JPH04288020A - トロンボスポンジン様活性を有するペプチド類の治療学的使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、１９９０年９月２４日に出願し
た共出願の米国連続番号５８７，１９７の部分的な継続
出願である。

【０００２】

【技術分野】本発明は、一般に、トロンボスポンジン（
Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）様活性を維持している
トロンボスポンジン（ＴＳＰ）のペプチドフラグメント
および合成類似物に関する。これらのペプチド類は、異
なる細胞系の細胞接着、細胞移動、細胞付着、および細
胞拡散に関する効力のある増強剤もしくは抑制剤として
のＴＳＰの生物活性を維持しそして模擬する。これらの
ペプチド類はまた、血小板凝縮を抑制する能力を有する
。ＴＳＰが存在していると、これらのペプチド類はトロ
ンボスポンジン様活性を抑制し、そしてＴＳＰが存在し
ていない場合、これらのペプチド類はトロンボスポンジ
ン様活性を増強する。

【０００３】これらのペプチド類は、種々の生物学的お
よび薬理学的用途で用いられている。これらの用途には
、（ａ）転移を抑制することによって癌の進行を阻害す
るか、或は腫瘍増殖の退縮を生じさせるかまたは抑制す
る；（ｂ）アテローム性動脈硬化症および血栓症の治療
領域における血小板凝縮を抑制する；（ｃ）脈管形成を
抑制する；（ｄ）診断もしくは治療薬として有益な抗体
を製造する；そして（ｅ）表面への細胞付着を促進また
は抑制する；薬剤としての使用が含まれる。

【０００４】

【背景】トロンボスポンジン（トロンビン感受性を示す
蛋白質またはＴＳＰとしても知られている）は、ジスル
フィド結合した３つの同じポリペプチド鎖から成る４５
０，０００の分子量を有する蛋白質である（Ｌａｗｌｅ
ｒ他、　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８６）　１
０１：１０５９−７１）。ＴＳＰは、生理学的活性剤、
例えばトロンビンおよびコラーゲンに反応して血小板か
ら分泌される（Ｌａｗｌｅｒ、　Ｊ．　Ｂｌｏｏｄ　（
１９８６）　６７：１１２−１２３）。ＴＳＰは、３％
の全体的血小板蛋白質と２５％の全体的血小板アルファ
顆粒蛋白質を含んでいる（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ、　Ｇ．
Ｐ．他、　（１９８５）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ
．　２６０：１２２４０−１２２４５）。線維芽細胞（
Ｊａｆｆｅ，　Ｅ．Ａ．他、　（１９８３）　Ｎａｔ．
　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８０：９９９−１０
０２）、平滑筋細胞（Ｒａｕｇｉ，　Ｇ．Ｊ．他、　（
１９８２）　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　９５：３５１
−３５４、および内皮細胞（ＭｃＰｈｅａｒｓｏｎ，　
Ｊ．他、　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５６：１
１３３０−１１３３６）を含む他の細胞もまたＴＳＰを
合成する。ＴＳＰは、特定の腫瘍組織、例えば黒色腫細
胞（Ｖａｒａｎｉ，Ｊ．他、　（１９８９）　Ｃｌｉｎ
．　Ｅｘｐｌ．　Ｍｅｔａｓｔａｉｓ　７：３１９−３
２９）、鱗状肺癌（Ｒｉｓｅｒ，　Ｂ．Ｌ．他、（１９
８８）　Ｅｘｐ．　Ｃｅｌｌ．　Ｒｅｓ．　１７４：３
１９−３２９）および乳癌（Ｐｒａｔｔ，　Ｄ．Ａ．他
、（１９８９）　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｌ
ｉｎ．　Ｏｎｃｏｌ．　２５：３４３−３５０）中に見
いだされた。加うるに、次に示す腫瘍細胞は、培地中で
ＴＳＰを合成することも知られている：線維肉腫、横紋
筋肉腫、グリア芽細胞腫、ウィルム腫瘍、神経芽細胞腫
、奇形腫、じゅう毛癌、黒色腫、および肺癌（Ｍｏｓｈ
ｅｒ，　Ｄ．Ｆ．、　（１９９０）　Ａｎｎｕ．　Ｒｅ
ｖ．　Ｍｅｄ．　４１：８５−９７）。数多くの最近の
研究により、ＴＳＰが細胞−細胞および細胞下層接着に
おいて主要な役割を果していることが示された（Ｔｕｓ
ｚｙｎｓｋｉ、Ｇ．Ｐ．他、　（１９８７）　Ｓｅｍｉ
ｎａｒｓ　ｉｎＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓｉ　Ｈｅｍｏｓｔ
ａｓｉｓ　（１３：３６１−３６８、　Ｍｏｓｈｅｒ，
　Ｄ．Ｆ．、　（１９９０）　Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　
Ｍｅｄ．　４１；８５−９７）。実験的転移に関して、
ＴＳＰは、ネズミのモデルにおける細胞付着、血小板凝
縮、および肺腫瘍コロニー形成を促進する（Ｔｕｓｚｙ
ｎｓｋｉ、　Ｇ．Ｐ．他、　（１９８７）　Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ　２３６：１５７０ー１５７３、　Ｔｕｓｚｙｎｓ
ｋｉ、Ｇ．Ｐ．他、　（１９８８）　Ｂｌｏｏｄ　７２
：１０９−１１５）。接着におけるＴＳＰの役割は、大
部分の組織の細胞外マトリックスはＴＳＰを含有してい
ることが観察されたことによって更に支持される。

【０００５】ＴＳＰは、種々の巨大分子、例えば血漿お
よびマトリックス成分に対して特異的に相互作用を示す
ところの、線状のポリペプチドドメインから成っている
。例えば、ＴＳＰは、ヘパリン（Ｙａｂｋｏｗｉｔｚ，
　Ｒ．他、（１９８９）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ
．　２６４：１０８８８−１０８９６）、フィブリノー
ゲン（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ，Ｇ．Ｐ．他、　（１９８５
）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６０：１２２４
０−１２２４５）、コラーゲン（Ｍｕｍｂｙ，Ｓ．Ｍ．
他、　（１９８４）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　
９８：１０８８８−１０８９６）、　およびプラスミノ
ーゲン（Ｄｅｐｏｌｉ，Ｐ．他、　（１９８９）　Ｂｌ
ｏｏｄ　７３：９７６−９０２）との複合体を形成する
。ＴＳＰの構造は、ヒトの蛋白質に対する抗体が、マウ
ス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ、および七面鳥
からのＴＳＰと交差反応する事実によって示されるよう
に、種々の動物種の中に保護されている（Ｓｗｉｔａｌ
ｓｋａ，Ｈ．Ｉ．他、　Ｊ．　Ｌａｂ　Ｃｌｉｎ．　Ｍ
ｅｄ．　１０６：６９０−７００）。

【０００６】トロンボスポンジンは、排除クロマトグラ
フィー（Ｌａｗｌｅｒ他、　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅ
ｍ．（１９７８）　２５３：８６０９−１６）、　ヘパ
リンアフィニティークロマトグラフィー（Ｌａｗｌｅｒ
他、Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｒｅｓ．　（１９８１）　２２：
２６７−２６９）、フィブリノーゲンアフィニティーク
ロマトグラフィー（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ他、　Ｊ．　Ｂ
ｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　（１９８５）　２６０：１２２
４０ー５）、塩化バリウム沈澱（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ他
、　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　（１９８４）　２１７：
６７−７１）およびＨＰＬＣを用いたアニオン交換クロ
マトグラフィー（Ｃｌｅｚａｒｏｌｉｎ他、　Ｊ．　Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇ．　（１９８４）　２９６：２４９−
５６）を含む数多くの操作によって精製されてきた。

【０００７】ＴＳＰの完全なアミノ酸配列が、Ｌａｗｌ
ｅｒ他、　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　（１９８６
）　１０３：１６３５ー４８；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ他、
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９８６）　２５：８
４１８−２５；Ｄｉｘｉｔ他、　Ｐｒｏｃ．　Ｎｔｌ．
　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　（１９８６）　８３：５４４
９−５３；およびＨｅｎｎｅｓｙ他、　Ｊ．　Ｃｅｌｌ
　Ｂｉｏｌ．　（１９８９）　１０８；７２９−３６を
含む種々のグループによって合成されたＤＮＡクローン
体から推論された。

【０００８】細胞接着は、多細胞有機体の発育および生
存にとって重大である。細胞接着の過程は複雑であり、
数多くの細胞外蛋白質、例えばフィブロネクチン、ビト
ロネクチン、コラーゲン、ラミニン、およびＴＳＰ、並
びに数多くの族の細胞レセプタ、例えばインテグリンお
よび細胞接着分子（ＣＡＭＳ）を必要としている。これ
らの分子は、正常および腫瘍細胞の両方の接着に関係し
ており、近年集中的に研究されている。

【０００９】アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｒ
ＧＤ）は、フィブロネクチン中の細胞付着ドメインとし
て確立された（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ，Ｍ．Ｄ．
およびＲｏｕｓｌａｈｔｉ，　Ｅ．、（１９８４）　Ｎ
ａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３０９：３０−３２）
。同じもしくは関係した配列が、数多くの蛋白質中に発
見され、そしてこれらはフィブリノーゲンのような巨大
分子のための細胞結合部位として働く（Ｇｉｎｓｂｅｒ
ｇ，　Ｍ．Ｄ．他、（１９８５）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　
Ｃｈｅｍ．　２６０：１１８９１−１１８９６）。しか
しながら、ラミニンの接着機能はこのＲＧＤ配列を基と
するものではなく、アミノ酸配列チロシン−イソロイシ
ン−グリシン−セリン−アルギニン（ＹＩＧＳＲ）を有
するＢ１鎖のペプチド配列を基としていることは明らか
である（Ｓａｓａｋｉ，　Ｍ．　１９８７、　Ｐｒｏｃ
．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　８４：９３５
−９３８）。 ＲＧＤおよびＹＩＧＳＲ配列を有する合成ペプチド類は
細胞接着を促進する。

【００１０】フィブロネクチンおよびラミニンの接着ド
メインを基とする合成ペプチド類の治療学的使用が最近
報告された。Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ他、　（２９８６）　
Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３３：４６７−４７０）が初めて、
ペンタペプチドＧＲＧＤＳとＢ１６−Ｆ１０ネズミ黒色
腫細胞とを一緒に注入するとＣ５７ＢＬ／６マウス中の
肺コロニーの生成を顕著に抑制することを示した。ラミ
ニン（ＹＩＧＳＲ）から誘導されたもう１つの合成ペプ
チドもまた、Ｃ５７ＢＬ／６マウス中のＢ１６−Ｆ１０
黒色腫細胞転移を顕著に抑制した（Ｋｌｅｉｎｍａｎ，
　Ｈ．Ｋ．他、　（１９８７）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３
８：１１３２−１１３３；　Ｋｌｅｉｎｍａｎ，　Ｈ．
Ｋ．他、　（１９９０）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａ
ｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７：２２７９−２２８
３）。これらのペプチドの抑制活性は、この腫瘍細胞の
転移切開中の、標的となる器官の血管床に対する腫瘍細
胞の内因性ラミニンおよびフィブロネクチン依存接着と
の競争による可能性がある。

【００１１】転移は１つの部位からもう１つの部位への
リンパおよび血液循環を通しての腫瘍細胞の移動を伴う
段階的過程であり、そして動物中の血小板減少が有効に
動物中の転移を防いだため（Ｇａｓｉｃ他、（１９８６
）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳ
Ａ　４８：４６−５２）、血小板が転移の進行に特別な
役割を果していると考えられてきた。ＴＳＰは全体のア
ルファ顆粒血小板分泌蛋白質の２５％を含んでいるため
、ＴＳＰが、腫瘍細胞を離れた器官に血行性移動させる
、主要な役割を有していると期待される。実際、ＴＳＰ
はネズミのモデルにおいて腫瘍細胞転移を促進すること
が示された（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ他、　（１９８７）　
４７：４１３０−４１３３）。更に、血小板活性化を伴
う出来事、例えば接着性蛋白質の分泌、血小板凝縮、蛋
白分解酵素の活性化、および凝固性カスケードの活性化
が、全て、腫瘍細胞転移において重要な役割を果してい
ることが示された（Ｇａｓｉｃ，Ｇ．Ｊ．、　（１９８
４）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　Ｒｅｖ．
　３：９９−１１６）。

【００１２】細胞外マトリックスの一部である接着性蛋
白質は、数多くの細胞種の動き、増殖、および形態を調
節している。細胞外マトリックス蛋白質は、腫瘍細胞レ
セプタに対して相互作用を示し、そして異なる様式で、
基底膜コラーゲンに対する腫瘍細胞接着に影響を与える
。例えばラミニンに対してインビトロで黒色腫瘍細胞を
暴露すると、この基底膜に対する腫瘍細胞の接着能力を
増大させ、そして肺腫瘍コロニーを生産する能力を上昇
させる（Ｂａｒｓｋｙ，Ｓ．Ｈ．他、　（１９８４）　
Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖ．　７４：８４３−８４８；
　Ｔｅｒｒａｎｏｖａ，Ｖ．Ｐ．他、　（１９８４）　
Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２６：９８２−９８５）。

【００１３】上述した情報を鑑み、ＴＳＰは、数多くの
様式の臨床的に重要な過程、例えば細胞移動、創傷治癒
、神経再生、および腫瘍細胞転移において重要な役割を
果している可能性がある。分子レベルでのこれらの過程
の病態生理学をより良く理解するため、ＴＳＰの特定な
サブドメインもしくはオリゴペプチドに対するＴＳＰの
生物活性の各々を研究することにより、価値ある情報が
得られるであろう。特に、ＴＳＰおよびＴＳＰレセプタ
のドメイン構造に関する詳細な知識は、ＴＳＰの病態生
理学活性、例えばＴＳＰ依存腫瘍細胞転移形成を防ぐこ
とのできるＴＳＰ拮抗ペプチドを設計するために利用で
きる。

【００１４】ＴＳＰは、種類Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ反
復で表示される３つの同族ペプチド配列を有している（
ＬａｗｌｅｒおよびＨｙｎｅｓ、　（１９８６）　Ｊ．
　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１０３：１６３５−１６４
８）。これらの３つの反復は、各々が６個のシステイン
残基を有している約６０個のアミノ酸から成っている。 種類Ｉの反復は、数多くの多様な蛋白質中に見いだされ
るペプチド配列に対して相同性を示す。我々はＴＳＰ中
に、他の蛋白質中に全体として保存されているか、或は
明らかに無関係の蛋白質中の１個または２個の保存的ア
ミノ酸置換基と一緒に存在しているか、或はそれらのｃ
ＤＮＡ配列によりコード化されるかまたは予測されると
ころの、２つのヘキサペプチド配列（ＣＳＴＳＣＧおよ
びＣＳＶＴＣＧ）を同定した。この保存された配列が広
範に存在していることを下記の表Ｉ中に示す。

【００１５】

【表１】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表Ｉ蛋白質　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　配列　　　　　　　　　　
　　　　　参照ＴＳＰ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　ＣＳＶＴＣＧ　　　Ｌａｗｌｅｒ他、　（１
９８６）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　ＣＳＴＳＣＧ　　　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏ
ｌ．　１０３：１６３５−４８サーカムスポロゾイト　
　　　　　ＣＳＶＴＣＧ　　　Ｄａｍｅ　Ｊ．Ｂ．他、
　（１９８４）（Ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ　２２５：５９３−５９９トラップ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　ＣＳＶＴＣＧ　　　Ｒｏｂｓ
ｏｎ　Ｋ．Ｊ．Ｈ．他、　（１９８８）　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　Ｎａｔｕｒｅ　３３５：７９−８２
プロパージン　　　　　　　　　　　　　　ＣＳＶＴＣ
Ｇ　　　Ｇｏｕｎｄｉｓ，　Ｄ．他、　（１９８８）　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　Ｎａｔｕｒｅ　３３５
：８２−８５糖タンパクＥ　　　　　　　　　　　　　
　ＣＶＶＴＣＧ　　　ＭｃＧｏｅｃｈ　Ｄ．Ｊ．他、　
（１９８５）ヘルペス担体Ｉ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉ
ｏｌ．　１８１：１−１３チトクロームＣ　　　　　　
　　　　　　ＣＳＥＴＣＧ　　　Ｌａｗｓｏｎ，　Ｊ．
Ｅ．他、　（１９８５）オキシダーゼ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｃｕｒｒ
．　Ｇｅｎｅｔ．　９：３５１−３６０ポリペプチドＩ
Ｉ 呼吸性硝酸還元　　　　　　　　　　　　ＣＳＶＴＣＫ
　　　Ｂｌａｓｃｏ，　Ｆ．他、　（１９８９）ベータ
鎖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．
　２１８：２４９−２５６バードスパイダー１８Ｓ　　
　　ＣＳＶＳＣＧ　　　Ｈｅｎｄｒｉｋｓ　Ｌ．他、　
（１９８９）リボゾームのＲＮＡ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．　１７７：１５−２０ニワトリのアルファ　　
　　　　　　ＣＳＶＶＣＧ　　　Ｌｅｍｉｓｃｈｋａ　
Ｉ．Ｒ．他、　（１９８１）チューブリン　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｊ．
　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　１５１：１０１−１２０ゼブ
ラダニオの　　　　　　　　　　　　ＣＳＫＴＣＧ　　
　Ｎｊｏｌｓｔａｄ　Ｐ．Ｒ．他、　（１９９０）ホメ
オボックス遺伝子　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　ＥＭＢＯ　Ｊ．　９：５１５−５２４大腸菌腸
　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＣＳＶＴＣＸ　
　　Ｙａｍａｄａ　Ｍ．他、　（１９８７）オペロン　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６２：５４
５５−５４６３大腸菌のＡＴＰアーゼ　　　　　　ＣＳ
ＶＴＣＭ　　　Ｋａｎａｚａｗａ　Ｈ．他、　（１９８
１）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＢＢＲＣ：１０
３：６１３−６２０ラットの肝臓　　　　　　　　　　
　　　　ＣＳＶＧＣＧ　　　Ｐｏｎｃｉｎ　Ｊ．Ｅ．他
、　（１９８４）アポリポたんぱくＡ−Ｉ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．　１４０：４９３トリプトファン　　　　　　
　　　　　　ＣＷＶＴＣＧ　　　Ｂｒｏｓｉｕｓ，　Ｊ
．他、　（１９８２）シンセターゼ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｇｅｎｅ　
１７：２２３−２２８Ｈｉｇｈｌａｎｄｓ　Ｊ　ウイル
ス　　　　　　ＣＳＶＴＣＬ　　　Ｏｕ　Ｊ．Ｈ．他、
　（１９８２）　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｊ．
　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　１５６：７１９−７３０ヒト
ｃ−ｍｙｂ　　　　　　　　　　　　ＣＳＶＴＣＫ　　
　Ｓｌａｍｏｎ　Ｄ．Ｊ．他、　（１９８６）原・腫瘍
遺伝子　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３３：３４７−３５１ア
ンチスタシン　　　　　　　　　　　　ＣＲＫＴＣＰ　
　　Ｇｉｎｓｂｅｒｇ　Ｖ．他、　（１９９０）（Ａｎ
ｔｉｓｔａｓｉｎ）　　　　　　　　　　　　ＣＲＶＨ
ＣＰ　　　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６４：１
２１３８−１２１４０Ｅｔｐ１００　　　　　　　　　
　　　　　ＣＶＣＥＣＧ　　　Ｔｏｍｌｅｙ　Ｆ．他、
　（１９８９）　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　ＣＳＡＴＣＧ　　　５ｔｈ　Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｃｃｉｓｉｏｓｉｓ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＣＳ
ＲＴＣＧ　　　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　４６９−５７３
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　ＣＳＥＱＣＧヒトデスミン　　　　　　　　　　　　
　　ＣＳＶＴＣＨ　　　Ｌｉ　Ｚ．他、　（１９８９）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　Ｇｅｎｅ　７８：２
４３−２５４ヒト関連***　　　　　　　　　　　　　
　ＣＳＶＰＣＧ　　　Ｍａｙ　Ｆ．Ｅ．Ｂ．他、　腫瘍
ウイルス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ　６０：７４３−７
４９ヒト原・腫瘍遺伝子　　　　　　　　ＣＳＲＴＣＧ
　　　Ｏｕｗｅｌａｎｄ　Ａ．Ｍ．Ｗ．他、　ｃ−ｆｅ
ｓ／ｆｐｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　ＥＭＢＯ　Ｊ．　４：２８９７−２９０３血小板
ＧＰＩＩｂ　　　　　　　　　　ＣＳＶＴＣＲ　　　Ｂ
ｒａｙ　Ｐ．Ｆ．他、　（１９８７）　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　
８０：１８１２−１８１７ 　　本発明は、無傷のトロンボスポンジンの生物活性を
模擬するか或は抑制するトロンボスポンジンフラグメン
トおよび類似物を提供するものであり、そしてこれは、
種々の生物学的、予防もしくは治療領域で使用できる。

【００１６】

【発明の要約】トロンボスポンジンの特異的ドメインか
らのフラグメントもしくは合成類似物の種類は種々の用
途を有していることがここに見いだされた。これらのペ
プチド類は、細胞接着、細胞移動、細胞付着、および細
胞拡散に関して効力を示す増強剤もしくは抑制剤として
の、ＴＳＰの生物活性を維持しそして模擬する。これら
のペプチド類は、それらの接着活性により、腫瘍細胞の
増殖および転移、細胞接着、脈管形成および血小板凝集
を増強および抑制する能力を有する。これらのペプチド
の増強および抑制特性は、内因性ＴＳＰの存在の有無に
依存していることが見いだされた。内因性ＴＳＰが存在
している場合、これらのペプチド類はトロンボスポンジ
ン様活性を抑制する。ＴＳＰが存在していない場合、こ
れらのペプチド類はトロンボスポンジン様活性を促進す
る。

【００１７】１つの面において、これらのペプチド類は
、癌、アテローム性動脈硬化、血栓症、および炎症性の
病気を含む種々の治療分野で有益である。これらのペプ
チド類は、転移を抑制するか、或は腫瘍の増殖を退縮さ
せるかまたは抑制することにより、癌の進行を阻害する
。これらのペプチド類が血小板凝集を抑制する能力を有
しているため、これらは、アテローム性動脈硬化および
血栓症の予防もしくは治療に有益である。これらのペプ
チド類は、脈管形成を抑制するため、炎症性疾患の治療
もしくは予防に有益である。

【００１８】もう１つの面において、これらのペプチド
類およびこれらのペプチドに対する抗体は、治療学的お
よび診断上の薬剤として有益である。これらの抗体の治
療学的用途は、上述した用途と類似している。

【００１９】本発明のもう１つの目的は、本発明のペプ
チド類もしくは抗体を用いた医薬装置を提供することに
ある。これらのペプチド類または抗体を使用することで
、トロンボスポンジン様活性を抑制（即ち、血小板凝集
を抑制）して、内因性ＴＳＰを含有しているサンプルの
通過を容易にし、そしてこの装置の損傷を減少させる。

【００２０】もう１つの面において、ある環境下でトロ
ンボスポンジン様活性を増強する該ペプチド類および抗
体の能力の利点を用いることも可能である。これらのペ
プチド類および抗体は、最適細胞培養、種々の人工器官
材料の誘導化、および周辺組織の結合促進のための表面
を調製するために用いられ得る。インビボで表面に細胞
を引き付けるか、或は移植に先立って、特定の表面上に
所望の細胞種の増殖を促進させるため、上記基質を用い
た医薬装置もまた設計できる。

【００２１】本発明のＴＳＰペプチド類および類似物は
トロンボスポンジン様活性を有することが見いだされた
。従って、本発明は、１つの面において、式

【００２２
】

【化２】Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｒ２［
式中、Ｒ１は、水素、アミノ、アセチルまたは１００個
以下のアミノ酸残基、好適には２０個以下のアミノ酸残
基、最も好適には１０個以下のアミノ酸残基を含む、保
護されているか或は未保護の末端アミノ基或はそれらの
デスアミノ型であり、Ｘ１およびＸ５は、同一もしくは
異なり、中性／小型アミノ酸残基であり、好適にはシス
テイン、セリン、およびアラニンから成る群から選択さ
れ、そして最も好適にはシステインまたはアラニンから
成る群から選択され、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、同一も
しくは異なり、中性／非極性／大型／非環状、或は中性
／極性／大型／非環状、或は中性／極性／小型、或は塩
基性／非環状の、アミノ酸残基であり、好適にはバリン
、トレオニン、セリン、およびアルギニンから成る群か
ら選択され、Ｒ２は、ヒドロキシル、カルボキシル、ま
たは１００個以下のアミノ酸残基、好適には２０個以下
のアミノ酸残基、そして最も好適には１０個以下アミノ
酸残基を含む、保護されているか未保護の末端カルボキ
シル基（それらのカルボキシアミドもしくはアルキルア
ミド型を含む）であり、好適にはリジン、グリシン、お
よびアルギニンから成る群から選択される］により同定
されるところの、トロンボスポンジン様活性を有するポ
リペプチド化合物（このポリペプチド構造物は、Ｘ１と
Ｘ５との間の結合、好適にはジスルフィド結合、或はＲ
１とＲ２との間の結合を通して任意に環化されている）
を意図したものである。

【００２３】本発明に従って提供されるものはまた、薬
学的に許容される液体、ゲルもしくは固体担体と一緒に
上で列挙したポリペプチド化合物を含有している薬学的
組成物である。。薬学的に有効量のこれらの組成物を投
与することにより、動物、特に哺乳動物および鳥類宿主
の如き脊椎動物に対するトロンボスポンジン様活性を有
効に増強もしくは抑制することができる。

【００２４】

【発明の詳細な記述】本発明に従って、インビボで哺乳
動物中のトロンボスポンジンの活性を抑制もしくは模擬
し得るところの、トロンボスポンジンのフラグメントお
よび類似物の種類を提供する。

【００２５】Ａ．定義 「トロンボスポンジン様活性」は、ここでは、トロンボ
スポンジンの公知の生物学的活性を模擬するいかなる活
性をも意味すると定義する。これらの活性には、細胞接
着促進活性、細胞***促進因子活性、細胞走化性活性お
よび止血活性、並びに腫瘍細胞、微生物または寄生虫の
転移活性の如きこれらの活性から誘導されるいかなる活
性、血小板凝集活性、フィブリノ溶解活性および免疫調
節が含まれる。

【００２６】「細胞接着活性」は、ここでは、細胞、好
適には哺乳動物細胞の、基質に対する付着を促進もしく
は抑制する能力として定義する。

【００２７】「血小板凝集活性」は、ここでは、血小板
が凝集する能力を抑制する能力として定義する。

【００２８】「抗転移活性」は、ここでは、腫瘍細胞転
移の度合もしくは大きさを防止するか或は大きく減少さ
せるか、或は主要な固体状腫瘍を抑制するか或は退縮を
生じさせる能力として定義する。

【００２９】「アテローム性動脈硬化活性」は、ここで
は、アテローム性硬化病巣形成を抑制するトロンボスポ
ンジンの能力として定義する。このアテローム性動脈硬
化病巣は、特に動脈壁中の、リピド含有材料の退化蓄積
として定義する。

【００３０】「抗血栓崩壊活性」は、ここでは、血小板
凝集を抑制するか、或は血栓形成を拮抗するかのどちら
かの能力として定義する。

【００３１】「血栓崩壊活性」は、ここでは、血栓の構
造を崩壊させる能力として定義する。

【００３２】「脈管形成活性」は、ここでは、血管また
はリンパ管の形成を抑制する能力として定義する。

【００３３】本ポリペプチド化合物のアミノ酸残基の配
列、そのコアのペンタペプチド、およびそれらの好適な
具体例は、特別な下位分類の特定な特性を有するアミノ
酸によって定義する。

【００３４】アミノ酸残基は、一般に、下記の如き４つ
の主要な下位分類に分類分けできる： 酸性、即ち、この残基は、生理学的ｐＨでＨイオンを損
失することにより負の電荷を有しており、そしてこの残
基は、このペプチドが水系媒体中に存在しているとき、
それが含有されるペプチド構造中の表面位置を求めるよ
うに、水溶液によって引き付けられる。

【００３５】塩基性、即ち、この残基は、生理学的ｐＨ
でＨイオンと会合することにより正の電荷を有しており
、そしてこの残基は、このペプチドが水系媒体中に存在
しているとき、それが含有されるペプチド構造中の表面
位置を求めるように、水溶液によって引き付けられる。

【００３６】中性／非極性、即ち、この残基は、生理学
的ｐＨで帯電しておらず、そしてこの残基は、このペプ
チドが水系媒体中に存在しているとき、それが含有され
るペプチド構造中の内部位置を求めるように、水溶液に
よって押し返される。

【００３７】中性／極性、即ち、この残基は、生理学的
ｐＨで帯電しておらず、そしてこの残基は、このペプチ
ドが水系媒体中に存在しているとき、それが含有される
ペプチド構造中の外側の位置を求めるように、水溶液に
よって引き付けられる。

【００３８】勿論、個々の残基の分子が統計的に集まる
とき、いくつかの分子は帯電し、そしていくつかの分子
は帯電しないと理解される。帯電に関する定義を適合さ
せるため、有意なパーセント（少なくとも約２５％）の
個々の分子が生理学的ｐＨで帯電させられる。

【００３９】アミノ酸残基は、更に、環状または非環状
、この残基の側鎖置換基に関する自己説明的分類分け、
および小型または大型として、下位分類を行うことがで
きる。この残基が、全体で３個またはそれ以下の炭素原
子を有している場合、これを小型と見なす。小型の残基
は、勿論、常に非環状である。

【００４０】天然に存在している蛋白質アミノ酸に関し
て、前述した分類に従う下位分類は下記の通りである：
酸性：　　アスパラギン酸およびグルタミン酸；塩基性
／非環状：　　アルギニンおよびリジン塩基性／環状：
　　ヒスチジン； 中性／極性／小型：　　グリシン、セリンおよびシステ
イン； 中性／極性／大型／非環状：　　トレオニン、アスパラ
ギンおよびグルタミン； 中性／極性／大型／環状：　　チロシン；中性／非極性
／小型：　　アラニン； 中性／非極性／大型／非環状：　　バリン、イソロイシ
ン、ロイシンおよびメチオニン； 中性／非極性／大型／環状：　　フェニルアラニンおよ
びトリプトファン。

【００４１】蛋白質アミノ酸のプロリンは、中性／非極
性／大型／環状の分類に入るが、ペプチド鎖の第二構造
に対するその公知の効果により代替物として含まれない
。

【００４２】通常に遭遇する特定の非天然アミノ酸、例
えばデスアミノトリシン（デスＴｙｒ）、アグマチン（
Ａｇｍ）、ｎ−ホルミルトリプトファン（ｆ−Ｔｒｐ）
、アルファ−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、およびサクロ
シン（Ｓａｒ）、スタチン、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホ
モリジン、ホモセリン、ホモアルギニン、ノルロイシン
（Ｎｌｅ）、ノルバリンもまた、本発明の化合物中に組
み入れることができる。デスアミノチロシンは、そのＮ
末端で組み入れられる。アグマチンおよびスタチンは、
そのＣ末端で組み入れられる。上の定義を基準にして、
ｎ−ホルミルＴｒｐは中性／非極性／大型／環状であり
、Ｓａｒは中性／非極性／小型であり、Ａｉｂは中性／
非極性／非環状であり、Ｏｒｎは塩基性／非環状であり
、ホモリジンは塩基性／非環状であり、ホモセリンは中
性／極性／小型であり、ホモアルギニンは塩基性／非環
状であり、ノルロイシンは中性／非極性／大型／非環状
であり、そしてノルバリンは中性／非極性／大型／非環
状である。

【００４３】本発明のポリペプチド化合物を記述するた
めに用いる学術用語は、アミノ基が各々のアミノ酸残基
の左側に表されておりそしてカルボキシ基が右側に表さ
れているところの、従来からの実施に従う。本発明の選
択された特異的具体例を表す式において、アミノおよび
カルボキシ末端基は、特に示されていないが、特に明記
されていない限り、生理学的ｐＨ値でそれらが示してい
ると考えられる形態で存在していると理解される。アミ
ノ酸構造式において、各々の残基は、一般に、以下に示
す計画に従って、アミノ酸の通称名に相当する１文字も
しくは３文字表示によって表す： アミノ酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３
文字記号　　　　　　　　１文字記号アラニン　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｌａ　　　　　　
　　　　　　　　　　Ａアルギニン　　　　　　　　　
　　　　　　　　　Ａｒｇ　　　　　　　　　　　　　
　　　Ｒアスパラギン　　　　　　　　　　　　　　　
　Ａｓｎ　　　　　　　　　　　　　　　　Ｎアスパラ
ギン酸　　　　　　　　　　　　　　Ａｓｐ　　　　　
　　　　　　　　　　　Ｄシステイン　　　　　　　　
　　　　　　　　　　Ｃｙｓ　　　　　　　　　　　　
　　　　Ｃグルタミン　　　　　　　　　　　　　　　
　　　Ｇｌｎ　　　　　　　　　　　　　　　　Ｑグル
タミン酸　　　　　　　　　　　　　　　　Ｇｌｕ　　
　　　　　　　　　　　　　　Ｅグリシン　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　Ｇｌｙ　　　　　　　　
　　　　　　　　Ｇヒスチジン　　　　　　　　　　　
　　　　　　　Ｈｉｓ　　　　　　　　　　　　　　　
　Ｈイソロイシン　　　　　　　　　　　　　　　　Ｉ
ｌｅ　　　　　　　　　　　　　　　　Ｉロイシン　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｌｅｕ　　　　
　　　　　　　　　　　　Ｌリジン　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　Ｌｙｓ　　　　　　　　　
　　　　　　　Ｋメチオニン　　　　　　　　　　　　
　　　　　　Ｍｅｔ　　　　　　　　　　　　　　　　
Ｍフェニルアラニン　　　　　　　　　　　　Ｐｈｅ　
　　　　　　　　　　　　　　　Ｆプロリン　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　Ｐｒｏ　　　　　　　
　　　　　　　　　Ｐセリン　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　　
　　　　Ｓトレオニン　　　　　　　　　　　　　　　
　　　Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　　　　　　Ｔトリ
プトファン　　　　　　　　　　　　　　Ｔｒｐ　　　
　　　　　　　　　　　　　Ｗチロシン　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　Ｔｙｒ　　　　　　　　　
　　　　　　　Ｙバリン　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　Ｖａｌ　　　　　　　　　　　　　　
　　Ｖ本出願において、光学的異性体を有するいかなる
アミノ酸残基のＬ型も、特に指示されていない限り、例
えば記号「［Ｄ−Ｘｎ］」によって表すものとする。

【００４４】本発明の範囲内にある化合物は、このよう
にして得られるポリペプチド化合物の活性を保持しなが
ら、この開示した式を数多くの様式で修飾することによ
って、得ることができる。例えば、これらの化合物のア
ミノ酸は、通常、天然のＬ光学異性体形態で存在してい
るが、１つ以上、通常２つ以下、好適には１個のアミノ
酸を、光学異性体のＤ型で置き換えるか、或はポリペプ
チド化合物を構成している分子中にＤ，Ｌ−ラセミ混合
物を与えることができる。

【００４５】更に、ジスルフィド結合は、活性が維持さ
れている限り、本発明の化合物中に存在していても存在
していなくてもよい。本分野の技術者によって認識され
るように、分枝させるか或は環状の鎖は、アミノもしく
はカルボキシル部分を有するアミノ酸側基とのペプチド
結合形成により生じさせることができる。上記側基を有
するアミノ酸には、例えばグルタミン酸（カルボキシル
基）、アスパラギン酸（カルボキシル基）およびリジン
（アミド基）が含まれる。分枝もしくは環状鎖はまた、
硫黄含有側基を有するアミノ酸残基、例えばシステイン
間の共有ジスルフィド結合の形成を通して生じさせるこ
ともできる。

【００４６】ここで用いる「保護された」末端アミノ基
は、ペプチド合成で従来から用いられている種々のアミ
ノ末端保護基のいずれかで連成させた末端アミノ基を表
す。適切な基の例には、アシル保護基、例えばホルミル
、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、スク
シニル、およびメトキシスクシニル；芳香族ウレタン保
護基、例えばベンジルオキシカルボニル；および脂肪族
ウレタン保護基、例えば第三ブトキシカルボニルまたは
アダマンチルオキシカルボニルが含まれる。Ｇｒｏｓｓ
およびＭｉｅｎｈｏｆｅｒ編集、　Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉ
ｄｅｓ、　３巻、　３−８８頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ
ｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８１）は、数多
くの適切な末端アミノ保護基を開示している。

【００４７】ここで用いる「保護された」末端カルボキ
シル基は、種々のカルボキシ末端保護基のいずれかで連
成させた末端カルボキシル基を表す。本分野の技術者に
とって既に明らかなように、適切な基には、第三ブチル
、ベンジル、或はエステルもしくはエーテル結合を通し
て末端カルボキシル基と結合する他の許容される基が含
まれる。

【００４８】本化合物内に含まれるアミノ酸残基、およ
び特にカルボキシ末端またはアミノ末端のアミノ酸残基
もまた、それらの活性に対して逆効果を与えることなく
、例えば循環半減期、プロテアーゼに対する耐性、およ
びこれらの化合物の溶解性を変化させ得るところの、他
の化学基を用いて、メチル化、アミド化、アセチル化ま
たは置換することによって修飾され得る。

【００４９】前述した定義に加えて、本発明の記述を通
して下記の省略形が用いられる： ＢＣＡ　　　　　　　　　　ビシンコニン酸ＢＳＡ　　
　　　　　　　　ウシの血清アルブミンｔ−Ｂｏｃ　　
　　　　ｔ−ブチルオキシカルボニルＢｚｌ　　　　　
　　　　　ベンジル ℃　　　　　　　　　　　　　　摂氏度ＤＣＭ　　　　
　　　　　　ジクロロメタンＤＩＥＡ　　　　　　　　
ジイソプロピルエチルアミンＤＭＥＭ　　　　　　　　
Ｄｕｌｂｅｃｃｏの最小必須媒体ＤＭＦ　　　　　　　
　　　ジメチルホルムアミドＨＦ　　　　　　　　　　
　　フッ化水素ＨＯＢＴ　　　　　　　　１−ヒドロキ
シベンゾトリアゾールＨＰＬＣ　　　　　　　　高性能
液クロｍＢＨＡ　　　　　　　　メチルベンズヒドリル
アミンμｇ　　　　　　　　　　　　ミクログラムμＬ
　　　　　　　　　　　　ミクロリットルｍＬ　　　　
　　　　　　　　ミリリットルｍＭ　　　　　　　　　
　　　ミリモルｎｍ　　　　　　　　　　　　ナノメー
ターＮＭＰ　　　　　　　　　　Ｎ−メタンピロリドン
％　　　　　　　　　　　　　　パーセントＰＡＭ　　
　　　　　　　　フェニルアセトアミドメチルＰＢＳ　
　　　　　　　　　燐酸塩緩衝食塩水ＴＦＡ　　　　　
　　　　　トリフルオロ酢酸Ｂ．好適な具体例 本発明のポリペプチド化合物は、全て、コアのペンタペ
プチド配列：

【００５０】

【化３】Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｒ２［
式中、Ｒ１は、水素、アミノ、アセチルまたは１００個
以下のアミノ酸残基、好適には２０個以下のアミノ酸残
基、最も好適には１０個以下のアミノ酸残基を含む、保
護されているか或は未保護の末端アミノ基、或はそれら
のデスアミノ型であり、Ｘ１およびＸ５は、同一もしく
は異なり、中性／小型アミノ酸残基であり、好適にはシ
ステイン、セリン、およびアラニンから成る群から選択
され、そして最も好適にはシステインまたはアラニンか
ら成る群から選択され、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、同一
もしくは異なり、中性／非極性／大型／非環状、或は中
性／極性／大型／非環状、或は中性／極性／小型、或は
塩基性／非環状の、アミノ酸残基であり、好適にはバリ
ン、トレオニン、セリン、およびアルギニンから成る群
から選択され、Ｒ２は、ヒドロキシル、カルボキシル、
または１００個以下のアミノ酸残基、好適には２０個以
下のアミノ酸残基、そして最も好適には１０個以下アミ
ノ酸残基を含む、保護されているか未保護の末端カルボ
キシル基（それらのカルボキシアミドもしくはアルキル
アミド型を含む）であり、好適にはリジン、グリシン、
およびアルギニンから成る群から選択される］を有して
おり、このポリペプチドの構造は、Ｘ１とＸ５との間の
結合、好適にはジスルフィド結合、或はＲ１とＲ２との
間の結合を通して任意に環化されている。

【００５１】特に好適なものは、該配列が下記のもの（
該配列は、Ｃ末端の酸およびアミド形態、ジスルフィド
結合した形態、およびブロックされたシステイン形態を
含んでいる）から成る群から選択される具体例である：

【００５２】

【表２】

【００５３】最も好適な具体例は下記のものから成る群
から選択される：

【００５４】

【表３】　　本発明の範囲内に入る化合物は、本分野で
よく知られた手段、例えば

【００５５】固相ペプチド合成などにより化学的に合成
できる。この合成は、アルファ−アミノ保護されたアミ
ノ酸を用いて、該ペプチドのカルボキシ末端から開始さ
れる。ｔ−ブチロカルボニル（Ｂｏｃ）保護基が全ての
アミノ基に関して使用できるが、他の保護基も適切であ
る。Ｓｔｅｗａｒｔ他、「固相ペプチド合成」（Ｓｏｌ
ｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｃｏ．、　Ｓａｎ　Ｆ
ｒａｎｃｉｓｃｏ　（１９６９）およびＭｅｒｒｉｆｉ
ｅｌｄ、　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ、　８５
：２１４９−２１５４　（１９６３）、　Ｖａｌｅ他、
　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１３、　１３９４−１３９７（１
９８１）、　およびＭａｒｋｅ他、　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃ
ｈｅｍ．　Ｓｃｉ．　１０３、　３１７８　（１９８１
）参照。利用できる他の合成方法には、Ｈｏｕｇｈｔｏ
ｎ　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　ＡＣＡＤ　Ｓｃｉ．　８
２：５１３２　（１９８１）の方法が含まれ、或は特に
小型の分枝もしくは環状鎖ペプチド類のためのもう１つ
の好適な合成操作には、従来からの液相方法が含まれる
。この液相方法、並びに他の合成方法が、「ペプチド合
成の法則」（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄ
ｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ編集、
　Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒｌａｇ　１９８４中に記述され
ている。ペプチド合成に関するこれらのおよび他の方法
はまた、米国特許番号３，８６２，９２５、　３，８４
２，０６７、　３，９７２，８５９および４，１０５，
６０２、　４，６８３，２９１、　４，２４４，９４６
および４，３０５，８７２によって例示されている。　
　便利に、化合物は、マニュアル技術を用いるか、或は
例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ　４３０Ａ
ペプチド合成装置（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ、　Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ）またはＢｉｏｓｅａｒｃｈ　ＳＡＭ　
ＩＩ自動ペプチド合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，　Ｉ
ｎｃ．、　Ｓａｎ　Ｒａｆａｅｌ、　Ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉａ）を用い、その製造業者が提供する指示マニュアル
中に与えられている教示に従って自動的に合成されても
よい。

【００５６】この合成したペプチドに関して、９５％以
上の純度が好適であるが、より低い純度も許容される。 例えば２つのシステインアミノ酸が結合している環状ペ
プチドか、或はこの残基がジスルフィドブリッジを有し
ているところの環状ペプチド類を得るため、これらは、
このペプチドの希釈水溶液をＫ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］で
酸化することによって生じさせてもよい。本分野で公知
の他の環化手段も利用できる。本発明の安定化された環
化ペプチドは、非隣接アミノ酸残基間のペプチド結合の
形成により製造されてもよい。上記ペプチド結合を生じ
させる操作は、Ｓｃｈｉｌｌｅｒ他、　Ｉｎｔ．　Ｊ．
　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ．　（１９
８５）　２５：１７１によって与えられた。本発明の化
合物を合成する過程中の本開示に従って構成される中間
体それ自身は有益な化合物であり、従ってそれらが本発
明の範囲内に入れらることは、ペプチド合成に関する本
分野の通常の技術者によって容易に評価されるであろう
。

【００５７】二者択一的に、本発明の選択された化合物
は、よく知られた方法に従って調製された組換えＤＮＡ
の発現によって生産できる。上記生産は、上記化合物の
大量もしくは代替具体例を与えるに望ましいものである
。

【００５８】Ｃ．投与 本発明の化合物は、無傷の動物中でトロンボスポンジン
様活性を有する。本発明の化合物、並びに無傷のトロン
ボスポンジンの効果を抑制するか或は模擬する生理学的
効果を有することを示すところの、それらを含有してい
る組成物は、数多くの治療および予防用途、例えば癌治
療、創傷治癒、血栓もしくは血栓崩壊状態、脈管形成、
或は細胞付着で使用できる。

【００５９】従って、本発明はまた、単独で、上で詳述
した治療上の利点を与えるために働くところの、それら
の無毒の付加塩、アミド類およびエステル類を含むとこ
ろの、本発明の化合物の有効量を含有している組成物も
提供する。上記組成物はまた、生理学的に許容される液
状、ゲルまたは固体状希釈剤、アジュバントおよび賦形
剤と一緒に用いられてもよい。

【００６０】これらの化合物および組成物は、獣医学的
使用、例えば家庭用動物に対する使用、並びに他の治療
薬と同様な様式でのヒトに関する臨床的使用のため、動
物に投与することができる。一般に、治療的有効性に必
要な服用量は、宿主の体重１ｋｇ当たり、約１μｇ〜３
００ｍｇ、より通常には１０μｇ〜３０ｍｇの範囲であ
る。二者択一的に、これらの範囲にある服用量を、長期
間、所望の治療学的恩恵が得られるまで通常２４時間以
上、に渡る一定の注入により投与することができる。

【００６１】典型的に、上記組成物は、液体溶剤または
懸濁剤のどちらかとしての注射可能物として製造され、
そして注射に先立って、液体中に溶液化或は懸濁化する
に適切な固体状形態として製造されてもよい。この調剤
もまた乳化できる。この活性材料は、しばしば、生理学
的に許容されそして該活性材料と相溶する希釈剤もしく
は賦形剤と混合される。適切な希釈剤および賦形剤は、
例えば水、食塩水、右旋性ブドウ糖、グリセロールなど
、およびそれらの組み合わせである。加うるに、望まれ
るならば、該組成物は少量の補助物質、例えば湿潤化剤
、乳化剤、安定化剤またはｐＨ緩衝剤などを含有してい
てもよい。

【００６２】本組成物は、例えば皮下もしくは静脈内注
射による非経口で通常投薬される。他の様式の投与に適
切な追加的調剤には、座薬、鼻腔内エーロゾル、および
ある場合には経口調剤が含まれる。座薬のための従来か
らの固着剤および賦形剤には、例えばポリアルキレング
リコール類またはトリグリセライド類が含まれ、そして
上記座薬は、０．５％〜１０％、好適には１％〜２％の
範囲の活性材料を含有している混合物から製造されても
よい。経口調剤には、例えば薬学グレードのマンニトー
ル、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サ
ッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムな
どの如き通常に用いられる賦形剤が含まれる。これらの
組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、ピル、カプセル、徐放
調剤、または粉剤の形態を取り、そして１０％〜９５％
、好適には２５％〜７０％の活性材料を含有している。 これらの経口調剤には、それが吸収されるまでそのペプ
チドを保護するように設計された調剤が含まれる。

【００６３】これらのペプチド化合物は、中性もしくは
塩の形態として該組成物中に調合されてもよい。薬学的
に許容される無毒の塩類には、酸付加塩（遊離アミノ基
を用いて製造される）が含まれ、そしてこれらは、例え
ば塩酸または燐酸の如き無機酸、或は酢酸、しゅう酸、
酒石酸、マンデル酸の如き有機酸を用いて製造される。 これらの遊離カルボキシル基を用いて製造される塩類は
、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ア
ンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄の如き
無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミ
ン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカ
インなどの如き有機塩基から誘導されてもよい。

【００６４】トロンボスポンジン様活性を示す本発明の
化合物に加えて、本発明の化合物もまた、上記有益な化
合物の合成における中間体として使用できる。

【００６５】本発明の化合物はそれ自身に対してホモ重
合（即ち、（ペプチド）ｎ）するか、或は互いにヘテロ
重合（即ち、（ペプチド１−ペプチド２））できる。こ
れらの化合物はまた、ジスルフィドまたはこの手段を通
して環化できる。これらの化合物はまた、生物学的相溶
性を示すポリマー状化合物、例えばＢＩＯＰＯＬＴＭポ
リマー類（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ　＆　Ｃｏ．　−Ｃｏｎ
ｎ．）に結合させることができる。

【００６６】いかなる理論によっても範囲を限定される
ことを望むものではないが、本発明の組成物は、天然の
トロンボスポンジンに対する作用薬もしくは拮抗薬とし
て働くものと考えられる。これらの化合物はまた、サー
カムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ
）蛋白質、トロンボスポンジンに関連した不明の蛋白質
、アンチスタシン（ａｎｔｉｓｔａｓｉｎ）、およびプ
ロパージン相補蛋白質に対する作用薬もしくは拮抗薬と
して作用するとも考えられる。更に、本発明の化合物の
大きさは小型であるため（無傷のトロンボスポンジンに
比較して）、それらが示す特性は、他の一般的な接着性
化合物、例えばＲＧＤ含有化合物（この配列は１００個
以上の蛋白質中で見いだされる）およびフィブロネクチ
ン、の作用とは逆に、実際上特異的である傾向が高い。 本発明のペプチド化合物の副作用は、これらの幅広い接
着性を示す化合物に比較して、大きく減少する。

【００６７】Ｄ．用途 前述したように、本発明の化合物は、種々の生物学的、
予防もしくは治療領域で使用できる。これらの化合物は
、トロンボスポンジン様活性が役割を果しているところ
の、いかなる病気段階もしくは状態の予防もしくは治療
において有益であると考えられる。これらの病気段階お
よび状態には、これに限定されるものではないが、癌、
アテローム性動脈硬化、心臓血管症、および炎症性症状
が含まれる。本発明の化合物に向かう抗体もまた、診断
薬、治療薬、或は他の化合物の担体として有益である。 これらの化合物はまた生物医学用装置で用いられ得る。

【００６８】トロンボスポンジン様活性を有する化合物
を示すために、数多くのインビトロおよびインビボ分析
法が使用できる。これらの分析法には、これに限定され
るものではないが、細胞接着法、血小板凝集法および細
胞増殖法が含まれる。

【００６９】転移 転移は、血液流もしくはリンパ系による悪性腫瘍細胞の
移動におけるが如く、体の一部からそれに無関係の他の
部分に病気が広がることである。転移は、内皮に対する
腫瘍細胞の接着、内皮の退縮、基底膜のマトリックス劣
化、および血液流への腫瘍細胞の侵入を含むカスケード
機構を通して行われるものと考えられる。更に、血小板
が、血液流中への腫瘍細胞の拡散、そして主要な腫瘍か
ら離れた部位における転移増殖において主要な役割を果
していると考えられる。このカスケード中のいかなる相
でも、干渉は転移癌の治療または予防にとって有益であ
る。

【００７０】天然のトロンボスポンジン分子は腫瘍細胞
転移を増強することが示された（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ他
、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　（１９８７）　
４７：４１３０−４１３３）。このトロンボスポンジン
増強が生じるメカニズムは、現在のところよくは分かっ
ていない。

【００７１】抗転移活性は、インビトロで黒色腫細胞に
対して結合するこれらの化合物の能力（Ｔｕｓｚｙｎｓ
ｋｉ他、　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｌ．　（１９９０）　１
８４：１８９−９１）およびインビボで腫瘍コロニーの
大きさおよび数を減少させる能力（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ
他、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　（１９８７）
　４７：４１３０−４１３３）として特徴づけられる。

【００７２】本発明の化合物は、抗転移剤として有益で
あり、特に抗肺転移剤として有益である。これらの化合
物は、転移性腫瘍細胞、特にトロンボスポンジンに反応
する細胞、の接着を抑制する。本化合物はまた、腫瘍コ
ロニーの数、並びに腫瘍コロニーの大きさを減少させる
。

【００７３】上記抗転移活性を生じさせ得る数多くの機
構が存在している。これらのペプチド類は、細胞毒性を
示すか、或は細胞増殖を抑制する。細胞増殖の抑制剤と
して、これらの化合物は、（１）有糸***誘発を抑制、
（２）脈管形成を抑制、或は（３）相補的通路および関
連したキラー細胞を活性化、するように働くことができ
る。該ペプチドが血小板凝集を抑制する場合、これは、
腫瘍細胞に対して相互作用を示す該血小板の能力を抑制
し、従って離れた所にある器官に種付けし得る血小板−
腫瘍塞栓形成を防止することも可能である。

【００７４】本発明の化合物はまた生物医学装置で使用
できる。これらの化合物は転移腫瘍細胞の付着を促進す
る能力を有しているため、血液またはリンパから循環し
ている腫瘍細胞を除去するこの化合物で生物医学装置を
コートすることも可能である。この生物医学装置はまた
肝細胞癌を捕捉するためにも有益である。

【００７５】これらの化合物のもう１つの用途は、診断
もしくは治療上の目的のための、標的トキシン、薬剤、
ホルモン、或は転移腫瘍細胞に対する画像診断剤に対す
る担体としてである。これらの担体はまた肝細胞癌と結
合する。

【００７６】抗血小板凝集 血小板凝集は、損傷を受けた組織の出血を止めるための
通常および有益な過程である。しかしながら、血小板凝
集は、心臓血管治療、例えば血管形成、血栓崩壊治療ま
たは血管移植の後、問題を生じ得る。血小板は、全体の
アルファ顆粒血小板分泌蛋白質中に、該ＴＳＰ蛋白質の
２５％にも及ぶ量を含有している。従って、該ＴＳＰ分
子中に保存されており、そして血小板の表面上のレセプ
タと結合するところの、ペンタペプチド配列を有するペ
プチドを導入すると、該血小板が凝集しそして血塊が生
成するのを、防止できる。

【００７７】抗血小板凝集活性は、（１）洗浄した血小
板中のＡＤＰもしくはトロンビン誘発血小板凝集の抑制
；（２）血小板が豊富な血漿中でのＡＤＰ誘発血小板凝
集の抑制；および（３）インビボで測定されるコラーゲ
ン誘発血小板凝集の抑制；を含む数多くの分析法によっ
て区別される。

【００７８】これらのペプチド類は、数多くの治療用途
、例えば末梢動脈手術中、、心臓血管手術中、または血
管形成後、に有益であり得る。該ペプチドはまた、予防
的に、心臓血管および虚血性疾患、並びに血小板凝集に
関連した病気を治療および防止するために用いられ得る
。本発明のペプチド類を基とする薬剤は、現在市販され
ている他の血塊溶解剤（例えばｔＰＡ、ストレプトキナ
ン）と一緒に使用するための、血管形成および血栓崩壊
治療に対する補助剤として使用できる。上記薬剤は、出
血を悪化させないか、或は合成抗血小板剤に通常の副作
用の危険性を有していない。更に、上記ペプチドは、小
さい直径の血管移植体が開いたままにさせておくための
補助を与え得る（例えば、心臓バイパス手術で使用され
るもの）。同様の用途が、発作の危険性を有する患者に
対して考えられる。該ペプチド類は、血液循環中、活性
の短い持続性を有しており、このため、このペプチド類
は、短期間の血小板凝集抑制が有益であるところの治療
処置（例えば、バイパス手術、血管形成など）において
望ましいものと考えられる。

【００７９】これらのペプチド類はまた診断用途におい
ても利用できる。該ペプチドは、透析膜上での血小板凝
集を減少させる努力において、透析患者に投与すること
ができる。二者択一的に、この透析膜に該ペプチドをコ
ートして、その流体サンプルが医学装置を通過するとき
の血小板凝集を防止することができる。

【００８０】脈管形成 脈管形成は血液およびリンパ管の形成である。本発明の
化合物は脈管形成を抑制するために有益である。脈管形
成は、固体状腫瘍の、進行中、創傷治癒中、および増殖
に関して必須である。脈管形成は複雑な過程であり、そ
して内皮細胞の発芽および移動、それらの増殖、および
管状構造への分化、並びに管の周囲における基底膜マト
リックスの生産が必要である（Ｈｅｒｂｅｒｔ他、　１
９８８、　Ｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１０６、　
１３６５−１３７３）。脈管形成はまた、腫瘍の進行、
増殖、および転移に必須である。脈管形成を防止するこ
とで、固体状腫瘍の増殖を抑制できる。本発明の化合物
を使用することで、脈管形成のカスケード過程における
１つ以上の段階を抑制することができ、従って上記ペプ
チドは、臨床的に転移を抑制するために有益であり得る
。本発明の化合物は、脈管形成の調節、特に腫瘍増殖の
抑制もしくは防止において有益である。本発明の化合物
はまた、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障およびリュー
マチ関節炎を含む炎症性の病気の抑制もしくは防止に有
益である。

【００８１】標準脈管血管分析は本分野でよく知られて
いる。これらの分析法には、これに限定されるものでは
ないが、種々の細胞系を用いた増殖および移動研究、コ
ラゲナーゼ抑制、およびニワトリの漿尿膜を用いたイン
ビボ血管新生（ＣＡＭ分析）が含まれる。

【００８２】抗体 本発明のペプチド化合物に向かう単クローンおよび多ク
ローン両方の抗体は、種々の治療および診断分野で有益
である。本発明はまた上記抗体に関する。本発明のペプ
チド類に向かう抗体は、いかなる他の上述治療もしくは
診断用途においても、或は上述した生物医学装置におい
て利用できる。

【００８３】抗体を製造するため、本分野で公知の数多
くの技術のいずれをも使用できる。上記技術の１つにお
いて、本発明の１種以上の化合物を動物（例えばラビッ
ト）に注射することによって、多クローン抗体が合成さ
れ得る。注射後、この動物は自然とこれらの化合物に対
して抗体を生産する。この抗体のレベルが充分なレベル
にまで上昇したとき、抗血清と呼ばれているところの抗
体含有血液を該動物から取り出し、そして数多くの分離
技術（例えばアフィニティークロマトグラフィー）のい
ずれか１つを用いて、この化合物に特異な抗体を他の抗
体から単離する。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ
、　Ｎａｔｕｒｅ　２５６、　４９５−４９７頁　（１
９７５）の技術を用いて、単クローン抗体が製造できる
。

【００８４】本発明の化合物はまた、標識した試薬、通
常抗体、を用いた免疫定量における使用のための抗血清
製造用として使用できる。便利に、これらのポリペプチ
ド類は、特に４〜６個の炭素原子を有しそして脂肪族の
ジアルデヒド類、或はカルボジイミドを用いて抗原に結
合させることができる。種々の標識、例えば発色団、蛍
光団、例えばフルオロセインまたはローダミン、放射異
性体、例えば１２５ｌ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈ、或
は磁化粒子を用い、本分野でよく知られた手段により、
これらの化合物および免疫学的試薬に標識を付けてもよ
い。

【００８５】これらの標識した化合物および試薬、或は
それらを認識しそして特異的に結合することのできる標
識した試薬は、例えば診断用試薬として利用できる。生
物学的標本から誘導されるサンプルは、本発明の化合物
を用いて、通常の抗原性決定因子を有する物質の存在お
よび量に関して分析され得る。

【００８６】転移性の胸部および結腸癌を有する患者の
血清中でトロンボスポンジンのレベルが上昇する（Ｔｕ
ｓｚｙｎｓｋｉ他、　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｈａｅｍ
ｏｓｔａｓ　（１９８９）　６２：４１８およびＳｍｉ
ｔｈ他、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　Ａｍｅｒｉｃａｎ
　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｏ
ｎｃｏｌｏｇｙ　（１９９０）　９：６）。本発明のペ
プチド類に対する抗体は、これに限定されるものではな
いが、胃腸管（胃、結腸、および直腸）の癌、乳癌およ
び肝癌を含む種々の種類の癌のための診断／予後定量法
における試薬として利用できる。

【００８７】これらの多クローンおよび単クローン抗体
は、上述した用途のいずれか、特に癌治療における治療
用途で利用できる。最初に、これらの抗体はトロンボス
ポンジンを分離するために使用できる。これは、トロン
ボスポンジンが腫瘍細胞転移を介在させるため有益であ
る。第二に、この抗体は、腫瘍細胞表面上に存在してい
るトロンボスポンジンをブロックするために使用できる
。三番目として、癌治療において、細胞毒性を示す薬剤
、ホルモン類、または画像診断剤をこれらの抗体に連成
させることができる。四番目として、これらの抗体を生
物医学装置にコートして、血清から過剰のトロンボスポ
ンジンを除去するか、或は細胞表面上にトロンボスポン
ジンを有している細胞を除去することができる。

【００８８】接着および細胞付着 本発明のペプチド類は、最適細胞培養のため、および人
工器官材料のための表面を製造して、周辺の組織との結
合を促進させるために用いることができる。これらのペ
プチド類は、細胞付着蛋白質として有益であり、疎水性
の表面、例えば未処理の合成プラスチック樹脂、そして
特に異なる膜用途のために用いられる材料、例えばニト
ロセルロースまたはポリスルホン、或は該ペプチドに対
して相溶性を示す材料、を処理することによって、細胞
が付着する基質を提供することができる。これらのペプ
チド類の細胞付着特性はまた、固体状支持体、例えばゲ
ルまたは合成樹脂、或は長鎖のポリサッカライドに対し
てポリペプチド類を共有結合的に連成させるためにも用
いられ得る。この後者の方法は、異なるアフィニティー
を有するクロマトグラフィー用途に利用できる。上記ペ
プチド類の使用に関するもう１つのの重要な用途は、粒
子がゼラチンでコートされているところの、市販の細胞
付着表面における該ペプチドの使用であり、それによっ
て、皿中で可能なよりもより小さい容積の媒体中で、同
等の付着細胞を成長させることが可能になる。インビボ
で表面に対して細胞を付着させるか、或は移植に先立っ
て、特別な表面上での所望細胞種の増殖を促進させると
ころの、上記ペプチド類と一緒に使用するための医学装
置が設計できる。この例は、膜に対する小島細胞の付着
、或は人工器官の血管または血管移植物上での内皮細胞
の成長である。上記ペプチド類は、創傷治癒を助けるた
めの斑移植などのコーティングにおいて使用できる。

【００８９】本発明のペプチド類はまた、細胞の抽出物
または細胞膜からトロンボスポンジン細胞表面レセプタ
を単離するためにも使用できる。アフィニティークロマ
トグラフィーの如き標準操作が使用できる。トロンボス
ポンジン細胞表面レセプタは、より良好なトロンボスポ
ンジン類似物を開発するか、或は血清から過剰のトロン
ボスポンジンを除去するために使用できる。

【００９０】下記の実施例は、主題事項に関するいかな
る制限をも意味するものではなく、説明として提供する
。

【００９１】

【実施例】本発明のペプチド類は、ペプチド合成の通常
の方法により合成できる。好適な通常の方法は、Ｉｎｔ
．　Ｊ．　Ｐｅｐｔ．　Ｐｒｏｃ．　Ｒｅｓ．２１、　
５７−６３　（１９８３）中に記述されている操作の使
用である。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｄの固相合成もまた好適で
ある（Ｊ．　Ａｍｅｒ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　８５
、　２１４９−２１５４　（１９６３）；　Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ　１５０、　１７８−１８５　（１９６５）；　同
書、　２３２、　３４１−３４７　（１９８６）。固相
合成は、一般に、適切な樹脂、例えばＣ−末端のカルボ
キシアミドを用いてペプチドを合成するときのフェニル
アセトアミドメチル（ＰＡＭ）ポリスチレン樹脂、或は
Ｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ｍＢＨＡ）樹脂に対
して、保護されたアルファアミノ酸を連成させることに
よって、該ペプチドのＣ末端から開始させる。合成中、
必要に応じて適切なアミノ酸側鎖保護基を用いる。この
ように、アスパラギン酸はベンジルエステルとしてその
ベータカルボキシル基が保護され、そしてアルギニンは
トシルによってそのグアニジノ基が保護される。所望の
ペプチドを合成し終わった後、このペプチドを該樹脂か
ら開裂させ、そしてフッ化水素（ＨＦ）の如き試薬で処
理して保護基を除去する。次に、このペプチドは、高性
能液クロ（ＨＰＬＣ）、或はペプチド精製のための他の
上記方法により精製され得る。固相ペプチド合成のため
の確立された操作に関する背景となる情報は、Ｓｔｅｗ
ａｒｔおよびＹｏｕｎｇ著の「固相ペプチド合成」（Ｓ
ｏｌｉｄ　ＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ）、Ｗ．Ｈ．　Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ．、　Ｓ
ａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　１９６９中に見いだされ
る。

【００９２】上記記述に従って、新規合成ペプチド類の
化学合成のために下記の操作を用いた。

【００９３】実施例１ Ｃ末端アミドを用いたペプチド配列ＣＳＶＴＣＧ（ＳＥ
Ｑ　ＩＤＮＯ：１）の合成 Ｃ末端アミドのための適切な樹脂４−メチルベンズヒド
リルアミン（ＭＢＨＡ）をポリプロピレン製の網状の袋
（６４μ）中に密封した。これらの袋全部を、ＣＨ２Ｃ
ｌ２の入っている共通の容器に入れた後、激しく振とう
してこの樹脂を洗浄しそして膨張させた。次に行う全て
の段階において、適切な溶媒移動を確保するため激しい
振とうを伴わせた。次に、５５％のトリフルオロ酢酸（
ＴＦＡ）／ＣＨ２Ｃｌ２を用いた酸分解を３０分間行い
、ＴＦＡ塩の形でα−アミノ酸基を脱離させることによ
って、Ｎ−α−ブトキシカルボニルを除去した。その後
、この袋を、ＣＨ２Ｃｌ２（２ｘ）、ＩＰＡ（２ｘ）、
そしてＣＨ２Ｃｌ２（２ｘ）で洗浄して、過剰のＴＦＡ
を除去することで、中和のための準備を行った。これら
の袋を、ＣＨ２Ｃｌ２中の５％ジイソプロピルエチルア
ミンで各々２分間３回洗浄することによって、該ＴＦＡ
塩を中和した。これに続いて、ＣＨ２Ｃｌ２で２回洗浄
して過剰の塩基を除去した。次に、袋を該共通の容器か
ら取り出した後、中和に先立ってコンピューターが計算
した情報により調製したところの、それらの個々の０．
２Ｍアミノ酸溶液に、これらの袋を加えた。その後、等
量の０．２Ｍジプロピルカルボジイミドを加えて、連成
反応を活性化した。室温で１時間連成を行った後、これ
らの袋を、ジメチル−ホルムアミドそしてＣＨ２Ｃｌ２
で洗浄した後、該共通容器に戻した。各々のアミノ酸に
対してこの方法を繰り返した。−１０℃〜０℃で９０分
間かけて、該ペプチドを９２．５％フッ化水素／７．５
％アニソールと反応させることで開裂を生じさせた。側
鎖保護基の除去の結果として生じる炭素陽イオンと反応
する捕捉剤としてアニソールを用いた。次に、温度を０
℃に保持しながら、Ｎ２の強烈な流れを用い、そして続
いてアスピレーター真空を用いることで、この溶液を除
去した。残存しているアニソールを、エチルエーテルで
２回洗浄することによって除去した。その後、１０％の
酢酸を用いてこのペプチドを抽出した。

【００９４】この粗ペプチドの純度を、流速が１ｍＬ／
分のＶｙｄａｃ　Ｃ−１８カラムの備わっているＢｅｃ
ｋｍａｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｇｏｌｄを用いた分析用ＲＰ
−ＨＰＬＣで検査した。用いた溶媒系は、３０分で５−
６５％Ｂの勾配を有する０．０５％ＴＦＡ水溶液（Ａ）
とアセトニトリル中の０．０５％ＴＦＡ（Ｂ）とであり
、２１５μｍの吸収を測定した。Ｗａｔｅｒｓ製造のＰ
ａｋ　Ｎｏｄｕｌｅ　Ｒａｄｉａｌ　Ｃｏｍｏｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ　Ｃ１８カラム（２５ｃｍｘ５ｃｍ、１０−２
０μ）の備わっているＷａｔｅｒｓデルタ製造の３，０
００調製用ＨＰＬＣを用いて精製を行った。この溶媒系
は、０．０５％ＴＦＡ水溶液（Ａ）とアセトニトリル中
の０．０５％ＴＦＡ（Ｂ）であった。種々の一次勾配を
用い、２３０ｎｍの吸収を測定し、そして４０ｍＬの画
分を採取した。次に、Ｂｅｃｋｍａｎ分析システムを用
いてこれらの画分を分析した。所望の画分をプールした
後、凍結乾燥した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣを用いてもう
一度この最終乾燥生成物を分析した。精製後のこのペプ
チドに関する典型的なＨＰＬＣクロマトグラムを図１に
示す。

【００９５】実施例２ ペプチド配列ＣＳＶＴＣＧ酸（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１
）の化学合成 Ｃ末端酸のための適切な樹脂フェニルアセトアミドメチ
ル（ＰＡＭ）をポリプロピレン製の網状の袋（６４μ）
中に密封した。これらの袋全部を、ＣＨ２Ｃｌ２の入っ
ている共通の容器に入れた後、激しく振とうしてこの樹
脂を洗浄しそして膨張させた。次に行う全ての段階にお
いて、適切な溶媒移動を確保するため激しい振とうを伴
わせた。次に、５５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／
ＣＨ２Ｃｌ２を用いた酸分解を３０分間行い、ＴＦＡ塩
の形でα−アミノ酸基を脱離させることによって、Ｎ−
α−ブトキシカルボニルを除去した。その後、この袋を
、ＣＨ２Ｃｌ２（２ｘ）、ＩＰＡ（２ｘ）、そしてＣＨ
２Ｃｌ２（２ｘ）で洗浄して、過剰のＴＦＡを除去する
ことで、中和のための準備を行った。これらの袋を、Ｃ
Ｈ２Ｃｌ２中の５％ジイソプロピルエチルアミンで各々
２分間３回洗浄することによって、該ＴＦＡ塩を中和し
た。これに続いて、ＣＨ２Ｃｌ２で２回洗浄して過剰の
塩基を除去した。次に、袋を該共通の容器から取り出し
た後、中和に先立ってコンピューターが計算した情報に
より調製したところの、それらの個々の０．２Ｍアミノ
酸溶液に、これらの袋を加えた。その後、等量の０．２
Ｍジイソプロピルカルボジイミドを加えて、連成反応を
活性化した。 室温で１時間連成を行った後、これらの袋を、ジメチル
−ホルムアミドそしてＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した後、該共
通容器に戻した。各々のアミノ酸に対してこの方法を繰
り返した。−１０℃〜０℃で９０分間かけて、該ペプチ
ドを９１．５％フッ化水素／７．５％アニソールと反応
させることで開裂を生じさせた。側鎖保護基の除去の結
果として生じる炭素陽イオンと反応する捕捉剤としてア
ニソールを用いた。次に、温度を０℃に保持しながら、
Ｎ２の強烈な流れを用い、そして続いてアスピレーター
真空を用いることで、この溶液を除去した。残存してい
るアニソールを、エチルエーテルで２回洗浄することに
よって除去した。その後、１０％の酢酸を用いてこのペ
プチドを抽出する。

【００９６】この粗ペプチドの純度を、流速が１ｍＬ／
分のＶｙｄａｃ　Ｃ−１８カラムの備わっているＢｅｃ
ｋｍａｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｇｏｌｄを用いた分析用ＲＰ
−ＨＰＬＣで検査した。用いた溶媒系は、３０分で５−
６５％Ｂの勾配を有する０．０５％ＴＦＡ水溶液（Ａ）
とアセトニトリル中の０．０５％ＴＦＡ（Ｂ）とであり
、２１５μｍの吸収を測定した。Ｗａｔｅｒｓ製造のＰ
ａｋ　Ｎｏｄｕｌｅ　Ｒａｄｉａｌ　Ｃｏｍｏｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ　Ｃ１８カラム（２５ｃｍｘ５ｃｍ、１０−２
０μ）の備わっているＷａｔｅｒｓデルタ製造の３，０
００調製用ＨＰＬＣを用いて精製を行った。この溶媒系
は、０．０５％ＴＦＡ水溶液（Ａ）とアセトニトリル中
の０．０５％ＴＦＡ（Ｂ）であった。種々の一次勾配を
用い、２３０ｎｍの吸収を測定し、そして４０ｍＬの画
分を採取した。次に、Ｂｅｃｋｍａｎ分析システムを用
いてこれらの画分を分析した。所望の画分をプールした
後、凍結乾燥した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣを用いてもう
一度この最終乾燥生成物を分析した。精製後のこのペプ
チドに関する典型的なＨＰＬＣクロマトグラムを図２に
示す。

【００９７】実施例３ 環状ＣＳＶＴＣＧ−酸（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）の合
成ＣＳＶＴＣＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）ペプチドの
環化を、５００ｍＬの脱酸素水中に実施例２の粗ペプチ
ド（５２ｍｇ）を溶解した後、２８％のＮＨ４ＯＨでｐ
Ｈを８．５に調整すること（溶液Ａ）によって行った。 Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６（１．７５ｇ）を１００ｍＬの脱酸
素水中に溶液した後、２８％のＮＨ４ＯＨでｐＨを８．
５に調整した。この溶液を溶液Ｂと呼ぶ。

【００９８】２時間かけて溶液Ｂに溶液Ａを滴下した後
、この混合物を更に１時間撹拌した。次に、１０％のＡ
ｃＯＨでｐＨを４に調整した後、この溶液を調製用ＨＰ
ＬＣに注入した。精製後、９５％純度のペプチド２８ｇ
を回収した。

【００９９】分析用逆相ＨＰＬＣおよびＦｅｂ−ＭＳに
より、この環状材料の組成を確認した。典型的なＨＰＬ
Ｃクロマトグラフィーを図３に示す。

【０１００】実施例４ 追加的ペプチド類の化学合成 適当な修飾を行い、実施例１〜３中およびＩｎｔ．　Ｊ
．　Ｐｅｐｔ．　Ｐｒｏｃ．　Ｒｅｓ．　２１、　５７
−６５　（１９８３）中に概略を示した操作に従って、
次に示すペプチド類を合成した。本発明の全てのペプチ
ド類の内毒素を標準ＬＡＬ法操作で検査し、内毒素が存
在していないことを確認した。

【０１０１】

【表４】

【０１０２】実施例５ ＴＳＰおよびペプチド類に対する種々の細胞の接着この
実施例において、一連のペプチドを試験し、これらのペ
プチド類が種々の細胞と結合する能力を、トロンボスポ
ンジンとの比較で測定した。トロンボスポンジンはその
接着特性を通して転移で働くと考えられている。Ｔｕｓ
ｚｙｎｓｋｉ他、　（Ａｎａｌ．　Ｂｉｏ．　（１９９
０）　１８４：１８９−９１）の開示に一般的に従って
分析法を開発し、これにより、トロンボスポンジンフラ
グメントまたは本発明の類似物に接着する細胞の能力を
評価する。この定量方法において、トロンボスポンジン
（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ他、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ
．　（１９８５）　２６０：１２２４０−５の方法によ
って精製）を正の対照として作用させ、そしてウシの血
清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｃｏ．）およびペプチド類ＡＮＫＨＹＦおよびＶＣ
ＴＧＳＣおよびＴＣＶＣＧＳを負の対照として作用させ
た。評価した細胞種は、Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞
、Ａ５４９ヒト肺腺癌細胞、ウシの大動脈平滑筋細胞、
およびラビットの平滑筋細胞であった。

【０１０３】本発明のトロンボスポンジン類似物を実施
例１〜４と同様にして合成した。９６個のウエルを有す
るミクロタイタープレートのウエル上で、２μｇのペプ
チドまたは対照蛋白質を一晩空気乾燥した。その後、ウ
エルをＨＥＰＥＳ緩衝食塩水で洗浄した後、ＨＥＰＥＳ
緩衝食塩水中の１％の、脂肪酸の入っていないＢＳＡで
１時間ブロックした。

【０１０４】これらの種々の細胞を増殖させた後、標準
操作を用いて対数増殖期中に収穫した。この収穫した細
胞を、血清の入っていないＤｕｌｂｅｃｃｏの最小必須
媒体（ＤＭＥＭ）（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）中で２回洗浄した後、５ｍＭのグルコースと１００
μＭのＭｇＣｌ２とが入っているＨＥＰＥＳ緩衝食塩水
中で、最終濃度が４ｘ１０５個細胞／ｍＬになるように
懸濁させた。この細胞懸濁液からウエル当たり２００，
０００個の細胞を取り出して、種々のリガンドの入って
いる該ミクロタイター皿の各々のウエルに加えた後、こ
の皿を、ＣＯ２培養器中３７℃で３０分間培養した。吸
引により、付着していない細胞を取り除いた後、これら
のウエルを２００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。これら
のミクロタイターウエル中で直接、これらの付着した細
胞を２００μＬのＰｉｅｒｃｅＢＣＡ処理溶液（Ｐｉｅ
ｒｃｅ　Ｃｈｅｍ．　Ｃｏ．Ｂｏｏｋｌｅｔ　Ｎｏ．　
２３２２５　（１９８７））に溶解することで、全細胞
会合蛋白質を測定した。このプレートに接着性マイラシ
ート（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｓ）のカバーをかけた後、６０
℃で３０分間保温した。プレートを室温に冷却し、カバ
ーシートを取り外した後、ミクロタイタープレート読み
取り装置（Ｂｉｏｔｅｋ、　Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、　
Ｖｅｒｍｏｎｔ．）により各々のウエルの吸収を５６２
ｎｍで測定した。経験的に測定した変換率により、吸収
を付着細胞の数に変換した。

【０１０５】図４中に図式的に示した結果は、本発明の
ペプチド類がＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞への接着特性を示
すことを表している。表ＩＩの結果は、本発明のペプチ
ド類が試験した細胞系全てに対して接着活性を示すこと
を表している。

【０１０６】

【表５】 実施例６ Ｂ１０Ｆ１０黒色腫細胞のコラーゲン依存接着に対する
ペプチド類の効果 ５ｍＭの酢酸中のコラーゲン２μｇを４℃で一晩ウエル
に吸着させた。その後、ウエルをＨＥＰＥＳ緩衝食塩水
で洗浄した後、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水中の１％の、脂肪
酸の入っていないウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）を用
いて１時間ブロックした。５ｍＭグルコースおよび１０
０μＭのＭｎＣｌ２の入っているＨＥＰＥＳ緩衝食塩水
中のＢ１６Ｆ１０細胞の懸濁液（ウエル当たり２００，
０００細胞）を、緩衝液、或は１００μｇ／ｍＬのペプ
チドまたは１００μｇ／ｍＬのＢＳＡが入っている緩衝
液中３７℃で１５分間予備培養した。次に、この細胞懸
濁液を、コラーゲンをコートしたウエルに加えた後、室
温で３０分間培養した。付着していない細胞を吸引で取
り除いた後、実施例５で前述したように、細胞会合蛋白
質を測定することによって付着細胞を測定した。図５中
に示した結果は、本発明のペプチド類がコラーゲンに対
する黒色腫細胞の結合を抑制することを示している。

【０１０７】実施例７ Ｂ１６Ｆ１０肺腫瘍細胞転移に対するペプチド類の効果
本発明のペプチド化合物の抗転移活性を示すために用い
たインビボモデルは、Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ他によって記
述されている（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　（１９８７）
　４７：４１３０−４１３３）。簡単に示すと、対照緩
衝液（Ｈｅｐｅｓ緩衝食塩水、ｐＨ７．４）か或は本発
明の表示ペプチド化合物１ｍｇのどちらかの存在下、１
ｘ１０５個のＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞をＣ５７ブ
ラックマウスに静脈注射した。各々の化合物に対して５
または６匹の動物を用いた。この定量法で試験したペプ
チド類は、トリパンブルー染色排除法により測定して、
細胞生死判別に対しいかなる有効な結果も示さなかった
。加うるに、これらのペプチド類は１ｍｇ／ｍＬで、２
４時間の共培養後、細胞増殖を示さなかった。１４日後
、これらのマウスをと殺した後、肺腫瘍の数を数えた。

【０１０８】図６に示した結果は、本発明のペプチド類
が抗転移活性を有することを示している。この棒グラフ
は、処理グループ中で観察された肺腫瘍の平均数を示し
ており、そして誤差に関する線は平均の標準誤差を表し
ている。図７は、各々の処理グループから得られる代表
的な肺を示している。

【０１０９】実施例８ 血小板凝集分析 発光を測定するように装備された単一チャネルの血小板
凝集計（Ｃｈｒｏｍｏ−Ｌｏｇ、Ｈａｖｅｒｅｔｏｗｎ
、　Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を用いて血小板凝集を
監視した。１５０Ｘｇで２０分間遠心分離することによ
り、０．３８％のクエン酸ナトリウムで凝固を抑制した
全血から、血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）が得られた。

【０１１０】ＡＤＰ誘発血小板凝集に対するペプチド類
の効果を図８に示す。種々の濃度のＣＳＶＴＣＧおよび
ＧＲＧＤＳの存在下、２ｕＭのＡＤＰと一緒に撹拌する
ことによって、一定分量０．５ｍＬの血小板富裕血漿を
凝集させた。クロノ−ログ血小板凝集計を用いて、凝集
を、時間に対する光学的吸収の減少として３７℃で測定
し、これを図８に示す。各々のパネル中に表示したペプ
チド類は、１文字コードを用いたアミノ酸配列で表す。

【０１１１】実施例９ コラーゲン誘発血小板凝集に対するペプチド類の効果洗
浄したヒトの血小板を、５ｍＭのグルコースと３５０μ
ｇ／ｍＬのＢＳＡとが入っているＨＥＰＥＳ緩衝食塩水
中に懸濁した。５００μｇ／ｍＬの種々のペプチド類の
存在下、５μｇ／ｍＬのコラーゲンと一緒に撹拌するこ
とによって、一定分量０．５ｍＬの血小板を凝集させた
。クロノ−ログ血小板凝集計を用いて、凝集を、時間に
対する光学的吸収の減少として３７℃で測定し、これを
図９に示す。１００％凝集は、ペプチドの存在無しで測
定した吸収の最大減少として定義した。対照の％は、ペ
プチド存在下で測定した吸収の減少をペプチド存在無し
で測定した吸収の減少で割った値に１００を乗じて計算
した。１文字コードを用いて表したアミノ酸配列により
、各々の棒グラフの下にペプチド類を表示する。 実施例１０ コラーゲン誘発血小板凝集に対するＣＳＶＴＣＧの用量
応答 洗浄したヒトの血小板を、５ｍＭのグルコースと３５０
μｇ／ｍＬのＢＳＡとが入っているＨＥＰＥＳ緩衝食塩
水中に懸濁した。種々の濃度のＣＳＶＴＣＧ（ＳＥＱ　
ＩＤ　ＮＯ：１）の存在下、５μｇ／ｍＬのコラーゲン
と一緒に撹拌することによって、一定分量０．５ｍＬの
血小板を凝集させた。クロノ−ログ血小板凝集計を用い
て、凝集を、時間に対する光学的吸収の減少として３７
℃で測定し、これを図１０に示す。１００％凝集は、ペ
プチドの存在無しで測定した吸収の最大減少として定義
した。対照の％は、ペプチド存在下で測定した吸収の減
少をペプチド存在無しで測定した吸収の減少で割った値
に１００を乗じて計算した。実施例１１ＴＳＰおよびペ
プチド類に対するヒトの血小板の接着付着血小板の数を
、本質的に前述したように測定した（Ｔｕｓｚｙｎｓｋ
ｉ他、　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏ．上記）。簡単に示すと、
前述したように（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ他、　（１９８８
）　Ｂｌｏｏｄ　７２、　１０９−２２５）、洗浄した
１ｍＬ当たり５ｘ１０８個の血小板１００μＬをミクロ
タイタープレートに加え、そしてこれらのウエルを、２
μｇのペプチドまたは蛋白質溶液（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩
水、ｐＨ７．４）で処理した。フュームフード（ｆｕｍ
ｅｈｏｏｄ）中で一晩培養した後、溶液を室温で乾燥し
た。その後、ウエルをＨＥＰＥＳ緩衝食塩水で洗浄した
後、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水中の１％の、脂肪酸の入って
いないウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロッ
クした。血小板（１００μＬ）をウエル中で３０分間培
養した後、吸引により、付着していない血小板を取り除
いた。ウエルを２００μＬのＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、ｐ
Ｈ７．４で３回洗浄した。付着血小板の数を、ＢＣＡ蛋
白質分析法を用いて血小板誘導蛋白質を測定することに
よって決定した。結果を図１１に示す。各々の棒グラフ
の下の表示は、該ウエルをコートするために用いた蛋白
質またはペプチドを表している。使用した蛋白質は、ト
ロンボスポンジン（ＴＳＰ）、フィブロネクチン（ＦＮ
）、およびウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）であった。 ペプチド類が、１文字コードを用いて表したアミノ酸配
列にり、各々の棒グラフの下に表してある。ブロックさ
れたｃｙｓ残基を有するペプチドは、Ｃ（Ｘ）ＳＶＴＣ
（Ｘ）Ｇ−ＮＨ−２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）（式中
、Ｘは阻止基ＡＣＭを表す）で与えられている。 ５ｍＭのグルコースと３５０μｇ／ｍＬのＢＳＡの入っ
ているＨｅｐｅｓ緩衝食塩水中の血小板の懸濁液（ウエ
ル当たり５ｘ１０７個の血小板）を、各々のウエル中で
３０分間培養し、吸引により、付着していない血小板を
除去した後、前述したように細胞会合蛋白質を測定する
ことによって付着細胞を測定した（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ
他、　（１９９０）　１８４：１８９ー１９１）。この
データは２〜３回の実験の代表であり、各々の実験にお
けるデータ点は３回の測定の平均値であり、誤差の線は
この平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表している。

【０１１２】実施例１２ 毛細管内皮細胞増殖分析 毛細管内皮細胞のインビトロ増殖に対する本発明のペプ
チド類の効果を測定した。毛細管内皮細胞は、血管新生
中、脈管形成刺激に反応して増殖することが知られてい
る（Ａｕｓｐｒｕｎｋ他、　Ｊ．　Ｍｉｃｒｏｒａｓｃ
．　Ｒｅｓ．　（１９７７）　１４：５３）。脈管形成
を伴う特定の細胞を用い、それらを公知の脈管形成因子
、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）で刺激すること
によって、脈管形成過程をインビトロで模擬し得る。使
用したこの分析法は、Ｍｏｓｅｓ他によって記述された
（Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９９０、　２４８：１４０８ー１
０）。０．０１、０．１、１．０、１０、および１００
μｇ／ｍＬの用量の、本発明のペプチド類ＣＳＶＴＣＧ
（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）およびＣＳＶＴＣＲ（ＳＥ
Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：２）を試験した。

【０１１３】最も効力を示すペプチドはＣＳＶＴＣＲ（
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）であり、これは、１０μｇ／
ｍＬで刺激内皮細胞増殖の２０％抑制を示し、そして１
００μｇ／ｍＬで１００％抑制を示した。ペプチドＣＳ
ＶＴＣＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）は１００μｇ／ｍ
Ｌで３９％抑制を示した。

【０１１４】実施例１３ コラゲナーゼ抑制分析 コラゲナーゼは脈管形成過程で重要な役割を有している
ことが示されている（Ｌａｎｇｅｒ他、　Ｐｒｏｃ．　
Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　（１９８０）　７
７：４３３１；　Ｔｈｕｒｇｉｅｒｓｓｏｎ他、　Ｊ．
　Ｎａｔｌ．　Ｃａｎｃｅｒ．　Ｉｎｓｔ．　（１９８
２）　６９：１０４９およびＲｉｆｋｉｎ他、「内皮細
胞の病理学」（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅ
ｎｄｏｔｈｅｌｉｃａｌ　Ｃｅｌｌ）（Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８２、　１９１−１９７）。コ
ラゲナーゼ抑制活性をＪｏｈｎｓｏｎ−Ｗｉｎｔ（Ａｎ
ａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　（１９８０）　１０４：１
７５）と同様にして測定した。コラゲナーゼ活性に対す
るＪｏｈｎｓｏｎ−Ｗｉｎｔ放射系酵素分析により、ペ
プチド類ＣＳＶＴＣＧ（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：１）および
ＣＳＶＴＣＲ（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：２）を５０ｎｇ、１
００ｎｇ、２５０ｎｇ、５００ｎｇ、１μｇおよび２μ
ｇの用量で試験した。

【０１１５】ペプチドＣＳＶＴＣＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ
Ｏ：１）は１μｇで若干の抑制（−１９％）を示し、そ
して２μｇでより一層の抑制（−３６％）を示した。ペ
プチドＣＳＶＴＣＲ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）は最低
用量で最大の抑制を示し、５０ｎｇで−２１％であった
。

【０１１６】実施例１４ 抗体製造 標準プロトコルを用い、ヤギ中でＣＳＴＳＣＧ（ＳＥＱ
　ＩＤ　ＮＯ：４）に対する抗体を上昇させた。簡単に
説明すると、フロインド完全アジュバンド中で乳化した
キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）に連
成させた１ｍｇのペプチドをこの動物に注射した後、不
完全フロインドアジュバンド中で乳化した連成ペプチド
０．５ｍｇを、追加的に２回、最初の注射後３週間およ
び６週間目に注射した。この動物に血漿しゃ血を２回受
けさせた後、と殺した。血漿サンプルをプールし、そし
て血清を製造した。抗体をＫＬＨ−セファロースに吸着
させて抗ＫＬＨ抗体を除去した後、ＴＳＰセファロース
カラムを用いてアフィニティー精製した。

【０１１７】アフィニティー精製した抗体は、ＴＳＰ、
およびウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）に連成させたＣ
ＳＴＳＣＧと、交差反応したが、フィブリノーゲンまた
はＢＳＡ単独とは交差反応しなかった。この抗体は特異
的にＴＳＰ誘発黒色腫細胞接着を抑制した。負の対照は
下記の通りであった。ＴＳＰ介在接着に対して抗ＫＬＨ
抗体は有効でなく、そしてフィブロネクチン誘発接着に
対して抗ペプチド抗体は有効でなかった。

【０１１８】このことは、ＣＳＴＳＣＧ（ＳＥＱ　ＩＤ
　ＮＯ：４）がＴＳＰの細胞接着ドメインの一部である
ことを示している。

【０１１９】実施例１５ 血小板凝集に対する抗ＣＳＴＳＣＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ
Ｏ：４）の効果 ＴＳＰの種類Ｉ反復が血小板凝集を抑制することを更に
確認するため、実施例１４と同様にしてＣＳＴＳＣＧ（
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）に対する抗体を製造した。こ
の抗体を実施例８と同様にして試験した。

【０１２０】アフィニティー精製したところの、濃度範
囲が３３〜７０μｇ／ｍＬの抗ＣＳＴＳＣＧは、図１２
に示すように、ＡＤＰ誘発ヒト血小板富裕血漿を抑制し
た。しかしながら、アフィニティークロマトグラフィー
で精製した非免疫対照ＩｇＧの３３〜７０μｇ／ｍＬは
、抗凝集特性を示さなかった。

【０１２１】この実験は、ＣＳＴＳＣＧ（ＳＥＱ　ＩＤ
　ＮＯ：４）が血小板凝集を抑制することに対する更に
一層の支持を与えている。

【０１２２】実施例１６ 腫瘍細胞転移に対する抗体の効果 ＣＳＴＳＣＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）に対する抗体
を実施例１４と同様にして製造した。実施例７に記述し
たのと同様の方法で、Ｃ５７ブラックマウス（１グルー
プ当たり６匹のマウス）の尾の内部葉脈中に、１．０ｘ
１０５個のＢ１６−Ｆ１０マウス黒色腫細胞と一緒に、
１００μｇの対照ＩｇＧまたは１００μｇのアフィニテ
ィー精製抗ＣＳＴＳＣＧのどちらかを注射した。この黒
色腫細胞をＥＤＴＡ中に収穫した後、Ｈｅｐｅｓ緩衝食
塩水溶液ｐＨ７．３５中に懸濁し、そして同じ緩衝液中
に抗体を溶解した。

【０１２３】トリパンブルー排除法により評価したとき
、この黒色腫細胞の生存率に対して、抗体は効果を示さ
なかった。２週間後、マウスをと殺して、肺腫瘍コロニ
ーの数を数えた。

【０１２４】図１３は、抗ＣＳＴＳＣＧが腫瘍細胞転移
を７３〜８０％まで抑制することを示している。このこ
とは、ＣＳＴＳＶＴがＴＳＰ中の細胞ドメインでありそ
して上記ペプチド／抗体が抗腫瘍転移効果を有している
ことに対する更に一層の支持を与えている。

【０１２５】

【表６】配列表 １）一般的情報 （ｉ）出願者：Ｅｙａｌ，　ＪａｃｏｂＨａｍｉｌｔｏ
ｎ，　Ｂｒｕｃｅ　ＫｉｎｇＴｕｓｚｙｎｓｋｉ，　Ｇ
ｅｏｒｇｅ　Ｐａｕｌ（ｉｉ）発明の名称：トロンボス
ポンジン様活性を有するペプチド類の治療学的使用 （ｉｉｉ）配列の数：１４ （ｉｖ）連絡住所 （Ａ）住所：Ｗ．Ｒ．　Ｇｒａｃｅ　＆　Ｃｏ．　−Ｃ
ｏｎｎ．（Ｂ）通り：７３７９、Ｒｏｕｔｅ３２（Ｃ）
市：Ｃｏｌｕｍｂｉａ （Ｄ）州：Ｍａｒｙｌａｎｄ （Ｅ）国：ＵＳＡ （Ｆ）郵便番号：２１０４４ （ｖ）コンピューター読み取り形態： （Ａ）媒体の種類：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュ
ーター：ＩＢＭ　ＰＣコンパティブル（Ｃ）作動システ
ム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウエア：
ワードパーフェクト５．１（ｖｉ）現在の出願日： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類：５３０ （ｖｉｉｉ）委任状による代理人／代理人情報：（Ａ）
名前：Ａｐｐｌｅｂｙ，　Ｖａｎｅｓｓａ　Ｌ．（Ｂ）
登録番号：３３２２３ （Ｃ）参照／処理予定番号：０１−７９００（ｉｘ）遠
隔通信情報： （Ａ）電話：（３０１）　５３１−４５１５（２）ＳＥ
Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：１に関する情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：６個のアミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）位相：線状 （ｉｉ）分子の種類：ペプチド （ｘｉ）配列記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１：Ｃｙｓ　
　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　Ｃｙｓ　　Ｇｌｙ１
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　５（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に関する情
報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：６個のアミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）位相：線状 （ｉｉ）分子の種類：ペプチド （ｘｉ）配列記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２：Ｃｙｓ　
　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　Ｃｙｓ　　Ａｒｇ１
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　５（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３に関する情
報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：６個のアミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）位相：線状 （ｉｉ）分子の種類：ペプチド （ｘｉ）配列記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：Ｃｙｓ　
　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｃｙｓ　　Ａｒｇ１
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　５（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４に関する情
報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：６個のアミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）位相：線状 （ｉｉ）分子の種類：ペプチド （ｘｉ）配列記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４：Ｃｙｓ　
　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｃｙｓ　　Ｇｌｙ１
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　５（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５に関する情
報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：６個のアミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）位相：線状 （ｉｉ）分子の種類：ペプチド （ｘｉ）配列記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５：Ｃｙｓ　
　Ａｒｇ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　Ｃｙｓ　　Ｇｌｙ１
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　５（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６に関する情
報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：６個のアミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）位相：線状 （ｉｉ）分子の種類：ペプチド 　　　　（ｘｉ）配列記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６：
Ａｒｇ　　Ｃｙｓ　　Ａｒｇ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　
Ｃｙｓ　　Ｇｌｙ１　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　５（２）ＳＥＱ　ＩＤ　
ＮＯ：７に関する情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：６個のアミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）位相：線状 （ｉｉ）分子の種類：ペプチド （ｘｉ）配列記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７：Ａｌａ　
　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　Ａｌａ　　Ａｒｇ１
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　５（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８に関する情
報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：６個のアミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）位相：線状 （ｉｉ）分子の種類：ペプチド （ｘｉ）配列記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８：Ｃｙｓ　
　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　Ｃｙｓ　　Ｌｙｓ１
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　５（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９に関する情
報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：６個のアミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）位相：線状 （ｉｉ）分子の種類：ペプチド （ｘｉ）配列記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９：Ｃｙｓ　
　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｃｙｓ　　Ｌｙｓ１
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　５（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０に関する
情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：６個のアミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）位相：線状 （ｉｉ）分子の種類：ペプチド （ｘｉ）配列記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０：Ｃｙｓ
　　Ｓｅｒ　　Ａｒｇ　　Ｔｈｒ　　Ｃｙｓ　　Ｇｌｙ
１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　５（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１に関す
る情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：６個のアミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）位相：線状 （ｉｉ）分子の種類：ペプチド （ｘｉ）配列記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１：Ｃｙｓ
　　Ａｒｇ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｃｙｓ　　Ｇｌｙ
１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　５（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２に関す
る情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：５個のアミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）位相：線状 （ｉｉ）分子の種類：ペプチド （ｘｉ）配列記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２：Ｃｙｓ
　　Ａｒｇ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　Ｃｙｓ１　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　５（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３に関する情報：（
ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：５個のアミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）位相：線状 （ｉｉ）分子の種類：ペプチド （ｘｉ）配列記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３：Ｃｙｓ
　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｃｙｓ１　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　５（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４に関する情報：（
ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：５個のアミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）位相：線状 （ｉｉ）分子の種類：ペプチド 　　　　（ｘｉ）配列記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４
：Ｐｒｏ　　Ｃｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　
　Ｃｙｓ　　Ａｒｇ１　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　５

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ペプチドＣＳＶＴＣＧ−ＮＨ２に対す
るＨＰＬＣ分析の結果を示している。

【図２】図２は、ペプチドＣＳＶＴＣＧに対するＨＰＬ
Ｃ分析の結果を示している。

【図３】図３は、ジスルフィド結合を通して環化してい
るペプチドＣＳＶＴＣＧに対するＨＰＬＣ分析の結果を
示している。

【図４】図４は、黒色腫細胞の接着を抑制する本発明の
ペプチドの能力を示している。

【図５】図５は、コラーゲン依存黒色腫細胞接着におけ
る本発明ペプチドの作用能力を示している。

【図６】図６は、本発明のペプチド類がインビボで抗転
移活性を有することを示している。

【図７】図７は、黒色腫細胞の存在下、本発明のペプチ
ド類で処理するか或は処理していないマウスの肺を比較
したものである。

【図８】図８は、ＡＤＰ誘発血小板凝集の抑制に対する
本発明のペプチド類の能力を示している。

【図９】図９は、コラーゲン誘発血小板凝集の抑制に対
する本発明のペプチド類の能力を示している。

【図１０】図１０は、コラーゲン誘発血小板凝集を抑制
するペプチドＣＳＶＴＣＧの能力に関する服用量応答を
示している。

【図１１】図１１は、ヒトの血小板接着を支持する本発
明のペプチド類の能力を示している。

【図１２】図１２は、ＡＤＰ誘発血小板凝集を抑制する
、本発明のペプチドに対する抗体の能力を示している。

【図１３】図１３は、本発明のペプチドに対する抗体が
、インビボで抗転移活性を有することを示している。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　有効量の、式 【化１】Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｒ２［
   式中、Ｒ１は、水素、アミノ、アセチルまたは１００個
   以下のアミノ酸残基を含む保護されているか或は未保護
   の末端アミノ基、或はそれらのデスアミノ（ｄｅｓａｍ
   ｉｎｏ）型であり、Ｘ１およびＸ５は、同一もしくは異
   なり、中性／小型アミノ酸残基であり、Ｘ２、Ｘ３およ
   びＸ４は、同一もしくは異なり、中性／非極性／大型／
   非環状、或は中性／極性／大型／非環状、或は中性／極
   性／小型、或は塩基性／非環状の、アミノ酸残基であり
   、Ｒ２は、ヒドロキシル、カルボキシル、または１００
   個以下のアミノ酸残基を含む、保護されているか未保護
   の末端カルボキシル基（それらのカルボキシアミドもし
   くはアルキルアミド型を含む）である］から成るポリペ
   プチド化合物（このポリペプチド構造物は、Ｘ１とＸ５
   との間の結合、或はＲ１とＲ２との間の結合を通して任
   意に環化されている）を投与することから成る、トロン
   ボスポンジン様活性を促進するか或は抑制する方法。
2. 【請求項２】　　細胞接着を抑制する請求項１の方法。