JPH0432078B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生育培地の１成分として、ことに細
胞の培養において、有用であるコレステロールに
富んだ分画を哺乳動物の血漿または血清から単離
しかつ精製することに関する。

ウシ血清から得られるコレステロールおよびコ
レステロール含有分画が種々の有機体の生育を促
進するために有用であることは知られている。ジ
ヤーナル・オブ・バクテリオロジー（J.
Bacteriol.）、vol.135、818−827ページ（1978）
は、マイコプラズマ・ニユーモニアエ
（Mycoplasma pneumoniae）およびマイコプラ
ズマ・アルスリチジス）Mycoplasma
arthritidis）の生育におけるコレステロール含有
血清分画の使用を記載している。ジヤーナル・オ
ブ・マイクロバイオロジー（J.Gen.
Microbiology）、vol.116、539−543ページ
（1980）は、トレポネマ・ハイオジセテリアエ
（Treponema hyodyseteriae）の生育における
USPコレステロールの使用を記載している。米
国特許第4290774号は、哺乳動物の血漿または血
清から総合的な方法により特定のコレステロール
分画を生産することを記載している。この総合的
な方法は、アルカリ金属炭酸塩およびアルカリ土
類金属塩で処理して変性蛋白質類を沈殿させかつ
それらを可溶性コレステロールから分離する工程
を含む。生ずる生産物はコレステロール標準物質
区として主として有用である。また、この特定の
コレステロール濃縮物は、米国特許第4403042号
に記載されているように、細胞膜の抗原および対
応する抗体の検出において使用することもでき
る。Zeit.Klin.Chem.6(3)、186−190ページ
（1968）は、コロイド状ケイ酸の使用によりヒト
血清からある種の脂蛋白質の除去を記載してい
る。上の先行技術のいずれも、本発明の特定の方
法またはそれにより生産される特定のコレステロ
ールに富んだ分画を開示あるいは示唆していな
い。

種々の哺乳動物の細胞を生育させて、例えば、
このような細胞への化学物質の作用をスクリーニ
ングし、癌の研究のための細胞を生産すること、
および引き続く研究、診断または治療の目的のた
めの代謝物および抗体を生産する。これらの哺乳
動物の細胞は、通常10〜15容量％のウシ胎児血清
を含有する適当な栄養培地中で生育させる。これ
の血清水準はこのような化合物培養条件下で適切
な細胞の生育に一般に必須であることがわかつ
た。キヤンサー・リサーチ（Cancer Research）、
Vol.41、473−477ページ（1981年２月）は、哺乳
動物の癌細胞を生育させかつ維持するために10％
のウシ胎児血清を使用することを記載する典型的
先行技術である。エクストペリメンタル・セル・
リサーチ（Experimental Cell Research）、
Vol.131、31−40ページ（1981）は、15％のウシ
胎児血清を使用して哺乳動物の細胞を維持するこ
とを開示している。

ウシ胎児血清の使用は適切な細胞の生育に望ま
しいが、それはいくつかの欠点を有する。第１
に、それは比較的高価な物質であり、そしてその
使用は細胞培養のコストを大きく増加する。第２
に、ばらつきのない生育特性を有する血清を得る
ことは困難である。第３に、栄養培地中の血清は
精製および細胞が生育培地中に分泌する所望の蛋
白質または糖蛋白質の回収を妨害する。ウシ胎児
血清の含量を有意に減少さて上の欠点を最小にす
るとき、細胞の生育は劇的に削減される。

脂蛋白質、例えば、コレステロールは細胞の生
育いくつかの望ましい作用を有することがあるこ
とは知られいる。イン・ビトロ（In Vitroo）、
Vol.17、No.５、519−530ページ（1981）は、高い
密度の脂蛋白質とトランスフエリンとの混合物を
使用して血清の不存在下にある種の哺乳動物の細
胞を生育させることが可能であることを開示して
いる。上のキヤンサー・リサーチ文献は、また、
10％のウシ胎児血清を含有する培地中で癌細胞の
コレステロールの代謝機構を論じている。上のエ
クスペリメタン・セル・リサーチ文献は、また、
細胞のコレステロールの生合成を論じている。

上の先行技術のいずれも、先行技術と異なる方
法により生産されるコレステロールに富んだ分画
を使用して、有意に減少したウシ胎児血清におい
ておよびさらに血清不含培地中においてさえ、満
足すべき量の細胞の生育を達成できることを開示
あるいは示唆していない。

本発明によれば、次の工程： (a) 液状のコレステロールを含有する血漿または
血清あるいはその分画をシリカの吸着剤と接触
させてコレステロールを吸着させ、 (b) 吸着されたコレステロールを残りの液状の血
漿または血清から分離し、 (c) 吸着されたコレステロールを凍結しかつ融解
し、 (d) 吸着されたコレステロールをPH9.0〜11.5に
おいて溶離し、 (e) 溶離されたコレステロール溶液を限外濾過に
より濃縮し、 (f) 濃縮されたコレステロール溶液のPHを11.0〜
11.4の値に調節し、 (g) 濃緒されたコレステロール溶液に順番に炭酸
ナトリウムおよび水に対して透析し、 (h) 透析したコレステロール溶液を限外濾過によ
り所望のコレステロール水準にさらに濃縮し、 (i) 濃縮されたコレステロール溶液のPHを7.0〜
11.0の値に調節し、 (j) 濃縮されたコレステロール溶液を50〜100℃
に30分〜24時間加熱し、そして (k) 精製されたコレステロールに富んだ分画をそ
れから回収する、 からなることを特徴とするコレステロールを含有
する哺乳動物の血漿または血清あるいはその分画
からコレステロールに富んだ分画を単離しかつ精
製する方法が提供される。

この方法により生産されるコレステロールに富
んだ分画は、新規な物質であり、哺乳動物の細胞
の細胞培養生育のための栄養培地の１成分として
ことに有用であり、これにより適当な細胞の収量
が得られ、ウシ胎児血清の使用を有意に減少し、
そしてウシ胎児血清の使用をさくしさえする。

本発明において使用するための出発物質は、コ
レステロールを含有する任意の哺乳動物の血漿ま
たは前記の分画であることができる。適当な出発
物質は、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタまたはヒトの
血漿または血清あるいはコレステロールを含有す
るそれらの分画、例ば、フイブリノゲンに乏しい
血漿、コーンフラクシヨンＩ上澄み液、脂蛋白質
に富んだ硫酸アンモニウムなどであることができ
る。好ましい出発物質はウシ血清である。出発物
質が血清であるとき、可溶性塩、例えば、クエン
酸ナトリウムを0.25〜1.0のイオン強化に添加す
ることが好ましい。他の適当な塩は、塩化ナトリ
ウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸
アンモニウムおよび硫酸ナトリウムを包含する。
可溶性塩を上の濃度に添加すると、引続くシリカ
吸着工程において吸着されるコレステロールの量
は増加する。ウシまたはヒトの血漿は、例えば、
通常抗凝血剤としてクエン酸塩を添加することを
包含する方法により集められる。この塩の濃度は
通常吸着工程のために十分であり、そして追加の
塩は不必要である。

血漿または血清の出発物質を０〜50℃、好まし
くは20〜25℃の温度に維持する。PHは5.5〜9.0、
好ましくは7.0〜8.0の範囲に調節する。

本発明において有用なシリカ吸着剤は臨界の組
成をもたない。適当なシリカ物質はカボツト・コ
ーポレーシヨン（Cabot Corporation）から商標
カボシル（Cabosil）で入手可能な極微小シリカ
およびカリー・カンパニー（Cary Company）
から商標エーロシル（Aerosil）380で入手可能な
粉末状シリカである。このシリカは液状の血漿ま
たは血清に１〜50/1、好ましくは10〜20ｇ／１の
量で添加される。

液状の血漿または血清中のシリカの懸濁液は次
いで約３〜４時間混合する。次いで吸着したコレ
ステロールを含有するシリカを残りの液状の血漿
または血清から好ましくは遠心により分離し、そ
して液相を廃棄する。次いでシリカのペーストを
−20℃で凍結し、そしてこの温度に少なくとも１
週間、好ましくは２週間保持する。次いで、凍結
したペーストを室温（約20〜25℃）に24〜48時間
融解する。融解したペーストから絞り出される液
体を廃棄する。

シリカのペーストを洗浄して存在するかも知れ
ない望ましくない蛋白質を除去する。これは約
0.15モルの塩化ナトリウムを含有する塩水溶液中
にペーストを懸濁させることによつて達成され
る。他の有用な塩は酢酸ナトリウムおよびリン酸
ナトリウムである。この塩溶液はペーストの重量
の約２倍の量で使用する。ペーストを液体から分
離する。塩溶液を使用するここの洗浄手順は好ま
しくは２回反復して吸蔵された蛋白質を除去す
る。

洗浄されたペーストを約２容量の脱イオン水ま
たは蒸留水に懸濁させ、そしてPHを9.0〜11.5、
好ましくは10.4〜10.6に適当なアルカリ性物質、
例えば、水性水酸化ナトリウムの添加により調節
する。この懸濁液を約２時間撹拌し、その間PHを
上のアルカリ性物質の周期的添加により所望水準
に維持する。この処理は所望のコレステロール分
画をシリカから溶離する。次いで、懸濁液を12〜
24時間、好ましくは12〜18時間沈降させる。コレ
ステロールを含有する上澄み液をさらに処理する
ためサイホンで取り出す。所望のコレステロール
に富んだ分画の生産のためのこの最初の溶離物の
みを使用することが好ましい。しかし、上のアル
カリ性懸濁、溶離、撹拌および沈降の工程を２回
以上反復し、そして第１の溶離物質とともに第２
および第３の溶離からの懸濁液をプールすること
が可能である。シリカを廃棄する。

コレステロール溶液を濾過および遠心により清
澄にして微量のシリカを除去し、次いでその最初
の体積の15〜50％、好ましくは20％に限外濾過技
術により濃縮する。PHはアルカリの添加により
11.0〜11.4の範囲の値、好ましくはPH11.2に調節
する。これは引続く除去のために存在するかも知
れない残留シリカの可溶化を促進する。

次いで、コレステロールの濃縮物を処理して存
在する塩の実質的にすべてを除去する。好ましい
塩の除去技術は順次に炭酸ナトリウムおよび水に
対して透析することである。この塩の除去工程は
引続く熱処理工程のためのに重要である。塩の有
意な量の除去は加熱時のコレステロールの望まし
くない変性を起こすであろう。

透析したコレステロールの溶液を限外濾過によ
り50〜3000mg／dl、好ましくは1000〜2000mg／dl
のコレステロール水準に濃縮する。

次いで、濃縮したコレステロールの溶液のPHを
7.0〜11.0の生育、好ましくはPH7.6に調節して、
それを生育培地中における引続く使用に最も適合
するようにさせる。

この溶液を50〜100℃、好ましくは80℃に20分
〜24時間、好ましくは30分〜60分加熱して、コレ
ステロールの貯蔵安定性を増加する。この溶液を
室温に冷却し、そして減菌濾過して精製されたコ
レステロールに富んだ分画を回収する。この生産
物は純粋なコレステロールではなく、それは生産
プロセスを通過した少量の同定されない物質と混
合されている。

本発明のコレステロールに富んだ分画を栄養培
地の１成分として用いる細胞培養法において有用
である哺乳動物の細胞は、細胞の培養において使
用することが知られている種々の細胞であること
ができる。例示的な例は、マウス線維芽細胞、ハ
ムスターの赤ん坊の腎細胞、マウス骨髄腫細胞、
ウシ脈管内細胞、類表皮頚部癌細胞、子宮内腺癌
細胞、ハムスター肺癌細胞などである。スクリー
ニングの目的にとくに有用な細胞は、アメリカ
ン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン
（American Type Culture Collection）から、
それぞれ表示L929、BHK−21およびP3x63−
Ag8.653で入手されるマウス線維芽細胞、ハムス
ターの赤ん坊の腎細胞およびマウス骨髄腫細胞で
ある。

細胞は細胞の培養生育についてよく知られてい
る条件下で営養培中で生育させる。

上の細胞を生育させるために用いる栄養培地は
この分野においてよく知られてている。例はダル
ベツコの変性イーグル培地（Dulbecco′s
Modified Egle Medium）、（DME）、イーグル
最小必須培地（MEM）、イーグルのベルサル培
地（Basal）、ハム（Ham）の培地Ｆ−10、ハム
の培地Ｆ−12、RPMI 1640培地などである。こ
れらの栄養培地は、例えば、M.A.バイオプロダ
クツ（Bioproducts）およびシグマ・ケミカル・
カンパニー（Sigma Chemical Co.）から入手可
能である。また、すべての栄養培地は、一般に、
緩衝剤、例えば、HPES（Ｎ−２−ヒドロキシエ
チルピペラジン−N′−２−エタンスルホン酸）
を含有する。栄養培地は血清を含有しないか、あ
るいは好ましくは0.5〜2.5容量％のウシ胎児血清
を含有することができる。血清不含培地を使用す
るとき、それはよく知られた成分、例えば、バイ
ロゲン不含水、HEPES緩衝剤、ダルベツコの変
性イーグル培地、ハムの培地Ｆ−12、インシユリ
ン、トランスフエリン、テストステロン、亜セレ
ン酸ナトリウム、エタノールアミン、飽和および
不飽和の脂肪酸および安定化蛋白質を含有するで
あろう。このような血清不含培地はいくつかの商
業的源から手入可能である。１つの典型的な製品
はベントレツクス・ラボラトリーズ・インコーポ
レーテツド（Ventrex Laboratories、Inc.）か
ら入手可能なHL−１である。栄養培地は、ま
た、特定のコレステロールに富んだ分画のコレス
テロール含量に基づいてて計算して0.0005〜0.01
％（重量／容量基準）のコレステロールを含有す
る。培地は、好ましくは、特定のコレステロール
に富んだ分画のコレステロール含有に基づいて計
算して0.001〜0.002％（重量／容量基準）のコレ
ステロールを含有する。

次の実施例により、本発明をさらに説明する。

実施例 １ 新鮮なウシ血清を20〜25℃の温度にし、そして
14.7ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム（0.5の血清イ
オン強度）を添加した。生ずる溶液を30分間撹拌
し、そしてPHを適当量の1Nの水酸化ナトリウム
の添加により7.0とした。微細なシリカを10ｇ／
ｌの量で添加し、そして生ずるスラリーを室温で
３時間撹拌した。吸着した物質を含有するシリカ
を次いで液相から遠心により分離し、そして液体
を廃棄した。シリカのペーストを−20℃で凍結
し、そしてその温度で２週間貯蔵した。次いで、
凍結したペーストを室温で48時間融解した。絞り
出された液体を廃棄した。次いシリカのペースト
を２容量の0.85％（重量／容量基準）の塩化ナト
リウム水溶液（0.146モルのNaCl）中に懸濁させ
た。それを15分間おだやかに混合し、そして少な
くとも３時間沈降させた。上澄み液をサイホンで
除去し、そして廃棄した。この洗浄工程を２回反
復した。次いで、洗浄したペーストを２容量の脱
イオン水中に懸濁させた。PHを1Nの水酸化ナト
リウムの添加により10.5に調節した。生ずる懸濁
液を室温で２時間撹拌し、その間PHを10.5に調節
した。撹拌を停止し、そして上澄み液を18時間沈
降させた。上澄み液はサイホンで取り出し、そし
て濾過および遠心により清澄にした。シリカを廃
棄した。次いで清澄にした溶液を限外濾過により
その最初の体積の20％に濃縮した。濃縮した物質
のPHは1Nの水酸化ナトリウムの添加により11.2
に調節した。次いで、濃縮した物質のPHを６容量
の0.01モルの炭酸ナトリウムに対してPH11.2にお
いて透析した。次いで、それを６容積の蒸留水に
対して透析した。この濃縮物のコレステロール水
準を既知の技術により分析し、そしてさらに1000
mg／dlのコレステロール水準に限外濾過により濃
縮した。次いで、PHを1Nの塩酸の添加により7.6
に調節し、そして得られる溶液を80℃に１時間加
熱した。次いで、この溶液を室温に冷却し、滅菌
瀟過した。次いで、濾過した物質を精製したコレ
ステロールに富んだ分画として回収した。

参考例 １ 各々がM.A.バイオプロダクツ（Bioproducts）
から商業的に入手可能な３mlのダルベツコ
（Dulbecco）のMEM培地を含有しかつまた0.5容
量％のウシ胎児血清を含有する５つの35mmの培養
皿に、各々別々に５×10⁴のマウス線維芽細胞
（ATCC L929）を接種（plate with）した。
各々が３mlの前述の同一の全体の培地を含有しか
つまた初期の栄養培地の１mlにつき20マイクログ
ラムのコレステロール（上の実施例１において調
製した特定のコレステロールに富んだ分画のコレ
ステロール含量から計算して）（重量／容量の基
準で0.002％）を含有する５つの同様な皿に、
各々別々に５×10⁴の上の同一のマウスの細胞系
統の細胞を接種した。接種した皿のすべてを37℃
で６日間インキユベーシヨンした。皿の各々にお
ける合計の細胞を計数し、そして５つの皿の各群
のための算術平均の合計の細胞計数を計算した。
特定のコレステロールに富んだ分画を含有する培
地は３×10⁵の平均の合計の細胞濃度を有し、一
方コレステロールを含まない培地は２×10⁴の平
均の合計の細胞濃度を有した。

参考例 ２ 各々が３mlの上の実施例２に記載するウシ胎児
血清を含有しかつまた初期の栄養培地の１mlｌに
つき５マイクログラムのコレステロール（上の実
施例１においてて調製した特定のコレステロール
に富んだ分画のコレステロール含量から計算し
て）（重量／容量の基準で0.0005％）を含有する
５つの同様な皿に、各々別々に５×10⁴のマウス
の線維芽細胞（ATCC L929）を接種した。各々
が３mlの同一の培地を含有しかつまた初期の栄養
培地の１mlにつき40マイクログラムのコレステロ
ール（上の実施例１において調製した特定のコレ
ステロールに富んだ分画のコレステロール含量か
ら計算して）（重量／容量の基準で0.004％）を含
有する５つの同様な皿に、各々別々に５×10⁴の
上の同一のマウスの細胞系統の細胞を接種した。
接種した皿のすべてを37℃で６日間インキユベー
シヨンした。少ない量の添加したコレステロール
を含有する培地は８×10⁴の平均の合計の細胞濃
度を有し、一方多い量の添加したコレステロール
を含有する培地は1.3×10⁵の平均の合計の細胞濃
度を有した。

参考例 ３ 各々が３mlの上の実施例２に記載するウシ胎児
血清を含有しかつまた初期の栄養培地の１mlｌに
つき20マイクログラムのコレステロール（米国特
許第4290774号に従つて調製したコレステロール
濃縮物のコレステロール含量から計算して）を含
有する５つの同様な皿に、各々別々に５×10⁴の
マウスの線維芽細胞（ATCC L929）を接種し
た。各々が３mlの同一の培地を含有しかつまた初
期の栄養培地の１mlｌにつき20マイクログラムの
コレステロール［イルビン・サイアンテイフイツ
ク（Irvine Scientific）から商業的に入手したコ
レステロール濃縮物溶液のコレステロール含量か
ら計算して）を含有する５つの同様な皿に、各々
別々に５×10⁴の上の同一のマウスの細胞系統の
細胞を接種した。接種した皿のすべを37℃で５日
間インキユベーシヨンした。第１群の皿は2.4×
10⁴の平均の合計の細胞濃度を有し、一方第２群
は1.2×10⁴の平均の合計の細胞濃度を有した。

参考例 ４ 各々が３mlの上の実施例２に記載するウシ胎児
血清が含有しかつまた初期の栄養培地の１mlｌに
つき20マイクログラムのコレステロール（上の実
施例１において調製した特定のコレステロールに
富んだ分画のコレステロール含量から計算して）
を含有する５つの同様な皿に、各々別々に５×
10⁴のハムスターの赤ん坊の腎細胞（ATCC
BHK−21）を接種した。接種した皿を37℃で６
日間インキユベーシヨンした。平均の合計の細胞
濃度は２×10⁵であつた。

参考例 ５ 各々が10mlの上の実施例２に記載するウシ胎児
血清の栄養培地を含有する25cm²の表面積の５つの
組織培養フラスコに、各々別々に１×10⁶のマウ
スの骨髄腫細胞（ATCC P3x63Ag8.653）を接種
した。各々が10mlの同一の培地を含有しかつまた
初期の栄養培地の１mlｌにつき20マイクログラム
のコレステロール（上の実施例１において調製し
た特定のコレステロールに富んだ分画のコレステ
ロール含量から計算した）を含有する５つの同様
なフラスコに、各々別々に１×10⁶の上の同一の
マウスの細胞系統の細胞を接種した。接種したフ
ラスコのすべてを37℃で６日間インキユベーシヨ
ンした。特定のコレステロールに富んだ分画を含
有する培地は2.5×10⁷の平均の合計の細胞濃度を
有し、一方コレステロールを含まない培地は1.2
×10⁶の平均の合計の細胞濃度を有した。

上の実験のデータが明瞭に示すように、特定の
コレステロールに富んだ分画を使用すると、わず
かに0.5容量％のウシ胎児血清を含有する栄養培
地中で細胞の培養を実施することができる。同一
の条件および添加剤の濃度のもとで、他のコレス
テロール濃縮物は利用を示さない。

血清不含培地と一緒に特定のコレステロールに
富んだ分画を使用することを、下の実施例に示
す。

参考例 ６ 各々が３mlのベントレツクス（Ventrex）HL
−１血清不含培地を含有する５つの35mmの培養皿
に、各々別々に５×10⁴のマウスの線維芽細胞
（ATCC L929）を接種した。各々が３mlの同一
のHL−１培地を含有しかつまた初期の栄養培地
の１mlにつき20マイクログラムのコレステロール
（上の実施例１において調製した特定のコレステ
ロールに富んだ分画のコレステロール含量から計
算して）を含有する５つの同様な皿に、各々別々
に５×10⁴の上の同一のマウスの細胞系統の細胞
を接種した。接種した皿のすべてを37℃で６日間
インキユベーシヨンした。特定のコレステロール
に富んだ分画を含有する培地は5.5×10⁵の平均の
合計の細胞濃度を有し、一方コレステロールを含
まない培地は６−５×10⁴の平均の合計の細胞濃
度を有した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次の工程： (a) 液状のコレステロールを含有する血漿または
   血清あるいはその分画をシリカの吸着剤と接触
   させてコレステロールを吸着させ、 (b) 吸着されたコレステロールを残りの液状の血
   漿または血清から分離し、 (c) 吸着されたコレステロールを凍結しかつ融解
   し、 (d) 吸着されたコレステロールをPH9.0〜11.5に
   おいて溶離し、 (e) 溶離されたコレステロール溶液を限外濾過に
   より濃縮し、 (f) 濃縮されたコレステロール溶液のPHを11.0〜
   11.4の値に調節し、 (g) 濃縮されたコレステロール溶液を順番に炭酸
   ナトリウムおよび水に対して透析し、 (h) 透析したコレステロール溶液を限外濾過によ
   り所望のコレステロール水準にさらに濃縮し、 (i) 濃縮されたコレステロール溶液のPHを7.0〜
   11.0の値に調節し、 (j) 濃縮されたコレステロール溶液を50〜100℃
   に30分〜24時間加熱し、そして (k) 精製されたコレステロールに富んだ分画をそ
   れから回収すること、 からなることを特徴とするコレステロールを含有
   する哺乳動物の血漿または血清あるいはその分画
   からコレステロールに富んだ分画を単離しかつ精
   製する方法。 ２ コレステロール源としてウシ血漿またはウシ
   血清を使用する特許請求の範囲第１項記載の方
   法。