JPH0431669B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

本発明は生物学的に活性な物質の固定化方法に
関する。 酵素、抗原、抗体などの生物学的に活性な物質
を固相担体に固定化する方法は数多く知られてい
る。その中でも簡便で経済的なのはアミノ基を有
する担体にグルタルアルデヒドを結合剤に用いて
固定化する方法である。この方法が適用できるた
めには、生物学的活性物質がアミノ基を有するこ
とが必要であるが、酵素、抗原、抗体などの生物
学的活性物質の大部分はアミノ基を有するので、
グルタルアルデヒドによつて担体に固定化するこ
とが可能である。 しかし、本発明者らは上記グルタルアルデヒド
法による生物学的活性物質の固定化法を詳細に検
討した結果、グルタルアルデヒドにより固定化し
た生物学的活性物質固定化物には、実用上好まし
くない性質のあることが明かになつた。すなわち
グルタルアルデヒドを結合剤に用いて生物学的活
性物質を固定化した固相には、さらに蛋白質が吸
着しやすい。またグルタルアルデヒドを結合剤に
用いて生物学的活性物質を固定化した固相に血漿
または血清が接触すると補体が活性化される。こ
れらの性質は生物学的活性物質固定化物とくに免
疫学的活性物質固定化物を医学的診断ないし治療
に利用する場合に好ましくない。たとえば放射免
疫測定、酵素免疫測定、蛍光免疫測定などの標識
免疫測定においては、結合した標識免疫活性物質
と遊離の標識免疫活性物質との分離を容易にする
目的で、結合のパートナーとなる生物学的活性物
質を固相担体に固定化して免疫活性物質と反応さ
せるが、その際に検体中の蛋白質または標識免疫
活性物質が固相に非特異的に吸着すると測定の精
度を悪くする。また免疫学的活性物質を固定化し
た微粒子状担体と検体溶液を反応させて、凝集の
有無により被測定物質を検知する方法は免疫血清
学的検査でしばしば用いられるが、検体中の成分
の非特異的吸着により非特異的凝集が起こること
は検査の妨げになる。また、近年免疫活性物質や
酵素などの固定化物と血液ないし血漿とを体外で
接触させて血中の有害成分を除去したのち、血液
ないし血漿を体内に戻すことにより血液を浄化す
る方法が難病に対する新しい治療法として注目さ
れている。しかし、この場合生物学的活性物質固
定化物と血液ないし血漿が接触したときに血中の
補体が活性化されると被治療者がシヨツクを起こ
す危険がある。 上記の事情を考察して、本発明者らはグルタル
アルデヒド法の利点は保持しつつ、欠点を克服し
た生物学的活性物質の固定化法を検討した結果、
本発明に到達した。 本発明はアミノ基を有する生物学的に活性なア
ミノ基を有する担体に固定化するにあたつて、結
合剤として多糖類の酸化生成物を、担体としてグ
リセル（メタ）アクリレートの単独または共重合
体のアミノ化物、ヒドロキシメチル（メタ）アク
リレートの単独または共重合体のアミノ化物、ま
たはアクリルアミドの単独または共重合体のホフ
マン分解生成物を用いることを特徴とする生物学
的活性物質の固定化法を提供するものである。 本発明方法に用いる多糖類は酸化剤による酸化
生成物が水溶性であれば、中性、酸性、塩基性の
いずれでもさしつかえない。好適な多糖類の例を
挙げれば、デキストラン、デキストラン硫酸ナト
リウム、１−アミノ−２−ヒドロキシポロピルデ
キストラン、澱粉、デキストリン、ヒドロキシエ
チルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロー
ス、カルボキシメチルセルロースおよびそのナト
リウム塩、アラビアゴム、アルギン酸およびその
ナトリウム塩、ヘパリン、コンドロイチン硫酸お
よびそのナトリウム塩、ヒアルロン酸などであ
る。 多糖類を酸化させるための酸化剤としては、具
体的には、クロム酸、四酢酸鉛、過ヨウ素酸、ホ
ードシル化合物（たとえば、酢酸ヨードシルベン
ゼンC₆H₅Ｉ（OCOCH₃）₂）、酸素（酢酸コバルト
を触媒として）、ペルオキソ硫酸−銀塩、塩化
銅、水酸化銅、タリウム塩、タリウム
塩、酸性硫酸セリウム、ビスマス酸塩、過酸化
ニツケル、キセノン酸、陽極酸化等が挙げられ
る。特に過ヨウ素酸、四酢酸鉛が好ましく用いら
れる。過ヨウ素酸は遊離の過ヨウ素酸を用いて
も、過ヨウ素ナトリウム、過ヨウ素酸カリウムな
どの塩類を用いてもよい。 多糖類の酸化反応における多糖類と酸化剤との
仕込比は、重量で１：２から200：１の範囲が好
適である。また反応温度は０〜40℃、pHは２〜
10が好適である。 担体はアミノ基を有する固体であればよく、と
くに限定はないが、成形の便からは有機高分子重
合体がとくに好ましい。担体の形体は球、円柱、
円板、試験管、円筒、繊維、膜、粒子、網、マイ
クロトレイ、螺旋などの目的に合致すればどのよ
うなものでもよい。担体の材料として好ましい有
機高分子重合体の若干例を挙げれば、スチレンの
単独または共重合体のアミノ化物、アクリル酸ま
たはメタクリル酸のグリシジルエステルの単独ま
たは共重合体のアミノ化物、アクリルニトリルの
単独または共重合体の水素化物、アクリルアミド
の単独または共重合体のホフマン分解生成物、ア
クリル酸またはメタクリル酸の単独または共重合
体のヒドラジドなどである。中でも親水性重合体
が好ましく、例えばグリセル（メタ）アクリレー
トの単独または共重合体のアミノ化物、ヒドロキ
シエチル（メタ）アクリレートの単独または共重
合体のアミノ化物、アクリルアミドの単独または
共重合体のホフマン分解生成物等が等に好ましく
用いられる。 担体に生物学的活性物質を固定化するに当つて
は、担体、生物学的活性物質および多糖の過ヨウ
素酢酸化物の３者を同時に混合して反応させても
よいが、生物学的活性物質の活性低下を避けるた
めには、まず担体を多糖の過ヨウ素酸酸化物で処
理した後、生物学的活性物質と接触させて固定化
するのがよい。 固定化の対象となる生物学的活性物質の例を挙
げれば、アスパラギナーゼ・ウレアーゼなどの酵
素類、ヒト絨毛性コナドトロピン・卵胞刺激ホル
モン・甲状腺刺激ホルモンなどのホルモンとそれ
に対する抗体、トレポネーマパリダム・Ａ型また
はＢ型肝炎ウイルス・風疹ウイルス・トキプラズ
マ・マイコプラズマ・溶連菌などの病原体の抗原
およびそれに対する抗体、α−フエトプロテイ
ン・癌胚抗原などの癌関連抗原とそれに対する抗
体、リボ核酸およびデオキシリボ核酸とそれに対
する抗体、IgG・IgM・IgA・IgD・IgEなどの免
疫グロブリンとそれに対する抗体、熱凝集IgG、
リウマチ因子、Ｃ反応性蛋白とその抗体、CIq・
CIr・CIs・C2・C3・C4・C5・C6・C7・C8・C9
などの補体とそれに対する抗体、各種アレルゲ
ン、プロテインＡ、コングルチニン、イムノコン
グルチニン、コンカナバリンなどのコングルチ
ン、各種組織適合抗原およびそれに対する抗体な
どである。 以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
る。 〔実施例 １〕 （蛍光コロイドの調製） メチルメタクリレート、グリシジルメタクリレ
ート、メタクリル酸、スルホプロピルメタクリレ
ートナトリウム塩、エチレングリコールジメタク
リレートを、50：20：15：５：10のモル比で混合
し、0.125％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）水
溶液にこれらモノマーの合計重量が10％となるよ
うに加え、窒素雰囲気下で激しく攪拌し、モノマ
ーを乳化させた。重合は、1mMの過硫酸アンモ
ニウムを開始剤として60℃で約1.5時間おこなつ
た。次に反応液中の未反応のモノマーを四塩化炭
素で抽出し除去した。得られた直径約0.15μmの
コロイド微粒子は、0.025％硫酸水溶液中で30℃
で１時間加水分解した後、水酸化ナトリウムで中
和し、洗浄した。洗浄は17500rpmで20分間遠心
することでおこなつた。洗浄後、コロイド粒子を
ジメチルスルホキシド（DMSO）中に分散し、
DMSO中で12％のアンモニアによりアミノ化し
た。 反応は35℃で3.5時間おこない、充分洗浄して
アンモニアを除去した。 別にアラビアゴムが４mg／ml、過ヨウ素酸ナト
リウムが５mg／mlの濃度になるように水に溶かし
（pHは3.0になつた）、25℃で１時間攪拌した。こ
の反応液にアミノ化コロイド粒子が１％になるよ
うに分散し、pHを10に調節して、30℃で３時間
攪拌した。反応後、過剰のアラビアゴム酸化物を
遠心による洗浄操作で除いた後、コロイド粒子を
0.1％となるようにDMSOに分散させ、0.2mg／ml
のジクロロトリアジニルアミノフルオレセインと
40℃で１時間反応させた。得られた蛍光コロイド
粒子はpH10.0の0.1M NaHCO₃−NaOH緩衝溶
液で洗浄した後、0.1％となるように同緩衝溶液
中に分散し保存した。 （抗HGG抗体の蛍光コロイド粒子への固定化） ヤギで作製した抗HGG（ヒトIgG）抗体IgG分
画（Miles）240μｇ／ml溶液500μと0.1％結合性
物質固定化用蛍光コロイド粒子500μとを混合
し、４℃で２日間反応させた。反応後シアン水素
化ホウ素ナトリウムを15mg加えて、25℃で１時間
反応させ、シツフ塩基を還元した。 得られた抗HGG抗体結合コロイド粒子を
pH8.0の0.1Mトリス塩酸緩衝液で洗浄し、１％の
ウシ血清アルブミン（BSA）を含む同緩衝液中
に保存した。 以上のようにして調製した抗HGG抗体固定化
コロイド粒子は４週間たつた後も分散していた。
一方、グルタルアルデヒドを用いてアミノ化コロ
イドに同様に抗HGG抗体を固定化したところ、
約１週間でコロイドの凝集がおこり、使用が困難
となつていた。 （固相用粒子の調製） 固相として使用した粒子は特開昭56−141559に
記載の方法により、グリシジルメタクリレート、
２−オキシエチルメタクリレート、およびトリエ
チレングリコールジメタクリレートの３者を
87.5：9.5：4.8のモル比で混合し重合した粒子を
アミノ化し、加水分解することにより調製した。
平均粒径4.3μmの親水性粒子である。 （固相用粒子への抗HGG抗体の固定化） 抗HGG抗血清（Miles）をProtein Ａ−
Sepharose（Pharmacia）のカラムクロマトグラ
フイーによりIgG分画に精製した。 調製した抗HGG抗血清のIgG分画10mg／mlを
含むpH7.2の0.15モルリン酸緩衝生理食塩水
（PBS）中に濃度が１％になるように特開昭56−
141559記載の方法に準じてグルタルアルデヒドで
活性化した固相用アミノ化粒子を分散させ25℃で
２時間反応させた。3000rpmの遠心操作で粒子を
沈降させることで粒子の洗浄をおこない、0.1％
のウシ血清アルブミン（BSAと略記する。）中に
分散し、抗HGG抗体固定化固相粒子を調製した。 （HGGの測定） HGG（Miles）の10μm／ml〜1ng／mlまでの10
倍稀釈系列（各90μ）を作製し、ガラス試験管
内で１％の抗HGG抗体固定化固相微粒子分散液
100μと振盪しながら25℃で１時間反応させて、
3000rpmで遠沈、再分散させる操作により、固相
微粒子をトリス緩衝液で３回洗浄し、HGGが抗
HGG抗体を介して結合している固相を得た。 抗HGG抗体固定化蛍光コロイド粒子0.02％分
散液10μとこの固相粒子１％分散液100μとを
試験管内で混合し、25℃で１時間反応させ、固相
をトリス緩衝液で充分洗浄した。洗浄後、固相粒
子を２mlのトリス緩衝液に分散し、450nmの光で
励起して530nmの蛍光強度を測定した。蛍光光度
計は日立650−40を使用した。 HGG10μｇ／ml〜1μｇ／mlまでの範囲におけ
るHGG濃度と蛍光強度との関係を第１図に示し
た。 〔実施例 ２〕 （ウシ血清アルブミン固定化粒子の調製） 特開昭56−141559に記載した方法により調製し
た平均直径3.0μmのアミノ化親水性粒子を蒸留水
に１％の濃度で分散させた。別にアルギン酸ナト
リウムを１％含む水溶液に過ヨウ素酸ナトリウム
を１mg／mlの濃度で添加し、25℃で１時間攪拌し
てアルギン酸ナトリウムを酸化した。次いでアミ
ノ化親水性粒子分散液２容とアルギン酸ナトリウ
ム酸化反応液１容と混合し、水酸化ナトリウムで
pHを10に調節し、30℃で30分間攪拌した。次に
粒子をPBSで洗浄し、PBS中に５％の濃度で分
散させた。 上記粒子分散液（５％）と等容のBSAの１
mg／mlPBS溶液を混合し、30℃で30分攪拌して、
BSAを粒子に固定化した。BSA固定化粒子を
PBSで洗浄後、ヒト血清アルブミン１％を添加
したPBSに粒子含量が1.25％になるよう分散させ
た。 （ウシ血清アルブミン固定化粒子の活性測定） 抗BSA抗血清（ウサギ）（2.3mg／ml）を１％ヒ
ト血清アルブミン添加PBSで10倍に希釈し、そ
れをＵ字型マイクロプレート上でさらに2n倍に
希釈した系列をつくり、各ウエルに25μずつ入
れた。30分静置後各ウエルにBSA固定化粒子分
散液25μを加えてふりまぜ、２時間静置した。
コントロール実験として抗BSA抗血清の代りの
健常ウサギ血清を使用して同じ操作を行つた。 ２時間静置後の沈降像を観察した結果は表１の
通りであつた。 The present invention relates to a method for immobilizing biologically active substances. Many methods are known for immobilizing biologically active substances such as enzymes, antigens, and antibodies onto solid supports. Among these, a simple and economical method is to immobilize glutaraldehyde on a carrier having an amino group using a binder. In order for this method to be applicable, it is necessary that the biologically active substance has an amino group, but since most biologically active substances such as enzymes, antigens, and antibodies have amino groups,
Immobilization on carriers is possible with glutaraldehyde. However, as a result of a detailed study of the method for immobilizing biologically active substances using the glutaraldehyde method, the present inventors found that biologically active substances immobilized by glutaraldehyde have properties that are undesirable for practical use. Something became clear. That is, proteins are more likely to be adsorbed to a solid phase in which a biologically active substance is immobilized using glutaraldehyde as a binder. Furthermore, when plasma or serum comes into contact with a solid phase on which a biologically active substance is immobilized using glutaraldehyde as a binding agent, complement is activated. These properties are unfavorable when a biologically active substance immobilized product, particularly an immunologically active substance immobilized product, is used for medical diagnosis or treatment. For example, in labeled immunoassays such as radioimmunoassays, enzyme immunoassays, and fluorescence immunoassays, the binding partner biological An objectively active substance is immobilized on a solid phase carrier and reacted with the immunoactive substance, but at this time, if the protein in the sample or the labeled immunoactive substance adsorbs nonspecifically to the solid phase, measurement accuracy will deteriorate. In addition, a method in which a particulate carrier immobilized with an immunologically active substance is reacted with a sample solution and the analyte is detected based on the presence or absence of agglutination is often used in immunoserological tests; Nonspecific aggregation caused by specific adsorption hinders testing. In addition, in recent years, a method of purifying blood by bringing immobilized substances such as immune-activating substances and enzymes into contact with blood or plasma outside the body to remove harmful components from the blood and then returning the blood or plasma to the body has been developed to treat intractable diseases. It is attracting attention as a new treatment method. However, in this case, if the complement in the blood is activated when the immobilized biologically active substance comes into contact with blood or plasma, there is a risk that the patient will suffer a shock. Considering the above circumstances, the present inventors investigated a method for immobilizing biologically active substances that overcomes the drawbacks while retaining the advantages of the glutaraldehyde method.
We have arrived at the present invention. The present invention uses a polysaccharide oxidation product as a binder and glycer (meth)acrylate alone or copolymerized as a carrier for immobilization on a biologically active carrier having an amino group. A method for immobilizing a biologically active substance, characterized by using an aminated product of a polymer, an aminated product of a single or copolymer of hydroxymethyl (meth)acrylate, or a Hofmann degradation product of a single or copolymer of acrylamide. It provides: The polysaccharide used in the method of the present invention may be neutral, acidic or basic, as long as the oxidation product produced by the oxidizing agent is water-soluble. Examples of suitable polysaccharides include dextran, dextran sodium sulfate, 1-amino-2-hydroxypropyldextran, starch, dextrin, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, carboxymethylcellulose and its sodium salt, gum arabic, alginic acid and Its sodium salt, heparin, chondroitin sulfate and its sodium salt, hyaluronic acid, etc. Examples of oxidizing agents for oxidizing polysaccharides include chromic acid, lead tetraacetate, periodic acid, hodosyl compounds (for example, iodosylbenzene acetate C ₆ H ₅ I (OCOCH ₃ ) ₂ ), and oxygen. (using cobalt acetate as a catalyst), peroxosulfuric acid-silver salt, copper chloride, copper hydroxide, thallium salt, thallium salt, acidic cerium sulfate, bismuthate, nickel peroxide, xenonic acid, anodic oxidation, and the like. In particular, periodic acid and lead tetraacetate are preferably used. As the periodic acid, free periodic acid may be used, or salts such as sodium periodate and potassium periodate may be used. The charging ratio of polysaccharide and oxidizing agent in the oxidation reaction of polysaccharide is preferably in the range of 1:2 to 200:1 by weight. In addition, the reaction temperature is 0 to 40℃, and the pH is 2 to 40℃.
10 is preferred. The carrier may be any solid having an amino group, and is not particularly limited, but organic polymers are particularly preferred from the viewpoint of ease of molding. The shape of the carrier is spherical, cylindrical,
Any material suitable for the purpose may be used, such as a disk, test tube, cylinder, fiber, membrane, particle, mesh, microtray, or spiral. Some examples of organic polymers preferable as carrier materials include aminated styrene alone or copolymers, aminated acrylic acid or methacrylic acid glycidyl esters alone or copolymers, and acrylonitrile alone. or a hydride of a copolymer, a Hofmann decomposition product of acrylamide alone or a copolymer, a hydrazide of an acrylic acid or a methacrylic acid alone or a copolymer, and the like. Among these, hydrophilic polymers are preferred, such as aminated products of glycer (meth)acrylate alone or copolymers, aminated products of hydroxyethyl (meth)acrylate alone or copolymers, and Hofmann degradation products of acrylamide alone or copolymers. products etc. are preferably used. When immobilizing a biologically active substance on a carrier, the carrier, the biologically active substance, and the polysaccharide periodate acetate may be mixed and reacted at the same time, but the biologically active substance In order to avoid a decrease in the activity of the carrier, it is preferable to first treat the carrier with periodate oxide of the polysaccharide and then contact it with the biologically active substance to immobilize it. Examples of biologically active substances that can be immobilized include enzymes such as asparaginase and urease, hormones such as human chorionic conadotropin, follicle-stimulating hormone, and thyroid-stimulating hormone, and antibodies against them, Treponema pallidum and A. Antigens of pathogens such as type or B hepatitis virus, rubella virus, toxplasma, mycoplasma, and streptococci and antibodies against them, cancer-related antigens such as α-fetoprotein and carcinoembryonic antigen and antibodies against them, ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid and antibodies against it, immunoglobulins such as IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE and antibodies against them, heat-agglutinated IgG,
Rheumatoid factor, C-reactive protein and its antibodies, CIq・
CIr・CIs・C2・C3・C4・C5・C6・C7・C8・C9
These include complements and antibodies against them, various allergens, conglutins such as protein A, conglutinin, immunoconglutinin, and concanavalin, various histocompatibility antigens and antibodies against them. The present invention will be specifically explained below with reference to Examples. [Example 1] (Preparation of fluorescent colloid) Methyl methacrylate, glycidyl methacrylate, methacrylic acid, sulfopropyl methacrylate sodium salt, and ethylene glycol dimethacrylate were mixed in a molar ratio of 50:20:15:5:10, and 0.125%. These monomers were added to a sodium dodecyl sulfate (SDS) aqueous solution so that the total weight was 10%, and the monomers were emulsified by stirring vigorously under a nitrogen atmosphere. Polymerization was carried out at 60°C for about 1.5 hours using 1mM ammonium persulfate as an initiator. Next, unreacted monomers in the reaction solution were removed by extraction with carbon tetrachloride. The obtained colloidal particles with a diameter of approximately 0.15 μm were heated at 30°C in a 0.025% sulfuric acid aqueous solution.
After hydrolysis for 1 hour, the mixture was neutralized with sodium hydroxide and washed. Washing was performed by centrifugation at 17500 rpm for 20 minutes. After washing, the colloidal particles were dispersed in dimethyl sulfoxide (DMSO) and
Aminated with 12% ammonia in DMSO. The reaction was carried out at 35°C for 3.5 hours, and ammonia was removed by thorough washing. Separately, gum arabic was dissolved in water to a concentration of 4 mg/ml and sodium periodate was dissolved in water to a concentration of 5 mg/ml (pH reached 3.0), and the mixture was stirred at 25°C for 1 hour. Aminated colloid particles were dispersed in this reaction solution to a concentration of 1%, the pH was adjusted to 10, and the mixture was stirred at 30° C. for 3 hours. After the reaction, excess gum arabic oxide was removed by centrifugal washing, and the colloidal particles were
Dispersed in DMSO to 0.1%, 0.2mg/ml
dichlorotriazinylaminofluorescein and
The reaction was carried out at 40°C for 1 hour. The obtained fluorescent colloid particles were washed with a 0.1M NaHCO ₃ -NaOH buffer solution of pH 10.0, and then dispersed in the same buffer solution to a concentration of 0.1% and stored. (Immobilization of anti-HGG antibody to fluorescent colloid particles) 500 μ of anti-HGG (human IgG) antibody IgG fraction (Miles) 240 μg/ml solution prepared in goat and 500 μ of fluorescent colloid particles for immobilizing 0.1% binding substance. The mixture was mixed and reacted at 4°C for 2 days. After the reaction, 15 mg of sodium cyanoborate was added and reacted at 25°C for 1 hour to reduce Schiff's base. The obtained anti-HGG antibody-bound colloid particles
It was washed with 0.1M Tris-HCl buffer at pH 8.0 and stored in the same buffer containing 1% bovine serum albumin (BSA). The anti-HGG antibody-immobilized colloid particles prepared as described above remained dispersed even after 4 weeks.
On the other hand, when anti-HGG antibodies were similarly immobilized on aminated colloids using glutaraldehyde,
The colloid agglomerated in about one week, making it difficult to use. (Preparation of particles for solid phase) Particles used as a solid phase were prepared by preparing glycidyl methacrylate, glycidyl methacrylate,
2-oxyethyl methacrylate and triethylene glycol dimethacrylate
It was prepared by aminating and hydrolyzing particles that were mixed and polymerized at a molar ratio of 87.5:9.5:4.8.
These are hydrophilic particles with an average particle size of 4.3 μm. (Immobilization of anti-HGG antibody to solid phase particles) Anti-HGG antiserum (Miles) was added to Protein A-
The IgG fraction was purified by Sepharose (Pharmacia) column chromatography. The IgG fraction of the prepared anti-HGG antiserum was dissolved in 0.15 molar phosphate buffered saline (PBS) at pH 7.2 containing 10 mg/ml of the anti-HGG antiserum to a concentration of 1%.
According to the method described in No. 141559, aminated solid phase particles activated with glutaraldehyde were dispersed and reacted at 25°C for 2 hours. Particles are washed by sedimentation using centrifugation at 3000 rpm, resulting in a concentration of 0.1%.
was dispersed in bovine serum albumin (abbreviated as BSA) to prepare anti-HGG antibody-immobilized solid-phase particles. (HGG measurement) HGG (Miles) 10 μm/ml to 1ng/ml
Prepare a series of double dilutions (90μ each) and place a 1% anti-HGG antibody-immobilized solid phase microparticle dispersion in a glass test tube.
Incubate at 25°C for 1 hour while shaking with 100μ
By centrifugation and redispersion at 3000 rpm, the solid phase particles were washed three times with Tris buffer, and HGG was
A solid phase bound via HGG antibody was obtained. 10μ of a 0.02% dispersion of anti-HGG antibody-immobilized fluorescent colloidal particles and 100μ of this 1% dispersion of solid phase particles were mixed in a test tube, reacted for 1 hour at 25°C, and the solid phase was thoroughly washed with Tris buffer. After washing, the solid phase particles were dispersed in 2 ml of Tris buffer, excited with 450 nm light, and the fluorescence intensity at 530 nm was measured. A Hitachi 650-40 fluorometer was used. The relationship between HGG concentration and fluorescence intensity in the range of 10 μg/ml to 1 μg/ml of HGG is shown in FIG. [Example 2] (Preparation of bovine serum albumin-immobilized particles) Aminated hydrophilic particles with an average diameter of 3.0 μm prepared by the method described in JP-A-56-141559 were dispersed in distilled water at a concentration of 1%. . Separately, sodium periodate was added at a concentration of 1 mg/ml to an aqueous solution containing 1% sodium alginate, and the mixture was stirred at 25° C. for 1 hour to oxidize the sodium alginate. Next, 2 volumes of the aminated hydrophilic particle dispersion and 1 volume of the sodium alginate oxidation reaction solution were mixed, and the mixture was mixed with sodium hydroxide.
The pH was adjusted to 10 and stirred at 30°C for 30 minutes. The particles were then washed with PBS and dispersed in PBS at a concentration of 5%. 1 of the above particle dispersion (5%) and an equal volume of BSA
Mix the mg/ml PBS solution and stir at 30°C for 30 minutes.
BSA was immobilized on particles. BSA immobilized particles
After washing with PBS, the particles were dispersed in PBS supplemented with 1% human serum albumin so that the particle content was 1.25%. (Activity measurement of bovine serum albumin-immobilized particles) Anti-BSA antiserum (rabbit) (2.3 mg/ml) was diluted 10 times with PBS supplemented with 1% human serum albumin, and further diluted with 2n on a U-shaped microplate. A series of two-fold dilutions was made, and 25 μl was added to each well. After standing still for 30 minutes, 25μ of BSA-immobilized particle dispersion was added to each well, mixed, and left standing for 2 hours.
As a control experiment, the same procedure was performed using healthy rabbit serum instead of anti-BSA antiserum. Table 1 shows the results of observing the sedimentation image after standing for 2 hours.

〔実施例 ３〕[Example 3]

蒸留水にデキストランT70および過ヨウ素酸ナ
トリウムの両者を、濃度がそれぞれ10mg／mlおよ
び２mg／mlになるように溶解し、25℃で１時間攪
拌した。この反応液に実施例１で用いた平均粒子
4.3μmの固相用アミノ化粒子を１％の濃度で分散
させ、少量の水酸化ナトリウムと炭酸水素ナトリ
ウムでpHを9.6に調節し、25℃で１時間攪拌し
た。反応後、粒子をpH9.6の緩衝溶液（水酸化ナ
トリウム＋炭酸水素ナトリウム）で洗浄し、同じ
緩衝溶液にIgGを溶解した溶液にポリマー濃度が
１％になるように分散させ、25℃で３時間攪拌し
て、粒子にIgGを固定化した。比較のため、テキ
ストランの過ヨウ素酸による酸化物の代りにグル
タルアルデヒドを用いて同様にIgGを固相用アミ
ノ化粒子に固定化した。IgG固定化粒子は１％シ
アン水素化ホウ素ナトリウム溶液（pH4.0）に分
散して（濃度１％）、25℃で30分攪拌した後、ト
リスー塩酸緩衝溶液（pH7.5）で洗浄し、PBS中
に１％の濃度で分散させて冷蔵庫中で保存した。
粒子に固定化されたIgGの量は塩酸で加水分解後
アミノ酸分析を行うことにより定量した。 このIgG固定化粒子による補体活性化の有無は
次のようにして試験した。すなわち、１％粒子分
散液と等容の新鮮ヒト血清とを混合し、37℃で15
分放置した。次にPBSで粒子を沈浄後PBSに１
％の濃度で再び分散し、スライドガラス上で、
PBSにより100倍に希釈した抗補体、抗血清（ウ
サギ）と混合し、凝集の有無を肉眼で判定した。
その結果を表２にまとめて示した。 Dextran T70 and sodium periodate were both dissolved in distilled water to a concentration of 10 mg/ml and 2 mg/ml, respectively, and stirred at 25°C for 1 hour. The average particles used in Example 1 in this reaction solution
Aminated particles for solid phase of 4.3 μm were dispersed at a concentration of 1%, the pH was adjusted to 9.6 with a small amount of sodium hydroxide and sodium hydrogen carbonate, and the mixture was stirred at 25° C. for 1 hour. After the reaction, the particles were washed with a pH 9.6 buffer solution (sodium hydroxide + sodium hydrogen carbonate), dispersed in a solution of IgG dissolved in the same buffer solution to a polymer concentration of 1%, and incubated at 25°C for 3 IgG was immobilized on the particles by stirring for a period of time. For comparison, IgG was similarly immobilized on solid-phase aminated particles using glutaraldehyde instead of periodic acid oxide in Textran. The IgG-immobilized particles were dispersed in a 1% sodium cyanogen borohydride solution (pH 4.0) (concentration 1%), stirred at 25°C for 30 minutes, and then washed with a Tris-HCl buffer solution (pH 7.5). It was dispersed in PBS at a concentration of 1% and stored in a refrigerator.
The amount of IgG immobilized on the particles was determined by hydrolysis with hydrochloric acid and amino acid analysis. The presence or absence of complement activation by the IgG-immobilized particles was tested as follows. That is, a 1% particle dispersion and an equal volume of fresh human serum were mixed and incubated at 37℃ for 15 minutes.
I left it for a minute. Next, after precipitating the particles with PBS, add 1
Disperse again on a glass slide at a concentration of %
The mixture was mixed with anti-complement and anti-serum (rabbit) diluted 100 times with PBS, and the presence or absence of agglutination was determined visually.
The results are summarized in Table 2.

【表】 ただし、凝集の判定に当つてはコントロールと
して常に健常ウサギ血清を使用した。表２から明
らかなように、グルタルアルデヒドを結合剤とし
てIgGを固定化した場合には、活性化された補体
成分が固相に結合しているが、デキストラン酸化
物を結合剤に用いた場合には、補体成分の固相へ
の結合は皆無ないし僅少である。[Table] However, healthy rabbit serum was always used as a control when determining agglutination. As is clear from Table 2, when IgG was immobilized using glutaraldehyde as a binding agent, activated complement components were bound to the solid phase, but when dextran oxide was used as a binding agent, the activated complement components were bound to the solid phase. There is no or minimal binding of complement components to the solid phase.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第１図は実施例１のHGG測定結果を示す図で
ある。 FIG. 1 is a diagram showing the HGG measurement results of Example 1.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] １ アミノ基を有する生物学的に活性な物質をア
ミノ基を有する担体に固定化するにあたつて、結
合剤として多糖類の酸化生成物を、担体としてグ
リセル（メタ）アクリレートの単独または共重合
体のアミノ化物、ヒドロキシメチル（メタ）アク
リレートの単独または共重合体のアミノ化物、ま
たはアクリルアミドの単独または共重合体のホフ
マン分解生成物を用いることを特徴とする生物学
的活性物質の固定化法。1. When immobilizing a biologically active substance having an amino group on a carrier having an amino group, an oxidation product of a polysaccharide is used as a binder and glycer (meth)acrylate alone or copolymerized as a carrier. A method for immobilizing a biologically active substance, characterized by using an aminated product of a polymer, an aminated product of a single or copolymer of hydroxymethyl (meth)acrylate, or a Hofmann degradation product of a single or copolymer of acrylamide. .