JPH0436657A - ヒト血清中のブタ・エラスターゼ測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒト血清中のブタ・エラスターゼ濃度の測定方
法に関する。

詳しくは、健常人にブタ・エラスターゼを経口投与し、
血清中のブタ・エラスターゼ濃度を高感度２点結合エン
ザイム・イムノアッセイを用いて測定する方法に関する
。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕ブタ膵
由来のエラスターゼは分子量２６０００のセリン・プロ
テアーゼの一種である。

エラスターゼはアテローム性動脈硬化血管に大量に存在
するエラスチンを加水分解する酵素であり、このエラス
ターゼをアテローム性動脈硬化患者の治療のために臨床
利用することが考え出された。

ブタ・エラスターゼはここ数年間に多数のアテローム性
動脈硬化患者に投与されているが、エラスターゼが消化
管から吸収されることの直接的な証明はなされていない
。

一般に、酵素タンパクの製剤は非常に吸収率が低いこと
、あるいは適当な定量法がないことから、経口投与した
時の血中濃度の測定は困難である。また、個体間あるい
は個体内変動も大きく、少数例で精度よく吸収実験を実
施することは極めて困難なこととされている。

一方、蛋白質の腸管吸収については既に研究がなされ、
微量の蛋白質がほぼそのままの形で吸収されると考えら
れるようになってきた（村地孝、化学と生物、　１９．
３７．１９８１）。

ブタ膵由来のエラスターゼの腸管吸収については既に研
究がなされている０例えば、１＄１１標識エラスターゼ
を用いたラット及びウサギでの吸収実験（Ｋ、Ｋａｔａ
ｙａｍａ　ｅｔ、ａｌ＋　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ。

＾ｃｔａ、、　２８８．１８１．１９７２）があるが、
ヒトを用いる製剤の吸収実験には適用できない。

また、赤血球凝集阻止反応を利用したウサギでの吸収実
験が報告されているが（九本ら、医学のあゆみ、　８４
．４２３．１９７３）、測定限界は３０乃／ｌであり、
測定感度は低い。

また、二抗体法によるラジオイムノアッセイ法（Ｏｏｙ
ａ＋ｗａ　ｅｔ、　ａｌ、、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ＋　７７＋　６Ｌ１９７７）の測定限界は１ｔｔ１１
／ｉｔであるが、１回の測定が４日間を要し、かつ操作
法が繁雑である欠点を有している。

一方、近年、酵素免疫測定法がタンパク質、ペプチドの
定量に急速に応用され、研究がなされている。

しかし、ヒト血清中のエラスターゼ濃度は上述のような
従来の測定方法では検出限界以下であり、臨床用量投与
でのヒトの吸収実験は不可能であった。

従って、ブタ・エラスターゼのヒト臨床用量でのヒト・
血清中濃度をより特異性のある高感度で測定する方法が
要望されている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、本
発明を完成するに到った。

即ち、本発明は、高感度２煮結合エンザイム・イムノア
ッセイを用いることを特徴とするヒト血清中のブタ・エ
ラスターゼ濃度の測定法を提供するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明の方法は、アフィニティーカラムで精製した抗ブ
タ・エラスターゼＩｇＧを不溶化したポリスチレンボー
ルをブタ・エラスターゼとインキュベートし、次に西洋
ワサビ・ペルオキシダーゼ標識アフィニティー精製ウサ
ギ抗ブタエラスターゼＦａｂ“とインキュベートするこ
とにより、ポリスチレンボールに結合した、ペルオキシ
ダーゼ活性を水素供与体として３−　（４−ヒドロキシ
フェニル）プロピオン酸を用いて螢光定量法で測定する
ものである。

本発明のエンザイム・イムノアッセイは、酵素で抗体を
標識し、抗原抗体反応を定量的に測定する方法である。

本発明は酵素免疫法の中でも多価抗原、つまり抗原分子
中に２ケ所以上の抗体との結合部位を有する抗原に用い
られる両側結合法である。

詳しくは、固相上に不溶化した抗体により、測定すべき
多価抗原を固相上にトラップし、ついでこれに酵素標識
抗体を結合させて、固相上に結合した酵素活性から測定
すべき多価抗原の量を知る方法である。別名サンドイン
チ法ともいう。

本方法は、他の方法と比較して抗原の測定において特異
性が高く、感度も優れた方法である。

例えば、親和性の高い抗体を用いて適切な条件下で測定
すると、ａ　ｍｏｌ（Ｉ　Ｘｌ０−”５ｏｌ）　レベル
での測定が可能である。

その原理を図１に示す。

本発明はエラスターゼ抗体２をポリスチレンボール１に
不溶化させ、これをエラスターゼの入った検体とインキ
ュベートするとエラスターゼ３はポリスチレンボール上
で抗体と結合する。

次いで、抗体と西洋ワサビ・ペルオキシダーゼとの複合
体４を添加すると複合体はエラスターゼと結合し、その
結合量はエラスターゼ量に比例する。

従って、結合物の量はポリスチレンポール上のペルオキ
シダーゼ活性を測定することにより求めることができる
。

なお、本発明で用いたブタ・エラスターゼはポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法により均一である。

本発明の方法による血清に添加したブタ・エラスターゼ
の回収実験を行った。

即ち、ブタ・エラスターゼ２６ｐｇ　（１ｆｓｏｌ）を
健常人の血清５０ｍと３７°Ｃで１時間インキュベート
し、実施例に従って２点結合エンザイム・イムノアッセ
イを行い、血清非存在下における標準曲線からブタ・エ
ラスターゼの回収率を求めると、その値は１１±３．３
％（ｎ＝１２）であった。

このように回収率が極めて低いことから、ブタ・エラス
ターゼは血清中ではα、−アンチトリプシン及びα２−
マクログロブリンと結合しているため、２点結合エンザ
イム・イムノアッセイとの反応性が非常に低い可能性が
示唆された。

本発明者は、この可能性を検討するため、ヒト血清を５
ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２００カラムでゲル濾過し、αｌ
−アンチトリプシン（分子量５２．０００〜５６．００
０）（Ｊｅｐｐｓｓｏｎ　Ｊ、　０．、　Ｍｅｄ、　Ｌ
ａｂ、＋　６＋　１６＋　１９７９）及びα２−マクロ
グロブリン（分子量７２５．０００）（Ｓｏｔｔｒｕｐ
−Ｊｅｎｓｅ　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、　Ｎ、
Ｙ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　４２１．４１．１９８３）を含む分画とブ
タ・エラスターゼ２６ｐｇ（ｌｆｍｏｌ）をインキュベ
ートし、２点結合エンザイム・イムノアッセイを行った
ところ、これらの分画量が多いほどブタ・エラスターゼ
の回収率は低下した。血清１０ｎｊ！を越える容量に相
当するα８−アンチトリプシン分画を添加した場合の回
収率は６０％、α２−マクログロブリン分画の場合の回
収率は４％であった。

添加分画容量を血清１０ｍ相当まで増加しても、それ以
上の回収率の低下は認められなかった。

この結果から血清１０ｎ！にはブタ・エラスターゼｌｆ
ｍｏｌと結合するために十分な量のα区アンチトリプシ
ン及びαニーマクログロブリンが含まれており、血清量
を１Ｏｎ１以上に増加してもそれ以上の結合は進行しな
いことが示された。健常者の血清にはα１−アンチトリ
プシン３０〜３３μ■ｏｌ／Ｉ！、α２−マクログロブ
リン２〜５μｓｏｌ／ｊ！　が含まれていると報告され
ており、本発明での実験と一致する。

次に、ブタ・エラスターゼ１０〜（０、３８ｎ■ｏｌ）
を健常者の血清１ｗＬ１とインキュベートし、５ｅｐｈ
ａｄｅｘＧ−２００カラムでゲル濾過し、２点結合エン
ザイム・イムノアッセイを行うとブタ・エラスターゼは
分子量７０．０００に相当する分画にのみ検出された。

以上の結果より、ブタ・エラスターゼはプロテアーゼ・
インヒビターと結合していることが示され、これらの事
はラットの血清を用いた研究結果（Ｋ、Ｋａｔａｙａ＋
ｗａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｉｓ、　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ。

Ａｃｔａ、　３３６．１６５．１９７４）　　と良く一
致する。

更にブタ・エラスターゼ２６ｐｇ（１ｆｏ＋ｏｌ）を健
常人血清５０ｍ又は１０１１１とインキュベートし、両
者からのブタ・エラスターゼ回収率を比較した。

血清１０Ｉ、血清５０ｐＩからのブタ・エラスターゼ回
収率はそれぞれ１５±３．１　（ＳＤ）％（範囲；１０
〜２０％、　ｎ＝１２）　、１１±３．３（ＳＤ）％（
範囲；８．４〜１５％、　ｎ＝１２）であった。血清５
０１１１からの回収率の方が低かったのは蛋白の影響が
あったためと思われる。

血清非存在下におけるブタ・エラスターゼの検出限界は
０．２６ｐｇ　（１０ａｍｏｌ）であった。

一方、血清中のブタ・エラスターゼ検出限界は血清５０
Ｉの場合は３５〜６５ｎｇ／ｉ！、であった。

血清中のブタ・エラスターゼ検出限界が高いのは、血清
とブタ・エラスターゼをインキュベートすると上述した
ようにプロテアーゼ・インヒビターと結合して回収率が
低下するためである。また、３種類のエラスターゼ濃度
（濃度範囲０．２８〜１Ｏ１７乃／ｉ！、）をプール血
清とインキュベートし、これらの濃度における測定精度
を検討した。測定的変動係数及び測定量変動係数はそれ
ぞれ５．５〜１１％（ｎ　＝１５）　、８．７〜１３％
（ｎ＝１４）であった。

〔実施例〕

以下、本発明を更に詳細に説明するための実施例を挙げ
るが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１ （１）抗ブタ・エラスターゼ抗体の調製と精製ブタ・エ
ラスターゼは小出らの方法に従って精製し、Ｄａｖｉｓ
の方法に従って検量したものを用いた（Ｋｏｉｄｅ　ｅ
ｔ　ａｌ−＋　Ｂｉｏｃｈｅｓ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　
Ｒｅｓ。

Ｃｏｍ＋ｓｕｎ、、　１００．１０９０．１９８１　；
　Ｄａｖｉｓ　Ｂ、Ｊ、、Ａｎｎ。

Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　１２１．４０４．１
９６４）。

ブタ・エラスターゼ０．１■を０．２−のフロイント完
全アジュバント（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ＋Ｃｏｃｈｒａｎｖｉｌｌｅ＋　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖ
ａｎｉａ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）とともにウサギに皮下投与
した。２週間後、エラスタ−ゼｌ■を２１のフロイント
完全アジュバントとともに、２週間隔で３回投与した。

最終投与１週間後に血液を採取し、０．１ｇ／／！ナト
リウムメルチオレートを添加し、−５０℃で保存した。

抗血清はブタ・エラスターゼ結合セファローズ４Ｂカラ
ムを用いて精製した。このアフィニティーカラムで精製
した抗ブタ・エラスターゼ抗体は、１．０ｇ／　Ｉ！、
ＮａＮ５を含む０．１ｓ＋ｏｌ／ｊ！リン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７，０）を用いたウルトロゲルＡｃＡ３４
（ＩＢＰ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ　Ｖｉｌｌｅｎｅｕ
ｖａ−Ｌａ−Ｇａｒｅｎｎｅ＋Ｆｒａｎｃｅ）カラム（
１，５ｘ１００　ｃｍ）で流速１５ｍｆ　／ｈでゲル濾
過し、抗ブタ・エラスターゼＩｇＧを含む分画を集め４
℃で保存した。

Ｆ（ａｂ’）ｔはＩｇＧをペプシン処理し、Ｆａｂ’は
Ｆ　（ａｂ’　）。

を２−メルカプトエチルアミンで還元し、調製した。

ＩｇＧ及びそのフラグメントの定量は２８０ｎ−の吸光
度から算出した（Ｉｓｈｉｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ−＋　
Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、　４．２０９．１９８３
）。

（２）　　Ｆａｂ’−ペルオキシダーゼ標識抗体の調製
アフィニティーカラムで精製した抗ブタ・エラスターゼ
Ｆａｂ”はＮ−サクシニミジル−６−マレイミトヘキサ
ノエー）　（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉａｉｄｙｌ　−６−＋
ｓａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｏａｔｅ）を用いて、西
洋ワサビペルオキシダーゼ（ｇｒａｄｅ　Ｉ　＋凍結乾
燥、　ＲＺ＝３．０゜Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ　ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ＋　ＦＲＧ）と
結合した。標識抗体の量はペルオキシダーゼ活性から算
出した（Ｉｓｈｉｋａｗａ　Ｅ、ｅｔ　ａｌｌＪ、Ｉｓ
＋ａ＋ｕｎ。

ａｓｓａｙ、４ｇ　２０９＋　１９８３　；　Ｈａｓｈ
ｉｄａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ａｐｐｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　６＋　５６＋　１９８４）。

（３）抗ブタ・エラスターゼＩｇＧ不溶化ポリスチレン
ポールの調製 １．０　ｇ＃アジ化ナナトリウム含む０．１ｍｏｌ　／
ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解したア
フイニイテイー精製抗ブタ・エラスターゼＩｇＧ（０，
１ｇ／ｊりを同緩衝液に溶解した非特異ウサギＩｇＧ（
０，１ｇ／　ｆ）にて１０倍希釈した。

この非特異ウサギＩｇＧは非特異ウサギ血清をＮａｚＳ
Ｏｍで分画後、ＤＥＡＥ−セルロースカラムを通して得
られたものである。

ポリスチレンボール（直径３．２　＋ｕ＋、　ｐｒｅｃ
ｉｓｉｏｎｐｌａｓｔｉｃ　Ｂａ１ｌ　Ｃｏ−＋　Ｃｈ
ｉｃａｇｏ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ、　Ｕ、Ｓ、＾、）を
先に述べた１０倍希釈液とインキュベートし、抗ブタ・
エラスターゼＩｇＧを物理吸着により不溶化した。

（４）ブタ・エラスターゼの２点酵素免疫測定法測定に
は主に０，１ｓｏｌ／／！塩化ナトリウム、１．Ｏｇ／
ｌウシ血清アルブミンを含む１抛−ｏ１／Ｉｌリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７，０）　（緩衝液Ａ）を使用し
た。

１．０ｇ／ｊ！アジ化ナトリウムを含む緩衝液Ａにブタ
・エラスターゼを溶解し、その５０ｍ又は血清５０Ｉ１
１を、０．５５　ｍｏｌ／　Ｎ塩化ナトリウム、Ｉｇ／
ｌウシ血清アルブミン及び１．０ｇ／ｊ！アジ化ナトリ
ウムを含む１０１１＠０１／　ｊ！リン酸ナナトリウム
緩衝液ｐＨ７，０）の１００　ｐｌと混合する。この混
合液に抗ブタ・エラスターゼＩｇＧ不溶化ポリスチレン
ボールを１個加え、２０℃で４時間、ついで４℃で一夜
インキエベートする。インキュベート後、ポリスチレン
ボールを０．１１Ｉｏｌ／ｊ！塩化ナトリウムを含むｌ
Ｏ霞ｍｏｌ／ｊ！リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０
）　２　ｔｄで２回洗浄後、緩衝液Ａに溶解した抗ブタ
・エラスターゼＦａｂ’−ペルオキシダーゼ複合体（５
０ｎｇ／１５０　ｐｉ　）と２０℃で３時間インキュベ
ートする。

最後に上述の如く、ポリスチレンボールを洗浄し、ポリ
スチレンボールに結合したペルオキシダーゼ活性を水素
供与体として３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオ
ン酸を用いて３０℃、６０分反応後、蛍光定量法により
測定した（ＩｓａｇａｅｍａＭ、　ｅｔ　ａｌ、　Ａｎ
ａｌ、　Ｌｅｔｔ−＋　１６．１５０９＋　１９８３Ｌ
蛍光強度は５０ｎｕｗｏｌ／　ｊ！硫酸に溶解した１■
／ｌキニーネを標準として励起波長３２０　ｎａ、蛍光
波長４０５ｎｍを用いて島津蛍光分光光度計（ＲＦ−５
１０゜島津製作所１京都）で測定した。

ブタ・エラスターゼの血清中濃度はブタ・エラスターゼ
投与前の血清５０ｉ１１を用いて得られたブタ・エラス
ターゼの積置曲線により算出した。

（５）経口投与後の健常人血清中のブタ・エラスターゼ
濃度の測定 ２０〜２８才の健常男子１２例（肥満及び喫煙者を除く
）は−晩絶食後ブタ・エラスターゼ３２　ａ＋ｇ（エラ
スチーム０錠として６錠、エーザイ■製）を内服した。

投与前及び投与後、経時的に採血し、血清中のブタ・エ
ラスターゼの濃度を測定した。結果を図２に示す。

図２より明らかなごとく、血清中のブタ・エラスターゼ
濃度は経口投与２時間後までは正確に測定できなかった
ものの１２時間以内には０．８３±０．３８Ｃ５Ｄ＞ｐ
Ｂ／　ｌ　（範囲０．３１〜１．６　ｔｒｙ／　１２　
）にまで上昇し、その後減少した。

この結果から経口投与したブタ・エラスターゼは２点結
合エンザイム・イムノアッセイにより検出可能な形態で
血液中に移行することが示唆された。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明の測定法の原理を示す図、図２はブタ・エ
ラスターゼを投与後の健常人血清中のブタ・エラスター
ゼ濃度の経時変化を示すグラフである。 １：ポリスチレンボール ２：エラスターゼ抗体 ３：エラスターゼ ４：抗体と西洋ワサビ・ペルオキシダーゼとの複合体

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 高感度２点結合エンザイム・イムノアッセイを用いるこ
   とを特徴とするヒト血清中のブタ・エラスターゼ濃度の
   測定法。