JPH0436197A - ***症原因菌の検査方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 本発明は、例えば細菌尿より細菌を集め、ＤＮＡ１抽出
し、検査する方法に関するものである。

（ロ）従来の技術 臨床診断や研究の分野において、生物試鋳中の細菌の種
類？同定したジ、その購ｉＥ成分倉分析する次めに細菌
を撞々の方法で寒天プレート上で培養するここに以前〃
１ら付わ几ていた７細床尿中にある線菌ｒ溶菌して菌体
成分？得る従来の方法汀誠←の÷濁液を培地につげて敞
日間層塗ｒ打い、得らｆＬ念コロニーを採取してこｎ２
遠心分癒し新体を分離回収する。

そしてこｎ’２溶液中でプロテネースにのような酵素あ
るいにドデシル硫酸ナトリウムのような界面活性剤ある
いは不酸化ナトリウムのようなアルカリを用いて各歯さ
せた夛、超音波、あるいはミルのような物理的破砕方法
で細菌を破砕したりすることで菌体成分を得る。

また従来の細菌同定法では例えばある特定の抗生物賀を
含んだ寒天などの培地に前記試料ｔまき、その結果とし
て生えてくる菌体群ｒ分別しさらにこの分別さ九た菌体
＃ｔま次別の抗生物置の含まｎる培地にまき分別に燥、
＃）返す分離培養法・あるいに菌体に固ＭＯ抗体ｔラテ
ックスビーズに固定しこｆＬｔ−前記試料中に添加し、
ビーズ表面の抗体が菌体を認識することにエルビーズが
凝集することを利用するラテックス凝集法、ポリエチレ
ン製プレヒトビーズＶｃ１次抗体を結合さぞ、こｎＫ菌
体を作用させ、抗原−抗体反応によ夕結合するものと、
しないものとＦＪ分け、さらに酵素や螢光物質により標
識さ九た２次抗体を作用さぜＢ／Ｆ分離俊酵素活注や螢
光強度ｒ測定することで同定するサンドイッチ抗体法、
′；ｊ）るいは前記コロニー會メンブランフィルタ−に
転写し溶菌後特異的ＤＮＡ断片に酵素や放射活性物質な
どｔ標絨したＤＮＡプロー１７作用させて遺伝子レベル
で検出するＤＮＡプローブ法がある。この方法はコロニ
ー中のＤＮＡ中にＤＮＡ７”ローブと相補的な塩基配列
があると両者の間に水素結合が生じること金利用して目
的の細菌等上検出する方法である。

ｅラ　　発明が屏決しようとする課題 しかしながら前記の菌体成分子得る方法にいずｎも培養
に長時間を要するため、菌体成分を迅速に得ることがで
きないのが難点である。とぐに***症ケ起こす工う
な原因菌の場合、早期に原因菌の特定し抗生甥頁などの
投与會行うことが病原菌の蔓延の阻止及び治療に大きな
勺果ｔもたらす、Ｘ発明の目的はこｎらのＭ’ｃ＠ｆＫ
同定し得る細菌検査法を提供することにある。

に）課題ｒｍ決する九めの手段 大発明の方法はフィルター内で、Ｗ菌全含む懸濁液から
菌体成分を採取し、上記菌体成分を含む溶液？ポリメラ
ーゼ連鎖反応法に付して、所望の菌のＤＮＡｇ増幅し、
前記増幅したＤＮＡ會用いて前記懸濁液中の所望の菌の
有無を検査する細菌検査法である− （ホ）作用 本発明は菌會含む懸濁液ｆ７４ｆｉ７ターホルダー中に
通し、フィルターホルダー内に配置さ九たフィルターで
懸濁液から菌を分離する。次にフィルターに溶菌ｇｋ遡
して菌Ａ成分ケ得る。

得た菌体成分はポリメラーゼ連鎖反応ｒ用いるため検査
法全体としても迅速かつ簡便なものとなる。また迅速に
結果がでるため病原菌に特異的に作用する抗生物質の投
与を行うことができる。

（へ）　　央　　施　　例 （試料液の調＃） ヒト尿１ｍｌに、標的菌１０１［！’に懸濁させ試料液
を得た。鷹的薗が大傷直の場合は入ＴＣＣ２３５１９ｋ
、プロテウス菌の場合はＪＣＭ１６６ｇを用いた。

（ｉ過処理） 上記で得ら７′２．た試料液を用いてｉ過処理上行つ念
。まず、第１図に示すごとくシリンジ２に前記の試料液
１ｒ入ｎ、シリンジ２とフィルター４に接続して濾過し
、次いでフィルターに５０ｍＭ燐酸バッファ　−ｐＨ７
，０（以下ｐＢ）５ｍｌで洗浄した。

（溶菌処理） 次いで新たにシリンジ３に溶Ｎ液５（プロテネース！１
■／ｍ１．　ｓＤ３０．１３％、　！ＩＬＳＯ，１３％
ｐｇ＠Ｑ　）　ｋ　２５０　ｐ　１人ｎ、フイｋｌ−４
（Ｍ＋１１ｉｐＱｒ８９　ＭＥＬ、ＬＥＸ−ＰＦ　Ｏ，
ｇμｍＦＩ　Ｉ　ｔｅｒ　　υｎ１１）Ｋ接続し穴。さ
らに塔石液５紫、ンリンジ３ヶ操乍しフィルター４内に
導いた。フィルター４の先に蓋６ｔつけて、６０°Ｃの
ウォーターバヌ７で１０分間インキ−ベートした俊、シ
リンジ３ｒ操作し溶菌液５を回収した。

（除ＳＤ８処理） 得らｆした溶出液のうち５００μｍ　’！”　］　、５
ｍｌ　容マイタロテヌトチーープに取や、４？量の５０
０ｍＭＫＣｌ水浴液を加え、沈澱する画分子遠心分離に
工り取り除いて溶出液に得た。

（熱処理） 得らｆ′Ｌ几溶出液ケ９５′Ｃで１０分インキ−ベート
し、プロテネースに２失活させ念。

（ＤＮＡの増幅） 上記溶出液に５声１取り特異的に目的ＤＮＡ【増やす方
法であるポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ法５ａｉｋ
ｉ　、　Ｒ、に、　ｅｔ　ａｌ　、　５ｃｉｅｎｃｅ　
２３ｇ４８７−４９１　（１９８８）　）　ｋ４時間で
行った。ここで上記ＰＣＭ法に以下の条件で打つ念。

すなわち、蒸留Ｘ２６．５μＩ、　ｄＮＴＰ　８戸１（
１゜２５墓Ｍ各ｄＮＴＰ）　、プライマー２．５μｍ（
２０戸Ｍ）２Ｐｉ、１０倍緩＃液５μＩ（パーキンエル
マーシータス裏）、τａｑポリメラーゼ２．５ユニット
（同社製）の合計５０μＩＶｃミネラル油１００μＩ］
蒸発防止剤として重層して、ＤＮＡ　ｒｈｅｒ＋ａａｌ
　（同社製）にセットし次。ここで言うプライマーとは
我々が独自で開発した２０塩基対のオリゴヌクレオチド
である（特許出願予定）。まえ、ここで言う１０倍緩＃
液とに１ｏｏＩＩＩＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９，０）
、５００　ｍ　Ｍ　Ｋ　（１、１５ｗ＝　Ｍ舅ｇｃ１２
である。

ＰＣＲ反尤の温度サイクＡ／は変性９４℃１分、アニー
リング３７°Ｃ１分、鎖長伸長６０’ＣＩ分、１サイク
ル５．７分、４２サイクルで行り几。

（検出） 上記ＰＣＭ後の溶液’に２０μｍとり、エチジウムブロ
マイドを含む２ｇ６アガローヌゲルで１００　Ｖ３５分
間電気泳＃ｒｈっ逢俊、トランヌイルξネター上にゲ〜
ｔ−ｆｆ１き波長３２（１−のＵＶ光を照射したところ
ＰＣＲ反応で増幅したＤＮＡは螢光を発し友。その螢光
ｒインスタントフィルムｔｉ着したカメラにて撮影した
結果？第２凶に示した。レーン１．５に故意に細菌を入
へず尿だけを試料液と同様に処理したパターンである。

レーン２．６はそｎ　（Ｊｎ大腸菌、プロテウス菌につ
いて本発明を実施したパターンである。レーン３．７に
各りの菌のポジティブコントロー〜である。レーン４．
８に溶出ｆｉｋ入ｎずにＰＣＲ法會行上行ものである。

Ｍは　Ｘ１７４ＤへＡｉ制限酵素Ｈｉｎｃ　　で完全消
化して得らｎた分子量マーカーであ夛、Ａ、、　Ｂ、　
Ｃ，Ｄ、に対応する塩基対の数である。

大腸菌がサンプル中（尿中）に含まｎている懸濁液を本
発明による方法を実施した後の電気泳ａパターンを第２
Ｉ１８１１のレーン２に示す。その結果４９１塩基対の
位置にバンドが出現した。こｎは同時に電気泳動し之ポ
ジティブコントロールサンデ／Ｌ／（２区のレーン３）
と同じ位置であることから大、偶ｄＭｙｔ特異的に検出
でき次ことがわかる。ここで言うポジティブコントロー
ルとに例えば大腸菌の場合は大腸菌ＡＴＣＣ２３５１９
ｋ液体培地中で純培養し之もの？＃素、界面活注剤で浴
薗した後フェノール、クロロ＊　ｐ　ム抽出エタノール
沈、搬を施して得たＤＮＡ溶ｇ？用いたものである。７
°ロチウス菌の場合も同様にして入手したもの盆用い念
。

ポジティブコントロールによるバンドと同じ長さのバン
ド（４６１塩基対）が検出できたことから標的菌が特異
的ＶＣ＠呂できたことがわかる。

上記結果からこの発明の細菌検査法によれば尿１ｍｌに
大腸菌、プロテウス菌が少なくとも１０’個含′１ｆ′
してい九は上記方法にょシ簡便かつ５時間以内という短
時間で検出できることがわかった。

（トフ　発明の効果 不発明に示した方法を用いることで細菌尿のような生体
試料中に含ま几るＤＮＡ；２含んだ菌体成分を入手する
ことができる。

ｉｒ＝、４− Ｍ発明（係る細Ｍ険査方法では、迅速かつ簡丈′ｆｘ第
１の発明に係る菌体成分採取方法を採用しかつ、不すメ
ラーゼ連鎖反応ｒ用い＠ｔめ横置法全体としても２便な
ものとなり、５時間以内という短時間で目的の病原菌ｒ
同定することができる。

【図面の簡単な説明】

第１区は、各々この発明の菌体成分採取方法を実施した
過程？示す説明図である。 第２凶にこの発明の方法ｒ実施した麦の電気泳動パター
ンである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）細菌尿中の細菌をフィルター上に分離することと
   、 前記フィルターに溶菌液を流通させて菌体成分を採取す
   ることと、採取した菌体成分を含む溶液をポリメラーゼ
   連鎖反応法に付して、所望の菌のＤＮＡを増幅すること
   と、 前記増幅したＤＮＡを用いて前記懸濁液中の所望の菌の
   有無を検査することと、 を含む***症原因菌の検査方法。