鎖
（Ｌ−４４２０）を、前記実施例２の方法に準じて化学
合成し、精製した。上鎖Ｕ−４４２０は配列番号１２で
示した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ま
た下鎖Ｌ−４４２０は上鎖Ｕ−４４２０に相補する配列
を有する鎖であるが、このものは上鎖Ｕ−４４２０の１
番目〜４番目の５′−ＡＡＴＴ−３′に相補する配列部
分は有さず、一方その下鎖の５′末端のＧに対し、その
５′側に５′−ＴＣＧＡ−３′が付加された塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドである。精製後得られた２本
のオリゴヌクレオチド（各１μｇ）を、前記実施例３の
方法に準じて、その５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いてリン酸化の後、アニール化により二本鎖
ＤＮＡ断片（４６ｂｐ）とした。一方、前記実施例４の
方法に準じてプラスミドベクターｐＫＫ１０１を制限酵
素ＥｃｏＲ　　Ｉ及びＨｉｎｄ　　ＩＩＩで切断し、複
製起点及び転写調節領域等を含む約３．４ＫｂｐのＤＮ
Ａ断片を分離精製した。

【００８３】上記方法に従って得られた３本のＤＮＡ断
片を、前記実施例３の方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ　　Ｋ−１２　　ＪＭ
１０３株のコンピテント　　セルに導入した。得られた
形質転換体の中より、目的のＦ４４２０発現ベクターｐ
ＫＦ４４２０（約３．９Ｋｂｐ）を有するクローンを、
制限酵素ＥｃｏＲ　　Ｉ、Ｘｈｏ　　Ｉ及びＨｉｎｄ　
　ＩＩＩによる切断パターンの確認並びに転換体ポリペ
プチドのＮ末置換部位周辺の塩基配列を調べることによ
り選択した。

【００８４】上記方法に従って構築した転換体発現ベク
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。ベクター
ｐＫＦ４４２０：配列表の配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号７で示したアミノ酸配列で置換されたポリペプチドＦ
４４２０をコードする。

【００８５】実施例８（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクター
ｐＫＦ４４２１及びｐＫＦ４１３７の構築）前記実施例
７（１）で得られた制限酵素Ｘｈｏ　　Ｉ切断部位を有
するプラスミドｐＵＣ１１９−Ｆ４１０４を用いて、そ
の制限酵素Ｘｈｏ　　Ｉ切断部位のＮ末端側に化学合成
オリゴヌクレオチド（アニーリングにより二本鎖化した
もの）を連結することにより、Ｎ末置換型転換体ポリペ
プチド（Ｆ４４２１及びＦ４１３７と命名）の発現ベク
ター（ｐＫＦ４４２１及びｐＫＦ４１３７と命名）を構
築した。

【００８６】プラスミドｐＵＣ１１９−Ｆ４１０４（約
３．７Ｋｂｐ）の５μｇを、前記実施例３の方法に準じ
て、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素Ｘｈｏ
　　Ｉ及びＨｉｎｄ　　ＩＩＩで切断し、Ｎ末部分を欠
失したＦ４１０４遺伝子を含む約４６０ｂｐのＤＮＡ断
片をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により分
離精製した。また、Ｆ４１０４のＮ末部分に置換する目
的でデザインしたオリゴペプチドをコードするオリゴヌ
クレオチドの上鎖（Ｕ−４４２１又はＵ−４１３７）及
び下鎖（Ｌ−４４２１又はＬ−４１３７）を、前記実施
例２の方法に準じて、化学合成及び精製した。上鎖Ｕ−
４４２１は配列表の配列番号１３で示した配列を有する
オリゴヌクレオチドである。また下鎖Ｌ−４４２１は上
鎖Ｕ−４４２１に相補する配列を有する鎖であるが、上
鎖Ｕ−４４２１の１番目〜４番目の５′−ＡＡＴＴ−３
′に相補する配列部分は有さず、一方その下鎖の５′末
端のＧに対し、その５′側に５′−ＴＣＧＡ−３′が付
加された配列を有するオリゴヌクレオチドである。また
、上鎖Ｕ−４１３７は配列表の配列番号１４で示した配
列を有するオリゴヌクレオチドである。下鎖Ｌ−４１３
７は上鎖Ｕ−４１３７に相補する配列を有する鎖である
が、上鎖４１３７の１番目〜４番目の５′−ＡＡＴＴ−
３′に相補する配列部分は有さず、一方その下鎖の５′
末端のＧに対し、その５′側に５′−ＴＣＧＡ−３′が
付加された配列を有するオリゴヌクレオチドである。精
製後得られた各上、下２本のオリゴヌクレオチド（各１
μｇ）を、前記実施例３の方法に準じてその５′末端を
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化の後、
アニール化により二本鎖ＤＮＡ断片（３４ｂｐ）とした
。

【００８７】一方、前記実施例４の方法に準じてプラス
ミドベクターｐＫＫ１０１を制限酵素ＥｃｏＲ　　Ｉ及
びＨｉｎｄ　　ＩＩＩで切断し、複製起点及ひ転写調節
領域等を含む約３．４ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離精製し
た。

【００８８】上記方法に従って得られた各３本のＤＮＡ
断片を、前記実施例３の方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ　　Ｋ−１２　　Ｊ
Ｍ１０３株のコンピテントセルに導入した。得られた形
質転換体の中より、目的のＦ４４２１発現ベクターｐＫ
Ｆ４４２１（約３．９Ｋｂｐ）又はＦ４１３７発現ベク
ターｐＫＦ４１３７（約３．９Ｋｂｐ）を有するクロー
ンを、制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｘｈｏ　　Ｉ及びＨｉｎｄ
　　ＩＩＩによる切断パターンの確認並びに転換体ポリ
ペプチドのＮ末置換部位周辺の塩基配列を調べることに
より選択した。

【００８９】上記方法に従って構築した転換体発現ベク
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。ベクター
ｐＫＦ４４２１：配列表の配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号８で示したアミノ酸配列で置換されたポリペプチドＦ
４４２１をコードする。ベクターｐＫＦ４１３７：配列
表の配列番号１で示したアミノ酸配列において、１番目
〜８番目のアミノ酸配列が配列番号９で示したアミノ酸
配列で置換されたポポリペプチドＦ４１３７をコードす
る。

【００９０】実施例９（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクター
ｐＫＦ４６０１及びｐＫＦ４６０２の構築）（１）プラ
イマー４２９１及び同４２９２をデザインした。これら
プライマーは配列番号１１の１９３番目のＣから２１３
番目のＴまでの塩基配列を有し、２０２番目〜２０４番
目の５′−ＣＣＡ−３′が、プライマー４２９１の場合
５′−ＧＡＴ−３′により、プライマー４２９２の場合
５′−ＡＴＧ−３′によりそれぞれ置換された２１塩基
からなるオリゴヌクレオチドである。

【００９１】オリゴヌクレオチドの化学合成及び精製は
前記実施例２の方法に準じて行われた。これらプライマ
ー４２９１あるいは４２９２を用い、前記実施例５（１
）及び（２）の方法に準じて目的の変異導入ＤＮＡを含
むプラスミド（約３．７Ｋｂｐ）を得た。ジデオキシ法
によりデザイン通りの変換体ＤＮＡに変異していること
を確認し、このプラスミドをｐＵＣ１１９−Ｆ４２９１
あるいはｐＵＣ１１９−Ｆ４２９２と命名した。変異導
入により得られた目的のヒトＴＮＦ変換体遺伝子を実施
例４のヒトＴＮＦ発現ベクターの構築方法に準じて、ｔ
ａｃプロモーターを有する発現ベクターｐＫＫ１０１に
組込みヒトＴＮＦ変換体発現ベクターを構築した。ヒト
ＴＮＦ変換体遺伝子（約４８０ｂｐ）は、上記で得られ
た約３．７ＫｂｐのプラスミドｐＵＣ１１９−Ｆ４２９
１あるいはｐＵＣ１１９−Ｆ４２９２より、前記の方法
に準じて、制限酵素ＥｃｏＲ　　Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩ
による切断後分離精製した。目的とするヒトＴＮＦ変換
体発現ベクターｐＫＦ４２９１あるいはｐＫＦ４２９２
は、ヒトＴＮＦ発現ベクター（ｐＫＦ４１０２）と同様
、宿主としてＥ．ｃｏｌｉ　　Ｋ−１２　　ＪＭ１０３
株を用いて取得した。

【００９２】（２）図８に従って説明する。前記実施例
５で得られたヒトＴＮＦ転換体発現ベクターｐＫＦ４１
６８（約３．９Ｋｂｐ）の５μｇを、前記実施例３の方
法に準じて、ミディアム・ソルトバッファーに溶解し、
制限酵素Ｓａｃ　　Ｉ及びＨｉｎｄ　　ＩＩＩで切断し
、複製起点及び転写調節領域等を含む約３．５Ｋｂｐの
ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）
により分離精製した。一方、前記実施例９（１）で得ら
れたヒトＴＮＦ変換体発現ベクターｐＫＦ４２９１又は
ｐＫＦ４２９２の５μｇを、前記と同様にして、制限酵
素ＳａｃＩ及びＨｉｎｄ　　ＩＩＩで切断し、Ｎ末部分
を欠失したヒトＴＮＦ変換体遺伝子を含む約３６０ｂｐ
のＤＮＡ断片を分離精製した

【００９３】上記方法に従って得られた２本のＤＮＡ断
片を、前記実施例３の方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ　　Ｋ−１２　　ＪＭ
１０３株のコンピテントセルに導入した。得られた形質
転換体の中より、目的のＦ４６０１又はＦ４６０２発現
ベクターｐＫＦ４６０１又はｐＫＦ４６０２（約３．９
Ｋｂｐ）を有するクローンを、制限酵素Ｓａｃ　　Ｉ及
びＨｉｎｄ　　ＩＩＩによる切断パターンの確認並びに
変換体ポリペプチド由来の変換部位周辺の塩基配列を調
べることにより選択した。

【００９４】上記方法に従って構築した転換体発現ベク
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。ベクター
ｐＫＦ４６０１：配列番号１で示したアミノ酸配列にお
いて、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番号２で示
したアミノ酸配列で置換され、６８番目のＰｒｏがＡｓ
ｐに変換されたポリペプチドＦ４６０１をコードする。 ベクターｐＫＦ４６０２：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号２で示したアミノ酸配列で置換され、６８番目のＰｒ
ｏがＭｅｔに変換されたポリペプチドＦ４６０２をコー
ドする。

【００９５】実施例１０（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクタ
ーｐＫＦ４１１３の構築） 転写プロモーターとしてｔｒｐプロモーターを有し、翻
訳開始シグナル（ＳＤ配列）をタンデムに２つ並べ、転
写ターミネーターとしてｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネータ
ーを有するプラスミドベクター（ｐＳＫ４０７と命名）
を図９〜図１１に示した方法に従って構築した。プラス
ミドベクターｐＧＦ１０１（約４．３Ｋｂｐ、大阪大学
薬学部より分与）の５μｇを、前記方法に準じて、ミデ
ィアム・ソルトバッファーに溶解し、１０ユニットの制
限酵素Ｃｌａ　　Ｉ（宝酒造）を添加することにより切
断した。この切断されたＤＮＡ断片を、前記実施例３の
方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化
し、エタノール沈殿操作後、ＮａＣｌを添加しＮａＣｌ
濃度を１７５ｍＭとしたハイ・ソルトバッファーに溶解
し、１５ユニットの制限酵素Ｓａｌ　　Ｉ（宝酒造）を
添加することにより切断した。前記実施例３の方法に準
じて、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により
約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。

【００９６】一方、Ｃａｓａｄａｂａｎら〔Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．，１４３，９７１（１９８０）〕によっ
て開発されプラスミドｐＭＣ１４０３（約９．９Ｋｂｐ
、京都大学ウィルス研究所より分与）の５μｇを、前記
方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲ　　Ｉにより切断後、
上記方法と同様に、平滑化及び制限酵素Ｓａｌ　　Ｉ切
断を行い、アガロースゲル電気泳動により約６．２Ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片を分離精製した。前記実施例３の方法に
準じて、先に精製したＤＮＡ断片との間でＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結反応を行い、塩化カルシウム法によ
り作製したＥ．ｃｏｌｉ−Ｋ１２　　ＨＢ１０１株（京
都大学ウイルス研究所より分与）のコンピテントセルに
導入した。得られた形質転換体の中より、目的のｔｒｐ
プロモーター並びに制限酵素ＥｃｏＲ　　Ｉ及びＢａｍ
Ｈ　　Ｉ切断部位を含む約１０．２Ｋｂｐのプラスミド
ベクター（ｐＳＫ１０１と命名）を有するクローンを選
択した。

【００９７】上記で得られたプラスミドベクターｐＳＫ
１０１の５μｇを２本のチューブにそれぞれ別々に、前
記方法に準じて、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制
限酵素ＥｃｏＲ　　Ｉ及びＳａｌ　　Ｉ並びに制限酵素
ＢａｍＨ　　Ｉ及びＳａｌ　　Ｉを添加することにより
切断し、アガロースゲル電気泳動により約４．０Ｋｂｐ
及び約６．２ＫｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ分離精製し
た。一方、ポータブル翻訳開始部位オリゴヌクレオチド
（ＳＤ−ＡＴＧリンカーと略し、翻訳開始シグナルＳＤ
配列及び翻訳開始コドンＡＴＧを含む塩基数２１のオリ
ゴヌクレオチド：カタログＮｏ．２７−４８７８−０１
及び２７−４８９８−０１ファルマシア・モレキュラー
・バイオロジカルズ１９８５　　Ｍａｙ、ファルマシア
社より入手）の上下鎖（各１００ｎｇ）を、前記実施例
３の方法に準じて、その５′末端のリン酸化及びアニー
ル化に供し、二本鎖ＤＮＡ断片（２１ｂｐ）とした。上
記で得られた３本のＤＮＡ断片を、前記方法に準じて、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ　　
Ｋ−１２ＨＢ１０１株のコンピテントセルに導入した。 得られた形質転換体の中より、目的とするＳＤ−ＡＴＧ
リンカーがｔｒｐプロモーターの下流かつ制限酵素Ｂａ
ｍＨ　　Ｉ切断部位の直前に挿入された約１０．２Ｋｂ
ｐのプラスミドベクター（ｐＳＫ２１１と命名）を有す
るクローンを選択した。このプラスミドベクターは、ｔ
ｒｐプロモーターの下流にタンデムに並んだ２つのＳＤ
配列を持つことになる。

【００９８】このプラスミドベクターの制限酵素Ｓａｌ
　　Ｉ切断部位を消失し、その近傍に制限酵素Ｈｉｎｄ
　　ＩＩＩ切断部位を新生する目的で以下の操作を行っ
た。 プラスミドベクターｐＳＫ２１１の５μｇを前記方法に
準じて、制限酵素Ｓａｌ　　Ｉにて切断後、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑化した。エタノール沈殿操作
により回収したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨ　　Ｉで
切断し、アガロースゲル電気泳動により約４．０Ｋｂｐ
のＤＮＡ断片を分離精製した。一方、ｔａｃプロモータ
ーを有するプラスミドベクターｐＫＫ２２３−３（ファ
ルマシア社）及びＳＤ−ＡＴＧリンカー等を用い、前記
のｐＳＫ２１１を構築した方法に準じた組換えにより構
築したプラスミドベクターｐＧＦＫ５０３−１（約５．
７Ｋｂｐ）の５μｇを、前記方法に準じて制限酵素Ｈｉ
ｎｄ　　ＩＩＩにて切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを
用いて平滑化した。エタノール沈殿操作により回収した
ＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨ　　Ｉで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動により約１．１ＫｂｐのＤＮＡ断片を
分離精製した。上記で精製した２本のＤＮＡ断片を、前
記方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、
Ｅ．ｃｏｌｉ　　Ｋ−１２　　ＨＢ１０１株のコンピテ
ントセルに導入した。得られた形質転換体の中より、目
的の制限酵素Ｓａｌ　　Ｉ切断部位を欠きＨｉｎｄ　　
ＩＩＩ切断部位を新生したｔｒｐプロモーターを含む約
５．１Ｋｂｐのプラスミドベクター（ｐＳＫ３０１と命
名）を有するクローンを選択した。

【００９９】このプラスミドベクターｐＳＫ３０１の５
μｇを、前記方法に準じて、ロウ・ソルトバッファーに
溶解し、５ユニットの制限酵素Ｂａｌ　　Ｉ（宝酒造）
を添加して切断反応を行った。反応終了後、反応液のＮ
ａＣｌ濃度を５０ｍＭとして制限酵素Ｈｉｎｄ　　ＩＩ
Ｉによる切断を行い、約４．３ＫｂｐのＤＮＡ断片をア
ガロースゲル電気泳動により分離精製した。一方、プラ
スミドベクターｐＫＫ２２３−３の５μｇを、前記方法
に準じて、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素
Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩ及びＳｃａ　　Ｉで切断し、約０．
８ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により
分離精製した。上記で精製した２本のＤＮＡ断片を、前
記方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、
Ｅ．ｃｏｌｉ　　Ｋ−１２ＨＢ１０１株のコンピテント
セルに導入した。得られた形質転換体の中より、目的と
するｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターがｔｒｐプロモー
ターの下流に配置されたプラスミドベクターｐＳＫ４０
７（約５．１Ｋｂｐ）を有するクローンを選択した。

【０１００】次に、２本のオリゴヌクレオチド（Ｕ−４
１１３及びＬ−４１１３）をデザインした。

【０１０１】 Ｕ−４１１３（配列表の配列番号１５、塩基数３２）Ｌ
−４１１３（塩基数３２） Ｕ−４１１３に相補するものであるが、配列番号１５の
１番目〜４番目の５′−ＧＡＴＣ−３′に相補する塩基
配列は有さず、一方配列番号１５の３２番目のＣに相補
するＧに対しその５′側に５′−ＴＣＧＡ−３′を付加
された塩基配列を有する。

【０１０２】前記実施例２の方法に準じて化学合成し、
精製することにより作製し、得られたオリゴヌクレオチ
ド（各１μｇ）を前記実施例３の方法に準じて、その５
′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸
化の後、アニール化により二本鎖ＤＮＡ断片（３２ｂｐ
）とした。また、ｔｒｐプロモーター及びｒｒｎＢＴ１
Ｔ２ターミネーター等を有するプラスミドベクターｐＳ
Ｋ４０７（約５．１Ｋｂｐ）の５μｇを、前記実施例３
の方法に準じて、ハイ・ソルトバッファーに溶解し制限
酵素ＢａｍＨ　　Ｉ及びＨｉｎｄ　　ＩＩＩで切断し、
複製起点及び転写調節領域等を含む約４．０ＫｂｐのＤ
ＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）に
より分離精製した。一方、前記実施例７（１）で得られ
たプラスミドｐＵＣ１１９−Ｆ４１０４（約３．７Ｋｂ
ｐ）の５μｇを、実施例８の方法と同様に、制限酵素Ｘ
ｈｏ　　Ｉ及びＨｉｎｄ　　ＩＩＩで切断し、Ｎ末端部
分を欠失したＦ４１０４遺伝子を含む約４６０ｂｐのＤ
ＮＡ断片を分離精製した（図１２）。

【０１０３】上記方法に従って得られた３本のＤＮＡ断
片を、前記実施例３の方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ　　Ｋ−１２　　ＨＢ
１０１株のコンピテントセルに導入した。得られた形質
転換体の中より、目的の約４．５ＫｂｐのＦ４１１３発
現ベクター（ｐＫＦ４１１３と命名）を有するクローン
を、制限酵素ＢａｍＨ　　Ｉ、Ｘｈｏ　　Ｉ及びＨｉｎ
ｄ　　ＩＩＩによる切断パターンの確認並びに転換体ポ
リペプチドのＮ末端付加部位周辺の塩基配列を調べるこ
とにより選択した。

【０１０４】上記方法に従って構築した転換体発現ベク
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。ベクター
ｐＫＦ４１１３：配列番号１で示したアミノ酸配列にお
いて、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番号１０で
示したアミノ酸配列で置換されたポリペプチドＦ４１１
３をコードする。

【０１０５】実施例１１（ヒトＴＮＦ及び同転換体ポリ
ペプチドの大腸菌による発現及び精製）実施例４で得ら
れたヒトＴＮＦ発現ベクター（ｐＫＦ４１０２）及び実
施例５、６、７、８及び９で得られたヒトＴＮＦ転換体
発現ベクター（ｐＫＦ４１６８、ｐＫＦ４４１５、ｐＫ
Ｆ４４１６、ｐＫＦ４４１７、ｐＫＦ４４１８、ｐＫＦ
４４２０、ｐＫＦ４４２１、ｐＫＦ４１３７及びｐＫＦ
４６０１）を有するＥ．ｃｏｌｉ　　Ｋ−１２ＪＭ１０
３株を、２５〜５０μｇ／ｍｌアンピシリン及び０．０
０１％ビタミンＢ１を含むＭ９培地（０．６％　　Ｎａ
２ＨＰＯ４、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％　　Ｎ
ａＣｌ、０．１％　　ＮＨ４Ｃｌ、２ｍＭ　　ＭｇＳＯ
４、０．２％グルコース及び０．１ｍＭ　　ＣａＣｌ　
　２）２０ｍｌに接種し、３７℃、１８時間振とう培養
を行った。この培養液２０ｍｌを上記培地１リットル中
に加え、３７℃、２〜３時間振とう培養を行った。次い
で、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（
ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭとなるように添加し、更に
３７℃、１８時間振とう培養を続けた。

【０１０６】実施例１０で得られたヒトＴＮＦ転換体発
現ベクター（ｐＫＦ４１１３）を有するＥ．ｃｏｌｉ　
　Ｋ−１２ＨＢ１０１株については、２５〜５０μｇ／
ｍｌアンピシリン、０．００１％ビタミンＢ１及び５μ
ｇ／ｍｌトリプトファンを含むＭ９ＣＡ培地（０．６％
　　Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％　　ＫＨ２ＰＯ４、０．
０５％ＮａＣｌ、０．１％　　ＮＨ４ＣＩ、２ｍＭ　　
ＭｇＳ０４、０．２％グルコース及び０．１ｍＭ　　Ｃ
ａＣｌ２及び０．２％カザミノ酸）２０ｍｌに接種し、
３７℃、１８時間振とう培養を行った。５μｇ／ｍｌト
リプトファンを含まない上記培地１リットル中にこの培
養液２０ｍｌを加え、３７℃、１８時間振とう培養を行
った。

【０１０７】遠心分離操作による大腸菌菌体の回収後、
ＴＰバッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　　ｐＨ８．
０及び１００μＭ　　ＰＭＳＦ）を用いて菌体の洗浄を
行った。洗浄後、菌体グラム当たり１０容量（ｍｌ）の
ＴＰバッファーに菌体を懸濁させ、超音波発生装置（ヒ
ート・システムズ；モデルＷ−２２５）を用いて菌体を
超音波破砕処理した。得られた懸濁液を遠心分離するこ
とにより、菌体残渣を除去し上清画分を回収した。この
超音波破砕処理以降の精製工程は、主に低温下（０℃〜
４℃）で行った。

【０１０８】この上清を０．４５μｍフィルターにてろ
過した後、セパビーズＦＰ−ＤＡ１３（三菱化成）を用
いた陰イオン交換クロマトグラフィー（カラムサイズ：
φ２．５×１．５ｃｍ及び流速：０．５ｍｌ／分）で分
画し、後記ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及
びＬ９２９細胞を用いた後記実施例１２の方法に準じて
活性の有無を検定することによって活性画分を得た。溶
出にはＮａＣｌを含むＴＰバッファーを用い、ＮａＣｌ
濃度を０．０５Ｍから０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．５Ｍへ
と段階的に上げ、ヒトＴＮＦ（１）は０．１Ｍ　　Ｎａ
Ｃｌで、ヒトＴＮＦ（２）、ヒトＴＮＦ転換体Ｆ４４１
５、同Ｆ４４１７、同Ｆ４４１８、同Ｆ４４２０及び同
Ｆ４６０１は０．２Ｍ　　ＮａＣｌで並びにヒトＴＮＦ
転換体Ｆ４１６８は０．５ＭＮａＣｌでそれぞれ溶出し
た。更に大腸菌菌体由来のエンドトキシン等を除去する
ために、核酸・エンドトキシン除去剤Ｃ−９（栗田工業
製造、大日本製薬販売）処理を添付マニュアルに準じて
行った。かくして、ヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプチ
ドの一段階精製試料を得た。

【０１０９】この試料を使用して、後記実施例１２、１
３及び１４の抗腫瘍活性の評価及び実験的肺転移に及ぼ
す効果の評価を行った。なお、転換体ポリペプチドＦ４
４１６、Ｆ４４２１及びＦ４１３７については使用した
宿主大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　　Ｋ−１２　　ＪＭ１０３　
　株中並びにＦ４１１３については使用した宿主大腸菌
Ｅ．ｃｏｌｉ　　Ｋ−１２　　ＨＢ１０１　　株中での
不安定性のためか、活性画分を得ることができなかった
。しかしながら他の宿主を使用すれば活性画分を得られ
る可能性がある。

【０１１０】上記試料を０．２０μｍフィルターにてろ
過した後、ＦＰＬＣシステムによる制御下のモノＱ（登
録商標）（ＨＲ１０／１０及びＨＲ５／５）プレパック
カラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製）
を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーで、ＮａＣｌ
を含むＴＰＱバッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ
８．０及び１０μＭ　　ＰＭＳＦ）によって溶出し、分
画を後記ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び
Ｌ９２９細胞を用いた実施例１２の方法に準じて活性の
有無を検定することによって活性画分を得た。溶出方法
は、ＦＰＬＣシステムの制御下で下記プログラムに従っ
て行った。第３ステップは、精製純度を上げるためにＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一バ
ンドとなるまで数回繰り返した。

【０１１１】 第１ステップ：モノＱ（登録商標）（ＨＲ１０／１０）
カラム使用 （流速：４ｍｌ／分） ０〜５分；０−０．２Ｍ　　ＮａＣｌ　　直線濃度勾配
５〜１６分；０．２Ｍ　　ＮａＣｌ １６〜２０分；０．２−０．５Ｍ　　ＮａＣｌ　　直線
濃度勾配 ２０〜２４分；０．５Ｍ　　ＮａＣｌ 上記方法に従った活性画分の分画結果（ＮａＣｌ濃度及
び保持時間）は、ヒトＴＮＦ（１）が０．２Ｍ、６．６
分、ヒトＴＮＦ（２）が０．２Ｍ、５．６分、ヒトＴＮ
Ｆ転換体Ｆ４１６８が０．２Ｍ、６．４分、同Ｆ４４１
５が０．２Ｍ、７．８分、同Ｆ４４１７が０．２Ｍ、５
．４分、同Ｆ４４１８が０．２Ｍ、５．４分、同Ｆ４４
２０が０．１８Ｍ、４．１分及び同Ｆ４６０１が０．２
Ｍ、７．０分であった。

【０１１２】 第２ステップ：モノＱ（登録商標）（ＨＲ　　５／５）
カラム使用 （流速：１ｍｌ／分） ０〜２．５分；０−０．２Ｍ　　ＮａＣｌ　　直線濃度
勾配２．５〜８分；０．２Ｍ　　ＮａＣｌ ８〜１０分；０．２−０．５Ｍ　　ＮａＣｌ　　直線濃
度勾配 １０〜１２分；０．５Ｍ　　ＮａＣｌ 上記方法に従った活性画分の分画結果（ＮａＣｌ濃度及
び保持時間）は、ヒトＴＮＦ（１）が０．２Ｍ、３．７
分、ヒトＴＮＦ（２）が０．２Ｍ、４．１分、ヒトＴＮ
Ｆ転換体Ｆ４１６８が０．２Ｍ、３．９分、同Ｆ４４１
５が０．２Ｍ、６．０分、同Ｆ４４１７が０．２Ｍ、３
．９分、同Ｆ４４１８が０．２Ｍ、３．３分、同Ｆ４４
２０が０．２Ｍ、３．２分及び同Ｆ４６０１が０．２Ｍ
、４．９分であった。

【０１１３】 第３ステップ：モノＱ（登録商標）（ＨＲ５／５）カラ
ム使用 （流速：１ｍｌ／分） ０〜６分；０−０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ直線濃度勾配６
〜１１分；０．１５−０．２Ｍ　　ＮａＣｌ　　直線濃
度勾配 １１〜１３分；０．２−０．５Ｍ　　ＮａＣｌ　　直線
濃度勾配 １３〜１５分；０．５Ｍ　　ＮａＣｌ 上記方法に従った活性画分の分画結果（ＮａＣｌ濃度及
び保持時間）は、ヒトＴＮＦ（１）が０．１６Ｍ、６．
５分、ヒトＴＮＦ（２）が０．１６Ｍ、６．５分、ヒト
ＴＮＦ転換体Ｆ４１６８が０．１７Ｍ、６．７分、同Ｆ
４４１５が０．１６Ｍ、６．４分、同Ｆ４４１７が０．
１６Ｍ、６．５分、同Ｆ４４１８が０．１６Ｍ、６．２
分、同Ｆ４４２０が０．１５Ｍ、５．６分及び同Ｆ４６
０１が０．１９Ｍ、９．８分であった。

【０１１４】かくしてヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプ
チドの精製試料を得た。この試料を使用して後記実施例
１２の抗腫瘍活性の評価を行った。

【０１１５】上記精製の過程及び精製試料についてＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ヒトＴＮ
Ｆ及び同転換体ポリペプチドの発現及び精製の確認をし
た。各試料を１０ｍＭ　　ＤＴＴを含有するＬａｅｍｍ
ｌｉ’ｓ　　サンプル・バッファー（６２．５ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ　　ｐＨ　　６．８、２％ＳＤＳ、０．０１
％ＢＰＢ及び１０％グリセロール）に加え、Ｌａｅｍｍ
ｌｉ〔Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０）〕の
方法に準じ、１５％の分離用ゲルを用いて電気泳動を行
った。電気泳動終了後、分離用ゲル中の蛋白質をクマシ
ー・ブリリアント・ブルーで染色することにより確認し
た。図１３及び１４にその結果の一部を示した。活性画
分を得ることのできたヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプ
チドのそれぞれの発現ベクターによる発現量はほぼ同程
度であり、得られた染色ゲルをクロマト・スキャナー（
島津、ＣＳ−９２０型）にかけてその発現効率を算出し
たところ、大腸菌総菌体蛋白質の約２０％であった。ま
た、最終精製試料は、得られた染色ゲルにおいて単一バ
ンドであった。その泳動位置より、ヒトＴＮＦ及び同転
換体ポリペプチドの分子量を算出し表１に示した。

【０１１６】なお、蛋白質の物性の一つとして、ヒトＴ
ＮＦ及び同転換体ポリペプチドの等電点をアンフォライ
ン（ＬＫＢ社製）を用いた等電点ゲル電気泳動法により
測定し、得られた結果を表１に示した。

【０１１７】

【表１】

【０１１８】 実施例１２（ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性の評価）実
施例１１で得られたヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプチ
ドの一段階精製試料及び精製試料について、マウス由来
結合組織細胞Ｌ９２９（ＡＴＣＣ　　ＣＣＬ１）に対す
る細胞傷害活性をＡｇｇａｒｗａｌら〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．
ｃｈｅｍ．，２６０，　　２３４５（１９８５）〕の方
法に準じて求めた。すなわち、９６ウエルの組織培養用
のマイクロプレート（コーニング社製）に３×１０４細
胞／０．１ｍｌ／ウエルでＬ９２９細胞を植え、５％炭
酸ガス存在下３７℃で一晩培養した。培地としては、１
０％のウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏによって修
飾されたイーグルのミニマム・エッセンシャル培地（Ｄ
ＭＥ培地、シグマ社製）を用いた。翌日、最終濃度１μ
ｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤを添加した上記培地に培
地を交換し、この培地にて段階希釈した試料を各ウエル
に処理した（総培地量０．１ｍｌ）。更に２０時間の培
養後、０．５％クリスタル・バイオレット溶液（０．５
％クリスタル・バイオレット／２０％メタノール）にて
プレートに付着した生細胞を染色（室温、１５分間）し
た。１ｍＭ　　ＣａＣｌ２及び１ｍＭ　　ＭｇＣｌ２を
含むリン酸バッファーＰＢＳ（１０ｍＭ　　Ｎａ・Ｋリ
ン酸塩ｐＨ７．４、０．８％ＮａＣｌ及び　　０．０２
％ＫＣｌ）で充分洗浄した後、３０％エタノールを含む
０．０１Ｎ塩酸溶液０．１ｍｌを用いてプレートに残っ
たクリスタル・バイオレットを抽出し、その吸光度（４
９２ｎｍ）をＥＩＡリーダー（バイオ・ラド社製、モデ
ル２５５０）で測定した。この吸光度は生存細胞数に比
例する。そこで、試料無処理ウエルの吸光度の５０％の
値に相当する吸光度を示すウエルにおける試料の最終希
釈率を求め、この試料希釈率の逆数をその試料の１ｍｌ
当りのユニット数〔ユニット／ｍｌ〕と定義する。

【０１１９】上記方法に準じて求めたＬ９２９細胞傷害
活性（ユニット／ｍｌ）から各試料の比活性（ユニット
／ｍｇ・蛋白）を算出するために、各試料の蛋白定量を
行った。定量はＢｒａｄｆｏｒｄ法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．，７２，２４８（１９７６）〕に準じ、標準
試料としてウシ血清アルブミンを用いて蛋白濃度（ｍｇ
／ｍｌ）を求めた。これらの結果より、ヒトＴＮＦ及び
同転換体ポリペプチド試料について算出した比活性を表
２に示した。

【０１２０】

【表２】

【０１２１】上記表２から、本発明のヒトＴＮＦ転換体
ポリペプチドは、ヒトＴＮＦと同様、マウス由来結合組
織細胞Ｌ９２９に対する細胞傷害活性作用を有すること
がわかる。

【０１２２】 実施例１３（ｉｎ　　ｖｉｖｏ　　抗腫瘍活性の評価）
実施例１１で得られたヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプ
チドの一段階精製試料について、マウス可移植線維芽肉
腫ＭｅｔｈＡ腫瘍に対する抗腫瘍治療活性を求めた。試
験は、生理食塩水に懸濁した１×１０６細胞／０．２ｍ
ｌのＭｅｔｈＡ腫瘍細胞（佐々木研究所より分与）をＢ
ＡＬＢ／ｃマウス（雄、５週令、チャールズ・リバー）
の背中部皮下に移植し、８日後腫瘍径が６〜１０ｍｍに
達したのを確認し、生理食塩水にて段階希釈した試料（
０．２ｍｌ／マウス）を尾静脈より投与することにより
行った。致死量を最高投与量とし、数段階の希釈により
各投与試料を作製した。

【０１２３】投与後約２週間、腫瘍増殖等の観察を続け
た。腫瘍増殖については、腫瘍容積（腫瘍塊の長径×短
径２／２）を計測し、試料投与日（０日）の腫瘍容積に
対する腫瘍容積率を求め、この値が２又は５となる試料
投与日からの日数（Ｄ２又はＤ５）を算定する。そして
、コントロール群（生理食塩水投与）に対する比率を算
出し、Ｄ２％コントロール値及びＤ５％コントロール値
を求めた。その値が大きい程、腫瘍増殖能が低下してお
り高い抗腫瘍活性を示すことを意味する。上記に準じて
得られた結果を表３及び表４に掲載した。

【０１２４】

【表３】

【０１２５】

【表４】

【０１２６】表３及び表４から、本発明のヒトＴＮＦ転
換体ポリペプチドは、ヒトＴＮＦと同様、マウスに移植
のＭｅｔｈＡ腫瘍に対する抗腫瘍治療活性作用を有する
ことがわかる。

【０１２７】実施例１４（腫瘍の肺転移に及ぼす効果）
Ｂ１６Ｆ１０マウス悪性黒色腫細胞（千葉大　　医学部
より分与）を以下の方法でクローン化することにより、
肺に対して高転移性を示すクローンを樹立した。すなわ
ち、イーグルのミニマム・エッセンシャル培地（ＭＥＭ
培地、日水製薬社製）に懸濁した２×１０４細胞／０．
２ｍｌのＢ１６Ｆ１０細胞をＣ５７ＢＬ／６　　ＮＣｒ
ｊマウス（雌、６週令、チャールズ・リバー）の尾静脈
内に注入し、１４日後に肺を摘出した。ＤＭＥ培地で洗
浄後、肺表面に形成された直径１ｍｍ程度の転移結節の
１つを２６Ｇ注射針付シリンジ（テルモ社製）を用いて
吸引し、１ｍｌのＤＭＥ培地に懸濁した後、１０％のウ
シ胎児血清を含むＤＭＥ培地含有軟寒天上で、５％炭酸
ガス存在下３７℃で培養することによりコロニー形成を
行った。このコロニー形成法は、「組織培養の技術」（
ページ３５〜３６、１９８４年、日本組織培養学会編、
朝倉書店）記載の方法に準じた。１０〜１２日後、コロ
ニーの径が１〜２ｍｍに達したところでパスツールピペ
ットを用いてコロニーを吸引し、１０％のウシ胎児血清
を含むＤＭＥ培地中にて培養した。培養後、増殖した細
胞を再びＭＥＭ培地を用いて２×１０４細胞／０．２ｍ
ｌの細胞濃度に調製し、上記の場合と同様、同マウスの
尾静脈内に注入した。１４日後に肺を摘出し、前回と同
様にして、転移結節の１つを単離・培養した。このよう
な操作を５回繰り返し、肺に高転移性を示すクローン（
Ｂ１６Ｆ１０／Ｌ５と命名）を獲得した。

【０１２８】１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地中
で直径１０ｃｍの組織培養用ディッシュ〔コーニング（
登録商標）岩城硝子社製〕を用いて培養した対数増殖期
のＢ１６Ｆ１０／Ｌ５細胞を、ディッシュ付着状態でリ
ン酸バッファーＰＢＳを用いて１回洗浄し、ＭＥＭ培地
５ｍｌを加えピペッティングを行うことにより細胞懸濁
液とした。遠心分離操作により細胞を集め、２ｍｌのＭ
ＥＭ培地に再懸濁した。一方、実施例１１で得られたヒ
トＴＮＦ及び同転換体ポリペプチドの一段階精製試料を
、所定の濃度（実施例１３の抗腫瘍治療試験において、
治療効果を示した投与量を本試験の投与量として使用し
た。）になるようにＭＥＭ培地で希釈し、その溶液中に
先に調製したＢ１６Ｆ１０／Ｌ５細胞懸濁液を添加する
ことにより、２×１０４細胞／０．２ｍｌの各一段階精
製試料を含む細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を
Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊマウス（雌、６週令）の尾静脈
より投与した（０．２ｍｌ／マウス）。コントロール群
はＢ１６Ｆ１０／Ｌ５細胞のみを投与した。投与１４日
後に肺を摘出し、肺表面の転移結節数を計測した。 上記に準じて得られた結果を表５及び表６に掲載した。

【０１２９】

【表５】

【０１３０】

【表６】

【０１３１】表５及び表６から、ヒトＴＮＦ及び同変換
体ポリペプチドが実験的肺転移を亢進する作用を有する
のに対し、そのＮ末端近傍にＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配
列を導入した本発明のヒトＴＮＦ転換体ポリペプチドは
実験的肺転移を亢進しないことがわかる。

【０１３２】

【発明の効果】本発明によれば、ヒトＴＮＦ又はその変
換体において、配列表の配列番号１の１番目のＳｅｒか
ら８番目のＡＳＰまでのアミノ酸配列あるいはそれに対
応するヒトＴＮＦ変換体のアミノ酸配列がＡｒｇ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｐ配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１
６個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されるこ
とにより、ヒトＴＮＦ又はその変換体と同様の抗腫瘍活
性作用を有し、一方それらで認められた癌転移の充進作
用を示さない新規なヒトＴＮＦ転換体が提供される。

【配列表】配列番号　　：１ 配列の長さ：１５５ 配列の型　　：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配　　列 配列番号　　：２ 配列の長さ：８ 配列の型　　：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配　　列 配列番号　　：３ 配列の長さ：８ 配列の型　　：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配　　列 配列番号　　：４ 配列の長さ：１１ 配列の型　　：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配　　列 配列番号　　：５ 配列の長さ：１１ 配列の型　　：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配　　列 配列番号　　：６ 配列の長さ：１１ 配列の型　　：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配　　列 配列番号　　：７ 配列の長さ：３ 配列の型　　：アミノ酸 トポロジー：直鎖伏 配列の種類：ペプチド 配　　列 配列番号　　：８ 配列の長さ：１４ 配列の型　　：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配　　列 配列番号　　：９ 配列の長さ：１４ 配列の型　　：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配　　列 配列番号　　：１０ 配列の長さ：１６ 配列の型　　：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配　　列 配列番号　　：１１ 配列の長さ：４６５ 配列の型　　：核　　酸 鎖の数　　　　：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配　　列 配列番号　　：１２ 配列の長さ：４６ 配列の型　　：核酸 鎖の数　　　　：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配　　列 配列番号　　：１３ 配列の長さ：３４ 配列の型　　：核酸 鎖の数　　　　：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配　　列 配列番号　　：１４ 配列の長さ：３４ 配列の型　　：核酸 鎖の数　　　　：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配　　列 配列番号　　：１５ 配列の長さ：３２ 配列の型　　：核酸 鎖の数　　　　：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配　　列

【図面の簡単な説明】

【図１】合成オリゴヌクレオチドの連結によるヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の構築過程を示す工程図である。

【図２】合成オリゴヌクレオチドの連結によるヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の構築過程を示す工程図である。

【図３】ヒトＴＮＦ発現型プラスミドベクターの構築過
程を示す工程図である。

【図４】ヒトＴＮＦ発現ベクターの構築過程を示す工程
図である。

【図５】部位特異的変異法によるヒトＴＮＦ変換体又は
同転換体遺伝子の作製過程を示す工程図である。

【図６】部位特異的変異法によるヒトＴＮＦ変換体又は
同転換体遺伝子の作製過程を示す工程図である。

【図７】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えによ
るヒトＴＮＦ転換体発現ベクターの構築過程を示す工程
図である。

【図８】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えによ
るヒトＴＮＦ転換体発現ベクターの構築過程を示す工程
図である。

【図９】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えによ
るヒトＴＮＦ転換体発現型プラスミドベクターの構築過
程を示す工程図である。

【図１０】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えに
よるヒトＴＮＦ転換体発現型プラスミドベクターの構築
過程を示す工程図である。

【図１１】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えに
よるヒトＴＮＦ転換体発現型プラスミドベクターの構築
過程を示す工程図である。

【図１２】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えに
よるヒトＴＮＦ転換体発現ベクターの構築過程を示す工
程図である。

【図１３】大腸菌により発現されたヒトＴＮＦ及び同転
換体ポリペプチドの精製試料の電気泳動結果を示す図で
ある。

【図１４】大腸菌により発現されたヒトＴＮＦ転換体ポ
リペプチドの精製試料の電気泳動結果を示す図である。

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　配列表の配列番号１で示した１番目の
   Ｓｅｒから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ
   酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換
   体において、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８番
   目のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する
   前記変換体のアミノ酸配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐの
   アミノ酸配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１６
   個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されている
   ことを特徴とするポリペプチド。
2. 【請求項２】　　前記Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミノ
   酸配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１６個のア
   ミノ酸を含むアミノ酸配列が配列表の配列番号２、３、
   ４、５、６、７、８、９又は１０で示したアミノ酸配列
   である請求項１記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】　　前記Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミノ
   酸配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１６個のア
   ミノ酸を含むアミノ酸配列が配列表の配列番号２、３、
   ５、６又は７である請求項１記載のポリペプチド。
4. 【請求項４】　　前記腫瘍壊死因子ポリペプチド又はそ
   の変換体が、配列表の配列番号１で示した９番目のＬｙ
   ｓから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配
   列あるいは当該アミノ酸配列の６８番目のＰｒｏが他の
   アミノ酸により置換されたアミノ酸配列を有する請求項
   １又は２記載のポリペプチド。
5. 【請求項５】　　前記他のアミノ酸がＡｓｐ又はＭｅｔ
   である請求項４記載のポリペプチド。
6. 【請求項６】　　配列表の配列番号１で示した１番目の
   Ｓｅｒから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ
   酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換
   体において、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８番
   目のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する
   前記変換体のアミノ酸配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐの
   アミノ酸配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１６
   個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されている
   ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むことを特徴とす
   る組換えプラスミド。
7. 【請求項７】　　前記組換えプラスミドがｐＫＦ４１６
   ８、ｐＫＦ４４１５、ｐＫＦ４４１６、ｐＫＦ４４１７
   、ｐＫＦ４４１８、ｐＫＦ４４２０、ｐＫＦ４４２１、
   ｐＫＦ４１１３、ｐＫＦ４１３７、ｐＫＦ４６０１又は
   ｐＫＦ４６０２である請求項６記載の組換えプラスミド
   。
8. 【請求項８】　　配列表の配列番号１で示した１番目の
   Ｓｅｒから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ
   酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換
   体において、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８番
   目のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する
   前記変換体のアミノ酸配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐの
   アミノ酸配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１６
   個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されている
   ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミ
   ドにより形質転換された組換え微生物細胞。
9. 【請求項９】　　前記組換え微生物細胞が大腸菌である
   請求項８記載の組換え微生物細胞。
10. 【請求項１０】　　配列表の配列番号１で示した１番目
    のＳｅｒから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミ
    ノ酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変
    換体において、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８
    番目のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応す
    る前記変換体のアミノ酸配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ
    のアミノ酸配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１
    ６個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されてい
    るポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えプラス
    ミドにより形質転換された組換え微生物細胞を培地中で
    培養し、当該アミノ酸配列を有するポリペプチドを産生
    し分離することを特徴とするポリペプチドの製造方法。
11. 【請求項１１】　　配列表の配列番号１で示した１番目
    のＳｅｒから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミ
    ノ酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変
    換体において、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８
    番目のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応す
    る前記変換体のアミノ酸配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ
    のアミノ酸配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１
    ６個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されてい
    るポリペプチドを有効成分として含有することを特徴と
    する医薬組成物。
12. 【請求項１２】　　前記Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミ
    ノ酸配列を少くとも１個含み、かつ、３個〜１６個のア
    ミノ酸を含むアミノ酸配列が配列表の配列番号２、３、
    ４、５、６、７、８、９又は１０で示したアミノ酸配列
    であるポリペプチドを含有する請求項１１記載の医薬組
    成物。
13. 【請求項１３】　　前記Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミ
    ノ酸配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１６個の
    アミノ酸を含むアミノ酸配列が配列表の配列番号２、３
    、５、６又は７で示したアミノ酸配列であるポリペプチ
    ドを含有する請求項１１記載の医薬組成物。
14. 【請求項１４】　　前記腫瘍壊死因子ポリペプチド又は
    その変換体が、配列番号１で示した９番目のＬｙｓから
    １５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列ある
    いは当該アミノ酸配列の６８番目のＰｒｏが他のアミノ
    酸により置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチド
    を含有する請求項１１又は１２記載の医薬組成物。
15. 【請求項１５】　　前記他のアミノ酸がＡｓｐ又はＭｅ
    ｔであるポリペプチドを含有する請求項１４記載の医薬
    組成物。
16. 【請求項１６】　　配列表の配列番号１で示した１番目
    のＳｅｒから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミ
    ノ酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変
    換体において、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８
    番目のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応す
    る前記変換体のアミノ酸配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ
    のアミノ酸配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１
    ６個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されてお
    り、更にそのＮ末端にＭｅｔを有することを特徴とする
    ポリペプチド。
17. 【請求項１７】　　配列表の配列番号１１で示した１番
    目のＴから４６５番目のＧまでで表わされる塩基配列を
    有する腫瘍壊死因子ポリペプチドのＤＮＡ又はその変異
    導入ＤＮＡにおいて、１〜３番目のＴＣＡから２２〜２
    ４番目のＧＡＣまでの塩基配列あるいはそれらに対応す
    る前記変異導入ＤＮＡの塩基配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａ
    ｓｐのアミノ酸配列を少なくとも１個含み、かつ、３個
    〜１６個のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩
    基配列により置換されていることを特徴とするＤＮＡ。