JPH04323559A - 免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［発明の目的］

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、磁性微粒子を利用して
サンプル内の抗原量を測定する免疫測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】サンプル（検体）中の特定の抗原量の定
量分析には従来の放射性元素を用いるＲＩＡ（ラジオイ
ムノアッセイ）法が行われている。しかしこのＲＩＡ法
は放射性元素を用いるために、専用の機器を設置し、資
格を有するオペレータが操作を行わなければならず、し
かも廃棄物の処理に注意を要する等の煩わしさがある。

【０００３】このためこのＲＩＡ法に代わり酵素反応を
利用して分析を行うようにしたＥＩＡ（エンザイムイム
ノアッセイ）法が行われてきている。そして最近になっ
てこのＥＩＡ法の中でも迅速を図る目的で磁性材料のよ
うな抗体固定化微粒子を利用した分析法が普及してきて
いる。

【０００４】図１３はこのようなＥＩＡ法の原理を説明
するもので、先ず第一抗体（第一試薬）２が固定された
磁性微粒子（Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ；以
下ＭＰと称する）１の溶液が用意され、これに測定すべ
き抗原３を含んだ検体（サンプル）４を分注することに
より第一の抗原・抗体反応が生じて抗原３の一部は第一
抗体２に結合される。結合しない抗原３′はフリー状態
で存在している。 従って磁石を用いＭＰ１を吸着することにより集合させ
た状態でフリーの抗原３′を除去し、いわゆるＢ／Ｆ分
離を行う。次に酵素５で標識された第二抗体（第二試薬
）６を分注することにより第二の抗原・抗体反応が生じ
て、測定したい抗原３はＭＰ１と酵素標識抗体６の一部
と結合してサンドイッチ状にされる。結合しない酵素標
識抗体６′はフリー状態で存在している。従って前記同
様に磁石を用いることによりＢ／Ｆ分離を行って、フリ
ーの酵素標識抗体６′を除去する。

【０００５】次にこれに基質液（第三試薬）７を分注す
ることにより第三の反応いわゆる酵素反応が生じて反応
生成物８が生成される。この抗原３には酵素５が結合さ
れているので、第三の反応状態を吸光法によって測光す
ることにより、酵素５の量に比例した抗原３の量が測定
できることになる。

【０００６】図１２はこのような原理に基いた免疫測定
方法を説明するもので、先ず反応容器１０例えば角形状
のガラス容器を用意しこれにサンプル４を分注する。次
にＭＰ１溶液をこれに分注することにより第一の反応が
生ずる。なおサンプル４とＭＰ１溶液の分注順序はいず
れでもよい。第一の反応によってサンプル４内の抗原３
の一部は第一抗体２に結合するので、続いて結合しない
でフリー状態で残っている抗原３′が次反応に影響を与
えるのを防止するため、磁石１１を用いて反応容器１０
に接近させることによりＭＰ１を吸着して集合させた状
態で、フリーの抗原３′を含む不要液をノズルで吸引し
て除去してＢ／Ｆ分離を行う。

【０００７】次に反応容器１０内に過剰の洗浄液（一般
に緩衝液）を吐出し、撹拌して液を分散した後磁石１１
を再び用いてＢ／Ｆ分離を行って残っている未反応（過
剰）の抗原３′を吸引して除去する。続いて第二抗体（
第二試薬）６を分注した後、洗浄液を吐出して撹拌を行
う。以下図１３の原理に従ってこのような反応が繰返さ
れる。

【０００８】このようなＥＩＡ法による免疫測定方法で
は、反応途中において反応液に含まれていた過剰の抗原
又は酵素標識抗体を次反応に影響を与えないようにＢ／
Ｆ分離によって除去することが重要である。一般にＥＩ
Ａの場合反応容器１０内に用意される反応液量は５０乃
至２００μｌであるのに対し、Ｂ／Ｆ分離のために用い
られる洗浄液量は反応液量の２倍乃至数倍が用意される
のが普通である。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】ところで従来の免疫測
定方法では磁性微粒子を効果的に利用するのが困難なの
で、反応効率が悪いという問題がある。これは反応時と
Ｂ／Ｆ分離時では液の深さが異なるので、磁石を最適位
置に配置するのが困難であるという事に起因している。 例えば磁石を反応液量の少ない方に合わせて配置すると
洗浄時における磁性微粒子の集合が不良となり、逆に磁
石を反応液量の多い方に合わせるとＢ／Ｆ分離後の次反
応時の磁性微粒子の分散が不充分となる。これは前記の
ように洗浄液量に比べ反応液量（特に試薬液量）が少な
いので、反応容器の壁面に磁性微粒子が残ってしまうた
めである。いずれの場合も磁性微粒子を効果的に利用す
るのが困難となる。この結果反応効率が悪くなるので測
定データ不良が生じ易い。

【００１０】本発明は以上のような問題に対処してなさ
れたもので、磁性微粒子を効果的に利用して反応効率を
向上するようにした免疫測定方法を提供することを目的
とするものである。

【００１１】［発明の構成］

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に本発明は、反応容器内にサンプル及び少なくとも抗体
固定化磁性微粒子液を分注し、前記サンプル内の抗原と
反応した抗体固定化磁性微粒子を磁石によって吸着した
状態で反応しない抗原を含む不要液を除去する免疫測定
方法において、前記反応容器内の反応液量に応じて磁石
を反応容器の管壁の深さ方向に沿って移動可能に配置す
ることを特徴とするものである。

【００１３】

【作用】反応容器内の反応液量に応じて磁石を反応容器
の管壁の深さ方向に沿って移動可能に配置するので、反
応液量が少ないときは磁石の位置を深くまた反応液量が
多いときは磁石の位置を浅くなるように自在に移動して
Ｂ／Ｆ分離を行うことができる。これによって磁性微粒
子を効果的に利用することができるので、反応効率を向
上することができる。

【００１４】

【実施例】以下図面を参照して本発明の免疫測定方法の
実施例を説明する。

【００１５】実施例１ 反応容器１０として図１のように内径５ｍｍ×６ｍｍ，
長さ４０ｍｍの角形状のガラス管を用意し以下の反応を
行った。

【００１６】先ず磁性微粒子（以下ＭＰと称する）のけ
んだく液（アドバンスト・マグネッチク社製）を１０μ
ｌ反応容器１０に分注し、次に１００乃至４００μｌの
０．１Ｍりん酸緩衝液（ＰＨ６．５）を加え撹拌して均
一化した後、図２のように反応容器１０に磁石１１を近
接させてＭＰを吸着することにより集合させた。反応容
器１０内の液量を変化させ、各々の場合につきＭＰが最
も速く吸着される磁石１１の深さ方向の中心位置ｈを測
定したところ次の表１のような結果が得られた。

【００１７】

【表１】

【００１８】なおいずれの場合もＭＰは約３０秒以内に
反応容器１０の壁面に吸着された。表１から明らかなよ
うに液量に応じて磁石１１の深さ方向の位置を変化させ
ると、液のＭＰを効率良く吸着できることが確かめられ
た。

【００１９】実施例２ 実施例１と同様な条件で１０μｌのＭＰ液と４００μｌ
の０．１Ｍりん酸緩衝液を反応容器１０に分注して混合
した。次に磁石１１を反応容器１０に近接させ深さ方向
の位置を変えて、各々の場合にて約３０秒間ＭＰの吸着
を行った。この状態で混合液の上澄の吸光度を６６０ｎ
ｍの波長で測定し、この結果に基きＭＰの集合率を測定
した。すなわち図３，図４のように、反応容器１０内の
混合液の６６０ｎｍの吸光度Ａ１　（１００％）を測定
した後、図５，図６のようにＭＰを集合させた状態で６
６０ｎｍの吸光度Ａ２　を測定し、（Ａ１　−Ａ２　）
％を集合率とした。この場合の磁石位置と集合率との関
係は表２のような結果が得られた。

【００２０】

【表２】

【００２１】表２から明らかなように、この場合の磁石
１１の最適位置は集合率が最大となる７ｍｍであること
を示している。この表２から磁石１１が最適位置から外
れるとＭＰの集合率が低下して、ＭＰの効果的な利用が
妨げられることが確かめられた。

【００２２】実施例３ 実施例２と同様な条件でＭＰとりん酸緩衝液との混合液
４００μｌを用意し、磁石１０を反応容器１０の底面か
ら７ｍｍの高さ位置に配置してＭＰの集合を行った。次
に反応をＡ，Ｂの２系統に分けて続けた。

【００２３】Ａ系統は図７のようにそのままで１分間放
置した。Ｂ系統は１５秒毎に図８乃至図１１に示すよう
に段階的に高さ位置を各々７ｍｍ，５ｍｍ，３ｍｍ，１
ｍｍに変化させた。各系統共に１分後上澄を除去し、新
たに各反応容器１０（図７及び図１１のもの）に対して
１００μｌの緩衝液を加えた。続いて回転形撹拌子を用
いて各混合液を撹拌した後、けんだく液５０μｌを用い
て各々２０倍に希釈して６６０ｎｍの吸光度を測定した
。以上のような反応を１０回繰返すことにより表３に示
すような結果が得られた。

【００２４】

【表３】

【００２５】なお６６０ｎｍの標準吸光度を５５０とし
た。

【００２６】表３から明らかなように、Ｂ系統のように
経時的に磁石１１の位置を変化させてＭＰを移動させれ
ば、平均吸光度は標準値に近くなりこの結果分散値及び
ばらつき率が小さく押えられることを意味している。こ
れによってＢ／Ｆ分離の洗浄から次工程の反応に移る際
、磁石１１の位置を低い方に移動させてＭＰを反応容器
１０の底面に移動させることにより、液中におけるＭＰ
の再分散値を向上できることが確かめられた。なおＡ系
統においては、前述したように洗浄液に比べて試薬量が
少ない場合には、ＭＰが反応容器１０の壁面に残ってし
まうので、分散されないため望ましい結果が得られない
。

【００２７】このように本発明実施例によれば、反応容
器内の反応液量に応じて磁石を深さ方向に沿って移動さ
せるようにしたので、Ｂ／Ｆ分散時の磁性微粒子の集合
率が向上するので損失を防止できる。またＢ／Ｆ分散後
の磁性微粒子の分散性を向上することができる。これに
よって磁性微粒子を効果的に利用することができるので
反応効率を向上でき、測定データの信頼性を改善するこ
とができる。

【００２８】なお磁石の配置態様は任意に設定すること
ができ、例えば複数の磁石を反応容器に対向して配置し
ておき各磁石の位置を反応過程に応じて高い位置に又は
低い位置に配置することができる。また反応容器に沿っ
て磁石を上下方向に移動しても良い。あるいは反応容器
に沿って複数の磁石をその上下方向の位置を少しずつ変
化させながら配置し、反応容器をその並べられた磁石に
沿って移動させることにより、内部の磁性微粒子を目的
の位置まで誘導することが可能である。

【００２９】

【発明の効果】以上述べたように本発明によれば、反応
容器内の反応液量に応じて磁石を反応容器の深さ方向に
沿って移動可能に配置するようにしたので、磁性微粒子
を効果的に利用でき反応効率を向上することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の免疫測定方法の第１の実施例を示す斜
視図である。

【図２】本発明の免疫測定方法の第１の実施例を示す側
面図である。

【図３】本発明の第２の実施例を示す上面図である。

【図４】本発明の第２の実施例を示す側面図である。

【図５】本発明の第２の実施例を示す上面図である。

【図６】本発明の第２の実施例を示す側面図である。

【図７】本発明の第３の実施例を示す側面図である。

【図８】本発明の第３の実施例を示す側面図である。

【図９】本発明の第３の実施例を示す側面図である。

【図１０】本発明の第３の実施例を示す側面図である。

【図１１】本発明の第３の実施例を示す側面図である。

【図１２】免疫測定方法を説明する工程図である。

【図１３】ＥＩＡ法の原理の説明図である。

【符号の説明】

１０　　反応容器 １１　　磁石

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　反応容器内にサンプル及び少なくとも
   抗体固定化磁性微粒子液を分注し、前記サンプル内の抗
   原と反応した抗体固定化磁性微粒子を磁石によって吸着
   した状態で反応しない抗原を含む不要液を除去する免疫
   測定方法において、前記反応容器内の反応液量に応じて
   磁石を反応容器の管壁の深さ方向に沿って移動可能に配
   置することを特徴とする免疫測定方法。
2. 【請求項２】　　反応容器にさらに酵素標識抗体液を分
   注し、抗原に酵素標識抗体を反応させて抗原を抗体固定
   化磁性微粒子とでサンドイッチ状にした後、磁石によっ
   て抗体固定化磁性微粒子を吸着した状態で反応しない酵
   素標識抗体を含む不要液を除去する請求項１記載の免疫
   測定方法。
3. 【請求項３】　　磁性微粒子を吸着した状態の磁石を管
   壁を移動させて前記磁性微粒子を目的位置まで移動させ
   る請求項１又は２記載の免疫測定方法。