JPH0434395B2 - - Google Patents
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- Y10S47/00—Plant husbandry
- Y10S47/11—The application of protective coatings to plants
Abstract
Description
本発明は培地にアガロースを使用して原形質か
ら形成した植物細胞を培養または増殖するための
下記に述べる方法に関する。
世界人口の急激な増加により、有用な植物の繁
殖は生物学研究の主要な焦点である。一方では、
食料、エネルギー及び原材料の代替再生可能源に
対する研究がある。例えば、新しい植物種、とく
に病原菌（例えば植物病原昆虫、真菌、細菌、ビ
ールスなど）、環境の影響または位置の条件（例
えば熱暑、寒冷、風、土壌条件、湿気、乾燥な
ど）に対する抵抗が増加したような有用な性質を
有するまたは葉、種子、塊茎、根、柄などでの保
存または貯蔵物質の形成が増加したハイブリツド
（hybrid）種である。他方、有用なバイオマス
（biomass）に対する必要性の増大に加えて、製
薬的に許容しうる植物起源の有効成分及びその誘
導体、例えばアルカロイド、ステロイドなどに対
しての必要性も増加している。そして天然原料か
らの収量が低いため、それらは代替方法たとえば
遺伝子操作された植物種からの抽出によりしだい
に入手可能になつてきている。
したがつて、多数の植物種を選択的に操作する
ことの実務上の可能性に対する関心が増してい
る。
高等植物の分離した分化全能細胞はポリマーを
含む培地中または培地上で胚細胞集合体そしてあ
る場合には生育できる（Viable）植物及び繁殖
できる植物を生産することを誘起できることは公
知である。しかしながら、比較的堅い細胞壁は通
常、細胞融合または遺伝子移植のような操作でほ
とんど打ち勝てない障壁を構成しているので、こ
れらの場合、裸の原形質を使用することが有利で
ある。そしてその原形質は酵素（ペクチナーゼ、
セルラーゼなど）の助けにより公知の方法で細胞
壁を除去することにより相当する分化全能の完全
な細胞から得られる。
今まで、植物細胞及び特殊な場合、原形質も培
養するために凝固剤として寒天が一般的に使用さ
れていた。しかしながら、寒天は大部分の原形質
タイプに対して有毒である。そしてとくに強健な
原形質が寒天中でうまく培養可能な少しの例外的
なケースのみが知られている。
この理由のため、他の有用な培地を見つけるた
めの研究が最近始まつた。他の物質の中でアルギ
ネート及び寒天が等しく良好な平板培養の性質を
有していることが見つけられた〔アダオハームバ
ナソ イー エヌ、ロスコー、デイーエツチ
（1982）、植物科学レター25：61−66（Adaoha−
Mbanaso E.N.，Roscoe，D.H.（1982），Plant
Sci.Let.25：61−66）〕。
アガロースは今まで動物細胞及び微生物を培養
するためだけに使われていた。しかしながら、植
物細胞を培養することはまつたく異なつた生理学
のために大変異なつた一群の問題を提出する。動
物細胞の培養の技術は必然的に植物細胞の増殖ま
たは植物原形質からの細胞集合体の形成に適用で
きない。
そのため、本発明の目的は、植物原形質から形
成した細胞培養物の成育のために寒天または精製
した寒天の使用から生じる困難を避けること、及
び培地の植物毒効果を避けるとともに、細胞集合
体または胚植物を培養することが可能な方法によ
り、とくに強健なタイプだけでなく、すべての原
形質タイプにも適用できる一般的な方法を提供す
ることである。この目的を本発明の方法による驚
くべき方法で達成する。
アガロースは寒天の構成成分の一つである。入
手可能な市販の寒天は、主に、中性アガロースと
多数の側基を有するイオン性アガロペクチンの混
合物からなつている。市販のアガロースは業界慣
用の方法により寒天から得られる。通常、多くの
側鎖はそのまま残しそしてゲル生成及び融点のよ
うな物理化学的性質を定める。
低い温度で融解及びゲル化するアガロースは例
えばアガロース分子にヒドロキシエチル基を導入
した後に得られる。この方法により変性したアガ
ロースをこの明細書全体を通してLMT（低温融
解）アガロースとして表わす。
驚くべきことに、寒天中の原形質から形成した
植物細胞の増殖から生じる困難、とくに原形質の
高い死滅率は寒天の代りにアガロースを使用する
ことにより実質上非常に減少または完全に除かれ
ることが現在見出された。アガロース、とくに
LMTアガロースで凝固された培地を使用するこ
とによるだけでなく、つけ加えて原形質を平板培
養した凝固培地をさらに小さい小片に切断し、そ
して所望の大きさの細胞集合体が形成するまで上
記の小片を個々にまたはグループで栄養溶液中で
培養することにより原形質から形成した細胞の増
殖を一層さらに刺激することができる。
アガロースの使用が異なつた原形質のタイプ、
とくに敏感な原形質から細胞培養物を形成する能
力を著しく増進させることができるだろうという
こと、その結果今まで培養することが可能でなか
つた原形質タイプをもまた今、細胞集合体から完
全な植物まで形成するように刺激することができ
るということは全く予期しないことであつた。
したがつて、本発明は、ａ 分離した原形質ま
たは原形質から再生させ、分離した細胞をアガロ
ース−凝固培地中または上で均一に平板培養する
こと、所望によりｂ 予備処理及び凝固されたこ
の培地を小片に切断し、そして上記の小片を液体
栄養溶液中に移すこと、そしてその細胞の集合体
が所望の大きさになるまで培養を続けることから
なる植物細胞の増殖集合体を培養する方法に関す
るものである。
この明細書を通して使われている「細胞集合
体」という語は測定できる数の植物細胞から完全
な植物までからなる培養物を意味すると理解され
たい。
本発明のとくに好ましい実施態様はａ 分離し
た原形質をアガロース−凝固培地中または上で均
一に平板培養すること、所望によりｂ 予備処理
され、凝固された培地を小片に切断し、該小片の
体積の１ないし10000倍量、好ましくは５ないし
10000倍量そして最も好ましくは20ないし100倍量
の、植物細胞を培養するのに適する液体栄養溶液
中で上記の小片を培養し、そして細胞培養物が所
望の大きさに達するまで、０ないし40℃の温度範
囲で培養を続けることからなる植物細胞の増殖す
る集合体を培養する方法である。
細胞集合体を培養するためにとくに有利な温度
範囲は12ないし30℃である。
原形質から植物を技術的及び商業的に繁殖させ
ることは非常に興味あることである。
本発明の新規な方法は次のように、微生物を再
生するために慣用的に用いられる平板培養の方法
を修整する便利な方法からなつている。即ち、公
知の方法で分離し、殺菌しそして精製した原形質
を寒天の代りにアガロースで凝固した培地中にと
り、そして前述の培地でその原形質を平板培養す
る方法を行い、その原形質を埋めたアガロース凝
固培地をさらに小さく、好ましくは同じ大きさの
小片に切断し、上記の小片を適する栄養溶液で部
分的に満した容器に単独にまたはいつしよに移植
し、所望の大きさの細胞集合体または萌芽的な生
育できる植物が形成するまで、上記の容器を所定
の温度範囲で暗所または明所の条件において一定
に振とうすることからなるものである。
細胞集合体が埋められているアガロースの小片
は、有用な天然生産物を得るために生物反応器中
での大規模培養にもつとも適している。
胚植物はとくに有用な性質を有する成熟した植
物、例えばハイブリツド植物、に生育することが
でき、そしてさらに慣用の生物学的方法により繁
殖させることができる。
本発明の、明細書において「小片」という語
は、平均断面が１ないし約100mm、好ましくは２
ないし60mm、そしてもつとも好ましくは２ないし
10mmである三次元の不規則な、または好ましくは
規則的な構造、例えば円盤、球、立方体、角柱、
円錐などを意味する。平均直径を有する球形小片
は発酵器で細胞集合体を大規模培養するためにと
くに好ましい。
本発明の方法は、とくに、手に負えないまたは
問題の原形質から、細胞集落及びその後培養物を
作るためにすべての公知の方法より効果的であ
る。それは簡単さが特徴であり、そして異なつた
系統の原形質を培養するために、及び融合及び遺
伝子操作した原形質のために使用することができ
る。この方法は、前述の有益な性質の一つまたは
それ以上を有する植物細胞を選択的に培養するの
に適している。さらに、また腫瘍組織から得られ
た原形質からの植物細胞を培養するために使用す
ることもできる。
したがつて、植物細胞または植物集落を培養す
るためのアガロースの使用が本発明の主要な特徴
である。さらに、異なつたアガロースは本発明の
方法においてそれらの使用に関する程度において
だけ異なり、そして原形質から植物細胞集落を培
養するためにはすべて寒天よりまつたくすぐれて
いるので、どのタイプのアガロースを使用するか
は重要でない。
実施例１ないし６の実験結果は、アガロースが
原形質からの植物細胞を培養するために寒天より
さらにすぐれていることを明白に表わしているけ
れども、アガロースを使用するときある種の問題
も実務上生じる。ゆえに形成の過程で細胞の集合
体は成長の進んだ段階で成長の停止を起しまたは
死さえも経験することがある。成長の停止の原因
は一種の栄養溶液の消耗といつてもよく、一方細
胞の死は細胞集合体の成長により放出された有毒
物質の増加の結果であろう。しかしながら、驚く
べきことに両方の望ましくない影響を簡単な方法
により除くことができる。原形質を平板培養した
一次アガロース−凝固培地を望ましくは同じ大き
さまたは同じ形のさらに小さい小片に切断、そし
て次いでこれらの小片を例えば、好ましくは十分
な量の適当な液体栄養溶液を含む振とう容器に移
すならば、細胞集合体が妨げられずに成長するこ
とが観察される。原形質のタイプに依存して、原
形質の平板培養後０ないし７日、通常３ないし４
日にアガロース−凝固培地を小片に切断するなら
ば、それは有利であることができる。つくばねあ
さがおのために最も良い時間は平板培養後４日目
で、タバコ及びクレピス カピラリス
（Crepiscapillaris）は３日目である。かぶの原形
質を平板培養するとき、小片にするのは最も好ま
しくはアガロースの凝固後だちに行う。
培地のための凝固剤としてのアガロースの使用
に加えて、原形質を埋めたアガロース−凝固培地
を適当な小片に切断することもまた本発明の重要
な目的を構成している。さらに本発明の目的はま
た前述の方法により作られた細胞集合体及び／ま
たは植物でもある。
細胞の成長を加速するためには、本発明の方法
で用いられる栄養溶液はまた微量の有機化合物を
含んでもよい。例えばビタミン甘蔗糖及びグルコ
ースのような炭素供給体、オーキシン及びシトキ
ニン（cytokinins）のような植物ホルモン、及び
麦芽エキスまたはやしの実の果汁のような天然抽
出物そしてもし必要なら他の有用な成分である。
培養条件例えば栄養物の温度、光の作用及び培養
の持続期間は植物種及び原形質のタイプまたは実
験の規模のようなそれぞれの条件に合わせること
ができる。
有用な原形質の培養を下記の製造例ａないしｃ
に示す。これらの例において最初の細胞培養を植
物のどんな器官または組織、例えば根、柄、葉、
花、種、花粉などからでも、また例えばカルス培
養物からも始めることができる。原形質を培養す
る技術は公知であり、そして実施例ａないしｃに
示される種に制限されるものではない。
純原形質の培養のための製造例
実施例ａ：原形質を培養するためにヒヨスチアム
ムチクス（Hyoscyamus muticus）種の補助
的栄養変異細胞系統（line）の細胞懸濁培養物を
0.25モル ソルビトール、0.0025モル 塩化カル
シウム２水塩及び0.5w／ｖ％２−（ｎ−モノホリ
ノ）エタンスルホン酸（MES）（PH5.2）中4w／
ｖ％セルラーゼ オノズカ R.10（日本国ヤクル
ト株式会社から入手可能）、及び2w／ｖ％ドリセ
ラーゼ（Driselase）〔スイス国のヘミツシユ フ
アブリツク シユバイツアーハーレ（Chemische
Fabrik Schweizerhalle）から入手可能〕の溶液
で処理する。その混合物を26℃で一晩中培養し、
次いで100μｍの金網でろ過する。そしてろ液を
同量の0.6モルのシヨ糖溶液で希釈する。希釈し
たろ液を0.16モル塩化カルシウム２水塩及び
0.5w／ｖ％MES（PH5.6）の上掛け溶液でおおう。
原形質を層の界面から集め、上掛け溶液で２回洗
浄し、そしてゲブハルト（Gebhardt）ら
〔（1981）プランタ（Planta）153：81−89〕の完
全培地B1で培養する。培地B1は栄養培地Ａとし
て下記に示される。
実施例ｂ： タバコ（Nicotiana tabacum）、系
統VR2の原形質をシリト（Shillito）ら（1981）
によりMutat.Res.81：165−175に記載されたよ
うに分離する。これらの原形質を精製するための
操作を次のように修正する。酵素溶液中での培養
に続いて半量の0.6モル シヨ糖溶液を加え、そ
してその希釈混合液を実施例ａのように塩化カル
シウムの上掛け溶液でおおう。その原形質を界面
で集めそして同じ塩化カルシウム溶液で洗浄す
る。さらに実施例ａで述べたように操作を繰り返
えしそしてその原形質を培地K3（培地Ｂとして下
記に示す）中で培養する。
実施例ｃ： アメリカ合衆国バージニア洲シヤー
ロツツビレ（Charlottesville）のエム ハンソン
（M.Hanson）から得られた半数体“ミツチエル
（Mitchell）”〔ピーエムビー ニユースレター
（PMB Newsletter），1980〕及び突然変異誘発
遺伝子つくばねあさがお〔ポトリクス アイ
（Potrykus Ｉ）（1970）ツエツト プフランツエ
ンチユヒトウング（Z.Pflanzen−zuchtuug）
63：24−40〕の２種のつくばねあさがおハイプリ
ダ（hybrida）の系統の原形質の分離。若く、十
分に広がつた葉を0.01w／ｖ％の二塩化水銀溶液
及び100ml中にトウイーン80（Tween80）を３滴
含む溶液で殺菌しそして水で希釈した殺菌剤で５
回洗浄する。中葉肋のない半葉を６枚積み重ねそ
して浸透液（Osmoticum）（アニトール0.375モ
ル、二塩化カルシウム0.05モル、MES0.5w／ｖ
％PH5.8）で湿めらせそして５mm幅の薄い切片に
切断する。その切片を酵素溶液（前記浸透液中の
0.2w／ｖ％セルラーゼ オノズカR.10及び
0.2w／ｖ％マセロチーム（Macerozyme）溶液、
PH5.6）で減圧浸透させる。暗所にて12℃で一晩
中培養したのち、上記の浸透液１容積を加えそし
てその混合物を100μｍの網目を通しろ過する。
原形質を透過液で２回洗浄し、砕片を除去するた
めに0.6モルのシヨ糖で上掛けする。界面からの
原形質を浸透液でもう一度洗浄し、培地〔デイー
ピーデイー：ドウラント（Durant）ら（1973）、
ツエト プフランツエンヒシオール（Z.
Pflanzenphysiol）69：26−34〕26℃、暗所で１
日に12時間培養する。
下記の比較試験で報告された結果は原形質から
植物細胞集合体を培養するとき、ａ 寒天をアガ
ロースに置換することによりそしてｂ アガロー
ス−凝固培地を切断しそして振とうした液体培地
に入れることにより観察された驚くべき有利な効
果を納得させるように説明する。
培地として寒天及びアガロースの比較試験例
ａ すべての栄養溶液を0.22μｍのナルゲンフイ
ルターを通して限外ろ過することにより殺菌す
る。凝固した培地は２倍にの濃縮した栄養溶液を
２倍に濃縮しそしてオートクレーブで滅菌したゲ
ル化剤と等量混合することにより作る。
適する液体栄養液は例えば下記のＡ，Ｂ，Ｃ，
Ｄ及びＥに挙げられた培地である：
Ａ 完全培地B1：ゲブハルト（Gebhardt）ら、
プランタ（Planta）、153，81〜89（1981）
Ｂ K3培地：ナギー（Nagy）及びマリガ
（Malig）、ツエツト プフランツエンフイジオ
ロギー（Z.Pflanzenphysiologie）78，453〜
455（1976）
Ｃ DPD培地：ドウラント（Durand）ら、ツエ
ツト プフランツエンフイジオロギー（Z.
Pflanzenphysiologie）69，26〜34（1973）
Ｄ リンツマイアー、イーエム（Lindsmaier，
E.M.）及びスコーグ、エフ（Skoog，F.）の
培地、フイジオロギア プランタイム（Phy−
aiologia Plantarum）18，100〜127（1965）
Ｅ ニツチ、ジエーピー（Nitsch，J.P.）及びニ
ツチ、シー（Nitsch，Ｃ）の培地、科学
（Science）163，85〜87（1969）。
使用するゲル化剤は：
１ アガロース：すべての試験においてシープラ
ク エルエムテイー（Sea Plaque LMT）〔マ
リン コロイズ（Marine Colloids）〕。
〔実施例５で報告する試験においてのみ、使用
した他のアガロースをそこに特定する〕
２ 寒天：すべての試験においてジフコ バクト
−寒天（Difco Bacto−agar）。
３ 精製寒天：454ｇの寒天（上記２）のものと
同じ）を続けて10の水、５のアセトン及び
５のエタノールで洗浄しそして減圧下40℃で
乾燥する。白色無臭の粉末を得る。
実施例ａないしｃで得られた原形質を凝固及び
精製した培地上に薄い層でペトリ皿での慣用の平
板培養方法により平板培養する。寒天及びアガロ
ースを、特に指定した場合を除き、0.4w／ｖ％
の濃度で使用する。全量３mlまたは10mlの培地を
それぞれ６cmまたは10cmのペトリ皿に対して用い
る。
寒天またはアガロースの小片を使用する実験の
ために、培地を小片に分ける前に原形質をその培
地に均一に平板培養する。次いでその小片を直径
10cmの容器に入つた30mlの栄養溶液に入れ、そし
て回転振とう機上26℃で暗所または明所で培養す
る。液体培地は規則的な間隔でまたは絶えず取り
かえる。原形質からの細胞集落の形成についてそ
の方法の有用性及び有利な影響の顕微鏡的評価は
４ないし６週間培養したのち代表的な数のわくに
おいて細胞集合体を計数及び検査することにより
行う。小片に分ける実験において、栄養溶液に浮
いている小片を入れている皿を14日間の間隔で撮
影しそして小片中に見える細胞集合体の数及び大
きさを評価する。
β 試験結果
実施例 １：10mlの凝固培地Ｂでヒヨスチアムス
ムチクス種、系統B9（trip-）の105の細胞ま
たは原形質の平板培養から再生した細胞集合体の
数。
The present invention relates to the method described below for culturing or propagating plant cells formed from protoplasm using agarose as a medium. Due to the rapid growth of the world's population, breeding useful plants is a major focus of biological research. on the one hand,
There is research into alternative renewable sources of food, energy and raw materials. For example, new plant species, especially pathogens (e.g. phytopathogenic insects, fungi, bacteria, viruses, etc.), increased resistance to environmental influences or locational conditions (e.g. heat, cold, wind, soil conditions, moisture, dryness, etc.) It is a hybrid species that has useful properties such as, or has increased formation of storage or storage substances in leaves, seeds, tubers, roots, stalks, etc. On the other hand, in addition to the increasing need for useful biomass, there is also an increasing need for pharmaceutically acceptable active ingredients of plant origin and their derivatives, such as alkaloids, steroids, etc. And because of their low yields from natural sources, they are increasingly becoming available by alternative methods, such as extraction from genetically engineered plant species. There is therefore increasing interest in the practical possibilities of selectively manipulating large numbers of plant species. It is known that isolated totipotent cells of higher plants can be induced to produce embryonic cell aggregates and in some cases viable and fertile plants in or on media containing polymers. However, the relatively stiff cell wall usually constitutes an almost insurmountable barrier to operations such as cell fusion or gene transplantation, so in these cases it is advantageous to use naked protoplasm. And the protoplasm contains enzymes (pectinase,
The corresponding totipotent intact cells are obtained by removing the cell wall in a known manner with the aid of cellulases, etc.). Until now, agar was commonly used as a coagulant for culturing plant cells and, in special cases, also protoplasm. However, agar is toxic to most protoplasm types. Only a few exceptional cases are known in which particularly robust protoplasm can be successfully cultured in agar. For this reason, research has recently begun to find other useful media. Among other materials, alginate and agar were found to have equally good plating properties [Adao Harbanaso, N., Roscoe, D. H. (1982), Plant Science Letters 25:61- 66 (Adaoha−
Mbanaso EN, Roscoe, DH (1982), Plant
Sci. Let. 25:61-66)]. Agarose has hitherto been used only for culturing animal cells and microorganisms. However, culturing plant cells presents a highly variable set of problems due to their very different physiologies. Techniques for culturing animal cells are necessarily not applicable to propagating plant cells or forming cell aggregates from plant cytoplasm. It is therefore an object of the present invention to avoid the difficulties arising from the use of agar or purified agar for the growth of cell cultures formed from plant protoplasm, and to avoid the phytotoxic effects of the medium and to It is an object of the present invention to provide a general method which is applicable not only to particularly robust types, but also to all protoplasmic types, by means of which it is possible to culture embryonic plants. This objective is achieved in a surprising manner by the method of the invention. Agarose is one of the constituents of agar. The commercially available agar consists primarily of a mixture of neutral agarose and ionic agaropectin with a large number of side groups. Commercially available agarose is obtained from agar by methods conventional in the industry. Usually many side chains are left intact and define physicochemical properties such as gel formation and melting point. Agarose that melts and gels at low temperatures is obtained, for example, after introducing hydroxyethyl groups into the agarose molecule. Agarose modified by this method is referred to throughout this specification as LMT (low melt) agarose. Surprisingly, the difficulties arising from the growth of plant cells formed from protoplasm in agar, particularly the high mortality rate of protoplasm, are virtually greatly reduced or completely eliminated by the use of agarose in place of agar. has now been discovered. Agarose, especially
By using medium solidified with LMT agarose, we also plated the protoplasm, cut the solidified medium into even smaller pieces, and cut the above small pieces until cell aggregates of the desired size are formed. The proliferation of cells formed from protoplasm can be further stimulated by culturing them individually or in groups in a nutrient solution. Types of protoplasm with different uses of agarose,
In particular, it would be possible to significantly enhance the ability to form cell cultures from sensitive protoplasm, so that protoplasmic types that hitherto could not be cultured could now be completely extracted from cell aggregates. It was completely unexpected that it could be stimulated to form even large plants. The invention therefore comprises: a) regenerating from the separated protoplasm or protoplasm and plating the separated cells homogeneously in or on an agarose-clotted medium, optionally b pre-treated and solidified this medium; A method of culturing a growing aggregate of plant cells comprising cutting into small pieces and transferring said pieces into a liquid nutrient solution and continuing to culture until the aggregate of cells reaches the desired size. It is something. As used throughout this specification, the term "cell aggregate" is understood to mean a culture consisting of a measurable number of plant cells up to a complete plant. Particularly preferred embodiments of the invention include: a) uniformly plating the separated protoplasm in or on an agarose-coagulated medium, optionally b) cutting the pretreated and coagulated medium into small pieces, the volume of the pieces being 1 to 10,000 times the amount, preferably 5 to 10,000 times the amount of
Incubate the above pieces in a liquid nutrient solution suitable for culturing plant cells in 10,000 times the volume and most preferably 20 to 100 times the volume and 0 to 40 times the volume until the cell culture reaches the desired size. It is a method of culturing a proliferating aggregate of plant cells that consists of continuing culturing at a temperature range of .degree. A particularly advantageous temperature range for culturing cell aggregates is 12 to 30°C. The technical and commercial propagation of plants from protoplasm is of great interest. The novel method of the present invention comprises a convenient modification of the plating method conventionally used to regenerate microorganisms as follows. That is, the protoplasm, which has been isolated, sterilized, and purified by a known method, is placed in a medium solidified with agarose instead of agar, and the protoplasm is plated on the aforementioned medium to bury the protoplasm. Cut the agarose solidified medium into smaller pieces, preferably of the same size, and transplant the pieces, singly or one after the other, into a container partially filled with a suitable nutrient solution to obtain cells of the desired size. It consists of constantly shaking the container in the dark or in the light at a predetermined temperature range until a mass or a plant capable of budding growth is formed. Agarose pieces in which cell aggregates are embedded are also suitable for large-scale cultivation in bioreactors to obtain useful natural products. The embryonic plant can be developed into a mature plant with particularly useful properties, such as a hybrid plant, and can be further propagated by conventional biological methods. In the specification of the present invention, the term "small pieces" refers to particles having an average cross section of 1 to about 100 mm, preferably 2 mm.
60mm to 60mm, and preferably 2 to 60mm
10 mm three-dimensional irregular or preferably regular structures, such as disks, spheres, cubes, prisms,
It means a cone, etc. Spherical pieces having an average diameter are particularly preferred for large-scale cultivation of cell aggregates in fermenters. The method of the present invention is more effective than all known methods, especially for creating cell colonies and subsequent cultures from recalcitrant or problematic protoplasm. It is characterized by simplicity and can be used for culturing protoplasm of different strains and for fusion and genetically engineered protoplasm. This method is suitable for selectively culturing plant cells that have one or more of the aforementioned beneficial properties. Additionally, it can also be used to culture plant cells from protoplasm obtained from tumor tissue. The use of agarose for culturing plant cells or plant colonies is therefore a key feature of the invention. Furthermore, since different agaroses differ only in degree with respect to their use in the method of the invention, and all are superior to agar for culturing plant cell colonies from protoplasm, it is important to know which type of agarose to use. It doesn't matter. Although the experimental results of Examples 1 to 6 clearly demonstrate that agarose is superior to agar for culturing plant cells from protoplasm, certain practical problems also arise when using agarose. arise. Thus, during the process of formation, cell aggregates may undergo growth arrest or even death at advanced stages of growth. The cause of growth cessation may be a type of nutrient solution depletion, while cell death may be the result of an increase in toxic substances released by the growth of cell aggregates. However, surprisingly both undesirable effects can be eliminated by simple methods. The primary agarose-solidified medium on which the protoplasm was plated is cut into smaller pieces, preferably of the same size or shape, and these pieces are then shaken, preferably containing a sufficient amount of a suitable liquid nutrient solution. If transferred to a container, the cell aggregates are observed to grow unhindered. Depending on the type of protoplasm, 0 to 7 days after plating the protoplasm, usually 3 to 4 days.
It can be advantageous if the agarose-solidified medium is cut into small pieces on a daily basis. The best time for Tsukuba morning glory is the fourth day after plating, and for tobacco and Crepis capillaris it is the third day. When plating turnip protoplasm, cutting into pieces is most preferably done immediately after solidification of the agarose. In addition to the use of agarose as a coagulating agent for the culture medium, the cutting of the protoplasm-filled agarose-coagulated medium into suitable pieces also constitutes an important object of the invention. Furthermore, the object of the present invention is also the cell aggregates and/or plants produced by the aforementioned method. To accelerate cell growth, the nutrient solution used in the method of the invention may also contain trace amounts of organic compounds. Carbon sources such as the vitamins cane sugar and glucose, plant hormones such as auxin and cytokinins, and natural extracts such as malt extract or palm fruit juice and other useful ingredients if necessary. It is.
The culture conditions, such as the temperature of the nutrients, the exposure to light and the duration of the culture, can be adapted to the respective conditions, such as the plant species and type of protoplasm or the scale of the experiment. The following production examples a to c are used to culture useful protoplasm.
Shown below. In these examples, the initial cell culture is grown in any organ or tissue of the plant, such as roots, stalks, leaves,
It can be started from flowers, seeds, pollen, etc., and also, for example, from callus cultures. Techniques for culturing protoplasm are known and are not limited to the species shown in Examples a-c. Preparation Example for the Cultivation of Pure Protoplasm Example a: Cell suspension cultures of a supplementary nutritional mutant cell line of Hyoscyamus muticus sp.
0.25 mol sorbitol, 0.0025 mol calcium chloride dihydrate and 0.5 w/v% 4 w/v in 2-(n-monopholino)ethanesulfonic acid (MES) (PH5.2)
v% Cellulase Onozuka R.10 (available from Yakult Co., Ltd., Japan), and 2w/v% Driselase (Chemische Fabrics, Switzerland).
Fabrik Schweizerhalle). The mixture was incubated overnight at 26°C,
Then, it is filtered through a 100 μm wire mesh. The filtrate is then diluted with an equal volume of 0.6 molar sucrose solution. The diluted filtrate was mixed with 0.16M calcium chloride dihydrate and
Cover with an overlay solution of 0.5w/v% MES (PH5.6).
The protoplasm is collected from the interface of the layers, washed twice with overlay solution, and cultured in complete medium B1 of Gebhardt et al. (1981) Planta 153:81-89. Medium B1 is designated below as nutrient medium A. Example b: Protoplasm of tobacco (Nicotiana tabacum), strain VR2 was prepared by Shillito et al. (1981).
Separation as described by Mutat.Res.81:165-175. The procedure for purifying these protoplasms is modified as follows. Following incubation in the enzyme solution, half the 0.6M sucrose solution is added and the diluted mixture is covered with a calcium chloride overlay solution as in Example a. The protoplasm is collected at the interface and washed with the same calcium chloride solution. The procedure is further repeated as described in Example a and the protoplasm is cultured in medium K3 (denoted below as medium B). Example c: Haploid “Mitchell” obtained from M. Hanson of Charlottesville, Virginia, USA [PMB Newsletter, 1980] and mutagenic gene Tsukubane Morning Glow (Potrykus I) (1970) Z.Pflanzen-zuchtuug
63:24-40] Separation of the protoplasm of two strains of Tsukubane Asagao hybrida. Young, fully expanded leaves were sterilized with a solution of 0.01 w/v mercury dichloride and 3 drops of Tween 80 in 100 ml and treated with a fungicide diluted in water for 5 minutes.
Wash twice. Stack 6 semilobes without mesolobes and add Osmoticum (0.375 mol of anitol, 0.05 mol of calcium dichloride, 0.5 w/v of MES)
% PH 5.8) and cut into thin sections 5 mm wide. The section was placed in an enzyme solution (in the permeate solution).
0.2w/v% Cellulase Onozuka R.10 and
0.2w/v% Macerozyme solution,
Infiltrate under reduced pressure (PH5.6). After overnight incubation at 12° C. in the dark, 1 volume of the above permeate is added and the mixture is filtered through a 100 μm mesh.
The cytoplasm is washed twice with permeate and overlaid with 0.6 molar sucrose to remove debris. The protoplasm from the interface was washed once again with osmotic solution and added to the medium [DP: Durant et al. (1973),
Z.P.
Pflanzenphysiol) 69:26-34] 1 in the dark at 26℃
Incubate for 12 hours per day. The results reported in the comparative tests below demonstrate that when culturing plant cell aggregates from protoplasm, a) by replacing agar with agarose, and b by cutting the agarose-solidified medium and placing it in a shaken liquid medium. Convincingly explains the surprising beneficial effects observed. Comparative test example a of agar and agarose as media All nutrient solutions are sterilized by ultrafiltration through a 0.22 μm Nalgene filter. The solidified medium is made by mixing an equal volume of a 2x concentrated nutrient solution with a 2x concentrated and autoclaved gelling agent. Suitable liquid nutrient solutions include, for example, A, B, C,
The media listed in D and E are: A. Complete medium B1: Gebhardt et al.
Planta, 153, 81-89 (1981) B K3 medium: Nagy and Malig, Z. Pflanzenphysiologie 78, 453-
455 (1976) C DPD medium: Durand et al., Z.
Pflanzenphysiologie) 69, 26-34 (1973) D Lindsmaier,
EM) and Skoog, F.'s medium, Physiologia plantime (Phy-
Nitsch, JP and Nitsch, C., Science 163, 85-87 (1969). The gelling agents used are: 1 Agarose: Sea Plaque LMT (Marine Colloids) in all tests. [Only in the tests reported in Example 5 are the other agaroses used identified there] 2 Agar: Difco Bacto-agar in all tests. 3. Purified agar: 454 g of agar (same as in 2) above) are washed successively with 10 parts of water, 5 parts of acetone and 5 parts of ethanol and dried at 40°C under reduced pressure. A white odorless powder is obtained. The protoplasm obtained in Examples a to c is plated in a thin layer on the solidified and purified medium by conventional plating methods in Petri dishes. Agar and agarose, unless otherwise specified, 0.4w/v%
Use at a concentration of A total volume of 3 ml or 10 ml of medium is used for a 6 cm or 10 cm Petri dish, respectively. For experiments using small pieces of agar or agarose, the protoplasm is plated uniformly on the medium before dividing the medium into small pieces. Then cut the piece into diameter
Place in 30 ml of nutrient solution in a 10 cm container and incubate in the dark or light at 26°C on a rotary shaker. The liquid medium is replaced at regular intervals or constantly. Microscopic evaluation of the usefulness and beneficial effects of the method on the formation of cell colonies from protoplasm is carried out by counting and examining cell aggregates in representative numbers of cages after 4 to 6 weeks of culture. In the fragmentation experiment, dishes containing the fragments floating in the nutrient solution are photographed at 14 day intervals and the number and size of cell aggregates visible in the fragments is assessed. β Test Results Example 1: Number of cell aggregates regenerated from a plate of 10 5 cells or protoplasm of Hyostiamus muticus sp., strain B9 (trip - ) in 10 ml of clotting medium B.
【表】
実施例１の結果は、細胞の培養及び原形質から
の細胞の培養の両方のために寒天よりもアガロー
スがより適していること、そして寒天がこの実験
で用いた原形質及び細胞に対して毒であることを
表わしている。この実験及び下記の実験例におい
て密度／mlは培地１ml当りの原形質または細胞の
数を意味するものと理解される。
実施例 ２：培地Ｂにおいて希釈度の増加にとも
なうタバコVR2原形質の平板培養の効率（％）[Table] The results of Example 1 demonstrate that agarose is more suitable than agar both for culturing cells and for culturing cells from protoplasm, and that agar is more suitable for protoplasm and cells used in this experiment. It means that it is poisonous. In this experiment and the experimental examples below, density/ml is understood to mean the number of protoplasm or cells per ml of medium. Example 2: Efficiency (%) of plating tobacco VR2 protoplasm with increasing dilution in medium B
【表】
＊＝計数に密すぎるほどの細胞の芝生
[Table] * = Lawn of cells too dense for counting
Claims (1)
せ、分離した細胞をアガロース凝固培地中または
上で均一に平板培養すること、所望により ｂ
予備処理及び凝固した培地を小片に切断しそして
上記の小片を液体栄養溶液中に移すこと、そして
その細胞の集合体が所望の大きさになるまで培養
を続けることからなる増殖植物細胞集合体を培養
するための方法。 ２ ａ 分離した原形質または原形質から再生さ
せ、分離した細胞をアガロース凝固培地中または
上で均一に平板培養すること、所望により ｂ
予備処理及び凝固した培地を小片に切断し、小片
の体積の１ないし10000倍量の、植物細胞を培養
するのに適当な液体栄養溶液中に上記の小片を入
れること、そしてその細胞の集合体が所望の大き
さになるまで０ないし40℃の温度範囲で培養を続
けることからなる特許請求の範囲第１項記載の方
法。 ３ 操作した原形質またはすでに再生した細胞壁
を有する操作した原形質を使用することからなる
特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかに
記載の方法。 ４ 操作が遺伝子または小器官の移植または細胞
融合である特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５ 培養温度が12ないし30℃の範囲にある特許請
求の範囲第１項ないし第４項のいずれか一項に記
載の方法。 ６ 小片の体積の５ないし10000倍量の、植物細
胞を培養するのに適当な栄養溶液に小片を入れる
ことからなる特許請求の範囲第２項記載の方法。 ７ 小片の体積の20ないし100倍量の、植物細胞
を培養するのに適する栄養溶液に小片を入れるこ
とからなる特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８ 原形質で平板培養した後、アガロース−凝固
一次培地を０ないし７日の間隔で小片に切断する
ことからなる特許請求の範囲第６項記載の方法。 ９ 平板培養の後、３ないし４日の間隔で小片に
切断することからなる特許請求の範囲第８項記載
の方法。 １０ 等しい大きさ及び規則的な形で１ないし
100mmの平均直径を有する小片を使用することか
らなる特許請求の範囲第１項ないし第９項のいず
れか一項に記載の方法。 １１ ２ないし60mmの平均直径を有する小片の使
用からなる特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２ 小片が２ないし10mmの平均直径を有する円
盤、球体、立方体、角柱または円錐である特許請
求の範囲第１１項記載の方法。 １３ 植物の種（species）のタバコ
（Nicotianatabacum）、ヒヨスチアムス ムチク
ス（Hyo−scyamus muticus）、とまと
（Lycopersicon esculentum）、クレピス カピラ
リス（Cre−pis capillaris）、かぶ（Brassica
rapa）またはつくばねあさがお（Petunia
hybrida）から分離した原形質の使用からなる特
許請求の範囲第１項ないし第１２項記載のいずれ
か一項に記載の方法。 １４ シー プラク（Sea Plaque）LMT，
LMP、タイプ ，HGT，HGTP，LE スタ
ンダード LMTまたはシー プレプ（Sea
Prep）のタイプのアガロースを使用することか
らなる特許請求の範囲第１項ないし第１３項記載
のいずれか一項に記載の方法。 １５ 原形質または再生した細胞壁を有する原形
質を含有するアガロース−凝固小片を生物反応器
中で大規模培養するために使用することからなる
特許請求の範囲第１項ないし第１４項のいずれか
１項に記載の方法。 １６ 生育できる植物（Viable plants）が発生
するまで、培養を行うことからなる特許請求の範
囲第１項ないし第１１項のいずれか１項に記載の
方法。[Scope of Claims] 1 a. Regeneration from the separated protoplasm or protoplasm and uniformly plating the separated cells in or on an agarose coagulation medium, optionally b
Propagating plant cell aggregates by cutting the pretreated and solidified medium into small pieces and transferring the said pieces into a liquid nutrient solution and continuing to culture until the cell aggregates reach the desired size. Method for culturing. 2 a Regeneration from the isolated protoplasm or protoplasm and plating the isolated cells homogeneously in or on agarose clotting medium, optionally b
Cutting the pretreated and solidified medium into small pieces, placing the pieces in a liquid nutrient solution suitable for culturing plant cells in an amount of 1 to 10,000 times the volume of the pieces, and aggregation of the cells. 2. The method according to claim 1, which comprises continuing culturing at a temperature range of 0 to 40° C. until the desired size is reached. 3. A method according to claim 1 or 2, which comprises using engineered protoplasm or engineered protoplasm with already regenerated cell walls. 4. The method according to claim 3, wherein the manipulation is gene or organelle transplantation or cell fusion. 5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the culture temperature is in the range of 12 to 30°C. 6. A method according to claim 2, comprising placing the pieces in a nutrient solution suitable for culturing plant cells in an amount of 5 to 10,000 times the volume of the pieces. 7. A method according to claim 6, comprising placing the pieces in a nutrient solution suitable for culturing plant cells in an amount of 20 to 100 times the volume of the pieces. 8. The method of claim 6, comprising cutting the agarose-solidified primary medium into small pieces at intervals of 0 to 7 days after plating with the protoplasm. 9. A method according to claim 8, which comprises cutting into small pieces at intervals of 3 to 4 days after plating. 10 1 or 1 of equal size and regular shape
10. A method as claimed in any one of claims 1 to 9, comprising using pieces having an average diameter of 100 mm. 11. A method according to claim 10, comprising the use of small pieces having an average diameter of 112 to 60 mm. 12. The method of claim 11, wherein the pieces are disks, spheres, cubes, prisms or cones with an average diameter of 2 to 10 mm. 13 Plant species Nicotianatabacum, Hyo-scyamus muticus, Lycopersicon esculentum, Cre-pis capillaris, Brassica
rapa) or Tsukubane Asagao (Petunia)
13. A method according to any one of claims 1 to 12, comprising the use of protoplasm isolated from A. hybrida. 14 Sea Plaque LMT,
LMP, Type, HGT, HGTP, LE Standard LMT or Sea Prep (Sea
14. A method according to any one of claims 1 to 13, which comprises using an agarose of the type Prep). 15. Any one of claims 1 to 14 consisting in the use of agarose-clotted pieces containing protoplasm or protoplasm with regenerated cell walls for large-scale cultivation in a bioreactor. The method described in section. 16. The method according to any one of claims 1 to 11, which comprises culturing until viable plants emerge.
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