JPH04248987A - 共役酵素反応によるｌ−ホスフィノトリシンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は二つの酵素反応の共役に
よる４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキ
ソ酪酸（ＨＭＰＢ）からのＬ−２−アミノ−４−（ヒド
ロキシメチルホスフィニル）酪酸（Ｌ−ホスフィノトリ
シン）の合成に関する。

【０００２】

【従来の技術】共役酵素合成によるホスフィノトリシン
製造は既にＥＰ　２４９　１８８に開示されている。こ
れにはアミノ供与体であるアスパルテートおよび、グル
タメート／オキザルアセテート・トランスアミナーゼ（
ＧＯＴ）の存在下にα−ケトグルタレートをグルタメー
トに転化することが記載されている。この転化反応は、
この第一反応において形成されたアミノ供与体であるグ
ルタメートの存在下に４−（ヒドロキシメチルホスフィ
ニル）−２−オキソ酪酸（ＨＭＰＢ）をＬ−ホスフィノ
トリシンに転化するもう一つのトランスアミナーゼ反応
と共役されている。

【０００３】さて、共役酵素反応における基質転化を完
全なものとするには、個々の酵素反応の平衡定数が相互
に異なっていることが重要である。しかしながら、アミ
ノ基転移反応の平衡定数は約１．０であるため、一般に
目的物は５０％収率でしか得られない（米国特許第４，
８２６，７６６号参照）。

【０００４】平衡系から反応生成物を除去するかまたは
過剰の出発物質を用いることにより、酵素反応の平衡を
生成物側にずらすことは可能である。

【０００５】一般に、Ｌ−ホスフィノトリシン合成のた
めの前記アミノ基転移反応には過剰のアミノ供与体であ
るグルタメートが用いられる〔Ａ．　Ｓｃｈｕｌｚ　ｅ
ｔ　ａｌ．　（１９９０）　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏ
ｎ．　Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．　５６，　１〜６，　Ｎｏ．
　１〕。しかしながら、これには、非タンパク原性アミ
ノ酸であるＬ−ホスフィノトリシンの天然アミノ酸例え
ばグルタメートからの分離が、例えばイオン交換クロマ
トグラフィーを二回連続行うなど相当な苦労の結果はじ
めて可能となるという欠点がある〔Ａ．Ｓｃｈｕｌｚ　
ｅｔ　ａｌ．　（１９９０）　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒ
ｏｎ．　Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．　５６，　１〜６，　Ｎｏ
．　１〕。

【０００６】ホスフィノトリシン特異的トランスアミナ
ーゼおよびＧＯＴの関与する共役法のもう一つの可能性
は、そのホスフィノトリシントランスアミナーゼにより
消費されるグルタメートを再循環させることにより反応
をＧＯＴによってホスフィノトリシン合成の方向に動か
すことである。これはＧＯＴ反応生成物であるオキザル
アセテートが二価金属イオンの存在下においてピルベー
トに自然に脱カルボキシされ、従って反応平衡系から除
かれるためである。しかしながら、これまでに報告され
ているすべてのＧＯＴはグルタメートの存在下において
ピルベートをアミノ基転移してアラニンにする副次的活
性を有しているため、ＮＨ４＋が反応系から連続的に除
かれてしまい、また等モル量のＨＭＰＢとアミノ供与体
（グルタメートおよび／またはアスパルテート）を用い
たのではＬ−ホスフィノトリシン生成反応は完全なとこ
ろまで進行しない。加えて、生成Ｌ−ホスフィノトリシ
ンはアラニンによって汚染されている。

【０００７】

【課題を解決するための手段】今般、ＧＯＴ活性を有す
るトランスアミナーゼおよびＬ−ホスフィノトリシント
ランスアミナーゼ活性を有するトランスアミナーゼを用
いた共役酵素反応においてアミノ供与体であるグルタメ
ートを触媒量で用いそしてアミノ供与体であるアスパル
テートがＨＭＰＢに対して略等モル量で用いると、実質
的に定量的収率で、そしてまた天然アミノ酸によって実
質的に全く汚染されることなくホスフィノトリシンが生
成することを見出した。

【０００８】従って本発明は式（Ｉ）

【化３】 で示されるＬ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホ
スフィニル）酪酸（Ｌ−ホスフィノトリシン）を式（Ｉ
Ｉ）

【化４】 で示される４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２
−オキソ酪酸（ＨＭＰＢ）から以下の反応工程、すなわ
ちａ）　　適当なトランスアミナーゼ１の存在下にアス
パルテートとα−ケトグルタレートを反応させてオキザ
ルアセテートおよびグルタメートを生成させる、および
ｂ）　　適当なトランスアミナーゼ２の存在下にグルタ
メートと式（ＩＩ）のＨＭＰＢを反応させてα−ケトグ
ルタメートおよびＬ−ホスフィノトリシンを生成させる
工程より成る共役酵素反応により製造する方法であって
、アスパルテート対ＨＭＰＢモル比を０．５〜１．５対
１、好ましくは０．８〜１．２対１、特に等モル比とし
、またグルタメートまたはα−ケトグルタレートを触媒
量で添加することを特徴とする前記方法に関する。

【０００９】グルタメート、アスパルテートおよびα−
ケトグルタレートまたはそれらの相当する酸は購入可能
な物質である。ＨＭＰＢはＥＰ　３０４２４に記載され
ている如くに製造することができる。

【００１０】トランスアミナーゼ１はトランスアミナー
ゼ活性を有しそしてアミノ供与体としてのアスパルテー
トの存在下にα−ケトグルタレートからグルタメートに
アミノ基転移できるいずれかの酵素（いわゆるＧＯＴ活
性酵素）である。ピルベートからアラニンにアミノ基転
移できず、またそれ故に共役反応の目的生成物であるＬ
−ホスフィノトリシンを他の天然アミノ酸で汚染するこ
とのないＧＯＴ（グルタメート／オキザルアセテートト
ランスアミナーゼ）を用いるのが好ましい。ピルベート
は例えばアスパルテートのアミノ基転移反応生成物であ
るオキザルアセテートの脱カルボキシ化によって製造さ
れる。

【００１１】特に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｃｏｌｉ　（Ｅ．ｃｏｌｉ））またはバチルス属細菌か
らのＧＯＴ活性を有し、またピルベート特異的活性を持
たないトランスアミナーゼを用いるのが好ましい。

【００１２】トランスアミナーゼ２はトランスアミナー
ゼ活性を有し、またアミノ供与体としてのグルタメート
の存在下にＨＭＰＢからＬ−ホスフィノトリシンにアミ
ノ基転移することができるいずれかの酵素である。この
タイプの酵素はＥＰ　２４９　１８８に示されている。 トランスアミナーゼ１と同様、ピルベートからアラニン
にアミノ基転移できないトランスアミナーゼをトランス
アミナーゼ２として用いるのが好ましい。

【００１３】特に、大腸菌からのＬ−ホスフィノトリシ
ン特異的トランスアミナーゼはピルベート特異的活性を
有さず、従って好ましいものとして用いることができる
。大腸菌からのＬ−ホスフィノトリシン特異的トランス
アミナーゼは例えばＡ．　Ｓｃｈｕｌｚ　（１９９０）
の方法によって濃縮することができる。

【００１４】原則として、特定のトランスアミナーゼ活
性を有する全細胞、細胞抽出物、部分的精製細胞抽出物
または精製酵素をアミノ基転移反応に用いることもでき
る。しかしながら、副次的反応、特にピルベートからア
ラニンへのアミノ基転移反応、がもはや生じなくなるま
で精製された酵素を用いるのが有利である。

【００１５】少くとも一つの、特に両方の、酵素を固定
された形で用いるのが特に有利である。トランスアミナ
ーゼ固定のための一つの可能な方法は例えばＡ．　Ｓｃ
ｈｕｌｚ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９０）に記載されてい
る。

【００１６】アミノ基転移反応は一般に、バイオコンパ
チブル（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）緩衝液、すなわ
ちｐＨを６．５〜１０、好ましくは７．５〜９．０、特
に７．５〜８．５の範囲に維持しかつ個々の成分とは反
応しない緩衝液、中で行われる。ホスフェートまたはｔ
ｒｉｓ緩衝液、特にｔｒｉｓ緩衝液を選択するのが好ま
しい。アスパルテート対ＨＭＰＢモル比は０．５〜１．
５対１、好ましくは０．８〜１．２対１、特に等モル比
である。グルタメートまたはα−ケトグルタレートは触
媒量で反応混合物に添加される。ＨＭＰＢ対グルタメー
トまたはα−ケトグルタレートは一般に０．０１〜１対
１、好ましくは０．０１〜０．２対１、特に０．０５〜
０．２対１である。反応混合物は一般に少量の補助因子
（ｃｏｆａｃｔｏｒ）であるピリドキサールホスフェー
トをも例えば１〜５００μｍ、好ましくは５〜１００μ
ｍの濃度で含有する。反応温度は一般に約２０〜７０℃
、好ましくは３０〜４０℃である。

【００１７】Ｌ−ホスフィノトリシン収率を高めるため
に、グルタメート／オキザルアセテートトランスアミナ
ーゼ反応で生成したオキザルアセテートを多価金属イオ
ンの存在下に脱カルボキシル化するのが好ましい（英国
特許出願第２　１６１　１５９号）。適当な多価金属イ
オンの例は前記英国特許出願に列挙されたすべての金属
イオン、好ましくは、Ａｌ３＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、
Ｆｅ２＋またはＦｅ３＋である。この好ましい態様にお
いて、付加的なピルベート特異的活性を有するトランス
アミナーゼまたはトランスアミナーゼ画分を全く用いな
いのがさらに有利である。前述の反応条件下にオキザル
アセテートの脱カルボキシル化反応を行うことによって
Ｌ−ホスフィノトリシンの収率が増大したことは全く予
想外であった。何故ならば英国特許出願第２　１６１　
１５９号によれば最高の生成物収率は反応系においてア
スパルテートを唯一のアミノ供与体として用いた場合に
認められたに過ぎなかったからである。

【００１８】アミノ供与体であるアスパルテートとグル
タメートが実質的に完全に消費されると、実質的に天然
アミノ酸不含の生成物Ｌ−ホスフィノトリシンが得られ
、またそれの形成されたα−ケト酸、α−ケトグルタレ
ートおよびオキザルアセテートまたはピルベートからの
分離は一段階で可能である。α−ケトグルタレートまた
はグルタメートは過剰にではなく極く少量で添加された
に過ぎず、また同様に、アスパルテートは過剰にではな
く好ましくはＨＭＰＢに対して等モルで添加されたにも
かかわらず、ＨＭＰＢからＬ−ホスフィノトリシンへの
実質的に完全な転化が認められた。このことは全く予測
し得なかったことである。

【００１９】Ｌ−ホスフィノトリシンは既知の方法、例
えばメチルイソブチルケトン抽出により、または例えば
　Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＩＲ　１２０　を用いた陽イオ
ン交換クロマトグラフィーにより簡易に精製することが
できる。

【００２０】得られるＬ−ホスフィノトリシンは一般に
農業において除草剤として用いられる。以下の実施例は
本発明をさらに詳述するものであるが、本発明を限定す
るものでは全くない。

【００２１】

【実施例】実施例１ 大腸菌Ｋ−１２による生物学的転換によるＬ−ホスフィ
ノトリシン合成 大腸菌Ｋ−１２をＬＢ培地（１０ｇ／リットル　トリプ
トン、５ｇ／リットル酵母エキス、１０ｇ／リットル　
ＮａＣｌ）中、３７°で１５時間培養した。５０００ｇ
で１０分間遠心分離することにより菌体を集め、ホスフ
ェート緩衝液（１０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０
、１０ｍＭ　ＮａＣｌ）で２回洗浄し、次いで以下の溶
液に１００ｍｇ／ｍｌ濃度となるように再懸濁した。

【００２２】溶液１： ＨＭＰＢ：グルタミン酸：アスパラギン酸＝１：１：１
１００ｍＭ　ＨＭＰＢ １００ｍＭグルタミン酸 １００ｍＭアスパラギン酸 ５０ｍＭ　ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０

【００２３
】溶液２： ＨＭＰＢ：グルタミン酸＝１：４ １００ｍＭ　ＨＭＰＢ ４００ｍＭグルタミン酸 ５０ｍＭ　ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０

【００２４
】菌体懸濁液を反応混合物と共に３７℃でインキュベー
トした。反応混合物中のＬ−ホスフィノトリシン含量を
合成過程の様々な時点でアミノ酸分析機を用いて測定し
た。表１は反応過程におけるＬ−ホスフィノトリシンへ
の転化率（％）を両方の生物学的転換混合物について示
したものである。（溶液２の場合）Ｌ−ＰＰＴ収率は４
倍過剰のアミノ供与体グルタミン酸を用いても８５％を
超えなかったのに、（溶液１の場合）アミノ供与体グル
タミン酸およびアスパラギン酸の等モル使用によりほぼ
１００％の転化率を達成できた。

【００２５】

【表１】

【００２６】実施例２ ブタからのグルタメート／オキザルアセテートトランス
アミナーゼの精製

【００２７】実施例３ 大腸菌からの精製Ｌ−ホスフィノトリシン特異的トラン
スアミナーゼおよびブタからのＧＯＴを様々なグルタミ
ン酸濃度で用いたＬ−ホスフィノトリシン合成大腸菌Ｋ
−１２からのＬ−ホスフィノトリシン特異的トランスア
ミナーゼ（ＰＳＴ）（ＥＰ−Ａ　０　３３４　６８３参
照）およびブタ心臓からのＧＯＴ（実施例２参照）をホ
スフェート緩衝液（２０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ＝７
．０、０．１ｍＭピリドキサールホスフェート、１ｍＭ
　２−ケトグルタレート、５ｍＭ　β−メルカプトエタ
ノール）に１ｍｇ／ｍｌ濃度となるよう溶解した。次に
各場合について、それら二酵素の１単位（＝ＰＳＴの場
合は１μｍｏｌ　Ｌ−ホスフィノトリシン／分、および
ＧＯＴの場合は１μｍｏｌグルタメート／分）の活性に
相当する容量を混合しそして以下の反応溶液と共に３７
℃で１時間インキュベートした。

【００２８】すべての反応混合物は １００ｍＭ　　ＨＭＰＢ １００ｍＭアスパラギン酸 ５０ｍＭ　ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ／８．０および付加
的にグルタミン酸を以下の濃度で含有した。 実験１：１００ｍＭ 実験２：５０ｍＭ 実験３：２０ｍＭ 実験４：１０ｍＭ 実験５：５ｍＭ 実験６：−

【００２９】反応時間後の各種混合物中のＬ−ホスフィ
ノトリシン含有量をアミノ酸分析機（Ｂｉｏｔｒｏｎｉ
ｃ　ＬＣ　５００１）で測定した。それより転化率（％
）として算出されたＬ−ホスフィノトリシン合成速度を
表２にまとめる。 これらの実験は、グルタミン酸濃度をＨＭＰＢまたはア
スパルテート使用濃度の０．２倍まで低下させることが
できしかもＬ−ホスフィノトリシン合成速度に対する悪
影響は無視できることを示している。

【００３０】

【表２】

【００３１】実施例４ 精製ＰＳＴ（大腸菌）およびＧＯＴ（ブタ）を各種酵素
比で用いたＬ−ホスフィノトリシン合成それら二つの精
製トランスアミナーゼを実施例３に記載の如く、１００
ｍＭ　ＨＭＰＢ、２０ｍＭグルタミン酸、１００ｍＭア
スパラギン酸および５０ｍＭ　ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ
＝８．０、より成る反応溶液と共に３７℃でインキュベ
ートした。それら二酵素の様々な活性比をこのために用
いた： １．　　ＰＳＴ　１単位／ＧＯＴ　１０単位２．　　Ｐ
ＳＴ　１単位／ＧＯＴ　１単位３．　　ＰＳＴ　１単位
／ＧＯＴ　０単位

【００３２】合成反応過程の様々な時
点で検体をアミノ酸分析機で測定しながら混合物中のＬ
−ホスフィノトリシン含量を測定した。それより算出さ
れたＬ−ホスフィノトリシン合成を表３に示す。酵素比
ＰＳＴ：ＧＯＴ＝１：１（混合物２）の場合に最高転化
率が得られた。ＧＯＴを添加しない場合（混合物３）に
達成し得る最大ＰＰＴ転化率はわずか約２０％に過ぎな
かったが、これは、この場合、Ｌ−ホスフィノトリシン
合成にグルタミン酸しか用い得ず、アスパラギン酸は使
用できないからである。

【００３３】

【表３】

【００３４】実施例５ Ｌ−ホスフィノトリシン合成に対する塩化マンガンの効
果 精製トランスアミナーゼを実施例３に記載の如く１：１
比（各１単位）で混合し、そして１ｍＭ　ＭｎＣｌ２の
存在下と、あるいはＭｎＣｌ２を用いずに、反応溶液（
１００ｍＭ　ＨＭＰＢ、２０ｍＭグルタミン酸、１００
ｍＭアスパラギン酸、５０ｍＭ　ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐ
Ｈ＝８．０）と共に３７℃でインキュベートした。Ｌ−
ホスフィノトリシン合成の進行を実施例４に記載の如く
測定し、それを表４にまとめる。塩化マンガンの添加に
より反応速度を顕著に増大させることができた。２４時
間の反応時間後のＬ−ホスフィノトリシン転化率は塩化
マンガンを用いない比較混合物よりも約１０％高かった
。

【００３５】

【表４】

【００３６】実施例６ シリカゲルへの“ＰＳＴ”トランスアミナーゼの固定５
０ｍｌの活性化シリカゲル（文献、すなわちＫ．　Ｍｏ
ｓｂａｃｈ，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ，　Ｖｏｌ．　ＸＬＩＶ；　Ａｃａｄｅｍｉｃ　
Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９７６，　１３
９および１４０ページに記載の如くシラン化およびグル
タールアルデヒド活性化したもの）を５０ｍｌのＰＳＴ
溶液（大腸菌からの精製ＰＳＴ、０．２５Ｍ燐酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ８）中のタンパク質１０ｍｇ／ｍｌ溶液
）に添加し、そしてゆるやかに撹拌しながら３時間反応
させる。次にまだ湿っている触媒を濾去しそして１００
ｍｌの０．２５Ｍホスフェート緩衝液（ｐＨ８）で洗浄
した。このようにして調製された生物学的触媒（ｂｉｏ
ｃａｔａｌｙｓｔ）は後述の反応に用いることができる
。

【００３７】実施例７ シリカゲルへの“ＧＯＴ”トランスアミナーゼの固定１
０ｍｌのＧＯＴ溶液（ブタからの精製ＧＯＴ、タンパク
質８．４ｍｇ／溶液１０ｍｌ）を実施例６に記載の如き
１０ｍｌのシリカゲルに固定する。この生物学的触媒は
この形で共役アミノ基転移反応に用いることができる。

【００３８】実施例８ 固定化ＰＳＴおよび固定化ＧＯＴを用いた共役アミノ基
転移反応 １８０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のＨＭＰＢ、１３３ｍｇ（１
ｍｍｏｌ）のＬ−アスパラギン酸、２９．４ｍｇ（０．
２ｍｍｏｌ）のＬ−グルタミン酸、１０ｍｇのピリドキ
サールホスフェートおよび０．６ｇのＴＲＩＳを蒸留水
で５ｇの溶液としそしてｐＨ８に調整する。これに０．
５ｍｌの固定化ＰＳＴ（実施例６）および０．５ｍｌの
固定化ＧＯＴ（実施例７）を添加し、そして注意深く撹
拌しながら２６℃、ｐＨ８で４８時間反応させる。反応
混合物のアミノ酸含量をＨＰＬＣ（アミノ酸分析機）に
より調べる。

【００３９】 　　収量（ＨＰＬＣ）：０．１２２ｇのＬ−ＰＰＴ（Ｈ
ＭＰＢに対し６８％）　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　０．０１２ｇのＬ−アスパラギン酸　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　０．０２８ｇのＬ−
グルタミン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　０．０２５ｇのＬ−アラニン

【００４０】実施例９ 固定化ＰＳＴおよび固定化ＧＯＴを用いた共役アミノ基
転移反応 １ｇ（５．６ｍｍｏｌ）のＨＭＰＢ、７１５ｍｇ（５．
６ｍｍｏｌ）のＬ−アスパラギン酸、１６３ｍｇ（１．
１ｍｍｏｌ）のＬ−グルタミン酸および１０ｍｇのピリ
ドキサールホスフェートを蒸留水で２０ｇの溶液としそ
してＫＨＣＯ３でｐＨ８に調整する。１ｍｌの固定化Ｐ
ＳＴ（実施例６）および１ｍｌのＧＯＴ（実施例７）を
添加後、ゆるやかに撹拌しながら３６℃で７２時間反応
させる。生成物溶液のアミノ酸含量をＨＰＬＣ（ＡＡＡ
）により調べる。

【００４１】 　　収量（ＨＰＬＣ）：０．５８ｇのＬ−ＰＰＴ（ＨＭ
ＰＢに対し５８％）　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　０．３０ｇのＬ−アスパラギン酸　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　０．１６ｇのＬ−グルタ
ミン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．
０２ｇのＬ−アラニン

【００４２】実施例１０ 固定化ＰＳＴおよび遊離ＧＯＴを用いた共役アミノ基転
移反応 １８０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のＨＭＰＢ、１４７ｍｇ（１
ｍｍｏｌ）のＬ−グルタミン酸、１３３ｍｇ（１ｍｍｏ
ｌ）のＬ−アスパラギン酸、１０ｍｇのピリドキサール
ホスフェートおよび０．７ｇのＴＲＩＳを蒸留水で５０
ｇの溶液（ｐＨ８）とし、そして実施例６からの溶液か
らの０．５ｍｌの固定化ＰＳＴおよび実施例７で調製さ
れたＧＯＴ溶液からの４２μｌの遊離ＧＯＴを添加する
。注意深く撹拌しながら３６℃で反応を行う。４８時間
後の溶液中のアミノ酸含量をＨＰＬＣ（ＡＡＡ）により
調べる。

【００４３】 　　収量（ＨＰＬＣ）：０．１４５ｇのＬ−ＰＰＴ（Ｈ
ＭＰＢに対し８０％）　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　０．０２４ｇのＬ−アスパラギン酸　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　０．１４７ｇのＬ−
グルタミン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　０．００３ｇのＬ−アラニン

【００４４】実施例１１ 固定化ＰＳＴおよび固定化ＧＯＴを用いた共役アミノ基
転移反応 実施例１０と同様にして反応を行う。遊離ＧＯＴに代え
て０．５ｍｌの固定化ＧＯＴ（実施例６）を用いる。生
成物溶液中のアミノ酸組成は実施例１０のそれに相当す
る。

【００４５】Ｌ−ＰＰＴ含量は薄層クロマトグラフィー
により測定した。それは約８０％である。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　式（Ｉ） 【化１】 で示されるＬ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホ
   スフィニル）酪酸（Ｌ−ホスフィノトリシン）を式（Ｉ
   Ｉ） 【化２】 で示される４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２
   −オキソ酪酸（ＨＭＰＢ）から以下の反応工程、すなわ
   ちａ）　　適当なトランスアミナーゼ１の存在下にアス
   パルテートとα−ケトグルタレートを反応させてオキザ
   ルアセテートおよびグルタメートを生成させる、および
   ｂ）　　適当なトランスアミナーゼ２の存在下にグルタ
   メートと式（ＩＩ）のＨＭＰＢを反応させてα−ケトグ
   ルタメートおよびＬ−ホスフィノトリシンを生成させる
   工程より成る共役酵素反応により製造する方法であって
   、アスパルテート対ＨＭＰＢモル比を０．５〜１．５対
   １、好ましくは０．８〜１．２対１、特に等モル比とし
   、またグルタメートまたはα−ケトグルタレートを触媒
   量で添加することを特徴とする製造方法。
2. 【請求項２】　　グルタメートまたはα−ケトグルタレ
   ートをＨＭＰＢに対し０．０１〜１対１、好ましくは０
   ．０１〜０．２対１、特に０．０５〜０．２対１のモル
   比で添加する請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】　　トランスアミナーゼ１がグルタメート
   ／オキザルアセテートトランスアミナーゼ活性（ＧＯＴ
   活性）を有する請求項１または２記載の方法。
4. 【請求項４】　　ＧＯＴがブタ、大腸菌またはバチルス
   、好ましくは大腸菌またはバチルスを起源とする請求項
   ３記載の方法。
5. 【請求項５】　　トランスアミナーゼ２がＬ−ホスフィ
   ノトリシントランスアミナーゼ活性を有する請求項１ま
   たは２記載の方法。
6. 【請求項６】　　Ｌ−ホスフィノトリシン特異的トラン
   スアミナーゼが大腸菌を起源とする請求項５記載の方法
   。
7. 【請求項７】　　オキザルアセテートが多価陽イオン、
   好ましくはＡｌ３＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、
   Ｆｅ２＋またはＦｅ３＋の存在下にピルベートに脱カル
   ボキシル化される請求項１〜６の少くとも一に記載の方
   法。
8. 【請求項８】　　トランスアミナーゼ１およびトランス
   アミナーゼ２がピルベートをアラニンに転化しない請求
   項７記載の方法。
9. 【請求項９】　　少くとも一方のトランスアミナーゼが
   固定化された形で存在する請求項１〜８の少くとも一に
   記載の方法。
10. 【請求項１０】　　固定化されたトランスアミナーゼが
    カラム反応装置に存在する請求項９記載の方法。