JPH0436197A - ***症原因菌の検査方法 - Google Patents
***症原因菌の検査方法Info
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- JPH0436197A JPH0436197A JP2144195A JP14419590A JPH0436197A JP H0436197 A JPH0436197 A JP H0436197A JP 2144195 A JP2144195 A JP 2144195A JP 14419590 A JP14419590 A JP 14419590A JP H0436197 A JPH0436197 A JP H0436197A
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(イ)産業上の利用分野
本発明は、例えば細菌尿より細菌を集め、DNA1抽出
し、検査する方法に関するものである。
し、検査する方法に関するものである。
(ロ)従来の技術
臨床診断や研究の分野において、生物試鋳中の細菌の種
類?同定したジ、その購iE成分倉分析する次めに細菌
を撞々の方法で寒天プレート上で培養するここに以前〃
1ら付わ几ていた7細床尿中にある線菌r溶菌して菌体
成分?得る従来の方法汀誠←の÷濁液を培地につげて敞
日間層塗r打い、得らfL念コロニーを採取してこn2
遠心分癒し新体を分離回収する。
類?同定したジ、その購iE成分倉分析する次めに細菌
を撞々の方法で寒天プレート上で培養するここに以前〃
1ら付わ几ていた7細床尿中にある線菌r溶菌して菌体
成分?得る従来の方法汀誠←の÷濁液を培地につげて敞
日間層塗r打い、得らfL念コロニーを採取してこn2
遠心分癒し新体を分離回収する。
そしてこn’2溶液中でプロテネースにのような酵素あ
るいにドデシル硫酸ナトリウムのような界面活性剤ある
いは不酸化ナトリウムのようなアルカリを用いて各歯さ
せた夛、超音波、あるいはミルのような物理的破砕方法
で細菌を破砕したりすることで菌体成分を得る。
るいにドデシル硫酸ナトリウムのような界面活性剤ある
いは不酸化ナトリウムのようなアルカリを用いて各歯さ
せた夛、超音波、あるいはミルのような物理的破砕方法
で細菌を破砕したりすることで菌体成分を得る。
また従来の細菌同定法では例えばある特定の抗生物賀を
含んだ寒天などの培地に前記試料tまき、その結果とし
て生えてくる菌体群r分別しさらにこの分別さ九た菌体
#tま次別の抗生物置の含まnる培地にまき分別に燥、
#)返す分離培養法・あるいに菌体に固MO抗体tラテ
ックスビーズに固定しこfLt−前記試料中に添加し、
ビーズ表面の抗体が菌体を認識することにエルビーズが
凝集することを利用するラテックス凝集法、ポリエチレ
ン製プレヒトビーズVc1次抗体を結合さぞ、こnK菌
体を作用させ、抗原−抗体反応によ夕結合するものと、
しないものとFJ分け、さらに酵素や螢光物質により標
識さ九た2次抗体を作用さぜB/F分離俊酵素活注や螢
光強度r測定することで同定するサンドイッチ抗体法、
′;j)るいは前記コロニー會メンブランフィルタ−に
転写し溶菌後特異的DNA断片に酵素や放射活性物質な
どt標絨したDNAプロー17作用させて遺伝子レベル
で検出するDNAプローブ法がある。この方法はコロニ
ー中のDNA中にDNA7”ローブと相補的な塩基配列
があると両者の間に水素結合が生じること金利用して目
的の細菌等上検出する方法である。
含んだ寒天などの培地に前記試料tまき、その結果とし
て生えてくる菌体群r分別しさらにこの分別さ九た菌体
#tま次別の抗生物置の含まnる培地にまき分別に燥、
#)返す分離培養法・あるいに菌体に固MO抗体tラテ
ックスビーズに固定しこfLt−前記試料中に添加し、
ビーズ表面の抗体が菌体を認識することにエルビーズが
凝集することを利用するラテックス凝集法、ポリエチレ
ン製プレヒトビーズVc1次抗体を結合さぞ、こnK菌
体を作用させ、抗原−抗体反応によ夕結合するものと、
しないものとFJ分け、さらに酵素や螢光物質により標
識さ九た2次抗体を作用さぜB/F分離俊酵素活注や螢
光強度r測定することで同定するサンドイッチ抗体法、
′;j)るいは前記コロニー會メンブランフィルタ−に
転写し溶菌後特異的DNA断片に酵素や放射活性物質な
どt標絨したDNAプロー17作用させて遺伝子レベル
で検出するDNAプローブ法がある。この方法はコロニ
ー中のDNA中にDNA7”ローブと相補的な塩基配列
があると両者の間に水素結合が生じること金利用して目
的の細菌等上検出する方法である。
eラ 発明が屏決しようとする課題
しかしながら前記の菌体成分子得る方法にいずnも培養
に長時間を要するため、菌体成分を迅速に得ることがで
きないのが難点である。とぐに***症ケ起こす工う
な原因菌の場合、早期に原因菌の特定し抗生甥頁などの
投与會行うことが病原菌の蔓延の阻止及び治療に大きな
勺果tもたらす、X発明の目的はこnらのM’c@fK
同定し得る細菌検査法を提供することにある。
に長時間を要するため、菌体成分を迅速に得ることがで
きないのが難点である。とぐに***症ケ起こす工う
な原因菌の場合、早期に原因菌の特定し抗生甥頁などの
投与會行うことが病原菌の蔓延の阻止及び治療に大きな
勺果tもたらす、X発明の目的はこnらのM’c@fK
同定し得る細菌検査法を提供することにある。
に)課題rm決する九めの手段
大発明の方法はフィルター内で、W菌全含む懸濁液から
菌体成分を採取し、上記菌体成分を含む溶液?ポリメラ
ーゼ連鎖反応法に付して、所望の菌のDNAg増幅し、
前記増幅したDNA會用いて前記懸濁液中の所望の菌の
有無を検査する細菌検査法である− (ホ)作用 本発明は菌會含む懸濁液f74fi7ターホルダー中に
通し、フィルターホルダー内に配置さ九たフィルターで
懸濁液から菌を分離する。次にフィルターに溶菌gk遡
して菌A成分ケ得る。
菌体成分を採取し、上記菌体成分を含む溶液?ポリメラ
ーゼ連鎖反応法に付して、所望の菌のDNAg増幅し、
前記増幅したDNA會用いて前記懸濁液中の所望の菌の
有無を検査する細菌検査法である− (ホ)作用 本発明は菌會含む懸濁液f74fi7ターホルダー中に
通し、フィルターホルダー内に配置さ九たフィルターで
懸濁液から菌を分離する。次にフィルターに溶菌gk遡
して菌A成分ケ得る。
得た菌体成分はポリメラーゼ連鎖反応r用いるため検査
法全体としても迅速かつ簡便なものとなる。また迅速に
結果がでるため病原菌に特異的に作用する抗生物質の投
与を行うことができる。
法全体としても迅速かつ簡便なものとなる。また迅速に
結果がでるため病原菌に特異的に作用する抗生物質の投
与を行うことができる。
(へ) 央 施 例
(試料液の調#)
ヒト尿1mlに、標的菌101[!’に懸濁させ試料液
を得た。鷹的薗が大傷直の場合は入TCC23519k
、プロテウス菌の場合はJCM166gを用いた。
を得た。鷹的薗が大傷直の場合は入TCC23519k
、プロテウス菌の場合はJCM166gを用いた。
(i過処理)
上記で得ら7′2.た試料液を用いてi過処理上行つ念
。まず、第1図に示すごとくシリンジ2に前記の試料液
1r入n、シリンジ2とフィルター4に接続して濾過し
、次いでフィルターに50mM燐酸バッファ −pH7
,0(以下pB)5mlで洗浄した。
。まず、第1図に示すごとくシリンジ2に前記の試料液
1r入n、シリンジ2とフィルター4に接続して濾過し
、次いでフィルターに50mM燐酸バッファ −pH7
,0(以下pB)5mlで洗浄した。
(溶菌処理)
次いで新たにシリンジ3に溶N液5(プロテネース!1
■/m1. sD30.13%、 !ILSO,13%
pg@Q ) k 250 p 1人n、フイkl−4
(M+11ipQr89 MEL、LEX−PF O,
gμmFI I ter υn11)K接続し穴。さ
らに塔石液5紫、ンリンジ3ヶ操乍しフィルター4内に
導いた。フィルター4の先に蓋6tつけて、60°Cの
ウォーターバヌ7で10分間インキ−ベートした俊、シ
リンジ3r操作し溶菌液5を回収した。
■/m1. sD30.13%、 !ILSO,13%
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導いた。フィルター4の先に蓋6tつけて、60°Cの
ウォーターバヌ7で10分間インキ−ベートした俊、シ
リンジ3r操作し溶菌液5を回収した。
(除SD8処理)
得らfした溶出液のうち500μm ’!” ] 、5
ml 容マイタロテヌトチーープに取や、4?量の50
0mMKCl水浴液を加え、沈澱する画分子遠心分離に
工り取り除いて溶出液に得た。
ml 容マイタロテヌトチーープに取や、4?量の50
0mMKCl水浴液を加え、沈澱する画分子遠心分離に
工り取り除いて溶出液に得た。
(熱処理)
得らf′L几溶出液ケ95′Cで10分インキ−ベート
し、プロテネースに2失活させ念。
し、プロテネースに2失活させ念。
(DNAの増幅)
上記溶出液に5声1取り特異的に目的DNA【増やす方
法であるポリメラーゼチェーン反応(PCR法5aik
i 、 R、に、 et al 、 5cience
23g487−491 (1988) ) k4時間で
行った。ここで上記PCM法に以下の条件で打つ念。
法であるポリメラーゼチェーン反応(PCR法5aik
i 、 R、に、 et al 、 5cience
23g487−491 (1988) ) k4時間で
行った。ここで上記PCM法に以下の条件で打つ念。
すなわち、蒸留X26.5μI、 dNTP 8戸1(
1゜25墓M各dNTP) 、プライマー2.5μm(
20戸M)2Pi、10倍緩#液5μI(パーキンエル
マーシータス裏)、τaqポリメラーゼ2.5ユニット
(同社製)の合計50μIVcミネラル油100μI]
蒸発防止剤として重層して、DNA rher+aal
(同社製)にセットし次。ここで言うプライマーとは
我々が独自で開発した20塩基対のオリゴヌクレオチド
である(特許出願予定)。まえ、ここで言う10倍緩#
液とに1ooIIIMトリス塩酸緩衝液(pH9,0)
、500 m M K (1、15w= M舅gc12
である。
1゜25墓M各dNTP) 、プライマー2.5μm(
20戸M)2Pi、10倍緩#液5μI(パーキンエル
マーシータス裏)、τaqポリメラーゼ2.5ユニット
(同社製)の合計50μIVcミネラル油100μI]
蒸発防止剤として重層して、DNA rher+aal
(同社製)にセットし次。ここで言うプライマーとは
我々が独自で開発した20塩基対のオリゴヌクレオチド
である(特許出願予定)。まえ、ここで言う10倍緩#
液とに1ooIIIMトリス塩酸緩衝液(pH9,0)
、500 m M K (1、15w= M舅gc12
である。
PCR反尤の温度サイクA/は変性94℃1分、アニー
リング37°C1分、鎖長伸長60’CI分、1サイク
ル5.7分、42サイクルで行り几。
リング37°C1分、鎖長伸長60’CI分、1サイク
ル5.7分、42サイクルで行り几。
(検出)
上記PCM後の溶液’に20μmとり、エチジウムブロ
マイドを含む2g6アガローヌゲルで100 V35分
間電気泳#rhっ逢俊、トランヌイルξネター上にゲ〜
t−ff1き波長32(1−のUV光を照射したところ
PCR反応で増幅したDNAは螢光を発し友。その螢光
rインスタントフィルムti着したカメラにて撮影した
結果?第2凶に示した。レーン1.5に故意に細菌を入
へず尿だけを試料液と同様に処理したパターンである。
マイドを含む2g6アガローヌゲルで100 V35分
間電気泳#rhっ逢俊、トランヌイルξネター上にゲ〜
t−ff1き波長32(1−のUV光を照射したところ
PCR反応で増幅したDNAは螢光を発し友。その螢光
rインスタントフィルムti着したカメラにて撮影した
結果?第2凶に示した。レーン1.5に故意に細菌を入
へず尿だけを試料液と同様に処理したパターンである。
レーン2.6はそn (Jn大腸菌、プロテウス菌につ
いて本発明を実施したパターンである。レーン3.7に
各りの菌のポジティブコントロー〜である。レーン4.
8に溶出fik入nずにPCR法會行上行ものである。
いて本発明を実施したパターンである。レーン3.7に
各りの菌のポジティブコントロー〜である。レーン4.
8に溶出fik入nずにPCR法會行上行ものである。
Mは X174DへAi制限酵素Hinc で完全消
化して得らnた分子量マーカーであ夛、A、、 B、
C,D、に対応する塩基対の数である。
化して得らnた分子量マーカーであ夛、A、、 B、
C,D、に対応する塩基対の数である。
大腸菌がサンプル中(尿中)に含まnている懸濁液を本
発明による方法を実施した後の電気泳aパターンを第2
I1811のレーン2に示す。その結果491塩基対の
位置にバンドが出現した。こnは同時に電気泳動し之ポ
ジティブコントロールサンデ/L/(2区のレーン3)
と同じ位置であることから大、偶dMyt特異的に検出
でき次ことがわかる。ここで言うポジティブコントロー
ルとに例えば大腸菌の場合は大腸菌ATCC23519
k液体培地中で純培養し之もの?#素、界面活注剤で浴
薗した後フェノール、クロロ* p ム抽出エタノール
沈、搬を施して得たDNA溶g?用いたものである。7
°ロチウス菌の場合も同様にして入手したもの盆用い念
。
発明による方法を実施した後の電気泳aパターンを第2
I1811のレーン2に示す。その結果491塩基対の
位置にバンドが出現した。こnは同時に電気泳動し之ポ
ジティブコントロールサンデ/L/(2区のレーン3)
と同じ位置であることから大、偶dMyt特異的に検出
でき次ことがわかる。ここで言うポジティブコントロー
ルとに例えば大腸菌の場合は大腸菌ATCC23519
k液体培地中で純培養し之もの?#素、界面活注剤で浴
薗した後フェノール、クロロ* p ム抽出エタノール
沈、搬を施して得たDNA溶g?用いたものである。7
°ロチウス菌の場合も同様にして入手したもの盆用い念
。
ポジティブコントロールによるバンドと同じ長さのバン
ド(461塩基対)が検出できたことから標的菌が特異
的VC@呂できたことがわかる。
ド(461塩基対)が検出できたことから標的菌が特異
的VC@呂できたことがわかる。
上記結果からこの発明の細菌検査法によれば尿1mlに
大腸菌、プロテウス菌が少なくとも10’個含′1f′
してい九は上記方法にょシ簡便かつ5時間以内という短
時間で検出できることがわかった。
大腸菌、プロテウス菌が少なくとも10’個含′1f′
してい九は上記方法にょシ簡便かつ5時間以内という短
時間で検出できることがわかった。
(トフ 発明の効果
不発明に示した方法を用いることで細菌尿のような生体
試料中に含ま几るDNA;2含んだ菌体成分を入手する
ことができる。
試料中に含ま几るDNA;2含んだ菌体成分を入手する
ことができる。
ir=、4−
M発明(係る細M険査方法では、迅速かつ簡丈′fx第
1の発明に係る菌体成分採取方法を採用しかつ、不すメ
ラーゼ連鎖反応r用い@tめ横置法全体としても2便な
ものとなり、5時間以内という短時間で目的の病原菌r
同定することができる。
1の発明に係る菌体成分採取方法を採用しかつ、不すメ
ラーゼ連鎖反応r用い@tめ横置法全体としても2便な
ものとなり、5時間以内という短時間で目的の病原菌r
同定することができる。
第1区は、各々この発明の菌体成分採取方法を実施した
過程?示す説明図である。 第2凶にこの発明の方法r実施した麦の電気泳動パター
ンである。
過程?示す説明図である。 第2凶にこの発明の方法r実施した麦の電気泳動パター
ンである。
Claims (1)
- (1)細菌尿中の細菌をフィルター上に分離することと
、 前記フィルターに溶菌液を流通させて菌体成分を採取す
ることと、採取した菌体成分を含む溶液をポリメラーゼ
連鎖反応法に付して、所望の菌のDNAを増幅すること
と、 前記増幅したDNAを用いて前記懸濁液中の所望の菌の
有無を検査することと、 を含む***症原因菌の検査方法。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2144195A JPH0436197A (ja) | 1990-05-31 | 1990-05-31 | ***症原因菌の検査方法 |
EP91108811A EP0461477A1 (en) | 1990-05-31 | 1991-05-29 | Method of bacterial examination and apparatus therefor |
KR1019910008959A KR950010187B1 (ko) | 1990-05-31 | 1991-05-30 | 요로감염유발 미생물과 식중독유발 미생물의 검사방법 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2144195A JPH0436197A (ja) | 1990-05-31 | 1990-05-31 | ***症原因菌の検査方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0436197A true JPH0436197A (ja) | 1992-02-06 |
Family
ID=15356425
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2144195A Pending JPH0436197A (ja) | 1990-05-31 | 1990-05-31 | ***症原因菌の検査方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0436197A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011512861A (ja) * | 2008-03-14 | 2011-04-28 | ビオメリュー | 凝集反応による液体培地中の微生物のリアルタイム検出のための方法 |
JP2018151392A (ja) * | 2007-10-10 | 2018-09-27 | ポカード・ディアグノスティクス・リミテッドPocared Diagnostics, Ltd. | 光学分析装置及び流体サンプル中の微生物のタイプと量とを同定する方法 |
-
1990
- 1990-05-31 JP JP2144195A patent/JPH0436197A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018151392A (ja) * | 2007-10-10 | 2018-09-27 | ポカード・ディアグノスティクス・リミテッドPocared Diagnostics, Ltd. | 光学分析装置及び流体サンプル中の微生物のタイプと量とを同定する方法 |
US10656140B2 (en) | 2007-10-10 | 2020-05-19 | Pocared Diagnostics Ltd. | System for conducting the identification of bacteria in urine |
JP2011512861A (ja) * | 2008-03-14 | 2011-04-28 | ビオメリュー | 凝集反応による液体培地中の微生物のリアルタイム検出のための方法 |
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