JPH04278452A

JPH04278452A - 分離回収用電気泳動ゲルおよびそれを用いた分離回収法

Info

Publication number: JPH04278452A
Application number: JP3032644A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Yoshioka; 浩吉岡; Yuichi Mori; 有一森
Original assignee: WR Grace and Co
Current assignee: WR Grace and Co
Priority date: 1991-02-27
Filing date: 1991-02-27
Publication date: 1992-10-05

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＬＣＳＴを有する温度
感応性架橋高分子化合物からなる分離回収用電気泳動ゲ
ルおよびそれを用いた分離回収法に関する。本発明の分
離回収法は、操作が簡便であると同時に極めて高い回収
効率を有し、また、試料変性を誘起しないためにタンパ
ク質や核酸などの分離回収法に著しい進歩をもたらすも
のである。

【０００２】

【従来の技術】従来、タンパク質、核酸あるいはそのフ
ラグメントなどを、アミノ酸分析、ペプチドマッピング
、アミノ酸配列決定、抗体の作製、ＤＮＡクローニング
、リコンビナントＤＮＡの作製などのために電気泳動に
よって分離し回収する方法が種々行われて来た。例えば
、電気泳動によって分離した被分離物質を含有するゲル
を切り出し再度電場をかけてゲル中に被分離物質を溶出
する電気溶出法、被分離物質を含有するゲル上に濾紙や
ニトロセルロース膜などを重ねてそれらの担体に移すブ
ロッチング法、ゲルを粉砕して被分離物質を抽出するゲ
ル粉砕法、ゲルの架橋を化学反応によって分解しゲル中
の被分離物質を溶出するゲル溶解法などが開発されてい
る。しかし、これらの方法には、回収操作が煩雑で工程
数が多く、回収率が低いうえに試料が変性するなどの問
題があることが指摘されている。特に微量のタンパク質
や核酸を分離回収する場合に、回収率が低いということ
は致命的である。

【０００３】一方、高回収率を達成することを目的とし
た可溶化ゲルも開発されている。最も典型的なものは、
ポリアクリルアミド化合物を分解性架橋剤であるＮ，Ｎ
’−ジアリル酒石酸ジアミド（ＤＡＴＤ）、Ｎ，Ｎ’−
（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビスーアクリルアミ
ド（ＤＨＥＢＡ）、Ｎ，Ｎ’−ビス−アクリルシスタミ
ン（ＢＡＣ）、エチレンジアクリレート（ＥＤＡ）など
によって架橋して得られるゲルである。上記のゲルを用
いて被分離物を電気泳動法によって分離した後、該被分
離物質を含有する部分を切り出し、酸化、還元あるいは
加水分解反応により該ゲルを可溶化しゲル中の被分離物
質を溶出させる方法が開発されている。しかし、この方
法には、分離したタンパク質や核酸を可溶化されたゲル
から再度分離しなければならないという大きな難点があ
る。特に、ゲルを可溶化した時点ではほとんど１００％
の回収が可能であるものの、その後の可溶化ゲルとの分
離の段階で回収率が低下してしまうという欠点がある（
例えば、Ｄ．　Ｃ．　Ｆｌｔｅｒ　と　Ｓ．　Ｓ．　Ｔ
ｅｖｅｔｈｉａ，　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　１１７：　２
６７−２７０，　１９８２）。

【０００４】したがって、従来の方法では電気泳動によ
って分離を行っても、被分離物をゲルから簡便な方法で
かつ高回収率で回収することは非常に困難であった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
の分離回収用電気泳動ゲルが有する上記の課題を解決し
た新規な分離回収用電気泳動ゲルを提供することにある
。また本発明は、かかる分離回収用電気泳動ゲルを用い
た簡便な工程により、高回収率でタンパク質や核酸など
の所望の物質を得る分離回収法を提供することをも目的
とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記の目的はＬＣＳＴを
有する温度感応性架橋高分子化合物からなる分離回収用
電気泳動ゲルおよびそれを用いた分離回収法によって達
成される。

【０００７】本発明におけるＬＣＳＴを有する温度感応
性高分子とは、水に対する溶解度温度係数が負を示す高
分子化合物であり、低温にて生成する高分子化合物と水
分子との水素結合に依存する水和物（オキソニウムヒド
ロキシド）が、高温で分解し脱水和することにより、高
分子化合物同士が凝集し沈殿する特徴を有する。ＬＣＳ
Ｔ（Ｌｏｗｅｒ　Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ
　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）とは、このような温度感応
性高分子化合物の水和と脱水和の転移温度をいう（例え
ば、ハスキンズ（Ｍ．　Ｈａｓｋｉｎｓ）らの　Ｊ．　
Ｍａｃｒｏｍｏｌ，　Ｓｃｉ．−Ｃｈｅｍ．，　Ａ２　
（８），　１４４１　（１９６８）　参照）。本発明に
おいては、ＬＣＳＴが０〜９０℃、さらには１０〜５０
℃である温度感応性高分子化合物を用いるのが好ましい
。

【０００８】本発明に用いられる温度感応性高分子化合
物は、ＬＣＳＴより高い温度では非水溶性で固体状態で
あり、温度をＬＣＳＴより低くすることによって可逆的
に水溶性になる。

【０００９】本発明のゲルに使用することができる温度
感応性高分子化合物としては、ポリＮ置換アクリルアミ
ド誘導体、ポリＮ置換メタアクリルアミド誘導体、これ
らの共重合体、ポリビニルメチルエーテルおよびポリビ
ニルアルコール部分酢化物などが挙げられる。

【００１０】好ましい高分子化合物を以下にＬＣＳＴが
低い順に列挙する。

【００１１】ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン；ポリ
ーＮ−ｎ−プロピルメタアクリルアミド；ポリーＮ−イ
ソプロピルアクリルアミド；ポリーＮ，Ｎ−ジエチルア
クリルアミド；ポリーＮ−イソプロピルメタアクリルア
ミド；ポリーＮ−シクロプロピルアクリルアミド；ポリ
ーＮ−アクリロイルピロリジン；ポリーＮ，Ｎ−エチル
メチルアクリルアミド；ポリーＮ−シクロプロピルメタ
アクリルアミド；ポリーＮ−エチルアクリルアミド上記
の高分子は、他の単量体と共重合したものであってもよ
い。共重合する単量体は、親水性単量体、疎水性単量体
のいずれであってもよい。一般的には、親水性単量体と
共重合するとＬＣＳＴは上昇し、疎水性単量体と共重合
するとＬＣＳＴは下降する。したがって、これらを選択
することによって所望のＬＣＳＴを有する高分子化合物
を得ることもできる。

【００１２】親水性単量体としては、Ｎ−ビニルピロリ
ドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタアクリル
アミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、ヒドロキシエチル
メタアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒ
ドロキシメチルメタアクリレート、ヒドロキシメチルア
クリレート、酸性基を有するアクリル酸、メタアクリル
酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチルスルホ
ン酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチルスル
ホン酸など、並びに塩基性を有するＮ，Ｎ−ジメチルア
ミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエ
チルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル
アクリルアミドおよびそれらの塩などが挙げられるが、
これらに限定されるものではない。

【００１３】一方、疎水性単量体としては、エチルアク
リレート、メチルメタクリレート、グリシジルメタクリ
レートなどのアクリレート誘導体およびメタクリレート
誘導体、Ｎ−ｎ−ブチルメタアクリルアミドなどのＮ置
換アルキルメタアクリルアミド誘導体、塩化ビニルなど
が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一
方、本発明に用いる温度感応性架橋高分子化合物は、上
記の温度感応性高分子化合物を与える単量体に二官能性
単量体を共重合させることによって調製することができ
る。二官能性単量体としては、例えば、Ｎ，Ｎ’−メチ
レンービスアクリルアミド（ＢＩＳ）、Ｎ，Ｎ’−ジア
リル酒石酸ジアミド（ＤＡＴＤ）、Ｎ，Ｎ’−（１，２
−ジヒドロキシエチレン）ビスーアクリルアミド（ＤＨ
ＥＢＡ）、Ｎ，Ｎ’−ビス−アクリルシスタミン（ＢＡ
Ｃ）、エチレンジアクリレート（ＥＤＡ）などが挙げら
れる。本発明のゲルは、塊状または有機溶媒中で共重合
反応を行った後、含水させることも可能であるが、通常
の電気泳動用アクリルアミドゲルと同様に水中で重合さ
せるほうが、そのまま電気泳動に供することができるの
で好ましい。ただし、水中での重合反応温度は温度感応
性高分子化合物のＬＣＳＴ以下の一定温度で行うことが
望ましい。重合手段に特に制限はないが、水中低温での
ラジカル重合は、例えば過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）
とＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン（ＴＥ
ＭＥＤ）の組み合わせなどのレドックス開始剤系を用い
るのが好ましい。また、温度感応性高分子化合物を与え
る単量体のかわりに該単量体と上記の親水性あるいは疎
水性単量体の混合物を用いることも可能である。

【００１４】次に、このような方法によって得られたゲ
ルを用いてタンパク質や核酸などを分離する方法につい
て説明する。まず、タンパク質や核酸を電気泳動法によ
って分離する。電気泳動時の温度は、該ゲルを形成する
温度感応性高分子化合物のＬＣＳＴより低い温度に設定
する必要があるが、それ以外は通常のスラブ電気泳動法
と全く同様の操作を行えばよい。その後、電気泳動法に
よって分離した被分離物を含有するゲル部分を切り出し
、温度感応性架橋高分子化合物のＬＣＳＴ以上に加温す
る。本発明のゲルは、ＬＣＳＴ以下の温度では多量の水
を吸って膨潤しているが、ＬＣＳＴ以上に加温するとゲ
ル内部の水や被分離物を排出して収縮する特性を有して
いる。したがって、このようにして排出された被分離物
をゲルから分離することによって簡便で効率よく目的物
を回収することができる。また、１回の排出では回収率
が不十分である場合には、排出された水溶液を回収した
後に残されたゲル切片に少量の水を添加してＬＣＳＴ以
下の温度で膨潤させ、再度ＬＣＳＴ以上に加温すること
によってゲル内部に残存するタンパク質などをさらに排
出し回収することができる。

【００１５】以下に実施例を示し、本発明をさらに具体
的に説明するが本発明の範囲は特許請求の範囲の記載に
より定まるものであり、以下の実施例により制限を受け
るものではない。

【００１６】

【実施例】（実施例１）電気泳動ゲルの調製およびタン
パク質の電気泳動には、マイクロスラブ電気泳動装置（
マリソル社製ＫＳ−８０１２型）を使用した。Ｎ−イソ
プロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡ）７．５ｇ、Ｎ，Ｎ
’−メチレン−ビス−アクリルアミド（ＢＩＳ）０．１
１ｇ、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）５０ｍｇを１００
ｍｌのトリスバッファー（３７５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，　ｐＨ　８．８，　０．１％　ＳＤＳ）に溶解し、
水流アスピレーターで１０分間脱気した。脱気後、Ｎ，
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ
）５０ｍｇを加えて、１ｍｍのスペーサーを挟んだ２枚
のガラス板間に幅８．５ｃｍ、高さ７ｃｍとなるように
溶液を注入した。その上に高さ１ｃｍ分のイソブチルア
ルコールを界面を乱さないように注入し、２０℃の恒温
槽中で終夜静置してゲル化させた。イソブチルアルコー
ルを完全に除去した後、通常の濃縮用ゲル層溶液（５％
アクリルアミド、０．１３％Ｎ，Ｎ’−メチレンビスア
クリルアミド、１２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．
８，０．１％ＳＤＳ，　０．０１％　ＡＰＳ，　０．０
２％　ＴＥＭＥＤ）を脱気後、ガラス板間の空隙に注入
し、コームをさして２０℃で１時間ゲル化させた。コー
ムを抜いて、ゲルを電気泳動装置にセットし、陰陽両極
チャンバーを電気泳動用トリスグリシンバッファー（２
５ｍＭ　Ｔｒｉｓ，　１９２ｍＭ　グリシン，　ｐＨ　
８．３，　０．１％　ＳＤＳ）で満たした。

【００１７】マーカーとして、プレステインドＳＤＳ−
ＰＡＧＥスタンダード（バイオラッド社製）、サンプル
として、ＳＤＳ処理したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
を別個のレーンに注入し、濃縮用ゲル層中は１０ｍＡで
、分離用ゲル層中は１５ｍＡで電気泳動させた。電気泳
動中ゲルの温度は，ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルア
ミド（ＰＮＩＰＡ）のＬＣＳＴである３０℃より低い２
０℃に保った。マーカーの分離パターンは通常のＳＤＳ
−ＰＡＧＥと同様であった。

【００１８】電気泳動後、マーカーを指標にＢＳＡサン
プルが含有されると推定される部分の含水ゲル０．１ｇ
を切り出し、ＰＮＩＰＡのＬＣＳＴ（３０℃）より高い
３７℃に加温してゲルを収縮させた。排出された水溶液
中のＢＳＡをプロテインアッセイキット（バイオラッド
社製）により定量したところ、電気泳動に供したタンパ
クの約８０％が回収されていることが確認された。

【００１９】（実施例２）電気泳動ゲルの調製およびタ
ンパク質の電気泳動には、マイクロスラブ電気泳動装置
（マリソル社製ＫＳ−８０１２型）を使用した。Ｎ−イ
ソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡ）７．５ｇ、ビス
アクリルクリスタミン（ＢＡＣ）０．１９ｇ、過硫酸ア
ンモニウム（ＡＰＳ）６ｍｇを１００ｍｌのトリスバッ
ファー（３７５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ　８．
８，　０．１％　ＳＤＳ）に溶解し、水流アスピレータ
ーで１０分間脱気した。脱気後、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−
テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）１．２５ｇを加
えて、１ｍｍのスペーサーを挟んだ２枚のガラス板間に
幅８．５ｃｍ、高さ７ｃｍとなるように溶液を注入した
。その上に高さ１ｃｍ分のイソブチルアルコールを界面
を乱さないように注入し、２０℃の恒温槽中で終夜静置
してゲル化させた。イソブチルアルコールを完全に除去
した後、ゲルを電気泳動装置にセットし、陰陽両極チャ
ンバーを上記トリスバッファーで満たして終夜１０ｍＡ
、２０℃で前処理電気泳動を行った。チャンバー内のバ
ッファーを除去して、通常の濃縮用ゲル層溶液（５％ア
クリルアミド、０．１３％Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアク
リルアミド、１２５ｍＭ　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ　
６．８，　０．１％　ＳＤＳ，　０．０１％　ＡＰＳ，
　０．０２％　ＴＥＭＥＤ）を脱気後、ガラス板間の空
隙に注入し、コームをさして２０℃で１時間ゲル化させ
た。コームを抜いて、陰陽両極チャンバーを電気泳動用
トリスグリシンバッファー（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ，　１
９２ｍＭ　グリシン，　ｐＨ　８．３，　０．１％　Ｓ
ＤＳ）で満たした。

【００２０】マーカーとして、プレステインドＳＤＳ−
ＰＡＧＥスタンダード（バイオラッド社製）、サンプル
として、ＳＤＳ処理したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
を別個のレーンに注入し、濃縮用ゲル層中は１０ｍＡで
、分離用ゲル層中は１５ｍＡで電気泳動させた。電気泳
動中ゲルの温度は、ＰＮＩＰＡのＬＣＳＴ（３０℃）よ
り低い２０℃に保った。マーカーの分離パターンは通常
のＳＤＳ−ＰＡＧＥと同様であった。

【００２１】電気泳動後、マーカーを指標にＢＳＡサン
プルが含有されると推定される部分の含水ゲル０．１ｇ
を切り出し、ＰＮＩＰＡのＬＣＳＴ（３０℃）より高い
３７℃に加温してゲルを収縮させた。排出された水溶液
中のＢＳＡをプロテインアッセイキット（バイオラッド
社製）により定量したところ、電気泳動に供したタンパ
クの約８０％が回収されていることが確認された。

【００２２】

【発明の効果】本発明の分離回収用電気泳動ゲルは、Ｌ
ＣＳＴを有する温度感応性架橋高分子化合物からなる。このため電気泳動によって分離された物質をゲル中から
回収するには、その物質を含有するゲルを切り出し、温
度をＬＣＳＴ以上に上げるだけでよい。また、ＬＣＳＴ
をタンパク質の変性温度以下に設定することによって、
タンパク質を変性させずに回収することもできる。した
がって、本発明は簡便で効率よく目的物を回収すること
ができる点で、その技術的価値は極めて高い。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＬＣＳＴを有する温度感応性架橋高分子化
合物からなることを特徴とする分離回収用電気泳動ゲル
。
【請求項２】ＬＣＳＴを有する温度感応性架橋高分子化
合物からなる分離回収用電気泳動ゲルを用いてＬＣＳＴ
以下の温度で試料を電気泳動させた後、被分離物を含有
するゲルを切り出し、ＬＣＳＴ以上の温度に加温するこ
とにより該ゲルを収縮させて試料を回収することを特徴
とする分離回収法。