JPH04368398A - ポリペプチド - Google Patents
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Landscapes
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はヒトTNF転換体として
新規なポリペプチドを提供することに係り、ポリペプチ
ド自身、それを含む医薬組成物、その製造方法、その遺
伝子組換えDNA及びプラスミド、形質転換微生物細胞
などに関する。
新規なポリペプチドを提供することに係り、ポリペプチ
ド自身、それを含む医薬組成物、その製造方法、その遺
伝子組換えDNA及びプラスミド、形質転換微生物細胞
などに関する。
【0002】
【従来の技術】TNF(腫瘍壊死因子)は、1975年
にCarswellらにより予めBacillus
Calmette Guerin(BCG)に感染さ
れエンドトキシンで処理したマウスの血清中に存在する
ことが見出された生理活性物質であり〔Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 72 3666
(1975)〕、1984年にPennicaらにより
ヒトTNFのcDNAがクローニングされヒトTNF蛋
白質の全一次構造(アミノ酸配列)が明らかにされた〔
Nature312,724(1984)〕。TNFは
腫瘍細胞に対する細胞傷害活性、移植腫瘍に対する出血
性壊死、増殖の抑制など特異的な抗腫瘍作用を有するが
、最近では高脂血症、血圧低下、発熱などの副作用も生
じうることが報告されており、薬効、副作用などでより
優れたものを見出すべく研究、開発がなされている。例
えば特開昭61−40221、同63−119692、
特開平1−277488各号公報では遺伝子操作技術に
よりヒトTNF蛋白質中の特定のアミノ酸を欠失したり
、他のアミノ酸に置換したりあるいは付加したりしてヒ
トTNF変換体を提供している。
にCarswellらにより予めBacillus
Calmette Guerin(BCG)に感染さ
れエンドトキシンで処理したマウスの血清中に存在する
ことが見出された生理活性物質であり〔Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 72 3666
(1975)〕、1984年にPennicaらにより
ヒトTNFのcDNAがクローニングされヒトTNF蛋
白質の全一次構造(アミノ酸配列)が明らかにされた〔
Nature312,724(1984)〕。TNFは
腫瘍細胞に対する細胞傷害活性、移植腫瘍に対する出血
性壊死、増殖の抑制など特異的な抗腫瘍作用を有するが
、最近では高脂血症、血圧低下、発熱などの副作用も生
じうることが報告されており、薬効、副作用などでより
優れたものを見出すべく研究、開発がなされている。例
えば特開昭61−40221、同63−119692、
特開平1−277488各号公報では遺伝子操作技術に
よりヒトTNF蛋白質中の特定のアミノ酸を欠失したり
、他のアミノ酸に置換したりあるいは付加したりしてヒ
トTNF変換体を提供している。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、十分満
足な薬理作用を有するヒトTNF変換体は、いまだ得ら
れていない。本発明の目的は、ヒトTNF又はその変換
体と同様の抗腫瘍作用を有し、一方それらで認められた
癌転移の亢進作用を示さない新規なヒトTNF転換体、
それらに関連する,ポリペプチドとそれらの製造方法、
プラスミド、微生物細胞など、及び用途を提供すること
にある。
足な薬理作用を有するヒトTNF変換体は、いまだ得ら
れていない。本発明の目的は、ヒトTNF又はその変換
体と同様の抗腫瘍作用を有し、一方それらで認められた
癌転移の亢進作用を示さない新規なヒトTNF転換体、
それらに関連する,ポリペプチドとそれらの製造方法、
プラスミド、微生物細胞など、及び用途を提供すること
にある。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明は、配列表の配列番号1で示した1番目のSerか
ら155番目のLeuまでで表わされるアミノ酸配列を
有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換体におい
て、前記配列番号1の1番目のSerから8番目のAs
pまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する前記変換
体のアミノ酸配列がArg−Gly−Aspのアミノ酸
配列を少なくとも1個含み、かつ、3個〜16個のアミ
ノ酸を含むアミノ酸配列により置換されているポリペプ
チドに係る。また本発明は、当該ポリペプチドをコード
するDNAを含む組換えプラスミド、この組換えプラス
ミドにより形質転換された微生物細胞、この微生物細胞
によるポリペプチドの製造方法、医薬組成物、前記アミ
ノ酸配列のN末端にメチオニンの結合したポリペプチド
並びに配列表の配列番号11で示した1番目のTから4
65番目のGまでで表わされる塩基配列を有する腫瘍壊
死因子ポリペプチドのDNA又はその変異導入DNAに
おいて、前記配列番号11の1〜3番目のTCAから2
2〜24番目のGACまでの塩基配列あるいはそれらに
対応する前記変異導入DNAの塩基配列がArg−Gl
y−Aspのアミノ酸配列を少なくとも1個含み、かつ
3個〜16個のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードす
る塩基配列により置換されているDNAに関する。
発明は、配列表の配列番号1で示した1番目のSerか
ら155番目のLeuまでで表わされるアミノ酸配列を
有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換体におい
て、前記配列番号1の1番目のSerから8番目のAs
pまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する前記変換
体のアミノ酸配列がArg−Gly−Aspのアミノ酸
配列を少なくとも1個含み、かつ、3個〜16個のアミ
ノ酸を含むアミノ酸配列により置換されているポリペプ
チドに係る。また本発明は、当該ポリペプチドをコード
するDNAを含む組換えプラスミド、この組換えプラス
ミドにより形質転換された微生物細胞、この微生物細胞
によるポリペプチドの製造方法、医薬組成物、前記アミ
ノ酸配列のN末端にメチオニンの結合したポリペプチド
並びに配列表の配列番号11で示した1番目のTから4
65番目のGまでで表わされる塩基配列を有する腫瘍壊
死因子ポリペプチドのDNA又はその変異導入DNAに
おいて、前記配列番号11の1〜3番目のTCAから2
2〜24番目のGACまでの塩基配列あるいはそれらに
対応する前記変異導入DNAの塩基配列がArg−Gl
y−Aspのアミノ酸配列を少なくとも1個含み、かつ
3個〜16個のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードす
る塩基配列により置換されているDNAに関する。
【0005】本発明者らは、ヒトTNF又はその変換体
が有するアミノ酸配列の一定のアミノ酸配列領域におい
て、Arg−Gly−Aspのアミノ酸配列を存在せし
めたところ、ヒトTNF又はその変換体に比し抗腫瘍活
性がほぼ同程度であり、一方ヒトTNF又はその変換体
が癌の転移を亢進するのに対しほとんど亢進しない新規
ヒトTNF転換体ポリペプチドが得られることを見出し
、その知見に基いて発明を完成した。
が有するアミノ酸配列の一定のアミノ酸配列領域におい
て、Arg−Gly−Aspのアミノ酸配列を存在せし
めたところ、ヒトTNF又はその変換体に比し抗腫瘍活
性がほぼ同程度であり、一方ヒトTNF又はその変換体
が癌の転移を亢進するのに対しほとんど亢進しない新規
ヒトTNF転換体ポリペプチドが得られることを見出し
、その知見に基いて発明を完成した。
【0006】配列表の配列番号1で示した1番目のSe
rから155番目のLeuまでで表わされるアミノ酸配
列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチドとはヒトTNFを
意味する。
rから155番目のLeuまでで表わされるアミノ酸配
列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチドとはヒトTNFを
意味する。
【0007】本発明におけるヒトTNFの変換体とは、
配列表の配列番号1で示したアミノ酸配列において1個
又は2個以上のアミノ酸を適宜付加、欠失、置換の改変
を単独又は複合処理したものであって、ヒトTNFと同
様の抗腫瘍作用を有するものである。したがって、本発
明において、配列番号1の1番目のSerから8番目の
Aspまでのアミノ酸配列に対応する前記変換体のアミ
ノ酸配列とは、変換体において前述のアミノ酸配列が改
変されていれば改変後のアミノ酸配列がそれに該当する
。この改変にはアミノ酸の欠失も含まれるので前述の1
番目のSerから8番目のAspまでアミノ酸配列が部
分的あるいは全部欠失したものも含まれる。
配列表の配列番号1で示したアミノ酸配列において1個
又は2個以上のアミノ酸を適宜付加、欠失、置換の改変
を単独又は複合処理したものであって、ヒトTNFと同
様の抗腫瘍作用を有するものである。したがって、本発
明において、配列番号1の1番目のSerから8番目の
Aspまでのアミノ酸配列に対応する前記変換体のアミ
ノ酸配列とは、変換体において前述のアミノ酸配列が改
変されていれば改変後のアミノ酸配列がそれに該当する
。この改変にはアミノ酸の欠失も含まれるので前述の1
番目のSerから8番目のAspまでアミノ酸配列が部
分的あるいは全部欠失したものも含まれる。
【0008】ヒトTNF変換休としては具体的には例え
ば下記のものが挙げられるが、本発明においてはこれら
以外のものを決して排除するものではない。
ば下記のものが挙げられるが、本発明においてはこれら
以外のものを決して排除するものではない。
【0009】(1)特開昭63−141999号公報に
記載:N末端に、Val−Argを付加し、更に29A
rg−30Argを29Asn−30Thrに変換した
もの。 (2)特開昭63−119692号公報に記載:(A)
32Asnを32Tyr、32His、32Asp又は
32Serにそれぞれ変換したもの。 (B)115Proを115Leu、115Ser、1
15Asp又は115Glyにそれぞれ変換したもの。 (C)117Tyrを117Hisに変換したもの。 (3)特開平1−277488号公報に記載:1Ser
〜8Aspを欠失し、9LysのN末端にArg−Ly
s−Argを付加したもの。 (4)特開平2−163094号公報に記載:1Ser
〜8Aspを欠失し、9LysのN末端にArg−Ly
s−Argを付加し更に154Alaを154Pheに
変換したもの。 (5)特開平2−142493号公報に記載:1Ser
〜8Aspを欠失し、9LysのN末端にArg−Ly
s−Argを付加し更に154Alaを154Trpに
変換したもの。 (6)特開昭63−270697号公報に記載:100
Gln〜107Alaを欠失したもの。1Serから2
個〜8個のアミノ酸残基を欠失したもの。 (7)特願平2−193935号明細書に記載:68P
roを68Asp、68Met又は68Tyrにそれぞ
れ変換したもの。
記載:N末端に、Val−Argを付加し、更に29A
rg−30Argを29Asn−30Thrに変換した
もの。 (2)特開昭63−119692号公報に記載:(A)
32Asnを32Tyr、32His、32Asp又は
32Serにそれぞれ変換したもの。 (B)115Proを115Leu、115Ser、1
15Asp又は115Glyにそれぞれ変換したもの。 (C)117Tyrを117Hisに変換したもの。 (3)特開平1−277488号公報に記載:1Ser
〜8Aspを欠失し、9LysのN末端にArg−Ly
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〜8Aspを欠失し、9LysのN末端にArg−Ly
s−Argを付加し更に154Alaを154Pheに
変換したもの。 (5)特開平2−142493号公報に記載:1Ser
〜8Aspを欠失し、9LysのN末端にArg−Ly
s−Argを付加し更に154Alaを154Trpに
変換したもの。 (6)特開昭63−270697号公報に記載:100
Gln〜107Alaを欠失したもの。1Serから2
個〜8個のアミノ酸残基を欠失したもの。 (7)特願平2−193935号明細書に記載:68P
roを68Asp、68Met又は68Tyrにそれぞ
れ変換したもの。
【0010】本明細書全般を通じてアミノ酸、ポリペプ
チド、塩基、それらの配列を表わすとき下記のリストの
ものを用いる。
チド、塩基、それらの配列を表わすとき下記のリストの
ものを用いる。
【0011】
アミノ酸:
記号 Ala Cys
Asp Glu 意味
アラニン システイン アスパラギン酸 グルタ
ミン酸 記号 Phe
Gly His Ile
Lys 意味 フェニルアラニン グ
リシン ヒスチジン イソロイシン リジン
記号 Leu Met A
sn Pro Gln 意味
ロイシン メチオニン アスパラギン プ
ロリン グルタミン 記号 Arg
Ser Thr Val Tr
p 意味 アルギニン セリン スレオニ
ン バリン トリプトファン 記号 Ty
r 意味 チロシン 塩基: 記号 A又はa C又はc G又はg
T又はt U 意味 アデニン シトシ
ン グアニン チミン ウラシル
Asp Glu 意味
アラニン システイン アスパラギン酸 グルタ
ミン酸 記号 Phe
Gly His Ile
Lys 意味 フェニルアラニン グ
リシン ヒスチジン イソロイシン リジン
記号 Leu Met A
sn Pro Gln 意味
ロイシン メチオニン アスパラギン プ
ロリン グルタミン 記号 Arg
Ser Thr Val Tr
p 意味 アルギニン セリン スレオニ
ン バリン トリプトファン 記号 Ty
r 意味 チロシン 塩基: 記号 A又はa C又はc G又はg
T又はt U 意味 アデニン シトシ
ン グアニン チミン ウラシル
【0012
】また本明細書で使用した略号は次のとおり意味する。 dATP:デオキシアデノシン三リン酸 (Deox
y adenosinetriphosphate)
dGTP:デオキシグアノシン三リン酸 (Deox
y guanosinetriphosphate)
dCTP:デオキシシチジン三リン酸 (Deoxy
Cytidine triphosphate)
TTP:チミジン三リン酸 (Thymidine
triphosphate) ATP:アデノシン三リン酸 (Adenosine
triphosphate) SDS:ドデシル硫酸ナトリウム(Sodium d
odecyl sulfate) BPB:ブロモフェノールブルー(Bromophen
ol Blue) DTT:ジチオスレイトール (Dithiothr
eitol) BSA:牛血清アルブミン (Bovine se
rum albumin) PMSF:フェニルメチルスルホニル フルオライド
(Phenylmethylsulfonyl Fl
uoride) EDTA:エチレンジアミン四酢酸(Ethylene
diaminetetraacetic Acid)
CPG樹脂:Controlled−Pore Gl
ass樹脂
】また本明細書で使用した略号は次のとおり意味する。 dATP:デオキシアデノシン三リン酸 (Deox
y adenosinetriphosphate)
dGTP:デオキシグアノシン三リン酸 (Deox
y guanosinetriphosphate)
dCTP:デオキシシチジン三リン酸 (Deoxy
Cytidine triphosphate)
TTP:チミジン三リン酸 (Thymidine
triphosphate) ATP:アデノシン三リン酸 (Adenosine
triphosphate) SDS:ドデシル硫酸ナトリウム(Sodium d
odecyl sulfate) BPB:ブロモフェノールブルー(Bromophen
ol Blue) DTT:ジチオスレイトール (Dithiothr
eitol) BSA:牛血清アルブミン (Bovine se
rum albumin) PMSF:フェニルメチルスルホニル フルオライド
(Phenylmethylsulfonyl Fl
uoride) EDTA:エチレンジアミン四酢酸(Ethylene
diaminetetraacetic Acid)
CPG樹脂:Controlled−Pore Gl
ass樹脂
【0013】本発明のポリペプチド転換体において、一
定の位置に前記Arg−Gly−Aspのアミノ酸配列
を少なくとも1個含み、かつ3個〜16個のアミノ酸を
含むアミノ酸配列は、抗腫瘍活性、癌の転移程度、副作
用、遺伝子組換え技術の適用性などを考慮して適宜決め
られる。前述の3個〜16個のアミノ酸を含むアミノ酸
配列は、そこに望ましくは3個〜11個のアミノ酸を含
むアミノ酸配列においてArg−Gly−Aspのアミ
ノ酸配列を1個又は2個以上有するものであり、具体的
には配列表の配列番号2〜10で示したアミノ酸配列が
挙げられるが、なかでも配列番号2、3、5、6及び7
が望ましい。
定の位置に前記Arg−Gly−Aspのアミノ酸配列
を少なくとも1個含み、かつ3個〜16個のアミノ酸を
含むアミノ酸配列は、抗腫瘍活性、癌の転移程度、副作
用、遺伝子組換え技術の適用性などを考慮して適宜決め
られる。前述の3個〜16個のアミノ酸を含むアミノ酸
配列は、そこに望ましくは3個〜11個のアミノ酸を含
むアミノ酸配列においてArg−Gly−Aspのアミ
ノ酸配列を1個又は2個以上有するものであり、具体的
には配列表の配列番号2〜10で示したアミノ酸配列が
挙げられるが、なかでも配列番号2、3、5、6及び7
が望ましい。
【0014】本発明におけるポリペプチド転換体のAr
g−Gly−Aspのアミノ酸配列を少なくとも1個含
み、かつ3個〜16個のアミノ酸を含むアミノ酸配列以
外の配列に関しては、配列番号1の9番目のLysから
155番目のLeuまでのヒトTNFのアミノ酸配列あ
るいはその68番目のProが他のアミノ酸望ましくは
Asp又はMetで置換されたアミノ酸配列が望ましい
。
g−Gly−Aspのアミノ酸配列を少なくとも1個含
み、かつ3個〜16個のアミノ酸を含むアミノ酸配列以
外の配列に関しては、配列番号1の9番目のLysから
155番目のLeuまでのヒトTNFのアミノ酸配列あ
るいはその68番目のProが他のアミノ酸望ましくは
Asp又はMetで置換されたアミノ酸配列が望ましい
。
【0015】配列表の配列番号11で示した1番目のT
から465番目のGまでで表わされる塩基配列を有する
腫瘍壊死因子ポリペプチドのDNAとは、ヒトTNFの
アミノ酸配列をコードするDNAの1形態である。
から465番目のGまでで表わされる塩基配列を有する
腫瘍壊死因子ポリペプチドのDNAとは、ヒトTNFの
アミノ酸配列をコードするDNAの1形態である。
【0016】ヒトTNFのアミノ酸配列をコードするD
NAの変異導入DNAとは、配列表の配列番号11で示
した塩基配列において1組又は2組以上のコドンを適宜
付加、欠失、置換の改変を単独又は複合処理したもので
あって、前述のヒトTNF変換体のアミノ酸配列をコー
ドするDNAである。したがって、その改変は、配列番
号11で示した1番目のTから465番目のGまでで表
わされる塩基配列の全域に及ぶので、1番目のTから2
4番目のCまでの塩基配列だけでなく、25番目のAか
ら465番目のGまでの塩基配列にも及ぶ。
NAの変異導入DNAとは、配列表の配列番号11で示
した塩基配列において1組又は2組以上のコドンを適宜
付加、欠失、置換の改変を単独又は複合処理したもので
あって、前述のヒトTNF変換体のアミノ酸配列をコー
ドするDNAである。したがって、その改変は、配列番
号11で示した1番目のTから465番目のGまでで表
わされる塩基配列の全域に及ぶので、1番目のTから2
4番目のCまでの塩基配列だけでなく、25番目のAか
ら465番目のGまでの塩基配列にも及ぶ。
【0017】次に本発明についてその実施態様を詳しく
記載するが、本発明に係る遺伝子操作技術については多
くの文献により記載されている方法や手段を適宜調整し
ながら適用する。その文献を参考までに以下に列挙する
。
記載するが、本発明に係る遺伝子操作技術については多
くの文献により記載されている方法や手段を適宜調整し
ながら適用する。その文献を参考までに以下に列挙する
。
【0018】T.Maniatis et al,
(1982):Molecular Cloning
,A Laboratory Manual(以下
、Molecular Cloningと略記する)
Cold Spring HarborLabor
atory、R.Wu et al,(1983)
:Methodsin Enzymology,10
0及び101、R.Wu et al,(1987
):Methds in Enzymology,
153,154及び155
(1982):Molecular Cloning
,A Laboratory Manual(以下
、Molecular Cloningと略記する)
Cold Spring HarborLabor
atory、R.Wu et al,(1983)
:Methodsin Enzymology,10
0及び101、R.Wu et al,(1987
):Methds in Enzymology,
153,154及び155
【0019】本発明のポリペ
プチドは種々の方法、手段、機械を用いて製造すること
ができるが、代表的な製造方法を下記する。
プチドは種々の方法、手段、機械を用いて製造すること
ができるが、代表的な製造方法を下記する。
【0020】(1)ヒトTNF遺伝子の取得ヒトTNF
遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列は前述のとおり、P
ennicaらにより明らかにされており、その塩基配
列を適宜変更してヒトTNF遺伝子を配列番号11のよ
うにデザインする。その際、宿主細胞(大腸菌など)に
適したコドンを選択するのが望ましく、また後述のDN
A断片の連結によるクローン化並びに変換体作製のため
の遺伝子改変が容易に実施できるように適当な位置に適
当な制限酵素切断部位を配置するのが望ましい。もちろ
んヒトTNF遺伝子の上流には翻訳開始コドン(ATG
)を、下流には翻訳終止コドン(TAA、TGA又はT
AG)をそれぞれ読み取り枠に合致させるように設置す
る必要があり、また翻訳開始コドンの上流並びに翻訳終
止コドンの下流にそれぞれ適当な制限酵素切断部位を設
置してベクターへの適用性、クローン化の簡便性を図る
のが好ましい。
遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列は前述のとおり、P
ennicaらにより明らかにされており、その塩基配
列を適宜変更してヒトTNF遺伝子を配列番号11のよ
うにデザインする。その際、宿主細胞(大腸菌など)に
適したコドンを選択するのが望ましく、また後述のDN
A断片の連結によるクローン化並びに変換体作製のため
の遺伝子改変が容易に実施できるように適当な位置に適
当な制限酵素切断部位を配置するのが望ましい。もちろ
んヒトTNF遺伝子の上流には翻訳開始コドン(ATG
)を、下流には翻訳終止コドン(TAA、TGA又はT
AG)をそれぞれ読み取り枠に合致させるように設置す
る必要があり、また翻訳開始コドンの上流並びに翻訳終
止コドンの下流にそれぞれ適当な制限酵素切断部位を設
置してベクターへの適用性、クローン化の簡便性を図る
のが好ましい。
【0021】ヒトTNF遺伝子は上鎖・下鎖それぞれに
ついて幾つかのオリゴヌクレオチドに分けて化学合成し
、ブロックごとに順次適切に連結する方法により作製で
きる。例えば配列表の配列番号11においては、ヒトT
NF遺伝子のコーディング鎖及び相補する配列を有する
鎖の各鎖を約50塩基程度ずつ10本のオリゴヌクレオ
チドに分け、合計20本化学合成する。
ついて幾つかのオリゴヌクレオチドに分けて化学合成し
、ブロックごとに順次適切に連結する方法により作製で
きる。例えば配列表の配列番号11においては、ヒトT
NF遺伝子のコーディング鎖及び相補する配列を有する
鎖の各鎖を約50塩基程度ずつ10本のオリゴヌクレオ
チドに分け、合計20本化学合成する。
【0022】その合成方法としてはジエステル法〔H.
G.Khorana,”SomeRecent De
velopments in Chemistry
ofPhosphate Esters of
Biological Interest”,Joh
n Wiley and Sons,Inc.,
New York(1961)〕、トリエステル法〔
R.L.Letsinger etal,J.Am.
Chem.Soc.,89,4801(1967)〕及
びホスファイト法〔M.D.Matteucci e
t al,TetrahedronLett.,21
,719(1980)〕が挙げられるが、全自動DNA
合成機を用いたホスファイト法が操作性などから好んで
用いられる。
G.Khorana,”SomeRecent De
velopments in Chemistry
ofPhosphate Esters of
Biological Interest”,Joh
n Wiley and Sons,Inc.,
New York(1961)〕、トリエステル法〔
R.L.Letsinger etal,J.Am.
Chem.Soc.,89,4801(1967)〕及
びホスファイト法〔M.D.Matteucci e
t al,TetrahedronLett.,21
,719(1980)〕が挙げられるが、全自動DNA
合成機を用いたホスファイト法が操作性などから好んで
用いられる。
【0023】合成されたオリゴヌクレオチドは例えば逆
相クロマトカラムを用いた高速液体クロマトグラフイー
、ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動などの通常
の精製方法により精製される。その後、オリゴヌクレオ
チドは例えばT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリ
ン酸化し、アニール化した後、T4DNAリガーゼを用
いて連結する。ここではオリゴヌクレオチドを幾つかの
ブロックに分け、所望のヒトTNF遺伝子配列が得られ
るように順次連結し、制限酵素で切断又はT4DNAポ
リメラーゼによる平滑化後、電気泳動等により精製する
。得られたDNA断片について例えばpUC8、同9、
同18、同19〔J.Messinget al,G
ene,19,259(1982)〕のようなプラスミ
ドベクターに組込み、常法によりコンピテントセルを形
質転換してクローン化する。得られたクローンより公知
の方法に従ってプラスミドDNAを抽出精製し、ベクタ
ーに挿入されたDNA断片の塩基配列が目的の遺伝子配
列を達成したか否かを点検する。達成できたヒトTNF
遺伝子の各部分について、それぞれを含むプラスミドベ
クターより制限酵素を用いて切り出し、再度前記ベクタ
ーに連結後組込むことにより目的の完全長のヒトTNF
遺伝子を有するプラスミドベクターを得る。かくして得
られたプラスミドベクターを制限酵素で切断後、ゲル電
気泳動法によって分離精製することにより所望のヒトT
NF遺伝子を得ることができる。
相クロマトカラムを用いた高速液体クロマトグラフイー
、ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動などの通常
の精製方法により精製される。その後、オリゴヌクレオ
チドは例えばT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリ
ン酸化し、アニール化した後、T4DNAリガーゼを用
いて連結する。ここではオリゴヌクレオチドを幾つかの
ブロックに分け、所望のヒトTNF遺伝子配列が得られ
るように順次連結し、制限酵素で切断又はT4DNAポ
リメラーゼによる平滑化後、電気泳動等により精製する
。得られたDNA断片について例えばpUC8、同9、
同18、同19〔J.Messinget al,G
ene,19,259(1982)〕のようなプラスミ
ドベクターに組込み、常法によりコンピテントセルを形
質転換してクローン化する。得られたクローンより公知
の方法に従ってプラスミドDNAを抽出精製し、ベクタ
ーに挿入されたDNA断片の塩基配列が目的の遺伝子配
列を達成したか否かを点検する。達成できたヒトTNF
遺伝子の各部分について、それぞれを含むプラスミドベ
クターより制限酵素を用いて切り出し、再度前記ベクタ
ーに連結後組込むことにより目的の完全長のヒトTNF
遺伝子を有するプラスミドベクターを得る。かくして得
られたプラスミドベクターを制限酵素で切断後、ゲル電
気泳動法によって分離精製することにより所望のヒトT
NF遺伝子を得ることができる。
【0024】一方、前述の方法に対してはTNFを発現
しているヒト細胞由来のmRNAよりヒトTNFをコー
ドするcDNAを作製し、そのcDNAを使用する方法
を適宜組合せてもよい。
しているヒト細胞由来のmRNAよりヒトTNFをコー
ドするcDNAを作製し、そのcDNAを使用する方法
を適宜組合せてもよい。
【0025】(2)ヒトTNF発現ベクターの構築前記
(1)で得られたヒトTNF遺伝子を適切に発現ベクタ
ーに挿入して、ヒトTNF発現ベクターを構築する。発
現ベクターは翻訳開始コドン(ATG)の上流に転写プ
ロモーター領域並びに翻訳シグナルであるSD(シャイ
ン・ダルガーノ)配列を有し、翻訳終止コドン(TAA
、TGA又はTAG)の下流に転写ターミネーター領域
を有する必要がある。また転写プロモーターとしては、
trpプロモーター、lacプロモーター、tacプロ
モーター、PLプロモーター、PH05プロモーター、
ADCIプロモーターなどが使用でき、転写ターミネー
ターとしてはtrpターミネーター、rrnBターミネ
ーター、ADCIターミネーターなどが使用できる。こ
のような発現ベクターは例えば、pKK223−3(フ
ァルマシア)、pPL−lambda(同左)、pDR
720(同左)などの市販品の中から容易に入手できる
が、これらを改良して発現性あるいは取扱性をより高度
化したものを使用してもよい。
(1)で得られたヒトTNF遺伝子を適切に発現ベクタ
ーに挿入して、ヒトTNF発現ベクターを構築する。発
現ベクターは翻訳開始コドン(ATG)の上流に転写プ
ロモーター領域並びに翻訳シグナルであるSD(シャイ
ン・ダルガーノ)配列を有し、翻訳終止コドン(TAA
、TGA又はTAG)の下流に転写ターミネーター領域
を有する必要がある。また転写プロモーターとしては、
trpプロモーター、lacプロモーター、tacプロ
モーター、PLプロモーター、PH05プロモーター、
ADCIプロモーターなどが使用でき、転写ターミネー
ターとしてはtrpターミネーター、rrnBターミネ
ーター、ADCIターミネーターなどが使用できる。こ
のような発現ベクターは例えば、pKK223−3(フ
ァルマシア)、pPL−lambda(同左)、pDR
720(同左)などの市販品の中から容易に入手できる
が、これらを改良して発現性あるいは取扱性をより高度
化したものを使用してもよい。
【0026】
(3)ヒトTNF変換体又は同転換体発現ベクターの構
築 ヒトTNF変換体又は同転換体ポリペプチドをコードす
るDNAの作製方法としては例えば次の方法が挙げられ
る。
築 ヒトTNF変換体又は同転換体ポリペプチドをコードす
るDNAの作製方法としては例えば次の方法が挙げられ
る。
【0027】(A)前記(1)ヒトTNF遺伝子の取得
で記載した方法に準じて化学的に合成したオリゴヌクレ
オチドを適切に連結することにより作製する。この方法
によればアミノ酸、ポリペプチドなどの置換、付加又は
欠失の改変は自在である。
で記載した方法に準じて化学的に合成したオリゴヌクレ
オチドを適切に連結することにより作製する。この方法
によればアミノ酸、ポリペプチドなどの置換、付加又は
欠失の改変は自在である。
【0028】(B)前記(1)で作製したヒトTNF遺
伝子を適当な制限酵素で切断し、遺伝子内の特定領域を
除去した後、変異を導入した塩基配列を有する合成オリ
ゴヌクレオチド(例:上下鎖をアニール化して連結した
二本鎖DNA断片)又は適当な他の遺伝子を組込む。こ
の方法によっても前記(A)の場合と同様、改変を自在
に行うことができる。
伝子を適当な制限酵素で切断し、遺伝子内の特定領域を
除去した後、変異を導入した塩基配列を有する合成オリ
ゴヌクレオチド(例:上下鎖をアニール化して連結した
二本鎖DNA断片)又は適当な他の遺伝子を組込む。こ
の方法によっても前記(A)の場合と同様、改変を自在
に行うことができる。
【0029】(C)変異を導入した塩基配列を有する合
成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いDNA鎖
を延長することにより、変異導入を行う〔部異特異的変
異法(T.A.Kunkel et al,Met
hods in Enzymology,154,
367(1987))〕。この方法は10塩基対を越え
る比較的長いDNA鎖の付加及び挿入には適用し難いが
、その他の改変は前記(A)の場合と同様、自在に行う
ことができる。特に任意のアミノ酸を置換することに適
している。
成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いDNA鎖
を延長することにより、変異導入を行う〔部異特異的変
異法(T.A.Kunkel et al,Met
hods in Enzymology,154,
367(1987))〕。この方法は10塩基対を越え
る比較的長いDNA鎖の付加及び挿入には適用し難いが
、その他の改変は前記(A)の場合と同様、自在に行う
ことができる。特に任意のアミノ酸を置換することに適
している。
【0030】本発明では一般に(C)の部位特異的変異
法及び制限酵素切断部位を利用する(B)の方法を適宜
組合せて使用するが、以下にその方法について説明する
。
法及び制限酵素切断部位を利用する(B)の方法を適宜
組合せて使用するが、以下にその方法について説明する
。
【0031】■ 部位特異的変異法により変換体又は
転換体ポリペプチドをコードするDNAを作製した後、
発現ベクター内に適切に挿入する。
転換体ポリペプチドをコードするDNAを作製した後、
発現ベクター内に適切に挿入する。
【0032】まず部位特異的変異法を行うに当り、鋳型
DNAを作製する。前記(1)で得られたヒトTNF遺
伝子を、Messingら〔Methods in
Enzymology,153,3(1987)〕に
よって開発された一本鎖プラスミドDNA調製用プラス
ミドベクター(pUC118、pUC119など)に連
結し、大腸菌株に導入する。得られた形質転換体の中よ
り目的のプラスミドを有するクローンを選択する。
DNAを作製する。前記(1)で得られたヒトTNF遺
伝子を、Messingら〔Methods in
Enzymology,153,3(1987)〕に
よって開発された一本鎖プラスミドDNA調製用プラス
ミドベクター(pUC118、pUC119など)に連
結し、大腸菌株に導入する。得られた形質転換体の中よ
り目的のプラスミドを有するクローンを選択する。
【0033】このプラスミドをdut−及びung−変
異大腸菌株(CJ236株など)に導入し、遺伝子内に
ウラシルを取り込ませ、大腸菌株にM13K07などの
変異型ヘルパーファージを感染させて目的の一本鎖プラ
スミドDNAを取得する。
異大腸菌株(CJ236株など)に導入し、遺伝子内に
ウラシルを取り込ませ、大腸菌株にM13K07などの
変異型ヘルパーファージを感染させて目的の一本鎖プラ
スミドDNAを取得する。
【0034】一方、本発明に係る変異導入部位及びその
前後の塩基配列を有する約15〜50塩基のオリゴヌク
レオチド・プライマーを化学合成する。このプライマー
と前述の工程で得られるウラシル導入一本鎖プラスミド
DNAとをアニール化した後、例えばT4DNAポリメ
ラーゼ及びT4DNAリガーゼを用いて、二本鎖化する
。鋳型であるウラシルを含むDNA鎖を不活性化し変異
導入頻度を高めるため、二本鎖となったプラスミドをu
ng+の大腸菌株に導入する。
前後の塩基配列を有する約15〜50塩基のオリゴヌク
レオチド・プライマーを化学合成する。このプライマー
と前述の工程で得られるウラシル導入一本鎖プラスミド
DNAとをアニール化した後、例えばT4DNAポリメ
ラーゼ及びT4DNAリガーゼを用いて、二本鎖化する
。鋳型であるウラシルを含むDNA鎖を不活性化し変異
導入頻度を高めるため、二本鎖となったプラスミドをu
ng+の大腸菌株に導入する。
【0035】前述のプライマーをプローブとして用いコ
ロニー・ハイブリダイゼーションを行い、目的の変換体
又は転換体ポリペプチドをコードするDNAを含むプラ
スミドを有するクローンを、得られた形質転換体中より
選択する。
ロニー・ハイブリダイゼーションを行い、目的の変換体
又は転換体ポリペプチドをコードするDNAを含むプラ
スミドを有するクローンを、得られた形質転換体中より
選択する。
【0036】前述で得られるプラスミドから制限酵素切
断処理によりヒトTNF変換体又は同転換体ポリペプチ
ドをコードするDNA断片を切り出し、前記(2)の場
合と同様に、発現ベクターに挿入して、目的のヒトTN
F変換体又は同転換体発現ベクターを構築することがで
きる。
断処理によりヒトTNF変換体又は同転換体ポリペプチ
ドをコードするDNA断片を切り出し、前記(2)の場
合と同様に、発現ベクターに挿入して、目的のヒトTN
F変換体又は同転換体発現ベクターを構築することがで
きる。
【0037】■ 適当な制限酵素切断により変異を導
入したい部分を切り出し、変換デザインに従って化学合
成等により作製したDNA断片で置換することにより変
換体又は転換体ポリペプチドの発現ベクターを構築する
。
入したい部分を切り出し、変換デザインに従って化学合
成等により作製したDNA断片で置換することにより変
換体又は転換体ポリペプチドの発現ベクターを構築する
。
【0038】ヒトTNFのN末端近傍のアミノ酸配列を
修飾するには、N末端近傍に適当な制限酵素切断部位が
存在するのが好ましい。そこで、まず部位特異的変異法
によりヒトTNFのN末端近傍に適当な制限酵素切断部
位を導入する。この制限酵素切断部位とその上流に位置
する翻訳開始コドンの前後に設置された制限酵素切断部
位の2種類の切断部位の使用は更に好ましい。
修飾するには、N末端近傍に適当な制限酵素切断部位が
存在するのが好ましい。そこで、まず部位特異的変異法
によりヒトTNFのN末端近傍に適当な制限酵素切断部
位を導入する。この制限酵素切断部位とその上流に位置
する翻訳開始コドンの前後に設置された制限酵素切断部
位の2種類の切断部位の使用は更に好ましい。
【0039】一方、本発明に係る変換デザインに従って
前記(1)の場合と同様にして、上鎖及び下鎖に対応す
るオリゴヌクレオチドを化学合成する。もちろん、その
両末端には発現ベクターへの組込みを考慮して上記の制
限酵素切断部位を設置しておく必要がある。このオリゴ
ヌクレオチド(上鎖及び下鎖)を例えばT4ポリヌクレ
オチドキナーゼを用いてリン酸化後アニール化すること
により二本鎖DNA断片とする。上記の2種類の制限酵
素で切断したヒトTNFの大部分を含む(N末部分を欠
失)発現用プラスミドベクター内にこの二本鎖DNA断
片を例えばT4DNAリガーゼを用いて挿入連結して、
目的とするN末端近傍のアミノ酸配列を修飾したヒトT
NF転換体の発現ベクターを構築することができる。
前記(1)の場合と同様にして、上鎖及び下鎖に対応す
るオリゴヌクレオチドを化学合成する。もちろん、その
両末端には発現ベクターへの組込みを考慮して上記の制
限酵素切断部位を設置しておく必要がある。このオリゴ
ヌクレオチド(上鎖及び下鎖)を例えばT4ポリヌクレ
オチドキナーゼを用いてリン酸化後アニール化すること
により二本鎖DNA断片とする。上記の2種類の制限酵
素で切断したヒトTNFの大部分を含む(N末部分を欠
失)発現用プラスミドベクター内にこの二本鎖DNA断
片を例えばT4DNAリガーゼを用いて挿入連結して、
目的とするN末端近傍のアミノ酸配列を修飾したヒトT
NF転換体の発現ベクターを構築することができる。
【0040】また、変換体又は転換体ポリペプチドをコ
ードする遺伝子内の適当な制限酵素切断部位を利用して
それぞれの発現ベクター間で組換えを行うことにより、
更に新規な変換体又は転換体ポリペプチドの発現ベクタ
ーを構築することができる。
ードする遺伝子内の適当な制限酵素切断部位を利用して
それぞれの発現ベクター間で組換えを行うことにより、
更に新規な変換体又は転換体ポリペプチドの発現ベクタ
ーを構築することができる。
【0041】発現ベクターを大腸菌株のような宿主細胞
へ導入することについては、例えば塩化カルシウム法に
より作製した大腸菌株のコンピテントセルを用いる公知
の方法〔Molecular Cloning,T.
Maniatis et al,(1982)〕に
従って行う。宿主細胞としては大腸菌、枯草菌、酵母な
どの微生物細胞が使用できるが、なかでも大腸菌として
はJM83、JM103、HB101などのE.col
i K−12株の変異種が挙げられる。
へ導入することについては、例えば塩化カルシウム法に
より作製した大腸菌株のコンピテントセルを用いる公知
の方法〔Molecular Cloning,T.
Maniatis et al,(1982)〕に
従って行う。宿主細胞としては大腸菌、枯草菌、酵母な
どの微生物細胞が使用できるが、なかでも大腸菌として
はJM83、JM103、HB101などのE.col
i K−12株の変異種が挙げられる。
【0042】
(4)ヒトTNF転換体ポリペプチドの取得本発明にお
いては前記(3)で記載の形質転換された微生物細胞を
培養し、目的のヒトTNF転換体ポリペプチドを培養物
中に産生、蓄積させて分離する。微生物細胞、特に大腸
菌の培養方法としては従来から知られている方法、例え
ば大腸菌が要求する栄養素を含んだ培養液に大腸菌を接
種し、通常32〜37℃で約12〜24時間振とう又は
かくはんすることにより短時間に大量に培養する方法が
使用できる。培地は例えばL培地、M9培地、M9CA
培地など〔前記Molecular Cloning
参照〕が使用でき、必要に応じてアンピシリンなどの抗
生物質を添加したり、転写プロモーターの効率を高める
ために培養開始時あるいは培養中にlacプロモーター
及びtacプロモーター使用の際はイソプロピル−β−
D−チオガラクトピラノシド等の薬剤を、trpプロモ
ーター使用の際は3−β−インドールアクリル酸等の薬
剤を添加することもできる。
いては前記(3)で記載の形質転換された微生物細胞を
培養し、目的のヒトTNF転換体ポリペプチドを培養物
中に産生、蓄積させて分離する。微生物細胞、特に大腸
菌の培養方法としては従来から知られている方法、例え
ば大腸菌が要求する栄養素を含んだ培養液に大腸菌を接
種し、通常32〜37℃で約12〜24時間振とう又は
かくはんすることにより短時間に大量に培養する方法が
使用できる。培地は例えばL培地、M9培地、M9CA
培地など〔前記Molecular Cloning
参照〕が使用でき、必要に応じてアンピシリンなどの抗
生物質を添加したり、転写プロモーターの効率を高める
ために培養開始時あるいは培養中にlacプロモーター
及びtacプロモーター使用の際はイソプロピル−β−
D−チオガラクトピラノシド等の薬剤を、trpプロモ
ーター使用の際は3−β−インドールアクリル酸等の薬
剤を添加することもできる。
【0043】本発明のヒトTNF転換体ポリペプチドは
培養後、通常、微生物細胞の集合体をトリスバッファー
に懸濁させた状態で超音波処理することにより破砕処理
を施し、遠心分離操作を行い菌体残渣を除去することに
より得られる。更に、かくして得られたものは核酸・エ
ンドトキシン除去剤処理、フィルターによるろ過、陰イ
オン交換クロマトグラフィー、その他従来からの蛋白質
の分離精製方法を組合せることにより、一層精製するこ
とができる。
培養後、通常、微生物細胞の集合体をトリスバッファー
に懸濁させた状態で超音波処理することにより破砕処理
を施し、遠心分離操作を行い菌体残渣を除去することに
より得られる。更に、かくして得られたものは核酸・エ
ンドトキシン除去剤処理、フィルターによるろ過、陰イ
オン交換クロマトグラフィー、その他従来からの蛋白質
の分離精製方法を組合せることにより、一層精製するこ
とができる。
【0044】本発明のヒトTNF転換体遺伝子は前述の
方法を適宜適用することにより、直接製造したり、一旦
ヒトTNF遺伝子を作製後製造したり、あるいはヒトT
NF遺伝子次いでその変換体変異遺伝子を作製後製造し
たりすることができる。
方法を適宜適用することにより、直接製造したり、一旦
ヒトTNF遺伝子を作製後製造したり、あるいはヒトT
NF遺伝子次いでその変換体変異遺伝子を作製後製造し
たりすることができる。
【0045】本発明のヒトTNF転換体ポリペプチドは
、ヒトTNF又はその変換体の持つ抗腫瘍作用と同様の
作用を有し、しかもヒトTNF又はその変換体に比し同
程度の抗腫瘍活性を示し、一方それらで認められた癌の
転移亢進作用をほとんど示さないことより抗腫瘍剤、医
薬の活性成分として有効である。本発明のヒトTNF転
換体ポリペプチドとしては、具体的には例えば後述する
F4168、F4415、F4416、F4417、F
4418、F4420、F4421、F4113、F4
137、F4601、F4602などが挙げられ、なか
でもF4168、F4415、F4417、F4418
、F4420、F4601が望ましく、F4168及び
F4418がより望ましい。その医薬組成物の製剤に当
っては薬理上許容される担体又は希釈剤とともに医薬組
成物に製剤化することができる。本発明の医薬組成物の
剤型としては、外用剤、経口投与剤、注射剤などが挙げ
られ、それぞれの剤型にあった投与方法で投与される。
、ヒトTNF又はその変換体の持つ抗腫瘍作用と同様の
作用を有し、しかもヒトTNF又はその変換体に比し同
程度の抗腫瘍活性を示し、一方それらで認められた癌の
転移亢進作用をほとんど示さないことより抗腫瘍剤、医
薬の活性成分として有効である。本発明のヒトTNF転
換体ポリペプチドとしては、具体的には例えば後述する
F4168、F4415、F4416、F4417、F
4418、F4420、F4421、F4113、F4
137、F4601、F4602などが挙げられ、なか
でもF4168、F4415、F4417、F4418
、F4420、F4601が望ましく、F4168及び
F4418がより望ましい。その医薬組成物の製剤に当
っては薬理上許容される担体又は希釈剤とともに医薬組
成物に製剤化することができる。本発明の医薬組成物の
剤型としては、外用剤、経口投与剤、注射剤などが挙げ
られ、それぞれの剤型にあった投与方法で投与される。
【0046】
【実施例】実施例1(ヒトTNF遺伝子のデザイン)既
に報告されている〔Pennicaら、前出〕ヒトTN
F構造遺伝子のアミノ酸配列を基に、ヒトTNF遺伝子
の塩基配列について遺伝子構築及び変換体作製の便宜上
、配列表の配列番号11のDNA塩基配列をデザインし
た。ここでは適当な間隔で制限酵素切断部位を組み込み
、また、その5′末端に翻訳開始コドン(ATG)を設
け、更にプラスミドベクターと容易に連結できるように
ATGの上流に制限酵素EcoRIによる切断部位を、
翻訳終止コドン(TAA及びTGA)の下流には制限酵
素Hind IIIによる切断部位をそれぞれ設けた
。
に報告されている〔Pennicaら、前出〕ヒトTN
F構造遺伝子のアミノ酸配列を基に、ヒトTNF遺伝子
の塩基配列について遺伝子構築及び変換体作製の便宜上
、配列表の配列番号11のDNA塩基配列をデザインし
た。ここでは適当な間隔で制限酵素切断部位を組み込み
、また、その5′末端に翻訳開始コドン(ATG)を設
け、更にプラスミドベクターと容易に連結できるように
ATGの上流に制限酵素EcoRIによる切断部位を、
翻訳終止コドン(TAA及びTGA)の下流には制限酵
素Hind IIIによる切断部位をそれぞれ設けた
。
【0047】
実施例2(オリゴヌクレオチドの化学合成)前記実施例
1でデザインされたDNAは、自動DNA合成機(アプ
ライド・バイオシステムズ,モデル381A)を用いて
、ホスファイト法にて化学合成した。合成は後述する塩
基配列を有するU−1〜10及びL−1〜10の20本
のオリゴヌクレオチドに分割して行い、合成されたオリ
ゴヌクレオチドのCPG樹脂(フナコシ社販売)からの
切り出し及び保護基脱離は、アプライド・バイオシステ
ムズ社のマニュアルに従った。各オリゴヌクレオチドの
分離精製は逆相クロマトカラムを用いたHPLC(高速
液体クロマトグラフィー)又は7Mウレアを含むポリア
クリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度10〜20%)に
より行った。
1でデザインされたDNAは、自動DNA合成機(アプ
ライド・バイオシステムズ,モデル381A)を用いて
、ホスファイト法にて化学合成した。合成は後述する塩
基配列を有するU−1〜10及びL−1〜10の20本
のオリゴヌクレオチドに分割して行い、合成されたオリ
ゴヌクレオチドのCPG樹脂(フナコシ社販売)からの
切り出し及び保護基脱離は、アプライド・バイオシステ
ムズ社のマニュアルに従った。各オリゴヌクレオチドの
分離精製は逆相クロマトカラムを用いたHPLC(高速
液体クロマトグラフィー)又は7Mウレアを含むポリア
クリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度10〜20%)に
より行った。
【0048】U−1〜10及びL−1〜10の各塩基配
列は以下に示すものである。 U−1:27塩基からなり、配列番号11の1番目のT
から19番目のAまでの配列を有し、しかも、1番目の
Tに対し上流方向に5′−ATG−3′更にその上流に
5′−AATTC−3′を接続した配列を有する。 U−2:50塩基からなり、配列番号11の20番目の
Gから69番目のGまでの配列を有する。 U−3:49塩基からなり、配列番号11の70番目の
Cから118番目のGまでの配列を有する。 U−4:50塩基からなり、配列番号11の119番目
のAから168番目のCまでの配列を有する。 U−5:50塩基からなり、配列番号11の169番目
のTから218番目のTまでの配列を有する。 U−6:52塩基からなり、配列番号11の219番目
のCから270番目のCまでの配列を有する。 U−7:48塩基からなり、配列番号11の271番目
のCから318番目のCまでの配列を有する。 U−8:49塩基からなり、配列番号11の319番目
のGから367番目のCまでの配列を有する。 U−9:51塩基からなり、配列番号11の368番目
のAから418番目のCまでの配列を有する。 U−10:53塩基からなり、配列番号11の419番
目のTから465番目のG までの配列
を有し、更に下流方向に5′−TAATGA−3′を有
する。
列は以下に示すものである。 U−1:27塩基からなり、配列番号11の1番目のT
から19番目のAまでの配列を有し、しかも、1番目の
Tに対し上流方向に5′−ATG−3′更にその上流に
5′−AATTC−3′を接続した配列を有する。 U−2:50塩基からなり、配列番号11の20番目の
Gから69番目のGまでの配列を有する。 U−3:49塩基からなり、配列番号11の70番目の
Cから118番目のGまでの配列を有する。 U−4:50塩基からなり、配列番号11の119番目
のAから168番目のCまでの配列を有する。 U−5:50塩基からなり、配列番号11の169番目
のTから218番目のTまでの配列を有する。 U−6:52塩基からなり、配列番号11の219番目
のCから270番目のCまでの配列を有する。 U−7:48塩基からなり、配列番号11の271番目
のCから318番目のCまでの配列を有する。 U−8:49塩基からなり、配列番号11の319番目
のGから367番目のCまでの配列を有する。 U−9:51塩基からなり、配列番号11の368番目
のAから418番目のCまでの配列を有する。 U−10:53塩基からなり、配列番号11の419番
目のTから465番目のG までの配列
を有し、更に下流方向に5′−TAATGA−3′を有
する。
【0049】L−1〜10は、配列番号11のDNA鎖
に対応した下鎖(コンプリメンタリー配列鎖)である。 L−1:29塩基からなり、配列番号11の25番目の
Aから1番目のTまでの配列に相補した配列を有し、し
かも1番目のTに相補するAの下流方向に5′−CAT
G−3′を接続した配列を有する。 L−2:52塩基からなり、配列番号11の77番目の
Gから26番目のAまでの配列に相補した配列を有する
。 L−3:50塩基からなり、配列番号11の127番目
のGから78番目のGまでの配列に相補した配列を有す
る。 L−4:50塩基からなり、配列番号11の177番目
のGから128番目のAまでの配列に相補した配列を有
する。 L−5:49塩基からなり、配列番号11の226番目
のCから178番目のGまでの配列に相補した配列を有
する。 L−6:49塩基からなり、配列番号11の275番目
のTから227番目のAまでの配列に相補した配列を有
する。 L−7:51塩基からなり、配列番号11の326番目
のCから276番目のCまでの配列に相補した配列を有
する。 L−8:49塩基からなり、配列番号11の375番目
のGから327番目のCまでの配列に相補した配列を有
する。 L−9:51塩基からなり、配列番号11の426番目
のTから376番目のAまでの配列に相補した配列を有
する。 L−10:49塩基からなり、配列番号11の465番
目のGから427番目のGまでの配列に相補した配列を
有し、しかも465番目のGに相補するCの上流方向に
5′−TCATTA−3′更にその上流方向に5′−A
GCT−3′を接続した配列を有する。
に対応した下鎖(コンプリメンタリー配列鎖)である。 L−1:29塩基からなり、配列番号11の25番目の
Aから1番目のTまでの配列に相補した配列を有し、し
かも1番目のTに相補するAの下流方向に5′−CAT
G−3′を接続した配列を有する。 L−2:52塩基からなり、配列番号11の77番目の
Gから26番目のAまでの配列に相補した配列を有する
。 L−3:50塩基からなり、配列番号11の127番目
のGから78番目のGまでの配列に相補した配列を有す
る。 L−4:50塩基からなり、配列番号11の177番目
のGから128番目のAまでの配列に相補した配列を有
する。 L−5:49塩基からなり、配列番号11の226番目
のCから178番目のGまでの配列に相補した配列を有
する。 L−6:49塩基からなり、配列番号11の275番目
のTから227番目のAまでの配列に相補した配列を有
する。 L−7:51塩基からなり、配列番号11の326番目
のCから276番目のCまでの配列に相補した配列を有
する。 L−8:49塩基からなり、配列番号11の375番目
のGから327番目のCまでの配列に相補した配列を有
する。 L−9:51塩基からなり、配列番号11の426番目
のTから376番目のAまでの配列に相補した配列を有
する。 L−10:49塩基からなり、配列番号11の465番
目のGから427番目のGまでの配列に相補した配列を
有し、しかも465番目のGに相補するCの上流方向に
5′−TCATTA−3′更にその上流方向に5′−A
GCT−3′を接続した配列を有する。
【0050】HPLC法については、ヌクレオジル5C
18カラム(φ4.6×150mm:ケムコ社販売)を
用いた逆相クロマトグラフィーによって、アセトニトリ
ルを含むトリエチルアミノ酢酸(100mM)バッファ
ー(pH7.0)で溶出することにより分離精製した。 上記溶出は、アセトニトリルの直線濃度勾配を5〜35
%(30分)とし、約15分のピークを回収した。
18カラム(φ4.6×150mm:ケムコ社販売)を
用いた逆相クロマトグラフィーによって、アセトニトリ
ルを含むトリエチルアミノ酢酸(100mM)バッファ
ー(pH7.0)で溶出することにより分離精製した。 上記溶出は、アセトニトリルの直線濃度勾配を5〜35
%(30分)とし、約15分のピークを回収した。
【0051】ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に関し
ては、各合成オリゴヌクレオチド試料を電気泳動により
分離し、紫外線シャドウイング法による泳動パターンの
観察結果より目的の大きさのバンド部分を切り出し、そ
のポリアクリルアミドゲル断片を約1〜2mm3の大き
さに切り刻み、約2mlの溶出バッファー(0.5MN
H4OAc及び1mM EDTA)を加え、37℃で
一晩振とうした。各オリゴヌクレオチドを含む溶出バッ
ファーを回収し、フェノール抽出(50%フェノール/
50%クロロホルム溶液使用)、イソブタノール抽出を
行い、エタノール沈殿操作により各オリゴヌクレオチド
の精製試料とした。
ては、各合成オリゴヌクレオチド試料を電気泳動により
分離し、紫外線シャドウイング法による泳動パターンの
観察結果より目的の大きさのバンド部分を切り出し、そ
のポリアクリルアミドゲル断片を約1〜2mm3の大き
さに切り刻み、約2mlの溶出バッファー(0.5MN
H4OAc及び1mM EDTA)を加え、37℃で
一晩振とうした。各オリゴヌクレオチドを含む溶出バッ
ファーを回収し、フェノール抽出(50%フェノール/
50%クロロホルム溶液使用)、イソブタノール抽出を
行い、エタノール沈殿操作により各オリゴヌクレオチド
の精製試料とした。
【0052】合成・精製したオリゴヌクレオチドの一部
について、マキサム・ギルバード法〔A.M.Maxa
m et al,Methods in En
zymology,65 499(1980)〕によ
り、目的の塩基配列を有していることを確認した。
について、マキサム・ギルバード法〔A.M.Maxa
m et al,Methods in En
zymology,65 499(1980)〕によ
り、目的の塩基配列を有していることを確認した。
【0053】以下(実施例3、4、5、6、7、8、9
及び10)の遺伝子組換えに係わる操作において、制限
酵素及び他の関連酵素の反応条件等は、主にMolec
ular Cloning(前出)記載の方法に準じ
た。なお、上記酵素等は主に宝酒造より入手しており、
宝酒造のマニュアルも参考にした。
及び10)の遺伝子組換えに係わる操作において、制限
酵素及び他の関連酵素の反応条件等は、主にMolec
ular Cloning(前出)記載の方法に準じ
た。なお、上記酵素等は主に宝酒造より入手しており、
宝酒造のマニュアルも参考にした。
【0054】実施例3(合成オリゴヌクレオチドの連結
によるヒトTNF遺伝子の構築) (1)まず図1に従ってヒトTNF遺伝子の構築を試み
た。前記実施例2で得られた合成オリゴヌクレオチドを
3つのグループ(U及びL−1〜4、U及びL−5〜7
並びにU及びL−8〜10)に分けてクローニングを行
った。すなわち、U−2、3、4、6、7、9及び10
並びにL−1、2、3、5、6、8及び9の各オリゴヌ
クレオチド(1〜2μg)の5′末端を2〜5ユニット
のT4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造)を用いて、
それぞれ別々にリン酸化した。リン酸化反応は10μl
の水溶液中(50mMトリス−HClpH7.6、10
mM−mgCl2、0.1mM スペルミジン、0.
1mMEDTA、10mMDTT及び1mM ATP
)、37℃で1時間行い、反応終了後、70℃で10分
間処理することによりT4ポリヌクレオチドキナーゼを
失活させた。新たに、1〜2μgのU−1、5及び8並
びにL−4、7及び10の各オリゴヌクレオチドをそれ
ぞれ別々に含む上記と同組成の水溶液10μlを用意し
、それぞれU及びLの同じ番号同士で各オリゴヌクレオ
チド(U−1〜10及びL−1〜10)水溶液を混合し
(20μl)、100℃で5分間煮沸後徐冷することに
よりアニール化した。次に、得られた10本のアニーリ
ング体(二本鎖DNA断片)を、各グループごとに連結
反応のための水溶液(66mMトリス−HCl pH
7.6、6.6mM MgCl2、10mM DT
T、1mM ATP及び100 μg/ml B
SA)に添加し(総液量120〜160μl)、40℃
に加温後徐冷によるアニール化の後、700ユニットの
T4DNAリガーゼ(宝酒造)を加えて、16℃で15
時間連結反応を行った。
によるヒトTNF遺伝子の構築) (1)まず図1に従ってヒトTNF遺伝子の構築を試み
た。前記実施例2で得られた合成オリゴヌクレオチドを
3つのグループ(U及びL−1〜4、U及びL−5〜7
並びにU及びL−8〜10)に分けてクローニングを行
った。すなわち、U−2、3、4、6、7、9及び10
並びにL−1、2、3、5、6、8及び9の各オリゴヌ
クレオチド(1〜2μg)の5′末端を2〜5ユニット
のT4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造)を用いて、
それぞれ別々にリン酸化した。リン酸化反応は10μl
の水溶液中(50mMトリス−HClpH7.6、10
mM−mgCl2、0.1mM スペルミジン、0.
1mMEDTA、10mMDTT及び1mM ATP
)、37℃で1時間行い、反応終了後、70℃で10分
間処理することによりT4ポリヌクレオチドキナーゼを
失活させた。新たに、1〜2μgのU−1、5及び8並
びにL−4、7及び10の各オリゴヌクレオチドをそれ
ぞれ別々に含む上記と同組成の水溶液10μlを用意し
、それぞれU及びLの同じ番号同士で各オリゴヌクレオ
チド(U−1〜10及びL−1〜10)水溶液を混合し
(20μl)、100℃で5分間煮沸後徐冷することに
よりアニール化した。次に、得られた10本のアニーリ
ング体(二本鎖DNA断片)を、各グループごとに連結
反応のための水溶液(66mMトリス−HCl pH
7.6、6.6mM MgCl2、10mM DT
T、1mM ATP及び100 μg/ml B
SA)に添加し(総液量120〜160μl)、40℃
に加温後徐冷によるアニール化の後、700ユニットの
T4DNAリガーゼ(宝酒造)を加えて、16℃で15
時間連結反応を行った。
【0055】反応終了後、各反応液をポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動(ゲル濃度6%)により分離し、エチジ
ウムブロマイド染色法による泳動パターンの観察結果よ
り目的の大きさ(176bp、150bp及び153b
p)のバンド部分を切り出し、エレクトロ・エリューシ
ョン法により目的とする3本のDNA断片を回収した。 更に、回収した各試料に対してフェノール抽出(50%
フェノール/50%クロロホルム溶液使用)、イソブタ
ノール抽出を行い、エタノール沈殿操作により目的のD
NAを精製した。上記方法に準じて、精製した3本の二
本鎖DNA断片をそれぞれ別々にその5′末端をT4ポ
リヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し、連結反応
のための水溶液中にて混合の後、40℃の加温によりア
ニール化を行い、T4DNAリガーゼを加えて連結した
。エタノール沈殿操作によりこの連結DNAを回収し、
1mM DTT及び100μg/mlBSAを含む5
0μlのハイ・ソルトバッファー(50mMトリス−H
Cl pH7.5、100mM NaCl、10m
M MgCl2)に溶解させ、15ユニットの制限酵
素EcoR I(宝酒造)及び15ユニットの制限酵
素Hind III(宝酒造)を添加して、37℃で
2時間切断反応を行った。反応終了後、上記方法に準じ
て、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度4%)
により目的とするDNA断片(約480bp)を分離精
製した。
ドゲル電気泳動(ゲル濃度6%)により分離し、エチジ
ウムブロマイド染色法による泳動パターンの観察結果よ
り目的の大きさ(176bp、150bp及び153b
p)のバンド部分を切り出し、エレクトロ・エリューシ
ョン法により目的とする3本のDNA断片を回収した。 更に、回収した各試料に対してフェノール抽出(50%
フェノール/50%クロロホルム溶液使用)、イソブタ
ノール抽出を行い、エタノール沈殿操作により目的のD
NAを精製した。上記方法に準じて、精製した3本の二
本鎖DNA断片をそれぞれ別々にその5′末端をT4ポ
リヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し、連結反応
のための水溶液中にて混合の後、40℃の加温によりア
ニール化を行い、T4DNAリガーゼを加えて連結した
。エタノール沈殿操作によりこの連結DNAを回収し、
1mM DTT及び100μg/mlBSAを含む5
0μlのハイ・ソルトバッファー(50mMトリス−H
Cl pH7.5、100mM NaCl、10m
M MgCl2)に溶解させ、15ユニットの制限酵
素EcoR I(宝酒造)及び15ユニットの制限酵
素Hind III(宝酒造)を添加して、37℃で
2時間切断反応を行った。反応終了後、上記方法に準じ
て、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度4%)
により目的とするDNA断片(約480bp)を分離精
製した。
【0056】一方、プラスミドベクターpUC9(九州
大学遺伝情報実験施設より分与)の5μgを、前記の方
法に準じて、制限酵素EcoR I及びHindII
Iで切断し、アガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%)
により約2.7KbpのDNA断片を分離精製した。先
に精製した約480bpのDNA断片(ヒトTNF遺伝
子を含む)とこのpUC9断片を、前記の方法に準じて
、20μlの連結反応液中にて混合し、350ユニット
のT4DNAリガーゼを添加し、16℃で3時間連結反
応を行った。塩化カルシウム法〔Molecular
Cloning参照〕により作製したE.coli
K−12JM83株(九州大学遺伝情報実験施設によ
り分与)のコンピテント セルを、上記連結反応液に
より常法に従って形質転換した〔Molecular
cloning参照〕。
大学遺伝情報実験施設より分与)の5μgを、前記の方
法に準じて、制限酵素EcoR I及びHindII
Iで切断し、アガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%)
により約2.7KbpのDNA断片を分離精製した。先
に精製した約480bpのDNA断片(ヒトTNF遺伝
子を含む)とこのpUC9断片を、前記の方法に準じて
、20μlの連結反応液中にて混合し、350ユニット
のT4DNAリガーゼを添加し、16℃で3時間連結反
応を行った。塩化カルシウム法〔Molecular
Cloning参照〕により作製したE.coli
K−12JM83株(九州大学遺伝情報実験施設によ
り分与)のコンピテント セルを、上記連結反応液に
より常法に従って形質転換した〔Molecular
cloning参照〕。
【0057】得られたアンピシリン耐性クローンより、
公知の方法を用いてプラスミドを調製し、前記の方法に
準じて、制限酵素(EcoR I及びHind I
II)処理後、アガロースゲル電気泳動によりその泳動
パターンを解析することにより、ヒトTNF遺伝子のp
UC9ベクターへの挿入を調べた。その結果、約250
bpの遺伝子の挿入が確認でき、そのクローンについて
挿入された遺伝子の塩基配列をジデオキシ法〔F.Sa
nger,Science,214,1205(198
1)〕により調べたところ、EcoR I部位から下
流に約130bpとHind III部位から上流に
約90bpの目的とするヒトTNF遺伝子の塩基配列を
有する遺伝子断片であることが確認された。このクロー
ン及びプラスミドをそれぞれpUA41/JM83及び
pUA41と命名した。
公知の方法を用いてプラスミドを調製し、前記の方法に
準じて、制限酵素(EcoR I及びHind I
II)処理後、アガロースゲル電気泳動によりその泳動
パターンを解析することにより、ヒトTNF遺伝子のp
UC9ベクターへの挿入を調べた。その結果、約250
bpの遺伝子の挿入が確認でき、そのクローンについて
挿入された遺伝子の塩基配列をジデオキシ法〔F.Sa
nger,Science,214,1205(198
1)〕により調べたところ、EcoR I部位から下
流に約130bpとHind III部位から上流に
約90bpの目的とするヒトTNF遺伝子の塩基配列を
有する遺伝子断片であることが確認された。このクロー
ン及びプラスミドをそれぞれpUA41/JM83及び
pUA41と命名した。
【0058】(2)引き続き、図2に従ってヒトTNF
遺伝子の構築を試みた。前記(1)工程でのクローニン
グでヒトTNF遺伝子の塩基配列において未達成な領域
周辺を2つのグループ(U及びL−3〜6並びにU及び
L−6〜9)に分け、前記(1)工程と同様にして、各
オリゴヌクレオチドをリン酸化し、アニール化した後、
T4DNAリガーゼにより連結した。前記方法に準じて
、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度6%)に
より分離精製し、得られた2本のDNA断片(201b
p及び200bp)をそれぞれ別々に100μlの67
mMトリス−HCl(pH8.8)、6.7mM M
gCl2、16.6mM (NH4)2SO4、6.
7μM EDTA、1mM DTT、200μg/
mlBSA及び各330 μMデオキシリボヌクレオ
チド三リン酸(dATP、dGTP、dCTP及びTT
P)水溶液にて溶解し、2〜5ユニットのT4DNAポ
リメラーゼ(宝酒造)を添加し、37℃で30分間反応
することによりDNA断片の両末端を平滑化した。反応
終了後、68℃で10分間処理することによりT4DN
Aポリメラーゼを失活させ、エタノール沈殿により目的
の2本のDNA断片を回収した。
遺伝子の構築を試みた。前記(1)工程でのクローニン
グでヒトTNF遺伝子の塩基配列において未達成な領域
周辺を2つのグループ(U及びL−3〜6並びにU及び
L−6〜9)に分け、前記(1)工程と同様にして、各
オリゴヌクレオチドをリン酸化し、アニール化した後、
T4DNAリガーゼにより連結した。前記方法に準じて
、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度6%)に
より分離精製し、得られた2本のDNA断片(201b
p及び200bp)をそれぞれ別々に100μlの67
mMトリス−HCl(pH8.8)、6.7mM M
gCl2、16.6mM (NH4)2SO4、6.
7μM EDTA、1mM DTT、200μg/
mlBSA及び各330 μMデオキシリボヌクレオ
チド三リン酸(dATP、dGTP、dCTP及びTT
P)水溶液にて溶解し、2〜5ユニットのT4DNAポ
リメラーゼ(宝酒造)を添加し、37℃で30分間反応
することによりDNA断片の両末端を平滑化した。反応
終了後、68℃で10分間処理することによりT4DN
Aポリメラーゼを失活させ、エタノール沈殿により目的
の2本のDNA断片を回収した。
【0059】一方、5μgのpUC9ベクターを1mM
DTT及び100μg/ml BSAを含む50
μlのミディアム・ソルトバッファー(10mMトリス
−HCl、pH7.5、50mMNaCl及び10mM
MgCl2)に溶解させ、15ユニットの制限酵素
HincII(宝酒造)を添加し、37℃で2時間の反
応後、エタノール沈殿により回収した。得られた切断・
開環したpUC9ベクターに、先に平滑化後回収した2
本のDNA断片をそれぞれ別々に、前記方法に準じて、
T4DNAリガーゼを用いて組込み、E.coli
K−12JM83株を形質転換した。得られたそれぞれ
のクローンについて、前記(1)工程と同様にして、挿
入されたDNAの塩基配列を調べ、目的の塩基配列であ
ることを確認した。これらのクローンをそれぞれpUA
42/JM83 及び pUA43/JM83と命
名し、プラスミドをpUA42及びpUA43と命名し
た。
DTT及び100μg/ml BSAを含む50
μlのミディアム・ソルトバッファー(10mMトリス
−HCl、pH7.5、50mMNaCl及び10mM
MgCl2)に溶解させ、15ユニットの制限酵素
HincII(宝酒造)を添加し、37℃で2時間の反
応後、エタノール沈殿により回収した。得られた切断・
開環したpUC9ベクターに、先に平滑化後回収した2
本のDNA断片をそれぞれ別々に、前記方法に準じて、
T4DNAリガーゼを用いて組込み、E.coli
K−12JM83株を形質転換した。得られたそれぞれ
のクローンについて、前記(1)工程と同様にして、挿
入されたDNAの塩基配列を調べ、目的の塩基配列であ
ることを確認した。これらのクローンをそれぞれpUA
42/JM83 及び pUA43/JM83と命
名し、プラスミドをpUA42及びpUA43と命名し
た。
【0060】上記(1)工程で得られたpUA41を制
限酵素EcoR I(ハイ・ソルトバッファー)及び
Sac I(宝酒造:ロウ・ソルトバッファー)、制
限酵素Hae II(宝酒造)及びHind II
I(ミディアム・ソルトバッファー)で、上記(2)工
程で得られたpUA42を制限酵素Sac I(ロウ
・ソルトバッファー)及びHpa I(宝酒造:KC
lバッファー)で並びにpUA43を制限酵素Hpa
I及びHae II(KClバッファー)で、前記
方法に準じて、それぞれ切断した。ロウ・ソルトバッフ
ァー(10mMトリス−HClpH7.5及び10mM
MgCl2)とハイ・ソルトバッファー又はKCl
バッファー(20mMトリス−HCl pH8.5、
100mM KCl及び10mM MgCl2)の
組合せについては、切断反応を2回に分け、反応の間に
エタノール沈殿操作を行うことにより対応した。pUA
41からのEcoR I−Sac I DNA断
片(127bp)及びHae II−Hind I
IIDNA断片(80bp)、pUA42からのSac
I−HpaI DNA断片(147bp)並びに
pUA43からのHpaI−Hae IIDNA断片
(126bp)を、前記方法に準じて、それぞれポリア
クリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度6%)により分離
精製した。
限酵素EcoR I(ハイ・ソルトバッファー)及び
Sac I(宝酒造:ロウ・ソルトバッファー)、制
限酵素Hae II(宝酒造)及びHind II
I(ミディアム・ソルトバッファー)で、上記(2)工
程で得られたpUA42を制限酵素Sac I(ロウ
・ソルトバッファー)及びHpa I(宝酒造:KC
lバッファー)で並びにpUA43を制限酵素Hpa
I及びHae II(KClバッファー)で、前記
方法に準じて、それぞれ切断した。ロウ・ソルトバッフ
ァー(10mMトリス−HClpH7.5及び10mM
MgCl2)とハイ・ソルトバッファー又はKCl
バッファー(20mMトリス−HCl pH8.5、
100mM KCl及び10mM MgCl2)の
組合せについては、切断反応を2回に分け、反応の間に
エタノール沈殿操作を行うことにより対応した。pUA
41からのEcoR I−Sac I DNA断
片(127bp)及びHae II−Hind I
IIDNA断片(80bp)、pUA42からのSac
I−HpaI DNA断片(147bp)並びに
pUA43からのHpaI−Hae IIDNA断片
(126bp)を、前記方法に準じて、それぞれポリア
クリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度6%)により分離
精製した。
【0061】一方、5μgのpUC19プラスミドベク
ター(九州大学遺伝情報実験施設より分与)を、前記の
方法に準じて、制限酵素EcoR I及びHind
IIIで切断し、約2.7kbpのDNA断片をアガ
ロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%)により分離精製し
た。 先に精製した4本のDNA断片を図示(図2)したよう
に順次添加し、前記方法に準じて、T4DNAリガーゼ
を用いて連結して行き、最後に上記の精製pUC19ベ
クター(約2.7Kbp断片)に組込み、JM83株を
形質転換した。この形質転換体に含まれるプラスミドに
ついて、前記方法に準じて、挿入された遺伝子の塩基配
列を調べたところ、目的とする完全長(約480bp)
のヒトTNF遺伝子を含むプラスミドベクター(約3.
2Kbp)を有するクローンであることが確認できた。 このクローンをpUA44/JM83と命名し、プラス
ミドをpUA44と命名した。
ター(九州大学遺伝情報実験施設より分与)を、前記の
方法に準じて、制限酵素EcoR I及びHind
IIIで切断し、約2.7kbpのDNA断片をアガ
ロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%)により分離精製し
た。 先に精製した4本のDNA断片を図示(図2)したよう
に順次添加し、前記方法に準じて、T4DNAリガーゼ
を用いて連結して行き、最後に上記の精製pUC19ベ
クター(約2.7Kbp断片)に組込み、JM83株を
形質転換した。この形質転換体に含まれるプラスミドに
ついて、前記方法に準じて、挿入された遺伝子の塩基配
列を調べたところ、目的とする完全長(約480bp)
のヒトTNF遺伝子を含むプラスミドベクター(約3.
2Kbp)を有するクローンであることが確認できた。 このクローンをpUA44/JM83と命名し、プラス
ミドをpUA44と命名した。
【0062】
実施例4(ヒトTNF発現ベクターの構築)(1)大腸
菌tacプロモーターを有する発現ベクターpKK22
3−3(ファルマシア社より入手)をより扱いやすくす
る目的で以下の改良を試みた。 (A)発現ベクターを低分子量化する。 (B)制限酵素BamH Iの切断部位を唯一とする
。 (C)tacプロモーターの方向をアンピシリン耐性遺
伝子の方向と逆向きにする。
菌tacプロモーターを有する発現ベクターpKK22
3−3(ファルマシア社より入手)をより扱いやすくす
る目的で以下の改良を試みた。 (A)発現ベクターを低分子量化する。 (B)制限酵素BamH Iの切断部位を唯一とする
。 (C)tacプロモーターの方向をアンピシリン耐性遺
伝子の方向と逆向きにする。
【0063】図3にその方法を図示した。プラスミドベ
クターpBR322(九州大学遺伝情報実験施設より分
与)の5μgを、実施例3の方法に準じて、制限酵素E
coRI及びHind IIIで切断後、その両末端
をT4DNAポリメラーゼを用いて平滑化した。実施例
3の方法に準じて、アガロースゲル電気泳動(ゲル濃度
1%)により約4.4KbpのDNA断片を分離精製し
、その開環部位に100ngのノンフォスフォリレーテ
ッド リンカーズのBgl IIリンカー(制限酵
素Bgl II切断部位を含む10bpの二本鎖DN
A断片:カタログNo.4721Aタカラ・バイオテク
ノロジー・カタログ1991 Vol.1、宝酒造よ
り入手)をT4DNAリガーゼを用いて挿入連結した。 前記実施例3の方法に準じて得た形質転換体の中より、
そのプラスミドについて制限酵素による切断の可否を調
べることにより、目的の制限酵素EcoR I及びH
ind III切断部位を欠き、制限酵素Bgl
II切断部位を新生したプラスミドpBR9333(約
4.4Kbp)を有するクローンを得た。
クターpBR322(九州大学遺伝情報実験施設より分
与)の5μgを、実施例3の方法に準じて、制限酵素E
coRI及びHind IIIで切断後、その両末端
をT4DNAポリメラーゼを用いて平滑化した。実施例
3の方法に準じて、アガロースゲル電気泳動(ゲル濃度
1%)により約4.4KbpのDNA断片を分離精製し
、その開環部位に100ngのノンフォスフォリレーテ
ッド リンカーズのBgl IIリンカー(制限酵
素Bgl II切断部位を含む10bpの二本鎖DN
A断片:カタログNo.4721Aタカラ・バイオテク
ノロジー・カタログ1991 Vol.1、宝酒造よ
り入手)をT4DNAリガーゼを用いて挿入連結した。 前記実施例3の方法に準じて得た形質転換体の中より、
そのプラスミドについて制限酵素による切断の可否を調
べることにより、目的の制限酵素EcoR I及びH
ind III切断部位を欠き、制限酵素Bgl
II切断部位を新生したプラスミドpBR9333(約
4.4Kbp)を有するクローンを得た。
【0064】上記で得たプラスミドpBR9333の5
μgを、実施例3の方法に準じて、ハイ・ソルトバッフ
ァーに溶解し、制限酵素Bgl II(宝酒造)及び
PvuII(宝酒造)で切断し、複製起点を含む約2.
3KbpのDNA断片をアガロースゲル電気泳動(ゲル
濃度1%)により分離精製した。一方、発現ベクターp
KK223−3(約4.6Kbp)の5μgを上記の場
合と同様、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素
BamH I(宝酒造)及びSca I(宝酒造)
で切断した。制限酵素BamH Iによる切断反応は
、添加酵素量を通常の約1/2とし、反応時間を5〜3
0分間とする部分切断により行った。切断処理後、ta
cプロモーター及びrrnBT1T2ターミネーター等
を含む約1.1KbpのDNA断片を上記の場合と同様
、アガロースゲル電気泳動により分離精製した。先に精
製した複製起点を含む約2.3KbpのDNA断片に上
記の約1.1KbpのDNA断片を前記に準じてT4D
NAリガーゼを用いて挿入連結し、実施例3の方法に準
じて、塩化カルシウム法により作製したE.coli
K−12 JM103株(九州大学遺伝情報実験施
設)のコンピテントセルに導入した。得られた形質転換
体の中より、目的とするtacプロモーター等を含む発
現ベクター(約3.4Kbp)を有するクローンを選択
し、この発現ベクターをpKK101と命名した。
μgを、実施例3の方法に準じて、ハイ・ソルトバッフ
ァーに溶解し、制限酵素Bgl II(宝酒造)及び
PvuII(宝酒造)で切断し、複製起点を含む約2.
3KbpのDNA断片をアガロースゲル電気泳動(ゲル
濃度1%)により分離精製した。一方、発現ベクターp
KK223−3(約4.6Kbp)の5μgを上記の場
合と同様、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素
BamH I(宝酒造)及びSca I(宝酒造)
で切断した。制限酵素BamH Iによる切断反応は
、添加酵素量を通常の約1/2とし、反応時間を5〜3
0分間とする部分切断により行った。切断処理後、ta
cプロモーター及びrrnBT1T2ターミネーター等
を含む約1.1KbpのDNA断片を上記の場合と同様
、アガロースゲル電気泳動により分離精製した。先に精
製した複製起点を含む約2.3KbpのDNA断片に上
記の約1.1KbpのDNA断片を前記に準じてT4D
NAリガーゼを用いて挿入連結し、実施例3の方法に準
じて、塩化カルシウム法により作製したE.coli
K−12 JM103株(九州大学遺伝情報実験施
設)のコンピテントセルに導入した。得られた形質転換
体の中より、目的とするtacプロモーター等を含む発
現ベクター(約3.4Kbp)を有するクローンを選択
し、この発現ベクターをpKK101と命名した。
【0065】(2)図4に従って、次の工程を説明する
。前記(1)工程で得た発現ベクターpKK101の5
μgを、前記方法に準じて、制限酵素EcoR I及
びHind IIIで切断し、複製起点及び転写調節
領域等を含む約3.4KbpのDNA断片をアガロース
ゲル電気泳動(ゲル濃度1%)により分離精製した。ま
た、前記実施例3で得られたヒトTNF遺伝子を含むプ
ラスミドpUA44(約3.2Kbp)を、同様にして
、制限酵素EcoR I及びHind IIIで切
断し、ヒトTNF遺伝子全域を含む約480bpのDN
A断片をアガロースゲル電気泳動により分離精製した。 このヒトTNF遺伝子全域を含むDNA断片を、先に発
現ベクターpKK101より精製した約3.4Kbpの
DNA断片に、前記方法に準じて、T4DNAリガーゼ
を用いて挿入連結し、前記の方法に準じてE.coli
K−12 JM103株に導入した。得られた形
質転換体の中より目的のヒトTNF発現ベクター(約3
.9Kbp)を有するクローンを選択し、この発現ベク
ターをpKF4102と命名した。
。前記(1)工程で得た発現ベクターpKK101の5
μgを、前記方法に準じて、制限酵素EcoR I及
びHind IIIで切断し、複製起点及び転写調節
領域等を含む約3.4KbpのDNA断片をアガロース
ゲル電気泳動(ゲル濃度1%)により分離精製した。ま
た、前記実施例3で得られたヒトTNF遺伝子を含むプ
ラスミドpUA44(約3.2Kbp)を、同様にして
、制限酵素EcoR I及びHind IIIで切
断し、ヒトTNF遺伝子全域を含む約480bpのDN
A断片をアガロースゲル電気泳動により分離精製した。 このヒトTNF遺伝子全域を含むDNA断片を、先に発
現ベクターpKK101より精製した約3.4Kbpの
DNA断片に、前記方法に準じて、T4DNAリガーゼ
を用いて挿入連結し、前記の方法に準じてE.coli
K−12 JM103株に導入した。得られた形
質転換体の中より目的のヒトTNF発現ベクター(約3
.9Kbp)を有するクローンを選択し、この発現ベク
ターをpKF4102と命名した。
【0066】実施例5(ヒトTNF転換体発現ベクター
pKF4168の構築) (1)図5に従って説明する。前記実施例3で得られた
プラスミドpUA44を、前記方法に準じ、制限酵素E
coR I及びHind IIIで切断し、ヒトT
NF遺伝子(全域を含む約480bp)のDNA断片を
アガロースゲル電気泳動により分離精製した。一方、M
essingら〔Methods in Enzy
mology,153,3(1987)〕によって開発
された一本鎖プラスミドDNA調製用プラスミドベクタ
ーpUC119(宝酒造より入手)を、同様にして、制
限酵素EcoRI及びHind IIIで切断し、I
G領域を含む約3.2KbpのDNA断片をアガロース
ゲル電気泳動により分離精製した。このIG領域(M1
3ファージDNAのintergenic regi
on)の存在により、プラスミドpUC119は、ヘル
パーファージM13K07感染後優先的に一本鎖DNA
となりファージ粒子に包み込まれ菌体外に放出される。 上記で精製したヒトTNF遺伝子全域を含む約480b
pのDNA断片とIG領域を含む約3.2KbpのpU
C119断片を前記に準じてT4DNAリガーゼを用い
て連結し、前記実施例3の方法に準じてE.coli
K−12JM83株に導入した。得られた形質転換体
の中より、目的のプラスミド(約3.7Kbp)を有す
るクローンを選択し、このクローンをpUC119−h
TNF/JM83と命名し、プラスミドをpUC119
−hTNFと命名した。
pKF4168の構築) (1)図5に従って説明する。前記実施例3で得られた
プラスミドpUA44を、前記方法に準じ、制限酵素E
coR I及びHind IIIで切断し、ヒトT
NF遺伝子(全域を含む約480bp)のDNA断片を
アガロースゲル電気泳動により分離精製した。一方、M
essingら〔Methods in Enzy
mology,153,3(1987)〕によって開発
された一本鎖プラスミドDNA調製用プラスミドベクタ
ーpUC119(宝酒造より入手)を、同様にして、制
限酵素EcoRI及びHind IIIで切断し、I
G領域を含む約3.2KbpのDNA断片をアガロース
ゲル電気泳動により分離精製した。このIG領域(M1
3ファージDNAのintergenic regi
on)の存在により、プラスミドpUC119は、ヘル
パーファージM13K07感染後優先的に一本鎖DNA
となりファージ粒子に包み込まれ菌体外に放出される。 上記で精製したヒトTNF遺伝子全域を含む約480b
pのDNA断片とIG領域を含む約3.2KbpのpU
C119断片を前記に準じてT4DNAリガーゼを用い
て連結し、前記実施例3の方法に準じてE.coli
K−12JM83株に導入した。得られた形質転換体
の中より、目的のプラスミド(約3.7Kbp)を有す
るクローンを選択し、このクローンをpUC119−h
TNF/JM83と命名し、プラスミドをpUC119
−hTNFと命名した。
【0067】上記で得たプラスミドpUC119−hT
NFを、そのDNA内にウラシルを取り込ませ保持する
ために、前記実施例3の方法に準じて、塩化カルシウム
法により作製した大腸菌CJ236株(dut−,un
g−)のコンピテント セルに導入した。CJ236
株はデオキシウリジン三リン酸分解酵素遺伝子に欠失変
異(dut−)を持つため競合反応が生じ、チミンの替
わりに一部ウラシルを取り込んだDNAを作ることがで
き、更にung−変異によりウラシルN−グリコシラー
ゼが欠損しており、そのウラシルをDNA中に保持して
おくことができる。このCJ236株はバイオ・ラドよ
り入手した。上記導入により得られたクローン(pUC
119−hTNF/CJ236)をヘルパーファージM
13K07(宝酒造より入手)の感染後、100μg/
mlアンピシリン、70μg/mlカナマイシン及び3
0μg/mlクロラムフェニコールを含む2×YTブロ
ース(1.6%トリプトン、1%酵母エキス及び0.5
%NaClpH7.6)にて培養することにより、目的
のウラシルを導入した一本鎖プラスミドDNA(約3.
7Kbases)をファージ粒子に包み込んだ形で菌体
外に放出させた。放出させたファージ粒子を培養上清よ
り回収し、一本鎖ファージDNAの調製方法に準じて、
目的の一本鎖プラスミドDNAを調製した。
NFを、そのDNA内にウラシルを取り込ませ保持する
ために、前記実施例3の方法に準じて、塩化カルシウム
法により作製した大腸菌CJ236株(dut−,un
g−)のコンピテント セルに導入した。CJ236
株はデオキシウリジン三リン酸分解酵素遺伝子に欠失変
異(dut−)を持つため競合反応が生じ、チミンの替
わりに一部ウラシルを取り込んだDNAを作ることがで
き、更にung−変異によりウラシルN−グリコシラー
ゼが欠損しており、そのウラシルをDNA中に保持して
おくことができる。このCJ236株はバイオ・ラドよ
り入手した。上記導入により得られたクローン(pUC
119−hTNF/CJ236)をヘルパーファージM
13K07(宝酒造より入手)の感染後、100μg/
mlアンピシリン、70μg/mlカナマイシン及び3
0μg/mlクロラムフェニコールを含む2×YTブロ
ース(1.6%トリプトン、1%酵母エキス及び0.5
%NaClpH7.6)にて培養することにより、目的
のウラシルを導入した一本鎖プラスミドDNA(約3.
7Kbases)をファージ粒子に包み込んだ形で菌体
外に放出させた。放出させたファージ粒子を培養上清よ
り回収し、一本鎖ファージDNAの調製方法に準じて、
目的の一本鎖プラスミドDNAを調製した。
【0068】(2)次に図6に従って説明する。コーデ
ィング鎖オリゴヌクレオチドを用いて、ヒトTNF遺伝
子に対し変異導入を行うために、プライマー4168を
デザインした。プライマー4168、配列番号11で示
した10番目のCから21番目のTまでの塩基配列のう
ち13〜15番目の5′−ACC−3′が5′−GGC
−3′に置換され16〜18番目の5′−CCG−3′
が5′−GAT−3′に置換された12塩基からなるオ
リゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドの化
学合成及び精製は、前記実施例2の方法に準じて行った
。
ィング鎖オリゴヌクレオチドを用いて、ヒトTNF遺伝
子に対し変異導入を行うために、プライマー4168を
デザインした。プライマー4168、配列番号11で示
した10番目のCから21番目のTまでの塩基配列のう
ち13〜15番目の5′−ACC−3′が5′−GGC
−3′に置換され16〜18番目の5′−CCG−3′
が5′−GAT−3′に置換された12塩基からなるオ
リゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドの化
学合成及び精製は、前記実施例2の方法に準じて行った
。
【0069】ヒトTNF遺伝子への部位特異的変異導入
は、バイオ・ラドのシステム(MutaーGeneTM
in vitro mutagenesis k
it)に準じて行った。すなわち、上記で作製した約0
.5μgのプライマーの5′末端を前記方法に準じてT
4ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した一部と
、先に調製したウラシル導入一本鎖プラスミドDNA(
pUC119−hTNF)の約200ngとの間で、1
0μlのアニーリング・バッファー(20mMトリス−
HCl pH7.4,2mM MgCl2及び50
mMNaCl)中にてアニーリング(約70℃に加温後
徐冷)を行った。アニーリング終了後、10倍シンセシ
ス・バッファー(5mM各デオキシリボヌクレオチド三
リン酸など(dATP、dGTP、dCTP及びTTP
)、10mM ATP、100mM トリス−HC
l pH7.4、50mM MgCl2及び20m
M DTT)を1/10容量加え、1ユニットのT4
DNAポリメラーゼ及び2〜4ユニットのT4DNAリ
ガーゼを用いて二本鎖化反応(37℃、90分間)を行
った。TEバッファー(10mM トリス−HCl
pH7.5及び1mM EDTA)を約8容量加え
、凍結することにより反応を停止した。前記実施例3の
方法に準じて、塩化カルシウム法により作製したE.c
oli K−12 TGl 株(ung+:アマ
シャム社)のコンピテントセルに、上記反応液を処理し
二本鎖DNAを導入した。
は、バイオ・ラドのシステム(MutaーGeneTM
in vitro mutagenesis k
it)に準じて行った。すなわち、上記で作製した約0
.5μgのプライマーの5′末端を前記方法に準じてT
4ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した一部と
、先に調製したウラシル導入一本鎖プラスミドDNA(
pUC119−hTNF)の約200ngとの間で、1
0μlのアニーリング・バッファー(20mMトリス−
HCl pH7.4,2mM MgCl2及び50
mMNaCl)中にてアニーリング(約70℃に加温後
徐冷)を行った。アニーリング終了後、10倍シンセシ
ス・バッファー(5mM各デオキシリボヌクレオチド三
リン酸など(dATP、dGTP、dCTP及びTTP
)、10mM ATP、100mM トリス−HC
l pH7.4、50mM MgCl2及び20m
M DTT)を1/10容量加え、1ユニットのT4
DNAポリメラーゼ及び2〜4ユニットのT4DNAリ
ガーゼを用いて二本鎖化反応(37℃、90分間)を行
った。TEバッファー(10mM トリス−HCl
pH7.5及び1mM EDTA)を約8容量加え
、凍結することにより反応を停止した。前記実施例3の
方法に準じて、塩化カルシウム法により作製したE.c
oli K−12 TGl 株(ung+:アマ
シャム社)のコンピテントセルに、上記反応液を処理し
二本鎖DNAを導入した。
【0070】ung+株にへテロ二本鎖DNAを導入す
ることにより、鋳型であるウラシルを含むDNA鎖は不
活性化され複製の対象とならない。(そのため変異の導
入頻度は50%を上回る高効率なものとなる。)得られ
た形質転換体の中より、変異導入のために使用したプラ
イマーをプローブとしたコロニー・ハイブリダイゼーシ
ョン法を用いて、目的の転換体DNAを含むプラスミド
(約3.7Kbp)を有するクローンを選択した。選択
されたクローンについて、そのプラスミドの変異導入部
位周辺の塩基配列をジデオキシ法〔F.Sanger:
前出〕により調べ、デザイン通りの転換体DNAに変異
していることを確認した。このプラスミドをpUC11
9−F4168と命名した。
ることにより、鋳型であるウラシルを含むDNA鎖は不
活性化され複製の対象とならない。(そのため変異の導
入頻度は50%を上回る高効率なものとなる。)得られ
た形質転換体の中より、変異導入のために使用したプラ
イマーをプローブとしたコロニー・ハイブリダイゼーシ
ョン法を用いて、目的の転換体DNAを含むプラスミド
(約3.7Kbp)を有するクローンを選択した。選択
されたクローンについて、そのプラスミドの変異導入部
位周辺の塩基配列をジデオキシ法〔F.Sanger:
前出〕により調べ、デザイン通りの転換体DNAに変異
していることを確認した。このプラスミドをpUC11
9−F4168と命名した。
【0071】(3)変異導入により得られた目的のヒト
TNF転換体遺伝子を、実施例4のヒトTNF発現ベク
ターの構築方法に準じて、tacプロモーターを有する
発現ベクターpKK101に組込みヒトTNF転換体発
現ベクターを構築した。ヒトTNF転換体遺伝子(約4
80bp)は、上記で得られた約3.7Kbpのプラス
ミドpUC119−F4168より、前記方法に準じて
、制限酵素EcoR I及びHind IIIによ
る切断後分離精製した。目的とするヒトTNF転換体発
現ベクター(pKF4168)は、ヒトTNF発現ベク
ター(pKF4102)と同様、宿主としてE.col
i K−12JM103株を用いて取得した。上記転
換体発現ベクターは、発現誘導により、以下に示す変換
を有する新規生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産す
る。
TNF転換体遺伝子を、実施例4のヒトTNF発現ベク
ターの構築方法に準じて、tacプロモーターを有する
発現ベクターpKK101に組込みヒトTNF転換体発
現ベクターを構築した。ヒトTNF転換体遺伝子(約4
80bp)は、上記で得られた約3.7Kbpのプラス
ミドpUC119−F4168より、前記方法に準じて
、制限酵素EcoR I及びHind IIIによ
る切断後分離精製した。目的とするヒトTNF転換体発
現ベクター(pKF4168)は、ヒトTNF発現ベク
ター(pKF4102)と同様、宿主としてE.col
i K−12JM103株を用いて取得した。上記転
換体発現ベクターは、発現誘導により、以下に示す変換
を有する新規生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産す
る。
【0072】ベクターpKF4168:配列番号1で示
したアミノ酸配列において、1番目〜8番目のアミノ酸
配列が配列番号2で示したアミノ酸配列で置換されたポ
リペプチドF4168をコードする。
したアミノ酸配列において、1番目〜8番目のアミノ酸
配列が配列番号2で示したアミノ酸配列で置換されたポ
リペプチドF4168をコードする。
【0073】実施例6(ヒトTNF転換体発現ベクター
pKF4415、pKF4416、pKF4417及び
pKF4418の構築) (1)前記実施例5(2)において、プライマー416
8の替りにそれぞれプライマー4415、同4416、
同4417又は同4418を用いて目的の変異導入DN
Aを含むプラスミド(約3.7Kbp)を取得した。ジ
デオキシ法によりデザイン通りの変換体DNAに変異し
ていることを確認し、これらのプラスミドをそれぞれp
UC119−F4415、pUC119−F4416、
pUC119−F4417又はpUC119−F441
8と命名した。
pKF4415、pKF4416、pKF4417及び
pKF4418の構築) (1)前記実施例5(2)において、プライマー416
8の替りにそれぞれプライマー4415、同4416、
同4417又は同4418を用いて目的の変異導入DN
Aを含むプラスミド(約3.7Kbp)を取得した。ジ
デオキシ法によりデザイン通りの変換体DNAに変異し
ていることを確認し、これらのプラスミドをそれぞれp
UC119−F4415、pUC119−F4416、
pUC119−F4417又はpUC119−F441
8と命名した。
【0074】ここで用いたプライマー4415、同44
16、同4417及び同4418は以下のオリゴヌクレ
オチドであり、その化学合成及び精製は前記実施例2の
方法に準じて行われた。
16、同4417及び同4418は以下のオリゴヌクレ
オチドであり、その化学合成及び精製は前記実施例2の
方法に準じて行われた。
【0075】プライマー4415:配列番号11で示し
た7番目のTから30番目のTまでの塩基配列のうち1
6〜18番目の5′−CCG−3′が5′−CGT−3
′に置換され、19〜21番目の5′−AGT−3′が
5′−GGT−3′に置換された24塩基からなるオリ
ゴヌクレオチドプライマー4416:配列番号11で示
した1番目のTから18番目のGまでの塩基配列のうち
9番目のTと10番目のCとの間に5′−CGTGGT
GAT−3′を挿入した27塩基からなるオリゴヌクレ
オチド。プライマー4417:配列番号11で示した1
0番目のCから27番目のGまでの塩基配列のうち18
番目のGと19番目のAとの間に5′−CGTGGTG
AT−3′を挿入した27塩基からなるオリゴヌクレオ
チド。プライマー4418:配列番号11で示した1番
目から9番目まで塩基配列に対し、1番目のTに対して
その5′側に5′−CGTGGTGAT−3′を付加し
、更にその5′側に5′−GAATTCATG−3′を
付加した27塩基からなるオリゴヌクレオチド。
た7番目のTから30番目のTまでの塩基配列のうち1
6〜18番目の5′−CCG−3′が5′−CGT−3
′に置換され、19〜21番目の5′−AGT−3′が
5′−GGT−3′に置換された24塩基からなるオリ
ゴヌクレオチドプライマー4416:配列番号11で示
した1番目のTから18番目のGまでの塩基配列のうち
9番目のTと10番目のCとの間に5′−CGTGGT
GAT−3′を挿入した27塩基からなるオリゴヌクレ
オチド。プライマー4417:配列番号11で示した1
0番目のCから27番目のGまでの塩基配列のうち18
番目のGと19番目のAとの間に5′−CGTGGTG
AT−3′を挿入した27塩基からなるオリゴヌクレオ
チド。プライマー4418:配列番号11で示した1番
目から9番目まで塩基配列に対し、1番目のTに対して
その5′側に5′−CGTGGTGAT−3′を付加し
、更にその5′側に5′−GAATTCATG−3′を
付加した27塩基からなるオリゴヌクレオチド。
【0076】(2)変異導入により得られた目的のヒト
TNF転換体遺伝子を、実施例4のヒトTNF発現ベク
ターの構築方法に準じて、tacプロモーターを有する
発現ベクターpKK101に組込みヒトTNF転換体発
現ベクターを構築した。ヒトTNF転換体遺伝子(約4
80bp)は、上記で得られた約3.7Kbpのプラス
ミドpUC119−F4415、pUC119−F44
16、pUC119−F4417又はpUC119−F
4418より、前記方法に準じて、制限酵素EcoR
I及びHind IIIによる切断後分離精製した
。目的とするヒトTNF転換体発現ベクターpKF44
15、pKF4416、pKF4417又はpKF44
18は、ヒトTNF発現ベクター(pKF4102)と
同様、宿主としてE.coli K−12JM103
株を用いて取得した。
TNF転換体遺伝子を、実施例4のヒトTNF発現ベク
ターの構築方法に準じて、tacプロモーターを有する
発現ベクターpKK101に組込みヒトTNF転換体発
現ベクターを構築した。ヒトTNF転換体遺伝子(約4
80bp)は、上記で得られた約3.7Kbpのプラス
ミドpUC119−F4415、pUC119−F44
16、pUC119−F4417又はpUC119−F
4418より、前記方法に準じて、制限酵素EcoR
I及びHind IIIによる切断後分離精製した
。目的とするヒトTNF転換体発現ベクターpKF44
15、pKF4416、pKF4417又はpKF44
18は、ヒトTNF発現ベクター(pKF4102)と
同様、宿主としてE.coli K−12JM103
株を用いて取得した。
【0077】上記転換体発現ベクターは、発現誘導によ
り、以下に示す変換を有する新規生理活性ポリペプチド
を大腸菌内に生産する。ベクターpKF4415:配列
番号1で示したアミノ酸配列において、1番目〜8番目
のアミノ酸配列が配列番号3で示したアミノ酸配列で置
換されたポリペプチドF4415をコードする。ベクタ
ーpKF4416:配列番号1で示したアミノ酸配列に
おいて、1番目〜8番目のアミノ酸配列が配列番号4で
示したアミノ酸配列で置換されたポリペプチドF441
6をコードする。ベクターpKF4417:配列番号1
で示したアミノ酸配列において、1番目〜8番目の配列
が配列番号5で示した配列で置換されたポリペプチドF
4417をコードする。ベクターpKF4418:配列
番号1で示したアミノ酸配列において、1番目〜8番目
の配列が配列番号6で示した配列で置換されたポリペプ
チドF4418をコードする。
り、以下に示す変換を有する新規生理活性ポリペプチド
を大腸菌内に生産する。ベクターpKF4415:配列
番号1で示したアミノ酸配列において、1番目〜8番目
のアミノ酸配列が配列番号3で示したアミノ酸配列で置
換されたポリペプチドF4415をコードする。ベクタ
ーpKF4416:配列番号1で示したアミノ酸配列に
おいて、1番目〜8番目のアミノ酸配列が配列番号4で
示したアミノ酸配列で置換されたポリペプチドF441
6をコードする。ベクターpKF4417:配列番号1
で示したアミノ酸配列において、1番目〜8番目の配列
が配列番号5で示した配列で置換されたポリペプチドF
4417をコードする。ベクターpKF4418:配列
番号1で示したアミノ酸配列において、1番目〜8番目
の配列が配列番号6で示した配列で置換されたポリペプ
チドF4418をコードする。
【0078】実施例7(ヒトTNF転換体発現ベクター
pKF4420の構築) (1)配列番号11で示した5番目のCから20番目の
Gまでの16塩基のうち13番目のAがGに置換された
オリゴヌクレオチドをデザインし、プライマー4104
と命名した。このオリゴヌクレオチドの化学合成及び精
製は、前記実施例2の方法に準じて行った。前記実施例
5(2)においてプライマー4168の替りにこのプラ
イマー4104を用いることにより目的の変換体DNA
を含むプラスミド(約3.7Kbp)を取得した。変異
導入部位周辺の塩基配列をジデオキシ法により調べ、デ
ザイン通りの変換体DNAに変異していることを確認し
、このプラスミドをpUC119−F4104と命名し
た。
pKF4420の構築) (1)配列番号11で示した5番目のCから20番目の
Gまでの16塩基のうち13番目のAがGに置換された
オリゴヌクレオチドをデザインし、プライマー4104
と命名した。このオリゴヌクレオチドの化学合成及び精
製は、前記実施例2の方法に準じて行った。前記実施例
5(2)においてプライマー4168の替りにこのプラ
イマー4104を用いることにより目的の変換体DNA
を含むプラスミド(約3.7Kbp)を取得した。変異
導入部位周辺の塩基配列をジデオキシ法により調べ、デ
ザイン通りの変換体DNAに変異していることを確認し
、このプラスミドをpUC119−F4104と命名し
た。
【0079】(2)前記実施例5(1)においてpUC
119−hTNFの替りにpUC119−F4104を
用いて目的の一本鎖プラスミドDNAを調製した。また
、配列番号11で示した46番目のGから66番目のG
までの21塩基のうち56番目のAがGに置換されたオ
リゴヌクレオチドをデザインし、プライマー4226と
命名した。このオリゴヌクレオチドの化学合成及び精製
は前記実施例2の方法に準じて行った。
119−hTNFの替りにpUC119−F4104を
用いて目的の一本鎖プラスミドDNAを調製した。また
、配列番号11で示した46番目のGから66番目のG
までの21塩基のうち56番目のAがGに置換されたオ
リゴヌクレオチドをデザインし、プライマー4226と
命名した。このオリゴヌクレオチドの化学合成及び精製
は前記実施例2の方法に準じて行った。
【0080】次に、上記で調製したpUC119−F4
104の一本鎖プラスミドDNA及びプライマー422
6を用いてヒトTNF変換体遺伝子への部位特異的変異
導入を前記実施例5(2)の方法に準じて行い、目的の
変換体DNAを含むプラスミド(約3.7Kbp)を取
得した。ジデオキシ法によりデザイン通りの変換体DN
Aに変異していることを確認し、このプラスミドをpU
C119−F4226と命名した。
104の一本鎖プラスミドDNA及びプライマー422
6を用いてヒトTNF変換体遺伝子への部位特異的変異
導入を前記実施例5(2)の方法に準じて行い、目的の
変換体DNAを含むプラスミド(約3.7Kbp)を取
得した。ジデオキシ法によりデザイン通りの変換体DN
Aに変異していることを確認し、このプラスミドをpU
C119−F4226と命名した。
【0081】(3)前記実施例7(2)で得られた制限
酵素XhoI切断部位を2箇所に有するプラスミドpU
C119−F4226を用いて、その生成した制限酵素
XhoI切断部位のN末端側に化学合成オリゴヌクレオ
チド(アニーリングにより二本鎖化したもの)を連結す
ることにより、N末置換型転換体ポリペプチド(F44
20と命名)の発現ベクター(pKF4420と命名)
を構築した。その構築方法を図7に従って説明する。
酵素XhoI切断部位を2箇所に有するプラスミドpU
C119−F4226を用いて、その生成した制限酵素
XhoI切断部位のN末端側に化学合成オリゴヌクレオ
チド(アニーリングにより二本鎖化したもの)を連結す
ることにより、N末置換型転換体ポリペプチド(F44
20と命名)の発現ベクター(pKF4420と命名)
を構築した。その構築方法を図7に従って説明する。
【0082】プラスミドpUC119−F4226(約
3.7Kbp)の5μgを、前記実施例3の方法に準じ
て、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素Xho
I(宝酒造)及びHind IIIで切断し、N
末部分を欠失したF4226遺伝子を含む約420bp
のDNA断片をアガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%
)により分離精製した。また、F4226のN末部分に
置換する目的でデザインしたオリゴペプチドをコードす
るオリゴヌクレオチドの上鎖(U−4420)及び下鎖
(L−4420)を、前記実施例2の方法に準じて化学
合成し、精製した。上鎖U−4420は配列番号12で
示した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ま
た下鎖L−4420は上鎖U−4420に相補する配列
を有する鎖であるが、このものは上鎖U−4420の1
番目〜4番目の5′−AATT−3′に相補する配列部
分は有さず、一方その下鎖の5′末端のGに対し、その
5′側に5′−TCGA−3′が付加された塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドである。精製後得られた2本
のオリゴヌクレオチド(各1μg)を、前記実施例3の
方法に準じて、その5′末端をT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いてリン酸化の後、アニール化により二本鎖
DNA断片(46bp)とした。一方、前記実施例4の
方法に準じてプラスミドベクターpKK101を制限酵
素EcoR I及びHind IIIで切断し、複
製起点及び転写調節領域等を含む約3.4KbpのDN
A断片を分離精製した。
3.7Kbp)の5μgを、前記実施例3の方法に準じ
て、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素Xho
I(宝酒造)及びHind IIIで切断し、N
末部分を欠失したF4226遺伝子を含む約420bp
のDNA断片をアガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%
)により分離精製した。また、F4226のN末部分に
置換する目的でデザインしたオリゴペプチドをコードす
るオリゴヌクレオチドの上鎖(U−4420)及び下鎖
(L−4420)を、前記実施例2の方法に準じて化学
合成し、精製した。上鎖U−4420は配列番号12で
示した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ま
た下鎖L−4420は上鎖U−4420に相補する配列
を有する鎖であるが、このものは上鎖U−4420の1
番目〜4番目の5′−AATT−3′に相補する配列部
分は有さず、一方その下鎖の5′末端のGに対し、その
5′側に5′−TCGA−3′が付加された塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドである。精製後得られた2本
のオリゴヌクレオチド(各1μg)を、前記実施例3の
方法に準じて、その5′末端をT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いてリン酸化の後、アニール化により二本鎖
DNA断片(46bp)とした。一方、前記実施例4の
方法に準じてプラスミドベクターpKK101を制限酵
素EcoR I及びHind IIIで切断し、複
製起点及び転写調節領域等を含む約3.4KbpのDN
A断片を分離精製した。
【0083】上記方法に従って得られた3本のDNA断
片を、前記実施例3の方法に準じて、T4DNAリガー
ゼを用いて連結し、E.coli K−12 JM
103株のコンピテント セルに導入した。得られた
形質転換体の中より、目的のF4420発現ベクターp
KF4420(約3.9Kbp)を有するクローンを、
制限酵素EcoR I、Xho I及びHind
IIIによる切断パターンの確認並びに転換体ポリペ
プチドのN末置換部位周辺の塩基配列を調べることによ
り選択した。
片を、前記実施例3の方法に準じて、T4DNAリガー
ゼを用いて連結し、E.coli K−12 JM
103株のコンピテント セルに導入した。得られた
形質転換体の中より、目的のF4420発現ベクターp
KF4420(約3.9Kbp)を有するクローンを、
制限酵素EcoR I、Xho I及びHind
IIIによる切断パターンの確認並びに転換体ポリペ
プチドのN末置換部位周辺の塩基配列を調べることによ
り選択した。
【0084】上記方法に従って構築した転換体発現ベク
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。ベクター
pKF4420:配列表の配列番号1で示したアミノ酸
配列において、1番目〜8番目のアミノ酸配列が配列番
号7で示したアミノ酸配列で置換されたポリペプチドF
4420をコードする。
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。ベクター
pKF4420:配列表の配列番号1で示したアミノ酸
配列において、1番目〜8番目のアミノ酸配列が配列番
号7で示したアミノ酸配列で置換されたポリペプチドF
4420をコードする。
【0085】実施例8(ヒトTNF転換体発現ベクター
pKF4421及びpKF4137の構築)前記実施例
7(1)で得られた制限酵素Xho I切断部位を有
するプラスミドpUC119−F4104を用いて、そ
の制限酵素Xho I切断部位のN末端側に化学合成
オリゴヌクレオチド(アニーリングにより二本鎖化した
もの)を連結することにより、N末置換型転換体ポリペ
プチド(F4421及びF4137と命名)の発現ベク
ター(pKF4421及びpKF4137と命名)を構
築した。
pKF4421及びpKF4137の構築)前記実施例
7(1)で得られた制限酵素Xho I切断部位を有
するプラスミドpUC119−F4104を用いて、そ
の制限酵素Xho I切断部位のN末端側に化学合成
オリゴヌクレオチド(アニーリングにより二本鎖化した
もの)を連結することにより、N末置換型転換体ポリペ
プチド(F4421及びF4137と命名)の発現ベク
ター(pKF4421及びpKF4137と命名)を構
築した。
【0086】プラスミドpUC119−F4104(約
3.7Kbp)の5μgを、前記実施例3の方法に準じ
て、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素Xho
I及びHind IIIで切断し、N末部分を欠
失したF4104遺伝子を含む約460bpのDNA断
片をアガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%)により分
離精製した。また、F4104のN末部分に置換する目
的でデザインしたオリゴペプチドをコードするオリゴヌ
クレオチドの上鎖(U−4421又はU−4137)及
び下鎖(L−4421又はL−4137)を、前記実施
例2の方法に準じて、化学合成及び精製した。上鎖U−
4421は配列表の配列番号13で示した配列を有する
オリゴヌクレオチドである。また下鎖L−4421は上
鎖U−4421に相補する配列を有する鎖であるが、上
鎖U−4421の1番目〜4番目の5′−AATT−3
′に相補する配列部分は有さず、一方その下鎖の5′末
端のGに対し、その5′側に5′−TCGA−3′が付
加された配列を有するオリゴヌクレオチドである。また
、上鎖U−4137は配列表の配列番号14で示した配
列を有するオリゴヌクレオチドである。下鎖L−413
7は上鎖U−4137に相補する配列を有する鎖である
が、上鎖4137の1番目〜4番目の5′−AATT−
3′に相補する配列部分は有さず、一方その下鎖の5′
末端のGに対し、その5′側に5′−TCGA−3′が
付加された配列を有するオリゴヌクレオチドである。精
製後得られた各上、下2本のオリゴヌクレオチド(各1
μg)を、前記実施例3の方法に準じてその5′末端を
T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化の後、
アニール化により二本鎖DNA断片(34bp)とした
。
3.7Kbp)の5μgを、前記実施例3の方法に準じ
て、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素Xho
I及びHind IIIで切断し、N末部分を欠
失したF4104遺伝子を含む約460bpのDNA断
片をアガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%)により分
離精製した。また、F4104のN末部分に置換する目
的でデザインしたオリゴペプチドをコードするオリゴヌ
クレオチドの上鎖(U−4421又はU−4137)及
び下鎖(L−4421又はL−4137)を、前記実施
例2の方法に準じて、化学合成及び精製した。上鎖U−
4421は配列表の配列番号13で示した配列を有する
オリゴヌクレオチドである。また下鎖L−4421は上
鎖U−4421に相補する配列を有する鎖であるが、上
鎖U−4421の1番目〜4番目の5′−AATT−3
′に相補する配列部分は有さず、一方その下鎖の5′末
端のGに対し、その5′側に5′−TCGA−3′が付
加された配列を有するオリゴヌクレオチドである。また
、上鎖U−4137は配列表の配列番号14で示した配
列を有するオリゴヌクレオチドである。下鎖L−413
7は上鎖U−4137に相補する配列を有する鎖である
が、上鎖4137の1番目〜4番目の5′−AATT−
3′に相補する配列部分は有さず、一方その下鎖の5′
末端のGに対し、その5′側に5′−TCGA−3′が
付加された配列を有するオリゴヌクレオチドである。精
製後得られた各上、下2本のオリゴヌクレオチド(各1
μg)を、前記実施例3の方法に準じてその5′末端を
T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化の後、
アニール化により二本鎖DNA断片(34bp)とした
。
【0087】一方、前記実施例4の方法に準じてプラス
ミドベクターpKK101を制限酵素EcoR I及
びHind IIIで切断し、複製起点及ひ転写調節
領域等を含む約3.4KbpのDNA断片を分離精製し
た。
ミドベクターpKK101を制限酵素EcoR I及
びHind IIIで切断し、複製起点及ひ転写調節
領域等を含む約3.4KbpのDNA断片を分離精製し
た。
【0088】上記方法に従って得られた各3本のDNA
断片を、前記実施例3の方法に準じて、T4DNAリガ
ーゼを用いて連結し、E.coli K−12 J
M103株のコンピテントセルに導入した。得られた形
質転換体の中より、目的のF4421発現ベクターpK
F4421(約3.9Kbp)又はF4137発現ベク
ターpKF4137(約3.9Kbp)を有するクロー
ンを、制限酵素EcoRI、Xho I及びHind
IIIによる切断パターンの確認並びに転換体ポリ
ペプチドのN末置換部位周辺の塩基配列を調べることに
より選択した。
断片を、前記実施例3の方法に準じて、T4DNAリガ
ーゼを用いて連結し、E.coli K−12 J
M103株のコンピテントセルに導入した。得られた形
質転換体の中より、目的のF4421発現ベクターpK
F4421(約3.9Kbp)又はF4137発現ベク
ターpKF4137(約3.9Kbp)を有するクロー
ンを、制限酵素EcoRI、Xho I及びHind
IIIによる切断パターンの確認並びに転換体ポリ
ペプチドのN末置換部位周辺の塩基配列を調べることに
より選択した。
【0089】上記方法に従って構築した転換体発現ベク
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。ベクター
pKF4421:配列表の配列番号1で示したアミノ酸
配列において、1番目〜8番目のアミノ酸配列が配列番
号8で示したアミノ酸配列で置換されたポリペプチドF
4421をコードする。ベクターpKF4137:配列
表の配列番号1で示したアミノ酸配列において、1番目
〜8番目のアミノ酸配列が配列番号9で示したアミノ酸
配列で置換されたポポリペプチドF4137をコードす
る。
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。ベクター
pKF4421:配列表の配列番号1で示したアミノ酸
配列において、1番目〜8番目のアミノ酸配列が配列番
号8で示したアミノ酸配列で置換されたポリペプチドF
4421をコードする。ベクターpKF4137:配列
表の配列番号1で示したアミノ酸配列において、1番目
〜8番目のアミノ酸配列が配列番号9で示したアミノ酸
配列で置換されたポポリペプチドF4137をコードす
る。
【0090】実施例9(ヒトTNF転換体発現ベクター
pKF4601及びpKF4602の構築)(1)プラ
イマー4291及び同4292をデザインした。これら
プライマーは配列番号11の193番目のCから213
番目のTまでの塩基配列を有し、202番目〜204番
目の5′−CCA−3′が、プライマー4291の場合
5′−GAT−3′により、プライマー4292の場合
5′−ATG−3′によりそれぞれ置換された21塩基
からなるオリゴヌクレオチドである。
pKF4601及びpKF4602の構築)(1)プラ
イマー4291及び同4292をデザインした。これら
プライマーは配列番号11の193番目のCから213
番目のTまでの塩基配列を有し、202番目〜204番
目の5′−CCA−3′が、プライマー4291の場合
5′−GAT−3′により、プライマー4292の場合
5′−ATG−3′によりそれぞれ置換された21塩基
からなるオリゴヌクレオチドである。
【0091】オリゴヌクレオチドの化学合成及び精製は
前記実施例2の方法に準じて行われた。これらプライマ
ー4291あるいは4292を用い、前記実施例5(1
)及び(2)の方法に準じて目的の変異導入DNAを含
むプラスミド(約3.7Kbp)を得た。ジデオキシ法
によりデザイン通りの変換体DNAに変異していること
を確認し、このプラスミドをpUC119−F4291
あるいはpUC119−F4292と命名した。変異導
入により得られた目的のヒトTNF変換体遺伝子を実施
例4のヒトTNF発現ベクターの構築方法に準じて、t
acプロモーターを有する発現ベクターpKK101に
組込みヒトTNF変換体発現ベクターを構築した。ヒト
TNF変換体遺伝子(約480bp)は、上記で得られ
た約3.7KbpのプラスミドpUC119−F429
1あるいはpUC119−F4292より、前記の方法
に準じて、制限酵素EcoR I及びHindIII
による切断後分離精製した。目的とするヒトTNF変換
体発現ベクターpKF4291あるいはpKF4292
は、ヒトTNF発現ベクター(pKF4102)と同様
、宿主としてE.coli K−12 JM103
株を用いて取得した。
前記実施例2の方法に準じて行われた。これらプライマ
ー4291あるいは4292を用い、前記実施例5(1
)及び(2)の方法に準じて目的の変異導入DNAを含
むプラスミド(約3.7Kbp)を得た。ジデオキシ法
によりデザイン通りの変換体DNAに変異していること
を確認し、このプラスミドをpUC119−F4291
あるいはpUC119−F4292と命名した。変異導
入により得られた目的のヒトTNF変換体遺伝子を実施
例4のヒトTNF発現ベクターの構築方法に準じて、t
acプロモーターを有する発現ベクターpKK101に
組込みヒトTNF変換体発現ベクターを構築した。ヒト
TNF変換体遺伝子(約480bp)は、上記で得られ
た約3.7KbpのプラスミドpUC119−F429
1あるいはpUC119−F4292より、前記の方法
に準じて、制限酵素EcoR I及びHindIII
による切断後分離精製した。目的とするヒトTNF変換
体発現ベクターpKF4291あるいはpKF4292
は、ヒトTNF発現ベクター(pKF4102)と同様
、宿主としてE.coli K−12 JM103
株を用いて取得した。
【0092】(2)図8に従って説明する。前記実施例
5で得られたヒトTNF転換体発現ベクターpKF41
68(約3.9Kbp)の5μgを、前記実施例3の方
法に準じて、ミディアム・ソルトバッファーに溶解し、
制限酵素Sac I及びHind IIIで切断し
、複製起点及び転写調節領域等を含む約3.5Kbpの
DNA断片をアガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%)
により分離精製した。一方、前記実施例9(1)で得ら
れたヒトTNF変換体発現ベクターpKF4291又は
pKF4292の5μgを、前記と同様にして、制限酵
素SacI及びHind IIIで切断し、N末部分
を欠失したヒトTNF変換体遺伝子を含む約360bp
のDNA断片を分離精製した
5で得られたヒトTNF転換体発現ベクターpKF41
68(約3.9Kbp)の5μgを、前記実施例3の方
法に準じて、ミディアム・ソルトバッファーに溶解し、
制限酵素Sac I及びHind IIIで切断し
、複製起点及び転写調節領域等を含む約3.5Kbpの
DNA断片をアガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%)
により分離精製した。一方、前記実施例9(1)で得ら
れたヒトTNF変換体発現ベクターpKF4291又は
pKF4292の5μgを、前記と同様にして、制限酵
素SacI及びHind IIIで切断し、N末部分
を欠失したヒトTNF変換体遺伝子を含む約360bp
のDNA断片を分離精製した
【0093】上記方法に従って得られた2本のDNA断
片を、前記実施例3の方法に準じて、T4DNAリガー
ゼを用いて連結し、E.coli K−12 JM
103株のコンピテントセルに導入した。得られた形質
転換体の中より、目的のF4601又はF4602発現
ベクターpKF4601又はpKF4602(約3.9
Kbp)を有するクローンを、制限酵素Sac I及
びHind IIIによる切断パターンの確認並びに
変換体ポリペプチド由来の変換部位周辺の塩基配列を調
べることにより選択した。
片を、前記実施例3の方法に準じて、T4DNAリガー
ゼを用いて連結し、E.coli K−12 JM
103株のコンピテントセルに導入した。得られた形質
転換体の中より、目的のF4601又はF4602発現
ベクターpKF4601又はpKF4602(約3.9
Kbp)を有するクローンを、制限酵素Sac I及
びHind IIIによる切断パターンの確認並びに
変換体ポリペプチド由来の変換部位周辺の塩基配列を調
べることにより選択した。
【0094】上記方法に従って構築した転換体発現ベク
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。ベクター
pKF4601:配列番号1で示したアミノ酸配列にお
いて、1番目〜8番目のアミノ酸配列が配列番号2で示
したアミノ酸配列で置換され、68番目のProがAs
pに変換されたポリペプチドF4601をコードする。 ベクターpKF4602:配列番号1で示したアミノ酸
配列において、1番目〜8番目のアミノ酸配列が配列番
号2で示したアミノ酸配列で置換され、68番目のPr
oがMetに変換されたポリペプチドF4602をコー
ドする。
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。ベクター
pKF4601:配列番号1で示したアミノ酸配列にお
いて、1番目〜8番目のアミノ酸配列が配列番号2で示
したアミノ酸配列で置換され、68番目のProがAs
pに変換されたポリペプチドF4601をコードする。 ベクターpKF4602:配列番号1で示したアミノ酸
配列において、1番目〜8番目のアミノ酸配列が配列番
号2で示したアミノ酸配列で置換され、68番目のPr
oがMetに変換されたポリペプチドF4602をコー
ドする。
【0095】実施例10(ヒトTNF転換体発現ベクタ
ーpKF4113の構築) 転写プロモーターとしてtrpプロモーターを有し、翻
訳開始シグナル(SD配列)をタンデムに2つ並べ、転
写ターミネーターとしてrrnBT1T2ターミネータ
ーを有するプラスミドベクター(pSK407と命名)
を図9〜図11に示した方法に従って構築した。プラス
ミドベクターpGF101(約4.3Kbp、大阪大学
薬学部より分与)の5μgを、前記方法に準じて、ミデ
ィアム・ソルトバッファーに溶解し、10ユニットの制
限酵素Cla I(宝酒造)を添加することにより切
断した。この切断されたDNA断片を、前記実施例3の
方法に準じて、T4DNAポリメラーゼを用いて平滑化
し、エタノール沈殿操作後、NaClを添加しNaCl
濃度を175mMとしたハイ・ソルトバッファーに溶解
し、15ユニットの制限酵素Sal I(宝酒造)を
添加することにより切断した。前記実施例3の方法に準
じて、アガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%)により
約4.0KbpのDNA断片を分離精製した。
ーpKF4113の構築) 転写プロモーターとしてtrpプロモーターを有し、翻
訳開始シグナル(SD配列)をタンデムに2つ並べ、転
写ターミネーターとしてrrnBT1T2ターミネータ
ーを有するプラスミドベクター(pSK407と命名)
を図9〜図11に示した方法に従って構築した。プラス
ミドベクターpGF101(約4.3Kbp、大阪大学
薬学部より分与)の5μgを、前記方法に準じて、ミデ
ィアム・ソルトバッファーに溶解し、10ユニットの制
限酵素Cla I(宝酒造)を添加することにより切
断した。この切断されたDNA断片を、前記実施例3の
方法に準じて、T4DNAポリメラーゼを用いて平滑化
し、エタノール沈殿操作後、NaClを添加しNaCl
濃度を175mMとしたハイ・ソルトバッファーに溶解
し、15ユニットの制限酵素Sal I(宝酒造)を
添加することにより切断した。前記実施例3の方法に準
じて、アガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%)により
約4.0KbpのDNA断片を分離精製した。
【0096】一方、Casadabanら〔J.Bac
teriol.,143,971(1980)〕によっ
て開発されプラスミドpMC1403(約9.9Kbp
、京都大学ウィルス研究所より分与)の5μgを、前記
方法に準じて、制限酵素EcoR Iにより切断後、
上記方法と同様に、平滑化及び制限酵素Sal I切
断を行い、アガロースゲル電気泳動により約6.2Kb
pのDNA断片を分離精製した。前記実施例3の方法に
準じて、先に精製したDNA断片との間でT4DNAリ
ガーゼを用いて連結反応を行い、塩化カルシウム法によ
り作製したE.coli−K12 HB101株(京
都大学ウイルス研究所より分与)のコンピテントセルに
導入した。得られた形質転換体の中より、目的のtrp
プロモーター並びに制限酵素EcoR I及びBam
H I切断部位を含む約10.2Kbpのプラスミド
ベクター(pSK101と命名)を有するクローンを選
択した。
teriol.,143,971(1980)〕によっ
て開発されプラスミドpMC1403(約9.9Kbp
、京都大学ウィルス研究所より分与)の5μgを、前記
方法に準じて、制限酵素EcoR Iにより切断後、
上記方法と同様に、平滑化及び制限酵素Sal I切
断を行い、アガロースゲル電気泳動により約6.2Kb
pのDNA断片を分離精製した。前記実施例3の方法に
準じて、先に精製したDNA断片との間でT4DNAリ
ガーゼを用いて連結反応を行い、塩化カルシウム法によ
り作製したE.coli−K12 HB101株(京
都大学ウイルス研究所より分与)のコンピテントセルに
導入した。得られた形質転換体の中より、目的のtrp
プロモーター並びに制限酵素EcoR I及びBam
H I切断部位を含む約10.2Kbpのプラスミド
ベクター(pSK101と命名)を有するクローンを選
択した。
【0097】上記で得られたプラスミドベクターpSK
101の5μgを2本のチューブにそれぞれ別々に、前
記方法に準じて、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制
限酵素EcoR I及びSal I並びに制限酵素
BamH I及びSal Iを添加することにより
切断し、アガロースゲル電気泳動により約4.0Kbp
及び約6.2KbpのDNA断片をそれぞれ分離精製し
た。一方、ポータブル翻訳開始部位オリゴヌクレオチド
(SD−ATGリンカーと略し、翻訳開始シグナルSD
配列及び翻訳開始コドンATGを含む塩基数21のオリ
ゴヌクレオチド:カタログNo.27−4878−01
及び27−4898−01ファルマシア・モレキュラー
・バイオロジカルズ1985 May、ファルマシア
社より入手)の上下鎖(各100ng)を、前記実施例
3の方法に準じて、その5′末端のリン酸化及びアニー
ル化に供し、二本鎖DNA断片(21bp)とした。上
記で得られた3本のDNA断片を、前記方法に準じて、
T4DNAリガーゼを用いて連結し、E.coli
K−12HB101株のコンピテントセルに導入した。 得られた形質転換体の中より、目的とするSD−ATG
リンカーがtrpプロモーターの下流かつ制限酵素Ba
mH I切断部位の直前に挿入された約10.2Kb
pのプラスミドベクター(pSK211と命名)を有す
るクローンを選択した。このプラスミドベクターは、t
rpプロモーターの下流にタンデムに並んだ2つのSD
配列を持つことになる。
101の5μgを2本のチューブにそれぞれ別々に、前
記方法に準じて、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制
限酵素EcoR I及びSal I並びに制限酵素
BamH I及びSal Iを添加することにより
切断し、アガロースゲル電気泳動により約4.0Kbp
及び約6.2KbpのDNA断片をそれぞれ分離精製し
た。一方、ポータブル翻訳開始部位オリゴヌクレオチド
(SD−ATGリンカーと略し、翻訳開始シグナルSD
配列及び翻訳開始コドンATGを含む塩基数21のオリ
ゴヌクレオチド:カタログNo.27−4878−01
及び27−4898−01ファルマシア・モレキュラー
・バイオロジカルズ1985 May、ファルマシア
社より入手)の上下鎖(各100ng)を、前記実施例
3の方法に準じて、その5′末端のリン酸化及びアニー
ル化に供し、二本鎖DNA断片(21bp)とした。上
記で得られた3本のDNA断片を、前記方法に準じて、
T4DNAリガーゼを用いて連結し、E.coli
K−12HB101株のコンピテントセルに導入した。 得られた形質転換体の中より、目的とするSD−ATG
リンカーがtrpプロモーターの下流かつ制限酵素Ba
mH I切断部位の直前に挿入された約10.2Kb
pのプラスミドベクター(pSK211と命名)を有す
るクローンを選択した。このプラスミドベクターは、t
rpプロモーターの下流にタンデムに並んだ2つのSD
配列を持つことになる。
【0098】このプラスミドベクターの制限酵素Sal
I切断部位を消失し、その近傍に制限酵素Hind
III切断部位を新生する目的で以下の操作を行っ
た。 プラスミドベクターpSK211の5μgを前記方法に
準じて、制限酵素Sal Iにて切断後、T4DNA
ポリメラーゼを用いて平滑化した。エタノール沈殿操作
により回収したDNA断片を制限酵素BamH Iで
切断し、アガロースゲル電気泳動により約4.0Kbp
のDNA断片を分離精製した。一方、tacプロモータ
ーを有するプラスミドベクターpKK223−3(ファ
ルマシア社)及びSD−ATGリンカー等を用い、前記
のpSK211を構築した方法に準じた組換えにより構
築したプラスミドベクターpGFK503−1(約5.
7Kbp)の5μgを、前記方法に準じて制限酵素Hi
nd IIIにて切断後、T4DNAポリメラーゼを
用いて平滑化した。エタノール沈殿操作により回収した
DNA断片を制限酵素BamH Iで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動により約1.1KbpのDNA断片を
分離精製した。上記で精製した2本のDNA断片を、前
記方法に準じて、T4DNAリガーゼを用いて連結し、
E.coli K−12 HB101株のコンピテ
ントセルに導入した。得られた形質転換体の中より、目
的の制限酵素Sal I切断部位を欠きHind
III切断部位を新生したtrpプロモーターを含む約
5.1Kbpのプラスミドベクター(pSK301と命
名)を有するクローンを選択した。
I切断部位を消失し、その近傍に制限酵素Hind
III切断部位を新生する目的で以下の操作を行っ
た。 プラスミドベクターpSK211の5μgを前記方法に
準じて、制限酵素Sal Iにて切断後、T4DNA
ポリメラーゼを用いて平滑化した。エタノール沈殿操作
により回収したDNA断片を制限酵素BamH Iで
切断し、アガロースゲル電気泳動により約4.0Kbp
のDNA断片を分離精製した。一方、tacプロモータ
ーを有するプラスミドベクターpKK223−3(ファ
ルマシア社)及びSD−ATGリンカー等を用い、前記
のpSK211を構築した方法に準じた組換えにより構
築したプラスミドベクターpGFK503−1(約5.
7Kbp)の5μgを、前記方法に準じて制限酵素Hi
nd IIIにて切断後、T4DNAポリメラーゼを
用いて平滑化した。エタノール沈殿操作により回収した
DNA断片を制限酵素BamH Iで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動により約1.1KbpのDNA断片を
分離精製した。上記で精製した2本のDNA断片を、前
記方法に準じて、T4DNAリガーゼを用いて連結し、
E.coli K−12 HB101株のコンピテ
ントセルに導入した。得られた形質転換体の中より、目
的の制限酵素Sal I切断部位を欠きHind
III切断部位を新生したtrpプロモーターを含む約
5.1Kbpのプラスミドベクター(pSK301と命
名)を有するクローンを選択した。
【0099】このプラスミドベクターpSK301の5
μgを、前記方法に準じて、ロウ・ソルトバッファーに
溶解し、5ユニットの制限酵素Bal I(宝酒造)
を添加して切断反応を行った。反応終了後、反応液のN
aCl濃度を50mMとして制限酵素Hind II
Iによる切断を行い、約4.3KbpのDNA断片をア
ガロースゲル電気泳動により分離精製した。一方、プラ
スミドベクターpKK223−3の5μgを、前記方法
に準じて、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素
Hind III及びSca Iで切断し、約0.
8KbpのDNA断片をアガロースゲル電気泳動により
分離精製した。上記で精製した2本のDNA断片を、前
記方法に準じて、T4DNAリガーゼを用いて連結し、
E.coli K−12HB101株のコンピテント
セルに導入した。得られた形質転換体の中より、目的と
するrrnBT1T2ターミネーターがtrpプロモー
ターの下流に配置されたプラスミドベクターpSK40
7(約5.1Kbp)を有するクローンを選択した。
μgを、前記方法に準じて、ロウ・ソルトバッファーに
溶解し、5ユニットの制限酵素Bal I(宝酒造)
を添加して切断反応を行った。反応終了後、反応液のN
aCl濃度を50mMとして制限酵素Hind II
Iによる切断を行い、約4.3KbpのDNA断片をア
ガロースゲル電気泳動により分離精製した。一方、プラ
スミドベクターpKK223−3の5μgを、前記方法
に準じて、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素
Hind III及びSca Iで切断し、約0.
8KbpのDNA断片をアガロースゲル電気泳動により
分離精製した。上記で精製した2本のDNA断片を、前
記方法に準じて、T4DNAリガーゼを用いて連結し、
E.coli K−12HB101株のコンピテント
セルに導入した。得られた形質転換体の中より、目的と
するrrnBT1T2ターミネーターがtrpプロモー
ターの下流に配置されたプラスミドベクターpSK40
7(約5.1Kbp)を有するクローンを選択した。
【0100】次に、2本のオリゴヌクレオチド(U−4
113及びL−4113)をデザインした。
113及びL−4113)をデザインした。
【0101】
U−4113(配列表の配列番号15、塩基数32)L
−4113(塩基数32) U−4113に相補するものであるが、配列番号15の
1番目〜4番目の5′−GATC−3′に相補する塩基
配列は有さず、一方配列番号15の32番目のCに相補
するGに対しその5′側に5′−TCGA−3′を付加
された塩基配列を有する。
−4113(塩基数32) U−4113に相補するものであるが、配列番号15の
1番目〜4番目の5′−GATC−3′に相補する塩基
配列は有さず、一方配列番号15の32番目のCに相補
するGに対しその5′側に5′−TCGA−3′を付加
された塩基配列を有する。
【0102】前記実施例2の方法に準じて化学合成し、
精製することにより作製し、得られたオリゴヌクレオチ
ド(各1μg)を前記実施例3の方法に準じて、その5
′末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸
化の後、アニール化により二本鎖DNA断片(32bp
)とした。また、trpプロモーター及びrrnBT1
T2ターミネーター等を有するプラスミドベクターpS
K407(約5.1Kbp)の5μgを、前記実施例3
の方法に準じて、ハイ・ソルトバッファーに溶解し制限
酵素BamH I及びHind IIIで切断し、
複製起点及び転写調節領域等を含む約4.0KbpのD
NA断片をアガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%)に
より分離精製した。一方、前記実施例7(1)で得られ
たプラスミドpUC119−F4104(約3.7Kb
p)の5μgを、実施例8の方法と同様に、制限酵素X
ho I及びHind IIIで切断し、N末端部
分を欠失したF4104遺伝子を含む約460bpのD
NA断片を分離精製した(図12)。
精製することにより作製し、得られたオリゴヌクレオチ
ド(各1μg)を前記実施例3の方法に準じて、その5
′末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸
化の後、アニール化により二本鎖DNA断片(32bp
)とした。また、trpプロモーター及びrrnBT1
T2ターミネーター等を有するプラスミドベクターpS
K407(約5.1Kbp)の5μgを、前記実施例3
の方法に準じて、ハイ・ソルトバッファーに溶解し制限
酵素BamH I及びHind IIIで切断し、
複製起点及び転写調節領域等を含む約4.0KbpのD
NA断片をアガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%)に
より分離精製した。一方、前記実施例7(1)で得られ
たプラスミドpUC119−F4104(約3.7Kb
p)の5μgを、実施例8の方法と同様に、制限酵素X
ho I及びHind IIIで切断し、N末端部
分を欠失したF4104遺伝子を含む約460bpのD
NA断片を分離精製した(図12)。
【0103】上記方法に従って得られた3本のDNA断
片を、前記実施例3の方法に準じて、T4DNAリガー
ゼを用いて連結し、E.coli K−12 HB
101株のコンピテントセルに導入した。得られた形質
転換体の中より、目的の約4.5KbpのF4113発
現ベクター(pKF4113と命名)を有するクローン
を、制限酵素BamH I、Xho I及びHin
d IIIによる切断パターンの確認並びに転換体ポ
リペプチドのN末端付加部位周辺の塩基配列を調べるこ
とにより選択した。
片を、前記実施例3の方法に準じて、T4DNAリガー
ゼを用いて連結し、E.coli K−12 HB
101株のコンピテントセルに導入した。得られた形質
転換体の中より、目的の約4.5KbpのF4113発
現ベクター(pKF4113と命名)を有するクローン
を、制限酵素BamH I、Xho I及びHin
d IIIによる切断パターンの確認並びに転換体ポ
リペプチドのN末端付加部位周辺の塩基配列を調べるこ
とにより選択した。
【0104】上記方法に従って構築した転換体発現ベク
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。ベクター
pKF4113:配列番号1で示したアミノ酸配列にお
いて、1番目〜8番目のアミノ酸配列が配列番号10で
示したアミノ酸配列で置換されたポリペプチドF411
3をコードする。
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。ベクター
pKF4113:配列番号1で示したアミノ酸配列にお
いて、1番目〜8番目のアミノ酸配列が配列番号10で
示したアミノ酸配列で置換されたポリペプチドF411
3をコードする。
【0105】実施例11(ヒトTNF及び同転換体ポリ
ペプチドの大腸菌による発現及び精製)実施例4で得ら
れたヒトTNF発現ベクター(pKF4102)及び実
施例5、6、7、8及び9で得られたヒトTNF転換体
発現ベクター(pKF4168、pKF4415、pK
F4416、pKF4417、pKF4418、pKF
4420、pKF4421、pKF4137及びpKF
4601)を有するE.coli K−12JM10
3株を、25〜50μg/mlアンピシリン及び0.0
01%ビタミンB1を含むM9培地(0.6% Na
2HPO4、0.3%KH2PO4、0.05% N
aCl、0.1% NH4Cl、2mM MgSO
4、0.2%グルコース及び0.1mM CaCl
2)20mlに接種し、37℃、18時間振とう培養
を行った。この培養液20mlを上記培地1リットル中
に加え、37℃、2〜3時間振とう培養を行った。次い
で、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(
IPTG)を最終濃度1mMとなるように添加し、更に
37℃、18時間振とう培養を続けた。
ペプチドの大腸菌による発現及び精製)実施例4で得ら
れたヒトTNF発現ベクター(pKF4102)及び実
施例5、6、7、8及び9で得られたヒトTNF転換体
発現ベクター(pKF4168、pKF4415、pK
F4416、pKF4417、pKF4418、pKF
4420、pKF4421、pKF4137及びpKF
4601)を有するE.coli K−12JM10
3株を、25〜50μg/mlアンピシリン及び0.0
01%ビタミンB1を含むM9培地(0.6% Na
2HPO4、0.3%KH2PO4、0.05% N
aCl、0.1% NH4Cl、2mM MgSO
4、0.2%グルコース及び0.1mM CaCl
2)20mlに接種し、37℃、18時間振とう培養
を行った。この培養液20mlを上記培地1リットル中
に加え、37℃、2〜3時間振とう培養を行った。次い
で、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(
IPTG)を最終濃度1mMとなるように添加し、更に
37℃、18時間振とう培養を続けた。
【0106】実施例10で得られたヒトTNF転換体発
現ベクター(pKF4113)を有するE.coli
K−12HB101株については、25〜50μg/
mlアンピシリン、0.001%ビタミンB1及び5μ
g/mlトリプトファンを含むM9CA培地(0.6%
Na2HPO4、0.3% KH2PO4、0.
05%NaCl、0.1% NH4CI、2mM
MgS04、0.2%グルコース及び0.1mM C
aCl2及び0.2%カザミノ酸)20mlに接種し、
37℃、18時間振とう培養を行った。5μg/mlト
リプトファンを含まない上記培地1リットル中にこの培
養液20mlを加え、37℃、18時間振とう培養を行
った。
現ベクター(pKF4113)を有するE.coli
K−12HB101株については、25〜50μg/
mlアンピシリン、0.001%ビタミンB1及び5μ
g/mlトリプトファンを含むM9CA培地(0.6%
Na2HPO4、0.3% KH2PO4、0.
05%NaCl、0.1% NH4CI、2mM
MgS04、0.2%グルコース及び0.1mM C
aCl2及び0.2%カザミノ酸)20mlに接種し、
37℃、18時間振とう培養を行った。5μg/mlト
リプトファンを含まない上記培地1リットル中にこの培
養液20mlを加え、37℃、18時間振とう培養を行
った。
【0107】遠心分離操作による大腸菌菌体の回収後、
TPバッファー(10mMトリス−HCl pH8.
0及び100μM PMSF)を用いて菌体の洗浄を
行った。洗浄後、菌体グラム当たり10容量(ml)の
TPバッファーに菌体を懸濁させ、超音波発生装置(ヒ
ート・システムズ;モデルW−225)を用いて菌体を
超音波破砕処理した。得られた懸濁液を遠心分離するこ
とにより、菌体残渣を除去し上清画分を回収した。この
超音波破砕処理以降の精製工程は、主に低温下(0℃〜
4℃)で行った。
TPバッファー(10mMトリス−HCl pH8.
0及び100μM PMSF)を用いて菌体の洗浄を
行った。洗浄後、菌体グラム当たり10容量(ml)の
TPバッファーに菌体を懸濁させ、超音波発生装置(ヒ
ート・システムズ;モデルW−225)を用いて菌体を
超音波破砕処理した。得られた懸濁液を遠心分離するこ
とにより、菌体残渣を除去し上清画分を回収した。この
超音波破砕処理以降の精製工程は、主に低温下(0℃〜
4℃)で行った。
【0108】この上清を0.45μmフィルターにてろ
過した後、セパビーズFP−DA13(三菱化成)を用
いた陰イオン交換クロマトグラフィー(カラムサイズ:
φ2.5×1.5cm及び流速:0.5ml/分)で分
画し、後記SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及
びL929細胞を用いた後記実施例12の方法に準じて
活性の有無を検定することによって活性画分を得た。溶
出にはNaClを含むTPバッファーを用い、NaCl
濃度を0.05Mから0.1M、0.2M、0.5Mへ
と段階的に上げ、ヒトTNF(1)は0.1M Na
Clで、ヒトTNF(2)、ヒトTNF転換体F441
5、同F4417、同F4418、同F4420及び同
F4601は0.2M NaClで並びにヒトTNF
転換体F4168は0.5MNaClでそれぞれ溶出し
た。更に大腸菌菌体由来のエンドトキシン等を除去する
ために、核酸・エンドトキシン除去剤C−9(栗田工業
製造、大日本製薬販売)処理を添付マニュアルに準じて
行った。かくして、ヒトTNF及び同転換体ポリペプチ
ドの一段階精製試料を得た。
過した後、セパビーズFP−DA13(三菱化成)を用
いた陰イオン交換クロマトグラフィー(カラムサイズ:
φ2.5×1.5cm及び流速:0.5ml/分)で分
画し、後記SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及
びL929細胞を用いた後記実施例12の方法に準じて
活性の有無を検定することによって活性画分を得た。溶
出にはNaClを含むTPバッファーを用い、NaCl
濃度を0.05Mから0.1M、0.2M、0.5Mへ
と段階的に上げ、ヒトTNF(1)は0.1M Na
Clで、ヒトTNF(2)、ヒトTNF転換体F441
5、同F4417、同F4418、同F4420及び同
F4601は0.2M NaClで並びにヒトTNF
転換体F4168は0.5MNaClでそれぞれ溶出し
た。更に大腸菌菌体由来のエンドトキシン等を除去する
ために、核酸・エンドトキシン除去剤C−9(栗田工業
製造、大日本製薬販売)処理を添付マニュアルに準じて
行った。かくして、ヒトTNF及び同転換体ポリペプチ
ドの一段階精製試料を得た。
【0109】この試料を使用して、後記実施例12、1
3及び14の抗腫瘍活性の評価及び実験的肺転移に及ぼ
す効果の評価を行った。なお、転換体ポリペプチドF4
416、F4421及びF4137については使用した
宿主大腸菌E.coli K−12 JM103
株中並びにF4113については使用した宿主大腸菌
E.coli K−12 HB101 株中での
不安定性のためか、活性画分を得ることができなかった
。しかしながら他の宿主を使用すれば活性画分を得られ
る可能性がある。
3及び14の抗腫瘍活性の評価及び実験的肺転移に及ぼ
す効果の評価を行った。なお、転換体ポリペプチドF4
416、F4421及びF4137については使用した
宿主大腸菌E.coli K−12 JM103
株中並びにF4113については使用した宿主大腸菌
E.coli K−12 HB101 株中での
不安定性のためか、活性画分を得ることができなかった
。しかしながら他の宿主を使用すれば活性画分を得られ
る可能性がある。
【0110】上記試料を0.20μmフィルターにてろ
過した後、FPLCシステムによる制御下のモノQ(登
録商標)(HR10/10及びHR5/5)プレパック
カラム(ファルマシアLKBバイオテクノロジー社製)
を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーで、NaCl
を含むTPQバッファー(20mMトリス−HClpH
8.0及び10μM PMSF)によって溶出し、分
画を後記SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び
L929細胞を用いた実施例12の方法に準じて活性の
有無を検定することによって活性画分を得た。溶出方法
は、FPLCシステムの制御下で下記プログラムに従っ
て行った。第3ステップは、精製純度を上げるためにS
DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一バ
ンドとなるまで数回繰り返した。
過した後、FPLCシステムによる制御下のモノQ(登
録商標)(HR10/10及びHR5/5)プレパック
カラム(ファルマシアLKBバイオテクノロジー社製)
を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーで、NaCl
を含むTPQバッファー(20mMトリス−HClpH
8.0及び10μM PMSF)によって溶出し、分
画を後記SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び
L929細胞を用いた実施例12の方法に準じて活性の
有無を検定することによって活性画分を得た。溶出方法
は、FPLCシステムの制御下で下記プログラムに従っ
て行った。第3ステップは、精製純度を上げるためにS
DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一バ
ンドとなるまで数回繰り返した。
【0111】
第1ステップ:モノQ(登録商標)(HR10/10)
カラム使用 (流速:4ml/分) 0〜5分;0−0.2M NaCl 直線濃度勾配
5〜16分;0.2M NaCl 16〜20分;0.2−0.5M NaCl 直線
濃度勾配 20〜24分;0.5M NaCl 上記方法に従った活性画分の分画結果(NaCl濃度及
び保持時間)は、ヒトTNF(1)が0.2M、6.6
分、ヒトTNF(2)が0.2M、5.6分、ヒトTN
F転換体F4168が0.2M、6.4分、同F441
5が0.2M、7.8分、同F4417が0.2M、5
.4分、同F4418が0.2M、5.4分、同F44
20が0.18M、4.1分及び同F4601が0.2
M、7.0分であった。
カラム使用 (流速:4ml/分) 0〜5分;0−0.2M NaCl 直線濃度勾配
5〜16分;0.2M NaCl 16〜20分;0.2−0.5M NaCl 直線
濃度勾配 20〜24分;0.5M NaCl 上記方法に従った活性画分の分画結果(NaCl濃度及
び保持時間)は、ヒトTNF(1)が0.2M、6.6
分、ヒトTNF(2)が0.2M、5.6分、ヒトTN
F転換体F4168が0.2M、6.4分、同F441
5が0.2M、7.8分、同F4417が0.2M、5
.4分、同F4418が0.2M、5.4分、同F44
20が0.18M、4.1分及び同F4601が0.2
M、7.0分であった。
【0112】
第2ステップ:モノQ(登録商標)(HR 5/5)
カラム使用 (流速:1ml/分) 0〜2.5分;0−0.2M NaCl 直線濃度
勾配2.5〜8分;0.2M NaCl 8〜10分;0.2−0.5M NaCl 直線濃
度勾配 10〜12分;0.5M NaCl 上記方法に従った活性画分の分画結果(NaCl濃度及
び保持時間)は、ヒトTNF(1)が0.2M、3.7
分、ヒトTNF(2)が0.2M、4.1分、ヒトTN
F転換体F4168が0.2M、3.9分、同F441
5が0.2M、6.0分、同F4417が0.2M、3
.9分、同F4418が0.2M、3.3分、同F44
20が0.2M、3.2分及び同F4601が0.2M
、4.9分であった。
カラム使用 (流速:1ml/分) 0〜2.5分;0−0.2M NaCl 直線濃度
勾配2.5〜8分;0.2M NaCl 8〜10分;0.2−0.5M NaCl 直線濃
度勾配 10〜12分;0.5M NaCl 上記方法に従った活性画分の分画結果(NaCl濃度及
び保持時間)は、ヒトTNF(1)が0.2M、3.7
分、ヒトTNF(2)が0.2M、4.1分、ヒトTN
F転換体F4168が0.2M、3.9分、同F441
5が0.2M、6.0分、同F4417が0.2M、3
.9分、同F4418が0.2M、3.3分、同F44
20が0.2M、3.2分及び同F4601が0.2M
、4.9分であった。
【0113】
第3ステップ:モノQ(登録商標)(HR5/5)カラ
ム使用 (流速:1ml/分) 0〜6分;0−0.15M NaCl直線濃度勾配6
〜11分;0.15−0.2M NaCl 直線濃
度勾配 11〜13分;0.2−0.5M NaCl 直線
濃度勾配 13〜15分;0.5M NaCl 上記方法に従った活性画分の分画結果(NaCl濃度及
び保持時間)は、ヒトTNF(1)が0.16M、6.
5分、ヒトTNF(2)が0.16M、6.5分、ヒト
TNF転換体F4168が0.17M、6.7分、同F
4415が0.16M、6.4分、同F4417が0.
16M、6.5分、同F4418が0.16M、6.2
分、同F4420が0.15M、5.6分及び同F46
01が0.19M、9.8分であった。
ム使用 (流速:1ml/分) 0〜6分;0−0.15M NaCl直線濃度勾配6
〜11分;0.15−0.2M NaCl 直線濃
度勾配 11〜13分;0.2−0.5M NaCl 直線
濃度勾配 13〜15分;0.5M NaCl 上記方法に従った活性画分の分画結果(NaCl濃度及
び保持時間)は、ヒトTNF(1)が0.16M、6.
5分、ヒトTNF(2)が0.16M、6.5分、ヒト
TNF転換体F4168が0.17M、6.7分、同F
4415が0.16M、6.4分、同F4417が0.
16M、6.5分、同F4418が0.16M、6.2
分、同F4420が0.15M、5.6分及び同F46
01が0.19M、9.8分であった。
【0114】かくしてヒトTNF及び同転換体ポリペプ
チドの精製試料を得た。この試料を使用して後記実施例
12の抗腫瘍活性の評価を行った。
チドの精製試料を得た。この試料を使用して後記実施例
12の抗腫瘍活性の評価を行った。
【0115】上記精製の過程及び精製試料についてSD
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ヒトTN
F及び同転換体ポリペプチドの発現及び精製の確認をし
た。各試料を10mM DTTを含有するLaemm
li’s サンプル・バッファー(62.5mMトリ
ス−HCl pH 6.8、2%SDS、0.01
%BPB及び10%グリセロール)に加え、Laemm
li〔Nature,227,680(1970)〕の
方法に準じ、15%の分離用ゲルを用いて電気泳動を行
った。電気泳動終了後、分離用ゲル中の蛋白質をクマシ
ー・ブリリアント・ブルーで染色することにより確認し
た。図13及び14にその結果の一部を示した。活性画
分を得ることのできたヒトTNF及び同転換体ポリペプ
チドのそれぞれの発現ベクターによる発現量はほぼ同程
度であり、得られた染色ゲルをクロマト・スキャナー(
島津、CS−920型)にかけてその発現効率を算出し
たところ、大腸菌総菌体蛋白質の約20%であった。ま
た、最終精製試料は、得られた染色ゲルにおいて単一バ
ンドであった。その泳動位置より、ヒトTNF及び同転
換体ポリペプチドの分子量を算出し表1に示した。
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ヒトTN
F及び同転換体ポリペプチドの発現及び精製の確認をし
た。各試料を10mM DTTを含有するLaemm
li’s サンプル・バッファー(62.5mMトリ
ス−HCl pH 6.8、2%SDS、0.01
%BPB及び10%グリセロール)に加え、Laemm
li〔Nature,227,680(1970)〕の
方法に準じ、15%の分離用ゲルを用いて電気泳動を行
った。電気泳動終了後、分離用ゲル中の蛋白質をクマシ
ー・ブリリアント・ブルーで染色することにより確認し
た。図13及び14にその結果の一部を示した。活性画
分を得ることのできたヒトTNF及び同転換体ポリペプ
チドのそれぞれの発現ベクターによる発現量はほぼ同程
度であり、得られた染色ゲルをクロマト・スキャナー(
島津、CS−920型)にかけてその発現効率を算出し
たところ、大腸菌総菌体蛋白質の約20%であった。ま
た、最終精製試料は、得られた染色ゲルにおいて単一バ
ンドであった。その泳動位置より、ヒトTNF及び同転
換体ポリペプチドの分子量を算出し表1に示した。
【0116】なお、蛋白質の物性の一つとして、ヒトT
NF及び同転換体ポリペプチドの等電点をアンフォライ
ン(LKB社製)を用いた等電点ゲル電気泳動法により
測定し、得られた結果を表1に示した。
NF及び同転換体ポリペプチドの等電点をアンフォライ
ン(LKB社製)を用いた等電点ゲル電気泳動法により
測定し、得られた結果を表1に示した。
【0117】
【表1】
【0118】
実施例12(in vitro抗腫瘍活性の評価)実
施例11で得られたヒトTNF及び同転換体ポリペプチ
ドの一段階精製試料及び精製試料について、マウス由来
結合組織細胞L929(ATCC CCL1)に対す
る細胞傷害活性をAggarwalら〔J.Biol.
chem.,260, 2345(1985)〕の方
法に準じて求めた。すなわち、96ウエルの組織培養用
のマイクロプレート(コーニング社製)に3×104細
胞/0.1ml/ウエルでL929細胞を植え、5%炭
酸ガス存在下37℃で一晩培養した。培地としては、1
0%のウシ胎児血清を含むDulbeccoによって修
飾されたイーグルのミニマム・エッセンシャル培地(D
ME培地、シグマ社製)を用いた。翌日、最終濃度1μ
g/mlのアクチノマイシンDを添加した上記培地に培
地を交換し、この培地にて段階希釈した試料を各ウエル
に処理した(総培地量0.1ml)。更に20時間の培
養後、0.5%クリスタル・バイオレット溶液(0.5
%クリスタル・バイオレット/20%メタノール)にて
プレートに付着した生細胞を染色(室温、15分間)し
た。1mM CaCl2及び1mM MgCl2を
含むリン酸バッファーPBS(10mM Na・Kリ
ン酸塩pH7.4、0.8%NaCl及び 0.02
%KCl)で充分洗浄した後、30%エタノールを含む
0.01N塩酸溶液0.1mlを用いてプレートに残っ
たクリスタル・バイオレットを抽出し、その吸光度(4
92nm)をEIAリーダー(バイオ・ラド社製、モデ
ル2550)で測定した。この吸光度は生存細胞数に比
例する。そこで、試料無処理ウエルの吸光度の50%の
値に相当する吸光度を示すウエルにおける試料の最終希
釈率を求め、この試料希釈率の逆数をその試料の1ml
当りのユニット数〔ユニット/ml〕と定義する。
施例11で得られたヒトTNF及び同転換体ポリペプチ
ドの一段階精製試料及び精製試料について、マウス由来
結合組織細胞L929(ATCC CCL1)に対す
る細胞傷害活性をAggarwalら〔J.Biol.
chem.,260, 2345(1985)〕の方
法に準じて求めた。すなわち、96ウエルの組織培養用
のマイクロプレート(コーニング社製)に3×104細
胞/0.1ml/ウエルでL929細胞を植え、5%炭
酸ガス存在下37℃で一晩培養した。培地としては、1
0%のウシ胎児血清を含むDulbeccoによって修
飾されたイーグルのミニマム・エッセンシャル培地(D
ME培地、シグマ社製)を用いた。翌日、最終濃度1μ
g/mlのアクチノマイシンDを添加した上記培地に培
地を交換し、この培地にて段階希釈した試料を各ウエル
に処理した(総培地量0.1ml)。更に20時間の培
養後、0.5%クリスタル・バイオレット溶液(0.5
%クリスタル・バイオレット/20%メタノール)にて
プレートに付着した生細胞を染色(室温、15分間)し
た。1mM CaCl2及び1mM MgCl2を
含むリン酸バッファーPBS(10mM Na・Kリ
ン酸塩pH7.4、0.8%NaCl及び 0.02
%KCl)で充分洗浄した後、30%エタノールを含む
0.01N塩酸溶液0.1mlを用いてプレートに残っ
たクリスタル・バイオレットを抽出し、その吸光度(4
92nm)をEIAリーダー(バイオ・ラド社製、モデ
ル2550)で測定した。この吸光度は生存細胞数に比
例する。そこで、試料無処理ウエルの吸光度の50%の
値に相当する吸光度を示すウエルにおける試料の最終希
釈率を求め、この試料希釈率の逆数をその試料の1ml
当りのユニット数〔ユニット/ml〕と定義する。
【0119】上記方法に準じて求めたL929細胞傷害
活性(ユニット/ml)から各試料の比活性(ユニット
/mg・蛋白)を算出するために、各試料の蛋白定量を
行った。定量はBradford法〔Anal.Bio
chem.,72,248(1976)〕に準じ、標準
試料としてウシ血清アルブミンを用いて蛋白濃度(mg
/ml)を求めた。これらの結果より、ヒトTNF及び
同転換体ポリペプチド試料について算出した比活性を表
2に示した。
活性(ユニット/ml)から各試料の比活性(ユニット
/mg・蛋白)を算出するために、各試料の蛋白定量を
行った。定量はBradford法〔Anal.Bio
chem.,72,248(1976)〕に準じ、標準
試料としてウシ血清アルブミンを用いて蛋白濃度(mg
/ml)を求めた。これらの結果より、ヒトTNF及び
同転換体ポリペプチド試料について算出した比活性を表
2に示した。
【0120】
【表2】
【0121】上記表2から、本発明のヒトTNF転換体
ポリペプチドは、ヒトTNFと同様、マウス由来結合組
織細胞L929に対する細胞傷害活性作用を有すること
がわかる。
ポリペプチドは、ヒトTNFと同様、マウス由来結合組
織細胞L929に対する細胞傷害活性作用を有すること
がわかる。
【0122】
実施例13(in vivo 抗腫瘍活性の評価)
実施例11で得られたヒトTNF及び同転換体ポリペプ
チドの一段階精製試料について、マウス可移植線維芽肉
腫MethA腫瘍に対する抗腫瘍治療活性を求めた。試
験は、生理食塩水に懸濁した1×106細胞/0.2m
lのMethA腫瘍細胞(佐々木研究所より分与)をB
ALB/cマウス(雄、5週令、チャールズ・リバー)
の背中部皮下に移植し、8日後腫瘍径が6〜10mmに
達したのを確認し、生理食塩水にて段階希釈した試料(
0.2ml/マウス)を尾静脈より投与することにより
行った。致死量を最高投与量とし、数段階の希釈により
各投与試料を作製した。
実施例11で得られたヒトTNF及び同転換体ポリペプ
チドの一段階精製試料について、マウス可移植線維芽肉
腫MethA腫瘍に対する抗腫瘍治療活性を求めた。試
験は、生理食塩水に懸濁した1×106細胞/0.2m
lのMethA腫瘍細胞(佐々木研究所より分与)をB
ALB/cマウス(雄、5週令、チャールズ・リバー)
の背中部皮下に移植し、8日後腫瘍径が6〜10mmに
達したのを確認し、生理食塩水にて段階希釈した試料(
0.2ml/マウス)を尾静脈より投与することにより
行った。致死量を最高投与量とし、数段階の希釈により
各投与試料を作製した。
【0123】投与後約2週間、腫瘍増殖等の観察を続け
た。腫瘍増殖については、腫瘍容積(腫瘍塊の長径×短
径2/2)を計測し、試料投与日(0日)の腫瘍容積に
対する腫瘍容積率を求め、この値が2又は5となる試料
投与日からの日数(D2又はD5)を算定する。そして
、コントロール群(生理食塩水投与)に対する比率を算
出し、D2%コントロール値及びD5%コントロール値
を求めた。その値が大きい程、腫瘍増殖能が低下してお
り高い抗腫瘍活性を示すことを意味する。上記に準じて
得られた結果を表3及び表4に掲載した。
た。腫瘍増殖については、腫瘍容積(腫瘍塊の長径×短
径2/2)を計測し、試料投与日(0日)の腫瘍容積に
対する腫瘍容積率を求め、この値が2又は5となる試料
投与日からの日数(D2又はD5)を算定する。そして
、コントロール群(生理食塩水投与)に対する比率を算
出し、D2%コントロール値及びD5%コントロール値
を求めた。その値が大きい程、腫瘍増殖能が低下してお
り高い抗腫瘍活性を示すことを意味する。上記に準じて
得られた結果を表3及び表4に掲載した。
【0124】
【表3】
【0125】
【表4】
【0126】表3及び表4から、本発明のヒトTNF転
換体ポリペプチドは、ヒトTNFと同様、マウスに移植
のMethA腫瘍に対する抗腫瘍治療活性作用を有する
ことがわかる。
換体ポリペプチドは、ヒトTNFと同様、マウスに移植
のMethA腫瘍に対する抗腫瘍治療活性作用を有する
ことがわかる。
【0127】実施例14(腫瘍の肺転移に及ぼす効果)
B16F10マウス悪性黒色腫細胞(千葉大 医学部
より分与)を以下の方法でクローン化することにより、
肺に対して高転移性を示すクローンを樹立した。すなわ
ち、イーグルのミニマム・エッセンシャル培地(MEM
培地、日水製薬社製)に懸濁した2×104細胞/0.
2mlのB16F10細胞をC57BL/6 NCr
jマウス(雌、6週令、チャールズ・リバー)の尾静脈
内に注入し、14日後に肺を摘出した。DME培地で洗
浄後、肺表面に形成された直径1mm程度の転移結節の
1つを26G注射針付シリンジ(テルモ社製)を用いて
吸引し、1mlのDME培地に懸濁した後、10%のウ
シ胎児血清を含むDME培地含有軟寒天上で、5%炭酸
ガス存在下37℃で培養することによりコロニー形成を
行った。このコロニー形成法は、「組織培養の技術」(
ページ35〜36、1984年、日本組織培養学会編、
朝倉書店)記載の方法に準じた。10〜12日後、コロ
ニーの径が1〜2mmに達したところでパスツールピペ
ットを用いてコロニーを吸引し、10%のウシ胎児血清
を含むDME培地中にて培養した。培養後、増殖した細
胞を再びMEM培地を用いて2×104細胞/0.2m
lの細胞濃度に調製し、上記の場合と同様、同マウスの
尾静脈内に注入した。14日後に肺を摘出し、前回と同
様にして、転移結節の1つを単離・培養した。このよう
な操作を5回繰り返し、肺に高転移性を示すクローン(
B16F10/L5と命名)を獲得した。
B16F10マウス悪性黒色腫細胞(千葉大 医学部
より分与)を以下の方法でクローン化することにより、
肺に対して高転移性を示すクローンを樹立した。すなわ
ち、イーグルのミニマム・エッセンシャル培地(MEM
培地、日水製薬社製)に懸濁した2×104細胞/0.
2mlのB16F10細胞をC57BL/6 NCr
jマウス(雌、6週令、チャールズ・リバー)の尾静脈
内に注入し、14日後に肺を摘出した。DME培地で洗
浄後、肺表面に形成された直径1mm程度の転移結節の
1つを26G注射針付シリンジ(テルモ社製)を用いて
吸引し、1mlのDME培地に懸濁した後、10%のウ
シ胎児血清を含むDME培地含有軟寒天上で、5%炭酸
ガス存在下37℃で培養することによりコロニー形成を
行った。このコロニー形成法は、「組織培養の技術」(
ページ35〜36、1984年、日本組織培養学会編、
朝倉書店)記載の方法に準じた。10〜12日後、コロ
ニーの径が1〜2mmに達したところでパスツールピペ
ットを用いてコロニーを吸引し、10%のウシ胎児血清
を含むDME培地中にて培養した。培養後、増殖した細
胞を再びMEM培地を用いて2×104細胞/0.2m
lの細胞濃度に調製し、上記の場合と同様、同マウスの
尾静脈内に注入した。14日後に肺を摘出し、前回と同
様にして、転移結節の1つを単離・培養した。このよう
な操作を5回繰り返し、肺に高転移性を示すクローン(
B16F10/L5と命名)を獲得した。
【0128】10%のウシ胎児血清を含むDME培地中
で直径10cmの組織培養用ディッシュ〔コーニング(
登録商標)岩城硝子社製〕を用いて培養した対数増殖期
のB16F10/L5細胞を、ディッシュ付着状態でリ
ン酸バッファーPBSを用いて1回洗浄し、MEM培地
5mlを加えピペッティングを行うことにより細胞懸濁
液とした。遠心分離操作により細胞を集め、2mlのM
EM培地に再懸濁した。一方、実施例11で得られたヒ
トTNF及び同転換体ポリペプチドの一段階精製試料を
、所定の濃度(実施例13の抗腫瘍治療試験において、
治療効果を示した投与量を本試験の投与量として使用し
た。)になるようにMEM培地で希釈し、その溶液中に
先に調製したB16F10/L5細胞懸濁液を添加する
ことにより、2×104細胞/0.2mlの各一段階精
製試料を含む細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を
C57BL/6NCrjマウス(雌、6週令)の尾静脈
より投与した(0.2ml/マウス)。コントロール群
はB16F10/L5細胞のみを投与した。投与14日
後に肺を摘出し、肺表面の転移結節数を計測した。 上記に準じて得られた結果を表5及び表6に掲載した。
で直径10cmの組織培養用ディッシュ〔コーニング(
登録商標)岩城硝子社製〕を用いて培養した対数増殖期
のB16F10/L5細胞を、ディッシュ付着状態でリ
ン酸バッファーPBSを用いて1回洗浄し、MEM培地
5mlを加えピペッティングを行うことにより細胞懸濁
液とした。遠心分離操作により細胞を集め、2mlのM
EM培地に再懸濁した。一方、実施例11で得られたヒ
トTNF及び同転換体ポリペプチドの一段階精製試料を
、所定の濃度(実施例13の抗腫瘍治療試験において、
治療効果を示した投与量を本試験の投与量として使用し
た。)になるようにMEM培地で希釈し、その溶液中に
先に調製したB16F10/L5細胞懸濁液を添加する
ことにより、2×104細胞/0.2mlの各一段階精
製試料を含む細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を
C57BL/6NCrjマウス(雌、6週令)の尾静脈
より投与した(0.2ml/マウス)。コントロール群
はB16F10/L5細胞のみを投与した。投与14日
後に肺を摘出し、肺表面の転移結節数を計測した。 上記に準じて得られた結果を表5及び表6に掲載した。
【0129】
【表5】
【0130】
【表6】
【0131】表5及び表6から、ヒトTNF及び同変換
体ポリペプチドが実験的肺転移を亢進する作用を有する
のに対し、そのN末端近傍にArg−Gly−Asp配
列を導入した本発明のヒトTNF転換体ポリペプチドは
実験的肺転移を亢進しないことがわかる。
体ポリペプチドが実験的肺転移を亢進する作用を有する
のに対し、そのN末端近傍にArg−Gly−Asp配
列を導入した本発明のヒトTNF転換体ポリペプチドは
実験的肺転移を亢進しないことがわかる。
【0132】
【発明の効果】本発明によれば、ヒトTNF又はその変
換体において、配列表の配列番号1の1番目のSerか
ら8番目のASPまでのアミノ酸配列あるいはそれに対
応するヒトTNF変換体のアミノ酸配列がArg−Gl
y−Asp配列を少なくとも1個含み、かつ、3個〜1
6個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されるこ
とにより、ヒトTNF又はその変換体と同様の抗腫瘍活
性作用を有し、一方それらで認められた癌転移の充進作
用を示さない新規なヒトTNF転換体が提供される。
換体において、配列表の配列番号1の1番目のSerか
ら8番目のASPまでのアミノ酸配列あるいはそれに対
応するヒトTNF変換体のアミノ酸配列がArg−Gl
y−Asp配列を少なくとも1個含み、かつ、3個〜1
6個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されるこ
とにより、ヒトTNF又はその変換体と同様の抗腫瘍活
性作用を有し、一方それらで認められた癌転移の充進作
用を示さない新規なヒトTNF転換体が提供される。
【配列表】配列番号 :1
配列の長さ:155
配列の型 :アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配 列
配列番号 :2
配列の長さ:8
配列の型 :アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配 列
配列番号 :3
配列の長さ:8
配列の型 :アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配 列
配列番号 :4
配列の長さ:11
配列の型 :アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配 列
配列番号 :5
配列の長さ:11
配列の型 :アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配 列
配列番号 :6
配列の長さ:11
配列の型 :アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配 列
配列番号 :7
配列の長さ:3
配列の型 :アミノ酸
トポロジー:直鎖伏
配列の種類:ペプチド
配 列
配列番号 :8
配列の長さ:14
配列の型 :アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配 列
配列番号 :9
配列の長さ:14
配列の型 :アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配 列
配列番号 :10
配列の長さ:16
配列の型 :アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配 列
配列番号 :11
配列の長さ:465
配列の型 :核 酸
鎖の数 :一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸合成DNA
配 列
配列番号 :12
配列の長さ:46
配列の型 :核酸
鎖の数 :1本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA
配 列
配列番号 :13
配列の長さ:34
配列の型 :核酸
鎖の数 :1本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA
配 列
配列番号 :14
配列の長さ:34
配列の型 :核酸
鎖の数 :1本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA
配 列
配列番号 :15
配列の長さ:32
配列の型 :核酸
鎖の数 :1本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA
配 列
【図1】合成オリゴヌクレオチドの連結によるヒトTN
F遺伝子の構築過程を示す工程図である。
F遺伝子の構築過程を示す工程図である。
【図2】合成オリゴヌクレオチドの連結によるヒトTN
F遺伝子の構築過程を示す工程図である。
F遺伝子の構築過程を示す工程図である。
【図3】ヒトTNF発現型プラスミドベクターの構築過
程を示す工程図である。
程を示す工程図である。
【図4】ヒトTNF発現ベクターの構築過程を示す工程
図である。
図である。
【図5】部位特異的変異法によるヒトTNF変換体又は
同転換体遺伝子の作製過程を示す工程図である。
同転換体遺伝子の作製過程を示す工程図である。
【図6】部位特異的変異法によるヒトTNF変換体又は
同転換体遺伝子の作製過程を示す工程図である。
同転換体遺伝子の作製過程を示す工程図である。
【図7】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えによ
るヒトTNF転換体発現ベクターの構築過程を示す工程
図である。
るヒトTNF転換体発現ベクターの構築過程を示す工程
図である。
【図8】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えによ
るヒトTNF転換体発現ベクターの構築過程を示す工程
図である。
るヒトTNF転換体発現ベクターの構築過程を示す工程
図である。
【図9】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えによ
るヒトTNF転換体発現型プラスミドベクターの構築過
程を示す工程図である。
るヒトTNF転換体発現型プラスミドベクターの構築過
程を示す工程図である。
【図10】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えに
よるヒトTNF転換体発現型プラスミドベクターの構築
過程を示す工程図である。
よるヒトTNF転換体発現型プラスミドベクターの構築
過程を示す工程図である。
【図11】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えに
よるヒトTNF転換体発現型プラスミドベクターの構築
過程を示す工程図である。
よるヒトTNF転換体発現型プラスミドベクターの構築
過程を示す工程図である。
【図12】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えに
よるヒトTNF転換体発現ベクターの構築過程を示す工
程図である。
よるヒトTNF転換体発現ベクターの構築過程を示す工
程図である。
【図13】大腸菌により発現されたヒトTNF及び同転
換体ポリペプチドの精製試料の電気泳動結果を示す図で
ある。
換体ポリペプチドの精製試料の電気泳動結果を示す図で
ある。
【図14】大腸菌により発現されたヒトTNF転換体ポ
リペプチドの精製試料の電気泳動結果を示す図である。
リペプチドの精製試料の電気泳動結果を示す図である。
Claims (17)
- 【請求項1】 配列表の配列番号1で示した1番目の
Serから155番目のLeuまでで表わされるアミノ
酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換
体において、前記配列番号1の1番目のSerから8番
目のAspまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する
前記変換体のアミノ酸配列がArg−Gly−Aspの
アミノ酸配列を少なくとも1個含み、かつ、3個〜16
個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されている
ことを特徴とするポリペプチド。 - 【請求項2】 前記Arg−Gly−Aspのアミノ
酸配列を少なくとも1個含み、かつ、3個〜16個のア
ミノ酸を含むアミノ酸配列が配列表の配列番号2、3、
4、5、6、7、8、9又は10で示したアミノ酸配列
である請求項1記載のポリペプチド。 - 【請求項3】 前記Arg−Gly−Aspのアミノ
酸配列を少なくとも1個含み、かつ、3個〜16個のア
ミノ酸を含むアミノ酸配列が配列表の配列番号2、3、
5、6又は7である請求項1記載のポリペプチド。 - 【請求項4】 前記腫瘍壊死因子ポリペプチド又はそ
の変換体が、配列表の配列番号1で示した9番目のLy
sから155番目のLeuまでで表わされるアミノ酸配
列あるいは当該アミノ酸配列の68番目のProが他の
アミノ酸により置換されたアミノ酸配列を有する請求項
1又は2記載のポリペプチド。 - 【請求項5】 前記他のアミノ酸がAsp又はMet
である請求項4記載のポリペプチド。 - 【請求項6】 配列表の配列番号1で示した1番目の
Serから155番目のLeuまでで表わされるアミノ
酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換
体において、前記配列番号1の1番目のSerから8番
目のAspまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する
前記変換体のアミノ酸配列がArg−Gly−Aspの
アミノ酸配列を少なくとも1個含み、かつ、3個〜16
個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されている
ポリペプチドをコードするDNAを含むことを特徴とす
る組換えプラスミド。 - 【請求項7】 前記組換えプラスミドがpKF416
8、pKF4415、pKF4416、pKF4417
、pKF4418、pKF4420、pKF4421、
pKF4113、pKF4137、pKF4601又は
pKF4602である請求項6記載の組換えプラスミド
。 - 【請求項8】 配列表の配列番号1で示した1番目の
Serから155番目のLeuまでで表わされるアミノ
酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換
体において、前記配列番号1の1番目のSerから8番
目のAspまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する
前記変換体のアミノ酸配列がArg−Gly−Aspの
アミノ酸配列を少なくとも1個含み、かつ、3個〜16
個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されている
ポリペプチドをコードするDNAを含む組換えプラスミ
ドにより形質転換された組換え微生物細胞。 - 【請求項9】 前記組換え微生物細胞が大腸菌である
請求項8記載の組換え微生物細胞。 - 【請求項10】 配列表の配列番号1で示した1番目
のSerから155番目のLeuまでで表わされるアミ
ノ酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変
換体において、前記配列番号1の1番目のSerから8
番目のAspまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応す
る前記変換体のアミノ酸配列がArg−Gly−Asp
のアミノ酸配列を少なくとも1個含み、かつ、3個〜1
6個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されてい
るポリペプチドをコードするDNAを含む組換えプラス
ミドにより形質転換された組換え微生物細胞を培地中で
培養し、当該アミノ酸配列を有するポリペプチドを産生
し分離することを特徴とするポリペプチドの製造方法。 - 【請求項11】 配列表の配列番号1で示した1番目
のSerから155番目のLeuまでで表わされるアミ
ノ酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変
換体において、前記配列番号1の1番目のSerから8
番目のAspまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応す
る前記変換体のアミノ酸配列がArg−Gly−Asp
のアミノ酸配列を少なくとも1個含み、かつ、3個〜1
6個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されてい
るポリペプチドを有効成分として含有することを特徴と
する医薬組成物。 - 【請求項12】 前記Arg−Gly−Aspのアミ
ノ酸配列を少くとも1個含み、かつ、3個〜16個のア
ミノ酸を含むアミノ酸配列が配列表の配列番号2、3、
4、5、6、7、8、9又は10で示したアミノ酸配列
であるポリペプチドを含有する請求項11記載の医薬組
成物。 - 【請求項13】 前記Arg−Gly−Aspのアミ
ノ酸配列を少なくとも1個含み、かつ、3個〜16個の
アミノ酸を含むアミノ酸配列が配列表の配列番号2、3
、5、6又は7で示したアミノ酸配列であるポリペプチ
ドを含有する請求項11記載の医薬組成物。 - 【請求項14】 前記腫瘍壊死因子ポリペプチド又は
その変換体が、配列番号1で示した9番目のLysから
155番目のLeuまでで表わされるアミノ酸配列ある
いは当該アミノ酸配列の68番目のProが他のアミノ
酸により置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含有する請求項11又は12記載の医薬組成物。 - 【請求項15】 前記他のアミノ酸がAsp又はMe
tであるポリペプチドを含有する請求項14記載の医薬
組成物。 - 【請求項16】 配列表の配列番号1で示した1番目
のSerから155番目のLeuまでで表わされるアミ
ノ酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変
換体において、前記配列番号1の1番目のSerから8
番目のAspまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応す
る前記変換体のアミノ酸配列がArg−Gly−Asp
のアミノ酸配列を少なくとも1個含み、かつ、3個〜1
6個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されてお
り、更にそのN末端にMetを有することを特徴とする
ポリペプチド。 - 【請求項17】 配列表の配列番号11で示した1番
目のTから465番目のGまでで表わされる塩基配列を
有する腫瘍壊死因子ポリペプチドのDNA又はその変異
導入DNAにおいて、1〜3番目のTCAから22〜2
4番目のGACまでの塩基配列あるいはそれらに対応す
る前記変異導入DNAの塩基配列がArg−Gly−A
spのアミノ酸配列を少なくとも1個含み、かつ、3個
〜16個のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩
基配列により置換されていることを特徴とするDNA。
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3240131A JPH04368398A (ja) | 1991-06-17 | 1991-06-17 | ポリペプチド |
JP31128391A JP3157571B2 (ja) | 1990-09-21 | 1991-09-19 | ポリペプチド |
EP91116017A EP0477791B1 (en) | 1990-09-21 | 1991-09-20 | Polypeptide |
AT91116017T ATE141093T1 (de) | 1990-09-21 | 1991-09-20 | Polypeptid |
DE69121227T DE69121227T2 (de) | 1990-09-21 | 1991-09-20 | Polypeptid |
US07/994,469 US5519119A (en) | 1990-09-21 | 1992-12-21 | Muteins of TNF pharmaceutical compositions and a method of making |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3240131A JPH04368398A (ja) | 1991-06-17 | 1991-06-17 | ポリペプチド |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04368398A true JPH04368398A (ja) | 1992-12-21 |
Family
ID=17054962
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3240131A Pending JPH04368398A (ja) | 1990-09-21 | 1991-06-17 | ポリペプチド |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH04368398A (ja) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7056695B2 (en) | 2000-03-02 | 2006-06-06 | Xencor | TNF-α variants |
US7101974B2 (en) | 2000-03-02 | 2006-09-05 | Xencor | TNF-αvariants |
US7244823B2 (en) | 2000-03-02 | 2007-07-17 | Xencor | TNF-alpha variants proteins for the treatment of TNF-alpha related disorders |
US7446174B2 (en) | 2001-03-02 | 2008-11-04 | Xencor, Inc. | Protein based TNF-α variants for the treatment of TNF-α related disorders |
US7662367B2 (en) | 2000-03-02 | 2010-02-16 | Xencor, Inc. | Pharmaceutical compositions for the treatment of TNF-α related disorders |
US7687461B2 (en) | 2000-03-02 | 2010-03-30 | Xencor, Inc. | Treatment of TNF-α related disorders with TNF-α variant proteins |
-
1991
- 1991-06-17 JP JP3240131A patent/JPH04368398A/ja active Pending
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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US7101974B2 (en) | 2000-03-02 | 2006-09-05 | Xencor | TNF-αvariants |
US7244823B2 (en) | 2000-03-02 | 2007-07-17 | Xencor | TNF-alpha variants proteins for the treatment of TNF-alpha related disorders |
US7662367B2 (en) | 2000-03-02 | 2010-02-16 | Xencor, Inc. | Pharmaceutical compositions for the treatment of TNF-α related disorders |
US7687461B2 (en) | 2000-03-02 | 2010-03-30 | Xencor, Inc. | Treatment of TNF-α related disorders with TNF-α variant proteins |
US7446174B2 (en) | 2001-03-02 | 2008-11-04 | Xencor, Inc. | Protein based TNF-α variants for the treatment of TNF-α related disorders |
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